1. INTRODUCCIÓN
El ser humano posee el sentido de la vista desarrollado. Sin embargo, no se pued pueden en ve verr a simp simple le vist vista a cosa cosas s que que mida midan n me meno nos s de un una a déci décima ma de milímetro. Y muchos de los avances en química, biología y medicina no se hubieran logrado si antes no se hubiera inventado el microscopio. En su afán de llegar siempre más lejos en la investigación de la naturaleza, naturaleza, de lo que los límites de sus órganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no podían penetrar. Así como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos mundos de dimension dimensiones es ínfimas, entre ellos la célula, célula, base de la vida. Se contaban así las bases de las modernas ciencias biológicas que hasta bien entrada la edad moderna se habían fundado en las observaciones directas. directas. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibirían.
1. MICROSCOPIA Y DESARROLLO HISTÓRICO DEL MICROSCOPIO 1.1. Microscopia La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la microscopía se evidencia los grandes aportes que la física ha hecho a la biología. Deriva del griego (micro- pekeño, scopen-ver) El microscopio se define como todo instrumento q permite aumentar la imagen de un objeto pequeño. Consta de un sistema de iluminación que nos permite visualizar el objeto y un sistema de lentes que nos permite aumentar el tamaño del objeto. Cuando un observador se acerca a un objeto el ángulo visual aumenta y el objeto parece ser mayor. Por debajo de una distancia de 20 cm. perdemos claridad por la deformación que sufre el cristalino para intentar adaptarse a ese ángulo. De aquí se saca la conclusión de que colocando una lente entre el ojo y el objeto que mantenga o aumente el ángulo, el objeto podrá ser observado con claridad.
1.2 Desarrollo histórico del microscopio desde sus inicios El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo Galilei, según los italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses. En 1628 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia. En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas. Unos años más tarde, Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio. A mediados del siglo XVII un holandés, Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, las bacterias y los protozoos; examinó por primera vez los glóbulos
rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres. Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler . En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes. Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o 1000X. Sin embargo, existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.). El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).
1.3 Primera persona en observar microorganismos y células reproductoras con el uso del microscopio Los primeros microorganismos se observaron hace 300 años y sin embargo pasaron unos 200 años hasta que se reconoció su importancia. Anthony Van Leeuwenhork . Se tenían teorías acerca de la existencia y posibles formas de algunos microorganismos, sin embargo este fabricante de lentes creador del microscopio (1676) fue el primero en observar microorganismos y materia microscópica, que según sus dibujos y descripciones, podrían tratarse de protozoos y bacterias. Esto encendió el interés por el mundo microscópico. El comerciante holandés, Antón van Leeuwenhork usaba lentes simples de pequeños trozos de cristal perfecto. Puliéndolos cuidadosamente, logró aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez. Tenía 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de roca y hasta de diamante, en algunos casos no eran mayores que el tamaño de un alfiler, por lo que sus microscopios tenían un tamaño diminuto comparados con otros de la misma época. Con esas lentes observaba todo lo que podía y logró describir los glóbulos rojos de la sangre y los capilares con mayor detalle. Fue el primero en ver a lo que más tarde se llamarían bacterias y a los protozoarios, que él denominó “animalículos”. En esta misma época, Anton
van Leeuwenhoek construyó su microscopio óptico rudimentario y observó muestras de agua, en las cuales vió protozoos y algas unicelulares. Van Leeuwenhoek también observó los glóbulos rojos de la sangre y los espermatozoides humanos (aunque no se cuenta de donde obtuvo la muestra).
Por tanto A van Leeuwenhoek fué el primero en observar células vivas, aunque pocos años antes R Hooke había visto la estructura del corcho y acuñó la palabra célula.
