UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE CIENCIAS METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS, PROTEINAS Y LIPIDOS
DOCENTE: Dr. Biol. Microbio. Carlos Azañero Díaz
CURSO: Microbiología
ALUMNOS:
I.
INTRODUCCION La característica más importante de los carbohidratos es la propiedad de crecer. Eventualmente la célula se divide, y esa división significa duplicación ordenada de todos los elementos celulares, esta duplicación garantiza la transmisión de las características de una generación a otra. Para realizar un trabajo químico tan complicado los microorganismos necesitan captar del exterior sustancias químicas como los carbohidratos, proteínas, lípidos, etc., que necesariamente deben ser incorporadas a los medios de cultivos. Como fuente de carbono los microorganismos pueden utilizar monosacáridos como glucosa, disacáridos como sacarosa, maltosa, etc. Y polisacáridos como almidón celulosa, etc. La capacidad de utilizar o no un determinado sustrato dependen de la presencia o no de las enzimas específicas que están gobernadas genéticamente. La glucosa La glucosa es un monosacárido que es utilizado por la mayoría de microorganismos, cuando es incorporado a un medio de cultivo puede ser metabolizado por diferentes vías metabólicas y derivar fácilmente en la producción de ácido/gas. La formación de ácido se puede evidenciar adicionando al medio un indicador de pH como el rojo de fenol que en alcalinidad es rojo y en acidez es amarillo. La observación de gas puede ser observada mediante la acumulación de gas en tubos invertidos (campana de Durham) que son incorporados en los tubos con medio glucosado. El almidón El almidón es un polímero de glucosa y es usado como fuente de carbono por aquellos microorganismos que tienen capacidad de hidrolizarlos en sustancias simples y asimilables. Esta capacidad está gobernada genéticamente por la síntesis o no de amilasas que son enzimas producidas por ciertos microbios cuando crecen en presencia de almidón. Los microorganismos que producen amilasas y por consiguiente hidrolizan el almidón (almidón negativo) y la aparición de zonas claras indica la ausencia de almidón (almidón positivo)
II.
OBJETIDOS Demostrar la degradación de la glucosa en forma aeróbica, anaeróbica y por fermentación. Determinar la hidrolisis de almidón, gelatina, urea y lecitina. Por microorganismos. Enumerar el método y tipo de microorganismos que degradan y/o utilizan la glucosa, el almidón, la gelatina, la urea y lecitina. Afianzar las destrezas en la siembra por puntura en medio sólido.
III.
MATERIALES Y METODOS
a.
Material Material biológico: Escherichia coli, Pseudomonas sp, proteus sp, bacillus sp.
Medio de cultivo: Caldo de glucosa rojo fenol
Agar almidón Medio gelatina
Agar casein Agar urea Material de vidrio:
Lámina portaobjetos Campana de Durham+Placas petri Tubos de ensayo 13x100mm
Otros:
b.
Lugo
Asa bacteriológica
Procedimiento A. Degradación de la glucosa A tres tubos conteniendo solo glucosado colocar una campana de Durham invertida y sembrar por separado E. coli, Pseudomonas sp y Proteus sp. Incubar a 37 °C por 24 horas. Observar la degradación de la glucosa con la formación de ácido, mediante el viraje a amarillo del indicador rojo de fenol. Observar la degradación de la glucosa con la formación de un gas mediante la acumulación de un gas en la campana de Durham. Anotar los resultados.
B. Degradación del almidón A tres tubos conteniendo Agar almidón sembrar por puntura Bacillus sp. Incubar a 37 °C por 48 horas. Cumplido el tiempo de incubación, adicionar lugol a las placas. Dejar reposar unos minutos Observar resultados y anotar. Degradación de la glucosa
Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos.
A tres tubos conteniendo caldo glucosado colocar una campana de Durham invertida y sembrar por separado E. coli, Pseudomona sp y Proteus sp., quitar el tapón del tubo, flamear la boca e introducir el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el c entro del tubo. Incubar a 37 °C por 24 horas Observar la degradación con la formación de ácido, mediante viraje a amarillo de indicador rojo fenol.
Prueba positiva (+): color amarillo Prueba negativa (-): color rojo
Prueba positiva (+): Burbujas en la campana de Durham Prueba negativa (-): Sin burbujas
Observamos la degradación de la glucosa con formación de gas mediante la acumulación de gas en la campana de Durham. Degradación del almidón
Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. A los tres tubos conteniendo agar almidón sembrar por puntura Bacillus sp,
Incubar a 37 °C por 48 horas.
