Lucia na de Gouvêa Viana
01
INTRODUÇÃO À MEDICINA LABORATORIAL
A MEDICINA LABORATORIAL NA PRÁTICA E ENSINO MÉDICOS
rologia, bacteriologia, m icologia). moniwramento de drogas rerapêuricas, laboratório forense, informática laborawrial. gestão laboramrial, entre oucras.
A Pawlogia Clínica, recentemente denominada
Nest e contexro, o pawlogisra clínico desempenha
Medicma Laborawrial. é uma especialidade médica
um papel voltado tanto para a relação com os mé-
que pode ser definida como a área que conduz e in-
dicos-assistentes, como consulcor, quanto atividades
terpreta restes laboracoriais, aplicando mewdologias
t écnicas e relativas à gestão laborarorial.
químicas, físicas, imunológicas, mo rfológicas, gené-
No Brasil, o médico parologista clínico passa por
ricas, encre oucras, em diversos materiais biológicos.
formação q ue inclui, além dos seis anos regu lamenta-
Os objecivos principais da especialidade na assistência
res do curso superior em Med1cina. mais crês anos de
à saúde são diagnosticar o u excluir doenças, definir
residência médica. credenciada pela Comissão Nacio-
marcadores prognósticos, acompan har as repercu s-
nal de Residência Médica, sendo um ano em clínica
sões terapêu ticas ou verificar a existência de fatores
médica e dois anos em laboratório clínico. O título
de risco para agravos à saúde humana.
de especialista pode ser obtido também po r médicos
A especialidade rem se cornada cada vez mais
atuantes em laboratórios clínicos a parrir de exame
complexa, em função da rápida evolução tecno lógica, a qual tem permitido o aprimoramento e diversifica-
ministrado anualmente pela Sociedade Brasileira de Parologia Clínica/Medicina Laborarorial- SBPC.
ção das mecodologias analíticas e dos instrumentos de
O mercado de trabalho para o parologista clínico
apoio na operac ionalização da assistência laborarorial.
se encontra principalmente em laborató rios de hospi-
A colaboração de o urros profissionais, além daqueles de formação médica, sempre ocorreu e é crescente,
tais, centros diagnósticos, clínicas especializadas com recursos laboramriais integrados e instituições de en-
cirando-se: farmacêuticos-bioquímicos, biomédicos,
si no e pesquisa. Ressalta-se que a Medicina Labora-
biólogos, químicos, entre outros. A s áreas específicas
rorial cresce cada vez mais no que se refere à impor-
de aruação, no contexm da Medicina Laborarorial,
tância científica e na sua utilização para a wmada de decisões m édicas, havendo quem aponte que o peso
abrangem diversas ram ificações e são, na prática, verdadeiras subespecialidades. Destaca m-se: bioquímica, genérica, hemarologia, imunologia, parasirologia,
das informações geradas pelo seror de diagnóstico chega a ser de até 70% nos processos cognitivos dos
microbiologia (esta, por sua vez, subdividida em vi -
médicos-assistentes.
A ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DO
LABORATÓRIO CLÍNICO A estrutura organizacional de um laboratório clínico deve concemplar as necessidades processuais das fases pré-analítica, analítica e pós-analítica, ramo no que diz respeico aos aspectos arquicecônicos, quamo em relação aos equipamencos, equipe técnica e tecnologia de informação. A planra física do laboratório deve acender às exigências legais para estabelecimentos de assistência à saúde. No Brasil, cal regulamencação é feita pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, por meio da Resolução de Direwria Colegiada RDC n° 50, de 21 de fevereiro de 2002, a qual dispõe sobre o Regulamento Técnico para planejamento, programação, elaboração e avaliação de projecos físicos de escabelecimencos assiscenciais de saúde. Deve-se enfatizar a necessidade de contemplar a minimização dos riscos para a equipe técnica e para o pacieme. A tendência acual é a consuução de plataformas laborawriais horizonralizadas e flexíveis (modulares) com o máximo de integração processual e mecodológica. Tal integração é tremendamente faci litada pela implantação de sistema de informatização laboracorial. Este tem papel crucial na otimização dos processos, a partir do momenco em que impõe alto grau de automação, interfaceamento entre as etapas do processo, segurança, rasrreabilidade e eliminação do retrabalho. Quando o laboratório está inserido em um contexto mulcidisciplinar, particularmente hospitalar, é fundamental a integração das informações geradas pela plataforma laboracorial com todo o aparato do serviço ao qual está vinculado. Tal eficiência na transmissão da informação relativa à assistência ao paciente interfere, positivamente, na resolutividade do caso e nos aspeccos gerenciais relacionados, tais como eficiência no facu ramento e na gestão de insumos. A existência de postos de coleta dissociados fisicamente da plataforma de processamento cria a necessidade de estru turação de logística segura e eficiente para o material biológico, garantindo adequados armazenamento e transporte. Para tal, existe legislação específica no Brasil, definida pela Agência Nacional de Transportes Terrestres- ANTT, por meio da Resolução N° 420, de 12 de fevereiro de 2004. A ANVISA definiu, em 2005, os requisitos para o funcionamento dos laboratórios clínicos e postos de coleta laboratorial públicos ou privados que realizam atividades
2 [ M edicina laboratorial para o clínico
na área de análises clínicas, patologia clínica e citologia. Trata-se da RDC n°. 302, de 13 de outubro de 2005, elaborada a partir de um trabalho conjunto de técnicos da ANVISA, Secretaria de Atenção a Saúde (SAS/MS), Secretaria de Vigilância à Saúde (SVS/MS), Vigilâncias Sanitárias Estaduais, Laboratório de Saúde Pública, Sociedade Brasileira de Patolog1a Clínica/Medicina Laboratorial, Sociedade Brasileira de Análises Clínicas, Provedores de Ensaio de Proficiência e um consultor técn ico com experiência na área. Esta RDC é aplicável a todos os serviços públicos ou privados que realizam atividades laboracoriais na área de análises clínicas, patologia clínica e citologia.
A FASE PRÉ-ANALÍTICA
Os estudos mais recentes têm apontado fatores préanalíticos como responsáveis por até 70% dos erros registrados em um laboratório clínico. Antes da coleta de qualquer material biológico para a realização de exames laboratoriais. é importance conhecer, controlar e, se possível, eliminar algumas variáveis que possam incerferir nos resultados. Entre as causas comuns de variabilidade préanalítica, têm-se: gravidez, atividade física, período neonacal e infância, idade avançada, postura, dieta, uso de drogas terapêuticas ou de abuso, infusão de fármacos, hemólise, lipemia, jejum, corniquete e variação cronobiológica.
Gravidez
Diversos analitos ap resentam significativa vanaçao nos valores de referência durance a gravidez, sendo possível, inclusive, a estratificação pelos diversos períodos gescacionais e pós-parto (Tabela 1.1 ).
Atividade física
A acividade física não deve ser considerada fator impeditivo ou limitante para a coleca da material biológico para a realização de exames laboratoriais. Deve-se cer em mente. porém, que exercícios físicos extenuantes geralmente elevam os níveis séricos de alguns analitos, tais como laccaco, creatinoquinase, aldolase, alanina aminotransferase, asparcaco aminocransferase, fósforo, creatini-
na, ácido únco, haproglobina, rransferrina. carecolaminas e leucóCito total. Albumina, ferro e sódio podem dlminwr. Tal InterferênCia pode perdurar por 12 a 24 horas. Por ouuo lado. o repouso excessivo impostO em algumas situações, como a hospitalização e/ou imobilização no leito. também é causa de interferência.
red ução na concentração de colesteroi- HDL e elevação de algumas substâncias, como corrisol e antígeno carci· noembriônico - CEA. O etilismo, por sua vez. alcera rapidamente a concentração plasmática de gl1cose. áodo lárico e cnglicérides, entre outros. Já o consumo crónico é responsável. por exemplo. pela elevação da at1vidade de gamaglutamil transferase.
Período neonatal, infância e idade avançada Infusão de fármacos
Valores de referênc1a defimdos para a população adulta geralmente não se aplicam à população pediátrica. As· s1m, é necessána a utilização de referências apropriadas a cada faixa etána. Novas Investigações têm definido valores de referênCia específ cos para a população idosa.
Postura
Alterações repentinas na postura corporal podem causar variações na concentração sénca de d1versos analitos, tais como albumina. colesterol, rriglicérides, hematócrito, hemoglobina e leucócitos.
Dieta
Alguns exames sofrem interferência da d1eta à qual o paoente está submetido, bem como a alterações bruscas nesta. A introdução de dieta hospitalar. por exemplo, deve ser considerada como interferente em potencial para tais determinações.
Uso de drogas terapêuticas ou de abuso
Cons1dera-se boa prática laboratonal o registro, no ato do atendimento, dos fármacos que o paciente usou ou tem usado pelo menos nas últimas 72 horas que antecedem a coleta de sangue. Tal medida visa à detecção e alerta ao médico-assistente de possível interferência m v1vo ou m v1tro em relação ao exame laboratOrial. Merecem destaque o tabagismo e o etilismo, pela sua freqüência. No primeiro, têm-se elevação na concentração de hemoglobina, elevação no número de hemácias e leucócitos e no volume corpuscular médio, além da
Introd ução à Medicina Laboratorial
A coleta de sangue deve ser realizada em local dis· rance de carecer. Se possível. esta deve ser real1zada pelo menos uma hora após o final da infusão. mesmo que em local diferente.
Hemólise
Representa a causa mais comum de re1e1ção de amostra de sangue no laboratório clínico. Quando discreta. interfere em poucas análises, mas. se intensa. causa elevação nos resultados de desidrogenase lá rica, bilirrubina. potássio, creatinoquinase. alanina aminorransferase. aspartaro aminotransferase e magnésio.
lipemia e jejum
A lipemia decorrente do estado pós-prandial pode interferir em algumas determinações laboratoriais. Com o avanço metodológico. porém, a exigência do jejum, preconizada até alguns anos atrás, tornou-se uma recomendação para a maioria dos exames. O jejum prolongado também deve ser lembrado. sendo uma interferência franca nas dosagens de glicema, quando superior a 16 horas.
Aplicação do torniquete
Na aplicação do tOrniquete por tempo supenor a dois minutos, haverá alterações metabólicas secundárias à estase venosa, provocando aumento de poráss1o e lactato e decréscimo de pH.
3
Tabela 1.1 - Resul[ados de exames laborawriats durame a gravidez expressos como porcemagem da média dos valores observados em mulheres não-grávidas Percentual da média dos valores obtidos em mulheres não-grávidas Ana lito
12 semanas 28 semanas 32 semanas
36 semanas
Termo
l 0 dia pós-parto
ACidO lHICO
68
79
92
106
120
135
Album1na
93
78
78
78
78
71
Bicarbonato
85
85
85
85
81
88
Bilirrubina mdireto
56
56
67
67
78
78
Có.c
98
94
94
95
97
94
Capac,dade de ligação do ferro
95
129
139
142
144
128
Cloreto
98
99
100
99
99
100
Colesterol HDL
121
121
119
127
130
116
Coleste1ol LDL
80
118
118
150
146
121
Colesterol total
100
132
144
148
156
138
CreatJmno
71
71
74
79
81
74
Ferrihna
81
33
33
37
59
81
Ferro
112
82
94
94
94
82
Fosfatase alcalino
90
131
203
274
347
284
Fósbo
108
99
97
103
96
106
Gilcem1o de jejum
98
94
94
91
94
94
Hemotocnto
94
89
91
94
97
91
Hemoglobina
95
89
90
93
96
89
leu óc to global
144
167
67
165
2.40
222
Magnésio
92
90
87
87
87
86
Potóss1o
95
95
95
98
100
98
Proteína
92
83
83
83
83
77
Sód·o
97
99
98
98
97
99
Tempo de protrombina
99
99
97
98
97
100
Tempo de trombaplostmo parcial otivodo
95
94
91
92
93
92
Triglicérides
141
244
300
356
3.49
328
U·éiO
77
63
63
63
77
72
Plaquetas
98
99
96
95
100
9.4
F;bnno ênio
119
132
154
157
165
161
T3
100
121
121
116
121
95
T4
98
71
72
62
74
80
TSH
I II
106
122
III
139
III
Cort.sol
111
28.4
301
?9?
309
238
Adaptado de: Jacob!. DS. Oxley Dk De'v\oa WR. Laboratory T~t Handbook. Hudson. Lex.-Comp tnc 2001
4
~dicina laboratorial para o clínico
Variação cronobiológica
Esra corresponde às alcerações cíclicas da concentração de determinado parâmeuo em função do rempo. O ciclo de variação pode ser diário, mensal, sazonal, anual,
Tal sicuação justifica o registro, por parce do laboratório clínico, da dara da última mensuuação, comando possível a correra correlação clínico-laborawrial e liberação do respectivo valor de referência no laudo.
e[c. A concemraçâo de cor[isol no soro corresponde a um exemplo bastante ilusrrarivo de variação circadiana de um analiro. Nesre caso, as coleras realizadas à carde fornecem resultados aré 50% mais baixos em relação às coleras realizadas pela manhã. Na Tabela 1.2 encontramse ouuos exemplos de flutuações fisiológicas de resultados de exames laboracoriais. Tabela 1.2 - Vanação torai em percenrual das concentrações séricas de analitos determ inadas em amosrras colhidas às oito e 14 horas
Va riaçã o Tota l (%)
Analito Sód io
1,9
Potássio
~1
Cloreto
3,8
Cálcio
3,2
Fósforo
10,7
Uréio
22.5
Creotinino
14,5
Ácido úrico
11 ,5
Ferro
36,6
Colesterol
14,8
Albumino
5,5
Proteínas toto1s
4.8
A sparto to a mino tra nsferase
25
Ala nina ominotronsferose
56
Fosfa ta se a lcalino
20
Desid rogenose ló tico
16
Adaptado de: )acobs DS. Oxfey DK. DeMon WR. Laboratory Test Handbook. Hudson. Lext-Comp lnc.. 2001
As variações hormonais dpicas do ciclo menstrual representam ourro exemplo de variação cronobiológica.
Introdução
à M edicina Laboratorial
A SOLICITAÇÃO MÉDICA
Toda amostra biológica destinada à realização de exames deve ser acompanhada de requisição formal adequada, na qual constem os dados de identificação do paciente, o rnarerial biológico a ser colhido e os exames a serem realizados. A jusrificariva para a realização dos exames é um dado de exuema importância e, para diversos serviços. obrigatória. No aco do atendimenw, cabe ao laboratório a confirmação de codos os dados de identificação do paciente e seu responsável legal, quando pertinente, mediante apresentação de documentos oficiais, cal como a carreira de identidade. Recomendase o registro dos seguintes dados cadastrais do paciente pelo laboratório: • número de regisrro gerado pelo laboratório; • nome; • idade, sexo e procedência; • telefone e/ou endereço. quando aplicável; • nome e comaco do responsável em caso de menor de idade ou incapacitado; • nome do solicitante; • dara e hora do arendirnenco; • horário da coleta, quando aplicável; • exames solicitados e ripo de amosu a; • quando necessário, informações adicionais, cais corno medicamentos em uso, dados do ciclo menstrual, indicação/observação clínica; • dara prevista para a entrega do laudo; • indicação de urgência, quando aplicável.
O PREPARO DO PACIENTE
O laboratório deve fornecer orientações claras e, prefere ncialmente, por escrico, relativas ao preparo para a realização de exames. No aco do arendimenw, esre deve ser verificado e, se a colera do material for realizada em condições especiais ou com alguma rescrição, esras devem ser regisuadas. As particularidades referentes ao
5
preparo do paciente para realização de exames laboramriais serão apresentadas nos respectivos capítulos.
Se forem utilizados frascos de vidro, deve-se obedecer à seguinte ordem:
A COLHEITA, TRANSPORTE E
ARMAZENAMENTO DO MATERIAL BIOLÓGICO A punção venosa é o procedimento mais comumenre realizado para obtenção de amosrras sanguíneas para realização de exames laboraroriais. Dá-se preferência às veias basílica mediana e cefálica no membro superior, lembrando que a última é mais propensa à formação de hemaromas. Devem-se evitar áreas com terapia ou hidraração intravenosa, locais com cicatrizes de queimaduras, áreas com hematomas, físculas arrério-venosas, membro superior próximo do local onde foi realizada masrecromia, cerererismo ou qualquer outro procedimento cirúrgico. A utilização do torniquete para auxiliar na evidenciação da veia deve ser feira com cautela, pois, se empregado por mais de dois minucos, causa alterações em diversas determinações laboratoriais, podendo, inclusive, inviabilizar a utilização da amostra devido à hemólise. Recomenda-se a higienização do local de punção com álcool isopropílico ou etílico 70%, limpando-o com movimentos circulares do centro para a periferia. São necessários cerca de 30 segundos para secagem da área, evitando-se, assim, ardência no aro da colera e até hemólise. Procede-se, a seguir, à colera do material. O sistema de colera a vácuo é o mais recomendado e utilizado no mundo. Este apresenta como vantagem a possibilidade de coleras múltiplas por meio de uma única punção. O tubo de colera rem, em seu inrerior, quantidade de vácuo proporcional à quantidade de anticoagulante, dando ao fleboromisra a cerreza de que o volume de sangue colhido foi correto, bastando observar a marcação do fabricante no cubo. Outra vantagem diz respeito à segurança do profissional de saúde, uma vez que o sistema de colera a vácuo é fechado, não havendo necessidade de manipulação do material colhido pelo floboromisra. Recomenda-se a seguinte seqüência de colera para cubos de plástico: • frascos para hemoculcura; • tubos com cirraro (rampa azul claro); • cubos para soro com arivador de coágulo (rampa vermelha ou amarela); • tubos com heparina (rampa verde);
6
[ Medicina laboratorial para o clín ico
• rubos com edra (rampa roxa); • cubos com fluoresco (rampa cinza).
• frascos para hemoculrura; • cubos para soro siliconizados (rampa vermelha); • tubos com cirraro (rampa azul claro); • rubos para soro com arivador de coágulo (rampa amarela); • rubos com heparina (tampa verde); • cubos com edra (rampa roxa); • rubos com fluorero (tampa cinza). Uma vez colerada e identificada adequadamente, a amostra deverá ser encaminhada ao seror de processamento em maletas isotérmicas que garantam a segurança no transporte. O tempo entre a colera do sangue e sua centrifugação não deve exceder uma hora. Amostras colhidas com anticoagulante, nas quais o exame será realizado no sangue total. devem ser mantidas refrigeradas entre 2 e goc aré o processamento. Todo cuidado deve ser tomado para que o prazo máximo e as condições ideais de armazenamento do material biológico sejam respeitados. evitando-se interferências no resultado dos exames. É fundamental que o laboratório clínico tenha mecanismos que garanram a rastreabilidade de codo o processo pré-analítico. Vale mencionar, novamente, o grande impacto desta fase nos erros verificados em resultados de exames laboratoriais.
A FASE ANALÍTICA: O PROCESSAMENTO DO MATERIAL BIOLÓGICO
Na fase analítica, as grandes preocupações referem-se aos reagentes, equipamentos gerais e específicos e qualidade da água utilizada no laboratório (água reagente). Além destas, a qualificação dos profissionais envolvidos e seu compromisso com a educação continuada é fundamental. O processo analítico deve ser o referenciado nas instruções de uso do fabricante, em referências bibliográficas ou em pesquisa cientificamente válida conduzida pelo laboratório. Assim, deve-se zelar pela utilização de merodologias que reúnam sensibilidade, especificidade e cusro-efetividade adequadas e estas, quando implanta-
]f--- - -- - -- - - - - - - - - - -- - -- - - -- - - - - -
das, devem seguir rigorosamente as especificações do fabricante. A validação interna é considerada etapa essencial e preliminar à inuodução de qualquer merodologia analítica no laboratório. Tende-se, arualmente, à auromação da maioria dos processos analíticos, empregando-se analisadores robusros e inrerfaciáveis, ou seja, com capacidade de receber e transmitir informações ao sistema informatizado do laboratório. As técnicas man uais encontram-se remiras às merodologias em relação às quais não foi possível auramação com manutenção de adequadas sensibilidade e/ou especificidade. Muitas vezes não é possível o laboratório Implantar merodologias de última geração em seu parque tecnológico, o que fortalece o papel dos laboratórios de apoio. Estes são representados por estabelecimentos de grande porre, alro nível tecnológico e de informatização, capazes de receber e processar amostras de diversos locais, com liberação rápida dos resultados. Assim, há desoneração de rodo o processo do laboratório associado a este, sem perda na qualidade do resultado.
A FASE PÓS~ANALÍTICA: REPORTANDO RESULTADOS DE EXAMES LABORATORIAIS
O laudo de um exame laborarorial deve comer, no mínimo, os seguintes itens: • identificação do laboratório; • endereço e telefone do laboratório; • identificação do responsável técnico (RT); • n° de registro do RT no respectivo conselho de classe profissional; • identificação do profissional que liberou o exame; • n° de registro do profissional que liberou o exame no respectivo conselho de classe do profissional; • n° de regisuo do laboratório clínico no respectivo conselho de classe profissional; • nome e registro de identificação do cliente no laboratório; • data da coleta da amostra; • data de emissão do laudo; • nome do exame, tipo de amosrra e método analítico; • resultado do exame e unidade de medição; • valores de referência, limitações técnicas da metodologia e dados para interpretação;
Introdução à Me d icina l abora[Qria l
• observações pertinentes. Quando for aceita amostra de paciente com restrição, esta condição deve constar no laudo. t fundamental que o laboratório defina os limites de risco, valores críticos ou de alerta para analitos cujo resultado necessite de imediata ação médica. Érecomendável que comentários relevantes em relação ao reste e/ou resultado sejam adicionados ao laudo, com o intuiro de auxiliar a interpretação médica. A equipe técnica do laboratório clínico deve estar capacitada para avaliar a consistência dos resultados antes de liberá-los, correlacionando-os com os dados cadastrais (idade, sexo, medicamentos em uso, etc.) do paciente e com as informações clínicas disponíveis. O julgamento pós-analítico é fundamental para assegurar ao médico e ao paciente a confiabilidade no laudo emitido.
CONTROLE DA QUALIDADE NO lABORATÓRIO ClÍNICO
A garantia da qualidade pode ser definida como um conjunto de processos que visa à obtenção de resultados laboratoriais confiáveis. Um programa de garantia da qualidade adequado deve abranger as fases pré-analítica, analítica e pós-analítica. O RT do laboratório deve elaborar uma lista abrangendo rodos os analiros e rodos os sistemas analíticos que utiliza. Para cada SIStema analítico, deve haver um plano para controle interno (moniroração da estabilidade do sistema analítico) e para controle externo (moniroração da exatidão ou da acurácia). O programa de garantia e controle da qualidade deve documentar o material de controle ou de proficiência que será usado, a freqüência de seu uso e os limites e critérios de aceitabilidade dos resultados. Todas as arividades referentes à garantia da qualidade devem ser registradas e analisadas criticamente de maneira regular que possibilite a investigação de causas raiz de problemas que impactem a confiabilidade das análises.
SEGURANÇA NO lABORATÓRIO CLÍNICO
Profissionais da área de saúde e outros trabalhadores que exercem suas arividades em laboratórios aruam sob diversos riscos: • riscos de aodentes;
7
• classe de risco III: risco individual elevado, baixo
• riscos ergonômicos;
• riscos físicos;
risco comunirário. O ageme pawgênico podepro-
• riscos químicos; • riscos biológicos.
vocar enfermidades humanas graves, podendo propagar-se de uma pessoa infectada para outra, entretanto, existe profilaxia e/ou tratamento. Ex:
Considera-se risco de acideme qualquer fator que co-
Mycobacterium tuberculos1s;
loque o trabalhador em siwação de perigo e possa afetar sua integridade, bem-estar físico e moral. São exemplos de risco de acidente: as máquinas e equipamentos sem proreção, probabilidade de incêndio e explosão, arranjo físico inadequado, armazenamento inadequado, etc. Considera-se risco ergonômico qualquer fator que possa interferir nas características psicofisiológicas do trabalhador, causando desco nforto ou afetando sua saúde. São exemplos de risco ergonômico: o levantamento e transporte manual de peso, o ritmo excessivo de trabalho, a monotonia, a repetitividade, a responsabilidade excessiva, a poswra inadequada de trabalho, o trabalho em wrnos, etc. Cons1deram-se agentes de risco físico as diversas formas de energia a que possam estar expostOs os trabalhadores, tais como: ruído, vibrações, pressões anormais, temperawras extremas, radiações ionizantes, radiações não ionizantes, ultra-som, materiais cortantes e pontiagudos, etc. Consideram-se agentes de risco químico as substâncias, compostos ou produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratória, nas formas de poeiras, fumos, névoas, neblinas, gases ou vapores ou que, pela nacu reza da atividade de exposição, possam ter contato ou ser absorvido pelo organismo através da pele ou por ingestão. Consideram-se agentes de risco biológico as bactérias, fungos, parasitos, vírus. entre outros. A classificação do risco biológico é definida pela patogenicidade para o homem; virulência; modos de transmissão; disponibilidade de medidas profiláticas eficazes, disponibilidade de tratamento eficaz e endemicidade. • classe de risco 1: escasso risco individual e comunitário. O microrgan ismo tem pouca probabilidade de provocar enfermidades humanas ou enfermidades de importância veterinária; • classe de risco 11: risco individual moderado. risco comunitário limitado. A exposição ao agente patogênico pode provocar infecção, porém, dispõese de medidas eficazes de tratamento e prevenção, sendo o risco de propagação limitado. Ex.: Schistosoma mansoni;
8
Medicina laboratorial para o clín ico
• classe de risco IV: elevado risco individual e comunitá rio. Os agentes pacogênicos representam grande ameaça para as pessoas e animais, com fác il propagação de um indivíduo ao outro, direta ou indiretamente, não existindo profilaxia nem tratamento. Ex: vírus ebola. Conforme os riscos definidos no laboratório, são necessários equi pamentos de proteção individual (EPI) e coletiva (EPC) para minimizá-los ou el iminá-los. Luvas, óculos de proreção, proretor facial e jaleco são exemplos de EPI. Cabine de segurança biológica, chuveiro de emergência e lava-olhos são exemplos de EPC. É preciso que o laboratório elabore uma lista dos riscos a que a equi pe técnica pode estar sujeita, incluindo os produtos químicos utilizados. A cada produtO químico adquirido para uso, o laboratório deve solicitar ao fabricante a respectiva Ficha de Informação de Segurança de Produto Químico - FISPQ. É necessário, também. que o laboratório normacize os procedimentos relativos à segurança por meio de manuais ou instruções técnicas. Estes devem conter, no mínimo: • normas e condutas de segurança biológica, química, física, ocupacional e ambiental; • instruções de uso para EPI e EPC; • procedimentos em caso de acidentes; • manuse1o e transporte de material e amostra biológica. São as seguintes as principais recomendações relativas à segurança ocupacional em um laboratório clínico: • nunca pipetar com a boca; usar dispositivos de pipetagem mecânica; • não comer, beber, fumar, mascar chiclete ou utilizar cosméticos no laboratório; • evitar o hábiro de levar as mãos à boca, nariz, olhos, rostO ou cabelo, no laboratório; • lavar as mãos antes de iniciar o trabalho e após a manipulação de agentes químicos, material 1nfec-
)1 ------ - - - - -- - - - -- - - - -- - - - - - -- - -
• •
• • • • •
•
•
•
•
•
•
cioso, mesmo que cenha usado luvas de proceção, bem como ames de deixar o laboratório; não guardar objeros de uso pessoal no laboratório; utilizar jaleco ou outro tipo de uniforme procecor, de algodão, apenas dentro do laboratório. Não utilizar essa roupa fora do laboratório; utilizar apenas sapacos fechados no laboratório; utilizar luvas quando manusear material infeccioso; não usar jóias ou outros adornos nas mãos, que podem impedir uma boa limpeza destas; manter a porra do laboratório fechada. restringindo o acesso à equipe técnica; não manter plantas, bolsas. roupas ou qualquer outro objeco não relacionado com o trabalho dentro do laboratório; usar cabine de segurança biológica para manusear material infeccioso ou materiais que necessitem de proceção contra contaminação; utilizar dispositivos de contenção ou que minimizem as arividades producoras de aerossóis. essas arividades incluem: centrifugação (usar copos de segurança). misturadores ripo vortex (usar cubos com tampa). homogeneizadores (usar homogeneizadores de segurança com copo metálico). entre outras; descontaminar todas as superfícies de trabalho diariamente e quando houver respingos ou derramamentos; colocar todo o material com contaminação biológica em recipientes com tampa e à prova devazamento ames de removê-lo do laboratório para autoclavação; descontaminar por aucoclavação ou por desinfecção química codo o material com contaminação biológica, como: vidraria, caixas de animais, equipamentos de laboratório. etc; descontaminar codo o equipamento ames de qualquer serviço de manutenção;
Introdução à Medicina Laboratorial
• depositar agulhas em recipientes rígidos. à prova de vazamento e embalados como lixo pacológico; • manter-se informado, através de treinamentos oficiais. sobre as providências em caso de acidente, bem como sobre a localização e instruções de uso do lava-olhos, chuveiro de segurança e extintor de incêndio; • informar à chefia imediata a ocorrência de qualquer acidente.
REFERÊNCIAS 1.
Brasil. M inistério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n°. 302, de 13 de outubro de 2005. D1spõe sobre Regulamemo Técnico para funcionamemo de Laboratónos Cl ín1cos. Diáno Oficial da Un1ão da República Federativa do Brasil, Brasília, 14 de outubro 2005.
2.
Brasil. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n°. 50. de 21 de fevereiro de 2002. D1spõe sobre Regulamento Técnico para planejamento, programação, elaboração e avaliação de projetas físicos de estabelecimentos assistenciais de saúde. Diáno Oficial da União da República Federativa do Brasil, Brasília. 20 de março 2002 .
3.
Brasil. Ministério dos Transportes. Agência Nacional de Transporte Terrestre. Resolução n°. 420. de 12 de fevereiro de 2004. A prova as Instruções Complementares ao Regulamento do Transporte Terrestre de Produtos Perigosos. Diário O fic1al da Un1ào da República Federativa do Brasil, Brasília, 31 de ma1o 2004.
4.
Jacobs DS, Oxley DK. DeMott WR. Laboratory Test Handbook. Hudson: Lexi- Comp; 2001.
5.
Plebani M. Erros 111 clin1cal laborarories or erros in laboratory medicine? Clin Chem Lab Med. 2006;44(6):750-9.
6.
Sociedade Brasileira d e Patologia Clín ica/Medicina Laboratorial. Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ M edicina Laboratorial para coleta de sangue venoso. São Paulo: Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ Med1cina Laboratorial; 2005. Disponível em h t t p :/ / w ww . s b pc .o rg. b r / u pI o ad / conte u do / 320070130154104.pdf.
9
02
Fernando Valadares Basques
INTERPRETANDO RESULTADOS DE EXAMES LABORATORIAIS
A interpretação dos resulrados de exames laboramriais requer o domínio da clínica e da epidemiologia da doença, bem como o conhecimento da merodologia laborarorial. Qual é o melhor mérodo para o diagnóstico e acompanhamenro da doença7 Qual é o significado real de um resultado negativo ou positivo7 Neste capítulo serão revistos conceiros laboratoriais básicos para auxiliar o clínico na interpretação dos resultados de exames. Uma hipótese diagnóstica formulada com base nos conheCimentos sem1ológicos, clínicos e ep1dem1ológicos é a base para o sucesso diagnóstico e. na maioria das situações, os exames laboratoriais são complementares, cabendo ao laboratório a confirmação da hipótese formulada ou a quantificação de um resultado esperado. A utilização de exames laborawriais para "adivinhar" um diagnóstico é quase sempre um equívoco. onera o paciente e os sistemas de saúde e, algumas vezes. pode até mesmo confundi r o médico-assistente. Com base na epidemiologia de algumas doenças e no 1mpacto do diagnóstico precoce, existem exames que são utilizados para rastrear hipóteses diagnósticas. Exemplos dessas situações são os exames solicitados nas consultas pré-natais, diagnóstico do diabetes melito e a triagem neonatal do hipotireoidismo e fen ilceronúria.
VALORES DE REFERÊNCIA A forma mais habitual para o diagnóstico de uma doença é a comparação de um valor mensurado com
valores observados em uma população saudável: os valores de referência. Por exemplo, a avaliação antropométrica de uma cnança requer valores de referência para elaborar-se uma h1pótese de déficit de crescimento. A Medicina Laborarorial não foge a esta regra. Os valores de referência são comumente utilizados para a análise dos resultados dos exames laboratoriais. A definição do valor de referência, embora possa parecer, não é ta refa simples. A maior dificuldade consiste em determinar se um indivíduo é ou não saudável. A saúde é um conceiro relativo: para se defini r se um indivíduo é saudável, há que se estabelecer um padrão, o que nem sempre é fácil. Além disso, afirmar que um indivíduo não tem doença é praticamente impossível. O valor de referência é definido como o intervalo de valores obtidos pela observação ou quantificação de determinado parâmetro em indivíduos "de referência". Os indivíduos "de referência" devem ser selecionados por meio de cmérios como idade, sexo. farores genéticos e étnicos (farores endógenos). Esses critérios devem ser considerados não só no momento da construção do valor de referência, mas tam bém quando se avaliam os resultados de um paciente. Ademais, devem ser determinadas com precisão as condições em que as amostras são coletadas, como: horário da coleta, tipo de alimentação no dia anterior, tempo de jejum. privação hídrica e alcoólica (farores exógenos), bem como o tipo de amostra (soro ou plasma), o tipo de anticoagulante e a merodologia utilizada (farores laboraroriais).
Outros aspectos importantes devem ser considerados na determinação de um valor de referência: • a mecodologia ucilizada deve ser rasueável a um mécodo de referência ou definitivo, denominado "padrão-ouro";
referência não devem ser utilizados como único parâmetro para diagnóstico. Alguns pacientes com câncer de próstata podem apresentar valores "normais" de PSA e, por ouuo lado, esre marcador tumoral pode estar elevado na ausência de doença maligna da próstata, como
• as mensurações devem ser feicas obedecendo a
em indivíduos com prosmice ou após exercícios físicos,
critérios de controle da qualidade laboratorial; • a seleção dos indivíduos "de referência" deve ser feita de forma aleatória ou por meio de ouuos mécodos estatísticos de seleção de grupo.
manipulação ou massagem prostática. A esuarificação dos valores de referência em idade e sexo é muito importante em alguns casos. A hemoglobina, a contagem global e específica de leucócitos e os hormônios sexuais fem ininos e masculinos são exemplos de parâmetros que variam em relação à idade e ao sexo. Em crianças, os valores de referência da contagem específica de leucócitos variam muito rapidamente entre as faixas etárias. Nesres casos, os exames devem ser avaliados comparando-se os resultados obtidos com os valores específicos para a idade. Os hormônios sexuais variam não só de acordo com a idade e o sexo, mas também com a fase do ciclo menstrual nas mu lheres em idade fértil. A gravidez também pode influenciar de maneira importante os resultados de exames laboratoriais. Os níveis de fosfatase alcalina podem aumentar-se até 274% e os rriglicérides variam de 114% na 14ª semana a 356% na 36ª semana de gestação. Ouuos exemplos de analitos que têm seus valores influenciados pela gravidez são creatinina, uréia, alfafetoproreína, proteínas torais e albumina, contagem de leucócitos, ferri tina e colesterol. Um resultado de exame nunca pode ser avaliado isoladamente. O conhecimento fisioparológico corroborado por um conjunto de resultados laboratoriais relacionados é a base para o sucesso diagnóstico e terapêutico. Por exemplo, a suspeita clínica de anemia ferropriva não pode ser afastada simplesmente por um resulcado de ferritina dentro dos valores de referência. A ferritina é uma proteína de fase aguda, portanto, condições inflamatórias podem elevar a sua dosagem, mesmo em um paciente com anemia ferropriva. O nível de decisão clínica fornece a melhor separação entre duas ou mais categorias clínicas e não pode ser confundido com valor de referência. O valor de referência para a glicose plasmática de jejum é de 70 a 99 mg/dl, já o nível de decisão clínica para o diagnóstico do diabetes melito é de 126 mg/dl. O colesterol mral, HDL, LDL e triglicérides são outros exemplos de parâmetros laboratoriais (analitos), cujos resultados são comumente reportados acompanhados dos níveis de decisão clínica.
Após a realização do teste laboratorial na população selecionada, os valores encontrados devem ser tabulados. O valor de referência é formado pelos valores obtidos em 95% dos indivíduos restados, com a exclusão de 2,5% dos menores e maiores valores (média ± 2 desviospadrão) (Figura 2.1). Os valores outliers, aqueles numericamente discrepantes das demais observações, também são retirados dos cálculos.
~· . 2dp
fl
fl + 2dp
Figura 2.1 - Distribuição gaussiana de resultados para um analito hipotético, mostrando a média ± 2 desvios-padrão (dp). É recomendável a utilização do termo valor de refe-
rência em substituição ao termo valor de normalidade, de
modo a evitar idéias equivocadas a respeiro do seu real significado. Um resultado laboracorial dentro da faixa de referência, "normal", não significa ausência de doença, bem como um resultado fora da faixa de referência, "anormal", não significa doença. Além disso, muitos parâmetros biológicos não apresentam distribuição gaussiana, "normal". A dosagem do antígeno prostática específico (PSA), largamente utilizada como rasueamento para o câncer de prósrara, é um exemplo clássico de que os valores de
12 (
Medicina laboratorial para o clínico
VARIAÇÃO BIOLÓGICA Uma das mais importantes fomes de variação dos resultados laboratoriais é a variação biológica, flucuação fisiológica que se verifica em menor ou maior grau em todos os analitos. Essa variação pode ocorrer seguindo um ritmo circadiano (cortisol e contagem específica de leucócitos), padrões de alimentação (ferro sérico e proteínas plasmáticas), mudança poscural (proteínas plasmáticas), ritmo mensal (hormônios sexuais femini nos) e idade (contagem global e específica de leucócitos). Os parâmetros biológicos alteram-se ao longo da vida e o grau dessa variação ou o coeficiente de variação intra-individual depende do parâmeuo escudado. Por exemplo, os valores do sódio sérico flu cuam muito pouco ao longo da vida, ao passo que a proteína C reativa e os u iglicérides ap resentam grandes variações em curtos períodos de tempo, sem que haja mudança no estado de saúde do indivíduo. Todos os exames laboratoriais apresentam variações nos valores mensurados, que podem ser de dois tipos: a variação aleatória ou imprecisão e a variação sistemática ou inexatidão. A pri meira é o grau de coincidência entre medidas repetidas de uma amostra obtida em condições padronizadas. O laboratório clínico mede a imprecisão de um método pela dosagem diária de uma amostra controle, um dos processos do controle interno da qualidade laboratorial. A distribuição dos resultados obtidos permite calcular o coeficiente de variação analítico (CVA), a imprecisão. A inexatidão é o grau de coincidência enue o valor mensurado e o valor "verdadeiro" da amostra. A análise da variação biológica pode indicar não só mudanças no estado de saúde do indivíduo, como resposta à tera pêutica de forma mais precoce do que a observação isolada dos valores de referência. Se as variações pré-analíticas forem controladas, as variações analíticas estiverem denuo das especificações do método (disponível em http://www.wesrgard.com/biodata baselhtm) e a diferença entre dois ou mais valores de um analito for maior que a especificada, pode-se assumir que existe mudança no "valor de referência individual" (MVR), de acordo com a fórmula:
Int erpretando resultados de exames laboratoriais
na qual 21/ 2 se refere a duas medidas seriadas; 1,96 é o valor de Z para 95% de probabilidade (p<0,05); CYA é o coeficiente de variação analítico; e CY 1 é ocoeficiente de variação biológica individual. A hemoglobina, por exemplo, possui variação biológica individual muito baixa, 2,8%. Uma situação clínica para exemplificar a utilização do MYR é a avaliação de merrorragia em uma paciente em idade fértil com hemoglobi na de 12,8 g/dl , com hemograma anterior realizado no mesmo laborató rio (CVA de 1,4%), que mostrava hemoglobina de 14,2 g/dl . Embora as duas med idas se encontrem dentro dos valores de referência (11,7 a 15,5 g/dl ), a mudança observada foi de 15,6% e o MVR calculado foi de 8,67%. Desta forma, pode-se afirmar com 95% de certeza que existe diferença significativa entre os dois valores. É evidente que no exercício clínico diário, o cálculo do MVR utilizando a variação biológica não é muito prático. Nem sempre os dados necessários para o cálculo estão disponíveis e o clínico não pode assumir que as boas práticas que visam a minimizar as variações pré-analíticas são respeitadas pelo laboratório, condições fundamentais para a análise do MVR. Mesmo assim, a análise da variação biológica é uma importante ferramenta para o médico. Compreender que essa variação é inerente à Medicina Laboramrial e que muitas vezes ela é mais significativa que as variações analíticas (erro laboratorial) pode auxiliar de forma importante na interpretação dos resultados e melhorar sobremaneira a prática clínica.
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE
Avaliar a capacidade que um determinado método laboratorial tem para diagnosticar ou afastar uma doença requer o conhecimento de alguns conceiws estatísticos. A sensibilidade e a especificidade estão entre os mais importantes deles. A sensibilidade é a probabilidade de um teste ser positivo quando o indivíduo está doente. Quanto maior for a sensibil idade de um teste, maior será sua capacidade de detectar doença quando um resultado estiver fora dos valores de referência. A especificidade é a probabi lidade de um teste ser negativo quando não existe doença. Um teste é muiw específico quando a maioria dos resultados é negativo na ausência de doença.
13
Apesar de sempre eiradas nos cesces diagnóscicos de doenças infecciosas, raramence a sensibilidade e a especifiCidade são mencionadas nos restes diagnóstiCOSde oueras doenças. Elas devem ser ucilizadas para caraccerizar codos os cesces laboraconais. A relação emre a sensibilidade e a espeof1odade de um cesce pode ser representada pela curva ROC do Inglês Receiver Operating Characteristic. A curva ROC é formada pelos pomos da sensibilidade colocados no etxo y (taxa de verdadeiro-posicivos) e de "1 - especificidade" no eixo x (caxa de falso-positivos) - (Figura 2.2) A análise da curva permite definir qual é o melhor ponto de corte, valor que separa resultados positivos e negativos. Quanro menor for a distância enrre um ponto da curva e o canto superior esquerdo (100% de sensibilidade e 100% de especificidade), maior será a eficiência do teste (capacidade de diferenciar enue saúde e doença). A observação da curva permite concluir que sempre que se aumenta a sensibilidade de um cesce, diminuindo-se o ponto de corte, dimtnui-se a especifiodade. O contrário também é verdadeiro, sempre que se aumenta a especificidade, aumentando o ponto de corte, diminui-se a sensibilidade do teste. Concluindo, não existem testes 100% sensíveis e 100% específicos simultaneamente.
{l .60 o
:;g :.õ · ;;; c
Jl . 20
VALORES PREDITIVOS Ouuos conceims estatísticos importantes para a avaliação de um método laboracorial são os valores preditivos. O valor preditivo positivo (VPP) de um teste é a probabilidade de o indivíduo escar doente quando o ceste é positivo. Já o valor predltlvo negatiVO (VPN) é a probabilidade de o indivíduo não ter a doença quando o teste é negativo. Além da sensibilidade e da especificidade do tesce, o cálculo dos valores predit1vos cambém leva em consideração a prevalência da doença na população e só se pode utilizá-los quando se conhece essa prevalência. O VPP do teste aumenta proporcionalmente com a prevalência da doença. Assim, quanto maior for a prevalência, maior será o VPP, quando são comparados tesces com amesma sensibilidade e especificidade em populações diferentes.
