Universidad Andrés Bello Facultad de ciencias Laboratorio de biología celular 133 Profesores: Luciana Oliveira Cruz Joselin Sofía Jerez Ortega
TRABAJO PRÁCTICO N°4:
Microscopía II BIO133-2
Autores:
Juan Pablo Duarte Martín Quezada Fernanda Arredondo
- 05-05-2011 -
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INTRODUCCION La microcopia microcopia de campo oscuro se utiliza habitualmente habitualmente para el análisis de elementos biológicos transparentes transparentes o sin pigmentación alguna, alguna, nos permitirá permitirá observar detalles en la superficie de las muestras analizadas. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por la estructura de la muestra por consecuenciaobservaremos consecuenciaobservaremos detrás de la muestra en análisis un fondo completamente completamente oscuro sobre el cual segmentos de la muestra emitirán pequeñas partículas brillantes que reflejan la luz del foco hacia el objetivo. Es como una habitación completamente oscura en la cual si llegase a entra un pequeño rayo de luz podremos ver partículas de polvo flotando en el aire. Lo que en un momento era invisible se volverá visible mediante mediante el haz de luz. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje porcentaje de éstas, ocuparemos ocuparemos una cámara cámara de Neubauer, normalmente normalmente utilizada para realizar un conteo celular en microscopia de campo claro o de contraste de fases,es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm.
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Objetivos El propósito de este laboratorio es poder analizar una muestra por medio de la microscopia de campo oscuro, donde apreciaremos en nuestros objetivos la luz que reflejara la muestra y detalles detalles que solo podremos ver por por medio de esta técnica técnica de microscopia. Por otro lado realizaremos un recuento de células, de una muestra de sangre humana diluida 1000 veces. Para esto utilizaremos la cámara de Neubauer Neubauer (ocupada para el contaje de células), material que aportara una cifra exacta a lo requerido. Y por último trataremos de medir el tamaño de las células de la muestra. Para lograr nuestro propósito ocuparemos ocuparemos una reglilla en el ocular de nuestro microscopio, la cual después de ser calibrada, nos ayudara a determinar el tamaño de los leucocitos.
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Materiales y métodos El material principal a utilizar es el microscopio óptico el que servirá para la observación de las muestras. En la primera muestra se visualizara un pelo humano en el que su objetivo será identificarlo en dos campos diferentes, la primera es analizarlo me diante el microscopio de manera normal con el foco de luz despejado, y la segunda habrá un cambio en el foco de luz ya que se le incorporara en la superficie un cartón oscuro dejando un pequeño espacio en sus costados para dejar una baja intensidad de luz hacia el objetivo (en este caso el pelo). Otro material que se ocupo para analizar fue la reglil la con la función de calibrar la medición de los glóbulos blancos de un frotis de sangre, esta reglilla presentaba diferentes mediciones (0.05 mm; 0.01 mm) marcadas con las que se podía obtener un dato aproximado del tamaño de las células, todo esto con la ayuda del microscopio óptico. La última muestra analizada fue sangre humana en el que se necesitaba contabilizar las glóbulos rojos, para esto se ocupo la Cámara de Neubauer que se adapta al microscopio con contraste claro, esta cámara está marcada con una pequeña depresión en el centro formando diminutas cuadriculas. La gota de sangre fue colocada en esta depresión que estaba cubierta por un portaobjetos donde esta comenzó a deslizarse, luego se debe esperar un cierto lapsus de tiempo para que sedimenten las células. Así mediante un microscopio los glóbulos rojos son observados y contabilizados donde se tendrá que utilizar una fórmula para saber el contenido de glóbulos rojos en 1mL. Las principales muestras y materiales utilizadas en este laboratorio fueron: -
Microscopio óptico
-
Reglilla calibrada
-
Cámara de Neubauer
-
Pelo humano
-
Sangre humana
-
Frotis de sangre
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Actividad practica A. Observación de un cabello La observación del pelo con objetivo 10X en campo claro se puede ver una franja marrón, plana, sin ningún detalle a distinguir. En cambio, en la observación con objetivo 10X, a la misma muestra de cabello, con campo oscuro, se aprecia una franja marrón tridimensional destacando los bordes, se nota la forma cilíndrica del pelo.
