Microscopia. II (Copy)

MICROSCOP ÍA

MICROSCOPÍA . 

Fundamento: formación de imágenes a partir de un especímen.

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Técnica que permite observar objetos con un microscopio (simple o compuesto) para obtener una imagen aumentada .

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AUMENTO/ RESOLUCIÓN. 

El objeto a estudiar (preparado histológico por ejemplo),

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fuente de iluminación,

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sistema óptico.

¿QUÉ ES UN MICROSCOPIO? 

Instrumento óptico destinado a observar objetos extremadamente diminutos.

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Todos producen imágenes, pero los mecanismos utilizados para generarlas son diversos.

TIPOS.  

Microscopios fotónicos 

Campo claro.

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Contraste de fases.

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Campo oscuro.

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  Fluorescencia.

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  Microscopio confocal.

  Microscopios electrónicos. 

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MET y MEB.

Microscopios de campo próximo. 

Fuerza atómica.

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Efecto túnel.

RIAG

M ICROSCOPIO C AMPO C LARO .

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Observación de especímenes. 

Morfología microscópica



Afinidad tintorial.

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Poder de resolución.

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Objetivos 10X, 40X y 100x

(inmersión).

MICROSCOP Í A CAM P O CLA RO

M ICROSCOPÍA

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DE

C ONTRASTE

DE F ASES .

Visualizar células sin teñir y en estado vivo.

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Índice de refracción de la luz.

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Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido.

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Partes oscuras corresponden a porciones densas del espécimen; partes claras

corresponden a porciones menos densas.

RIAG

M ICROSCOPÍA

DE CONTRASTE DE FASES .

M ICROSCOPÍA CAMPO OSCURO . 

Haz enfocado de luz muy

intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. 

El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que

tiene detrás. 

Observación de células vivas y móviles.

M ICROSCOPÍA CAMPO OSCURO .

M ICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA . 

Utilización de fluorocromos.

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Fuente luminosa que emite radiaciones ultravioleta (a una determinada longitud de onda).

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Imagen observada: resultado de radiación electromagnética emitida por moléculas que han absorbido excitación primaria y reemitido luz con mayor longitud de onda.

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Lentes de cuarzo.

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Epifluorecencia.

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Espécimen fluorescente con el fondo oscuro.

F LUOROCROMOS . 

Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas moléculas.

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Conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula.

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Tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).

P RINCIPALES FLUOROCROMOS EMPLEADOS EN INMUNOFLUORESCENCIA . ESPECTROS DE ABSORCIÓN Y EMISIÓN . Fluorocromo

Longitud de onda de absorción (nm)

Longitud de onda de emisión (nm).

Cascade blue

374- 403

422- 430

Fluoresceína (FITC)

494

520

Rodamina (TRITC)

540

570

Naranja de acridina

460- 502

526- 650

Yoduro de propidio

536

617 RIAG

M ICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA .

M ICROSCOPÍA CONFOCAL . 

Fuente de luz: Láser.

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Sistema para captación y procesamiento de imágenes.

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Permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos gruesos y realizar reconstrucciones 3D a partir de cortes seriados.

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Enfoque a un solo plano.

M ICROSCOPÍA CONFOCAL. Izquierda: hipotálamo de ratón, centro: músculo liso de rata (dobles y triples marcajes). Derecha: grano de polen de girasol el cual es autofluorescente.

M ICROSCOPÍA CONFOCAL. Reconstrucciones tridimensionales a partir de cortes ópticos. (a) grano de polen, (b) hígado de ratón, (c) corteza cerebral de rata. (d) auto fluorescencia de una porción de raíz de helecho. Las reconstrucciones fueron realizadas a partir de series de 30-45 cortes ópticos.

M ICROSCOPÍA 

Utiliza electrones.

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Objetos de 0,001 µm.

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Cortes ultrafinos.

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Preparación de la muestra.

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Contraste 

Oxido de osmio



Tungsteno



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Uranio.

Visualizar ultraestructuras

ELECTRÓNICA .

M ICROSCOPÍA ELECTRÓNICA .

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO. RIAG

M ICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN  (TEM). 

Se observa a través del espécimen (trans- iluminación).

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Láminas ultrafinas (en el orden de nanómetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la cual es bombardeada con un haz de electrones enfocado.

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Una silueta del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o placa fotográfica situada por debajo del mismo.

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Resolución: 0,2nm.

M ICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO  (SEM). 

Se observa la superficie de un espécimen sólido (epiiluminación).

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Se puede lograr una resolución de 10nm y un aumento hasta de 20.000x.

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Imágenes en 3D gracias a una mayor profundidad de campo.

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Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (primarios) y los electrones que rebotan (secundarios) son recogidos por un detector.

RIAG

M ICROSCOPÍA DE FUERZA  ATÓMICA . 

Aguja cargada, emite electrones: se dobla al

desplazarse sobre la muestra, detectando irregularidades en la superficie, “palpando la muestra” y por ende su

forma. 



Definición a nivel subatómico. Imágenes 3D

Instrumento mecano-óptico similar al microscopio de efecto túnel. 

Se captura la información proveniente de la fuerza magnética de superficie de la muestra lográndose ver moléculas muy pequeñas y átomos. 

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Aplicaciones en biología celular

M ICROSCOPÍA DE FUERZA  ATÓMICA .

M ICROSCOPÍA DE CAMPO PRÓXIMO . E FECTO TÚNEL . 

También denominados de sonda de barrido (scanning probe microscopes).

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Nanociencia.

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Se constituyen básicamente de una plataforma y una sonda o aguja fina que recorre la superficie de la muestra con gran precisión (escaneo o barrido).

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El filamento se coloca muy cerca (a 1 nm) del objeto , generando corriente eléctrica y se desplaza por la superficie, captando electrones que se escapan en lo que se llama efecto túnel.

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Los electrones saltan de la punta a la muestra y viceversa. La corriente del efecto túnel varía dependiendo de la distancia entre la sonda y la muestra.

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Reproducción de la topografía o relieve de la muestra con una alta resolución.

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Propiedades químicas, eléctricas, mecánicas o físicas de la microestructuras o nanomateriales

M ICROSCOPÍA DE EFECTO TÚNEL .

Corral cuántico.

M ICROSCOPIO DE IONES EN CAMPO . 

Los ejemplares se observan en una cámara de alto vacío que es cargada con un gas como el helio o el neón.

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La muestra se congela y se aplica voltaje positivo; los átomos del gas se ionizan y el material provoca una magnetización que repele los iones, los cuales chocan sobre un detector que recoge la información, obteniéndose así una imagen de alta definición por los iones gaseosos rechazados.

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Análisis de átomos, nanomateriales y elaboración de microsondas para microscopios de barrido con sondas.

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Obtención de imágenes muy nítidas a escala atómica.

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Gracias por su atención. RIAG