RESGATE DA IDÉIA CENTRAL DO CAPÍTULO O conhecimento da fisiopatologia e da epidemiologia das doenças são as bases para o sucesso diagnósLico. Os valores de referência são a forma mais hab1cual para o diagnóstico laboratorial de doença. Grupos semelhantes de pacientes em relação a sexo e idade devem ser usados para avaliar resultado dos exames. Os valores de referência representam 95% dos resultados esperados para uma população "saudável". Os valores de referência isoladamente não definem saúde ou doença. A variação biológica é a flutuação aleatória de um resultado laboracorial em corno do estado homeostáLico. Compreender conceitos estatísticos, como sensibilidade, especificidade e valores preditivos, é fundamental para a interprecação dos exames laboraroriais . REFERÊNCIAS Burns A. Ashwood E. Ttetz Texrbool of Cltntcal Chem1srry. 3th ed. Philadelphia: Elservter; 1998. 2. Fraser C. Biological Vananon from Pnnctples w Prauce. Washingmn: AACC Press; 2001. 3. Henry JB. Clinical Diagnosis and Managemem by Laborarory Merhods. 201h ed. Phtladelphta: W.B. Sanders: 2001. 4. NCCLS C28-2. How w Define and Dctcrmtne Reference lmervals in the Clin1cal Laboratary. /\pprovecl Gu1dehne. Dtsponível em: hnp://www.clst.org/source/Oiders/free/ c28-a2.pdf. I.
0.0
.20
.40
.60
.80
1.0
1 - especifidode
Figura 2.2 - Curva ROC do PSA mostrando do1s níve1s de deosão. 4 e 10 ~g/L Note-se que não ex1ste na curva um valor que represente 100% de sens1b1hdade e 100% especificidade('). Adaptado de TIETZ Textbook of Clin1cal Chem1stry.
14
Medicina laboratorial para o clínico
03
Lucienne França Reis Paiva Maria de Fátima Fi/ardi Oliveira Mansu r
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO: PRINCÍPIOS E TÉCNICAS
O Laboratório de Microbiologia Clínica desempenha importante papel no diagnóstico e controle das doenças infecciosas. Todavia, sua eficiência é limitada pela qualidade da amostra, pelos meios como é transportada até o laboratório e pelas técnicas empregadas para demonstrar a presença do microrganismo na amostra. Como as doenças infecciosas podem surgir em qualquer parte do corpo, sistema ou órgão e podem ser causadas por uma grande variedade de microrga nismos, incl uindo bacrérias, fungos, parasitos e vírus, a seleção do espécime para o exame laboracorial é um pomo crítico no processo de d iagnóstico e a comunicação encre o médico-assistente e o laboratório é, também, essencial. Além disso, a maior pane dos prococolos para testes sofisticados tem pouco valor se a amostra coletada não for representativa do local de infecção. Tendo em vista que muitas amostras enviadas ao laboratório para análise são contaminadas durante a coleta pelos microrganismos que colonizam a superfície de mucosas e pele, a interpretação do resultado de cultura contaminado corna-se difícil e algumas vezes impossível, pois a maioria das infecções é causada por microrganismos endógenos. O médico-assistente precisa estar consciente da complexidade dos exames e de suas limitações mecodológicas, inerentes ao processo, e conhecer o tempo real necessário para obtenção dos resultados numa rotina laboratorial para não criar falsas expectativas.
COLETA, ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DE AMOSTRAS PARA EXAME MICROBIOLÓGICO
Dentre os conceicos básicos referentes à coleta, acondicionamento e transporte de materiais biológicos destinados à análise microbiológica, destacam-se: • a amostra clínica deve ser material represemativo do verdadeiro local da infecção e deve ser coletada com um mínimo de contaminação, a partir de tecidos adjacentes, órgãos ou secreções; • devem ser estabelecidos períodos ótimos para coleta de amostras, a fim de se conseguirem maiores possibilidades para isolamento dos possíveis agentes causais; • deve ser obtida quantidade de amostra suficiente para a execução das téc nicas microbiológicas solicitadas; • utilizar dispositivos de coleta, recipientes para amostras e meios de culturas adeq uados para assegurar um ótimo isolamento dos microrgan ismos responsáveis pelo processo infeccioso; • sempre que possível, coletar material antes da administração de antibióticos; • o recipiente de transporte da amostra para cultura deve ser adequadameme rotulado e estéril. O objetivo primário do transporte de amostras para diagnóstico microbiológico consiste em mantê-las o
mais próximo possível de seu estado original, com deterioração mínima, para que a recuperação dos microrganismos não seja prejudicada. A s amostras devem ser enrregues ao laboratório o mais rápido possível, sendo um padrão mrernacional considerar-se o prazo máximo
• meio de transporte para anaeróbios: frascos contendo vácuo e com meios específicos para cultura anaeróbica. mantendo os microrganismos viáveis por até 24 horas.
de uma hora para a maioria dos rnareriais (Quadro 3.1). Quando amostras forem colhidas fora do laboratório, estas deverão ser colocadas em meios de transporte, dentre eles os mais indicados são: • meio de Stuart: meio de transporte que suporta a viabilidade da ma1oria das bactérias, incluindo as exigences, por até 24 horas; • meio Cary 8/air: 1ndicado para transporte de fezes ou swab recai quando se deseja cultura para V1bno cholerae, Campylobacter ou outras bactérias enceroparogênicas, mantendo-as v1áveis por até 48 horas; • meio de Amies com carvão: utilizado principalmente quando há suspeita de microrganismos exigentes como Neisseria spp ou Haemophilus spp; • tampão de fosfato com glicerol: para patógenos encéricos comuns; • frasco estéril: unhzado para transportar pequenos fragmentos de tecidos ou biópsias, podendo-se adicionar de 0,5 a 1.0 ml de salina estéril ou quando há punção de abcessos, fezes. urina, escarro e outros;
PROCEDIMENTOS TtCN ICOS D E COLETA
Secreção de ouvido
Para se estabelecer o diagnóstico microbiológico específico de 1nfecção do ouvido médio, é necessário eferuar uma timpanocentese com aspiração de líquido do ouvido médio. Essa coleta não é muito usual, pois o tratamento de tal infecção geralmente é empírico. O material ideal a ser coletado no canal audit ivo externo é a secreção existente logo após a ruptura da membrana timpânica. Este deve ser coletado pelo ocorrino laringologisra com equipamento estéril. Para coleta de material do ouvido externo, deve-se proceder à descontaminação local, principalmente quando há drenage m espontânea. Deve-se coleta r o material da parte mais profunda, correspondendo a secreções mais recentes, e empregar dois swabs, um destinado à cultura e ouuo para o preparo da lâmina de bacterioscopia.
Quad ro 3.1 - Condições de acondicionamemo e transporte dos principais m ateriais enviados ao laboratório para exames microbiológiCos Material
Acondicionamento
Transporte
Líquor Líquido pleural Líquido sinoviol Líquido pericárdico Hemoculturo
Enviar imediatamente (manter em estufo 37°C até processamento)
Temperatura ambiente
Secreção ocular Secreção de ouvido Swab oroforinge SecrP.çno genilol Urino de 1° joio Esperma Fezes
Tempero luro ambiente !plantio mo1s rápido possível quando não enviodo em me1o de transporte)
Temperatura ambiente
Urino Escorro Secreção brônquico Secreção traqueal Cateteres Secreções em geral
Manter refrigerado até processamento
Em caixa térmico o .1 °(, com exceção de amostras respiratórios, que deverão ficar em temperatura ombienle
16 [ Medicina laboratorial para o clínico
Secreção ocular
Conjuntiva
• inmuir o paciente a comparecer ao laboratório sem lavar o rosw;
• colher dois swabs: um para microscopia e outro para cultura. Deve-se utilizar de preferência um swab de Dacron ou alginaw de cálcio. A coleta poderá ser realizada mesmo após o pacien-
• colher, preferencialmente, no fundo do saco con-
te rer feiro higiene bucal e se alimentado. Na presença
jumival, rodando suavemente o swab para colher secreção e células, evitando o comam com a borda da pálpebra; • preparar o esfregaço para bacterioscopia no momenm da coleta e, preferencialmente, semear o outro swab imediatamente nos meios selecionados; • coletar, separadamente, para o olho direiw e esquerdo.
de pseudomembrana, como a que ocorre na difteria (Corynebacterium diphtheriae), deve-se coletar uma porção dela e proceder à cultura em meio de Lóeffler e coloração de Gram e Albert Laybourn.
Pesquisa de Chlamydia em conjuntiva ocular
Esta coleta deve ser feita pelo oftalmologista ou por profissionais especialmente treinados. • proceder à coleta empregando-se swab pequeno ou espátula de Kimura; • fa zer esfregaço em lâmina limpa e desengordurada; deixar secar ao ar e fixá-lo com metanol absoluw. Úlcera de córnea
O raspado corneano deverá ser coletado pelo oftalmologista. Neste caso, o laboratório deve fornecer lâminas e os meios de cultura usuais para que o planeio seja feito imediatamente após a coleta, pelo próprio médico.
Seios paranasais
A coleta de secreção dos seios para nasais é um procedi mento médico, sendo o material coletado diretamente dos seios por meio de agulha e seringa. O transporte deverá ser anaeróbico e o processamento imediato. Ressalta-se que a cultura de amostras da nasofaringe não tem valor algum. Swab nasal
A coleta de swab nasal encontra-se restri ta à avaliação da microbiota de indivíduos hospitalizados ou com aruação direta no ambiente hospitalar com o objetivo de detectar portadores de microrga nismos de interesse em surtos e controle de infecção hospitalar. Em algumas situações, indica-se a coleta deste e de swabs axilares e perianais para estudos mais amplos.
Amostras das vias aéreas inferiores Vias res piratórias superiores
Orojaringe
• dirigir um foco de luz para a cavidade oral aberta e, com o auxílio de um abaixador de língua estéril, aplicar o swab estéril na área de inflamação (amídalas, faringe posterior e qualquer exsudaco ou área ulcerativa). É preciso evitar a contaminação da amostra com saliva, visto, na presença de saliva, algumas bactérias podem crescer excessivamente. Por outro lado, o crescimento de Streptococcus do grupo A pode ser ini bido;
Diagnóstico microbiológico: princípios e técnicas
Escarro expectorado
• o paciente deve lavar a boca com água ames da coleta da amostra, elimi nando assim secreções orofaríngeas e saliva. Esse procedimento é fundamental, já que a qualidade da amostra obt1da irá validar o resultado do cultivo microbiológico. Após, orientá-lo a tossir profunda mente e expecto rar as secreções das vias aéreas inferiores diretamente em recipiente estéril e de boca larga; • se possível, colher a primeira amostra da manhã, porque contém o conjunto das secreções norurnas;
17
• quando há dificuldade de coleta ou não há produção de escarro, a coleta poderá ser feira com indução de salina nebulizada. com um respirador de pressão positiva, com supervisão direta da equipe de enfermagem ou da fisioterapia. Secreção traqueal! Aspirado traqueal
A coleta deste material é rea lizada em pacientes incubados, através de sonda de aspiração. Embora esta cultura seja realizada roti neiramente, os resultados microbiológicos podem refletir colonização local ou com outros patógenos nosocomiais. sendo a interpretação clínica extremamente complicada. Lavado broncoa/veolar É um procedimento realizado por equipe médica especializada. O material é obtido por meio de procedimento broncoscópico, no qual são injetados cerca de 100 a 300 ml de solução salina e amostras são colhidas. sendo a primeira usada para citologia. a porção intermediária para cultivo microbiológico e microscopias e a porção final a mais recomendada para pesquisa de micobactérias. Deve-se enviar ao laboratório com urgência para que o processamento seja imediato. O lavado broncoalveolar e cultura quantitativa estão indicados em casos de pneumonias graves. que necessitem de suporte ventilatório, de evolução rápida ou em imunocomprometidos ou quando há falha terapêutica empírica. É o material de escolha para pesq uisa de Pneumocystis carinii (renomeado P. jiroveoi), vários fungos, micobactérias, inclusões virais e outros microrganismos.O material deverá ser obtido antes de biópsias e de escovados, para evitar-se excesso de sangue.
Amostra de broncoscopia
A broncoscopia com fibra ó ptica é uma técnica empregada para obtenção de biópsias e outras amostras transbronquiais, em particular em pacientes com abcessos pulmonares ou outras infecções profundas de pulmão. Se for utilizado broncoscópio "protegido", este constitui o material adequado para realizar culturas anaeróbicas. Os anestésicos podem inibir o crescimento das
baccérias, de modo que as amostras devem ser processadas imediatameme. Aspirado/lavado gástrico
Coleca ucilizada especialmence em crianças ou em outros pacientes que têm dificuldade de expectorar. quando da necessidade de estabelecer diagnóstico da tuberculose.
Urina
Urina (jato médio)
Deve-se evitar a contaminação da amostra com a microbiota indígena da uretra ou vagina. Recomenda-se a coleta da pri meira urina da manhã ou urina retida na bexiga por quat ro horas. • mulheres: fazer rigorosa higiene da região vulvar com água e sabão, enxaguar e secar com gaze estéril. Orientar a paciente para afastar os grandes lábios, evitando também qualquer contam de partes do períneo com a urina coletada; • homens: expor a glande e cuidadosamente lavar com água e sabão e depois enxaguar e secar com gaze estéril; • instruir o paciente para desprezar o primeiro jaco, colher o jaco médio em frasco estéril e desprezar o restante da micção no vaso; • crianças: a coleta deve ser realizada no laboratório por pessoal treinado. Fazer rigorosa ami-sepsia na região genital com água e sabão. Em seguida, adaptar cuidadosamente o colecor pediátrico estéril. Se a coleta não for realizada em até 40-60 minutos, substituir o coletor, repetindo codo o procedimenco; • enviar imediatamente ao laboratório. Caso não seja possível. refrigerar a amostra. Tempo máximo após coleta sem refrigeração: duas horas. Urina (paciente cateterizado)
• retirar a bolsa e clampar a sonda; realizar desinfecção na ponca da sonda com sabão neutro líquido, reti rar o sabão com soro fisiológico; desprezar o pri meiro fl uxo uri nário;
18 ( Medicina laboratorial para o clínico ]1-- - - - -- - - - - - - - - - - -- - - -- - - - - - - --
• fazer a desinfecção da sonda em sua parte inicial, com álcool a 70%, polvidine tópico por dois minutos e novameme com álcool a 70%; • punciona-se a sonda com seringa e agul ha estéreis. Transferir o material para um frasco estéril; • enviar imediatamence ao laboratório. Caso não seja possível, refrigerar a amostra. Tempo máximo após coleta sem refrigeração: duas horas. Urina (aspirado suprapúbico)
Trata-se de amostra obtida por procedimentO médico invasivo e sem a possibilidade de comaminação pela microbiota urecral. É o ún ico método válido para cultura anaeróbica e também útil para a coleta de amostras de crianças ou adultos incapazes de fornecer amostras represemativas por meio dos procedimemos usuais. Os cuidados com aco ndicionamento e transporte são os mesmos utilizados para coleta de uri na do jaro médio. No local da punção deverá ser realizada anti-sepsia com álcool a 70%.
Aparelho genital feminino e masculin o
Secreção vaginal
Quando for solicitado exame a fresco (pesquisa de fungos e Trichomonas), Gram e/ou cultura de germes banais. deve-se: • instruir a paciente para comparecer ao laboratório sem higiene vaginal e sem urinar por pelo menos duas horas ames da coleta; • colocar a paciente em posição ginecológica e introduzir no canal vaginal dois swabs estéreis. O primeiro será usado para bacterioscopia (Gram e exame a fresco) e o outro para cultu ra. Swab endocervical
Quando solicitada pesquisa de Chlamydia e/ou cultura de Ureaplasma e Mycoplasma, deve-se: • realizar a coleta com o uso de espéculo vaginal; • remover com bola de algodão ou gaze estéril rodo o muco ou secreção existente no colo uterino;
Diagnóstico microbiológico: princípios e técnicas
• com swab próprio (de algodão ou fibra têxtil) fazer a coleta no colo uterino, provocando uma leve raspagem para obter células do endocérvix. Um swab é usado para preparar a lâmina de imunofluorescência para pesquisa de Chlamydia e outro swab para colocar no meio de transporte para cultura de Ureaplasma e Mycoplasma. Quando solicitado, especificamente, pesquisa e cultura para Neisseria gonorrhoeae. o sítio ótimo de coleta é o endocérvix. Na presença de corrimento abundante. este é o material de excelência para exame a fresco, Gram e cultura de germes banais. Secreção uretra!
• o paCiente deverá comparecer ao laboratório preferencialmente pela manhã, sem ter urinado e sem uso de qualquer medicação; • orientar o paciente para que retraia o prepúcio e limpe o meato com gaze estéril umedecida com soro fisiológico estéril; • solicitar ao paciente que comprima a base do meato ureual e, com uma alça bacceriológica, coletar o material e preparar o esfregaço para Gram no ato da coleta. Col her, também, dois swabs para realização do exame a fresco e cultu ra. Caso seja solicitada pesquisa de Chlamydia e/ou cultura de Ureaplasma e Mycoplasma. proceder como se segue: • introduzir na uretra em mais ou menos 1,0 cm o swab próprio e, delicadamente, fazer uma raspagem da mucosa com movimentos rotatórios; • um swab é usado para preparar a lâmina de imunofluorescência para pesquisa de Chlamydia e oun o para ser colocado no meio de transporte próprio para cultura de Ureaplasma e Mycoplasma. Urina de primeiro jato
A coleta de urina de primeiro jaco está indicada quando não há secreção urerral ou esta for mu ito escassa. Para se proceder à coleta, deve-se:
19
ro ou fazer esfregaços quando for UEilizar coloração de Fonrana-Tribondeau. Neste caso. não fiambar a lâmina, fixando-a com líquido de Ruge.
• orienrar o pacienre para que faça limpeza com água e sabão do mearo uretra! e então colher no máximo 10 ml de urina do primeiro jaro, desprezando o restante da micção no vaso; • no laboratório. centrifugar o material e trabalhar com o sedimenro. Quando a suspeita for de Trichomonas em secreção uretra! masculina e esta for escassa, introduzir um swab próprio no mearo uretra! do paciente e raspar a mucosa, pois este microrganismo rem predileção pela parede uretra!. Quando solicitada cultura em canal anal. inserir um swab próprio em aproximadamente 2 cm, fazendo movimentos rorarivos. O proced imento é o mesmo para homens e mulheres. Esperma
A colera deve ser realizada por masturbação manual, seguindo as orientações: • o paciente deverá lavar as mãos com água e sabão e com adequada rerração do prepúcio. lavar os órgãos genitais e secar com toalha limpa; • colher o esperma em trasco estéril de boca larga. • se a coleta for realizada em domicílio do paciente, a amostra deverá ser mantida em temperatura ambiente e transportada o mais rápido possível para laboratór o.
Lesões genitais
Cancro duro (pesquisa de Treponema pallidum)
• remover a crosta, quando presente; • limpar a lesão com gaze umedecida em solução fisiológica estéril. não usar sabão ou anti-séprico; • raspar a lesão com alça de platina até provocar ligeiro sangramenro ou utilizar irritação química com éter ou xilol; • apertar a base da lesão. entre polegar e indicador, e segurar aré exsudação de soro claro ou líquido seroso; • colerar esse material com alça e preparar lâminas. com lamínulas. para microscopia em campo escu-
20
Cancro mole (pesquisa de Haemophilus ducreyi)
• limpar a área da lesão com gaze umedecida em soro fisiológico estéril; • com uma alça bacteriológica, coletar material do centro da lesão e fazer esfregaços em uma única direção, em lâminas limpas e desengorduradas, para coloração de Gram. Este procedimento é necessário para preservar as características morfológicas típicas do microrganismo. Como o principal diagnóstico diferencial do cancro duro é feiro com cancro mole e como as infecções podem ser mistas. aconselha-se a pesquisa simultânea de T pallidum e H. ducreyi. Se o cancro for interno. na vagina. deve-se usar o espéculo vaginal e. primeiramente. remover o material vaginal. limpar com solução fisiológica e secar. Se for observada a presença de pomada sobre a lesão, removê-la e orientar o paciente para fazer compressas mornas no local. rerornando em 24 horas.
Fezes
Recomenda-se a colera de fezes para coproculru ra na fase aguda (diarréica) da doença. O transporte ao laboratório deve ser imediato para garantir a viabilidade dos agentes infecciosos e para evitar qualquer alteração das fezes, pois com o metabolismo bacteriano o pH torna-se ácido, comando-se tóxico para Shigella. O recipiente deve ser um frasco estéril com tampa de rosca. Não se deve usar swab, a não ser em pesquisas direcionadas, como em surcos hospitalares. levantamentos epidem iológicos e quando da impossibilidade do paciente de colher fezes. A quantidade de material colhido com swab é escassa, diminuindo a sensibilidade do exame. Para coleta de swab recai, recomenda-se: • umedecer o swab em sa'ina estéril e inseri-lo no esfíncrer reral. realizar movimentos rotatórios; • ao retirar o swab, certificar-se de que existe material fecal no algodão;
Medicina laborarorial para o clínico ]1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
-
- --
------
• incroduzir o swab no meio de cransporce. O número de swabs depende do ripo de investigação solicitada .
Tecidos e fragmentos ósseos
O melhor material é o obtido por procedimento cirúrgico, removendo-se e debridando-se o tecido desvitalizado. Os tecidos devem ser obtidos de panes representativas do processo infeccioso. eferuando-se, quando possível. a coleta de múltiplas amostras. A amostra deve ser transportada em recipiente estéril com adição de solução salina estéril para evitar o ressecamento, principalmente se for obtida pequena amostra, como uma biópsia. O médicoassistente deve informar todos os dados clínicos relevantes, tais como: presença de gás, cheiro fétido (suspeita de anaeróbios), mordida, suspeita de tuberculose, suspeita de infecção fúngica e presença de imunossupressão. Como o procedimento é invasivo, rodos os esforços devem ser feitos para assegurar a obtenção de amostra adequada e também para isolamento dos microrganismos clinicamente significativos da infecção.
Líquor e outros líquidos corporais
Deve-se proceder à anti-sepsia da pele com álcool e solução de iodo (tintura de iodo 1 a 2% ou PVPI 10%) e remoção com álcool a 70%. O líquor deverá ser coletado em tubos estéreis com rampa de rosca e um volume de S-10 ml deve ser obtido. Em nenhuma circunstância a amostra deverá ser refrigerada ou aquecida. Caso a colera permita somente a disponibilidade de um tubo, o laboratório de Microbiologia deverá ser o pri meiro a manipulá-lo. E, caso haja colera de dois ou mais tubos. o laboratório de Microbiologia deverá ficar com o tubo que contiver menos sangue. Se não for possível o envio imediato do líq uor ao Laboratório, este deve fornecer tubos estéreis vazios e com meio de cultura (ágar chocolate) para que o material seja semeado no ato da coleta e com instruções de acondicionamento e tra nsporte. A colera de outros líquidos corporais deve ser antecedida pela anti-sepsia do sítiOda punção com álcool a 70% e tintura de iodo. a qual deverá ser removida após o procedimento com álcool a 70%. Trata-se de procedimento médico. por
Diagnóstico microbiológico: princípios e técnicas
meio de punção percucânea, utilizando agulha e seringas estéreis. Se o volume for pequeno, o material obtido deverá ser enviado em frasco ou tubo estéril com tampa de rosca. Se o volume obtido for grande, este poderá ser inoculado em frasco de hemoculrura, rendo o cuidado de retirar bolhas de ar. Neste caso, uma pequena quantidade deverá também ser enviada ao laboratório para o preparo de bacterioscopias.
Sangue
Os facores mais importantes e que determinam o sucesso de uma hemoculrura são a anti-sepsia do sírio de punção e o volume de sangue processado. O volume ideal corresponde a 10% do volume total do frasco de coleta. Quanto maior o volume de sangue inoculado no meio de cult ura, por amostra, melhor a recuperação do microrganismo, respeitando-se a pro porção sangue/ meio, pois o sangue em desproporção com o meio pode dificultar a recuperação de microrganismos. Frascos que possibilitem coleta de até 10 ml são mais indicados. Não se deve coletar sangue para hemoculrura durante o pico feb ril, pois neste momento estão sendo liberadas endocoxinas ou exotoxinas dos microrganismos, que podem inibir a recuperação dos microrganismos. O momento ideal é no início do pico febril ou da bacteremia. Não é recomendada a técnica de coleta através de cateteres ou cânulas para diagnóstico de infecção sistêmica, quando punções venosas podem ser utilizadas. Também não se recomenda a troca de agulhas entre coleta e distri buição do sangue nos frascos específicos. Como em qualquer solicitação de exame laboratorial. o médico-assistente deve registrar a suspeita clínica, como endocardites, infecções fúngicas, suspeita de bactérias do grupo HACEK (Haemophilus, Actinobacillus. Cardiobacterium. Eikene/la, Kingella), pois são microrganismos de crescimento muico lento, necessitando de mais tempo de incubação. Diante da suspeita de brucelose e leptospirose. o laboratório deve ser comunicado previamente para providenciar o envio do material a centros de referência e indicar os meios específicos. Recomenda-se o seguinte procedimenco para colera de amostras de sangue para hemoculru ra: • coletar em local fechado, sem correntes de ar; • lavar as mãos com sabão degermante, enxugar e secar adequadamente;
21
• desinfetar a tampa dos frascos de hemoculrura com álcool a 70%; • garrocear o braço do paciente e, pela inspeção ou palpação, selecionar uma veia adequada. Esta área não deverá mais ser cocada com os dedos; • colocar as luvas de procedimento; • fazer anti-sepsia da pele com álcool a 70%, seguido de solução de iodo 1 a 2%, depois remover o iodo com gaze embebida de álcool a 70% em movimencos centrífugos. Esperar um minuto para secagem e para ação adequada do iodo; • coletar assepticamente e inocular nos frascos recomendados e agitar levemente por inversão; • anocar no rótulo do frasco: dados de identificação do paciente, data e hora da coleta, via de coleta (sangue periférico ou cateter). Volume de sangue recomendado: • 10-20 ml em adulcos; • 5,0-1 0 ml para crianças e adolescentes; • 1,0-2,0 ml para recém-nascidos.
• utilizando luvas. examinar o local, verificando se há presença de edema, ericema, linfangite, calor, dor e trombose venosa palpável; • fazer a desinfecção local com algodão embebido em álcool a 70%, álcool-iodado ou PVPI 10% tópico, removendo qualquer anrimicrobiano ou sangue presente na pele em torno do cateter; • retirar o cateter com auxílio de pinça hemostática estéril. A porção externa deve ser mantida para cima e afastada da pele. O cateter não deve tocar a pele; • enviar para o laboratório 5,0 a 7,0 cm da ponta distal do cateter, ou seja, a que estava mais profundamente introduzida na pele. Cortar o fragmento com tesoura estéril e colocar em um frasco estéril seco; • anocar informações cl ínicas, tais como: tipo de infusão, local ização anatômica, data da inserção e remoção do cateter, suspeita ou infecção provável. uso de antibióticos.
Exsudatos, transudatos, úlceras, feridas e abcessos
Número de amostras: Deve-se coletar duas ou três amosuas a cada 24 horas. As coletas devem ser eferuadas em intervalos de 30 a 60 minucos. Caso o paciente apresente choque séptico ou seJa necessário instituir imediatamente antibioticoterapia, obter simultaneamente as três amostras em sítios diferentes. Paciente com febre de origem indeterminada, coletar duas amostras em locais diferentes; se estiver com cateter, convém coletar uma terceira amostra pelo cateter. Manter a mesma proporção de sangue da coleta por via periférica: 1,0 ml de sangue para 5 ou 10 ml de meio de cultura/ caldo. Caso a febre persista e as hemoculruras continuem negativas após 48 horas de incubação, coletar mais duas amostras periféricas. Em se tratando de paciente neutropênico com cateter de longa permanência, coletar uma amostra pelo cateter. Diante da suspeita de endocardite, obter três amostras com intervalo de 30 a 60 minucos. Se negativas após 48 horas de incubação, coletar pelo menos mais duas amostras com o mesmo intervalo.
Deve-se evitar a contaminação com o material da superfície, procurando-se obter amostras da parte profunda da ferida após limpeza de sua superfície. Pode-se obter material por aspiração com seringa e agulha de abscessos localizados ou outros procedimentos cirúrgicos. Os aspirados de um abcesso fechado devem ser obtidos do centro ou da parede do abcesso e não da base do abcesso. Pode-se coleta r a drenagem de infecções do tecido mole por aspiração. Se não houver flutuação, pode-se infundir pequena quantidade de solução salina no tecido e, a seguir, retirá-la para cultura. O volume ideal para pesquisa de bactérias varia de 1,0 a 5,0 ml e, para micobactérias, 3,0 a 5,0 ml. Sempre que possível. deve-se evitar o uso de swab. Caso seja necessário usar swabs de algodão, deve-se colher a maior quantidade possível de exsudato e aco ndicionálo em recipientes adequados. Para realização de cultura, a imersão em meio de transporte é fundamental.
Catet er venoso
RECEPÇÃO DE AMOSTRAS E O BSERVAÇÕES PRELIMINARES
A coleta de carecer venoso para cultura segue o seguinte procedimento:
A manipulação das amostras biológicas que chegam ao laboratório de Microbiologia deve obedecer às nor-
22
Medicina laboratorial para o clínico )1-- - - - - -- - - -- - - - - - -- - -- - - - - -- -- -
mas de segurança, utilizando-se das barreiras de proteção necessárias para cada procedimento, como uso de capela de fluxo laminar, equipamentos de proreção individual (EPI) e um fluxo de trabalho bem estabelecido. As amostras deverão ser registradas num sistema informati-
rações, desde os menores vírus até parasitos multicelulares maiores. O resulcado de uma análise microscópica auxilia no diagnóstico presuntivo de um processo infeccioso e permite o início de terapia antimicrobiana direcionada.
zado ou caderno de registro e processadas o mais rápido possível. O laboratório deve avaliar as condições gerais das amostras enviadas e critérios de rejeição devem ser aplicados, quando necessário. Deve-se avaliar se a amostra e a solicitação médica dispõem dos dados necessários ao seu processamento: • nome completo e legível/número de registro do paciente/leito; • idade e sexo; data/hora de atendimento e hora da coleta; • nome do profissional solicitante; • exames solicitados e tipo do espécime clínico; • informações adicionais, como uso de medicamentos e outros de relevância; • indicação de urgência, quando aplicável.
EXAME DIRETO SEM COLORAÇÃO Preparação com salina
Trata-se de uma preparação não corada examinada à microscopia óptica comum, de campo escuro ou contraste de fase. É útil para examinar a morfologia em geral de organ ismos e amostras biológicas, tais como exame a fresco de secreção vaginal e secreção uretra!.
Gota pendente É utilizada para avaliar morilidade de bactérias Gram
Representam critérios de rejeição de amostras: • quando as informações contidas no pedido médico não correspondem às da amostra (nome do paciente ou espécime clínico, por exemplo); • transporte de amostras em temperatu ra imprópria; • transporte de amostras após duas horas da coleta, sem utilização de meio de transporte; • amostra insuficiente para realização dos exames solicitados, tais como swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos; • amostras enviadas em recipientes com vazamento, frascos quebrados ou com sinais de contaminação na superfície externa; • amostras enviadas em formal ou outras soluções fixadoras ou amostras ressecadas.
negativo não fermentadoras de açúcares. A técnica consiste em colocar uma gota do caldo com a bactéria em estudo no centro de uma lamínula; pingar óleo em cada ponta; inverter a lamínula sobre a concavidade de uma lâmina com esta depressão. Resultado: a motilidade positiva é observada quando as bactérias trocam de posição em relação a si mesmas.
Solução iodada de lugol
Adiciona-se iodo a preparações a fresco de amostras para exame parasitológico, a fim de aumentar o contraste das estruturas internas. A técnica facilita a diferenciação entre amebas e leucócitos.
Preparação com hidróxido de potássio - KOH (10% a 40%)
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS APLICADAS À MICROBIOLOGIA
O uso da microscopia no laboratório de Microbiologia ajuda a definir as relações entre uma diversidade de microrganismos com o meio ambiente e suas inte-
Diagnóstico microbiológico: princípios e técnicas
O KOH é utilizado para dissolver o material de fundo (proteináceo) e facilitar a detecção de elementos fúngicos, que não são afetados pela solução alcalina forte. Podem ser adicionados corantes como o lactofenol azul de algodão para aumentar o contraste entre os elementos
23
fúngicos e o fundo da preparação. Éempregado no exame micológico de raspado de pele, unhas ou cabelo.
Preparação com tinta da China
Modificação do tratamento pelo KOH. em que se adiciona tinta da China como material de contraste. Corante utilizado principalmente para detecrar espécies de Cryptococcus no líquor e outros líquidos orgânicos. A cápsula de polissacarídeo das espécies de Cryptococcus afasta a tinta, criando um halo transparente ao redor da célula.
Microscopia de campo escuro
São utilizadas as mesmas lentes do m1croscópio óptico. entretanto, usa-se um condensador especial que impede que a luz transmitida ilumine diretamente a amostra. Apenas a luz oblíqua e dispersa atinge a amostra e passa pelos sistemas de lentes. fazendo com que a amostra torne-se ilum1nada contra um fundo escuro. A vantagem desse mécodo é seu poder de resolução, que é significativamente superior ao da microscopia óptica. isto é, 0.02 versus 0,2 IJm. permitindo a detecção de bactérias extremamente finas. como Treponema pallidum. Borre/10 e espéoes de Leptosp1ra.
do microrganismo, das condições de cultura e das habilidades de coloração do microscopista. Entre as indicações para realização do exame bacterioscópico pelo mécodo de Gram, destacam-se: • fornecer resultados preliminares para os objetivos clínicos e secundariameme para medidas do controle da qualidade do cultivo bacteriano; • avaliação da qualidade de algumas amostras, tais como escarro, urina e secreções de feridas. É válido ressaltar que a grande limitação do reste é a sensibilidade, pois para que uma célula bacteriana possa ser observada por campo em aumento de 1.000x (lente de imersão), a concentração deverá ser em torno de 105 células bacterianas/ml de espécime clínico. No Quadro 3.2 encontram-se as características morfotlntoriais de diversos microrganismos de interesse médico.
Coloração de Ziehi-Neelsen
Utilizada para corar micobacrérias, bem como outros microrganismos ácido-resistentes. Os microrganismos são corados com carbolfucsina básica e resistem à descoloração com soluções de álcool-ácido. O fundo é contracorado com azul de metileno. Os organismos aparecem vermelhos contra um fundo azul-claro. A captação de carbolfucsina requer o aquecimento da amostra (coloração ácido-resistente a quente).
COLORAÇÕES DIRETAS Coloração de Gram
Coloração de Kinyoun
A coloração de Gram é a mais comumence utilizada no laboratório de Microbiologia, constituindo a base de classificação dos principais grupos de bactérias (Gram poSitivo e Gram negarivo). Arós fix<~ção ri<~ <~mo~rr<~ ~ l~mina (tratamento pelo calor ou álcool). esta é exposta a uma solução de cristal violeta e, a seguir, adiciona-se iodo (lugol) para formar um complexo com o corante primário. Durante a descoloração com álcool ou éter-acetona, o complexo é retido nas bactérias Gram positivo, porém perd1do nas bactérias Gram negativo; o contracorante (fucsina ou safranlna) é retido pelos microrganismos Gram negativo (cor vermelha). O grau de retenção do corante é uma função
Coloração ácido-resistente a frio (não exige aquecimento). Mesmo princípio da coloração de Ziehi-Neelsen.
24 ( Medicina laboratorial para o clínico
Coloração auramina-rodamina
Mesmo princípio de outras colorações áodo-resistentes, exceto que são utilizados corantes fluorescentes como corante primário, enquanto o permanganato de potássio (agente oxidante forre) é o contracorante que inativa os corantes fluorocromos não ligados. Os organismos emitem fluorescência verde-amarelada contra um fundo preto.
Quadro 3.2 - Características morfotinroriais de diversos microrganismos de interesse médico
Coloração ácido-resistente modificada
Utiliza-se um agente de descoloração fraco com Cocos Gram positivo
Gênero
Dispostos aos cachos
Stophylococcus
Drspostos em cadeias
Streptococcus, Enterococcus
Dispostos aos pores, encapsulados, às vezes em chamo de velo
Streplococcus pneumonioe
Dispostos em grupos de quatro (tétrode)
Micrococcus
Cocos Gram neg ativo
Gênero
Aeróbios em formo de grãos de café, dispostos aos pores
Neisserio
Anoeróbios
Veilonello
Bastonetes G ra m n egativo Bastonetes retas, normalmente pequenos, com cápsula
quanto as micobactérias são fortemente ácido-resis-
tentes, outros organismos coram-se mais fracamente (exemplos: Nocardia, Rhodococcus, Cryptosporidium,
/sospora, Sarcocystis, etc.). Esses organismos podem ser corados com mais eficácia utilizando-se um agente descorante fraco nas colorações ácido-resistentes. Os organismos que retêm este corante são conhecidos como parcialmente ácido-resistentes. É uma coloração utilizada principalmente para diferenciar os gêneros Nocardia (parcialmente ácido-resistente) do gênero Actinomyces.
Gênero
Klebsiello, enteroboctérios
Formas diplobacilares
Moroxello, Acmetobocter
Bastonetes retas, normalmente mais finas
Pseudomonos e outros não fermentadores
Bastonetes curvos
Vibrio
Bastonetes curvos, mais curtos ou médios (esfregaça endocérvix/ vaginal)
Mobiluncus
Formas filamentosos, de extremidades afiladas (fusifarmes)
Fusobocterium
Bastonetes curtos ou médios, de extremidades arredondados (anaeróbio)
Bocteroides
Bastonetes Gram positivo não
Gênero
esporu lados Filamentos ramificados que, nos tecidos, formam grãos
qualquer um dos três corantes acido-resistentes. En-
Nocordio (oeróbio). Aclinomyces (anaeróbio)
Bastonetes retas ou lrge~romente encurvados, com extremidades claviformes e granulações
Coryneboc/erium
Bastonetes curtos
Usterio
Bastonetes curtos com tendência à formação de filamentos
Erysipelothrix
Bastonetes retas, finos e relativamente longos
Loctobocillus
Bastonetes Grom positivo esporulodos aeróbios. bastonetes nédios, largos
Boci//us
Bastonetes Grom positivo esporulodos onoeróbios: bastonetes médios, largos
Closlridium
CO LORAÇÕES FLUORESCENTES Neste tipo de microscopia são utilizados alguns compostos denominados fluorocromos, que podem absorver a luz ultravioleta ou azul-violeta e emitem energia num comprimento de onda maior vtsível. O microscópio emprega uma lâmpada de vapor de mercúrio, halogênio ou xenônio de alta pressão, que emite um comprimento de onda de luz mais curro do que aquela emitida pelo microscópio óptico tradicional. A luz emitida a partir do fluorocromo é aumentada por meio da objetiva e ocular tradicionais. As amostras e organismos corados com fluorocromos aparecem iluminados de modo brilhante contra um fundo preto. embora as cores variem, dependendo do fluorocromo utilizado. O contraste entre o organismo e o fundo é grande o suficiente para que a amostra possa ser rapidamente visualizada com baixo aumento; uma vez detectada a fluorescência, o material é observado em maior aumento.
COLORAÇÃO PELO AZUL DE TOLUIDINA E AZUL DE METILENO Coloração utilizada principalmente para detecção de Pneumocystis em amostras respiratórias. Os cistos coram-se de azul-avermelhado a púrpura denso, com fundo azul claro. A coloração de fundo é removida por solução sulfatada. Células leveduriformes coram-se. sendo difícil diferenciá-las. Está sendo substituída por colorações fluorescentes específicas.
D iagnóstico m icrobiológico: p rincípios e técnicas
25
Azul de metileno
aumentando seu número
e se acumulando
em co-
lónias (grupo de células que podem ser visua lizadas Coloração tndicada para ser realizada junto com a
sem a utilização de um microscópio) que contêm
coloração de Gram para sedimentos de líquor. As bac-
milhares de células ou populações que agrupam bi-
térias Gram negativo como
Haemophdus rnfluenzae e
Ne1ssena meningitidis freqüemememe
não
se desta-
lhões de células. Os objerivos principais do cul tivo microbiano são
cam conua o fundo corado em vermelho da colora-
o isolamemo de agemes etiológicos de determina-
ção do Gram. Com a utilização do azul de metileno.
do processo infeccioso. distinguindo-os de prováveis
os leucócitos polimorfonucleados coram-se de azul
concaminames e da f lora indígena. As cu/curas quan-
escuro e as baccérias são melhor visualizadas contra
t itativas. por sua vez. cêm por fina lidade correlaciona r
um fundo cinza claro.
a incens1dade do crescimemo com dada situação cl ínica. na qual a pamopação de agemes da microbioca indígena é relevance.
COLORAÇÃO COM BRANCO DE CALCOFLÚOR
Existe grande variedade de meios disponíveis comercialmeme, porém a seleção de um pequeno número de
Utilizada para a detecção de elemenws fúngicos e
meios seletivos e não seletivos é suficiente para o iso-
Pneumocystis. O corante liga-se à celulose e
lamento da grande maioria de microrganismos envol-
espécies de
quitina nas paredes celulares; pode-se misturar o corante
vidos em infecções humanas. Esta seleção depende de
com KOH (mutws laboratórios substituíram a prepara-
cmérios biológicos Individuais dos m icrorganismos e da
ção cradic1onal de KOH por esca coloração).
origem do sítio de infecção. rendo como referência quais são os pnnopa1s microrganismos envolvidos naquele sírio específ1co.
COLORAÇÃO D E W RIGHT-GI EMSA
Me1os seletivos são elaborados com o objecivo de favorecer o crescimento da bactéria de interesse. impe-
Utilizada para detecção de parasiws no sangue,
dindo o crescimemo das outras bactérias. Têm-se como
corpúsculos de inclusão virais e estruturas fúngicas de
exemplos o ága r MacConkey-seletivo para baswnetes
Borre/ia. Toxoplasma,
Gram negativo. Meios não seletivos, como o ágar sangue
micoses sistêm1cas e espécies de
PneumocystJS.
t
uma coloração policromática que as-
e o ágar chocolate, são isencos de inibidores e permitem
socia azul de metileno e eosina. Os uofozoícas dos pro-
o crescimemo da maioria dos microrganismos isolados
wzoários possuem núcleo vermelho e ciwplasma azul-
no laboratório clínico.
acinzentado; as leveduras intracelulares e corpúsculos de inclusão coram-se tipicamente de azul; espécies de
Pneumocystrs coram-se de púrpura.
CULTIVO SECUNDÁRIO
CULTIVO PRIMÁRIO
para o estudo de um microrganismo isolado no plan-
Quando são necessários procedimemos adicionais eio pnmário, subculcivos são realizados com o ob)et1vo O cultivo primário é um processo de crescimen-
de obter uma cultura pura originária de uma cultura
to de microrganismos presentes em um sírio infec-
mista. isco é, com mais de um tipo de colónia. A téc-
(m vivo) recuperado em um ambiente artificial (rn vitro). O êxito da cransição do meio in vrvo para o meio in vitro depende dos nucrientes e con dições
nica consiste na transferência da colónia para oucro
cioso
meio de cultura. Essa dinâmica da rotina microbiológica. classicamen-
ambientais adequados para que a bactéria desen-
te lema. deve ser compreendida pelos médicos e uma
volva e se multiplique. Crescimento microbiano se
comunicação com o laboratório deve ser estabelecida
refere ao número e não ao tamanho das células. Os
a fim de evitarem-se prejuízos ao paciente, como o uso
mtcrorganismos em crescimento estão, na verdade,
desnecessário de amimicrobianos.
26 ( Medicina laborarorial para o clínico
TESTES DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
Difusão de discos (Kirby-Bauer) é a prova clássica, usada há vários anos pela grande maioria dos laboratórios. É um método que oferece resultados qualitativos.