Fig. 1 Pelo con objetivo 10X en campo claro claro Fig. 2 Cabello con objetivo 10X en campo campo oscuro B.
Reglilla
Fig. 2 Reglilla con objetivo 10X
Utilizamos una reglilla calibrada para calibrar la reglilla ocular La medición de un glóbulo blanco, al ponerlo al m icroscopio y medirlo con la reglilla, su radio era de aproximadamente 0,01mm [fig. 3].
Fig. 3 Un leucocito medido por un dibujo
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C. Determinación del numero de células
Fig. 5 Cámara de Neubauer. Los cinco cuadrados del centro, es el área donde se cuentan los eritrocitos. Las áreas de las esquinas es donde se cuentan los glóbulos blancos.
Contamos 23 eritrocitos en un cuadrado cuadrado de 0,2 mm x 0,2 mm. Con esto y sabiendo los datos de los cuadrados de la cámara y su profundidad se calcula la cantidad de eritrocitos 3
en 1mm de disolución. Eritrocitos = 23 Volumen del cuadrado = 1/4000 mm
3
3
N° de eritrocitos por cada mm = Eritrocitos contados N° de cuadrados pequeños x Volumen del cuadrado x disolución 3
3
N° de eritrocitos por cada mm = 23 x 4000 mm x 1000 = 5.750.000 eritrocitos/ mm 16
3
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Discusión Es posible convertir un microscopio de campo oscuro a uno de campo claro. La observación a través del microscopio de campo oscuro hace que las porciones transparente de la muestra se vean oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven más brillantes. La observación del cabello con campo oscuro a objetivo 10X resalta los detalles de la superficie del pelo y se aprecia la forma cilíndrica de este, en cambio, en uno de campo claro solo se aprecia una figura plana.
Los leucocitos son células que se encuentran en la sangre, representes hemáticos de la serie blanca, y efectores celulares de la respuesta inmunitaria. Estos no tienen pigmentos por eso su color blanco, tienen núcleo, son capaces de moverse libremente mediante seudópodos y su tamaño oscila entre 8 y 20 μm. Su clasificación: leucocitos mononucleares y leucocitos. La medición de un glóbulo blanco en el laboratorio, con un microscopio con objetivo 10X y con una reglil la calibradora fue de 0,01 mm, lo que tamaño es de 8 a 15μm, corresponde 10μm. Por tamaño puede ser un linfocito, cuyo tamaño un basófilo, el cual mide 10μm o un Eosinófilo que mide de 10 a 12μm.
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1mm, el cual, consta de 25 cuadrados de 0,2 mm x 0,2 mm. Muy importante es recordar que los eritrocitos que quedan en la mitad de las líneas inferior y/o de la derecha no son contabilizados. El conteo de eritrocitos en varones es de 5 a 5.5 3
millones y en las mujeres de 4.5 a 5 millones por mm . Los resultados arrojaron 23 3
células por cuadrado de 0,2 mm, lo que corresponde a 5.750.000 eri/mm de sangre (sin diluir), la muestra no está dentro del rango superior, que es el de varones pero no se aleja mucho, probablemente se deba al mal conteo de eritrocitos o por error de disolución de la muestra de sangre. En un principio la muestra fue diluida en 1:10, pero eran muchas células, así que se diluyo en 1:1.000, pero aún así fue diluida en 1:10.000 mas no funcionó, de tal forma que la disolución usada fue de 1:1.000. Lo más probable es que todo este proceso de prueba de diluciones haya generado un error que afectó al resultado de conteo de eritrocitos en la cámara de Neubauer.
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Bibliografía http://es.wikipedia.org/wiki/Linfocitos http://es.wikipedia.org/wiki/Monocitos http://es.wikipedia.org/wiki/Neutrofilos http://es.wikipedia.org/wiki/Basofilos http://es.wikipedia.org/wiki/Eosin%C3%B3filos http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_campo_oscuro http://migueldegetaupbl.blogspot.com/2008_02_01_archive.html http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1mara_de_Neubauer http://bioservice77.obolog.com/camara-neubauer-100991