Cumplido el tiempo de incubación, adicionar lugol a las placas.
IV.
RESULTADOS: A. METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS A.1. Metabolismo oxidativo fermentativo
Caldo glucosa, rojo fenol; muestra de e.coli; siembra por suspension
El aceite no ha reducido
El aceite ha desaparecido, esto se debe al poder oxidativo de las Bacterias aerobicas
Caldo glucosa, rojo fenol; muestra de bacillus sp; siembra por suspension
La muestra casi no presenta cambio, el aceite no ha reducido
La muestra presenta una reduccion de aceite
A.2. Hidrolisis de almidón
Agar almidon, siembra por puntura; a 37°C durante 24 h
B. HIDROLISIS DE NITROGENO B.1. Acción sobre la gelatina
Medio gelatina, siembra por picadura: a 37°C durante 48h
Se observa un, cambio de color, la parte superior un poco celeste y amarillento la arte inferior
La muestra esta turbia
B.2. Hidrolisis de caseína Se observa un halo transparente , esto nos indica la dehidrolisis de la caseina
B.3. Acción sobre la urea
Agar Urea, siembra masiva en superficie. Oncuvacion a 37°C durante 24h
Se puede observar pequeñas burbujas en el
En la muestra de pseudomonas se puede observar un color morado observar un color morado
Se observa dos faces decolorativas .
En la Fase de control no ocurre nada.
C. HIDROLISIS DE LIPIDOS
Pseudomona, se observa un color verdusco un alo Bacillus, le rodea una parte transparente E. coli, de coloor blanco espeso
V.
DISCUSIONES
PRINCIPIOS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO. Evelyn Rodriguez Caballin Página 195: Hidrólisis del almidón El almidón es un homopolisacárido de glucosa, cuyos componentes son la amilosa línea y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa1-4, liberan maltosa e isomaltosa, que ingresan a la célula y pueden metabolizarse. Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidón forma un complejo de color azul con el yodo. Las cadenas de amilopectina solo dan un color café rojizo. METABOLISMO GENERAL PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL almidón hidrolizado no da ninguna coloración. Por lo tanto la ausencia del color azul indica que el almidón ha sido hidrolizado. • MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA Y MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS. Luis Roberto Alarcón. Página 36 - 37 Hidrólisis de la gelatina La gelatina es una proteína fibrosa que se obtiene al hervir huecos, cartílago y otros tejidos conectivos que al enfriarse forman gel. Ciertos microorganismos tienen habilidad para romper la molécula mediante la exoenzima gelatinasa, liberando aminoácidos que se usan como nutrientes. La gelatina hidrolizada se vuelve líquida. Hidrólisis de la urea La urea o carbamida es una diamida que se degrada por medio de una amidasa llamada ureasa. Se rompe el enlace del nitrógeno con el carbono, con liberación de amoniaco y CO2. El medio con urea es adicionado un indicador de pH (rojo de fenol). El amoniaco libre alcaliniza el pH y el indicador vira a color violeta. MICROBIOLOGÍA CLÍNICA PRÁCTICA. Pedro García Martos, Fernando Paredes Salido, María Teresa Fernández del Barrio. Página 117: Metabolismo de Lípidos Los lípidos no constituyen cuantitativamente un elemento nutritivo de importancia para las bacterias; sólo unas pocas especies pueden metabolizar algunos de ellos por contener lipasas, lectinasas u otras enzimas. Investigación de lipasas: Se lleva a cabo por cultivo sobre agar enriquecido. La
existencia de lipasa se traduce por la aparición de un halo opaco alrededor de las colonias, a causa de la precipitación de los ácidos grasos. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DE LOS MICROORGANISMO. METABOLISMO GENERAL PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL VII. CONCLUSIONES • Se evidencio el desarrollo de diferentes microorganismos en diferentes sustratos. • Los microorganismos pueden degradar a casi todo tipo de sustancias orgánicas o inorgánicas, también en su manera de actuar y bajo qué condiciones estrictas (aerobias, anaerobias, etc.). • Se llego a entender cómo actúan los mecanismos de estos microorganismos que se valen de enzimas para degradar el sustrato presente en el exterior para así poder absorberlos y realizar sus distintas vías metabólicas necesarias para su supervivencia. VIII. CUESTIONARIO 1. ¿Qué importancia tiene la acción degradativa de un determinado sustrato por parte de un determinado microorganismo? Las bacterias actúan sobre las proteínas, glúcidos y lípidos (moléculas voluminosas) para convertirlas en fragmentos más pequeños y así puedan penetrar a través de la membrana citoplasmática, mediante la participación de exoenzimas. Por ejemplo: • Los microorganismos disponen de carbohidratos en forma de polímeros, la celulosa y el almidón, siendo sus enzimas de tipo extracelular la celulasa y amilasa respectivamente, las que son secretadas a través de la pared celular. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DE LOS MICROORGANISMO. METABOLISMO GENERAL PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL degradadas hasta unidades (maltosa, glucosa) que puedan penetrar a la célula con facilidad. • La acción degradativa de un organismo sobre una proteína, por ejemplo la gelatina es debido a la enzima gelatinasa quien logra producir unidades de aminoácidos. • Por otro lado, muchos microorganismos degradan grasa y aceites (lipólisis) y obtener un acetato para el metabolismo de carbohidratos y la síntesis de aminoácidos. “Los tres procesos metabólicos que parecen independientes, relacionados con los carbohidratos, proteínas y lípidos, en realidad están muy relacionados entre sí. Los tres pueden suplir compuestos activos dentro del ciclo de Krebs, proporcionando energía para la síntesis y proveyendo unidades estructurales para componentes celulares” 2. Mencione cual es la razón de añadir indicadores acido – base a algunos medios de cultivo. Ejemplos. Indicadores ácido-base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones de pH. Por ejemplo: Fermentación de la glucosa: el cambio de color de rojo a amarillo indica formación de ácidos a partir de la degradación de la glucosa, lo cual hace virar el indicador de ph contenido en el medio. La formación de gas se observa dentro de la campana de Dirham en el tubo de ensayo. Hidrólisis de la urea: Los gérmenes que forman la enzima ureasa utiliza la urea dando como resultado la formación de amoniaco que alcaliniza el medio y por presencia de un indicador de ph este vira a un color rojo. Este es un resultado positivo. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DE LOS MICROORGANISMO. METABOLISMO GENERAL PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL Esta técnica se puede realizar en tubos con medios inclinados o no inclinados y suele usarse para determinar la movilidad de los microorganismos. Se hace regularmente con el asa de siembra en punta. Siembra por estría en superficie masiva: Realizada mayormente en tubos inclinados con pico de flauta
extendiendo a los microorganismos sobre toda la superficie para ver su efecto de degradación sobre el sustrato utilizado. 4. Describa el fundamento de cada uno de los resultados obtenidos en cada uno de los procedimientos por medio de un cuadro sinóptico o mapa conceptual HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. VI.
VII.
CONCLUSIONES Se demostró la degradación de la glucosa en forma aeróbica, anaeróbica y por fermentación. Se determino la hidrolisis de almidón, gelatina, urea y lecitina. Por microorganismos. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
http://www.slideshare.net/breid/pruebas-bioqumicas-y-medios-de-cultivo-en-bacterias• http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismos.shtml http://www.monografias.com/trabajos14/bacterias/bacterias.shtml. http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html. VIII. 1. 2.
PREGUNTAS Y/O TAREAS ¿Cuantos ATP obtendría un microbio que degrada tributirina? ¿Sería el mismo número si usa glicerina? ¿Qué relación existe entre una prueba de catalasa y la utilización del oxígeno atmosférico? La catalasa es una enzima lo posee la mayoría de las bacterias aeróbicas, la prueba y la
prueba de la descompone el peróxido de hidrógeno en agua del oxígeno y el oxígeno atmosférico es compuesto por un 78% de nitrógeno y un 21% de oxígeno y un 1%5 que ocupa otros gases nobles y sin la enzima catalasa es responsable del oxígeno 3.
atmosférico. Mencione dos géneros de bacterias y dos fúngicos que poseen alfa amilasa y beta amilasa. En el genero bacteriano tenemos a: B.stearothermophilus y B. subtilis . Entre los fúngicos tenemos a: Aspergillus niger y Aspergillus orizae
4. 5. 6.
Describa el proceso bioquímico por el cual el almidón, caseína y tributirina son hidrolizados hasta sus monómeros. ¿Cómo explicarías el crecimiento (si se llegara a observarse) de E. coli en las placas de agar almidón? ¿Su fuente carbonada lo obtiene del almidón? ¿Qué ventajas metabólicas obtienen los microorganismos que crecen; tanto en aerobiosis, como en anaerobiosis?