É uma atribuição fundamental do laboratório de
ou seja. o microrganismo
é avaliado como sensível (S),
Microbiologia realizar metodologias padronizadas que
intermediário (i) ou resistente (R) aos diferentes antibi-
permiram a análise de sensibilidade dos microrganiscrobiano mais adequado, contribuindo para o sucesso
óricos resrados, de consranre pad ronização pelo Clinical and Laboratory Standards lnstitute (CLSI), de fácil real ização e de custo razoável, razão pela qual é ainda
terapêutico.
o mais utilizado pelos laboratórios de Microbiologia. O
mos, com o objetivo de auxiliar a escolha do antimi-
O conhecimento das características do perfil de
princípio básico consiste no contara de discos impreg-
sensibilidade de cada instituição hospitalar é peça fun-
nados com antibiótico com a super fície úmida do ágar
damental para que a Comissão de Controle de Infecção
Mueller-Hinron; a água
Hospitalar possa instituir uma política de uso racional de
e o antibiótico se difunde para o mei o circundante. Este
antimicrobianos.
mécodo tem como prin cipais lim itações a impossibili-
O objetivo do antibiograma é verificar a sensibili-
é absorvida pelo papel de f iltro
dade de liberação de resu ltados quantitat ivos
e a não
dade ou resistência de um microrganismo frente a
aplicação para m icro rganismos de crescimento lento,
uma concentração padronizada de antimicrobiano. É
como fungos e anaeróbios, além da imprecisão em re-
indispensável para microrganismos que apresentam
lação a antimicrobianos de fraca difu são em ágar. como
variações quanto à sensibilidade e resistência aos anti-
as polimixinas.
microbianos, para bactérias isoladas de amostras clínicas representativas de um processo infeccioso, no qual a sensibilidade aos antimicrobianos não é p revisível, e
CONSIDERAÇÕES FINAIS
para fins epidemiológicos. O antibiograma apresenta limitações. como:
Todo resultado liberado pelo laboratório de Micro-
• não prediz tOxicidade ou hipersensibilidade;
biologia é conseqüência da qualidade da amostra re-
• não prediz resistência futura;
cebida. O material coletado deve ser representativo do
• não reproduz as condições do sítio de infecção;
processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o
• não garante que o agente antimicrobiano testado renha acesso ao sírio de infecção.
melhor sítio de coleta, evitando-se contam inação com áreas adjacentes. A colera e o transporte inadequados podem acarre-
Existem várias metodologias bem padronizadas que podem ser utilizadas: • métodos quanmativos que determinam a concentração inibitória mínima (cim): m icrodiluição, macrodiluição e e-test;
tar falhas no ISolamento do agente infeccioso, tanto em relação ao isolamento de contaminantes, quanto ao não isolamento do m icrorganismo responsável pelo processo em investigação. Muitas vezes é impossível definir o significado clí-
• métodos qualitativos, que dividem os microrga-
nico de um isolado microb iológico, caracterizando-o
nismos em resistentes. sensíveis ou de grau de
como patógeno ou mero contaminante. Tal decisão
suscetibilidade intermediário ao antimicrobiano
deve ser pautada em evidências microbiológicas, clíni-
testado (disco difusão);
cas e epidemiológicas.
• métodos automa tizados; • méwdos que diretamente detectam a presença
REFERÊNCIAS
de um mecanismo de resistência específica em uma bactéria isolada; • métodos especiais que medem interações do complexo anrimicrobiano - microrganismo.
Diagnóstico microbio lógico: princípios e técnicas
1.
Cl inical and Laborarory Standards lnstitute. CLSI. M100S15: normas de desempenho para testes de sensibilidade antlmicrobiana; 15° Suplemento Info rmativo. Disponível em: http://www.sbmlcroblologla.org.br/clsi_OPASMlOOS15.pdf
27
2. Forbes BA. Sham DF. We1ssfeld AS. Ba1ley's & Scon's D'agnosric Microb1ology. 101h ed. Sr Lou1s: Mosby; 1998. 3 Koneman EW. Allen SD. !anda WM. Scheckenberger PC. Wlnn )r WC. DiagnóstiCO MicrobiológiCO. s• ed. RIO de )ane1ro: Meds1; 2001 4 Murray PR. Baron EJ. Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Ciln1cal M1crobiology. gth ed. Wash1ngron DC: American Soc1ery for Microbiology; 2003 5. NCCLS. Padron1zação dos restes de sens1b1hdade a ant1m1crob1anos por d1sco-difusão: norma aprovada. s• ed. D1sponível em: hnp://www.anvisa.gov.br/serv1cosaude/ manua1s/cls1/cls1_OPASM2 -A8.pdf.
28
Medici na laboratorial para o clínico
6. Oplusnl CP. Zoccoh CM. Toboun NR. Smto SI. Procedimentos Bás1cos em M1crob1olog1a Clín1ca. São Paulo Sarvier; 2000. 7. Serufo JC. Clemente WT. Pnncíp1os Gera1s do D1agnóst1· co Laboraronal nas Doenças lnfecc1osas. ln: Pedroso ERP. Rocha MOC. ClíniCa Méd1ca - 1\ntlblotlcorerapla - Belo Honzonre: Medsi; 2001. 8. The Nacional Comm1rree for Ciln1cal Laborarory Srandard. Metodologia dos restes de sens1b11idade a am1 microb1anos por dllu1çào para bacréna de cresc1memo aeróbio: norma aprovada. 6• ed. D1sponível em: hrrp:/1 www.sbmlcroblologla.org.br/clsi_OPASM7_A6.pdf.
Cybele de Andrade Paes Sandra Guerra Xavier Teresa Bunte de Carvalho
04
DIAGNÓSTICO HEMATOLÓGICO:
PRINCÍPIOS E TÉCNICAS
O exame do sangue periférico é necessariamente solicitado na avaliação hemawlógica do paciente. Devido ao fácil acesso e proximidade com codos os tecidos. o sangue pode proporcionar evidências precoces de alterações no estado de saúde e no desenvolvimento de doenças. As informações fornecida s pela história clínica e exame físico aliadas à avaliação cuidadosa da morfologia celular e quantificação dos elementos sangü íneos podem fi rmar um diagnóstico preciso e orientar quanto à instituição de terapêutica adeq uada.
A COLETA DE AMOSTRAS PARA EXAMES HEMATOLÓGICOS A coleta de amostra biológica adequada é fundamental para a obtenção de dados laboratoriais confiáveis e precisos. devendo ser padron izada para reduzir-se variabilidade nos resultados. Para o exame hematológico. o sangue é obtido por punção venosa (flebocomia) e coletado em tubos contendo anticoagulante. Na sua impossibilidade, várias determinações podem ser realizadas em amostras colhidas em polpa digital. lobo de orelha ou superfície plantar do calcanhar ou hálux (crianças e recém-nascidos). Respeitando-se a técnica de coleta adequada, é recomendada a utilização de tubos a vácuo siliconizados comercializados por conterem a concentração correta de anticoagu-
lance. se preenchidos com volume adeq uado de sangue. Desta forma. tanto a morfologia quanto as contagens das células são preservadas.
FATORES FISIOLÓGICOS QUE AFETAM OS RESULTADOS DOS TESTES Fatores fisiológicos tais como sexo do paciente. idade, raça. atividade física. nível de hidratação e temperatura corporal podem afetar significativamente os parâmetros hematológicos. Outros fatores, incluindo uso de medicamentos. tabagismo e ansiedade. também podem provocar alterações em alguns deles (Quadro 4.1). Em fu mantes, observam-se concentrações elevadas de carboxihemoglobina. que produzem eritrocitose absoluta e níveis aumentados da concentração de hemoglobina e do hematócrito. sendo esse aumento proporcional ao consumo diário. Além disso, contagens mais baixas de neutrófilos podem ser encontradas nesses indivíduos. Quadro 4.1 - Facores que influenciam os parâmetros hemacológicos sexo idade raça a tividade física nível de hidratação
uso de medicamentos temperatura corporal tabagismo ansiedade
a) Variação fisiológica na contagem de erítrócítos Variações na contagem de eritrócicos são mais acentuadas nas primeiras semanas de vida. Após a primeira ou segunda semana de vida extra-uteri na, os níveis de hemoglobina caem, em média, de 17 g/dL para 12 g/
dL até os dois meses de idade. Após esse período. os níveis permanecem relativamente constantes durante o primeiro ano de vida. Crianças com concentrações de hemoglobina aba ixo de 11 g/dL devem ser consideradas anêmicas. Segundo o critério da O rganização Mundial de Saúde, uma concentração de hemoglobina abaixo de 12 g/ dL para mulheres e 13 g/dL para homens indica anemia. Nos adultos de ambos os sexos, as taxas de hemoglobina e de hemarócrito tendem a ser mais elevadas nos homens. Após a meia-idade, os homens tendem a apresentar queda nos parâmetros hematimétricos e nas mulheres estes podem elevar-se levemente ou manter-se inalterados. Na gravidez normal ocorre uma expansão gradativa do volume sangüíneo de 40 a 50%, mantendo-se até o termo. Esse aumemo parece ser mediado pela ação de estrógeno e progesterona. Observa-se, também, elevação do número de eri trócitos conseqüente à hiperplasia eritróide da medula óssea. Apesar do aumento da eritropoese, as concentrações de hemoglobina, hemácias e hematócrito diminuem ligeiramente. Policitemia secundária à baixa pressão atmosférica é observada em altas altitudes devido a aumento nos níveis de eritropoerina plasmática. A exposição à hipóxia ocasiona elevação transitória na concentração de hemoglobina e do hematócríto devido a um rápido decréscimo no volume plasmático seguido de aumento da eritropoese per se. b) Variação fisiológica na contagem de leucócitos A leucomerria ao nascimento e nas primeiras 24 horas de vida apresenta grandes variações. Os neutróFilos são as células predominantes nessa fase, variando de 6 a 28 x 109 /L e permanecendo em torno de 5 x 109/L a parti r da primeira semana. Ao nascimento, a contagem de linfócitos é, em média, 5.5 x 109/Le assim permanece até aproximadamente os sere anos, qua ndo os neutrófilos passam a predomi nar. As contagens de neutrófilos e de leucócitos tendem a apresenta r um mesmo padrão de variação diurna, em um mesmo indivíduo. Leucocitose está relacionada a exercícios fí-
30 [ M edicina laboratorial para o clínico
sicos; e concentrações mais baixas de neuuófilos são encontradas em indivíduos negros. c) Variação fisiológica na contagem de plaquetas Ao nascimento, a contagem de plaquetas rem seus valores de referência mais baixos que em crianças maiores e adultos, podendo variar de 84 a 478 x 109/L. Estes valores atingem os níveis de adultos após a primeira semana de vida. Nas mulheres. contagens mais baixas são encontradas durante o período menstrual.
ASPIRADO DE MEDULA ÓSSEA A aspiração da medula óssea é o procedimento utilizado para obtenção de material medular, objerivando: a) escudo ciromorfológico. por meio do mielograma; b) estudo citoquímico; c) escudo imunofenorípico, por imunofluorescência ou ciromerria de fluxo; d) estudo citogenético, por meio de citogenética clássica e/ou molecular; e) estudo molecular, por meio de métodos de biologia molecular; f) escudo do ferro medular; g) estudo microbiológico, por intermédio de métodos di retos e cultura, emre outros. A avaliação minuciosa da medula óssea deve incluir tanto a aspiração quanto a biópsia, sendo ambos os restes complementares. Diversos tipos de agulhas são utilizados para a aspiração; a maioria possui um mandril removível para prevenir a sua obstrução, até que se atinja o canal medular, momento em que será retirado e a agulha acoplada a uma seringa, para que se proceda à aspiração. Alguns modelos de agulha possuem um anteparo protetor para aJUStar a profundidade da penetração no tecido ósseo (Figuras 4.1 e 4.2).
Figura 4.1 - Agulha de mielograma reutilizável.
• • • • •
esradiamento de rumores envolvendo a medula; possíveis infecções por organismos intracelulares; doenças metabólicas de depósiro; desordens imunológicas; doenças não hematopoéticas.
Ocasionalmente, a medula óssea encontra-se tão envolvida pelo processo infilrrativo que nenhum material é aspirado (punção seca) e a biópsia representa a única opção diagnóstica. Figura 4.2- Agulha de m1elograma descarcável com anceparo procecor.
BIÓPSIA DE MEDULA ÓSSEA A escolha do sítio de coleta da amostra medular é condicionada, entre outros fatores, à idade do paciente, à sua condição clínica, à d1ficuldade de acesso e aos riscos envolvidos. Em recém-nascidos e lactentes, as punções são realizadas na reg1ão nb1al média anterior; em crianças maiores e adultos, na cnsta ilíaca postenor ou ante no r. Em adultos, o manúbno e o corpo do esterno (na altura do segundo espaço Intercostal) também são freq üentemente utilizados como local para aspiração de medula óssea havendo, no entanto, risco de complicações secundárias à penetração acidental da cavidade torácica. Procedimento técnico: 1. Definir o local do procedimento e realizar assepsia; 2. Anestes1ar a pele, o tecido celular subcutâneo subjacente e o periósteo, com xilocaína 2% sem vasoconscritor (alguns pacientes pediátricos e adultos requerem sedação prévia); 3. Introduzir a agulha acoplada ao mandril. com movimentos rotatórios, até a comcal óssea; 4. Retirar o mandril ao se atingir o canal medular; 5. Acoplar uma seringa de 20 ml à agulha e proceder à aspiração (a quantidade de material aspirado é dependente do estudo a ser realizado); 6. Ret1rar a agulha e fazer curatiVO compressivo local. As indicações para a aspiração da medula óssea incluem: • diagnóstico de leucemias agudas e crônicas; • mielodisplasias; • controle de tratamento quimioterápico; • avaliação de citopenias; • depósiros de ferro e presença de ferro anormal em precursores eritró1des;
Diagnóstico hemacológico: princípios e técnicas
A biópsia de medula óssea é um procedimenro amplamente utilizado na prática médica, não só para o diagnóstico de diversas doenças hemarológicas ou metastáticas, como também no acompanhamento das primeiras. Embora menos simples e confortável que a punção aspirativa, a biópsia preserva a arquitetura medular e fornece dados importantes sobre sua estrutura, celularidade, topografia das células e grau de fibrose (através da impregnação das fibras de reticulina pela prata). Por outro lado, devido à sobreposição de células e à desidratação das mesmas pelo formal (freqüentemente utilizado como fixador), torna-se difícil a identificação de estruturas isoladas, seu estágio de maturação e detalhes morfológicos. No momenro do procedimento a biópsia de medula óssea deve ser realizada ames da punção aspirativa da crista 11íaca, posterior ou amenor ou em um sítio contíguo ao da aspiração para eVItar hemorragia no local e artefatos no material biopsiado. A agulha de biópsia é mais calibrosa que a de aspiração e é acompanhada de obturador, lâmina cortante e estilete para remoção do fragmento ósseo (Figura 4.3). O procedimento consiste na retirada de um fragmenro ósseo cilíndrico de 2 a 3 cm de comprimento e os cuidados prévios à realização da biópsia são os mesmos aplicados à punção aspirativa. Procedimento técnico: 1. Definir o local do proced1mento e realizar assepsia local; 2. Anestesiar a pele, o tecido celular subcutâneo subjacente e o periósteo com xilocaína 2% sem vasoconsrritor (alguns paciemes pediátricos e adultos requerem sedação prévia);
31
• doenças infecciosas; • processos infiltrativos focais (carcinomas, linfomas e outros rumores).
ADITIVOS UTILIZADOS NOS TUBOS DE CO LETA Anticoagulantes são substâncias utilizadas para pre-
c
venir a coagulação e retardar a deterioração do sangue. Os mais utilizados em hemarologia são os sais dissódicos ou dipotássicos do ácido etilenodiaminocerracétiCO
Figura 4.3 - Agul ha de b1ópsia de medula óssea descartável.
(EDTA), o cirrato trissódico
ea
heparina. O EDTA
e
o
cirraro trissódico impedem a coagulação removendo o
3. IntroduZir a agulha acoplada ao obturador, com
cálcio do plasma por precip itação o u por ligação em for-
movimentos rotatório s, em sentido horário. até
ma não ionizada. O EDTA é o anticoagulante de escolha
ultrapassar a cortical óssea;
nas contagens hematológicas e na confecção de esfrega-
4. Retirar o obturador ao se at1ngir o cana l medular
ços (produz distorções mínimas nas células sangüíneas.
e medir a parte da agulha ainda exteriorizada;
impede a aglutinação das plaquetas) e o citrato trissó-
5. Prosseguir com movimentos no sentido horário
dico nos estudos da hemostasia. A heparina, na presen-
até que se penetrem aproximadamente 2 a 3 cm;
ça da antitrombina III plasmática. neutraliza a trombina
6. Q uebrar o fragmento biopsiado, que se encontra
inibindo a interação de vários fatores da coagulação. Esse
na luz da agulha, forçando a agulha em movimen-
aditivo não altera a morfologia e o tamanho cel ular, pre-
tos látero-laterais e longitudinais;
vine a hemólise e seu uso está indicado nos testes de
7. Proceder à retirada da agulha com movim entos
fragilidade osmótica dos eritrómos. Os esfregaços de
rotatórios, em sentido anti-horáno. devagar;
sangue heparinizado adquirem coloração azulada quan-
8. Comprimir o local e realizar curativo com pressivo;
do corados. contra-indicando sua utilização para estudo
9. Com auxílio do estilete, retirar o fragmento biop-
ciromorfológico.
siado do interior da agulha, sempre em sentido contrário. para não danificá-lo;
10. Realizar dro
e
imprint do fragmento em lâmina de vi-
rransferi-lo para um frasco com solução
CONFECÇÃO DO ESFREGAÇO DE SANGU E PERIFÉRICO E MEDU LA ÓSSEA
fixadora;
11. Em seguida, a amostra deve ser descalcificada,
O exame do esfregaço sangüín eo proporciona in-
parafinada, microcorrada e montada em lâminas
formações importantes em uma ava liação hemaroló-
e estudos anatomopatológico e
gica e complementa os dados o btidos pelo analisador
para coloração
imunohistoquímico.
hematológtco. O esfregaço é uma camada de células estend ida sobre uma lâmina de microscopia. As célu-
As indicações da biópsia de medula óssea incluem: • avaliação de aplasia
e hiperplasia medular;
las. após serem fixadas e t ratadas com corantes especiais, adquirem colo ração adequada para seu estudo
• doenças mieloproliferativas;
microscópico. Os esfregaços de sangue periférico po-
• mielodisplasias:
dem ser preparados com amostras colhidas em EDTA
• m1eloma múltiplo;
ou sem anticoagulante, co lhidas p or punção de polpa
• leucemia de células pilosas;
d igital. Os esfregaços de sangue não anticoagulado,
• inflamação granulomatosa;
quando confeccionados prontamente após a colhei ta,
• fibrose;
preservam melhor a morfo logia e as características cin -
• doenças de depósito;
roriais das células.
32 [ Medicina laboratorial para o clínico
Uma gota de sangue ou de medula óssea é colocada a 1 ou 2 cm da extremidade da lâmina. Uma segunda lâmina é posicionada a um ângulo de 30 a 45 graus em relação à primeira e movida em direção ao sangue. Após a gota de sangue espalhar-se ao longo de sua borda, a lâmina é deslizada rápida e uniformemente em sentido contrário, ao longo de 3 ou 4 cm, mantendo a mesma angulação, evitando-se que o sangue toq ue as bordas latera is da primeira lâmina (Figu ra 4.4). O esfregaço deve secar ao a r livre, antes de ser identificado e corado.
A
B
c Figura 4.4 - Confecção do esfregaço. A: uma gota de sangue ou de medula óssea é colocada a 1 ou 2 cm da extremidade da lâmina. Uma segunda lâmina é posicionada a um ângulo de 30 a 45 graus em relação à primeira e movida em direção ao sangue. B: a gota de sangue espalha-se ao longo da segunda lâmina. C: a segunda lâmina é deslizada rápida e uniformemente em sentido contrário, ao longo de 3 ou 4 cm, mantendo a mesma angulação. evitando-se que o sangue roque as bordas lateraiS da prime1ra lâmina.
O esfregaço é dividido em três partes: cabeça ou porção inicial, corpo e cauda. No sangue periférico, os neutrófilos polimorfonucleares e os monócitos predominam nas margens e cauda do esfregaço e os linfócitos na parte central. A sua espessura depende do tamanho da gota de sangue, da angulação e da velocidade de deslizamento da lâmina. A camada de células adelgaça-se progressivamente da origem à cauda do esfregaço; o local ideal para a anál ise individual das células é na transição do corpo com a cauda e na cauda, onde as mesmas se encontram lado a lado, sem se tocar.
Diagnóstico hematológico: princípios e técnicas
O EXAME DO ESFREGAÇO DE SANGUE PERIFÉRICO E MEDULA ÓSSEA O estudo morfológico da medula óssea e do sangue periférico consiste na análise quantitativa e qualitativa de suas células por meio de microscopia óptica comum de esfregaços corados. O escudo microscópico do esfregaço pode ser sistematizado em duas fases: 1ª fase: em aumento de 100 e 400 vezes - aspectos gerais do esfregaço, observando-se a distribuição das células, a qualidade da coloração, a cel ularidade do material, a presença de agrupamentos celulares e da população megacariocítica (nos estudos de medula óssea) e a escolha dos campos para o exame com a objetiva de imersão; 2ª fase: em aumento de 1.000 vezes, sob imersão em óleo - contagem diferencial, avaliação das características citomorfológicas dos diferentes tipos celulares e presença de parasitos. Essas células são definidas pela análise do contorno celular; tamanho do núcleo e relação núcleo-citoplasmática; coloração e padrão de cromatina nuclear, presença de nucléolos; coloração citoplasmática, presença e características dos grânulos; presença de vacúolos, projeções ou inclusões. O escudo da medula óssea pelo mielograma propicia uma excelente visualização da morfologia celular e enumeração de seus elementos. São aspectos analisados: • a celularidade e o aspecto do material e a celularidade relativa (índice gra nulocítico/eritrocítico - GE); • a maturação das células (séries eritrocítica, granulocítica, megacariocítica, linfoplasmocitária e histiocítica); • atipias celulares; • a presença de células de depósito. eritrofagocitose, infiltração por células tumorais e células necróticas; • a presença de parasitos. A contagem diferencial da medula óssea de indivíduos normais pode apresentar grandes variações devido ao padrão naturalmente variegado de seus componentes. assim como a distribuição irregular das células nos esfregaços. Variações fisiológicas da celularidade são encontradas devido à idade. Nas crianças, a proporção de células hematopoéticas em relação à de tecido gorduroso é maior do que nos adultos. Estudos comparativos de contagens diferenciais em aspirados medula-
33
res mostram que as crianças apresentam 30 a 50% de linfóciws no primeiro ano de vida; estas po rcentagens declinam até os valores apresentados pelos adulros por volta dos quatro anos de idade. Da mesma forma, as crianças mais jovens tendem a apresentar contagens de
eosinófilos mais elevadas que os adulcos. Na gravidez, a medula apresenta hi perplasia leve a moderada, afetando ramo a erirropoese quanto a granulo poese. Um estudo sistemático da medula óssea, fundamentado nos dados clínicos e no exame do sangue periférico, muitas vezes dispensa a contagem diferencial para a definição de um diagnóstico preciso. A celularidade depende, tam bém, da representatividade da amostra; aspiração excessiva pode ocasionar variáveis graus de dil uição com sangue periférico e a presença de fibrose pode proporciona r uma punção seca. Os esfregaços representativos geralmente contêm partículas medulares (Figura 4.5).
Quadro 4.2 - Contagem diferencial de aspirados de med ula óssea em indivíduos normais Medula óssea Série Eritrocítico: Proeritroblastos Eritroblosios bosófilos Erilroblastos policromáticos Eritroblastos ortocromáticos
Percentagem
0- 1,6%
0 -5,0% 5,0-34,0% 5,0-8,0%
Série Granulocítica : M ieloblastos Promielócitos Mielócilas neutrófilos M ielócitos eosinófilos M ielócitos basófi los Metam ielócitos lneutr., eosin , basof.) Bastonetes e segmentados neuhófilos Bastonetes e segmentados eosinófilos Segmentados bosófilos
0-0,4% 10.0 - 30,0% 7,0-30, 0% 0.2 - 3,0% o- 0, 4%
Séne Linloplasmocitária: Linfócitos Células plasmáticos
5,0-20,0% 0,2-5,0%
Monóc itos
o- 1,0%
Célula s reticulares
o- 2,0%
Índice G/E
1,5- 5,0
o- 3,6% o- 5.0% 5,0-20,0%
o- 3,0%
Observação: Esses valores são cons1derados apenas como referência aproximada e devem ser Interpretados à luz do laudo méd1co
PRINCÍPIOS DE COLO RAÇÃO PANÓ PTICA F1gura 4.5 - Esfregaço de aspirado de medula óssea corado por May-Grunwald-G1emsa, contendo panículas medulares na exrre· m1dade caudal. Ver pag111o 34 Na análise do mielograma são contadas SOOa 1 000 células e o índice G/E consiste na relação entre o número de elementos granulocíticos e eritrocíticos. Devido à diversidade de valores de referência apresentados na literatura especializada, o Setor de Hematologia do Serviço de Medicina Laboracorial do Hospital das Clínicas da UFMG elaborou o Quadro 4.2, a partir de uma compilação dessas fontes. A maturação das séries eritrocítica e granulocítica é interpretada pelo escalonamento maturativo de seus elemenws e pelo tipo de eritropoese e gran ulopoese, respectivamente. No aspirado de medula óssea, os megacariócitos são analisados pela sua distribuição no esfregaço e pela presença de plaquetas. As plaquetas são derivadas de fragmentos citoplasmáticos dos megacariócitos, seus precursores.
34 (
Medicina laboratorial para o clínico
Os mecanismos pelos quais certos componentes da estrutura celular se coram por determinados corantes dependem de complexas diferenças de ligação desses corantes a estruturas químicas e de interações entre as suas moléculas. Os corantes atualmente utilizados em hemawlogia são modificações do corante de Romanowsky e associam o azul de metileno e a eosina mais o azur B, derivado do azul de metileno. O azul de metileno e o azur B são corantes azuis básicos e a eosina é corante vermelho ácido. Esses corantes possuem a propriedade de corar os grânulos leucocitários distintamence. Os corances básicos ligam-se às estruturas ácidas do DNA nuclear, aos ribossomos e grânulos do citoplasma e os corantes ácidos às estruturas básicas do citoplasma (hemoglobina e grânulos). Os citoplasmas dos proeritroblastos, dos eritroblastos basófilos e dos mielo blastos são basofílicos devido aos ribossomos das células imatu ras. As hemácias e os eritroblastos ortocromáticos, devido ao seu conteúdo de hemoglobina, são eosinofílicos e coram-se em verme-
lho alaranjado. As esrrururas coradas pela combinação de ambos os corantes são neutrofílicas e apresentam coloração vermelho-violácea. Os grânulos dos neutrófilos possuem leve excesso de comeúdo básico e coram-se fracamente com o componente azur. Os grânulos dos eosinófilos contêm force derivado básico da espermina e coram-se imensamente pela eosina. Em conuaste, os grânulos dos basófilos comêm uma proceína ácida, heparina, que tem afinidade com o componente básico do corante. A maioria dos corames de Romanowsky é dissolvida em álcool merílico e combina fixação com coloração. Entre os méwdos mais conhecidos estão os corantes de Giemsa, Wright, Leishman e May-Grünwald-G iemsa. O corante de Giemsa é particularmente indicado para corar parasiws da malária e prorozoários.
COLORAÇÕES ESPECIAIS Diversas colorações especiais podem ser realizadas nos esfregaços de sangue periférico, medula óssea, im· prints e materiais de biópsia medular, as quais proporcionam informações adicionais sobre a linhagem celular além das obtidas pelas colorações-padrão com corames de Romanowsky ou de hemaroxilina-eosina. Elas geralmente enquad ram-se em duas categorias: colorações citoquímicas, que utilizam reações enzimáticas para possibilitar a coloração, e corantes imu nociwquímicos, que coram epiropos específicos das células. Esses corantes são particularmente úteis na caracterização de neoplasias hemawlógicas e metastáticas, distinguindo, por exemplo, padrões de diferenciação de granulóciros e monóciros imaturos nas leucemias.
Colorações citoquímicas
Mieloperoxidase: os grânulos pnmanos das séries neuuofílica e eosinofílica contêm a enzima mieloperoxidase. Os monóciros coram-se fracamente, linfóciws e células vermelhas nucleadas são negativos. Sudan Negro B: detecta fosfolipídios inuacelulares e outros lipídios. A coloração é positiva em neuuófilos e eosinófilos, fracamente positiva em monóciros e usualmente negativa em linfóciros.
Diagnóstico hemarológico: prin cípios e técnicas
Esterase específica (cloro-acetaco): identificação de células blásticas mielóides. Esterase inespecífica (u -naftilbutiraro ou u - naftilacetaro): identificação de células monocíticas. Coloração para ferro pelo azul da Prússia: identificação de sideroblascos e siderámos e avaliação do ferro medular (hemossiderina).
Coloração lmunohistoquímica
lmunohisroquímica é uma das mais importantes ferramentas microscópicas utilizadas acualmente em hisroparologia e ciroparologia. Geralmente, a detecção de antígenos em tecidos é designada imunohistoquímica e a detecção em células, imunociroquímica. Ambos os mérodos utilizam anticorpos monoclonais conjugados a marcadores que se ligam especificamente às proceínas celulares investigadas (antígenos), permitindo sua localização em áreas dentro das células, preservando sua morfologia ou estrutura imerna. O marcador pode ser um corame fluorescente, metal colóide, hapteno, marcador radioativo ou enzima, esta mais utilizada em microscopia óptica.
CITOMETRIA DE FLUXO
Ciromeuia de fl uxo é a técnica de identificação, caracterização e isolamenro de células individuais a partir de suas propriedades físicas. químicas ou imunofenotípicas, que podem ser medidas por meios ópticos. Emre essas propriedades encontram-se o tamanho e a esuucura celular, comeúdo de DNA, dist ri buição ancigênica e atividades enzimáticas. Avanços nas técnicas imunológicas nas duas últimas décadas permitiram a identificação de recepw res antigênicos específicos na superfície, ciroplasma e núcleo das células leucocitárias (imunofenotipagem). Um grande progresso na identificação desses marcadores foi alcançado com a descoberta da técnica de hi bridomas para a produção de reagentes puros e específicos em quantidades adequadas para uso laboratorial amplo: os anticorpos monoclonais (AcMo). Os anticorpos monoclonais são conjugados a compostos fluorescentes (fluorocromos), que absorvem
35
energia luminosa de comprimenco de onda caraccerísrico para cada composro. A cc-expressão de ancígenos em uma mesma célula ou população de células pode ser dececrada pelo uso de dois ou mais anticorpos conjugados a diferences fluorocromos com espectros de emissão discintos. A combinação de diversos anticorpos monoclonais contra antígenos celulares permice a identificação de populações celulares específicas (Figura 4.6).
CD7 FITC
CDJ
CD45 PERCP
CD45 PERCP
Figura 4.6 - Marcação celular com amicorpos monoclonais conjugados com fluorocromos. Diagrama represemando a conjugação dos amicorpos monoclonais C07, C03 e C045, marcados com fluorocromos, a diferentes sírios antigênicos de uma célula. nomenclatura CD (cluster differentiation) foi proposta e estabelecida em 1982 no 1st lnternational Workshop and Conjerence on Human Leukocyte Dijjerentiatwn Ant1gens (HLDA), visando uma classificação uniforme dos anticorpos monoclonais contra moléculas de superfície leucocicárias (ancígenos) desenvolvidos mundialmente. Por ocasião da oicava conferência realizada em 2004, 339 CDs já haviam sido identificados e caraccerizados. Cada CD é designado quando uma mesma molécula é reconhecida por mais de um anticorpo monoclonal. cescando-se os padrões de expressão da molécula-alvo em grande painel de células e tecidos. Estudos recentes estimam existirem mais de 4.000 diferentes moléculas nas membranas leucocitárias. A imunofenocipagem por citometria de fluxo é a técnica pela qual células ou outras partículas em suspensão. alinhadas uma a uma, passam diante de um feixe luminoso (raio laser), possibilitando medir a percentagem e o número de células positivas para os marcadores ucilizados. A maioria dos citômecros de fluxo possui dois cipos de sistemas ópticos de medida: de dispersão de luz e de fluorescência. O feixe luminoso, ao acingir a célula ou partícula, é dispersado gerando sinais que são captados por detectores adequados. A luz dispersada para freme é uma medida do camanho celular (forward scatter. FSC). enquanto a A
36
No estudo imunofenotípico por cicometria de fluxo, obtêm-se dois tipos diferentes de informação para cada célula e para cada marcador escudado: presença ou ausência do marcador e a quantidade de fluorescência obt1da. A Intensidade da fluorescência corresponde à afinidade da amoscra pelos corantes. refletindo o número de moléculas de antígenos.
RP~CD7 FITC
~.f7o "-).
dispersão lacerai (side scatter, SSC) define a granulosidade
e a complexidade interna da célula (Figura 4.7).
APLICAÇÕES HEMATO LÓG ICAS O desenvolvimento de anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos e a marcação simultânea de diferentes antígenos celulares levaram a importantes conquistas no diagnóstico clínico. Entre elas. destacam-se a contribuição da citometria de fl uxo no escudo da hemacopoese normal. das subpopulações linfocitárias em distintas doenças e o diagnóstico e classificação imunológica de leucemias e linfomas. Além disto, o emprego dessa tecnologia tem demonstrado ser de grande utilidade em oueras áreas, como: • qua ntificação de células pluripocenciais, em amoseras de medula óssea ou aférese periférica para transplante; • análise de ciclo celular; • monitoramenco de doença residual mínima; • diagnóstico de hemoglobinúria paroxística nocurna; • detecção de auto-a nticorpos e imunocomplexos; • diagnóstico de crombocicopenias adquiridas; • contagem de reciculócicos; • realização de provas linfocicárias cruzadas; • diagnóstico diferencial de neoplasias epiceliais; • detecção de oncoproceínas, de receptores celulares para fa rores de crescimento e de hormônios.
CITOG EN ÉTICA
PRINCÍPIOS BÁSICOS DA CITOGEN ÉTICA O exame cirogenécico é a análise do conjunto cromossómica celular (cariótipo) em seus aspectOs morfológico e numérico. A detecção das alterações do cariótipo pode contribuir para o diagnóstico, prognóstico e acompanhamento de diversas doenças.
Medicina laboratorial para o clínico )f---- - - - - - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- -
fiUOte~oe6ndo
Votóo
Fluorew:inc10 lotuf'ltO Flvoresdnc10 V•tm.'hg
R3
o
R2
·50
~o-~~
e
o
50 f!IC-
rc 100 150 200 250
Tamanho
Figura 4.7 - Desenho esquemátiCO demonstrando o pnncíp10 da Otomema de Fluxo. Ver pog • a 37
O complemento genérico normal em humanos é composto de 22 pares de aurossomos e o par de cromossomas sexuais, chamado de conjunto diplói de (2n). A Figura 4.8 exibe um cariótipo masculino normal. As alterações cromossômicas podem ser estruturais e/ ou numéricas e. resumidamente, serão descritas a seguir. As alterações estruturais dentro de um mesmo cromossoma podem ser: Deleção (dei): ausência de parte do cromossoma. Inversão (inv): quebra com rotação de 180° do fragmento e posterior reunião ao ponto de quebra original. Duplicação (dup): segmento de um homólogo presente em duplicação na seqüência original ou invertida. lsocromossomo (i): formado pelo mesmo braço cromossômico, possivelmente a partir de erros na divisão celular, permanecendo com duplicação de um dos braços e ausência de outro. Cromossoma em anel (r): formado a partir de duas quebras e posterior reunião das extremidades. As alterações estruturais envolvendo mais de um cromossoma podem ser: Translocação (r): transferência de segmentos de um cromossoma para outro. Derivativo (der): formado a partir de rranslocações e referido com o número do centrômero. Inserção (ins): adição de material genérico entre dois segmentos normais de um cromossoma. Esse material
Diagnóstico hematológico: princípios e técnicas
pode pertencer ao mesmo cromossoma ou ser originário de ourro.
u :f ••
2
l\ }r
3
4
5
\! li· 1ê ii )} ,.,, 6
7
ii
~~
13
~
19
8
9
t!15
~16'
&
IIII
~
21
;;
11
12
10
14
20
...!t~
22
! 17
( X
18
I y
46,XY Figura 4.8- Foromicrografia de cariónpo masculino normal.
Cromossoma marcador (mar): formado por segmento cromossómica de origem desconhecida, deve possuir cenuômero. As alterações numéricas referem-se ao número de cromossomas. As células poliplóides possuem múl-
37
tiplos do número básico haplóide que não o diplóide, como, por exemplo, criploidia (3n) e tecraploidia (4n). Variações numéricas que envolvam redução o u adição ao número, mas não de todo o conjunto, são chamadas de aneuploidias, como as trissomias e as
monossom1as. O estudo citogenético pode ser realizado em diferentes amostras biológicas, como sangue periférico, medula óssea e tecidos, devendo ser utilizadas as células tumorais, que possuem d ivisão espontânea. O material de escolha é o aspirado de medula óssea, que poderá ser processado imediatamente ou colocado em cultura na incubadora de co2ou estufa por 16, 24 ou 48 horas. Caso não seja possível a aspiração medular, o material poderá ser obtido por biópsia. Para os pacientes com contagem de leucócitos superior a 10 x 10 9 /L - sendo no mínimo 10% dessas células formas imaturas - poderá ser utilizada amost ra de sangue periférico sem o estímulo com a fitohemagluti ni na, agente habitualmente utilizado na citogenética clínica. Deverão ser colecados 1 a 5 ml de medula óssea ou 10 mi de sangue periférico utilizando-se como anticoagulante a heparina sódica. Para o estudo citogenético dos linfomas, deverá ser utilizado material proveniente da biópsia de linfo nodos. Assim que são obtidas as células em divisão, agentes mitogênicos (colchicina, co lcemide ou vinblastina) são adicionados à cultura para a obtenção das mecáfases, fase em que os cromossomas são mais bem visualizados. A seguir, as células são submetidas a choque hipmônico co m clo reto de pmássio (KCI), para aumento do vo lume e melhor espalhamento dos cromossomas e posterior fi xação com sol ução de t rês pan es de metanol e uma de ácido acético (fixador de Carnoy) para conservação. Após a fixação, a suspensão celular é gotejada em lâminas que são submetidas a bandamento com tripsina (tratamento enzimático que permi te a ind ividualização dos cromossomas), coradas com corante de Wright e analisadas ao microscópio óptico. Deverão ser contadas e analisadas 30 células de cada preparação disponível. Duas metáfases de cada clone celular são fotog rafadas, recortadas e o cariótipo é montado. Em substituição à fotografia e ao recorte para a montagem do cariótipo, pode ser uti lizado um sistema de digitalização das imagens.
A definição de clone celular é adorada quando duas ou mais células apresentam cromossoma extra ou a mesma alteração estrutural ou monossomia do mesmo cromossoma em mais de três células. A descrição dos cariótipos é feita de acordo com o lnternational System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN 2005). Como mado previamente, para o estudo mogenético é necessário que as células estejam em divisão para a obtenção das meráfases. A citogenética convencional mostra alterações relativamente grosseiras, ou SeJa, a área envolvida deve comer pelo menos cinco milhões de pares de bases. Isto explica porque, em alguns casos que apresentam exame esuutu ral normal. é possível detectar a alteração genética (críptica) por téc nicas mais sensíveis, como os métodos genético-moleculares. A técnica de hibridação in situ com fluorescência (FISH) é um método cicogenécico-molecular que permite a demonstração morfológica de seqüências de DNA ou RNA em células, cortes de tecidos e preparações cromossômicas. O método baseia-se no princípio de que sequências de fica simples de DNA ou RNA (sondas) marcadas com fluorocromos ligam-se ao DNA ou RNA celular, em condições propícias, formando híbridos estáveis. A análise é realizada com microscópio de fluorescência e as metáfases ou os núcleos são fotografados (F1gura 4.9).
Figura 4.9- H1bndação 1n s1tu com fluorescênoa para pesquisa do gene de fusão BCR ABL. Ver pog nn 38
O FISH, apesar do alto custo e de visar à detecção de anormalidades genéticas específicas, cem como vantagens a rapidez de execução, sensibilidade e especificidade altas e a possibilidade de utilização de núcleos inter-
38 ( M edicina laboratorial para o clínico ]r-- - - - -- -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - -
fásicos. No entanto, deve-se salientar que a cirogenética convencional permanece como método imprescindível, já que permite detecm alterações cromossômicas adiClonais presentes no diagnóstico e no decorrer do uatamento de neoplasias hemacológicas.
APLI CAÇÕES HEMATOLÓG ICAS Um dos objetivos do estudo cicogenético na área de hematologia é o estudo de quebras cromossômicas feito em pacientes com síndromes que apresentam instabilidade cromossômica, tais como anemia de Fanconi, ataxia telangiectasia e síndrome de Bloom. Esses pacientes apresentam quebras espontâneas, as quais têm sua freqüência aumentada pela adição de drogas indutoras específicas do meio de cultura. No estudo das leucemias, a detecção de alterações cromossômicas específicas por citogenética convencional e FISH permite d1ferenciar subgrupos com comportamento clínico-biológico particular. além de contribuir para o melhor entendimento da doença e auxiliar na escolha da melhor opção terapêutica. Durante o acompanhamento, a utilização dessas técnicas permite a detecção de recaída e de evolução clonai. Ademais, a cicogenética convencional e o FISH podem ser utilizados para avaliação de quimerismo. O quimerismo é a coexistência de células de dois organismos diferences (provenientes de dois zigotos distintos) em um único indivíduo. Na avaliação de pacientes submetidos a transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH), a utilização dessas mecodologias apresenta a limitação de que doador e recepcor devem possuir sexos diferences, po1s a análise é realizada comparando-se a constituição cromossômica sexual dos mesmos. No caso de doador e receptor do mesmo sexo, a monitoração apenas poderá ser feita se um deles possuir algum heteromorfismo cromossômico.
MÉTODOS GENÉTICO-MOLECULARES
Em alguns centros de referência, é crescente a disponibilidade de diferences metodologias moleculares para a detecção das alterações genéticas associadas a doenças hematológicas, desde as mais simples, como as baseadas
Diagnóstico hematológico: princípios e técnicas
na reação em cadeia da polimerase (PCR), até as mais complexas, como os microarrays.
APLICAÇÕES HEMATOLÓGICAS O estudo genético-molecular de mutações que determinam uma variedade de doenças hematológicas hereditárias é método de rotina para o diagnóstico de algumas delas, particularmente na fase pré-natal. Alguns exemplos dessas doenças incluem: • herança autossômica recessiva: anemia falciforme, talassemias e doença de Gaucher; • herança autossômica dominante: esferocitose hereditária, trombofilia devida ao fator V de Leiden e várias formas da doença de von Willebrand; • ligação com o cromossoma X: deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase e hemofilias A e B. Por ourro lado, um alto número de doenças hemacológicas adquiridas, como as leucemias e os linfomas, resulta de alcerações em vários genes regu latórios. Algumas dessas alterações não podem ser detectadas por meio da cicogenética convencional (crípticas), mas o produto qUimérico pode ser evidenciado por técnicas moleculares. A utilização dos testes moleculares para o estudo dessas doenças tem grande importância não só para o diagnóstico, como também para a esrratificação de risco e a identificação de alvos para o monitoramenco da doença residual mín ima (ver capítulo 29) e para a terapêutica dirigida. Ouuas aplicações de importância dos métodos genético-moleculares na hemacologia incluem: • a detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes que codificam o complexo de histocompatibilidade (HLA - human leucocyte antlgens). Arualmeme, o status dos antígenos HLA é investigado para avaliação da compatibilidade por metodologia molecular, ames de transplantes de célu las-tronco hematopoéticas e de outros órgãos; • a análise de quimerismo, método cada vez mais utilizado para a monicorização da presença do enxerto no paciente no período pós-TCTH. Nessa fase do rratamenco, essa análise pode auxiliar na detecção precoce de recaída ou rejeição.
39
CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS 1.
Ba1n BJ. Blood cells. A pracrical gUide. London: Blackwell Publtshing; 2006. Barch MJ, Knutsen T. Spurbeck JL. The AGT CytogenetiCs Laboratory Manual. ew York: L1pp1ncou-Raven Publtshers; 1997.