1.4. Primer constructor del microscopio compuesto El microscopio compuesto, que se ha hecho de uso general a partir de mediados del siglo XIX y que fue de importancia crucial para la evolución de la microbiología como ciencia, es todavía, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigación microbiológica rutinaria. El microscopio compuesto es el microscopio más utilizado en la ciencia, el trabajo y el hobby. Consiste en dos partes ópticas: lentes oculares (el que está próximo a tus ojos) y los lentes objetivos (el que está posicionado cerca de la prueba observada). El microscopio compuesto fue introducido por inventor holandés Zacarías Janssen (el también es conocido por inventar el telescopio). Su aparato sofisticado para el año 1590, llevaba a cabo dos tareas: para ver estrellas y pequeños objetos. El instrumento se convirtió en una invención del primer microscopio compuesto y un telescopio al mismo tiempo. Este tipo de microscopio está formado básicamente por una parte mecánica y una parte óptica y es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente en el formato de lupa. •
Un microscopio compuesto es un microscopio óptico que tiene más de una lente de objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista.
1.5. Graficar un microscopio compuesto con sus partes y definir cada una de ellas.
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Sistema óptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la o imagen de ésta. se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos o sobre la preparación. está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, o
quedando la cara superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación). DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el o condensador. El condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. o
Sistema mecánico •
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El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular. La columna o brazo: llamada también asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante una charnela, permitiendo la inclinación del tubo para mejorar la captación de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. El tubo: tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares y en el extremo inferior el revólver de objetivos. El tubo se encuentra unido a la parte superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. El tornillo macrométrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación. El tornillo micrométrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. La platina: es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje óptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Las pinzas: son dos piezas metálicas que sirven para sujetar la preparación. Se encuentran en la platina. Carro móvil: es un dispositivo que consta de dos tornillos y está colocado sobre la platina, que permite deslizar la preparación con movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda. El revólver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el
eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, lo que se nota por el ruido de un piñón que lo fija.
1.6. Procedimiento para realizar una observación utilizando un microscopio. Para realizar una observación a través de los microscopios debe de seguir unos pasos para que así tenga un resultado óptimo. Lo primero que debería tener en cuenta es que el objeto o muestra a observar por los microscopios sea sometido a un proceso para destacar algunas de las partes que le interese observar especialmente. Se debe de conservar la muestra u objeto para realizar observaciones posteriores. Las dos fases de este proceso son: la de fijación y la tinción. La fijación consiste en que la muestra que deseamos observar no se mueva y para ello se utilizan diferentes sustancias líquidas o temperaturas elevadas para que la muestra se deshidrate, y posteriormente debe lavarse en un medio apropiado para poder realizar la observación. En cuanto a la tinción se trata de colorear la muestra que deseamos observar a través de los microscopios, para así destacar las partes que nos interesan. Para realizar esta tinción la gama de colores es muy amplia, y cada uno de ellos destaca una parte diferente de la muestra, por ejemplo si la muestra que tenemos para observar a través de los microscopios es una célula, la tinción que deberíamos de utilizar para la observación del núcleo de la célula sería la fucsina básica, el verde metilo. Si queremos observar el citoplasma de la misma se utilizaría la fucsina ácida, el verde luz o la eosina, etc.
1.7. Procedimiento para realizar un montaje o preparación microscópica Una vez que ya tiene preparada las muestras para observarlas a través de los microscopios, debería de colocarlas en un vidrio transparente (portaobjetos) y la cubrimos con otro vidrio transparente más fino (cubreobjetos). Las muestras se pondrían en los microscopios para realizar la observación. Para obtener una imagen aumentada de las muestras en los microscopios debe de tener en cuenta que para obtener el aumento deseado debe de combinar los objetivos con el ocular. Posteriormente para enfocar las muestras debe de realizarlo con el tornillo macrométrico y después con el tornillo micrométrico para afinar el enfoque y así obtendremos una visión perfecta de las muestras. Cuando las muestras ya estén perfectamente enfocadas se van cambiando los objetivos hasta encontrar el aumento que necesitamos. Y ya para tener una observación perfecta la fuente de luz que tienen los microscopios, la pueden regular con el diafragma hasta tener la iluminación adecuada para la observación. Antes de observar la preparación al microscopio, esta debe de ser montada sobre vidrio. Para ello existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos (porta), que, como su nombre indica, es el soporte sobre el que va la muestra, y cubreobjetos (cubre) que siempre ha de colocarse sobre la muestra. Una vez colocada la muestra en el porta, se debe añadir una gota
