Práctico N°6 - Metabolismo de carbohidratos

Universidad Santo Tomás Departamento de Ciencias Básicas Laboratorio de Bioquímica Semana del 26 de Mayo al 6 de Junio del 2014.-

PRÁCTICO N°6 Metabolismo de Carbohidratos. OBJETIVOS • Observar experimentalmente el proceso de metabolismo anaeróbico anaeróbico de fermentación. fe rmentación. • Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis.

INTRODUCCIÓN Todos los seres vivos requieren un continuo aporte de nutrientes para suplir sus necesidades de materia y energía. El principal nutriente de la célula es la glucosa, la que es catabolizada para producir ATP, la forma más importante de energía energía utilizable en en la célula. El metabolismo aeróbico de la glucosa glucosa ocurre a través de una serie de reacciones: Glicólisis:

Glu Glu cos cos a

Piruvato vato  ATP ATP  NADH NADH  Piru

Descarboxilación oxidativa del piruvato: Ciclo de Krebs:

Ace Aceti tilC lCoA oA

Piru Piruvat vato o

Aceti tilC lCoA oA  CO2  NADH NADH  Ace

NADH  FA FADH 2  ATP ATP  CO2  NADH

Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa:

NADH NADH  FA FADH 2

ATP  H 2 O  O2  ATP

En ausencia o deficiencia de oxígeno, ocurre el proceso anaeróbico de fermentación, en que el piruvato (producto de la glicólisis) se transforma en acido láctico (músculo) o etanol (levaduras y bacterias). Fermentación Fermentación láctica:

Piru Piruvato vato  NADH NADH  Lacta Lactato to  NAD NAD

Fermentación alcohólica:



Piru Piruvato vato  NADH NADH  E  anol  NAD NAD



 CO2

En presencia de suficiente oxígeno ocurre respiración celular aeróbica , en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil-CoA, el cual a través del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial donde son reoxidados por O 2, y que consecuentemente mediante fosforilación oxidativa producen ATP. Esta vía aeróbica es la principal vía de producción de ATP. En cambio, algunas células como los glóbulos rojos y las bacterias anaeróbicas estrictas tienen en el metabolismo anaeróbico la única vía de producción de ATP, en tanto que otras células como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O 2 realizan fermentación y en presencia de él, realizan respiración celular.

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ACTIVIDADES A. Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae). La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción: C 6 H 12O6



2 C 2 H 5 OH  2 CO2

El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentación por la producción de CO 2. Procedimiento. Soluciones y materiales:    

Solución de levadura 10%(p/v) a 43°C Solución de glucosa 10% (p/v) a 43°C Solución de NaF 0,1 M Solución rojo neutro 0,01 M



Agua destilada a 43°C



Papel pH y papel parafilm 4 tubos de ensayo

 

Baño termorregulado a 43°C

1. Prepare la siguiente batería de tubos: TUBOS Suspensión de levaduras Solución de Glucosa Solución de NaF Agua destilada Solución rojo neutro

1 1mL

2 1mL 1mL

2mL

1mL

3 1mL 1mL 1mL

4 1mL 1mL

1mL

2. Agite por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo. 3. Tape cada tubo herméticamente con papel parafilm. Marque el nivel de la solución en cada tubo y amarre con un elástico los 4 tubos. Incube en un baño termorregulado a 43°C. 4. Al cabo de 30 minutos marque el nivel final de la solución en cada tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua. 5. Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.

6. Anote y discuta sus resultados. ¿Qué debería ocurrir en cada tubo?

7. Busque y anote la estructura de la glucosa y determine sus características. 8. Investigue para qué se utiliza el NaF y la solución rojo neutro en esta actividad. 9. Investigue qué sucede con el CO 2 cuando pasa a la fase acuosa.

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B. Velocidad de Fermentación. Soluciones y materiales:  Solución de levadura 10%(p/v)  Solución de glucosa 10% (p/v)  Solución de sacarosa 10% (p/v)  Solución de azul de bromotimol  Agua destilada  Cronómetro 

Baño termorregulado a 43°C



Trozo de manguera flexible Papel parafilm. Dos tubos de ensayo

 

1.- Tomar dos tubos de ensayo. En el primer tubo adicionar 5 ml de sacarosa al 10% y 1 ml de cultivo de levaduras al 10%; y en el segundo tubo adicionar 1ml de Azul de Bromotimol diluido en 4 ml de agua destilada. Sumergir ambos tubos en baño a 43ºC. 2.- Conectar ambos tubos de ensayo con una manguera flexible, teniendo la precaución de dejar la manguera sumergida en la solución de Azul Bromotimol. Sellar bien cada tubo con Parafilm para evitar la fuga de gas. 3.- Cuando comience la reacción de fermentación, el producto gaseoso burbujeará en la solución indicadora, por lo que Azul de Bromotimol, cambiará a un color amarillo-ocre. 4.- Tomar el tiempo que demora el azul de bromotimol en que cambie su color original a amarillo ocre, considerando que la reacción comienza inmediatamente después de colocar tubos en baño termorregulado a 43°C y sellar ambos tubos. 5.- En paralelo, otro grupo realice el mismo experimento cambiando la sacarosa por glucosa al 10%. 6.- Comparta los resultados obtenidos con sus compañeros y analice.

7.- Investigue por qué cambia el color de la solución de azul de bromotimol ¿cuál es la finalidad de esta solución en esta reacción?. ANEXO (revisar estas preguntas previo al práctico).

1.- Si en ambas experiencias experimentales está analizando el proceso de fermentación: a) Esquematice la reacción exacta del metabolismo anaeróbico realizado por la levadura (glicólisis y fermentación). b) ¿Cuál es la finalidad del proceso de fermentación?. c) ¿La fermentación corresponde a un proceso catabólico o anabólico?. Fundamente. d) Respecto a la actividad A: ¿cuál de todos los tubos analizados genera en forma adecuada fermentación y porqué?. e) Respecto a la actividad B: ¿cuál es la reacción más rápida de fermentación ya sea utilizando glucosa o sacarosa y porqué?. ESTE LABORATORIO SERÁ EVALUADO CON QUIZ DE ENTRADA (NOTA QUIZ) Y QUIZ DE SALIDA (equivalente a NOTA INFORME).

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Práctico N°6 - Metabolismo de carbohidratos

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