O d1agnóstico laboratonal das doenças hematológicas, especialmente as neoplás1cas. deve ser multidlsophnar. Os relevantes avanços ocorridos na medicina labo-
2.
rarorial nas úlrimas décadas perm1mam desvendar. com
3. Beutler E, Llchrman MA, Coller BS, K1pps TJ, Sellgsohn U.
nível crescente de sofisticação e complexidade, a grande heterogeneidade envolvida na parogênese dessas doenças. possibilitando diagnósticos mais precisos, a criação de protocolos individualizados e a monitorização da doença residual mínima ao longo do tratamento.
4
S. 6.
7.
8. 9.
10.
40
Medicina laborat orial para o clín ico
Wílham's Hemawlogy. '\lew York: McGraw-H1II; 2001 Braz1el RM. Molecular d1agnos1s of hematopo1enc dlsorders. Hematology. 2003; 279 - 93. Greer JP, Foersrer ). Lukens JN. W1nrrobe's Clin~eal Hemarology. Nashville: Lippincorr W1ll1ams & Wdk1ns; 2003. Henry JB. Clinical diagnos1s and managemem by laboratory merhods. Phdadelph1a: W.B. Saunders Company; 2001. Khan F. Agarwal A. Agrawal S. S1gn,ficance of chimerISm 111 hemaropo1et1C srem cell rransplamanon: new vanar1ons on an old theme. Bone Marrow Transplanr. 2004;34(1}:1-12. Korf B. Molecular mediCine molecular d1agnos1s. New Eng JMed. 1995;332:1218-20 Lew1s SM, Bam BJ, Bares I OaCie and Lew1s Pract1cal Haematology. Hong Kong. Church1ll L1v1ngsrone; 2006. Shaffer LG, Tommerup N. ISCN 2005. An lmernanonal Sysrem for Human Cyrogener1c Nomenclacure. Basel: Karger; 2005.
os
Myriam de Siqueira Feitosa Rosângela Fátima Di Lorenzo Pires
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO: PRINCÍPIOS E TÉCNICAS
PRINCÍPIO
ESPECTROFOTOMETRIA
As dererminações especrroforomérricas ganha-
Quando uma rad iação elerromagnénca (luz) ime-
ram significariva popularidade no laborarório clínico,
rage com a maréna, os áromos e moléculas emirem
principalmente pela sensibilidade, especificidade e fa-
uma energia radtanre, que pode ser derecrada na for-
cilidade na execução das dererminações bioquímicas
ma de luz visível ou invisível. Newron descobriu, em
em amosrras biológicas, das récnicas manuais às gran-
1600, que a luz branca é uma misrura de várias cores.
des auromações.
Mais rarde, Thomas Young demonsrrou que a luz se
Quase rodas as subsrâncias de inreresse clínico para o
propagava em ondas cujo comprimenco define a cor
diagnósrico e comrole rerapêurico de doenças humanas
da luz, variando de 380 nm a 760 nm a região do es-
podem ser quamtflcadas por merodologia especrroforo-
pectro visível. A região acima e abaixo corresponde à
mérrica, que é a capacidade de uma subsrância ou um
região do infravermelho e ulrravioleca, respecrivamen-
produro derivado de reação bioquímica em absorver ou
ce. De faro, essas regiões são someme uma pequena
emirir luz, em um dererminado comprimemo de onda,
parre da família da radiação conhecida como espectro
sob condições físico-químicas esrabelecidas. (Figura 5.1)
eleuomagnécico.
Cor é a sensação fisiológica associada a um com primemo de onda. Objeros possuem cor porque refie-
Espectrofotometria
rem comprimemos de onda específicos, porramo, cor relaciona-se com o espectro de energia radiame. Todas as cores somadas resultam na cor branca. As subsrâ nfeixe incidente
feixe emergente
cias emirem cores diferences daquelas que absorvem. Por exemplo, uma solução de cor azu l absorve rodas as cores, excero o azul, que é reflerido. As cores absor-
Solução
vidas e reflecidas são dicas complemencares. A maioria das análises bioquímicas rea lizadas no laborarório clínico baseia-se no princípto da quamidade de luz absorvida ou reflerida, de acordo com as leis de
Cu beta
Figura 5.1 - Pnncípto da espe([roforomerria.
Beer e Lambere:
1° Lei de Lambere quando a concentração de um analiro é consrame. a absorção depende do comprimento do caminho óptico. 2° Lei de Beer: quando o camtnho óptico é constante e igual a 1, a concentração é diretamente proporcional
àquantidade de luz absorvida ou inversameme proporcional ao logarítimo da luz transmitida, em relação à luz incidente: A= abc= log (100 I %T) onde A= absorvância a= absortividade do composto, sob determinadas condições b= diâmetro da célula analítica (cubeta) c= concentração do composto %T= porcentagem de transmitância. (Figura 5.2)
o
'ü c •O >
~
..0
concentração
·º
concentração
Figura 5.2 - Relação da absorvânCia (A) e porcenragem de trans-
mitânCta (%T). A determinação da concentração do analito é feita a partir da comparação de uma solução padrão de concentração conhecida da mesma substância. Quando a concentração tem relação linear com a absorção. calcula-se o fator de calibração, que é multtplicado pela absorvânoa da substância a ser quantificada, encontrando-se assim a concentração.
Exemplo: Dosagem de glicose em plasma sanguíneo Padrão =100 mg/dL Abs (00)=0,120 Fator de calibração =100 I 0,1 20=833 Absorvância (abs) da amostra= 0,095 Concentração de glicosena amoscra =0,095 x 833=79 mg/dL Quando uma substância não segue a lei de Beer, ou seja. não há linearidade entre absorção e concentração. usa-se uma curva de calibração por meio de gráfico da absorvância de padrões de concentrações conhecidas. A concentração desconhecida é calculada interpolando-se os valores na curva.
ESPECTROFOTÔMETRO Os principais componentes do espectrofotômetro são a fome de luz. o monocromador, o compartimento para amostra, o detector e o dispositivo de leitura. A fonte de luz incandescente de tungstênio é usada para comprimento de ondas na região visível (320 a 1000 nm) e de deutério para região UV (100 a 390 nm). O monocromador separa a luz em bandas individuais. O compartimento para amostra, ou cubetas, geralmente é de quartzo, quadrada, com 1 cm 2. Para medir pequenas amostras, microcubetas podem ser usadas. Um tipo de dispositivo foi desenvolvido para facilitar e agilizar a rotina laboratorial, o fl uxo contínuo, cuja amostra é levada para a cubeta através de tubos de teflon, por bomba peristáltica. O detector converte a radiação eletromagnética em sinal elétrico. Há relação direta entre a intensidade da radiação e o sinal elétrico produzido. Hoje, com o avanço tecnológico, os especcrofotômetros microprocessados permitem funções automáticas, armazenamento de dados, cálculo de curva-padrão, mais sensibilidade e confiabiltdade nos resultados, menor volume de amostra e reagentes, controle de temperatura e facilidade operaoonal.
ELETROFORESE
PRINCÍPIO
t a separação de moléculas baseada na sua carga elétrica sob a ação de um campo elétrico externo.
42 [ Medicina laboratorial para o clínico ) 1 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - -
Quando uma voltagem é aplicada a uma solução, gera-se uma corrente eléuica pelo fluxo dos íons: cátions (partículas com carga positiva) migram em direção ao pólo negativo (catado) e ânions (partÍculas com carga negativa) em direção ao pólo positivo (anodo). Muitas moléculas orgânicas são anfotéricas, ou seja, podem estar carregadas positiva ou negativamente, dependendo do pH da solução. A mobilidade, ou taxa de migração, da molécula é dependeme de vários fawres: • carga elétrica: quamo maior a carga, mais rápido ela se move no meio de suporte; ou seja, mais se afasta do ponto de aplicação; • tamanho: quamo maior o peso molecular (pm), menor o deslocamento; • propriedades do meio de suporte: meio poroso separa as partículas por carga e por tamanho, meio viscoso diminui a mobilidade e adsorção da partícula; • força do campo elétrico: quanto maior a voltagem, mais rápida a migração; • e ndosmose: quando o meio de suporte adsorve íons hidroxila do tampão, w rnando-se carregada negativameme, há retardo na migração das moléculas; • força iônica do tampão: quanto menor a força iónica, mais rápida a migração; • temperatura: o aumento da temperatura aumenta a taxa de migração. Portanto, tendo em vista wdos os fato res influentes sobre a migração elet roforética, ao ser aplicada uma diferença de potencial a uma mistura de macromoléculas com taman ho e/ou cargas diferentes, as moléculas migrarão com velocidades e/ou direções diferentes, dependendo de seus tamanhos e cargas. Deve haver equilíbrio entre todos os fatores citados, de modo a permitir modelos de migração sem distorção, com exatidão, sensibilidade e qualidade dos resultados obtidos.
SISTEMA DE ELETROFORESE
O sistema de eletroforese é composto de uma cuba com tampa, meio de suporte, reagentes (tampão, corante ou revelador, fixado r, transparentizador), fonte elétrica de corrente contínua, densitômetro. A cuba de eletroforese
Diagnóstico bioquímico: princípios e técnicas
consiste de duas câmaras não comunicáveis entre si, nas quais é colocado o tampão e nivelado entre os dois lados. Entre as duas câmaras, que possuem os eleuodos responsáveis pela passagem da corrente elétrica, fica um suporte no qual é colocada a amostra biológica a ser analisada (Figura 5.3). Vários tipos de tampões e meios de suporte podem ser usados, dependendo da substância a ser separada e quantificada. A evolução dos meios de suporte, com elevado grau de pureza e propriedades bem definidas, permite separação mais nítida e estável dos elementos:
~
~
/ /
I
tampão
tampão
I Eletrodo (+)
I
~
ponte
Eletrodo
fonte
(·li
I
Figura 5.3 - Diagrama de uma câmara de eletroforese.
• acetato de celulose: material desenvolvido para reduzir a natureza polar do papel. através da acetilação do radical hidroxila da celulose. O material é prensado em fitas resistentes. algumas das vantagens do seu uso são o baixo custo e a necessidade de menor volume de amostra (1 a 2 ~L); • gel de amido: é preparado aquecendo-se uma solução de amido a 100 °c, colocado sobre um suporte. É trabalhoso e pouco usado; • gel de agarose: mais fácil de manusear que o amido, com menos adsorção da amostra; • gel de poliacrilamida: formado pela polimerização de dois compostos monoméricos, a acrilamida e a n,n-metileno-bis-acrilamida. Os corantes mais usados são a ninhidrina, sudan black B, Ponceau S, Fat Red 7B e amido black. O densitômetro mede a absorvância do corante no meio de suporte, por meio de um mecan ismo ótico. O sistema percorre a fita, registra a densidade ótica de cada fração e traça o perfil eletroforético. Atualmente, existe no mercado densitômetro integrado ao sistema de
43
elecroforese capaz de capcurar o traçado elecroforécico. analisar e imerprerar os resulrados abridos.
APLICAÇÃO CLÍN ICA
A eletroforese encontra apl icações cama na pesquisa e no desenvolvimento biocecnológico (DNA recombi name) quanto nos diagnósticos clínico e forense. A aplicação da eletroforese no laboratóno clínico é diversificada. sendo utilizada na separação e quantificação de proceínas séricas. análise de isoenzimas (LDH. CPK. fosfatase alcal1na), hpoproceínas. hemoglobinas e na separação de ácidos nucléicos. Pelo pri ncípio da eletroforese, novas mecodologias foram desenvolvidas com o objecivo de melhorar a especificidade e sensibilidade do reste, diminuir o volume de amoscra, tempo de análise e aucomatização do processo: Focalização isoelétrica: a base de separação é pela carga da molécula em um gradiente de pH. A principal aplicação tem sido o escudo de isoenz1mas da fosfatase alcalina em eritrócicos e soro. proceínas em biópsias e bandas monoclonais em líquor. Eletroforese de proteínas em alta resolução: a técnica envolve o uso de gel de agarose sob alta voltagem e com o resfnamenro do SIStema. Aelerroforese de proteínas em líquor,
por alea resolução. cem sido considerada efeciva no diagnóscico da esclerose múlcipla. além do escudo das doenças linfoproliferativas. especialmente doenças de cadeia leve. Eletroforese capilar: também chamada de eletroforese de zona capilar ou elecroforese capilar de alta performance, é um avanço na cécnica de separação, auwmacizada e com resultados rápidos nas identificações das frações de proceínas no soro, urina, líquor e hemoglobinas variantes.
CROMATOGRAFIA
A cromacografia pode ser definida como um sistema que separa os componentes de uma mistura (solução) pela inceração do composco com uma fase estacionária e outra móvel à medida que atravessa o meio de suporte. A fase estacionária é aquela composta pelo meio de suporte e qualquer solvente e a fase móvel aquela em que há o fluxo de gás (cromacografia à gás) ou líquido (cromacografia líquida) pelo sistema. O mécodo cromatográfico classifica-se geralmente de acordo com o método de separação (princípio cromatográfico. o tipo da fase móvel e fase estacionária). Quanco aos mecanismos de separação físico-químicos, a cromacografia classifica-se em (F1gura 5.4):
Papel
Camada delgada em a lta resoluçã o
Ca mada delgado
Figura 5.4 - Class1ficação da cromatografia.
44
Medicina labora torial para o clínico
)1-- - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -
Os princípios de separação das cromacografias líqui-
• cromatografia líquida por: adsorção (líquida/sólido)
da e gasosa têm os mesmos fundamentos. As bases físi-
partição (líquida/líquido)
co -químicas do processo de separação fundamentam-
troca iónica permeação (filtração por gel ou molecular).
se em dois equilíbrios: o de fase e o de distribuição. O equilíbrio de fase refere-se ao estado de equilíbrio entre sólido, líquido e gasoso, como, por exemplo, as técnica s
• cromatografia gás por:
de sublimação e outras de destilação. Os equtlíbrios de
adsorção (gás/sólido)
distribuição referem-se às diferenças de solubilidade
partição (gás/líquida)
e
adsorção de uma substância entre duas fases imiscíveis. Encontra-se no Quadro 5.1 a classificação de cromatografia quanto ao princípio da técnica: Na cromatografia por adsorção (líquida/sólido. ou gás/sólido). o composto é adsorvido a um suporte sólido, como a sílica ou alumina. Na cromatografia por partição (líquido/líquido. L/L ou gás/líquido. G/L). os solutos são separados pelas diferenças na distribuição entre as fases líquidas ou entre o gás e a fase líquida. A troca iónica usa coluna com grupos iónicos ligados covalentemente a um polímero na fase estacionária. onde pode haver troca iónica, de forma reversível. com a fase móvel. Na filtração por gel. os solutos são separados conforme o tamanho das partículas, em relação aos poros do gel na fase estacionária.
CROMATÓGRAFO O cromatógrafo é o equipamento usado para a realização da separação cromatográfica. Ele consiste de cinco unidades básicas: um sistema para o suprimento da fa se móvel, injetor de amostra, uma coluna ou coluna aberta. um detector (fotómecros. fluorômetros. sistemas elecroquímicos, condutividade térmica, ionização de chama) e um processador de dados. O sistema para o suprimenco da fase móvel pode variar de um simples cilindro de gás a um complexo mecanismo de êmbolos conectados a quatro ou cinco reservatórios de solventes.
Quadro 5.1 -Classificação dos méwdos cromawgráficos. Princípio cromatográfico
Tipo de fase móvel
Dispositivo da fase estacionária
Tipo de cromatografia
Adsorção Competição entre um odsorvenfe sólido e o fase móvel
Gás
Coluna
Gás/ Sólido (GS)
Coluna Líquido Camada plano
Partição Competição entre o fase estacionário líquido e o fase móvel Troco iônico Competição entre a resina de troco iônica da fase estacionário e o fase móvel líquido
Gás
Coluna
líquido
Coluna
Líquido (LI HPLC • Delgado (D) Popei(P) Gás/ Líquido iG/ LI Líquido/ líquido (LL) HPLC • Troco iônico (TI)
Líquido
Permeação Competição entre o polímero do motriz Líquido e o fase móvel líquido
Coluna HPIC * *
Coluna
Filtração por gel
• t tPLChigh performance liquid chromarography ·· HPICh1gh performanceionchromarography
Diagnóstico bioquímico: princípios e técnicas
45
APLICAÇÃO CLÍN ICA
Devido ao grande número de combinações entre as fases móvel e estacionária, a cromatografia é um procedimento importante no laboratório clínico, permitindo separar misturas complexas, identificando e quantificando as substâncias individualmente, sendo o método de referência em toxicologia (drogas terapêuticas e de abuso). Em geral, a cromarografia a gás é usada para a separação de materiais voláteis. A cromatografia líquida separa líquidos não voláteis e sólidos. Muitas substâncias não voláteis, tais como aminoácidos, esteróides, ácidos graxas de alto peso molecular, são derivatizadas em subprodutos voláteis e dosados por cromatografia gasosa. Peptídeos, polipeptídeos, proteínas e outros biopolímeros são separados somente por cromatografia líquida. A evolução da cromatografia líquida de alta pressão, inicialmente para separar e medir a concentração de drogas e seus metabólicos nos líquidos corporais, alcançou os limites de picogramos para uma grande variedade de compostos de interesse clínico. A cromatografia líquida em coluna e a cromatografia a gás têm algumas desvantagens: tempo de preparo da amostra, tempo de análise, necessidade de pessoal altamente capacitado e custo elevado do equipamento e sua manutenção.
presença de uma fonte com voltagem constante, chamada de eletrodo de referência. O eletrodo usado para a medição é chamado de eletrodo indicador. A concentração de determinados íons em uma solução pode ser obtida medindo-se a diferença de potencial entre esses dois eletrodos, pelo potenciómetro.
ELETRODOS DE REFERÊNCIA
Existem vários tipos de eletrodos de referência. O eletrodo saturado de calomel e o de prata/cloreto de prata (Ag/Agcl) são muito usados na prática. O eletrodo de referência tem potencial fixo, independentemente da atividade do analito. Nos equipamentos de medida, esse potencial é comparado ao potencial gerado por um ou mais eletrodos indicadores, para calcular a atividade do analito desejado.
ELETRODOS ÍON SELETIVOS
Eletroquímica engloba a medida da voltagem ou corrente elétrica gerada pela atividade de íons específicos. No laboratório clínico, são especialmente usados os procedimentos baseados na potenciometria e amperometria.
Potenciais de membrana são causados pela permeabilidade de certos tipos de membrana a determinados cátions ou anions. Um eletrodo íon seletivo consiste em uma membrana seletiva para o íon a ser medido, separando-se uma solução de referência de concentração fixa para esse mesmo íon e um elemento de referência de uma solução a ser analisada. Émuito sensível e específica para o íon a ser analisado. A complexidade do design depende da composição da membrana que determina a seletividade da mesma. Existem vários tipos de eletrodos íon seletivos, como eletrodos de vidro, eletrodos líquidos de troca iónica e eletrodos de fase sólida.
POTENCIOM ETRIA
ELETRODOS DE VIDRO
Potenciometria é a diferença de voltagem ou potencial elétrico entre dois eletrodos numa célula eletroquím ica, quando nenhuma corrente externa é aplicada e a célula está em equilíbrio. A célula eletroquímica é composta de dois eletrodos conectados por uma solução eletrolítica conducora. Um eletrodo consiste em um condutor metálico único em uma solução eletrolítica. Para medir o potencial de um eleuodo, é necessária a
Eletrodos de vidro são feitos de vidro especialmente formulado com diferentes composições, para determinar a seletividade para H+, Na+, K+, Li+ e outros. Eles foram os primeiros e ainda são os mais comuns para medir pH. São também muito usados para medir Na+ no soro. Eletrodos com superfície achatada têm sido usados para medir Na+ diretamente na pele para diagnóstico de fibrose cística.
ElETROQUÍMICA
46
Medicina laboratorial para o clín ico ]1---- -- - -- - -- - - -- - -- - - - - - - - -- --
ELETRODOS DE FASE SÓLIDA Podem ser de membranas homogêneas ou heterogêneas. O eletrodo de clorew de prata rem sido usado para medir direrameme a atividade de Cl-.
ELETRODOS DE TROCA IÓN ICA Uma membrana líquida de troca iónica consiste numa substância carreadora de íons seleriva envolvida por um solvente inerte. A membrana líquida pode ser separada da solução a ser restada por uma membrana de colódio; ou uma matriz porosa pode ser embebida pela membrana líquida. Essas membranas são muito usadas para medir K+, NH4+,e Ca 2+
ELETRODO DE pC0 2 Incorpora os dois elecrodos, referência e indicador, em um mesmo sensor. A amostra fica em comam com a membrana que, nesse caso, é permeável ao gás e não à solução. O gás difunde-se através da membrana e entra em coma to com uma solução de bicarbonaw, alterando o pH dessa solução, que é medido por um eletrodo de vidro interno.
AMPEROMETRIA É baseada na medida da corrente que passa através
de uma célula eletroquímica quando é aplicada uma voltagem constante aos elerrodos. Uma importante aplicação dessa tecnologia é o elerrodo de p0 2. descriw originalmente por Clark. O sensor consiste em um carodo de platina, um anodo de prata, uma solução elerrolítica e uma membrana gás permeável. Uma voltagem constante é mantida entre o catodo e o anodo. O oxigênio da amostra passa através da membrana e é reduzido no catodo. Ao chegar ao anodo, ele doa os elérrons recebidos. A quantidade de oxigênio reduzido é direramenre proporcional ao número de elétrons recebidos no carodo. Assim, pode-se determinar a quantidade de oxigênio na solução medindo-se a mudança na corrente (fluxo de elétrons) entre carodo e anodo.
Diagnóstico bioquími co: princípios e técnicas
Alguns biossensores desenvolvidos nos últimos anos incorporam a amperomerria para medir alguns analiws. Essa tecnologia tem se expandido para atender à demanda de restes realizados em laboratórios-satélite ou em unidades de tratamento intensivo e/ou de emergência. O primeiro biossensor desenvolvido foi para medir glicose e, desde então, alguns outros estão disponíveis, como uréia, bilirrubinas e lactaro. À medida que novos sensores tornam-se disponíveis, cresce a demanda por outros sensores.
AUTOMAÇÃO EM QUÍMICA CLÍNICA
Analisadores automáticos no laboratório permitem que sejam processadas muitas amostras em curw período de tempo, graças à maior velocidade de realização das análises. Em uma hora, podem ser feitas centenas ou milhares de análises nesses equipamentOs. A auwmação permite também a eliminação de passos ou tarefas repetitivas e monównas, que podem levar à instabilidade ou erro nas análises. melhorando de forma significativa a reprodutibilidade dos restes. Embora a melhoria da reprodutibilidade não seja acompanhada necessariamente de maior exaridão, já que esra está ligada ao méwdo analítico usado, houve melhoria significativa na qualidade dos exames laborawriais nos últimos anos. lsw ocorreu devido à combinação de equipamentos automatizados. cada vez mais bem projetados. com bons méwdos analíticos e programas eficazes de garantia da qualidade. Em geral, os sistemas auwmatizados são versões mecanizadas de técnicas e procedimentos laborawriais manuais, tais como: • identificação da amostra e do paciente; • medida e adição de reagentes; • pipetagem da amostra; • homogeneização de amostra e reagente; • incubação da mistura; • calibração do ensaio; • medida e leitura da reação; • liberação do resultado e armazenamento dos dados. As amostras são transportadas dentro do equipamenw de modos diferentes, dependendo do tipo de equipamento. Em analisadores de fluxo contínuo, o fluxo é feiw por bombas perisrálricas. Em analisadores de
47
acesso randômico, o transporte pode ser feiro por seringas, probóscides com ponteiras descartáveis acopladas e agulhas de aspiração. A pipetagem dos reagentes também é feira por seringas ou agulhas. Os reagentes ficam armazenados no próprio equipamento, em geral em
quamidade suficieme para trabalhar horas ou mesmo dias. As diluições das amostras e reagenres também são feitas por seringas ou agulhas adaptadas para aspiração. As diluições podem ser previamente programadas, assim como os volumes de amostra e reagentes utilizados. A incubação da reação é feita de maneira a manter a temperatura constante, com mínimas variações. A dosagem dos analiros baseia-se tradicionalmente na espectroforomerria. Alguns analiros, íons como sódio, porássio e cloro, são medidos pela inclusão nesses equipamentos de elerrodos íon-selerivos. Mérodos alternativos incluem forometria de reflectânCia, como nos equi pamentos de qu ím1ca seca e fl uo romema. A introdução de computadores nos instrumentos laboraroriais permitiu que os usuários visualizassem os resultados em diversos formaros. Entre outras funções, eles podem fazer cálculos, curvas de calibração e controle Interno da qualidade. Podem acumular dados dos pacientes, do controle da qualidade e das calibrações. Os resultados podem ser enviados direramenre ao sistema do laboratório, evitando-se a transcrição manual dos mesmos, onde poderão ser avaliados para serem liberados para o paciente e/ou médico-assistente. A escolha do instrumento ou equipamenro a ser utilizado em cada serviço dependerá de inúmeros aspectos técnicos e económicos. Nenhum instrumento pode atender todas as necessidades de laboratórios de porres diferences. Existe no mercado uma demanda crescente de eficiência e rap1dez. levando os laboratórios a prover serv1ços de mane1ra mais rápida, com menor cusro e a automação em química clínica se estendeu a outras áreas do laboratório, especialmente para a dosagem de hormônios e imunoensaios. Muiros dos princípios analíticos usados para determinação de constitUintes séricos são também usados para analisar os mesmos constitUintes na urina. A auromação de dosagens urinárias é mais difícil, pois muiros constituintes estão presentes em concentrações bem menores que no soro, exigindo menor limi te de detecção e maior faixa de linearidade da reação. que permitam a medida de concentrações maiores do anal iro sem diluições.
48 [ Medicina laboratorial para o clínico
TESTES LABORATORIAIS REMOTOS Após a introdução dos analisadores de bancada no início dos anos 80, surgi u uma nova geração de lnsrrumenros cada vez mais compacros. auromarizados e de mais fácil manuseio. Existem agora muiros instrumentos compactos. para uso fora do laboratório central, em salas de emergência, unidades de rraramemo intensivo, blocos cirúrgicos. asilos, etc. Esses instrumentos podem ter grande variedade de restes d1sponíveis e usar vários tipos de amostra. preferencialmeme sangue rotai. eliminandose a etapa de preparo da amostra. A maioria usa pequenos volumes de amostra, menores que 50 ~ L. e libera resulcados em até 15 minutos. Os reagentes usados, em geral, são prontos para uso. assim como os calibradores e controles. O crescimemo rápido desses insrrumemos rornou-se possível pelo avanço tecnológico dos microprocessadores, elerrodos íon-selerivos e biossensores. Já existe no Brasil regulamentação do funcionamenro dos laborarónos clínicos deliberando sobre o com role da qualidade em rodos os procedimentos. incluindo os restes laboraroriais remoros. O manuseio, controle da qualidade e treinamento do pessoal envolvido deve ser supervisionado e documentado pelo laboratório clínico.
REFERÊNCIAS Barker K. Na Bancada - manual de 1n1C1ação o encífica em laborarónos de pesqUisas bioméd1cas. Porto Alegre: Arrmed; 2002. 2. Henry JB. Ciln1cal d1agnosis and managemenr by laborarory merhods. 20th ed. Phdadelph1a: W. B. Saunders; 2001. 3. Kaplan LA. Pesce Aj. Clmical chem1srry- rheory, analys1s, correlarion. 3th ed. SL Louis: M osby Year Book; 1996. 4. T1erz NW. Texrbook of clinical chem1srry. Philadelph1a: W. B. Saunders; 1986. 5. Ward KM . Lehmann CA. Le1ken AM. Ciln1cal laborarory 1nsrru menrat1on and auromat1on-pnnc1ples, applica t~ on and selectlon. Phdadelphia: W. B. Saunders; 1994. 1.
]r-- - - - - -- - - - -- - - - - - - - -- -- - - - - - - -
Leonardo de Souza Vasconcellos Silvana Maria Eloi Santos
06
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO:
PRINCÍPIOS E TÉCNICAS
Define-se como teste sorológico todo ensaio laboratorial que envolva uma reação imunoquímica de ligação de moléculas de anticorpo a um ou mais determinantes antigênicos, levando à formação de imunocomplexos. IStO é. complexos antígeno-anticorpo.
PRINCÍPIOS GERAIS DOS TESTES SOROLÓGICOS
Na prática do laboratóno clínico, o teste sorológico pode ser empregado tanto na procura de antígenos quanto na procura de anticorpos. Como uma reaçào química, há o envolvimento de uma constante de assoCiação e uma constante de dissociação cujo efeito somatóno produz uma constante de equilíbrio.
Ag + Ac =; AgAc
Os diferentes tipos de reações sorológicas são nomeados em função dos princípios utilizados na detecção do 1munocomplexo formado. Assim, resumidamente. temos a precipitação, em que antígenos e anticorpos solúveis são misturados e ao reagiram entre si formam um precipitado insolúvel que pode ser visualizado. Na aglutinação. outra reação imunológica clássica, um ou ambos os componentes da reação estão sob a forma
de partículas em suspensão. que são aglutinadas quando da formação dos imunocomplexos. Na floculação, técnica utilizada na reaçào de VDRL, o antígeno empregado. um composto de cardiohpina-lecitina-colesterol. não se encontra sob a forma de partícula. mas. por sua composição hpíd1ca. também não é solúvel. Ass1m, cunhou-se o termo floculação para a reação que se forma quando da combinação de anticorpos séricos com o antígeno do VDRL, uma vez que flocos são visualizados à microscopia óptica. Outros métodos sorológ~eos envolvem uma segunda etapa, na qual um segundo anticorpo. antiimunoglobulina humana, encomra-se conjugado com algum marcador que pode ser detectado por diferentes maneiras. Nas técnicas de imunofluorescência, o marcador utilizado é a molécula de 1sotiocianato de fluoresceína que, quando excitada pela luz ultravioleta. emite uma cor esverdeada, que é visualizada em um microscópio apropriado. Já nas técnicas imunoenzimáticas, utilizam-se compostos enz1máticos e seus respectivos substratos para a pesquisa do imunocomplexo. A reação final é mensurada por um espectrofotômetro. que avaliará a mudança de cor da solução do substrato. Nas reações de radioimunoensaio, agora em desuso, são utilizados compostos rad1oat1vos que em item raios gama detectados por contadores de radioatividade e. nas técnicas de quimiluminescência. empregam-se compostas capazes de emitir fótons. que serão detectados por leirores de luz.
CONCEITOS BÁSICOS DE IMUNOLOGIA Para o bom entendimento de tais técnicas, torna-se necessário relembrar alguns conceiros básicos da imunologia e da imunoquímica.
No final do século XIX, o termo "amicorpo" foi utilizado para indicar o fator presente no soro responsável pela resposta à administração de um "amígeno", ouu o vocábulo introduzido para designar qualquer substância (na ocasião, princi palmente células e microrganismos) capaz de induzir uma resposta imune contra si. Vários outros termos foram historicamente usados para indicar diferentes atividades dos anticorpos (agluti ninas, preopitinas, opsoninas), uma vez que as características físico-químicas dos antígenos e dos anticorpos não eram conhecidas. A partir de Paul Ehrlich (1 854-1915), que sugeriu que reações imunológicas ti nham uma base química, uma nova fase da imunologia foi desencadeada, a fase da imunoquímica. Em 1936, Heldelberger e Kendall purificaram anticorpos a partir da dissociação de precipitados por soluções salinas concentradas. Posteriormente, foram aplicados métodos de ultracentrifugação (1937) e eleuoforese (1938), quando se confirmou que os anticorpos pertenciam à fração globulina das proteínas séricas de baixa mobilidade, designadas então de gamaglobulinas. Atualmente, considera-se que o sistema imune humano seja produto de milhões de anos de evolução de sistemas primordiais presentes ta nto em invertebrados (de onde provavelmente deriva o chamado sistema imune inato) quanto em vertebrados (de onde deriva o sistema imune adaptativo). Por sistema imune inato emende-se o conju nto de fenômenos moleculares e celulares que envolvem algumas linhagens celulares (macrófagos, granulócitos, células dendríticas, células NK) que utilizam um número limitado de receptores protéicos codificados na linhagem germinal (germ-line encoded proteins), conservados ao longo da evolução (também conhecidos como receptores de reconhecimento de padrão primitivo ou RRPP), que reconhecem padrões (motifs) moleculares comuns (lipídios e carboidratos) altamente conservados nos microrganismos. Entre as pri ncipais ações do sistema imune inato, destaca-se a ativação do complemen to, fagocitose, citotoxicidade celular e produção de ci tocinas, quimioci nas e peptídeos antimicrobianos.
Já o sistema imune adaptativo envolve a participação de recepto res antigênicos em linfócitos T e B gerados por rearranjo genético clone-específico, de forma que individualmente tais células expressam em sua superfície apenas um único tipo de receptor antigênico, que é capaz de reconhecer um limitado número de (ou um único) determinantes antigênicos. Outra característica do sistema imune adaptativo é o desenvolvimento de uma resposta anamnéstica, isto é, uma resposta imune secundária à exposição antigénica subseqüente à exposição primária. Essa resposta secundária que ocorre após um tempo considerável depois da primeira exposição ao antígeno é geralmente mais rápida e intensa. Assim, o braço adaptativo do sistema imune é responsável pelas suas propriedades relativas à "memória" e à "especificidade", que serão, muitas vezes, avaliadas pelas reações sorológicas.
CARACTERÍSTICAS DAS IMUNOGLOBULI NAS São proteínas plasmáticas pertencentes ao grupo das gamaglobulinas, que são as proteínas séricas com a mais lenta mobilidade elerroforérica. São produzidas por li nfócitos B diferenciados e medeiam a chamada resposta imune humoral. Sua estrutura molecular básica consiste na presença de um par de cadeias polipeprídicas menores (cadeias leves, constituídas por um domínio constante - CL e um domínio variável - VL) e um par de cadeias polipepcídicas maiores (cadeias pesadas, constituídas por um domínio variável - VH e domínios constantes - CH) unidas por ligações covalentes. A porção Fc é constituída pelas porções constantes das cadeias pesadas e a porção Fab pelas porções variáveis das cadeias leves e pesadas (Figura 6.1). São descri ros dois tipos de cadeias leves: kappa (K) e lam bda (À). De cadeias pesadas, temos cinco tipos: alfa (a ), gama (y), delta (8), mi (~) e epsilon (e), as quais determinam os isótipos, ou classes, de imunoglobulinas (lgA, lgG, lgD, lgM e lgE, respectivamente).
PRO DUÇÃO DE IMUNOGLOBULI NAS NA CRIANÇA Apesar de linfócitos pré-Bserem detectados no fígado fetal humano desde a oitava semana de gestação e células Bexpressando lgM de superfície serem detectadas na 10a
50 [ Medicina la borarorial para o clínico ]f-- - - - - - - - - - -- - - - -- - - - -- - -- - - - -
semana de gestação, o recém-nascido a termo produz pequena quantidade de anticorpos. Entretanto, em seu soro, há elevada concentração de lgG materna, devido ao transporte ativo transplacentário que ocorre desde o terceiro mês de gestação. Isso faz com que os níveis de lgG no plasma do recém-nascido seJam próximos aos do materno, ao nascimento, caindo a seguir devido ao catabolismo das lgGs maternas e arraso no início da síntese das próprias lgGs. Como conseqüência, entre seis e nove meses de vida, as crianças apresentam hipogamaglobulinemia fisiológica. Após esse período, os níveis elevam-se. atingem 60% dos adultos no primeiro ano de vida e tornam-se comparáveis aos dos adulms por volta dos sete anos de idade. A lgM pode ser detecrada no sangue do cordão devido à produção fetal. Após uma semana de vida, a síntese de lgM acelera-se. mrnando-se a principal lg do recém-nascido. Atinge 50% dos níveis adultos aos seis meses e 80% aos 12 meses de vida. lgA, lgD e lgE não são sintetizadas em quantidades significativas pelo neonato. Suas concentrações no sangue do cordão são muito baixas e aumentam lentamente durante o primeiro ano, atingindo, então, 10% a 25% dos níveis adultos.
lulas Bem relação à especificidade antigênica, passando de altamente específica a antígenos estranhos para mais específica a antígenos próprios. Embora indivíduos idosos renham mais alto núme ro de auto-anticorpos, não se pode afirmar que isso reflita em manifestações subclínicas de doenças auco-imunes. Auto-anticorpos associados a doenças auco-imunes geral mente são antígenos específicos. ao contrário de auto-anticorpos naturais apresentados por idosos que apresentam resposta à ampla variedade de antígenos de diferentes tecidos (ver capítulo 61).
PRODUÇÃO DE IMUNOGLOBU LI NAS PELO IDOSO
Cadeias pesadas
O processo de senescência do sistema imune é caracterizado por mudanças principalmente na imunidade celular e parece estar associado a diferentes fatores, sendo os mais expressivos a diminuição da atividade do timo e a permanente estimulação antigênica ao longo da vida. Idosos saudáveis demonstram decréscimo de 10% a 15% na contagem de linfócitos totais. Observa-se elevação do número de linfócims T imaturos (CD2+CD3-) associada ao aumento simultâneo de células NK, aumento dos linfócitos T de memória (expressando CDLíSRO) e depleção de linfócitos T virgens (expressando CD4SRA). Em relação à imunidade humoraL no envelhecimento humano ocorre decréscimo na resposta de anticorpos a antígenos específicos, contribuindo para o aumento da suscetibilidade e gravidade de doenças infecciosas, assim como na menor eficiência de vacinas em idosos. Verifica-se também aumento no número de células B secretoras de anticorpos que reconhecem antígenos próprios (auto-antígenos), sugerindo que no envelhecimento ocorra mudança na população de cé-
Diagnóstico imunológico: princípios e técnicas
Figura 6.1 - llusuação esquemática da estrutura de um monômero de imunoglobulina. As cade1as leves (que podem ser da classe K ou À) possuem dois domínios: um variável (VL) e um constante (CL). As cadeias pesadas da lgG. lgAe lgD possuem 1 domínio variável (VH) e 3 domínios constantes (CH). Os monômeros de lgM e lgE possuem um domínio extra na porção constante da cadeia pesada. A porção Fab, composta pelos domínios VL e VH, contém o sítio de ligação com o amígeno (paratopo) que é tridimensionalmente complememar ao epitopo (porção antigênica). O reconhecimento antigênico se dá através das ligações não-covalentes que se estabelecem enrre estas duas superfícies.
TERMOS COMUMENTE UTILIZADOS EM SO RO LOG IA Afinidade e avidez
Afinidade: medida da força de ligação entre um sítio de combinação de anticorpo e um determi nante antigênico. Écalculado pela lei de ação das massas.
Sl
Avidez: é a somatória das afinidades individuais e da proporção de cada amicorpo em um sistema policlonal (ex: uma amostra de soro), que comém anticorpos de diferences afinidades para um ancígeno. Em restes imunoenzimácicos, a avidez pode ser aferida pela eiUição dos anticorpos de menor afinidade por me1o do emprego de agentes caotróp1cos que desfazem as reações antígeno-anticorpo de baixa afinidade.
Anticorpos polidonais e monodonais
Anticorpos podem ser utilizados como ferramentas para o reconhecimento de moléculas antigénicas específicas com grande precisão e podem ser induzidos artificialmente. Dependendo da forma de obtenção. e conseqüente clonalidade, são classificados em policlonais ou monoclonais. Anticorpos Policlonais: Entende-se por anticorpos policlonais o conjunto de anticorpos isolados a partir do soro de animais (geralmente coelho ou cabra), obtido após imunização com preparação antigênica purificada. Apesar de serem uma miscura de anticorpos de diferences especificidades individuais, isco é, provenientes de dis[lntos clones de linfócitos B responsivos ao mesmo ancígeno, apresentam alta especificidade dev1da aos processos de purificação realizados após sua obtenção. Podem ser produz1dos em grande quantidade e são amplamente utilizados em diferentes testes sorológicos. Anticorpos Monoclonais: Em 1975, Kohler e M1lstein desenvolveram um clone celular capaz de produzir um só anticorpo com especificidade bem definida para o ancígeno pesquisado. originando. então, o denominado anticorpo do tipo monoclonal. Em reconhecimento aos seus estudos. foram congratulados com o prêmio Nobel de Med1cina em 1984. AntiCOrpos monoclonais são obtidos a partir da fusão de linfócitos B esplênicos de animais imunizados (geralmente camundongos) com células humanas de mieloma múltiplo. que consistem em plasmócicos monoclonais com taxa de divisão maior que a de plasmócitos normais e intensa produção de imuneglobulinas. O hibridoma resultante é mantido em cultura e seu sobrenadance contém anticorpos de um
52 [ Medicina laboratorial para o clínico
único tipo, provenientes de um único linfócito B, daí o nome monoclonal (Figura 6.2).
Efeito prozona
Na formação dos imunocomplexos, para que ocorra a reação é necessária a equivalência das concentrações relativas de antÍgenos e anticorpos. O excesso de qualquer um favo rece uma reação subótima que pode não ser detectada. Considera-se como efeito "prozona" a ausência de reação sorológica detectável em um sistema de teste na presença de altas concentrações de anticorpos séricos. A Figura 6.3 apresenta a ilustração do fenômeno de prozona.
Epitopo
Mesmo que determinante antigênico. São regiões estruturais dos antígenos, que são reconhecidas pelos anticorpos. Quanto maior a complexidade dos antígenos. maior a heterogeneidade de epitopos presentes e maior a clonalidade da resposta desencadeada.
Fase sólida
Substrato ou porção fixa dos métodos de imuneensaios, geralmente constituída de vidro. celulose ou plástico, onde os componentes antigênicos ou anticorpos estão fixados e onde se processam e ev1denciam as reações. São apresentados habitualmente na forma de placas. partículas, esferas, tubos. grades, pentes. fitas.
Janela imunológica
Período de tempo compreendido entre a exposição à fonte de infecção e o surgimento de algum marcador sorológico detectável pelos testes sorológicos disponíveis. É naturalmente observada durante o curso natural das infecções e sua duração é variável, dependendo especialmente da natureza do agente infeccioso, do tamanho do inóculo, da eficácia da resposta imune do hospedeiro e do imunoensaio empregado.
]1 -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- -- - - - - - - - - -
Imunização
Linfócitos B extraídos do baço
'( )f
.~.t:
Fusão
·r'
Clo nagem
Cultura
1
Hibridoma Cultura de células de mieloma
. . . . ... ...
...........
Seleção dos hibridomas de interesse
.... '
...
Anticorpos monoclonais presentes no sobrenadante da cultura
'f
A " A
~·
....
~
..:
Figura 6.2- Produção m v1tro de anr1corpo monoclonal a parm da fusão de linfóCito Bespecífico para o anrígeno alvo {proven1enre de an1mal 1mun1zado) +células provenienres de culcura de células de m1eloma múlnplo humano {plasmóciros monoclona1s).
PRO ZONA
!excesso de anticorpos)
ZONA DE EQUIVAl ~NCIA
PÓS.ZONA
!excesso de onngenas)
-i)
~A >
J- A ~ <({ \~~ y>
~
y>
.f. ~ A"k,~
y>
{A~A ~ ~
~ <({<({~ ~
~
y> ~ ~
J.A~
~<({~A~
~t!
YJ_;,-
t;t~~
i)
~~ ~ v (f
~v~i) i)(f
(f i) i) v> v~i) ~ rf ~(f ov o i) i) i) v v i)
(f
(fi)~
i>
(f
Figura 6.3 - Na presença de excesso de anrtcorpos (prozona de equivalência) ou anrígeno (pós-zona de equtvalênoa). não ocorre formação de complexos grandes. necessános para visualização da reação. O fenómeno de prozona é causa de resultados falso-negattvos em algumas reações sorológicas. como o VDRL. Resposta anamnéstica
PRINCIPAIS MÉTODOS SOROLÓGICOS MÉTODOS DE AGLUTINAÇÃO
Resposra imune secundária que se segue após expoSIÇÕes posreriores ao amígeno. Geralmeme mais rápida e imensa.
Título
É expresso como o tnverso da úlrima diluição de soro
que apresemou reação posiriva.