de agua, o de la solución acuosa pertinente, antes de colocar el cubre, para evitar interfases agua-aire, que provocan zonas ciegas. Para enfocar la preparación se ha de seguir de forma minuciosa el protocolo. Consejos prácticos En los microscopios que requieren transformador, el enchufe a la red y desenchufe debe hacerse sobre el transformador, y nunca debe desenchufarse el microscopio del transformador. Se debe mantener apagada la luz del microscopio siempre que no se esté utilizando, ya que la vida media de la bombilla es corta. Siempre se debe comenzar el enfoque con el objetivo de menor aumento. Anotar siempre el número de aumentos con el que se observa la preparación. Para calcularlo basta multiplicar el número de aumentos del objetivo por el de los oculares. Hacer esquemas y dibujos de lo observado con cada aumento. Salvo que se indique lo contrario no utilizar nunca el objetivo de inmersión, ya que se requiere un aceite especial sin el que, además de no enfocar bien, existe una gran probabilidad de dañar la lente al rozar con el cubreobjetos. Una vez enfocada, procurar recorrer, con los tornillos de la platina, toda la preparación -
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1.8. Clases de Microscopios. Definir cada uno de ellos Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes. Hay varios tipos de microscopios disponibles en el mercado. Seleccionar un tipo adecuado no es una tarea simple, ya que tienes la necesidad de determinar para qué fin será utilizado exactamente. •
El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser monocular, y consta de un solo tubo. La observación en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos ojos. Esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.
Microscopio compuesto
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Microscopio estereoscópico: el microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio.
Microscopio Estereoscopico
Un microscopio digital tiene una cámara CCD adjunta y esta conectada a un LCD, o a una pantalla de computadora. Un microscopio digital usualmente no tiene ocular para ver los objetos directamente. El tipo triocular de los microscopios digitales tienen la posibilidad de montar una cámara, que será un microscopio USB. •
Microscopio Digital
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Microscopio de campo oscuro . Este microscopio está provisto de un condensador paraboloide, que hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo oscuro.
Microscopio de campo oscuro
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Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio.
Microscopio de fluorescencia •
Microscopio de contraste de fases. Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación.
Microscopio de contraste de fases Un microscopio electrónico es uno de los más avanzados e importantes tipos de microscopios con la capacidad más alta de magnificación. En los microscopios de electrones los electrones son utilizados para iluminar las partículas más pequeñas. El microscopio de electrón es una herramienta mucho más poderosa en comparación a los comúnmente utilizados microscopios livianos. •
Microscopio Electrónico
1.9. Para que se realizan la tinciones Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en estas tinciones se observamorfología, estructura y agrupamientos de microorganismos. El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
1.10. Diferencia entre tinción simple y diferencial. Escriba tres ejemplos de cada una.
Tinción Simple: utiliza un solo colorante Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). La tinción simple es una tinción sencilla en la cual la bacteria es teñida con un solo reactivo. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. Ejemplo: Un ejemplo de uso de tincion simple esta cuando quieres ver levaduras y diferenciar las vivas de las muertas. Las levaduras muertas se tiñen en su interior y se ven con el mismo color del tinte que aplicaste. Las levaduras vivas no se tiñen por dentro.
Tinción diferencial : Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. (Tinción de Gram, Coloración de ácido resistencia). Es aquella donde usas mas de un (1) colorante. Con esta tincion tu vas a poder ver morfologia, tamaño, organizacion de las bacterias y ademas categorizar los microorganismos en varios grupos, segun su afinidad con el colorante que tu estas utilizando Ejemplo: Hay varios tipos de tincion diferencial pero las que uno mas usa son la TINCION DE GRAM O COLORACION DE GRAM y la COLORACION DE ZIEHL NEELSEN. Con la TINCION DE GRAM tú puedes diferencias las bacterias en dos grupos: BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS. Eso va a depender de si retienen o no el colorante CRISTAL VIOLETA o el colorante SAFRANINA. La capacidad que tengan de retener un colorante o no va a depender de la composicion de la pared celular de la bacteria. Las GRAM POSITIVAS cuando realizar el procedimiento de tincion de gram, puede ver que luego de añadir lugol, el colorante cristal violeta se mantiene en el interior de la bacteria. Las GRAM NEGATIVAS al añadir lugol pierden la coloracion del cristal violeta y si le añades otro colorante, por ejemplo la safranina, adoptaran ese color.