Diagnóstico imu nológico: princípios e técnicas
Nos mérodos de aglurinação, que podem ser realizados em rubos ou em placas, um dos dois componenres da reação anrígeno-anricorpo deve esrar fixado na superfície de panículas insolúveis. Após a formação do imunocomplexo. é possível visualizar a formação de agregados. A imensidade da reação poderá ser medida considerando-se o ramanho final dos
53
agregados formados, podendo variar desde negativa, na ausência de agregados, até fonemente positiva, na presença de agregados maiores (Figura 6.4). Vários fawres interferem na aglutinação, como a classe a que pertence o amicorpo pesquisado (a lgM, por sua estrutura pentamérica e presença de 10 sítios de ligação ao antígeno, é 750 vezes mais eficiente em aglutina r panículas que lgG), concentração de eleuóliws, pH (ideal entre 6,0 e 8,0), tempo de incubação antígenoanticorpo e temperatura.
Aglutinação intenso
Antígenos e ou anticorpos porticulodos são adiciono dos e misturados
!
/ ®/ /
/0 /
Aglutinação fraco
/ ®/ """
Ausênc ia de aglutinação
/ 0 /
Figura 6.4 - Método de aglutinação em placa: aglutinação daspartículas é graduada de negativa a 1mensa. dependendo da formação de grumos.
Caso os determinantes amigênicos sejam constituintes de estruturas naturalmente insolúveis, como bactérias, protozoários, fungos ou hemácias, a reação é chamada de aglutinação direta. É geralmente utilizada para a detecção de microrganismos ou de antígenos eritrocitários, a partir do emprego de anticorpos específicos. Seus usos clínicos mais freqüemes são no diagnóstico de infecção por clamídia, salmonelose, brucelose, nckettslose e em imunohematologia. na cipagem de grupos sanguíneos e na detecção de auto-anticorpos amieritromános nas hemólises imunológ1cas. Se o méwdo necessitar da fixação artificial de algum dos dois componentes da reação antígenoanticorpo na superfície de panículas insolúveis (geralmente hemácias, poliestireno (conhecidas como látex) ou bentonita), ele é chamado de aglutinação indireta ou passiva. Os teste de aglutinação são examinados a olho nu, após período de incubação curw, em geral menor que cinco minutos (Figura 6.5).
54 ( M edicina laboratorial para o clínico
•
+
•• ••
Partícula correodoro
Antígenos solúveis
Partículas sensibilizados
Anticorpos
Partícula sensi bilizado
Aglutinação visível
Fi gura 6.5 - Aglutinação indireta: Partículas ou células sensibilizadas (impregnadas por amígenos) são aglutinadas por ação de anticorpos, formando grumos visíve1s.
Reações de hemaglutinação
Os testes de hemaglutinação indireta são amplamente empregados na pesquisa de anticorpos. Exemplo clássico é a reação de hemaglutinação lndireta (geralmente abreviada por HAI) para pesquisa de anticorpos no d iagnóscico de diversas doenças infecciosas, como sífilis, toxoplasmose, doença de Chagas, entre oucras. Nesses casos, antígenos provenientes dos agentes infecciosos são fixados na superfície de hemácias de carneiro ou humanas do grupo O. que são fixadas com formaldeído ou glutaraldeído para melhor conservação. Para a execução dos testes. amostras de soro dos pacientes, em diferentes diluições, segundo recomendações do fabricante, são incubadas em microplacas com suspensão de hemácias sensibilizadas, isto é revestidas com a preparação antigência. Após o tem po preconizado para incubação. é realizada leitura da reação: no teste considerado positivo, verifica-se a formação de fina camada homogênea de hemácias recobrindo o fundo da cavidade, enquanto nos testes negativos a ausência de aglutinação permite que as hemácias se sedimentem no fundo da cavidade, formando um pequeno círculo compacw. O título da amostra será a maior diluição em que ainda se observa reação positiva. Pe la HAI, detectam-se anticorpos das classes lgM e lgG em concentração superior a O.Ol~g/ml. Entre suas vantagens estão: apresentam baixo custo, não necessitam de equi pamentos automatizados e são testes semiquantitativos, podendo ser utilizados na monitoração de títulos (Figura 6.6).
de látex são revestidas com anticorpos, monoclonais ou policlonais, que reconhecem antígenos microbianos e os restes são, em geral, qualitativos, sugerindo a presença ou não do agente infeccioso.
TESTE DE FLOCULAÇÃO- AGLUTINAÇÃO DE CRISTAIS DE COLESTEROL No caso da reação de VDRL- Venerai Disease Research Laboratory, não são empregadas partículas sensibilizadas e Figura 6.6 - Hemaglurinação indireta em placa: Os testes negativos (por exemplo: A2. A3. AS) são identificados pela compactação das hemáms sed1memadas na base do poço (presença de um pomo hemátiCO central) e os posi6vos (por exemplo: ALi, B3, BS, C4. Dl), pela formação de um tapete no fundo da placa. Reações de aglutinação de látex
As partículas de látex são esferas de poliesrireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proreinas solúveis e anrígenos polissacarídeos, para emprego em reações de aglutinação. Foi descrita inicialmente por Singer e Plorz. em 1956. para a pesquisa do faror reumatóide, mas ainda é basta me utilizada, servindo como base para ensaios qualiranvos. semiquamitativos e até automatizados. Apesar de poder ser empregada tanto na pesquisa de antígenos quanto de anticorpos. seu uso clínico mais freqüente é na pesquisa de antígenos. Uma utilização clássica da reação de aglur1nação de partículas de látex ainda é a pesqu1sa de fato r reumatóide (auto-anticorpo da classe lgM que reconhece porção Fc de lgG humana), em que parrículas de látex sensibilizadas com porções Fc de lgG humanas são incubadas com diferentes diluições de soro e verifica-se qual a maior dilUição em que se observou aglutinação das partículas de látex. Outras indicações freqüentes são a semiquantificaçào de proteína C reativa e a pesquisa de hCG. Nesses casos. partículas de látex enconrram-se sens1b1lizadas, respecrivamente, com anticorpos am1proreína C reariva ou amicadeia ~ do hCG. Outra unlização clín1ca seria na detecção de antígenos polissacarídeos bacterianos, como os estreptococos. os esrafilococos e os meningococos. e na detecção de microrganismos em diferences líquidos biológicos (soro. secreção, urina. líquor, erc.). Em tais situações, parrículas
Diagnóstico imunológico: princípios e técnicas
sim suspensão antigênica alcoólica de cardiolipina juncamente com cristais de colesterol com lecirina (ver capítulo 54). Trata-se de um método de pesquisa de anticorpos anricardiolipina que estão presentes em diferentes situações clínicas, especialmente na sífilis, no lúpus eritematoso sistêmico e na síndrome antifosfolípide. Os anticorpos anticardiolipina presentes no soro formam imunocomplexos com a cardiolipina que são precipitados sobre os cristais de colesterol, que são refringentes. A leitura do teste é feita microscopicamente, sendo positivo quando há formação de flocos refringentes e negativo quando se apresenta homogêneo e sem agregados (Figura 6.7).
MÉTODOS DE PRECIPITAÇÃO Reações que envolvem precipitação de imunocomplexos solúveis, tam bém chamadas de ensaios de imunoprecipitação, são freqüentemente adoradas em ensaios laboratoriais, sendo os principais métodos a nefelometria e a turbid1merria. Heidelberg, em 1935. já havia descrito que a formação de imunocomplexos solúveis depende de vános fatores, entre eles a equ ivalência na concentração de antígenos e anticorpos, a avidez e afinidade entre eles, condições do meio (tampão, pH, força iônica da solução) e presença de polímeros (por ex. polierilenoglicol), que aumentam a sensibilidade, a faixa de detecção e a velocidade do ensaio. Ao receber uma luz incidente, imunocomplexos formados em solução podem provocar dispersão, absorção, reflexão e alteração da rransmissão da luz. Esses fenômenos são proporcionais ao tamanho, forma e concentração das partículas e quanto maior a precipitação entre ancígeno e ancicorpo, maior a dispersão e a reflexão da luz incidente e menor a sua rransmitância.
ss
Fonte
de luz
Detector B
Detector A
Figura 6.8- Princípios da automação para mensuração da reação ancígeno-anricorpo por métodos de precipitação. A luz incidente no cubo pode ser capeada pelo detector A (nefelometria - que quantifica a dispersão da luz) ou pelo detector B(rurbidimerria - que mede a absorção da luz), cuja leitura final apresenta correlação com a concentração de anrígeno ou anticorpo da amostra resrada.
Figura 6.7 A e B- A: reste negar1vo - ausência de floculação, com dispersão de antígenos na placa. B: Teste positivo - formação de "flocos", conseqüentes à formação de imunocomplexos, evidenciando presença de anticorpos no soro reste.
Nefelometria
A nefelometria é um método direto de med ida da dispersão de uma luz incidente, em um determinado ângulo, sendo sensível para dimensionar as reações de precipitação. Geralmente, os aparelhos, chamados de nefelômetros, utilizam, como fome de luz, lâmpadas de rungsrênio, mercúrio, xenônio, hélio-neônio (laser), etc. Os feixes de luz ou do laser são coletados por lemes focalizadoras e atravessam o tubo comendo a amostra e a solução reagente. Outras lentes coletam a luz emergente em ângulo de 70° e a focalizam para um detector eletrônico, q ue amplifica o sinal. Este é convertido em unidades de registro digital que são relacionadas com a concentração do anrígeno ou do anticorpo na amostra (Figura 6.8).
56 [ Medicina laboratorial para o clínico
Na determinação de compostos de baixo peso molecular, como hormônios, drogas e outros haptenos, utiliza-se a nefelomecria de inibição, em que os haptenos a serem dosados competem com haptenos conjugados com proteínas carregadoras pelos sítios no anticorpo específico, havendo inibição na formação de precipitados. O emprego de micropanículas inertes, tais como látex (esferas de poliestireno) recobertas com antígeno ou anticorpo, aumenta a sensibilidade dos ensaios nefelométricos. Essas panículas são usadas como suporte dos reagences, amplificando a precipitação e a dispersão da luz. Vantagens: reação precisa, rápida, de fácil realização e tmalmente automatizada. Com partículas amplificadoras apresenta elevada sensibilidade (na ordem de 1J.lg/ ml e de 1ng/ml). Desvantagens: alto custo do nefelômetro e dos anticorpos, reações inespecíficas em amostras lipêmicas ou hemolisadas e a necessidade de múltiplas diluições quando os antígenos do teste estão muito concentrados. Aplicação: quantificação de drogas, hormônios, proteínas (por ex. imunoglobulinas, componentes do complemento, faror reumatóide e proteína C reativa), imunocomplexos, lipoproteínas, etc.
Turbidimetria
excitadas com luz de alta energia, absorvem parte dessa
É um mérodo muiw semelhante à nefelometria, mas
energia, emitindo luz de um comprimento de onda maior e menor energia. fenômeno denominado de fluorescên-
que mede a diminuição da imensidade de luz transmiti-
cia. Assim, a leitura das reações é feira em microscópios
da, em relação à incidente, por meio de uma suspensão
de fluorescência, que possuem uma fome de luz de alta
de panículas, devido a: reflexão, absorção ou dispersão
imensidade (geralmenre lâmpadas de quarrzo-halogênio),
do seu feixe de luz. As leicuras são conduzidas em uni-
filtros de excitação e de barreira, que permitem alta transmissão da fluorescência emitida. Pode-se então dizer que
dades de absorbância que refletem a relação entre luz incidente e luz transmitida. Assim como na nefelometria, partículas amplificadoras (por ex. polierilenoglicol) podem ser admadas, aumentando a sensibilidade do
a reação de imunofluorescência associa as propriedades
reste. Nesses casos têm-se os restes PETIA (imunoensaio rurbidimérrico com partículas de látex amplificadoras) e PETINIA (imunoensa1o turbidimémco de inibição com partículas de látex amplificadoras). A comparação entre as técnicas de nefelomerria e turbidimerria depende mais da qualidade dos aparelhos de leitura do que do princípio do mérodo propriamente dico. Vantagens: reação precisa, rápida, de fácil realização, au-
tica, é realizada em lâminas. O substrato utilizado deve ser visível à microscopia órica (células, micoorganismos) e a técnica não é passível de automação. uma vez que exige a atuação de pessoal treinado na leicura microscópica.
da fluorescência, da reatividade anrígeno-anricorpo e ainda da microscopia óptica. Devido a essa última caracterís-
O reste de imunofl uorescência oode ser realizado de forma direta ou indirera (Figura 6.9).
lmunofluorescência direta
tomatizada e econôm1ca. Não necessita de separação entre as fases e as amostras podem ser ensaiadas d1retamente sem a necess1dade de pré-tratamento. A turbidimerria tende a ser mais precisa, ma1s reprodutível e mais s1mples que a nefelomema. A utilização do especrroforômetro, que é um aparelho mais comum, reduz o seu cusw.
Nessa técnica, empregada na pesquisa de microrganismos e na localização de anrígenos em células ou tecidos, utiliza-se anticorpo específico, monoclonal ou policlonal. marcado com fluorocromo (chamado de conjugado). Na lâmina de vidro, onde ocorre a reação. fixa-se a amostra a ser examinada, geralmente líquidos corporais, secreções
Desvantagens: reações inespecíficas em amostras lipêmicas ou hemolisadas. A curbidimeuia rende a ser menos sensível que a nefelometria.
do paciente ou cortes h1srológ1Cos, que podem comer os antígenos que serão reconhecidos pelo anticorpo flu-
Aplicação: quantificação de drogas, hormônios, pro-
oresceinado. Após incubação, este se fixa ao anrígeno,
teínas (por ex. pré-albumina, albumina e proteína C reariva), lipoproteínas. etc.
formando um complexo estável. Posteriormente, a lâm ina é lavada para remoção dos anticorpos não ligados e
IMUNO FLUORESCÊNCIA Descrita com sucesso pela primeira vez por Coons et ai. em 1941, envolve a capacidade da molécula de anticorpo se ligar covalenremenre a fluorocromos sem perder sua reatividade específica. Isso é possível, pois geralmente a conjugação do fluorocromo com o anticorpo se faz por me10 dos grupos am no da lisina, que não são críticos para a reat1v1dade do anticorpo. Fluorocromos (por ex. 1smioe~anaro de fluoresceína, isonoe~anaro de tetrame-
tilrodamma, lisamina-rodamina B e ácido d1metli nafralenossulfônlco) são substâncias complexas que, quando
Diagnóstico imunológico: princípios e técnicas
levada ao microscópio de fluorescência para leitura da reação. Na reação positiva, a estrutura comendo o antígeno apresenta-se com a típica cor esverdeada brilhante da fluoresceína, enquanto na reação negativa a estrucura apresenta-se não corada ou, em alguns casos, corada por coloração de fundo, que geralmente é empregada para facili tar a leitura final. Vanragens: além da especificidade, que é dependente do anticorpo utilizado, permite a localização do amígeno no substrato utilizado. Desvantagem: sensibilidade relativa, demorada, não passível de automação, requer a aruação de profissional bem treinado para a leitura e microscópio com manutenção rigorosa.
57
A
<:
..
Lavagem
'
+
Antígeno presente no amostro o ser testado (p.ex . Chlomydia trochomotis)
Solução de anticorpos específi cos marcados com fluoresceíno
Complexo o ntígen
B
..
..
Lavagem
Lavagem
+
+
) An tígeno lixado no lâmina de vidro
(Trypanosomo cruz~
Anticorpos presente no soro do paciente
Complexo ontígencranticorpo
Antiimunoglobulinos marcados (fluorocromo)
Complexo ontígeno-onticorpo fluorescente
Figura 6.9- Exemplos de técnicas de imunofluorescência di reta e indireta. A) lmunofluorescência di reta: utiliza-se de um preparado de anticorpos específicos marcados com fluoresceína para a pesquisa de antígenos em amostras do paciente. Na ilustração, pesquisa de Chlamydia trachomatis por imunofluorescênc1a di reta. B) lmunofluorescência indireta: utiliza-se preparado antigênico fixado a uma lâmina de vidro (na ilustração, uma suspensão de T cruzi). para pesquisa de anticorpos no soro do pac1ente (na ilusuação. pesqu1sa de anticorpos an tiT cruzl). A revelação é feita com anticorpos ami1munoglobulina humana marcados com fluoresceína.
Aplicações: principalmeme na imunocitoquímica e na demonstração de vários amígenos de células e tecidos. além da pesquisa de alguns agemes infecciosos como clamídia, treponemas, amebas. etc.
lmunofluorescência indireta
Nas reações chamadas indireras. emprega-se uma segunda preparação de amicorpos, que será aquela que estará complexada com a fluoresceína. Esse mécodo é geralmeme empregado na pesquisa de amicorpos séricos. Nesses casos, preparações amigênicas padronizadas, geralmeme protozoários. bactérias ou células. encomramse fixadas à lâmina de vidro. Diluições de soro do paciente são colocadas sobre o substraco e incubadas para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo.
58
Medicina laboratorial para o clínico
Após lavagem, a preparação é reincubada com anticorpos. geralmente de cabra ou coelho amiporções constantes de imunoglobulinas humanas, conjugados com fluoresceína. Utilizando-se diluições seriadas do soro é possível determinar o título de amicorpos, que será a máxima diluição em que se observa fluorescência. Resumidamente: para facilitar o entendimento das duas formas de fluorescência (direta ou indireta), lembrem-se de que no método direto o reagente fornecido no kit é a preparação de amicorpos específicos conjugados com a fluoresceína. O amígeno será pesquisado na amostra do paciente. Já na reação de imunofluorescência indireta, o kit fornece as lâminas comendo a preparação antigênica e os amicorpos serão pesquisados no soro do paciente. Nessa reação, o kit também fornece uma preparação de anticorpos de origem an imal que reconhecem anticorpos humanos conjugados com fluoresceína.
Vantagens: alta sensibilidade e especificidade Desvantagens: as mesmas da fluorescência direta. Aplicações: Além da pesquisa de anticorpos em doenças Infecciosas. como sífilis (FTA-ABS), roxoplasmose. ciromegalovírus. herpes simples, doença de Chagas e malária, é o mécodo de escolha para pesquisa de auraanticorpos na pesquisa de anticorpos antinucleares.
litativos, quantitativos ou semiquantitativos. Nos ensaios de quantificação de antígenos. uma curva-padrão é traçada a partir de diferentes amostras de referência contendo concentrações conhecidas do antígeno. Na pesquisa de anticorpos, cujas concentrações são mais variáveis, a quantificação ou semiquamificação envolve esrabelecimemo de um limiar de afinidade ou pomo de corte (cut-ofj), acima do qual os valores serão considerados positivos.
REAÇÃO DE IMUN OPEROXIDASE Empregada essencialmente em ensaios de imunohistoquímica, foi descrita inicialmente em 1966 com o objetivo de detectar e localizar antígenos celulares, empregando microscopia óptica comum e ação da enzima peroxidase. Segue o mesmo princípio da imunofluorescência, exceto pela utilização da enzima no lugar do fluorocromo. Essa enzima converte o substrato em produro insolúvel que precipita no sítio da reação. sendo visível no microscópio óptico comum. Outras enzimas. como a fosfatase alcalina e a glicose oxidase. também podem ser empregadas. Uma grande vantagem da peroxidase está no seu baixo peso molecular, permitindo maior penetração celular e conseqüentemente melhor definição das estruturas. A detecção simultânea de dois ou mais constituintes celulares pode ser conduzida com a utilização de dois ou ma1s cromógenos. As principa1s vantagens da imunoperoxidase em relação à imunofluorescência estão no fornecimento de preparações mais duradouras. no baixo custo e na utilização de microscopia óptica comum. Amplificadores como avidina (ligada à enzima) e biotina (ligada ao anticorpo) podem ser utilizados em escudos de imunociroquímica e imunohisroquímica.
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS Os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) são aqueles nos quais é empregada marcação de anticorpos com enzimas e a leitura se faz pela medida da ação enzimática sobre substrato cromogênico, levando à mudança de cor da solução. As enzimas mais utilizadas como marcadores nos ELISA são peroxidase e fosfatase alcalina. São métodos mu1ro empregados e têm substiwído amplamente a reação de imunofluorescência. Podem ser qua-
Diagnóstico imunológico: princípios e técnicas
Métodos imunoenzimáticos para detecção de anticorpos
Os ensaios de detecção de anticorpos solúveis podem ser conduzidos basicamente por dois mérodos: indirero e de captura dos anticorpos lgM. O método indirero é o mais amplamente empregado (Figura 6.10). No método indireto, microplacas de poliestireno contendo vários pequenos poços são sensibilizadas com preparações antigênicas. Amostras de soro em diluições recomendadas pelo fabricante são incubadas por período preestabeleCido para permitir a reação dos anticorpos presentes na amostra com o antígeno fixado na microplaca. Após lavagem dos poços, um preparado de anticorpos anciimunoglobulinas humanas conjugados com enzimas é adicionado. Esse conjugado antiimunoglobulina humana reage com o anticorpo capturado pelo antígeno da fase sólida e a reação é revelada com adição do substratO específico para a enzima utilizada. Em casos de reações positivas, ocorre mudança de cor na solução e a intensidade da cor é estimada colorimeuicamente, sendo proporcional à concentração do anticorpo pesquisado. Caso o antiCOrpo a ser pesquisado seja da classe lgM. é freqüente a ocorrência de resultados falso-negativos ou falso-positivos. Por isso, emprega-se o método de captura de anticorpos lgM. Nesse teste, a fase sólida é sensibilizada com anticorpos anncade1a pesada da lgM (cadeia 1-1). Os soros em teste são incubados, capturando todos os lgM da amostra. A seguir, incuba-se com anrígeno solúvel e posteriormente com preparações de anticorpos específicos para o antígeno, marcados com enzima. Como nos demais testes, após lavagem dos poços para retirada dos componentes não fixadas, o substrato enzimático é adicionado e a intensidade da cor é lida em especuofotômeuo, sendo diretamente proporcional à concentração do anticorpo (lgM) pesquisado.
59
+
~-<
Lavagem
+
>
:) Fase sólido + ontígeno
Complexo ontígeno-onticorpo
Anticorpos do amostro
>->->--
+
Complexo ontígeno - anticorpo - onti-imunoglob ino
u
o
Adição de cromógenos
i>--
Lavagem
>
~
Anti-imunoglobino marcado com peroxidose
>->-- ~ >--
Complexo ontígeno- anticorpo - onti-imunoglob ino marcado
Lavagem
c::=~>
Formação de precipitado
Figura 6.10 - Pesqutsa de amtcorpos pelo metódo imunoenzi mático indirero: amostra de soro ou plasma é incubada em microplacas contendo antígenos fixados. para detecção de anticorpos específicos. Após lavagem para retirada de anticorpos não fixados. são adicionados anticorpos anriimunoglobulina humana conjugados com enztma. Após incubação e posterior lavagem para retirada dos anticorpos não ligados. ad iciona-se o substrato da enztma conJugada e a reação é revelada pela mudança de cor. A imensidade da cor é diretamenre proporcional à concentração do anncorpo pesquisado. Medida da avidez de lgG
Em algumas sicuações clínicas, especialmente no diagnóstico de infecções em gestantes, rornase úril a medida da avidez das lgGs séricas pelos antígenos. É sabido que lgGs mais recentes apresentam menor avidez que aquelas produzidas há mais cem po. Assim. a avaliação da avidez das lgGs circulantes pode contribuir para considera r o processo infeccioso como agudo ou não. A técnica envolvida na medida da avid ez envolve a realização do reste imunoen zimático em duplicata. Um teste é realizado de forma convencional. enquanto no outro. é ac rescentada uma etapa de adição de solução que favorece a dissociação do imunocomplexo. Q ua nto maior a estabilidade da interação antígeno-ancicorpo. maior resistência à ação da solução dissociante. A medida do índice de avidez é feita pela razão: leicu ra do teste com solução dissociante I le icura do cesce co nvencional. Se o índice (razão x 100) for maior que 60%, admite-se alta avidez. Se inferior a 30%. co nsidera-se baixa avidez. Valores intermediários são inconclusivos.
60 [ Medicina laborarorial para o clínico
Métodos imunoenzimáticos para detecção de antígenos
Já os ensaios de imunoenzimáticos para pesquisa de ancígenos podem ser conduzidos por mécodos de captura (ou sanduíche). de competição com anticorpo marcado e de competição com antígeno marcado. Entretanto, por apresentarem sensibilidade moderada. têm sido substituídos por outras mecodologias. como a quimioluminescência. O mécodo de captura é o mais adorado para pesquisa de antígenos polivalentes. As placas (fa se sólida) são sensibilizadas com anticorpo específico para o amígeno a ser testado. Após incubação da amoscra com a fase sólida. lava-se o sobrenadame. A seguir, incuba-se novamente com amicorpo específico marcado com uma enzima. Faz-se a segunda lavagem. A reação é revelada com a adição de um subscraco e a atividade enzimática final (taxa de degradação desse subsuaco pela enzima) é direcameme proporcional à concentração inicial do antígeno na amostra testada. No mécodo de competição com amicorpo marcado, a fase sólida é sensibilizada com antígenos. Adicionase a amostra teste e amicorpos marcados com enzima.
Os anticorpos se ligam tanto aos antígenos da amostra, quanto aos da fase sólida. A densidade óptica encontrada é inversamente proporcional à concentração inicial do antígeno na amosua testada. No méwdo de competição com antígeno marcado, a fase sólida também é sensibilizada com anticorpo específico para o ancígeno a ser testado. Adiciona-se a amosua teste e o conjugado (antígeno-enzima). A densidade óptica encontrada é inversamente proporcional à concentração inicial do antígeno na amoscra testada. Vantagens: sensibilidade e especificidade elevadas, rapidez, precisão, estabilidade dos reagentes, objetividade da leitura e possibilidade de automação. Desvamagens: a atividade enzimática pode ser afecada por constituimes plasmáticos. Comparada com os radioimunoensaios, a mensuração da atividade da enzima pode ser mais complexa e com menos sensibilidade do que a mensuração dos radioisótopos. Possibilidade de ocorrência de efeito gancho (ver capítulo 59) no método de capwra, comum nas dosagens hormonais. Aplicação: o método de ELISA é o mais empregado na prática da soroimunologia laborawrial. Sua proliferação pode também ser atribuída ao emprego de anticorpos monoclonais e antígenos recombinantes específicos.
RA DIOIMUNOENSAIOS Berson et a/. foram os pioneiros nesse método em 1956, em pesquisas envolvendo anticorpos anciinsulina. O radioimunoensaio (RIA), que era muito utilizado na prática laboratorial, acualmeme vem perdendo espaço para outros métodos que utilizam marcadores não radioarivos, ficando sua atuação cada vez mais restrita em atividades de pesquisa. O princípio do método é praticamente o mesmo visco nas reações imunoenzimácicas, variando apenas a marcação molecular que, no caso, consiste de componentes radioativos em vez de componemes enzimáticos. A medição da reação é feita por contadores de radioatividade. Vários radioisócopos podem ser utilizados, sendo os isótopos com 1125 (vida média de 57.5 dias) e 1131 (vida média de 8 dias) os mais empregados. Diferentes variações do métOdo foram desenvolvidas, emre elas o ensaio imunorradioméuico (IRMA), descrito inicialmente por Miles e Hales, em 1968, utilizado na detecção de antígenos proréicos.
Di agnósrico im unológico: princípios e récnicas
Vantagens: elevada sensibilidade para a análise quantitativa das reações anrígeno-ancicorpo, facil idade de conjugação do isócopo, permite medidas rápidas e precisas, derecra sinais sem orimizaçào e estabilidade contra fawres interferentes no ensaio. Mesmo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção na ordem de nanogramas ou picogramas. Omro pomo positivo está na detecção de pequena concentração de analitos, mesmo quando o volume da amostra é bastante escasso. Desvantagens: cusro elevado, vida média curra dos reagentes e necessidade de proteção no uso de radioisótopos. Apl icações: na toxicologia, farmacologia, endocrinologia, sorologia, etc. Pode ser utilizado para quantificar drogas, marcadores tumorais, hormônios, alérgenos, antígenos e anticorpos virais, bacterianos, fúngicos, etc. Adorado também para pesquisas, em detecção de novos antígenos.
ENSAIOS IMUNOQU IMIOLUMINESCENTES Entende-se por q uimioluminescência o fenômeno no qual ocorre emissão de luz eletromagnética (inclusive ultravioleta ou infravermelho) a partir de reação química. A reação de imunoquimioluminescência é outra variação dos imunensaios, muito semelhante aos imunoenzimoensaios, porém muito mais sensível, na q ual a fosfatase alcalina (conjugada a anticorpos antiimunoglobu lina humana) acua hidrolisando um substrato quimioluminescenre e gerando um prod uto instável, o qual após estabilização gera emissão de fótons (amplificados). Os ensaios imunoquimiolu minescemes são geralrrente automatizados e a leirura se dá em aparelhos chamados lum inômetros, emendendo-se por luminometria a medida da luz emitida por composros quimiolum inescentes. Os agentes quimioluminescentes mais comuns são luminol, isolum inol, luciferina (presente nos vaga-lumes), derivados de acridina, indol. Em 1989, Bronstein desenvolveu um substrato quimioluminescenre (admantil 1.2-dioxietano-fosfaro) para a fosfatase alcalina que, ao contrá rio dos demais, não necessita de molécula adicional para a emissão de luz quimioluminescente. Atualmente, novos marcadores estão em escudos e, por apresentarem alta sensibilidade, os
61
ensaios imunoquimioluminescenres vêm se rornando cada vez mais rotineiros. Vantagens: elevada sensibilidade, linearidade da curva dose-resposta (emissão de luz tende a ser proporcional à concentração do analito em análise), rapidez (sinal é gerado em poucos segundos e pode permanecer por várias horas), custo mais baixo (pouca concentração de reagentes), procedimento simples, possibilidade de aumentar a sensibilidade com uso de amplificadores. Desvantagens: reações oxidativas, como as do lumina i, podem sofrer interferência de inúmeros fatores presentes no sistema, aumentando a inespecificidade do exame. Aplicação: pela alta sensibilidade são amplamente empregados na dosagem de hormônios. antígenos. viraminas e marcadores tumorais.
ENSAIOS IMUNOFLUORIMÉTRICOS Esse método é muito semelhante ao ensaio imunoquimioluminescente, exceto por empregarem substratos fluorigênicos que, após ser estimulado por um comprimento de onda de excitação étimo, há emissão de fluorescência máxima. Essa fluorescência é captada por fluorômetro equipado com um multiplicador de fótons. A intensidade da fluorescência é direramente proporcional à concentração inicial de antígeno ou anticorpo pesquisado na amostra testada. Vantagens: praticamente as mesmas dos ensaios imunoquimioluminescentes. Os sinais gerados são superiores aos observados nos ensaios imunoenzimáticos. Desvantagens: pode haver presença de substâncias interferentes na amostra. emitindo luz fluorescente, falseando os resultados. Aplicação: semelhante à dos ensaios imunoquimioluminescentes.
REAÇÃO DE WESTERN-BLOT É um método sorológico no qual é possível identificar as frações do preparado antigênico reconhecidas pelos anticorpos do paciente. Isco é. nos ensaios descritos acima, os anticorpos do pacientes eram incubados com homogeneizados antigênicos, geralmente complexos,
62
Medicina laboratorial para o clínico
compostos de diversos componentes protéicos. Para a técnica de western-blot. a preparação antigênica é previamente submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida. de alta definição, a fim de separá-la em diferentes bandas, de acordo com seus tamanhos e cargas. Posteriormente, todo o conteúdo proréico presente no gel é transferido para a folha de nitrocelulose, mantendo-se conservado o perfil eleuoforético. Dessa forma, a folha de nitrocelulose contém o preparado antigênico apresentado sob a forma de bandas proréicas individualizadas. Essa fira de nitrocelulose sensibilizada é submetida a um processo semelhante ao da reação de ELISA Isto é, após ser incubada com soro diluído do paciente e lavada, é reincubada com anticorpos antiimunoglobulina humana marcados com enzima. Substrato cromógeno adequado é adicionado e. ao sofrer ação da enzima. muda de cor e colore as bandas nas quais houve reconhecimento pelos anticorpos do paciente (Figura 6.11). A reação de western-blot foi e ainda é amplamente utilizada na confirmação do diagnóstico da infecção pelo HIV. Variações da técnica original foram desenvolvidas. Uma das mais promissoras e mais empregadas é a utilização de antígenos recombinantes no lugar do extrato antigênico bruto proveniente de lisado de células infectadas. Essa variação é conhecida como imunoblot recombinante (RIBA- recombinant immunoblot assay) e rem sido bem aceita pelos laboratórios devido à pureza do antígeno e conseqüente facilidade de leitura. Vantagens: elevada sensibilidade e especificidade. Desvantagens: resultados qualitativos, cusco elevado.
TESTES RÁPIDOS São geralmente testes de triagem que produzem resultados em, no máximo. 30 minutos, sem utilização de equipamentos. São também chamados de testes remotos. pelo faca de poderem ser realizados distante do laboratório (a beira do leito, ambulatório, trabalhos de campo). Existem atualmeme inúmeros testes rápidos no mercado para detecção de antígenos e anticorpos em amostras biológicas. produzidos por vários fabricantes e utilizando diferentes princípios técnicos. Geralmente, os restes rápidos são qualitativos. de metodologia simples e acondicionados em embalagens individualizadas. permitindo a resragem individual das amostras.
A) Etapa de produção da fita de nitrocelulose contendo as frações protéicas antigênicas Separação eletroforético dos proteínas com formação de bandos
Aplicação em gel de poliocrilomido
Transferência elétrico poro membranas de nitrocelulose
c:=::~>
c:=====~>
c:=::~>
~
?> Eletroforese em gel de poliocrilomido SDS-PAGE
Extraio ontigênico em solução
Gel de poliocrilomido contendo os bandos protéicos
Folho de nitrocelulase contendo os bandos protéicos
B) Etapa da reação de western-blot
--
-
Anti-imunoglobulino humano marcado com enzima
Amostro do paciente
Adição de substrato
<::===:::::J
Leitura Final
lmunocomplexo
Formação do reoção ontígenoanticorpo
Tiro de nitrocelulose contendo os bandos protéicos
Figura 6.11 - Reação de western-blot: Inicialmente, o preparado antigênico é submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida. para separação das diferentes proteínas de acordo com seus pesos moleculares. e posteriormente rransferido para membrana de nitrocelulose acravés de corrente elétrica. Posteriormente, é realizada reação imunoenzimática na fira de nitrocelulose contendo as diferentes bandas amigênicas. Utilizam como suporte sólido para os antígenos fixados diferentes materiais como membranas de celulose ou nylon, látex, microparrículas ou carreias plásticas. Entre os mais adorados está o dipstick, que emprega matriz de nitrocelulose como suporte. Para detecção da reação, utiliza-se corante coloidal, enzimas ou ouro coloidal. Nos kits para detecção de antígeno, usa-se um anticorpo de captura, ligado à membrana, e um anticorpo marcado específico para esse antígeno. já nos kits para detecção de anticorpo, emprega-se um antígeno ligado à membrana e um anticorpo antiimunoglobulina específico marcado. Vantagens: rapidez do resultado, simplicidade da técnica, fácil interpretação, elevado valor preditivo negativo.
Diagnóstico imunológico: princípios e técnicas
Desvantagens: são testes principalmente de triagem e seus resultados são apenas qualitativos.
IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRI A DE FLU XO
Diferentemente dos métodos descritos, que são utilizados geralmente na detecção de antígenos ou anticorpos solúveis presentes em líquidos biológicos, a imunofenotipagem por citometria de fl uxo. em laboratórios clínicos, tem sido adorada essencialmente nos estudos de caracterização fenotípica de células em suspensão, principalmente leucócitos do sangue periférico e células
63
da medula óssea. Qualquer célula ou parcícula em sus-
CONSIDERAÇÕES FINAIS
pensão medindo 0,2-SOjJm de camanho pode ser analisada no cirômerro de fluxo. Células de cecidos sólidos devem ser desagregadas para permitir sua análise. Como
Nas últimas duas décadas, os mérodos sorológicos passaram por importantes avanços que resultaram na
o próprio nome indica, crara-se de um mémdo de feno-
disponibilização de restes de alta sensibilidade, especi-
tipagem celular realizada a partir de anticorpos que reconhecem antígenos presemes na superfície celular. Para
ficidade e reprodutibilidade. Emrecanro, mesmo com a utilização de amicorpos monoclonais, anrígenos recom-
ranro, anticorpos (em geraL são empregados anticorpos
binames, peprídeos sintéticos, marcadores específicos e
monoclonais, disponíveis comercialmente) enconcram-
sensíveis, o reste sorológico é essencialmente biológico,
se marcados com fluorocromos, que absorvem uma luz
não possuindo a precisão das reações químicas puras. É sempre bom recordar que anticorpos não possuem
incidence e emitem outra luz de comprimenw de onda maior e específico. Há diversos fluorocromos, cada um com seu padrão panicular de absorção e emissão de luz, o que possibilita a utilização simultânea de vários amicorpos, cada um conjugado com um diference fluorocromo. O emprego clínico mais comum da imunofenoripagem por ciromerria de fluxo está na contagem de linfócims T CD4+ circulantes no moniroramento da infecção pelo HIV (ver capítulo 44) e no diagnóstico e classificação imunológica de leucemias e linfomas (para maiores detalhes ver capítulo 4). De maneira simplificada, pode-se dizer que o citômerro de fluxo é uma combinação de um contador auromático de células, similar ao empregado na realização auromarizada de hemograma (vide capítulo 4), com um derecror de fl uorescência. Isso permite a determinação simultânea de múltiplas propriedades físicas das células examinadas: tamanho, complexidade interna de fluorescência.
e emissão
No cirômetro, a suspensão de células previamente incubadas com as preparações de anticorpos fluorescentes é colocada em tubos de ensaio, de onde é aspirada e levada até uma câmara onde um feixe de luz laser incide sobre cada célula individualmente, permitindo a análise individual de cada células, em suas diferences propriedades. As alterações no feixe de luz induzidas pela célula são detectadas por diferences sensores e transformadas em impulsos elérricos convertidos em sinais digitais, podendo oferecer os resultados em diferences formas de análise, cais como hiswgramas, dot-plot, entre outros. O sistema óptico permite identificar as células pelo seu tamanho e sua complexidade interna e o sistema de filtros permite a idemificação da fluorescência emitida.
especificidade absoluta e que diferences agemes infecciosos podem compartilhar determinames antigênicos Emão, a detecção de amicorpos exclusivameme específicos para algum ageme específico é uma meta praticamente impossível de se atingir. Enfim, a interpretação de um reste sorológico depende principalmeme da situação clínica envolvida e do paciente individualmeme. Isso porque a produção de anticorpos no indivíduo é particular e variável: cada paciente rem seu perfi l de resposta imune, resultado de sua genérica e de sua experiência imunológica prévia. Assim, os exames sorológicos só podem ser interpretados à luz de informações clínicas.
REFERÊNCIAS Burris (A, Ashwood ER, Bruns DE. Tierz Texrbook of Clinical Chem1srry and Molecular D1agnosrics. 4 th ed. Sr. Lou1s: Elsevier Saunders; 2006. 2. Ferreira AW, Ávila SLM. D1agnósnco laboraronal das principais doenças 1nfecc1osas e auro-imunes. 2• ed. R1o de janeiro: Guanabara Koogan; 2001. 3. jacobsDS, DeMorr WR, Oxley DK. Laborarory resr handbook. srh ed. Cleveland: Lexi-comp; 2001. 4. McPherson RA, Pincus MR, Threarre GA, Woods GL. Henry's Clin1cal Diagnos1s and Managemem by Laborawry Merhods. 21th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 1.
2007.
5. SriresDP, Terr AI, Parslow TG. Basic Clinical lmmunology. grh ed. London: Prennce-Hall; 1994. 6. Vaz AJ, Take1, k, Bueno. EC. lmunensaios: Fundamentos e Aplicações. R1o de jane1ro: Guanabara Koogan; 2007.
64 [ Medicina laboraro rial para o clínico ]1-- - -- - -- - - - - - - - -- - -- -- - - - - - - - --
Edi/berto Nogueira Mendes Paula Prazeres Magalhães Guilherme Birchal Coi/ares
07 ,
,
DIAGNOSTICO GENETICO: PRINCÍPIOS E TÉCNICAS
A descrição da estrutura da molécula de D A há cerca de 50 anos, por Watson e Crick, constituiu o pomo de partida para o desenvolvimento de diversas técnicas de estudo de ácidos nucléicos, cujas aplicações, no campo da bioanálise e do biodiagnósrico, são virtualmente ilimitadas. De faro. pôde-se testemunhar, nos últimos 25 anos, um avanço sem precedentes na compreensão de diferentes fenômenos biológicos, que expandiu nosso conhecimento sobre as bases moleculares das doenças e. ao mesmo tempo. forneceu. aos profissionais da área de saúde, novas maneiras para estabelecer o diagnóstico e o prognóstico e monirorar o curso das mesmas. Os mérodos de genérica molecular. ou seja. o conjunto de técnicas que empregam ácido nucléico como alvo. vêm sendo paulatinamente incorporados à prática médica, particularmente nas diversas áreas da Medicina Laboratorial. Características como simplicidade. rapidez. confiabilidade, sensibilidade e especificidade conferem. aos métodos genéricos. posição de destaque no campo do diagnóstico laborarorial. Tais métodos possibilitam a caracterização, inclusive de mutações e polimorfismos. e a análise da expressão gênica. tanto no que se refere ao hospedeiro como. no caso de doenças infecoosas, ao agente etiológico do processo. O objetivo deste capítulo é apresemar os pnncípios gerais e as aplicações das técnicas de genética molecular mais comumeme empregadas no diagnósnco laboratonal.
ESTRUTURA E FUNÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Áodos nuclé1cos são macromoléculas que consistem de subun1dades denominadas nucleotídeos. constituídas por uma pentose, uma base nitrogenada e um gru po fosfato. Dois tipos de pentose podem ser observados. ri bose e desoxirribose, que diferem pela presença/ausência de um grupo hidroxila na posição 2' do anel do açúcar. As bases nltrogenadas, ligadas à pos1ção 1' do anel da pentose, podem ser pmm1dinas (CitoS111a, timina e uracila) ou punnas (adenina e guanina). que possuem, respectivamente, um e dois anéis heterocícl icos de carbono e nitrogênio. Ligado às posições 5' e 3' de pentoses adjacentes e, portanto, responsável pela formação da cadeia polinucleotídica. encontra-se o grupo fosfato. que confere carga negativa à macromolécula. O nucleotídeo terminal de uma das fitas de ácido nucléico apresenta o grupo 5' livre; na outra extrem idade, o grupo 3' encontra-se livre. Convencionou-se que a seqüência de nucleocídeos da fita deve ser apresentada no sentido 5'-3'. Existem dois tipos de ácidos nucléicos, ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA). que apresentam diferenças estruturais e funcionais. O DNA é responsável pelo armazenamento e pela transmissão da informação genética e o RNA está envolvido no processo de síntese protéica, também denominado rradução.
O DNA é uma molécula de fica dupla, cuja pencose é a desoxirribose e cujas pirimidinas são citosina e timina. As cadeias que consticuem a molécula são antiparalelas, ou seja, a orientação de uma das ficas é 5'-3' e da fica complementar 3'-5'. O pareamento enue as firas, para formação da dupla hélice. é mamido por ligações entre bases nicrogenadas complementares (A-T e C-G) e interações entre pares de bases adjacentes. (Figura 7.1)
extremidade 5'
PRINCIPAIS TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR APLICADAS AO DIAGNÓSTICO Diversos métodos que analisam DNA ou RNA podem ser empregados no diagnóstico laboratorial. sendo agrupados em duas caregorias. Os mérodos baseados em amplificação são, na maioria das vezes, mais sensíveis, permitindo a detecção de pequena quantidade do ácido nucléico alvo e, portamo, são especialmente úteis para realização de diagnóstico a partir do espécime clínico. Embora a quantidade de ácido nucléico necessária seja consideravelmente maior, os métodos que não envolvem amplificação são utilizados. na prática, em diversas situações, inclusive na confirmação da identidade de produtos amplificados.
TÉCNICAS QUE NÃO ENVOLVEM AMPLI FICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS (
cu,
o-~-o
o
0 11
~~v ~ .
•••.• •
O= r-o·
~·· o
p
o
Os dois mécodos de genétiCa molecular que não envolvem amplificação mais utilizados na prática laboracorial são hibridização e análise com endonucleases de restrição. Ambos possuem numerosas aplicações, sendo particularmente úteis na condução de investigações de natureza epidemiológica.
o
Figura 7.1 - Represemação esquemática de molécula de DNA. (Cotostna; G - guanina; A - adenosina: T - tinína).
Hibridização
O RNA, que apresenta citosina e uracila como bases pirimídicas e ribose como açúcar, é uma molécula de fita simples, mas exibe diversas regiões de fita dupla, em decorrência do pareamento entre bases nicrogenadas complementares (A-U e C-G). Existem três tipos principais de RNA: mensageiro, transportador e ribossômico, que são uanscritos de DNA. O RNA mensageiro carreia a informação codificada no DNA para a síntese protéica. o RNA transportador é responsável pelo carreamento do aminoácido a ser 1ncorporado na cadeia polipepcídica em formação e o RNA ribossômico é um consticuinte estrutural dos ribossomos, organelas complexas que catalisam a cradução da informação gênica em uma seqüência de aminoácidos. (Figura 7.2)
Hibridização é um conceito fundamenta l na bioquímica de ácidos nucléicos. A técnica baseia-se na propriedade de pareamento entre seqüência alvo e sonda. A sonda é uma cadeia curta de nucleotídeos complementar à seqüência de interesse e pode ser sintetizada in vitro ou obtida pelo tratamento de uma cadeia polinucleotíd ica com endonucleases de restrição. Para permitir a detecção dos híbridos. a sonda deve ser marcada. Essa marcação pode ser feita com ISÓWpo radioativo, que torna o método mais sensível. mas apresenta os riscos inerentes à manipulação de material radioacivo, ou com subscratos quimioluminescentes ou cromogênicos, que são reagentes mais estáveis, facilitando a padronização e a reprodutibilidade do método. A forma de detecção varia de acordo com o tipo de marcação empregada.
66
Medicina laboratorial para o clínico
anti c odon S
GCGGAUUUAOCUC~AGCGCCAGA CUGAAYAY CUGGAGGUCCUGUG
CAC AG AAUUCGCA -
3'
Figura 7.2 -Representação esquemática de molécula de RNA rransportador (A- adenina; C - cirocinina; G - guanina; U - uracila)
Em linhas gerais, a hibridização envolve as seguintes etapas, apresentadas esquemacicamente na Figura 7.3: ligação do ácido nucléico alvo a uma membrana; desnaturação da fira dupla de ácido nucléico, quando for o caso; adição da sonda em condições de cemperacura e força iônica adequadas; remoção do excesso de sonda não hibridizada e dececção da seqüência híbrida. A hibridização pode ser empregada em diversas sicuações, visando, na maioria das vezes, a invescigação de semelhanças entre moléculas de ácidos nucléicos de di-
ferentes origens. Sondas de DNA ou de RNA podem ser ucilizadas para dececção de seqüências complementares; podem ser obcidos híbridos DNA/DNA. DNA/RNA ou RNA /RN A. Devido à facil idade de processamento inicial, de armazenamento e de rransporre do maceria!, bem como à possibilidade de análise simulcânea de numerosas amostras, a hibridização é parcicu larmente adequada para escudos epidem iológicos que envolvem obcenção de macerial em locais que não dispõem de infra-escrucura adequada.
gel
membrana Transferência d o
acido nuc léico do gel paro o membrana
sonda marcada
d etecção do alvo
1 -d Figura 7.3 -Representação esquemática de técnica htbridização.
Diagnóstico genérico: princípios e récnicas
67
A tecnologia de microarray, um tipo particular de hibridização mais recentemente desenvolvido, emprega sonda marcada ligada a um suporte sólido ao qual as amostras teste são adicionadas. Por ser uma técnica miniaturizada, requer pequenos volumes de reagentes, o que reduz o cusco do teste. Os microarrays são manufaturados por diversos fornecedores, que utilizam diferences supones sólidos, encre os quais o vidro, o mais comumeme empregado. A metodologia ainda não se encontra disponível na imensa maioria dos laboratórios de diagnóstico.
Análise com endonucleases de restrição
Endonucleases de restrição são enzimas produzidas por microrganismos, que reconhecem pequenas seqüências palindrômicas específicas de nucleotídeos e clivam a molécula de ácido nucléico. O tratamento de ácidos nucléicos com tais enzimas gera fragmentos de diferences tamanhos, de acordo com a distância entre os sítios de clivagem presentes na molécula. O perfil de restrição da amostra pode ser revelado por eletroforese em gel do produto da reação. Para investigação do perfil de restrição, pode ser empregado DNA obtido di retamente da amostra ou DNA amplificado por reação de polimerização em cadeia (PCR). Existe uma ampla gama de endonucleases de restrição disponíveis no mercado; a escolha das enzimas pode ser feita com base na seqüência do alvo em questão ou de maneira aleatória. O número de enzimas utilizado em determinado teste pode variar de acordo com o propósito do estudo e o emprego de diferences enzimas aumenta o poder discriminatório do método. Em síntese, a técnica consiste em submeter a amostra de DNA à clivagem por endonuclease(s) de restrição nas condições físico-químicas adequadas para que a reação ocorra. O produto da digestão enzimática é, então, discriminado por eletroforese em gel. A comparação entre os perfis de restrição obtidos permite a investigação de semelhanças entre ácidos nucléicos de diferences origens (Figura 7.4).
limitação é a sensibilidade baixa, ou seja, resultados falsonegativos poderão ser obtidos quando a quantidade de ácido nucléico alvo não for adequada. O desenvolvimento de métodos que envolvem amplificação, em especial PCR, contribuiu para a solução deste problema e incrementou a utilização de métodos de genética molecular no diagnóstico laboratorial. Apesar de a PCR ser a estratégia de amplificação de ácidos nucléicos mais util izada, outras metodologias têm sido desenvolvidas. Além da ampli ficação do ácido nucléico alvo, elas podem envolver ampli ficação da sonda (oligonucleotídeo) ou do sinal (marcador da sonda). Esse grupo de métodos apresenta, como principal vantagem, a combinação de sensibilidade e especificidade elevadas, sendo util izado, especialmente, nas áreas de Oncologia e de doenças infecciosas e hereditárias. Kits d iagnósticos que empregam algumas dessas técnicas vêm sendo amplamente comercializados.
PCR
PCR é uma reação química simples, pr-omovida in vitro, que combina os princípios de hibridização com aqueles de replicação de ácidos nucléicos. Permite a amplificação exponencial de seqüências genômicas de interesse, sendo considerado um método de diagnóstico extremamente sensível e específico. A
Digestão por endonuclease Exemplo: EcoR 1
3'- C - T - T - A - A 5'- C
lA- A- T- T - C - 3'
sitio de reconhecimento
~ Eletroforese em gel
-1-t--- Padrão de restrição
TÉC NICAS QUE ENVOLVEM AMPLI FICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Embora as técnicas que não envolvem amplificação do alvo apresentem especificidade elevada, sua principal
t G - 5'
-
Figura 7.4 - Representação esquemática da análise empregando enzima de restrição.
68 ( Med icina laboratori al para o clínico Jr-~~~~~~------------~~~~~~~~~~~-
Para a realização da PCR, alguns consEiwinces são fundamentais: a) o molde (DNA), ao qual se liga o par de primers; b) os primers, usualmente seqüências curtas de DNA de fita simples (15 a 25 nucleotídeos), cada um deles complementar a uma das fitas de DNA molde; c) os desoxi rribonucleosídeos trifosfaEados (dNTPs), que são adicionados de maneira complementar à seqüência do molde; d) a DNA polimerase termoescável, usualmente Taq DNA polimerase, que, após ligação dos primers, catalisa a adição de desoxirribonucleotídeos às fitas em formação. A concentração de cloreto de magnésio, outro reagente essencial, influencia o desempenho da técnica, podendo ser ajustada para tornar adequadas a especificidade e a sensibilidade da reação. Cada ciclo de amplificação inclui três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A desnaturação é o período no qual a fita dupla de DNA é desfeita. O processo é promovido pela exposição do material à temperatura de aproximadamente 95°C. Durante a fase seguinte, os primers ligam-se a regiões homólogas no DNA molde. Esta etapa ocorre em temperatura mais baixa, influenciada pela seqüência de bases niuogenadas dos primers. No período de extensão, promovida em torno de 72°(. temperatura ideal para ação da Taq DNA polimerase, ocorre formação da cadeia complementar de DNA. cujo tamanho é determinado pela posição de anelamento dos pnmers. Os produtos da reação ou amplicons, produzidos em quantidades extremamente elevadas (cerca de 2n, n = número de ciclos de amplificação), o que diminui de forma significativa o limite mínimo de detecção, podem ser evidenciados pelo emprego de diferentes técnicas, incluindo eletroforese em gel. colorimetria, fluorimetria e quimioluminescência, entre outras (Figura 7.5). A aplicação da PCR, sem dúvida o principa l avanço técnico recente na área de Genética Molecular, tem revolucionado o conhecimento relativo aos organismos vivos. O impacto da técnica afeta rodos os campos da Biologia, tanto na área básica como aplicada, sendo empregada para diagnóstico clínico, esrudo de doenças hereditárias e análise forense, entre outros. Merece destaque sua utilização no campo das doenças infecciosas, para a compreensão da relação entre microrganismos e hospedeiro, o diagnóstico etiológico e a investigação de resistência a drogas antimicrobianas. A técntca é utiliza-
Diagnóstico genético: princípios e técnicas
da para deEecção de um alvo específico, o que implica a necessidade de se conhecer previamente a seqüência da região a ser investigada. A PCR é um procedimentO de execução simples, cujo resultado pode ser obtido de forma rápida. Diversas modificações que aumentam a aplicabilidade da técnica têm sido desenvolvidas. Entre elas, podem ser citadas PCR multiplex, nested PCR, arbitrarily-primed PCR (AP-PCR), reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) e PCR em tempo real. A PCR multiplex é a variação na qual mais de um par de primers é incluído na reação, o que permite a detecção de diferentes alvos. A principal lim itação da técnica é a dificuldade de padronização, decorrente da utilização simultânea de primers com propriedades químicas e físicas distintas. Em conseqüência da possibilidade de detecção de múltiplos alvos em uma mesma reação, a PCR multiplex torna a relação custo/ benefício mais favorável. Nested PCR envolve o uso de dois conjuntos de primers, empregados em reações seqüenciais. O amplicon produzido na primeira reação é utilizado como molde na segunda. As vantagens desta técnica são sensibilidade e especificidade aumentadas, em decorrência do número elevado de ciclos de amplificação e do uso de um conjunto de primers que se anelam a regiões do produto amplificado na primeira reação, respectivamente. As principais desvantagens são o custo elevado e a necessidade de mani pulação do produto amplificado na pri meira reação. AP-PCR emprega primer que se liga a alvos aleatórios na molécula de DNA produzindo fragmentos de diferentes tamanhos. À semelhança da análise com endonucleases de restrição, a técntca é útil para a detecção de semelhança entre genomas de diferentes origens. RT-PCR utiliza RNA como alvo. Na primeira fase da reação, DNA complementar (cDNA) é produzido pela ação da enzima transcriptase reversa. A seguir, este DNA é empregado como molde para amplificação, como descrita anteriormente para PCR convencional. Encomra-se disponível, atualmeme, uma DNA polimerase termoestável que, em condições adequadas, possui também atividade de uanscriptase reversa. As principais aplicações da técnica incluem o estudo da expressão gênica e o diagnóstico de doenças infecciosas por vírus cujo genoma é constituído por RNA.
69
amplicans do tamanho esperado
I
...,
.
DNA (li•a dopla) /
I
se~
r egião o a m p li fic ado
I \,
llllllllr.. I
...
~
S.:::J'-.... i
... I
S.---'
'.r"J
?
';:J
5_;:::1
Primers
1 1 \
1
';:J
?
',..:::J
!..~
-I i----=-
/ ' ,r::J
/
f ·~ -. \-
...
i
'
desnaturação/
PRIMEIRO C ICLO
R
extensã o
anelomen to
SEGUNDO CICLO
""'/ \
? llllllllr.. I
...
s..,=:J
?
=TERCEIRO CICLO
Figura 7.5 - Representação esquemác1ca de PCR.
A PCR em tempo real é um mérodo que alia às vantagens da PCR tradicional a capacidade de quantificar o DNA alvo. ou seja. permite avaliar, por exemplo. a carga de microrgan1smos infecranres. t uma tecnologia recentemente desenvolvida. baseada na detecção e quantificação de uma molécula repóner fluorescente. cuja concentração é medida a cada ciclo da reação. Para detecção e quantificação do produw amplificado. duas abordagens são usualmente empregadas: sondas ou corantes intercalantes que se ligam ao amplicon. Embora o cusw ainda seja um fawr limitante para o emprego dessa merodologia. a PCR em tempo real apresenta duas grandes vantagens: diminuição da chance de contaminação, uma vez que o amplicon é detectado durante a reação. e rapidez com que o resultado é obtido.
Seqüenciamento
O seqüenciamento de ácidos nucléicos é reconhecido, atualmente, como uma técnica fundamental no campo da Genética Molecular. Porém. sua aplicação ainda é limitada pelo custa elevado. A determinação da ordem exata dos nucleotídeos que constituem os ácidos nucléicos possibilita o conhecimento profundo do genoma dos organismos. A partir desse conhecimenco. é possível o desenvolvimento de
70 [ Medicina laboratoria l para o clínico
primers e sondas para utilização no diagnóstico de uma ampla variedade de doenças. a seleção de estratégias adequadas para a obtenção de seqüênoas de interesse para emprego na tecnologia de DNA recombiname. o reconhecimento de mutações e do seu significado. a comparação entre diferences seqüências visando estudos filogenéticos. o esclarecimento da etiopawgenia de diversas doenças e o desenvolvimento de estratégias para prevenção. controle e tratamenco das mesmas. entre outras numerosas aplicações. O conhecimento da seqüência de nucleotídeos de um determ inado gene elucida não apenas sua estrutura. mas também permite deduzir a seqüência de aminoácidos codificados. Além disro. por comparação com genes previamente descriws. novos genes podem ser mais facilmente localizados no genoma e ter suas funções deduzidas com base na similaridade entre as seqüências dos mesmos. O seqüenciamento de DNA é realizado por PCR. empregando-se o método de terminação de cadeias. que consiste em utilizar. em adição aos precursores habituais (dNTPs). didesoxirribonucleosídeos trifosfacafos (ddNTPs). Esses compostos são semelhantes aos dNTPs. mas desprovidos do grupamento hidroxila na posição 3', sítio de ligação ao nucleotídeo adjacente e. portamo. fundamental para o alongamento da cadeia. Para execução da técnica. quatro misturas de reação são preparadas. Todas contêm tampão. DNA
]1---- - - - --
Reação em cadeia da ligase (lCR)
molde, DNA polimerase e os quatro dNTPs e a cada uma delas é acrescentado um único ddNTP. Quando o ddNTP é incorporado à cadeia em formação, ocorre interrupção da síntese de DNA. Os producos da reação são submetidos à eleuoforese em gel desnacurante de poliacrilamida, em paralelo, o que permite a detecção de uma série de bandas seqüenciais que identificam moléculas nas quais a síntese de DNA foi interrompida na posição correspondente à incorporação do ddNTP. A seqüência de DNA é obtida a parcir da leicura da banda de menor peso molecular e. assim, seqüencialmenre até a banda de maior peso molecular (Figura 7.6). Primers ou ddNTPs marcados com isócopos radioativos ou com fluoróforos podem ser empregados. Os avanços tecnológicos permitem que. acualmenre, a reação seja realizada em um único cubo, empregando ddNTPs marcados com fluoróforos d1ferences. Além disco. os eqUipamentos ma1s modernos são docados de sistemas de detecção que d1spensam execução de eleuoforese em gel de poliacrilamida.
O princípio básico da LCR, mécodo que envolve amplificação do oligonucleotídeo (sonda). é a ligação entre dois oligonucleocídeos adjacentes catalisada por uma DNA ligase cermoescável. Os oligonucleocídeos anelamse de forma específica às regiões alvo das fitas de DNA. A seguir. são unidos entre si pela ação de duas enzimas: fragmento Scoffel de Taq DNA polimerase e DNA ligase termoestável. Os fragmentos resultantes da ligação entre os oligonucleotídeos são. então. empregados como molde para amplificação nos ciclos subseqüenres. A técnica é extremamente útil no screenmg de mutações de pomo relacionadas com resistência a drogas amimicrobianas e com alterações de propriedades associadas à pacogenicidade microbiana, emre outros. Embora seja mais acurada com a utilização das duas enzimas. a reação pode ser realizada empregando-se apenas a DNA ligase rermoestável. Neste caso. os oligonucleotídeos anelam-se a regiões adjacentes da f1ta alvo e a enzima catalisa as ligações covalemes que unirão os pares de oligonucleocídeos entre s1.
G
A
C
T T G
1
~t c
G
Figura 7.6 - Representação esquemánca de seqüenoamento de áodo nucléico.
Diagnóstico genético: princípios e técnicas
71
Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
APLICAÇÕES CLÍNICAS DO DIAGNÓSTICO GENÉTICO
NASBA é um sistema de amplificação isocérmica do alvo que utiliza três enzimas: cranscriprase reversa, RNase H e T7 RNA polimerase. Na primeira fase da reação, um primer contendo sício de ligação para a T7 RNA polimerase liga-se ao ácido nucléico alvo. A seguir, a u anscriprase reversa catalisa a síntese de cDNA e, então, a RNase H degrada a fira molde de RNA, o que possibilita o anelamenro do segundo primer. Na seqüência, a arividade de DNA polimerase da cranscriprase reversa caralisa a síntese de uma cópia do cDNA comendo o sítio de ligação da T7 RNA polimerase. Essa enzima produz grande quantidade de cópias de fitas simples de RNA iguais ao alvo, que servirão como molde nos ciclos subseqüentes da reação. Quando o molde é DNA, o processo é o mesmo, excero pela necessidade de um ciclo inicial de desnaturação ames da adição das enzimas. O mérodo envolve caprura em suporte sólido e detecção com sonda marcada. Uma das grandes vantagens da técnica é a sensibilidade excremamenre elevada. Sua principal aplicação é a quantificação de RNA virai na infecção pelo vírus da imunodeficiência humana e a caracterização de amostras do vírus resistentes a drogas.
Branched DNA (bDNA) Branched DNA é um sistema de amplificação extremamente sensível, que se baseia em múltiplos ciclos de hibridização de ácidos nucléicos seguidos por uma única etapa enzimática durante a fase de derecção. Inicialmente, o ligonucleorídeos de caprura ligados a uma fase sólida hibridizam-se ao alvo e imobilizam o mesmo. Na seqüência, oligonucleotídeos bivalentes de detecção ligam-se a regiões do alvo, servindo também como subscraros para hibridização do bDNA, que caprura oligon ucleorídeos marcados com uma enzima. Entre as vanragens do mérodo, podem ser citadas a obcenção de dados quantitativos, a menor possibilidade de contaminação e a facilidade do processamento inicial do espécime clínico, que dispensa remoção de inibidores enzimáticos, e da manutenção do mesmo.
O desenvolvimento das téc nicas de genética molecular represemou grande avanço na propedêucica laboratorial para diagnóscico e acompanhamento de doenças de diferences categorias, como as de etiologia infecciosa, oncológicas e de natureza hereditária. Sensibilidade e especificidade elevadas, rapidez de execução e possibilidade de utilização de uma ampla gama de espécimes biológicos para análise, incluindo material fixado em parafina, representam im portantes vamagens dessas técnicas. O diagnóstico genético de doenças infecciosas tem sido cada vez mais ucilizado, represemando uma imponame alternaciva às técnicas convencionais, muicas vezes crabalhosas e de execução demorada. Tais mécodos podem ser empregados não apenas para detecção de agentes infecciosos, mas cambém para sua quantificação, sua caracterização genética e pesquisa de resistência a amimicrobianos. Técnicas de genética molecular são particularmente úteis quando microrganismos não cultiváveis, de difícil cultivo ou de crescimento lemo, como vírus e micobactérias, são os agentes do processo. Entretanto, o método não perm1ce o isolamento de microrganismos para outros estudos. Emre as técnicas de diagnóstico genético, PCR é a mais amplamente utilizada. Embora apresente as vantagens mencionadas, possui algumas limitações importantes. Na maioria das vezes, os primers utilizados são específicos, razão pela qual resultados negativos não excluem infecção por outro microrganismo e resultados positivos não excluem infecções mistas. Devido à possibilidade de detecção de quantidades ínfimas de microrganismos, a positividade do reste não significa, necessariamente, identificação do ageme etiológico da infecção. Como detecta material genético, é possível a obtenção de resultados positivos na presença apenas de microrganismos inviáveis ou larentes que, naquele momento, não estão envolvidos na etiopatogenia do processo. Assim, o emprego de PCR não é adequado em algumas situações específicas, como avaliação da eficácia do tratamento de pacientes com tuberculose. A PCR encontra-se incorporada à prática clínica para o diagnóstico de hepatites virais, in fecção por HIV e HPV, uretrites, cervicites, tu berculose e ciromegalovirose. Existem diversas variações de técnica que permitem, entre outros, avaliação de carga virai e de resposta ao trata-
72 [ Medicina laboratorial para o clínico ]f-- - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
mento com antimicrobianos especialmente em pacientes com infecção por HIV, hepatites e ciwmegalovirose. Outra possibilidade de aplicação das técnicas de genética molecular na abordagem do paciente com doença infecciosa é a detecção de resistência do agente etiológico a antimicrobianos. É importante salientar que a ausência do gene não significa suscetibilidade à droga, uma vez que a resistência pode ser conferida por outros mecanismos. Além disco, a presença de um gene de resistência não indica necessariamente sua expressão. Apesar dessas limitações, a alteração da amibioticoterapia deve ser considerada quando genes de resistência são detectados. A pesqu isa de genes de resistência é particularmente útil quando a realização de testes de suscetibil idade não é possível ou é dificultada pelo tempo de geração do microrganismo. Uma das principais indicações desta pesquisa é fornecer subsídios para a escolha de esquema terapêutico para tratamento de pacientes com tuberculose. quando há suspeita de resistência aos tuberculostáticos habitualmente empregados. Vários genes de resistência a antimicrobianos têm sido estudados, entre eles rpoB, relacionado com resistência a rifampicina, e katG, inhA e ahpC. associados à resistência à isoniazida. Técnicas de genética molecular são úteis também no diagnóstico e acompanhamento de doenças oncológicas. A rransformação maligna das células requer. geralmente, ativação múltipla de proto-oncogenes ou desregulação de genes supressores de tumor. Por meio destas técnicas é possível identificar oncogenes e mutações em genes supressores de tumor. Para se atingir esses objetivos, podem ser utilizados PCR. empregando-se primers para detecção de alguns oncogenes. e seqüenciamento, para pesquisa de mutações. Entre várias possibilidades, tais métodos podem ser utilizados para auxiliar no diagnóstico diferencial entre linfoma folicular e hiperplasia folicular de tecido linfóide por meio da detecção, por PCR, de rearranjos do gene bcl-2; da leucemia mielóide crônica pela detecção do segmento bcr!abl resultante da translocação (9;22); de câncer de mama e ovário por meio de seqüenciamento de brcA1 e brcA2 para pesquisa de mutações; e de carcinoma medular da tireóide e neoplasia endócrina múltipla, pelo seqüenciamento dos exons 10, 11. 13, 14 e 16 do gene ret, para pesquisa de mutações.
Diagnóstico genético: prin cípios e técnicas
Estes métodos apresentam vantagens sobre a determinação do cariótipo, que requer a obtenção de células em divisão. Além disto, técnicas de genética molecular são mais sensíveis, uma vez que o método convencional não detecta anormalidades submicroscópicas. Por outro lado. como os métodos genéticos são direcionados para a pesquisa de uma anormalidade específica, resultados negativos não excluem a presença de alteração. Ainda, a cariotipagem detecta variações numéricas de cromossomas, como trissomias e monossomias, que não são identificadas por PCR. A pesquisa de alterações genéticas associadas ao câncer não é recomendada para rastreamento da doença na população geral. já que o cusco-benefício é desfavorável e o diagnóstico pode levar a sofrimento desnecessário. Além disto, as medidas a serem adoradas caso uma alteração associada a risco elevado para o desenvolvimento de neoplasia seja detectada não estão estabelecidas. Um exemplo que ilustra esta situação é a detecção de mutações em brcA1 e brcA2. Embora tais alterações genéticas estejam presentes em apenas aproximadamente 2,5% das mulheres com câncer de mama, estão associadas à transmissão hereditária da neoplasia, que apresenta padrão autossômico dominante de herança e risco de desenvolvimento do tumor superior a 50% em indivíduos com até 50 anos de idade. podendo atingi r valores próximos de 90% a partir da sétima década de vida. Deste modo, a detecção dessas alterações poderiam levar a conduta radical. como a mastectomia profilática. Assim, tornam-se fundamentais estudos epidemiológicos mais profundos relativos ao tema. Detecção de alterações genéticas pode ser util izada. ainda, como marcador prognóstico e no acompanhamento de tratamento de pacientes com neoplasias diversas. Nessas situações, a importância da detecção de marcadores genéticos de câncer já está mais bem estabelecida. Por exemplo. a presença de translocação (12;21) em pacientes com leucemia linfoblástica aguda está relacionada com mel hor prognóstico e resposta adequada à quimioterapia convencional e algumas mutações do p53 estão associadas a prognóstico pior em alguns tumores gastrintestinais. de bexiga. pulmão, ovário, mama e próstata. Informações mais detalhadas sobre o uso de técnicas de genética molecular no diagnóstico e acompanhamento de leucemias encontramse nos capítulos 29, 30 e 31.
73
Com a elucidação do genoma humano, têm sido descobertas diversas alterações genéticas relacionadas a doenças hereditárias. Mérodos de genética molecular são cada vez mais empregados para detecção dessas alterações na prática clínica, entre eles, seqüenciamento
de ácido nucléico, PCR e hibridização. Quando a PCR é utilizada, primers específicos para a mutação procurada e para o gene selvagem devem ser empregados para identificar-se a presença do gene murado em homozigose ou heterozigose. Como exemplo, pode ser citada a fibrose cística; o quadro já foi associado a mais de 1.000 mutações e, geralmente, os testes genéticos são capazes de detectar apenas as mais comumente relatadas. Outras aplicações de tais métodos na área de doenças genéticas incluem o diagnóstico da síndrome do X frágil, de hemocromarose hereditária, de disrrofia muscular Duchenne/Becker e de ataxia espinocerebelar. bem como detecção de mutações nos genes da metilenotetrahidrofolaro redutase, da protrombina e do fator V de Leiden, associadas à trombofilia. e nos genes pkd1 e pkd2, relacionados à doença renal policística aurossômica dominante. É importante ressaltar que, devido à narureza irreversível das alterações provocadas, é sempre importante o aconselhamento pré e pós-reste visando avaliar o paciente e informar as indicações do ensaio, o significado da presença das alterações em homozigose e em hererozigose para a doença pesquisada, a necessidade ou não de acompanhamento clínico e psicológiCo pós-teste, os possíveis riscos de transmissão da doença ou da alteração genética para os descendentes e a necessidade de avaliação posterior de outros membros da família. Os métodos de genética molecular são aplicados no diagnóstico de paternidade. O teste pode ser realizado por meio da amplificação, por PCR, de regiões denominadas short tandem repeats, caracterizadas pela presença de número variável de repetições de um segmento de crês a sere pares de bases localizadas cm diversos loci cm regiões não traduzidas do genoma humano. Cada indivíduo apresenta dois alelos de tamanhos variáveis em cada um desses loCI. O diagnóstico é feiro a partir da análise de 12 a 25 /oo e comparação dos alelos do filho com os maternos e com os do suposw pai. Os resultados são analisados em softwares que consideram a freqüência dos alelos encontrados na população local e liberados como probabilidade de paternidade que, quando confirmada,
74
Medicina laboratorial para o clínico
geralmente atinge valores superiores a 99,99%. Mérodos semelhantes podem ser usados em perícia criminal para investigação de materiais biológicos. na tentativa de identificar um indivíduo suspeiw. Apesar da grande utilidade das técnicas de genética
molecular no diagnóstico e acompanhamenro de doenças de diferences etiologias, sua aplicação na prática médica é, ainda, pouco difundida. O custo desses testes ainda é tido como um faror limitante para sua utilização. Deve-se lembrar que os benefícios do método genético de diagnósnco, entre eles rapidez e acurácia, podem contribuir para uma relação custa-benefício mais favorável. possibilitando redução da necessidade de outros exames complementares, instituição de tratamento mais eficaz e diminuição do número e da duração de internações. Outros fawres limitantes, talvez mais importantes que o cusw elevado, são o desconhecimento das técnicas e de suas aplicações e a falta de pessoal capacitado. Assim, é fundamental que se promova maior disseminação de informações referentes a indicações e benefícios da inclusão de técnicas de genética molecular na abo rdagem laboratorial do paciente. REFERÊNCIAS 1.
Clark DP. Russell LD. Molecular Biology M ade Simple and Fun. 3rd ed. Sr. LoUis: Cache R1ver Press; 2005.
2.
Coleman WB, Tsongal is GJ. Molecu lar Diagnostics for che Clinical Laboracorian. 2nd ed. Torowa: Humana Press,
3.
Forbes BA. Sahm DF, We1ssfeld AS. Molecular mechods for mlcroblalidentlficatlon and characrerizanon.ln: Badey
2004:567.
& Scmr's Diagnosnc M 1crob1ology. Se. Lou1s: Mosby; 2002.
p. 188-207. 4.
Louie M. Lou1e L. S1mor AE. The role of DNA ampllficatlon rechnology 111 rhe d1agnos1s of 111fecnous d1seases.
S.
Mon1s PT. G1gl1o S. Nucle1c ac1d amplificaCion -based
6.
rechniques for pathogen derecDon and 1demificarion. lnfecr Gen Evol. 2006;6:2-12. Wagener C. Molecular d1agnost1cs. J Moi Med.
Can Med Ass J. 2000;163:301-9.
1997;75728-44. 7.
8.
Yang S. Rorhman RE. PCR-based diagnostics for lllfecrious diseases: uses. limitaDons, and future applicarions in acure-care serrings. Lancer. 2004;4:337- 348. Zimnng JC. Noite FS. Polymerase chain reacrion and orher amplificarion technology. ln: Henry JB; editor Cl inical D1agnosis and Management by Laborarory Merhods. Phdadelph1a: Sa unders Company; 2001. p. 1287-95.
]1-- - - - - - - -- - - -- - - - - - - - -- - - -- - - - -
Guilherme Birchal Cofiares Lucienne França Reis Paiva Hyllo Baeta Marcel/o júnior
08
,
MICROBIOTA INDIGENA
O ser humano é isento de germes somente enquan-
tes de seu metabolismo, e colabora com os mecanismos
to habita, em condições normais, o útero materno,
de proteção antiinfecciosa, mas, também, constitui um
tornando-se colonizado por microrganismos a partir do
reservatório de microrganismos potencialmente pato-
momento do nascimento. Em contara com o meio ex-
gênicos. Além disso, conhecendo a microbiota indígena,
terior, as superfícies corporais são colonizadas principal-
é possível interpretar melhor os resultados de culturas,
e
valorizando ou não o isolamento de determinados mi-
mente por bactérias e, em menor escala, por fungos
protozoários. Essa coleção de microrganismos que habi-
crorgan ismos em determinados sítios.
tam o corpo é comumente denominada de "microflora normal". Outros termos muito usados são "flora normal", "microbiota indígena" e "microbiota autóctone".
MICROBIOTA INDÍGENA
De todos, os mais corretos são "microbiota indígena" e "microbiota autóctone", pois inferem uma coleção de
Mecanismos regulatórios do hospedeiro (fatores
microrganismos que são nativos do corpo. "Flora" e "mi-
autógenos) e fatores externos (alogênicos) são respon-
croflora" são conotações botânicas infelizes, derivadas
sáveis pela presença de determ inados microrganismos
dos tempos em que as bactérias e outros m icrorganis-
no corpo e pela elimi nação de o utros. Diferenças bio-
mos eram considerados semelhantes às células vegetais.
químicas e fisiológicas em diferentes regiões do corpo
A m icrobiota indígena habita a superfície da pele, a ca-
(temperatura, pH, potencial de oxirredução, osmola-
vidade oral, o t rato respiratório superior, o trato diges-
ridade, nutrientes, receptores na superfície de células
tivo e os tratos urinário e genital, variando qualitativa e
epiteliais, entre outros) proporcionam ambientes pro-
quantitativamente nos diversos locais.
pícios para determinados microrganismos e desfavo -
O número de microrganismos presentes na m icro-
ráveis para outros. A capacidade de adesão a superfí-
biota indígena chega a superar o número de células
cies do corpo, que é célula-específ ica e rel acionada à
de seu próprio hospedeiro. Enquanto um adulto hu-
expressão de adesinas, é um dos principais requisitos
mano é constituído de aproximadamente 1013 células
para a colonização.
eucarióticas, as suas superfícies podem ser colonizadas
A microbiota pode ser classificada em transitória
pelo total de 1014 células microbianas procarióticas e
ou residente. A m icrobiota residente é praticamente
eucarióticas.
constante em determinada topografia e faixa etária.
O conhecimento da microbiota é importante porque
Após seu estabelecimento, e em condições normais,
ela exerce ações benéficas para o hospedeiro, decorren-
não é al terada; e quando isto ocorre, é prontamente
resrabelecida por si só. Esrá firmemente aderida aos receptores reciduais acravés de ligações covalentes, hidrogênio-iônicas. entre outras, só podendo ser removida pela morte microbiana ou alterações no recepcor. Os nossos tecidos representam seu habitat natural e quando o equilíbrio é mantido, não provoca doenças, atuando como barreira amiinfecciosa. A microbiota uansitória pode colonizar tecidos temporariamente por algumas horas. dias ou semanas, não sendo restabelecida por s1 só. A sua imeração com os recepcores teciduais é reversível, podendo ser removida. Geralmente. origina-se do meio amb1ente ou de outros tecidos do hospedeiro e não representa problema se a microbiota residente permanecer inalterada, mas pode originar doenças na sua alteração. A 1nteração da microbiora com os tecidos é altamente específica e é determinada por facores locais do hospedeiro, como especificidade dos receptores, suprimento sangüíneo, nutrientes, temperatura, umidade. pH. potencial de oxirredução, presença de enzimas e anticorpos lgA. Os fatores ambientais. como o tipo de dieta, háb1tos de higiene. polu1ção, saneamento básico. utilização de anrimicrobianos ou anti-sépticos e hospitalização, tam bém influenciam na constituição da microbiota indígena. Cada parte do corpo contendo suas características estruturais e microbianas pode. por definição, ser considerada um ecossistema. Como cada ecossistema abriga uma m1crobiora característica, a microbiora indígena humana pode ser dividida em m1crobiota da pele, do trato respiratório superior. cav1dade oral. microbiota gasrrinrestinal e do trato geniturinário.
MICROBIOTA DA PELE A m1crobiora da pele é constituída principalmente pelos Staphylococcus spp. coagulase negativos. sendo Staphylococcus epiderm1d1s a espécie mais freqüente. Outros cocos Gram posmvo podem ser encontrados. entre eles: Micrococcus. Peptococcus saccharolytlcus. Streptococcus viridans e Enterococcus. Outro importante membro da microbiota da pele é o Staphylococcus aureus, presente em cerca de 20% das pessoas. podendo estar relaoonado a infecções como impetigo. foliculite e furunculose. Bastonetes Gram positivo também
76 [ Medicina laboracorial para o clínico
podem ser encontrados habicando normalmeme a pele humana e são representados pelos difreróides aeróbicos (Corynebactenum sp e Brev1bactenum sp) e pelos difteróides anaeróbicos. Bastonetes Gram negativo são raramente encontrados como membros da microbiota da pele, a não ser em pacientes hospicalizados. O Quadro 8.1 lista os microrganismos mais freqüentemente isolados da pele. O conhecimento dessa microbiora se faz importante já que microrganismos da pele podem aparecer como contaminantes de culturas de diversos materiais, como nas uroculturas, hemoculruras e culturas de secreções diversas.
MICROB IOTA DO TRATO RESPIRATÓRIO O trato respiratório inferior é estéril abaixo da carina. As vias aéreas superiores são colonizadas predominamemente por cocos Gram positivo, sendo Staphylococcus aureus e Staphylococcus ep1derm1dis as espéoes ma1s isoladas. Bastonetes Gram positivo, como os difteróides. também podem ser encontrados com freqüência . O Quadro 8.2 lista os principais microrganismos da microbiota do trato respiratório superior. t importante ressaltar que microrganismos considerados patógenos primários. como Streptococcus pyogenes, Neisseria memng1tidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus mfluenzae. podem ser isolados nessa topografia. normalmente como componentes da microbiota.
MICROBIOTA DA CAVI DADE ORAL A cavidade oral apresenta grande densidade microbiana. comparada apenas à da m1crobiota intestinal. Microrganismos anaeróbios estritos como bacteróides. Fusobacterium e Veillonella superam numericamence as espécies facultativas. Streptococcus mutans. presentes normalmente na microbiora oral, podem contribuir para a formação da placa dentária, possibilitando o desenvolvimento da cárie. Os microrganismos mais comumente encontrados na cavidade oral humana estão listados no Quadro 8.3. É importante ressaltar que microrganismos presentes na microbiota o ral podem representar importantes contaminantes de culturas de escarro.
Quadro 8.1 -Microrganismos comumenre dereclados na pele humana Cocos Gram positivo
Slophylococcus oureus 5 ounculores S cop,s S cohntt S. epidermidis S. hoemolyticus S. hominis S socchoroltticus S. soprophyticus
Bastonetes Gram positivo
Coryneboctenum Jei erum S. Xyfosus C ureo/yt1Cum Micrococucus luteus C mmullsstmum M.lyloe Proprombocterium M. nishinom1yoensis ocnes M. krislinoe P. ovidum M sP.denlorius P. gronulosum M. roseus Breviboctenum M. vorions eptdermidts S. simulons S. worner
Bastonetes Gram negativo
Leveduras
Malossezio furfur
Acinetobocter JOhnsonii
Aracnídeos
Demodex folliculorum
Modrflcado de lannod .. GW Normal M rcroflora1
Quadro 8.2 - M1crorgamsmos comumente detectados no trato respiratório superior Porção anterior das normas
Stophylococcus epidermidis S. oureus Corynebocterium sp
Mod fiCado de: Tannock GW
Nosoforinge
Orofaringe
Stophylococcus Todos os do nosofonnge, m01s. eprdermidis Streptococcus ongmous S. constellotus S oureus S. inlermedius Coryneboctenum spp S soguis Moroxello cororrholis Hoemophdus ínfluenzoe S. oro/is S. mitis Nersse1i0 meningitidis S. ocidomintmus N . mucoso N . sicco N subflovo
S. S. S. S. S. S. S. S. S
morbillorum salivorius uberis gordonir mutons cricectus rattus sobnnus crrsto
S. pneumonioe S. pyogenes I< 10% do população humanal
Hoemophilus potarn· fluenzoe Mycoplosmo solivorius M. oroles
ormal M•croflora 2
Quadro 8.3 - M1crorgamsmos comumenre detectados na cav1dade oral de seres humanos Bastonetes G rom positivo e bactérias filamentosos
Actinomyces :srae/1; A. viscosus A. noeslund11
Eubacterium olocto/ylicum E. saburreum Lactobocillus cosei Bifidobocterium denltum Corynebocterium mafruchotii Propronibocterivm sp Rothto dentoconoso
Bastonetes Grom negativo
Prevotelo meloningogemco P intermedio P. loescheii P. denticolo Porphyromonas gingivolis P. assocharo/ytica P. endodontalis Fusobacterium nucleatum F. naviforme
F IUSSII F peridoncticum F. olocis F sulci Leptotrichio buccalis Selenomonos sputigeno S. flueggei Copnocytophaga ochracea C spvtagena
C. gingivolis Compylabocter rectus C. curvus Veillonello p01vulo V otyprca V dispor
Modrf•cado de Tannod. G\V 1\orma MICroflora 2
M ICROBIOTA GASTRINTESTINAL
O esôfago normalmente contém apenas microrganismos provenientes da microbioca oral e dos alimentos.
Microbiota indígena
O estômago. devido ao baixo pH, não abnga microrganismos em condições no rmais. No JntescJno, a população bacteriana aumenta no sentido céfa lo-caudal, sendo que na ampola retal podem ser encontradas até
77
1012 UFC por grama de fezes. O bolo fecal
é consticu-
ressaltar que Candida albica ns, agente causador d e
ído principalmente por microrganismos anaeróbios es-
vaginites, pode estar presente como parte da micro-
tri tos numa relação de aproximadamente 1.000 bacté-
biora indígena vaginal.
rias anaeróbias estritas para cada anaeróbio facultativo. Os principais anaeróbios encontrados são bacteróides,
Fusobacteriumm spp., Clostridium spp. e lactobacilos. En-
Quadro 8.5 - Gêneros bacterianos comumente encontrados no lavado vaginal de humanos
tre os facultativos, destacam-se as enterobactérias, como
Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp e Pro teus spp. O Quadro 8.4 lista os principais microrganismos encontrados no bolo fecal. Quadro 8.4 - Gêneros bacterianos comumente encontrados nas fezes humanas
Cocos Gram positivo anaeróbios
Bocteroides Condido Corynebocterium Eubocterium Gordnerello Loctobocillus
Mycoplosmo Propionibocterium Stophylococcus Streplococcus Ureoplosmo
Mod1ficado de: Tannock, GW: Normal Microflora
Acidominococcus Bocleroides Bifidobocterium Clostridium Coprococcus Enterobocter Enterococcus Escherichio Eubocterium Klebsiello
Loctobocillus Megomonos Meghosphoero Methonobrevibocler Methonosphoero Peplostreptococcus Proteus Ruminococcus Veillonello
IMPORTÂNCIA DA MICROBIOTA INDÍGENA
A microbiota indígena, quando em equilíbrio e na ausência de fatores que comprometem a imunidade do hospedeiro, apresenta vários efeitos benéficos, atuando
Mod1fícado de: Tannock, GW: Normal M icroflora
na própria defesa antiinfecciosa e contribuindo na nutrição do hospedei ro. Certos membros da microbiora intestinal são capa-
MICROBIOTA DO TRATO GEN ITURINÁRIO
zes de sintetizar vitaminas K, B12, folato, piridoxina, biorina e riboflavina, participando da nutrição do hospedeiro.
O trato urinário superior é estéril até 1 cm da
Apesar disso, com exceção da vitamina K, as quantida-
uretra distal. O meato uretral e o segmento distal
des produzidas são muito pequenas em relação à quan-
da uretra são geralmente colonizados por micror-
tidade presente numa dieta balanceada.
ganismos da pele. O trato genital feminino é colo-
Na defesa, a microbiota age impedindo o esta-
nizado por m icrorganismos dife rentes, dependendo
belecimento de microrganismos exógenos possivel-
da época de vida. Ao nascimento, devido à ação de hormônios maternos, o epitélio vaginal está rep leto
mente patogênicos, a partir de diversos m ecanismos, como competição por nutrientes, produção
de glicogênio, substrato para a proliferação de lac-
de bacteriocinas o u modificações ambientais, que
tobacilos. Com a queda dos níveis hormonais, após
desfavorecem a colonização de patógenos. Bacté-
algumas semanas de vida ocorre diminuição do gli-
rias do gênero
Bifidobacterium presentes no cólon
cogênio do epitélio vaginal, os lactobacilos desapa-
de crianças em aleitamento materno produzem um
recem, o pH vaginal torna-se neutro, o que permite
ambiente adverso para infecção por patógenos en-
Streptococcus
a proliferação de m icrorganismos anaeróbios como
téricos. Bacteriocinas produzidas por
Bacteroides spp. Na puberdade, a partir da menarca, durante todo o período fértil, ocorre colonização
do grupo viridan s presentes na microbiota da orofaringe impedem a colonização por Streptococcus
vaginal por lactobacilos em conseqüência da pro-
pneumoniae, Streptococcus pyogenes e bastonetes
dução de hormônios sexuais. Outros microrganis-
Gram negativo, pOtencialmente patogênicos. A mi-
mos encontrados na microbiota vaginal da mulher
crobiota vaginal apresenta efeito similar d e prote-
em idade fértil estão listados no Quadro 8.5. Vale
ção contra infecções. devido à produção de ácido
78 [ Medicina laboratorial para o clínico ] 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - -- -
lárico pelos Lactobacillus spp, por meio do merabolismo do glicogênio presente no epitélio vaginal. A produção de ácido lático ajuda a manter o pH vaginal ácido (aproximadamente 4.5), o que dificulta a presença de enterobactérias patogênicas. Além disso, a produção de peróxido de hidrogênio pelos Lactobacillus spp. tem ação antimicrobiana direta e, em associação com a mieloperoxidase, libera íon cloro, outro potente germicida. Modificações da microbiota indígena induzidas pelo uso de antibioticoterapia de largo espectro podem levar a alterações na defesa do hospedeiro, evidenciado pelo aparecimento de infecções. Candida albicans da microbiota indígena pode multiplicar-se intensamente, causando micoses superficiais nas regiões oral e genital após o uso de antimicrobianos. Colite pseudomembranosa é resultado da proliferação de Clostridium difficile devido à pressão seletiva decorrente do uso intensivo de antimicrobianos. Outro mecanismo pelo qual a microbiota indígena auxilia a defesa contra infecções é a indução da produção de imunoglobulinas, como lgA e lgG, pela estimulação antigênica. Animais isentos de germes têm sistema mononuclear-fagocitário pouco desenvolvido e baixos níveis séricos de imunoglobulinas. Assim, muitas bactérias consideradas não-patogênicas podem ser letais para animais criados em condições completamente assépticas.
que pode levar à perironire e formação de abscessos intra-abdominais relacionados à presença de anaeróbios e enterobactérias intestinais. Streptococcus do grupo Viridans, presentes normalmente na cavidade oral, podem atingir a circulação sangüínea devido a traumas diversos (por ex. exrraçâo dentária) e colonizar valvas cardíacas previamente lesadas, levando à endocardite bacteriana. Além disso, microrganismos da microbiota podem causar infecções diversas em pacientes com comprometimento de seus mecanismos de defesa. Assim, a maior parte das infecções hospitalares é causada por espécies da microbiota humana autóctone. O desenvolvimento de uma doença infecciosa depende particularmente do modo de interação entre parasito e hospedeiro, o que, por sua vez, depende de fatores relacionados aos microrganismos, às defesas do hospedeiro e ao ambiente no qual ocorre a infecção. Classicamente, os microrganismos são distribuídos em patogênicos e não-patogênicos, de acordo com sua capacidade de produzir doença. Essa divisão se torna muitO difícil à medida que a ocorrência da doença não depende apenas da capacidade do microrganismo de produzir lesão, mas também da capacidade do hospedeiro em evitar a infecção. Microrganismos classificados como não-patogênicos podem induzir doenças graves em pacientes imunocomprometidos. Sendo assim, rodo microrganismo que coloniza um ser vivo deve ser considerado potencialmente patogênico.
MICROBIOTA COMO FONTE DE AGENTES INFECCIOSOS
RESGATE DA IDÉIA CENTRAL DO CAPÍTULO
Em contrapartida aos efeitos benéficos, a microbiota indígena pode atuar como reservatório de microrganismos potencialmente patogênicos para o hospedeiro. Muitos microrganismos presentes normalmente na microbiota do hospedeiro podem causar infecções oportunistas nos seus sítios indígenas, como mencionado no desequilíbrio pela ação de antimicrobianos ou quando atingem locais diferentes de seu local natural de colonização. Assim, a maioria das infecções do trato urinário é causada por enterobactérias da microbiota do trato digestivo, que atingem o trato urinário por via ascendente. A perfuração do cólon libera material fecal na cavidade abdominal, o
O ser humano apresenta microbiota indígena variada que, quando em condições de equilíbrio, desempenha funções benéficas, auxiliando na defesa contra infecções. Apesar disso, pode atuar como reservatório de microrganismos potencialmente patogênicos, levando à ocorrência de infecções, principalmente, em situações em que os mecanismos de defesa antiinfecciosa se encontram prej udicados. Mudanças constitucionais da microbiota, como ocorrem nos casos de hospitalização e uso abusivo de antimicrobianos, levam, muitas vezes, à seleção de microrganismos mais patogênicos e resistentes, favorecendo ainda mais o desenvolvimento de infecções.
Microbiota indígena
79
REFERÊNCIAS 1.
Berg RD. The 1nd1genous gasrroinresnnal m1croflora. Trends M1crob1ol. 1996;4:85-91. 2. Fernandes AT. R1be1ro Filho N. Infecção Hosp1talar: desequilíbrio ecológ1co na ln teração do homem com sua mlcrobiota.ln: Fernandes AT. Fernandes MOV. Ribe1ro Filho
6.
Ryan KJ_Normal M 1crob1al Flora. ln: Ryan KJ. editOr. Sherns Medical M 1crob1ology: an inrroduction w infectious diseases. Connecticut: Appleton & Lange; 1994. p. 13340. 7. Tannock, GW. Normal m1croflora: an lntrodu((lon ro
N. edimres. Infecção Hospitalar e suas lmerfaces na Área da Saúde. São Paulo: Atheneu; 2000. p.163-208. 3. jawetz E, Melnick JL. Adelberg EA, Brooks GF. Burel JS, Ornston LN. M 1crob1ologia Médica. Rio de janeiro: Guanabara Koogan; 1998. 4. Mackow1ak P. The normal m1crobial flora. N Engl J Med. 1982;307(2):83-93. 5. Noverr MC Huffnagle GB. Does the m1Crob1ma regulare immune responses omside the gut7 Trends M1crob1ol. 2004;12(12): 562-8.
80 ( Medicina laboratorial para o clínico
microbes 1nhab1nng rhe human body. London: Chap8. 9.
man and Hall; 1995. Tannock GW. M ed1callmporrance of rhe Normal M icroflora. London: Kluwer Academic Publishers; 1999. Torwra GJ. Funke BR, Case CL. M icrobiologia. Porro Alegre: Artmed Ed1mra; 2000.
]r ---- - - - - -- - - -- - -- - - - - - -- - - -- - -- - -
09
Bruno Horta Andrade Stella Sala Soares Lima Wanessa Trindade Clemente
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM INFECÇÃO DO TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR
Infecções do eram respiratório infenor (ITRI) são uma das prinopais causas de morte associada a processos infecciosos no mundo e, apesar do avanço na detecção de patógenos, ainda permanecem controversos os critérios clínicos e propedêuticas para defintção do diagnóstico. Com a crescente complexidade de pacientes portadores de infecções respiratórias e a melhoria da assistência à saúde. houve maior demanda de arsenal propedêutico elaborado. Por outro lado, a disponibilidade e custo-efetivtdade dessas novas técnicas devem ser considerados na escolha da propedêutica. Acresça-se que a abordagem laboratonal das ITRI não visa somente à tdennftcação do agente etiológico, mas também auxtlta na definição de gravidade e documenta a presença de co-morbidades. Entre as ITRI, serão abordadas neste ca pítulo as pneumonias adquiridas na comunidade (PAC}, as associadas à asstsrência à saúde (PAAS), a aspergilose e a pneumocistose pulmonar. Embora discuttdas dtsttntamence, destaca-se que, na práttca clínica, o dtagnóstico diferencial entre essas entidades pode ser difíetl, sendo muitas vezes necessária a utilização de procedimentos invasivos, nem sempre dtsponíveis, ou terapêutica empinca de maiorespectro na ausência de identificação do agente etiológico.
PNEUMONIA ADQUIRIDA NA COMUNIDADE
Pneumonia é a inflamação aguda do parênqutma pulmonar dtsral aos bronquíolos, causada por agente in-
feccioso bacteriano. fúngico ou virai. Conceirualmente, a PAC acomete o individuo fora do ambiente hospitalar ou aqueles Internados, CUJOS sintomas se iniciaram antes de 48 horas da admtssão. No Brastl. as PACs são a segunda mator causa de internação, com maior ocorrência nos meses de inverno e em indivíduos nos extremos erários (< 5 anos e > 70 anos), havendo leve predominância do sexo masculino, segundo dados do Departamento de Informática do SUS- DATASUS. A investigação propedêutica, nesse caso, objetiva a comprovação da PAC. a detecção de co-morbidades associadas. a determinação da condição basal do paciente para comparação evolutiva, a predição ou identificação do parógeno e o estabelecimento da gravidade da doença. A decisão médica inicial concentra-se na indtcação ou não de hospitalização, dependendo da classificação de gravidade do paciente. e geralmente a mataria (75%) deles pode ser tratada ambulatorialmente. A classificação do risco dos pacientes com PAC. baseada nos estudos de FINE et ai. (Pneumonia Severity Index - PSI), encontra-se nos Quadros 9.1 e 9.2. Está indicado tratamento ambularorial para os paoentes das classes I e 11, embora condtções sociats, co-morbidades, falência de cratamento ambulatorial e Insuficiência renal aguda determinem internação, mesmo nos indivíduos dessas classes. A direuiz brasileira para PAC em adultos imunocomperenres recomenda a utilização do critério de gravidade do consenso britânico (CURP-65), por ser este mais simples. De acordo com esse critério, utilizam-se cinco
Quadro 9.1 - Pontuação para emarificação de nsco em pacientes co m pneumonia adqu1rida na comun1dade, segundo Pneumoma Seventy Index (PSI) Características dos pacientes
Pontuação
Fatores demográficos Idade Homem
<50 anos= O Idade em anos
Mulher
Idade em anos - 1O
Casa de repouso
+ 10 Co-morbidodes
Neop1asra Hepolopollo
+30 +20
Insuficiência cardiaca Doença ce10brol vascular Doença renal
+l O + lO +l O
Exame físico Confusão mentol
+20 +20 +10 ..-20
FR?30 pm FC~125 bpm PAS<90 mrnHg Tax <35oC e >40°C
Quadro 9.3 - Cntérios para indicação de Internação em umdade de tratamento intens1vo para paCientes com pneumoma adqu1nda na comunrdade
+15 Laboratório
pH <7.35 Uréio <>30 mg% Sódio <130 mEq/L
+30
Glicose >250mg%
+ lO
Hemotócrito <30%
+ 10 +10
Pa0 2 <60 mmHg ou Sot02 <90% Derrame pleural
+?0
Sinais menores
Sinais maiores
~ 20
PA sistólica < 90mmHg
Ventilação mecânica
PA diastólico < óOmmHg
Choque séptico
Pa02/Fi02 < 250 mmHg
+10
Fonte adaptado da Drreurz para pneumonras adqurrrdas na comunrdade (PAC) eM adultos rmunocompetentes !Bras Pneumol 2004.30(Suppi4)S 1-24
Q uadro 9.2 - Estratificação de risco das pneumonias adquiridas na comunidade. por critério de pomos, segundo Pneumonra Seventy Index (PSI)
Grau
famres para estabelecimento de gravidade: confusão mental, uréia superior a SOmg/dL, freqüência respiratória superior a 30 ipm, pressão sanguínea sistólica inferior a 90mmHg ou diastólica igual ou superior a 60mmHg, idade superior a 65 anos. Cada famr corresponde a um ponto e sua soma varia de zero a cinco. Pacientes com escore zero ou um, se pontuados apenas pela tdade. podem ser tratados no domicílio. Escores maiores indicam internação. Entretanto, a avaliação de co-morbidades descompensadas (doença pul monar obstrutiva crônica - DPOC. alcoolismo. diabetes, neoplasias. insuficiências renal, cardíaca ou hepár1ca), extensão da pneumonia e saturação de 0 2• além da situação social. pode influenciar a decisão de hospitalização. A indicação de internação em unidade de tratamento intensivo ocorre na presença de pelo menos dois dos três critérios menores e um dos critérios maiores, apresentados no Quadro 9.3.
Pontos
Mortalidade
Local de trotamento
o
0,1
Ambulatório
< 70
0,6
Amoulatório
III
71 - 90
2,8
Internação
IV
9 1 - 130
8,2
lnlernoção
v
> 130
29,2
lnlernoção
Fonte adaptado da Drrecnz para pneumonras adqurrrdas na comunrdade (PAC) em adultos rmunocompeLentes. ) Bras Pneumol 2004:30(Suppi4):S 1-24.
RodrogroLo de tórax com envolvrmenlo murtrlobor Fonte. adaptado da Drreurz para pneumonra\ adqurrrdas na comunrdade (PAC) em adultos rmunocompetenles. ) Bras Pneumol 2004;30(Suppl<í).S 1-24.
MAN IFESTAÇÕES CLÍN ICAS E ESTUDOS DE IMAGEM
Não existe uma combinação de sinais e sintomas pacognomônicos de pneumonia, apesar desces serem reconhecidos como essenciais no diagnóstico e na avaliação de gravidade do paciente. A PAC habitualmente apresenta-se por sintomas agudos, como cosse, dispnéia, expecmração, dor corácica, além de manifestações sisrêmicas como febre. confusão mental. cefaléia. calafrios e mialgias. Entretanto. o quadro clínico pode
82 [ M edicina laboratorial para o clínico ) 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
ser diference, sobretudo em pacientes nos extremos de idade. Taquipnéia, taquicardia e confusão mental são observadas com freqüência em idosos, precedendo outros achados clínicos por até quauo dias. Sinais como redução da expansibilidade pulmonar, macicez à percussão do tórax, frêmiro roracovocal, ruídos adventícios (crepitaçàes e s1bilos) ou abolição do murmúrio vesicular, dia me de derrame pleural, são observados em apenas 30% dos casos. Um dos cri térios diagnósticos de PAC é o aparecimentO de imagem radiológica não presente previamente. A alteração mais sugestiva é o aparecimento de consolidação do espaço alveolar, homogénea, com broncograma aéreo, que respeita os limites das cissuras. Consollda~ões heterogéneas, cavitações, alterações intersticiais e derrame pleural são menos freqüemes e usualmente se relacionam com o agente etiológico.
ABORDAG EM LABORATORIAL Exames gerais
A saturação periférica de 0 2 (Sp02) através de oxímetros deve ser obtida ames do início de oxigenmerapia. Se a Sp0 2 for ~ 90% ou em casos de maior gravidade, deve-se realizar gasomema artenal. O hemograma mostra-se útil para avaliação de critério de gravidade e de resposta terapêutica. Alterações como leucopenia ou leucocitose intensa denotam mau prognóstico. independentemente do agente etiológico. Podem-se observar alterações morfológicas dos leucócitos (granulações tóxicas, corpúsculos de Dohle e vacúolos), além de desvio para a esquerda e eosinopenia. A dosagem de uréia acima de SOmg/dL representa outro indicador de gravidade. A avaliação sérica de marcadores de infecção, a exemplo da proteína C reativa, interleucinas e procalcitonina, pode fornecer Informações relevantes ao diagnóstico, gravidade e resposta ao tratamento. As dosagens de glicemia. elerróhtos e rransammases estão indicadas na identificação de co-morb1dades e na avaliação de gravidade, em pacientes internados. com doenças preexistentes e idade superior a 65 anos. As arua1s diretrizes para PAC recomendam a realização de sorologia para vírus da imunodeficiência adqu1rida
(HIV) naqueles pacientes com fatores de risco para a aqui-
sição do vírus e a sua consideração em pacientes emre 15 e 54 anos e que necessitem de inrernação hospitalar.
Exames específicos
A investigação etiológica utiliza diversas técnicas, espeoalmente a avaliação da secreção respiratória, hemocultura, restes sorológicos, pesquisa de anrígenos urinários e técnicas moleculares, a exemplo da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os parógenos relacionados à PAC com ma1or frenqüenoa encontram-se listados no Quadro 9.4. Contudo, observa-se variabilidade na prevalência desses agentes. Quadro 9.4 - Freqüência de patógenos 1solados na pneumonia adquirida na comunidade
Patógeno Pneumococo
Freqüência em Freqüência em pacientes pacientes não internados internados 17% 22%
Mycoplasma pneumomae
18%
6%
Chlamydia pneumoniae
16%
6%
Vírus
10%
7%
Haemophilus mfluenzae
A%
Leg10ne/la sp
raro
4%
Fome: adap[ado da D•rerr1z para pneumonoas adqu•ndas na comumdade (PAC) em adultos 1munocompe(emes. J Bras Pneumol 2004;30(Suppi4):S 1-24
Em várias séries de escudos sobre PAC. a etiologia não é definida. De acordo com a Sociedade Americana de Doenças Infecciosas (IDSA). a avaliação da secreção respiratória, na tentativa de determinar o agente etiológico, rem validade no paciente hospitalizado. Exames mais invasivos (lavado broncoalveolar - LBA escovado e aspirado rransuaqueal) têm sido instituídos na prática, quando o isolamento ou identificação do agente for imprescindível. como em pacientes graves, imunocomprometidos e na suspeita de bactéria mulrirresisrente. Esses exames invasivos serão abordados na seçào referente à PAAS.
Investigação laboratorial do paciente com infecção do rrato respiratório inferior
83
Avaliação da secreção respiratória
O escudo do escarro baseia-se na bacterioscopia pelo mémdo do Gram e na culrura, embora sua utilização ainda seJa alvo de controvérsia na abordagem da PAC. A IDSA sugere que esres exames devam ser realizados em rodos
do paciente com PAC. Sendo assim, essa análise fica reservada a siruações especiais, como nos pacienres que apresentam quadros graves e não responsivos ao rraramemo 1nicial proposco. Não se deve retardar o início do rraramenro, aguardando-se a coleta das amosuas.
os paciencescom PAC que necessicem de incernação. O exame direro corado pelo Gram é simples, de baixo cusro e a bacrerioscopia pode orientar a terapêutica inicial. Se o exame de escarro for realizado, deve-se ater a cuidados especiais na colera, rransporre e processamento da amostra. conforme descriro no Capítulo 3. A seleção da amostra para análise depende da composição celular e deve ser rorine1ramente realizada. A amostra é considerada representativa se apresentar menos de 10 células epireliais escamosas e mais de 25 leucóciros polimorfonucleados por campo (no aumento de 100x). A interpretação do exame de escarro depende também da análise sem1quantirariva da amosrra, baseada na predominância da bacréria no Gram e presença de microrganismos imracelulares nos leucóciros polimorfonucleados (>5%). Em estudo receme. Garcia-Varquez et a/., avaliando 1.669 pacientes com PAC. conseguiram isolar um parógeno predominante em apenas 240 (14.4%) das amoscras de escarro. É 1mponanre destacar que alguns microrganismos são sempre parogênicos quando encontrados no escarro, a exemplo de Legione/la pneumophila, Mycobactenum tuberculosis, Pneumocystts JiroveCII, mesmo se a amostra não for representativa. Se houver suspeita clín1ca. colorações especiais deverão ser real1zadas, como a pesquisa de fungos e a pesquisa de bacilos álcoolácido-resisremes (BAAR). No emamo. o exame de escarro apresenta vánas limitações: dificuldades de expecroração, amosrra madequada, uso prévio de amimicrobianos e análise mconclusiva. O escarro 1nduz1do, coletado após micronebulização unlizando soro fisiológico em concentração de 3 a 5%, é geralmente recomendado para detecção de P. proveci1 e M. tubercu/osis naqueles indivíduos CUJa cclera espontânea é difícil; mas não apresenta vantagens para outros parógenos.
Os restes sorológicos não são realizados rotineiramente na avaliação inicial dos pacientes com PAC e apresentam baixa sensibilidade. São utilizados na investigação de microrganismos atípicos, como Legione/la, Mycoplasma e Chlamydia, e nos casos graves e não responsivos ao tratamento empírico in icial. Amostras sorológicas colhidas na fase aguda e na convalescença podem ser utilizadas para confirmações etiológicas retrospectivas e para identificação de surras. A elevação de quatro vezes no título da lgG ou lgM ~ 1/16 na imunofluorescência é valida para o diagnóstiCO de infecção por C pneumomae. A detecção de M. pneumoniae auavés de k1ts comerciais apresenta sensibil1dade variável. A pesquisa de anrígenos urinários rem limitada aplicação. Deve ser utilizada em pacientes com PAC grave, em que haja suspeita de infecção por Legionclla ou pneumococo. Na suspeita de legionelose, a pesquisa qualitativa do antígeno urinário apresenta-se positiva em cerca de 80% dos pacientes, com a vantagem de permanecer positiva por muitos meses após a infecção aguda. Nesta situação, rem especificidade bastante elevada (95%). A positividade rorna-se maior a parm do terceiro dia de sinroma. Um resultado negativo em fase mais precoce não exclui a doença. A pesquisa do ancígeno urinário do pneumococo no diagnóstico etiológico da pneumonia tem sido foco de escudos nos últimos anos, sobretudo pela simplicidade e rapidez do reste. aliado à dificuldade diagnósrica de outras técnicas. Sua sensibilidade vana de 50 a 80%, com especificidade de aproximadamente 90%, sendo menor na popu lação pediárrica devido à colonização das vias aéreas superiores pelo pneumococo.
Hemoculturas
Testes de genética molecular
As hemoculruras têm se mosuado de baixo rendimento, com baixa sensibilidade/ especificidade e rarameme induzem mudança de conduta no rraramemo
A PCR pode ser útil na identificação de L. pneumoph1la, M. pneumonwe e C pneumoniae, vírus respiratórios e mi-
84
Medicina laboratorial para o clínico
Testes imunológicos
cobacrénas, em paoemes selecionados.
]1-- - -- - -- - - - - - -- -- - - -- - - - - - - -- - -
O Quadro 9.5 apresenta os exames laboratoriais recomendados na PAC. de acordo com a complexidade do quadro clínico.
PNEUMONIA ASSOCIADA À ASSISTÊNCIA A SAÚDE Conceiwalmente, a PAAS é definida como a pneumonia que surge após 72 horas de hospitalização. Considerada a segunda causa mais comum de infecção nosocomial nos EUA, é no Brasil a infecção hospitalar mais prevalente. Entre as condições que favorecem a ocorrência de PAAS estão o ambience pro pício (unidade de u atamento intensivo), a redução de im unidade do hospedeiro, o inóculo e/ou a virulência do microrganismo patogênico. Freqüentememe a colonização do trato respiratório precede a infecção e o agente hospitalar chega ao pulmão pelo wbo orouaqueal e aspiração. A inalação de aerossóis contaminados, disseminação hematogênica e inocu lação direta são menos comuns. O principal fator de risco associado à PAAS é a vemilação mecânica (VM), o que explica a elevada taxa de PAAS em unidade de tratamento intensivo. A pneumonia associada à ventilação mecân ica (PVM) ocorre em 8% a 28% dos paciemes em uso de VM, com mortalidade associada de 24% a 76% e risco de morte duas a 10 vezes mais alto que em pacientes sem PVM. Devido à dificuldade prática de estabelecer se o microrganismo estava ou não presente no
ma memo da imubação, a pneumonia associada à ventilação mecânica é, por definição, aquela que se inicia 48 horas após a VM. Ainda pode ser subdividida em precoce (~ 4 dias de VM) e tardia (~ 5 dias de VM). Dependendo da duração da VM, os agentes eciológicos e prognóscico são usualmeme diferences, sendo o da PVM precoce mais favorável. Esse tipo de pneumonia apresenta taxas de morbidade e letalidade elevadas, especialmente quando o agente causal tem maior potencial de resistência aos antimicrobianos.
AGENTES ETIO LÓG ICOS A disti nção entre microrganismo colonizante e patógeno, na amostra de secreção respiratóna, é multas vezes difícil. Quando há isolamento, os bacilos Gram negativo (BGN) são os mais freqüentemente enconuados (55% a 85% dos casos), seguidos de cocos Gram positivo (CGP) em 20% a 30% e microbiota mista em 40% a 60%. Considerando-se a classificação de PVM em precoce e tardia, reconhece-se que os microrganismos associados são d iferentes. Na PVM precoce, os agentes mais comuns são H. mjluenzae, S. pneumoniae, Staphylococcus aureus sensíveis a meticilina (MSSA) ou enterobanérias. Por outro lado, na PVM tardia são freqüentemente isoladas bactérias resistentes a múltiplos antim icrobianos, como P aeruginosa, Acinetobacter spp., S aureus resistente a meticili na (M RSA) e encerobactérias resistentes.
Quadro 9.5 - [xames laboratoriais recomendados nas pneumon1as adq uiridas na comunidade (PAC) de acordo com a com plexidade do quadro clínico
PAC domiciliar
PAC enfermaria ou pronto-atendimento
PAC em unidade de tratamento intensivo Todos os descritos e broncoscopia ou aspirado traqueal no imuboção, com culturas quantita tivas
Avaliação Etiológ ico
desnecessário
Boclerioscopio (G rom) e cultura de escarro Duas hemocuhuros Primeiro amostro poro sorologio
Avaliação Geral
Radiografia de tórax
Hemogromo, uréio, transaminoses. glicemic. Todos os descr~ tos e monitorização 10nograma, Sp0 2, gosometno arterial se ventilatória, hemodinãmico e de Sp02 s; 90%. sorologio pa10 HIV (fatores de trocos gasosos risco ou dade entre 15 e 54 anos)
Fome: adaptado da D1rewz para pneumonias adq ui rida~ na comunidade (PAC) em adutros imunocompetentes. J Bras Pneumol. 2004;30(Suppl4):51-24.
Investigação laborato rial do paciente com infecção do traco resp iratório inferior
85
à
resistência são:
mon ia com o diagnóstico obtido por biópsia pulmo-
pneumonia com VM por período superior a sete dias
nar observam que em menos de dois terços dos casos
e uso prévio de antimicrobianos de amplo espectro (cefalosporinas de terceira geração, fluoroqu inolonas e
houve concordância.
Os fatores de risco associados
Da mesma forma, as alterações radio lógicas na
carbapenems).
PAAS são inespecíficas. Em um escudo, apenas cer-
A Sociedade Torácica Americana (ATS) propôs classificação em crês grupos de provável et iologia,
ca de um terço dos pacientes com novas alterações
baseando-se nos critérios de gravi dade, presença de
cropsia, sendo o broncograma aéreo o sinal q ue mais
doença crônica, farores de risco para microrganismos
se correlaci onou com o resultado (64%). Entretanto, todo paciente com suspeita clínica de PAAS deve ter
específicos. uso prévio de antim icrobianos
e tempo
decorrido entre admissão hospitalar e o aparecimento da doença (Quadro 9.6).
rad iológicas ceve diagnóstico de pneumonia em ne-
radiografia do tórax em incidências póstero-anterior (PA) e perfil. Esse procedimento pode determinar a extensão da doença
e a presença de complicações.
No intuito de elevar a sensibilidade e especificidaMAN IFESTAÇÕES ClÍNICAS E ALTERAÇÕES DE IMAGEM
de no diagnóstico de PVM, o Clinical Pulmonary lnjec-
ado em nova ou progressiva alteração na radiografia,
tion Score (CPIS) propõe escore baseado em achados e culturas (Quadro 9.7). Com o máximo de 12 pomos, CPIS maior que seis associa-se à alta probabilidade de PVM (sensibilidade e especificidade
febre. leucocitose e secreção u aqueobrônquica puru-
de 93% e 100%, respeccivamence).
clínicos, Gram O diagnóstico de PAAS, na prática clínica. é base-
lenta. Contudo, esses critérios pouco se relacionam com aquele estabelecido pelo padrão ouro, a partir da biópsia pulmonar e, para pacientes em VM, qualquer
ABORDAGEM LABORATORIAL
um desses fatores pode ser devido a d iversas outras etiologias, o que resu lta em baixo valo r predicivo. Escudos que comparam o diagnóstico clínico de pneu-
Os exames gerais não diferem da abordagem apresentada para PAC.
Quadro 9.6 - Exames laborawriais recomendados nas pneumonias adqu1ridas na comun1dade - (PAC) de acordo com provável eriologia
Grupos Grupo I
Grupo 11
Grupo III
Descrição
Pacientes com pneumonia nosocomio l leve o moderado. sem fatores de risco, iniciado o qua lquer tempo de admissão ou pacientes com pneumonia grave de 1nicio orecoce
Pacientes com pneumonro nosocomio l leve o moderado. com fa tores d e risco, inic iado o qualquer tempo do admissão
Pacientes com o neumonio nosocomial g rave. com fa tores de risco, d e início precoce ou ta rdio
Etio logias prováveis
Pseudomonos, Agentes do grupo I, a lém de Enterobocter, Klebsiello, Serrotio, onoeróbios {cirurgia abdominal, Proteus), H. influenzoe, MSSA. S. a spiração conhecido), S. oureus pneumonioe {como, trauma crânio-encefálico, BGN entéricos {exceto
Agentes do grupo I, se início p recoce, a lém de Pseudomonos,
Acinetobocter e MRSA
diaberes mel iro, insuficiência renal); Legionella sp. {uso de corticóides); Pseudomonas {internação prolongada em unidade de trotamento intensivo, corticóides, ontimicrobionos e doença estrutural pulmona r - bro nquiecto sios)
Fome: adaplado da Drremz para pneumonras adqurridas na comunidade (PAC) em adu lws r munocom peteme~. J Bras Pneu moi. 2004;30(Suppi4):S1 -24.
86 [ Medicina laboratorial para o clínico
Quadro 9.7 - Escore da pneumonia associada à ventilação mecânica pelo Clintcol Pulmonary Jnject10n Score (CPIS) Pa râmetros Temperatura ( CI 0
Estratificação
Pontuação
>36,5 e <38.4
o
e <38.9
1
>39,0 e <36.0
2
>4.000 e <11.000
o
>38,5
leucometrio (célulos/mm3)
<4.000 e >11.000
bastões ausência secreção não mucopuru· lento secreção purulento >240 ou ARDS <240 ou sem ARDS
+I
sem infiltrado infiltrado difuso infiltrado localizado sem progressão rodiológ1co progressão rad·otógico (sem ICC ou ARDS) bactéria patogénico raro ou sem cresc1mento bactéria patogénico em moderado o grande quonttdode mesmo bactéria visto no Grom
o
+ de 50%
Secreção Traqueal Índice de Oxige· noção (PoOj Fi01 mmHgl Radiografia de Tórax Progressão do Infiltrado P lmonor
Cultura Semt· quonti:ohvo
TOTAL
o 2
o 2
1 2
o 2
o
+1 0·12
Nota AROS : acute resplfamry syndrome: ICC tnsuftênCia cardíaca con· gesttva. Fome adaptado de Stngh et ai. Short-course emptr'c anttbtottc therapy for pat ents wtth pulmonary tnfrltrares tn the ntenstve care untt. Aproposed solunon for tndtscnm tnate anttbtonc prescnpnon Am J Resp Cm Care Med. 2000.162:505-11.
Exames específi cos
Avaliação da secreção respiratória Secreções respiratórias podem ser obtidas por métodos invasivos ou não-invasivos. Os métodos não-invasivos apresentam vantagens de menor custo do procedimento e alta sensibilidade, apesar de sua baixa especificidade. Os mécodos invasivos têm maior especificidade, à custa de maior freqüência de complicações (hemotórax, pneumotórax e hemorragias) e
cusro mais elevado. além da necessidade de técnicas especializadas. Entre os métodos não-invasivos, o Gram e a cultura de escarro são considerados de baixa sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de pneumonia, prin-
cipalmence devido à comaminação pela microbiota orofaringeana. Contudo, alguns autores encontraram concordância de 79% entre cultura de escarro e de aspirado traqueal para o crescimento de microrganismos considerados patogênicos. Para a coleta do aspi rado traqueal utiliza-se cateter endotraqueal inserido às cegas na árvore traqueobrônquica. É faci lmence executado em paciences em ventilação mecânica porque o cubo endotraqueal permi te superar a barreira entre vias aé reas superiores e inferiores. Outra vantagem é o cusw mais baixo em relação à broncoscopia. As desvantagens são a impossibilidade de observação das vias aéreas e o risco potencial de coleta de secreção em local inadequado. O aspirado traqueal qualitativo apresenta elevada freqüência de resultados falso-positivos, em vircude da colonização das vias aéreas superiores por microrganismos considerados patogênicos. Porém. é benéfico para exclusão do diagnóstico de PVM no pacienre em VM, com cultura negativa e sem o uso de antimicrobianos. O aspirado traqueal quantitativo apresenta sensibilidade de 38% a 100%, com especificidade de 14% a 100%. Alguns autores sugerem que cu lturas quancitativas de aspirado traqueal apresentam desempenho semelhante à de mécodos mais invasivos. Entretanto, outros estudos mostram resultados conflitantes em relação tanco ao valor de corte quanto à sua sensibilidade e especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Desta forma, a cultu ra quantitativa de aspirado traqueal pode ser útil para identtficar os indivíduos com PVM. mas não para idencificar seguramente o agente etiológico. Apesar de ser uma técnica às vezes utilizada para dtagnóstico de pneumon ia, qua ndo nen huma técnica broncoscópica estiver disponível, devem-se ressaltar suas li mitações: • aproxtmadamence 30% dos pacientes não são Identificados utilizando-se um ponto de corte de 106 unidades formadoras de colónia (UFC)/ml; • pontos de corte mais baixos reduzem drasticamente a espeCtfiodade;
Investigação laboratorial do paciente com infecção do rrato respiratório inferior
87
• a seleção de antimicrobianos somente com base nesse mécodo pode levar ao uso incorrem ou tratamento desnecessário. Os mécodos invasivos mais utilizados para o diagnósrico de pneumonia são a culrura de LBA e de escovado brônquico protegido (EBP), obtidos por meio de técnicas broncoscópicas. O pomo de corre mais utilizado para EBP é 103 UFC/ml e para LBA 10 4 UFC/ml. Não há padronização técnica rígida para a infusão de solução salina no LBA. O volume infundido geralmente varia de 120 a 150 mL. podendo teoricamente preencher uma área com aproximadamente um milhão de alvéolos, ou seja. 1% da superfície pulmonar. No miniLBA. infunde-se menor volume, sendo o valor de corre da culrura de 103 UFC/ml. Apesar da inexistência de prococolos bem estabelecidos, é recomendável que o tempo máximo emre a colheita do material e seu processamento seja de até 30 minutos, independentemente do método utilizado. Um critério de rejeição para amostras de LBA é a presença de 1% ou mais de células epiceliais. Não há consenso sobre qual mécodo broncoscópico é mais eferivo para o diagnóstico de PVM. Todavia, uma vantagem do LBA é a realização do exame citológico, que auxilia a tomada de decisão clínica até que o resultado das culturas se torne disponível. No caso de bactérias intracelulares em mais de 1% a 5% dos neutrófilos e macrófagos. dependendo do estudo, a especifiCidade para pneumonia é alta (89% a 100%). mas a sensibilidade é muico variável (37% a 100%). Também não está estabelecido se a utilização de uma técnica broncoscópica melhora o prognóstico do paciente em relação ao uso de uma técnica não-invasiva, como a cultura de aspirado traq ueal. Especialistas não têm consenso a este respeito, mas escudos canadenses sugerem que as técnicas broncoscópicas podem reduZir o uso de amim1crobianos e melhorar o prognóstico dos pacientes. Sua ma1or utilidade seria nos casos com resultado negativo, onde o médico-assistente poderia, com segurança. suspender a terapia antimicrobiana e investigar outras possíveis doenças. As técnicas não-broncoscópicas, por outro lado. superestimariam a ocorrência de PVM, desviando a atenção do médico de outros possíveis sírios de infecção, além de contribuir para o uso inadequado de ant1microb1anos.
88 [ M edicina laboratori al para o clínico
De acordo com Chame e Fagon, uma técnica broncoscópica (LBA ou EBP) deve ser utilizada. caso disponível. como primeira escolha, em todos os pacientes gravemente doentes com suspeita de PVM. Entre as duas técnicas. o LBA rem a vantagem de apresentar sensibilidade ligeiramente superior e guiar a seleção empírica de amimicrobianos por citologia e Gram, ames da conclusão da cultura. Em alguns pacientes. principalmente nos portadores de DPOC. o pequeno volume de salina recolhido após a instilação. proveniente principalmente dos brônquios e não dos alvéolos, compromete a sensibilidade da récn1ca (aumento de falso-negativo). Nesses pacientes. o EBP é mais vantajoso. A administração de antimicrobianos deve ser iniciada prontamente nos pacientes graves com suspeita de PVM. preferencialmente nas primeiras seis horas, pois isto parece influenciar favoravelmente o prognóstico. Caso não seja possível realizar a broncoscopia nesse período ou esta não esteja disponível no serv1ço. uma técnica não-broncoscópica pode ser utilizada.
Hemoculturas As hemoculruras podem identificar o microrganismo causador da pneumonia. no caso da bacteriem1a, se não houver outra fonte de infecção ev1deme. Porém. resultados positivos para esses exames ocorrem em menos de 10% dos casos.
ASPERGILOSE PULMONAR
Infecções causadas pelo Asperg1llus podem apresentar ampla gama de formas clínicas, desde quadro de hi persensibilidade broncopulmonar (aspergilose broncopulmonar alérgica) até doença disseminada. As espécies mais comumente associadas à infecção humana são Asperglllus jum1gatus. Aspergi/Jus jlavus. Aspergi/Jus terreus e Aspergi/Jus mger. A infecção pulmonar por Asperglllus spp. representa a segunda infecção fúngica nosocomial mais freqüente, ocorrendo principalmente em pacientes imunocomprometidos. As principais formas de infecção pelo Asperglllus são: • colonização traqueobrônquica: isolamento sem infecção correspondente;
• aspergilose alérgica: apresentada como pneu-
vasiva manifesta-se habitualmente como doença aguda,
monite de hipersensibilidade e aspergilose bron-
progressiva, com os sinais e sintomas dependendo do
copulmonar alérgica;
sítio acometido. Como o
• aspergiloma ("bola fúngica"): colonização em lesões cavitadas pulmonares preexistentes;
Aspergi/lus é habitualmente
introduzido no organismo humano pelo trato respiratório, os principais sintomas relacionam-se ao acomet i-
• aspergilose invasiva: comumeme observada em
menro desse sírio. podendo haver doença concomiranre
pacientes imunocomprometidos. acometendo
em seios paranasais e estruturas adjacentes. O sintoma
pulmão e menos freqüememente sistema nervo-
mais freqüeme é febre. que não responde ao uso de an-
so central, pele e ossos.
timicrobiano de amplo espectro. Outros simomas são: dor torácica. tosse, dispnéia e hemoptise. A radiografia
Aspergillus seja um microrganismo difun-
de tórax pode ser normal ou demonstrar presença de
dido no meio ambiente e a exposição a seus esporos
lesões nodulares e in filtrados dispersos. A tomografia
seja freqüente, a doença invasiva é infreqüente e ocorre
computadorizada de t órax é o exame de imagem de
principalmente em pacientes imunocomprometidos.
escolha para investigação da aspergilose pulmonar inva-
Embora o
Nestes. a taxa de mortalidade varia de 80 a 100%. Os
siva. Pacientes imunocomprometidos, par ticularmente
principais fatores de risco para aspergilose pulmonar in-
neutropênicos. são incapazes de resposta Inflamatória
vasiva são neutropenia por mais que 10 dias e uso de
adequada e. sendo assim, a tom ografia com putadoriza-
corticóides, seguidos de infecção avançada pelo HIV e
da exige interpretação cautelosa, já que pode apresentar
transplante alogênico de medula óssea com doença do
alterações sueis. A doença pulmonar invasiva é sugerida
versus hospedeiro (GVHD). O EORTC (European Orgamzat1on for Research and Treatment of Cancer) orienta que a definição de doen-
pela presença de lesões nodulares, às vezes cavitadas, pulmonar. observa-se bola fúngica ou micetoma no in-
ça fúngica invasiva seja classificada em três grupos:
terior de lesão cavitada.
enxerto
com halo de vidro fosco (sinal do halo). No aspergiloma
• doença comprovada (exame hismpaLOiógico dem onstrando invasão tecidual); • provável (presença de três desses elementos: fa-
ABORDAGEM LABORATORIAL
tores de risco, apresentação clínica sugestiva e
Investigação microbiológica
exame m1cológico); • possível (presença de pelo menos um dos elementos Citados acima).
A microscopia óptica do espeCJme
(swab nasal,
escarro, LBA, biópsia pulmonar) p ode ser realizada diDesta forma. o diagnóstico definit ivo de infecção
retamente ou após colo ração po r hemacoxilina-eosina
por Asperglflus ssp. depende da evidência de invasão te-
(HE), Gomori, PAS ou Gridley. A morfologia t ípica é a
Cidual, por vezes ang101nvasiva, em exame histopatológi-
presença de hifas septadas hialinas com rami ficações
co. Embora o isolamento de Aspergillus
spp. em cultura
dicotômicas em ângu lo agudo (45•). A diferenciação
possa sugeri r doença, algumas vezes representa apenas
entre as espécies é baseada nas características cultu-
colon1zação. Naqueles com exames de imagem indicati-
rais e morfológicas (cor e forma da cabeça conid ial.
vos de doença e com cultura positiva para o Aspergillus.
número de fiálides, forma da vesícula. cor dos conídios
o diagnóstico de aspergilose pulmonar é provável.
e conid ióforos). As estru tu ras de reprodução, que caracterizam as diversas espécies. são produzidas em 48 a 72 horas de cultivo. Ressalta-se que a identificação
MAN IFESTAÇÕES CLÍNICAS E ESTUDOS DE IMAGEM
de espécie tem relevada importância clínica. já que o
Aspergillus terreus apresenta resistência Intrínseca
à anfotericina. Em secreção respiratória de pacientes A doença causada pelas diferentes espécies de Aspergillus é clinicamente Indistinguível. A aspergilose in-
com aspergiloma, as colónias têm crescimento lento e apresentam-se sem pigmentação e esporulação atí-
Investigação laboratorial do pacienre com infecção do trato respiratório inferior
89
pica, tornando difícil a sua identificação. Do ponto de visra morfológico, a Pseudollescheria boydii, Fusarium. Penicillium e Zygomycetes podem ser semelhantes. Todavia, a distinção entre essas espécies é essencial, uma vez que a abordagem terapêutica é distima.
Na culrura em meio ágar Sabouraud com anrimicrobiano, o Aspergi/Jus cresce rapidameme, sendo visível em cerca de três dias de incubação. Emrecamo, se o inóculo for pequeno, o crescimemo é lento (até quatro semanas). Apesar de possível, o isolamento de Aspergillus em hemocultura é muito raro.
Testes imunológicos
O imunodiagnóstico é baseado na detecção de anticorpos e na reatividade de restes cutâneos. Depende da preparação antigénica, pureza e natureza química da solução. Apresema maior valor no diagnóstico da aspergilose broncopulmonar alérgica e aspergiloma, tendo pouca utilidade na aspergilose invasiva, pois, nesse caso, os pacientes habitualmente têm resposta humoral baixa ou auseme. Na aspergilose invasiva, a detecção do antígeno. no soro, urina ou líquidos biológicos diversos, possibili ta o diagnóstico precoce. A detecção sérica da galactomanana, por meio de ensa1o imunoenzimático em sanduíche (ELISA), rem sido um exame promissor no diagnóstico de doença invasiva. Esse anrígeno é um dos principais constituimes da parede celular do Aspergillus, sendo liberado durante o crescimemo da hifa. O resultado positivo do teste precede em cinco a oiw dias aos sintomas da doença. alterações radiológicas ou culturas positivas. Comudo, falso-positivos foram descritos em paciemes em uso de piperacilina-razobactam. O resulcado negativo praticamente afasta aspergilose.
Técnicas de genética molecular
A PCR para Aspergillus é exame ainda em investigação, com resultados conflitantes quando comparada com a pesquisa de galactomanana ou beta-D-glucan. Um aspecm importante é a possibilidade de resultado falso-positivo devido à elevada sensibilidade do método, atribuída à colon ização do traw respiratório por esse
90 ( Medicina laboratorial para o clínico
fungo. Ouuo reste molecular é a hibrid ização in situ de amostras teciduais. Infelizmente. não se tem disponível ainda um ceste padron izado e a utilização das técnicas citadas é limitada na prática clínica, estando a maioria restrita a
cenrros de pesquisa.
Avaliação anatomopatológica
A confirmação histológica pode não ser possível em pacientes imunocompromeridos com comra-indicação à biópsia, a exemplo de trombocitopenia ou doença grave. Nos pacientes com doenças hemamlógicas graves, a presença de sintomas respiratórios ou novo infiltrado pulmonar, mesmo sem o reconhecimento de Aspergi/Jus em amostra respiratória, é suficiente para o diagnóstico presumível da doença e instituição de terapêutica dirigida.
PNEUMOCISTOSE PULMONAR O PnP.umocyçtiç jirovP.cii (amigo P carinii) é um fungo cuja imporrância como patógeno hu mano se relaciona com o aumemo do número de pacientes im unocomprometidos por transplantes e quimioterápicos e com o apa recimento da epidemia da SIDA há 20 anos. Embora identificado por Chagas e Carini em 1909 e 1910. teve sua patogenicidade reconhecida por Vanek e Ji rovek em 1952, daí a sua renomeação. Em reconhecimento às diferenças genéricas e funcionais, foram nomeados como espécies diferentes: P. carinii e P. jirovecii, sendo a pri meira espécie observada em diversos animais e a segunda causadora de pneumonia em humanos. Até recentemente, o Pneumocystis era considerado protozoário. Mas com a melhoria do conhecimento sobre a biologia desse microrganismo, foi em seguida classificado como fungo. Contudo, ai nda hoje existem dúvidas quanto à sua taxonomia, já que o Pneumocystis não responde à terapia antifúngica e ta mpouco cresce em me1os de cultivo de fungo, gerando discordância entre os especialistas que não o consideram um fungo verdadeiro.
Esses microrganismos foram inicialmente classificados como procozoários por apresentarem três formas evolutivas em seu ciclo: ciscos, esporozoícos e crofozoícos. Todavia, a maneira de transmissão não foi ainda completamente elucidada. Sabe-se que a transmissão ocorre precocemente na vida (inquéricos sorológicos demonstram soropositividade até a idade de quatro anos) e provavelmente pela via respiratória. A infecção primária é assintomática ou subclínica e o microrganismo permanece em estado latente até ser reacivado, na vigência de imunossupressão. Apesar disso, é possível que ocorra transmissão pessoa a pessoa e surros com a identificação de aglomerados (cluster outbreaks) já foram relatados em unidades oncológicas e de acendimento ao portador do HIV. A incidência de pneumocisrose, independentemente do grupo de risco, tem sido dramaticamente modificada pela profilaxia, que é atualmente a principal medida de prevenção.
MANIFESTAÇÕES ClÍNICAS E ESTUDOS DE IMAGEM
Embora a localização pulmonar seja a mais freqüente, lesões extrapulmonares são descritas em órgãos do sistema reticuloendotelial e retina. A pneumociscose pulmonar apresenta estabelecimento gradual e insidioso, caracterizado por febre (79% a 100%), cosse (95%) e dispnéia progressiva (95%). Acosse é geralmente não produtiva, mas 30% dos pacientes referem produção de algum escarro. Outros sintomas incluem fadiga, calafrios, dor corácica e perda de peso. Ao exame, usualmente observam-se febre e taquipnéia. A ausculta respiratória é normal em 50% dos casos. Manifestações extrapulmonares como hepacoesplenomegalia e lesões de pele podem ser vistas principalmenre naqueles com profilaxia com pentamidina aerossol. Os fatores de risco para evolução desfavorável incluem hipoxemia, comprometimento pulmonar bilateral, infecções pulmonares concomita ntes, doença recorrente, níveis de desidrogenase lática (LDH) sérica elevados e gradiente alvéolo-arterial de oxigênio >30 mmHg. A radiografia de tórax é geralmente normal em casos iniciais. As alterações mais freqüentes são infiltrados intersticiais e alveolares difusos e bilaterais. Cistos, nódu-
los, infiltrados lobares, pneumacoceles e derrame pleural também são descritos. A comografia computadorizada de tórax apresenta elevada sensibilidade e especificidade para a pneumocistose pulmonar, indicando a presença de vidro fosco, imagem micronodular e cisros. Apesar de esses achados serem sugestivos de pneumocistose pulmonar, não estabelecem o diagnóstico. Entretanro, a tomografia computadorizada sem alterações coscuma afastar a suspeita clínica.
ABORDAGEM LABORATORIAL Exames gerais
A desidrogenase láctica (LDH) é uma enzima intracelular e concentrações séricas elevadas sugerem destruição tecidual. Contudo, apesar de freqüentemenre elevada na pneumocistose pulmonar (valores superiores a SOO U/L) e ser determ inante de prognóstico, pode estar elevada em uma série de outras situações. O hemograma de pacienres com sorologia positiva para HIV e pneumocistose pulmonar habitualmente revela leucopcnia. A contagem de linfóciros CD4 é usualmente < 200 células/mm 3 A gasomerria arterial pode revelar hipoxemia (pressão parcial de 0 2 s; 70 mmHg) ou gradiente alvéolo-arterial de oxigênio:?: 35 mmHg. Nestas sicuações, é indicado o uso de corticóide associado ao antimicrobiano.
Exames específicos
O dtagnóstico definitivo da pneumoostose pulmona r é estabelecido pela identificação do agente e sua morfologia no tecido ou fluidos do hospedeiro dependem da forma evolutiva do parasito. Pode ser encontrado em secreções do trato respiratório (escarro, aspirado traqueal, LBA), tecidos (biópsia pulmonar) e fluidos orgânicos (líquido pleural). A sensibilidade da pesquisa nessas amostras varia com a morfologia do microrganismo e com o diagnóstico de base do paciente, sendo em torno de 80% em escarro induzido naqueles com SIDA. Por outro lado, esse exame é raramente positivo em crianças sem SIDA. Acredita-se que a diferença de sensibilidade observada nesses dois grupos seja devida a cargas parasitárias distintas.
Investigação laboratorial do paciente com infecção do trato respiratório inferior
91
A avaliação do espécime clínico não é modificada se coletada até três dias do início do tratamento. O material biológico deve ser tratado com solução mucolítica, diluído e centrifugado para análise do sedimento. O diagnóstico laboracorial da pneumocistose pulmo-
nar nas últimas duas décadas era baseado na demonstração de cistos por meio de colorações de Gomori, metenamina-prata, azul de toluidina e calcoflúor (essas técnicas permitem tam bém a visualização do espessamento duplo focal típico), além da identificação de ciscos e trofozoícos pela coloração de Giemsa. Com a introdução de técnicas mais modernas, a exemplo da pesquisa do microrganismo por anticorpos monoclonais (por im unofluorescência), têm-se resultados mais sensíveis e específicos capazes de detectar formas císticas e trofozoítas em cerca de duas horas. A introdução de métodos moleculares, a exemplo da PCR. possibilita a detecção do agente em amostras negativas na imunofluorescência, porém nem sempre é possível diferenciar indivíduos colonizados de doentes. Todavia, uma PCR negativa pode excluir a doença Esse método carece ainda de validação definitiva. Por fim, a dosagem sérica de S-adenosilmetionina é teste em avaliação. Está reduzida em pacientes doentes e seu nível sérico passa a se elevar após aproximadamente uma semana de tratamento. É promissora por auxiliar o diagnóstico, em casos onde a coleta de amostra respiratória é difícil, e permitir monitorização do tratamento.
92 [ Medicina laboratorial para o cl ínico
REFERÊNCIAS 1.
A scioglu S. Rex JH. de Pauw B, Bennerr JE, Bill e J. Crokaerr F. er ai. Defi ning opporrunistic invasive fungai infewous in 1munocomprom1sed pariems w1th cancer and hemaropoienc stem cell transplants: an internacional consensus. Clin lnfecr Disease. 2002;34:7-14.
2. Barone AA Pneumocisrose. ln: Tavares W, Marinho LAC. Roc1nas de diagnóstiCO e tratamento das doenças Infecciosas e parasitárias. São Paulo: Arheneu; 2005; 869-873. 3.
Kollef MH. Diagnosis of ventilador-associated pneumo-
4.
nia. ln: UpToDare, Rose BD. Wellesley: UpToDate; 2002. Nouer AS, Nucci MLM. A spergilose. ln: Tavares W, Marinho W, Marinho LAC. Rotinas de diagnóstico e tratamento das doenças mfecciosas e parasitárias. São Paulo: Atheneu; 2005;121 a 124.
5.
Rabello E. Pneumonia. ln: Tavares W, Mann ho W, Marinho LAC. Rotinas de diagnóstico e t ratamento das doenças infecc1osas e parasitárias. São Paulo: Atheneu;
6.
2005. p. 874-89. Sing N, Rogers P, Arwood CN, Wagner. MM. Yu VL. Shorr-course empine amibiotic therapy for panents wi rh pulmonary in filt rares in rhe inrensive care unir. A pro-
7.
posed solurion for indiscriminate amibiocic prescriprion. Am J Resp Cnt Care Med. 2000;162:505 -11 Sooedade Brasileira de Pneumologia. Diretriz para pneumonias adquindas na comunidade (PAC) em adultosJmunocomperenres. J Bras Pneu mo i. 2004;30 Suppi i4:S1 -24 .
Jf-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- -- - - - - - -
Silva na Spíndola de Miranda
10
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM MICOBACTERIOSES:
Mycobacterium tuberculosis E MICOBACTÉRIAS NÃO TUBERCULOSAS
INTRODUÇÃO
As micobactérias estão posicionadas taxonomicameme na Ordem Actinomycetales, Família Mycobacteriaceae, Gênero Mycobacterium e a Espécie Mycobacterium tuberculos1s. O M. tuberculosis tem crescimemo lemo, com tempo de geração de 18 às 24 horas em meio de Lowenstein-jensen (L-J), tem como temperatura ótima em torno de 36°C. É resisteme a agemes químicos, mas sensível a agemes físicos, como a radiação ultravioleta e o calor, sendo aeróbico estrito, imóvel, não esporula, é parasito celular facultativo, álcool-ácido-resisteme devido a seu alto comeúdo lipídico, e "dormência" por longo tempo. É a espécie de maior importância médica, por ser o principal ageme etiológico da tuberculose (TB) e, junco com o M. bovis, M. africanum, M. canetti, M. microti, forma o complexo Mycobactenum tuberculosis.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
O problema da tuberculose no Brasil reflete o estágio de desenvolvimento socioeconômico do país, onde a pobreza, a desorganização do sistema de saúde e as deficiências de gestão impedem a diminuição das doenças marcadas pelo contexto social. No caso da tuberculose, a epidemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e AIDS e a multirresistência têm agravado essa doença.
O Brasil, segundo a Organização Mundial de Saúde, ocupa o 15° lugar emre 22 países responsáveis por 80% do total de casos de tuberculose no mundo. Fomes do Ministério da Saúde (2003) estimam prevalência no país de 38/100.000 casos/habitames, com cerca de 50 milhões de infectados, com 86.062 casos novos e 4.979 óbitos ocorrendo anualmeme. Existe uma variação de 29,3/100.000 na região Cemro-Oeste a 44,6/100.000 na região Sudeste. Em relação ao uatamemo, 72,2% receberam alta por cura, com aba ndono de 11,7 e 7% de óbito, longe, portanto, das metas imernacionaís estabelecidas pela OMS e MS, de curar 85% dos casos estimados. A distribuição da tuberculose no Brasil, segundo idade e formas clínicas, são: maiores de 15 anos - 85%, cujos 90% com formas pulmonares; menores de 15 anos -15%, cujos 75% com formas pulmonares. A co-infecção TB/HIV é preocupante, pois a evolução do estado de infecção para o adoecimemo é muito diference para pessoas imunocompetences e aquelas infectadas pelo HIV No caso de TB, as chances de que a infecção evolua para a doença é em torno de 10% ao longo da sua vida. No indivíduo infectado pelo HIV, essa chance passa a ser de 8 a 10% ao ano. A OMS estima a existência de 33,6 mi lhões de pessoas vivendo com HIV/AIDS e de 637 mil casos co-i nfectados (TB/HIV/AIDS). Segundo o MS, no Brasil, encre 1980 e junho de 2000, ocorreram 190.523 casos de AIDS e 20 a 40% desenvolveram TB. Em relação à co-infecção TB/HIV, estimou-se que 8% dos casos de TB seriam também seropositivo para o HIV
Verificam-se hoje, devido aos problemas na condu-
das as barreiras físicas e inespecíficas, inicia-se a ativação
ção do Programa de Controle da Tuberculose (PCT), re-
específica contra o agente agressor, com a progressão da
Sistência adqwnda (21.0%) e resistênoa pnmána (9,2%).
inflamação e broncopneumonia inespecífica. Com isso,
A constatação da resistência primária inicial, inclusive
o bacilo começa a se dividir e a aumentar em número no
a tuberculose mult irresistente (TBMR - 1.1%), mostra o
foco de inoculação, disseminando-se tanto por via linfá-
agravamemo da siEUação epidemiológica no país.
cica para os gânglios linfácicos de drenagem como por via hematogênica para órgãos exrrawrácicos. A partir das lesões pulmonares, também conheci-
ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS EIMUNOLÓGICOS
das com o cancro de inoculação ou nód ulo de Ghon, os bacilos m igram por via linfática até os linfonodos
A patogenia da tuberculose está div1dida em quatro estágios:
hilares
e
med1astinais, onde ocorrem as mesmas rea-
ções inflamatórras observadas nos pulmões. Ao con-
Estágio 1 - Destruição do bacilo por macrófagos
junto formado pelo cancro de inoculação, linfangite e
alveolares residentes maduros, dependendo de: capaci-
linfadenopatia, dá-se o nome de complexo primário
dade inibitória do macrófago; virulência do bacilo; carga
de Ranke (Figuras 10.1 e 10.2). O momento do surgi-
infectante.
mento do tubérculo corresponde ao desenvolvim ento
Estágio 2 - Multiplicação logarítmica doM. tuberculosis
da imunidade celular e
é associado à vi ragem do test e
(Mtb) dentro de macrófagos imaturos. O mecan1smo seria
ru berculínico. No momento da disseminação hema-
devido a: monócicos/macrófagos recrutados da circulação
wgênica, o organismo, já com a Imunidade adquirida
não detêm o crescrmenco; formação da lesão inicral.
desenvolvida, impede o estabelecimento da tubercu-
Estágio 3 - Número estacionário de bacilos. O mecanismo seria devido a: multiplicação do M.
tuberculosis
lose doença em 95% dos casos, encerrando, então, a prrmo-infecção.
inibida pela resposta imunológica mediada por células; formação do foco tuberculoso, com centro caseoso sólido impedindo a multiplicação extracelular do bacilo; em
TU BERCU LOSE PRIMÁRIA
torno do cencro necrótico as células epitelióides inibem a multiplicação e destroem o M. tuberculosis; macrófagos
Em 5% dos casos, as lesões provocadas pela primo-
imaturos ainda permitem a multiplicação; a evolução da
infecção tuberculosa adquirem caráter progressivo.
doença depende do número de macrófagos maruros e/
dando orrgem à tuberculose primária . Conceltualmen-
ou imaturos.
te, a tuberculose resultante da progressão do comple-
Estágio 4 - Liquefação do cáseo e evasão do bacilo.
xo pulmonar primário que se desenvolve nos primeiros
O mecanismo seria devido a: mult iplicação extracelular
cinco anos após a primo-infecção é chamada de tuber-
em larga escala; expectoração e preservação da espécie
culose primárra.
pela t ransmissão para outro hospedeiro; m ecanismos de defesa incapazes de controlar a infecção.
A lesão pulmonar pode adqui rrr aspecto pneumónico, estender-se até a pleura ou escavar, originando a caverna primária. Os linfonodos. aumentando de volume, podem determinar compressão brónquica,
PRIMO-INFECÇÃO
levando
à atelectasia, quando toda a luz brônquica é
obstruída, ou insuflação pulmonar, no caso de obstruO ser humano adquire o bacilo da tuberculose, o
ção parc1a l, com mecanismo valvular. Se os linfonodos
é eliminado dos pulmões de um paciente através
perfuram para dentro da luz brônquica, instala-se a
de part ículas expelidas durante a tosse. fa la ou espirro.
bronqui te tuberculosa, que muitas vezes manifesta-se
Aquelas partículas diminutas, com algumas unidades
por tosse incoercível. Uma das formas mais graves é a
qual
bacilares, logo que eliminadas, são rapidamente desse-
forma m iliar, resultante da difusão de lesões granulo-
cadas e permanecem em suspensão na atmosfera e em
matosas muim pequenas que atingem não apenas os
cond1ções de serem inaladas por outras pessoas. Venci-
pulmões, como outros órgãos.
94
Medici na laborato rial para o clínico
casos no interior das vias aéreas superiores, onde há resistência inespecífica contra a instalação dos bacilos devido a barreiras físicas em que a mais importante é a clearence muco-ciliar. Caso o bacilo vença a barreira física, ele atinge os alvéolos pulmonares e a infecção tu -
berculosa inicia-se. Os macrófagos alveolares são uma das primeiras células a interagir com os bacilos através da fagocicose, que
Figura 10.1 - Complexo pnmáno.
caracteriza a etapa inicial da resposta imune inespecífica antimicobacceriana. Quando ocorre a multiplicação dos bacilos e a liberação de seus antígenos, desencadeiam-se estímulos aos linfócitos T que. a partir da liberação de citocinas e outros mediadores, promovem a ativação de macrófagos e a proliferação de novos linfócitos T, objetivando a contenção ou mesmo a destruição dos bacilos da tuberculose. Os mecanismos imunológicos da tuberculose não estão ainda completamente esclarecidos, mas envolvem linfócitos T, macrófagos, interleucinas e inúmeros outros mediadores. Uma vez iniciada a multiplicação bacilar, entram em ação os macrófagos ativados e os linfócitos T, que produzem intedeucina-2, a qual promove a multiplicação de outros linfóciros, possibilitando a migração dos
Figura 10.2- Complexo pnmáno. Nesta imagem não se observa o cancro de 1noculaçào. TUBERCU LOSE PÓS-PRIMÁRIA OU SECUNDÁRIA
mesmos para o foco da lesão. Existem várias subpopulações de linfócitos T, sendo as principais as de linfócitos T auxiliares, helper ou CD4+, cujas funções mais importantes são secretar interleuci-
Os bacilos da primo-infecção podem permanecer vi-
na-2, a qual promove a ampliação da resposta inflamatória, e produzir TNF- alfa, que facilita a lise dos bacilos
áveis no organismo por muitos anos e até mesmo duran-
pelos macrófagos com formação de granulomas.
te toda a vida do indivíduo. Ocorrendo queda da defesa
Os linfócitos T moduladores (supressores) ou CD8+ interagem com os linfócitos CD4+, organizando, mo-
do organismo por qualquer mmivo, esses bacilos podem multiplicar-se e dar origem à tuberculose de reativação, nos pulmões. pleura, ossos, rins, olho ou em qualquer outro órgão onde o bacilo renha se alojado anteriormente. Nos países com baixa prevalência de tuberculose, a rear1vaçào endógena acomete principalmente as pessoasem idade avançada, enquanto que nos países com alta prevalênciade pacientes bacilíferos, a reinfecção exógenaé maisimportante eatinge principalmente adulwsjovens, como acontece em nosso país.
M ECAN ISMOS IMUNOLÓGICOS
dulando e quantificando a reação inflamatória. Esses linfócitos têm também ação citotóxica, promovendo a destruição de macrófagos não arivados e de tecidos circunvizinhos, bem como dos organismos invasores. Com essa destruição tissular, forma m-se áreas de necrose caseosa, dificultando a mu ltiplicação dos bacilos pela baixa tensão de oxigénio e do pH ácido. A interação entre linfócitos CD4+, CD8+ e macrófagos pode ser benéfica ou prejudicial, pela destruição rissular, dependendo da intensidade da reação. Entre os linfóciws T helper, foram identificadas duas subpopulações principais, sendo que a Th-1 tem a função
A primeira experiência do organismo humano com o bacilo da tuberculose ocorre na quase total idade dos
Investigação laboratorial do paciente com micobacterioses
de promover a proliferação celular e a ativação de células citmóxicas, pela secreção de interlucina-2 e interferon-
95
gama. A subpopulação Th-2 age auavés da liberação de inrerleucinas 4, S. 6, 10 e 13. promovendo a proliferação de linfócitOs B, os quais, atuando sobre os plasmóciros. conduzem à produção de anticorpos, cujos papéis na tuberculose ainda estão para ser esclarecidos. A hipersensibilidade do cipo re[ardado é parce incegrame dos mecanismos imunológicos da tuberculose e intimamente vinculada à interação entre linfócitos CD4+. CD8+ e macrófagos. As lesões anacomopacológicas da tuberculose ocorrem na dependência de mecanismos de hipersensibilidade aos antígenos do bacilo. Esses fenômenos imunológicos estão vinculados à imunidade celular. com envolvimento dos linfócitos T. principalmente CD4+ e CD8+, macrófagos ativados e cicocinas, em especial as inrerleucinas. o inrerferon-gama (INF-gama) e o faror de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa). secretadas por estas células. Na tuberculose disseminada, ocorre falência das defesas imunológicas. principalmente de linfócitOs CD4+. permitindo intensa multiplicação e disseminação bacilar, com a formação de numerosos focos inflamatórios. acompanhados ou não de necrose caseosa. Essas lesões se desenvolvem na dependência da ação de INF-gama e TNF-alfa. enquanto que os mecanismos de hipersensibilidade são pouco expressivos. com PPD rearor fraco ou mesmo não rearor, em decorrência da falência da inreração entre linfócitOs CD4+, CD8+ e macrófagos.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
TUBERCU LOSE PULMONAR A TB manifesta-se por uma síndrome infecciosa de curso crónico, com febre baixa. sudorese noturna e consome o indivíduo, debilitando e gerando o emagrecimento. Apresenta tosse. que inicialmente pode ser seca, e posteriormente expectOração por mais de três semanas, que pode evoluir com escarro sangüíneo (hemoptóicos) e hemoptise. dor toráoca e dispnéia nos casos ma1s avançados.
TUBERCULOSE EXTRAPU LMONAR A forma exrrapulmonar acomete cerca de 15% dos casos de TB. pode apresentar os mesmos sintomas ge-
96
Medicina laborarorial para o clínico
rais citados na TB pulmonar e o quadro clínico vai variar conforme a localização e a gravidade do caso. O teste tuberculínico é geralmente rearor forre. A forma mais prevalente é a pleural em pacientes imunocompetentes.
ABORDAGEM DIAGNÓSTICA
TUBERCULOSE PULMONAR Investigação microbiológica
A obtenção de amosua representativa das vias aéreas inferiores é fundamental para o sucesso do diagnóstico microbiológico da tuberculose pulmonar. Caso não haja escarro. pode-se fazer o escarro induzido com solução salina hipertônica a 3%, a partir da nebulização (nebulizador ultra-sônico), seguindo-se as Normas de Biossegurança do Ministério da Saúde. Ouua escolha é fazer a broncofibroscopia para coletar o material clín1co: lavado broncoalveolar e/ou biópsia transbrônqUJca. Baciloscopia
A baciloscopia direta do escarro é o método mais importante para o diagnóstico da tuberculose pulmonar no Brasil. já que a maioria dos nossos pacientes são portadores da cepa do Mycobacterium tuberculosis, sendo aceito, portanto. o diagnóstico de TB utilizando-se desta técnica. As micobactérias não tuberculosas têm prevalência muiro baixa, porém, deve-se estar atento para esta hipótese, principalmente em pacientes imunossuprim idos ou seqüela de doenças pulmonares. A técnica mais utilizada é a coloração de Ziehi-Neelsen (ZN), que é um exame simples e barato, utiliza microscópio à luz branca. sendo empregado não só para o diagnóstico, mas também para o controle mensal dos pacientes e definição de estratégias de controle da TB diante da quanndade de bacilíferos na comunidade. Outro mérodo de coloração é o da Auramina, que utiliza microscópio fluorescente para a visibilização do bacilo, sendo sua leitura muita mais rápida que a leitura com a técnica de ZN, já que os bacilos apresentam-se amarelo-brilhante sob um fundo escuro. Para que se tenha lâmma positiva (baciloscopia poSitiva), são necessários pelo menos 5.000 bacilos por ml da amostra.
Quando um diagnóstico é feico somente pela técnica da Auramina, deve-se corar novamente essa lâmina pela técnica de Z , para a confirmação e liberação do resultado. Alguns estudos, porém, demonstram que em laboratórios que possuem técnicos altamente treinados, a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo positivo e o valor predicivo negativo desse mécodo são maiores que pela coloração com ZN. A liberação do resultado pode ser aucorizada e a correlação clínica e radiológica deve ser avaliada. Liberação da baciloscopia (BAAR · bacilo álcool-ácido resistente) em material direco (não centrifugado). Os critérios variam conforme o tipo de amostras. a) Em amostras de escarro: • não são encontrados BAAR em 100 campos = relata-se resultado negativo; • são encontrados um a nove BAAR em 100 campos = relata-se apenas a quantidade de baar encontrada; • são encontrados 10 a 99 BAAR em 100 campos = relata-se resultado positivo (+); • são encontrados, em média, um a 10 BAAR por campo nos primeiros 50 campos observados = relata-se resultado positivo (++); • são encontrados, em média, 10 BAAR por campo nos primeiros 20 campos observados = relata-se resultado positivo (+++). b) Em outras amostras, quando: Não são encontrados BAAR = relata-se resultado negativo; São encontrados BAAR em qualquer quantidade, 100 campos =relata-se resultado positivo. Liberação da baciloscopia em material centrifugado. Leitura em 300 campos: • foi encontrada nos 100 primeiros campos média de mais de 10 BAAR por campo. está encerrada a leitura e a amostra é positiva(+++). Se a média for inferior ou não contiver BAAR, continua a leitura até completar 200 campos; • foi encontrada em 200 campos média de um a 10 BAAR por campo. está encerrada a leitura e a amostra é positiva(++). Se a média for inferior ou não contiver BAAR, continua a leitura até completar 300 campos;
Investigação laboratorial do paciente com micobacrerioses
• foi encontrado em 300 campos um total de 10 a 99 BAAR. sendo a amostra positiva (+); • foram encontrados um a nove BAAR, o resultado é inconclusivo para tuberculose. Deve-se solicitar nova amostra e repetir-se o exame; • não foram encontrados BAAR nos 300 cam· pos observados, sendo a amosrra negativa para BAAR. OBS: caso o diagnóstico de TB seja feito pela baciloscopia após centrifugação de amostra de escarro, as baciloscopias de controle do tratamento deverão ser realizadas da mesma forma, para que se possam comparar os resultados. Cultura
A cultura do material clímco é o método mais específico e sensível para detectar o bacilo da tuberculose. São necessários 10 a 100 bacilos viáveis por ml da amostra para um resultado positivo. Está indicada nos casos em que duas amostras são negativas na baciloscopia. na tuberculose exuapulmonar, TB recidivante, retorno pós-abandono do tratamento e em indivíduos com imunossupressão. A parti r da cultura pode-se identificar as espécies m1cobactenanas e realizar-se o teste de sensibilidade em pacientes suspeiros de portar cepas resistentes. Em outros países. cepas mult1drogas-resistenres (MDR) são defin1das como cepas do Mtb resistentes a pelo menos a rifampicina e a isoniazida. No Brasil. por utilizar-se o esquema de falência com estrepromicina, etambucol, etionamida e pirazinamida, as MDRs são definidas como cepas resistentes à rifampicina, isoniazida e a outro medicamento utilizado no esquema I. IR ou III. A cultura é fei ta no meio sólido de Lowentein-Jensen e o crescimento do M. tuberculosis é em torno de 28 dias de incubação à temperatura de 36"(. porém outros meios sólidos à base de Agar (7H10) e líquidos (7H9. 7H12) foram padronizados para serem utilizados no diagnóstico da TB, adorando-se aparelhos auromat1zados ou semi-auromatizados, como: BACTEC 460 TB®, BACTEC 9000®. MGIT 960® (Mycobactena GrowLh lnd1cator Tube) (Becton Dickmson, Sparks, Md.), MB/BACJ®, MB REDOx® (Heipha D1agnostika Biorest, Alemanha) e ESP 11® (Trek Diagnostic Systems). A vantagem desses meios é o tempo de crescimento do Mtb (em torno de 10 d1as).
97
Métodos moleculares
Várias técnicas de Biologia Molecular têm sido utilizadas para o diagnóstico da cuberculose pulmonar e extrapulmonar, como, por exemplo: AMTD® e EMTD® (GenProbe lnc, San Diego, CA), Amplicor® e COBAS Amplicor® (Rache Molecular Systems, Brancburg, NJ), LCx Probe System® (Abbot Laboratories), SDA® (Biosciences Sparks, Md). Encretanto, apenas o AMTD®, o Amplicor®e o EMTD® foram aprovados pela FDA e exclusivamente para amostras respiratórias, com baciloscopia positiva. Somente o EMTD foi aprovado para amostras com baciloscopia negativa. Esses testes aprovados devem ser usados na suspeita clínica de TB pulmonar do adulto não infectado pelo HIV e sem tratamento prévio nos 12 meses anteriores. A recomendação do Ministério da Saúde é de que a PCR não deve ser utilizada na rotina diagnóstica da TB pulmonar no nosso meio, nem substituir a culcura. Ela poderá ser empregada em laboratórios de referência, nos casos que necessitarem de diagnóstico rápido, considerando-se os testes validados para as distincas sicuações e as características da população escudada, antes da decisão diagnóstica.
A forma primária apresenta-se mais comumente como: consolidação parenquimantosa semelhante a uma forma pneumónica e algumas vezes com presença de broncograma aéreo. A topografia mais comum é: sub-lobar e subpleural; linfoadenopatia mediastinal e hilar usualmente estão associadas à consolidação parenquimacosa ou à atelectasia, pela compressão extrínseca de um li nfanodo; padrão miliar ou micronodular, que são pequenas opacidades (micronódulos) isoladas distribuídas homogeneamente, dissem inadas por todo o pulmão. Na forma pós-primária, os achados radiográficos mais freqüentes são: opacidades heterogêneas e cavidades nos segmentos ápico-posteriores dos lobos superiores ou superiores dos lobos inferiores; consolidações e padrão retículo-nodular por disseminação broncogênica; nódulos (cuberculoma); banda parenquimatosa represemando fibrose local. (Figuras 10.3 e 10.4)
Testes sorológicos
Existem várias técnicas sorológicas para o diagnóstico de TB: hemaglutinação. aglutinação em látex, fluorescência indireta, radioimunoensaio e imunofluorescência. Entretanto, vários fatores estão associados ao limitado rendimento dos testes sorológicos avaliados até hoje: técnica sorológica, tipo de antígeno empregado, classe de imunoglobulina pesquisada, população escudada, situação imunológica. variações genéticas individuais, possibilidade de sensibilização prévia com outras micobacténas e produção de diferentes classes de anticorpos em momentos disti ntos da doença. Assim, não é recomendada a utilização de testes sorológicos na rotina clínica da investigação da cuberculose.
Figu ra 10.3 - Grandes cavtdades em terço superior dtreito e disseminação broncogênica contra lateral.
Diagnóstico por imagem
Radiograma de tórax
A apresentação radiológica da TB dependerá se TB primária ou pós-primária (secundária).
98
Figura 10.4 - Cavidades apicais associadas a lesões heterogêneas confluentes e dissemtnação broncogêntca.
Medicina laboratori al para o clínico )1---- - - - -- -- - -- - - - -- - - - -- - -- - - - - -
Tomografia do tórax
A comografia computadorizada de alta resolução (TCAR) é um método de imagem de alco cusco e deve ser utilizado em situações especiais, como: quando o rad1ograma de tórax não contribui para o diagnóstico da doença em arividade, na TB miliar, sendo de fundamental importância a definição quanto à distribuição de pequenos nódulos parenquimacosos, na avaliação do mediastino e suspeita de outras doenças. Os principais achados comográficos são: nódulo de espaço aéreo, nódulos centro-lobulares, aspecto de árvore em brotamenco. cavitações, espessamento de paredes brônquicas. consolidações, opacidades em vidro fosco e espessamento do interstício pulmonar (Figura 10.5).
Figura 10.5 - A: Radiograma de tórax apresentando opaodade orcunscma de limites imprecisos localizados no lobo superior do pulmão dtretto. B: Lesão vtstbtltzada em radtograma de tórax em perftl C: Imagem tomográfica com consoltdaçào em lobo supenor do pulmão dtretto com broncograma aéreo e preenchimento alveolar (árvore em broramento) em torno da lesão princtpal.
Teste tuberculínico
O Teste Tuberculíneo (TT) é utilizado como auxiliar diagnóstiCO da TB (70 a 80% dos portadores de TB apresentam TT ~ 10 mm), a partir da técnica de Mantoux. Há urna reação celular no local da inoculação intradérmica do derivado protéico purificado do Mtb. No Brasil. o MS distribui o PPD RT 23, aplicados 2UT (0,1 ml) no antebraço esquerdo. A leitura é feita 72 a 96 horas no sentido transverso da enduração palpada, com régua milimetrada. O resultado positivo evidencia a infecção por micobactérias, não caracterizando doença. O resultado origina a seguinte classificação: • O a 4 mm - não reator: ind1víduo não infectado pelo Mtb ou por outra m1cobactéria; infectado pelo Mtb em fase de viragem tuberculínica ou excepcionalmente em pessoas infectadas ou doentes pelo Mtb (pacientes imunodeprimidos);
Investigação laboratorial do paciente com micobacterioses
• 5 a 9 mm - reator fraco: 1ndivíduo vacinado com BCG, infectado pelo bacilo da TB ou por outras mtcobacrérias; • :2: 10 mm - reator forte: vacinado com BCG recentemente (dois a três anos). indivíduo infectado pelo bacilo da TB, que pode esrar doeme ou não. Nos pacientes HIV positivo, o resultado considerado não reacor é de Oa 4 mm e reatar ~ 5 mm. Algumas situações podem interferir no resultado do TT. como: doença imunodepressora; vacinação com vírus vivo; gravidez; tratamento com corticóide e imunodepressores; crianças com menos de dois meses de idade; pessoas com mais de 60 anos de idade. Esse teste possui limitações importantes para seu uso na deCISão diagnósnca, principalmente em locais de alta prevalênCia de infecção pela TB (infecção no Brasil está entre 25 e 55% na população geral) e nos locais de coinfecção TB/HIV. onde poderá aumentar a probabi lidade de falso-negativo.
TUBERCULOSE EXTRAPU LMONAR Tuberculose pleural
Uma avaliação epidemiológica clínica e laboracorial deve ser empregada para o diagnóstiCO da TB pleural. A realização do radiograma de tórax revela a presença do derrame pleural acompanhado ou não de lesões parenquimatosas (Figura 10.6). A TC de tórax pode esclarecer se lesões parenquimacosas existem em radiogramas que não evidenciaram tais lesões (TB pleuropulmonar). A ulrra-sonografia pode auxiliar na evtdênCta de derrames loculados, pleura espessada e guiar a toracocentese. O líquido deve ser puncionado e uma biópsia da pleura deve ser realizada a com a agulha de Coppe. Exames bioquímicos. segundo os critérios de Light, relatam que o líquido tem que ser exsudarivo: a) proteínas no líquido pleural/proteína sénca > 0.5; b) destdrogenase lánca (DL) líquido pleurai/DL sénca > 0,5; DL do líqUtdo pleural > 2/3 do limite superior do normal sérico. O líquido geralmente é amarelo citrino, raramente hemorrágico. A citologia apresenta linfocitose, ausência ou raras células mesoteliais. A histopatologia do fragmento está tndtcada em todo derrame pleural, tem mais sensibilidade que
99
a cultura, mas não ulcrapassa 85%. Na pleura, o granuloma com necrose caseosa indica altíssima probabilidade de TB.
ácido resistentes). Quando o gânglio estiver em vias de
supuração, pode ser feita a punção aspirativa, ocasião em que a baciloscopia rem mais positividade. O material também deve ser enviado para cu ltura de micobactérias. O reste tubercu lín ico geralmente é positivo.
Tuberculose geniturinária Vias urinárias - muitos pacientes podem ser assintomá[lcos. Podem apresentar disúria
e dor lombar.
Não é comum a hematúria. O acometimento da bexiga pode provocar polaciúria
e dor.
H istória de leuco-
citúria sem bacteriúria deve chamar a atenção para o d iagnóstico de TB. Figura 10.6 - Imagens radiológicas comparivel com derrame pleural à d1re1ta.
TB genital masculina - próstata, vesícu las seminais e epidídimo podem ser acometidos. No escroro podemse observar edemas e físrulas.
e cultura
e do
fragmento
TB genital fem inina - pode estar acompanhada de
devem ser realizadas, porém a baciloscopia com a téc-
infertilidade, doença inflamatória pélvica, amenorréia ou
nica de ZN pode ter sensibilidade de zero a 5%. O ren-
aumento do fluxo menstrual. Acomete as trompas. en-
A baciloscopia
dimenm da cultura está se cult1va o líquido.
e
em
e do
do líquido
rorno de 10 a 35%, quando
fragmento da pleura entre 40
65%. Em pacientes imunossuprimidos
e
dométrio e ovários. Exames micobacteriológicos e histOpatológicos são recom endados para o diagnóstico.
diabéticos.
O reste tuberculínico é positivo na maioria dos pacien-
pode ocorrer a perda da função dos linfóciros, podendo
tes. A baciloscopia da urina pode ser positiva. porém, de-
verificar-se ausência de formação granulomatosa. o que
vido às micobactérias não tuberculosas presentes nas via
dificulta o diagnóstico. Outras doenças podem apresen-
gemturinárias. o diagnóstiCO deve ser feim pela cultura.
tar granuloma. como micobactérias não tuberculosa. sarco1dose, m icoses e artrite reumatóide.
A urografia excretora pode apresentar-se com alterações. como: estenose urereral; perda da f lexibilidade do
O teste ruberculínico, na grande maioria das vezes. é
ureter; baqueteamento calicial. com hidronefrose; calci-
positivo, podendo inicialmente ser negativo com poste-
ficação do parênquima renal; dim inuição da bexiga e de
nor positivação.
sua distensão quando acometida intensamente. A ultra-
Outro método diagnóstico aceitável como auxiliar
sonografia mostra com mais detalhes o parênquima re-
é a dosagem da enzima adenosi nadeaminase (ADA) no
nal (microcalcificações). A citoscopia é importante para
líquido, realizada pela técnica de Giusti, com valores po-
a biópsia de lesões em bexiga.
Sitivos > 40 UI/I. O diagnóstico diferencial deve ser feiro com emp1ema, linfomas, aruire reumatóide e raramente adenocarcinoma.
Tuberculose osteoarticular
Tuberculose ganglionar periférica
dos quadris. joelhos
O local mais acometido é a coluna vertebral. segu ido
e
tornozelos. Entretanto, qualquer
parte do esqueleto pode ser acometida. Dor. tumoração, O diagnóstico
é dado pela hisroparologia a partir da
biópsia (lesão granulomatosa, geralmente com necrose caseosa
e infiltrado hisitomário
de células multinuclea-
das. podendo ser encontrados ou não os bac1los álcool-
100 ( M ed ici na laboratorial para o clínico
alterações neurológicas
e
alteração da marcha podem
ocorrer. Com a progressão da doença vertebral. pode haver destruição e colapso dos corpos vertebrais, levando à cifoescoliose, muitas vezes deformantes.
Tuberculose ocular
O diagnóstico de TB ocular é difícil e de exclusão, pois é necessário descartar oucras doenças, como mxoplasmose, sífilis, sarcoidose, colagenoses, emre oueras. A história de comam e o teste cuberculínico são importantes no diagnóstico de probabilidade, já que isolar o agente é raramente possível. Não há lesões características, porém a úvea é o local mais acometido. A conjuntivite flictenular é a resposta de hipersensibilidade do bacilo da tuberculose. Assim, após terem sido descartadas as doenças citadas e avaliada a história de concato - teste wberculínico ~ 10 mm, deve-se iniciar o tratamento, sendo necessário o acompanhamento rigoroso pelo oftalmologista. Caso haja melhora nos dois primeiros meses, deve-se continuar o tratamento. Se não houver melhora, o medicamento deve ser suspendido e ouuas hipóteses de doença ocular devem ser aventadas. Após o fina l do tratamento, se houver recidiva da doença ocular, o diagnóstico de TB também deve ser revism.
Figura 10.7- lnfilrrado imersticial micronodular difuso. A: granúlia. B: micronódulos maiores.
Figura 10.8- Radiograma de tórax apresenrando infiltrado intersticial micronodular difuso de uma criança.
Tuberculose do sistema nervoso central Tuberculose miliar
e pode ter duas apresentações: a forma menigoencefálica e tuberculoma É também uma forma grave da TB
A TB miliar é uma das formas mais graves da TB. Trata-se de uma forma disseminada. Deve-se lembrar que a TB disseminada pode apresentar ou não a forma miliar. Caso o radiograma de tórax apresente infiltrado micronodular difuso, pode-se preconizar uma forma miliar, senão, ocorre simplesmente uma TB disseminada. A TB miliar pode se dar a partir da primo-infecção, dependendo da descarga bacilar via hematogênica (Figuras 10.7 e 10.8). A TB miliar acomete principalmente crianças não vacinadas com a BCG, idosos e imunodeprimidos. Pode apresentar-se de duas formas: pulmonar - com tosse seca e dispnéia; sistêmica - com quadro consuptivo, sendo o SNC comprometido em 30%. Por isso, diante de uma TB miliar, a punção liquórica é imprescindível. O diagnóstico é dado a partir da suspeita radiológica (granúlia ou coalescência); realização da biópsia uansbrônquica (para aval iação histopatológica- granuloma). A baciloscopia é pobre e a cultura tem baixo rendimento. Podem-se fazer hemoculturas para isolar-se a micobactéria.
Investigação laborarorial do paciente co m micobacrerioses
intracraniano. A clínica pode ter início insidioso em adultos e agudo em crianças de baixa idade, com sintomas de comprometimento meníngeo. O diagnóstico é baseado nos dados laboratoriais do líquor. O líquido pode inicialmente apresentar-se neuuofílico e depois wrnar-se linfomonocitário, com proteína alta e glicose baixa. O TC de crânio pode exibir áreas de infarto ou tuberculoma. A baciloscopia direta e a cultura raramente positivam-se.
Tuberculose cutânea
Na suspeita de TB cutânea, toda a lesão deve ser biopsiada, para a realização da baciloscopia, cultura e avaliação hiswpatológica. Nas lesões ulceradas, deve-se coletar a secreção e enviar rapidamente para o laboratório de micobactéria, que realizará a baciloscopia e a cul-
101
rura (jamais enviar swab da lesão, pois o bacilo pode ficar aderido no algodão). O teste tuberculínico na sua maioria é positivo. A TB verrucosa. o lúpus vulgaris, a goma tuberculosa. a tuberculose mil!ar cutânea aguda, a tuberculose orificial e as ruberculídes são geralmente diagnosticados pela hiscopacologla. O emema nodoso costuma ser uma resposta de hipersensibilidade do bacilo. Quando o achado hiscopatmógico evidencia o eritema endurado de Basin, 30% a 40% podem estar relacionados à tuberculose cutânea.
Tuberculose gastrintestinal
t
pouco comum. O paciente pode apresentar dor abdominal, diarréia, sinais de obstrução intestinal e emagrecimento. No exame físico. uma massa abdominal pode ser palpada, devido aos gânglios mesenréricos. O local ma1s acometido é a região íleo-jejunal e ileo-cecal. A endoscop1a e a colonoscopia auxiliam na detecção da lesão para a biópsia. A ulua-sonografia e a TC computado nzada podem auxiliar na ev1dência de gânglios no mesentérico e retroperitônio e ascite (TB peritoneal, com líquido amarelo citrino, predomínio de linfócito. A bacteriologia do líquido e da biópsia pode dar o diagnóstiCO de certeza ou sugestivo com base na hiscopacologia. Pode também estar associada à TB hepacobiliar). Ass1m, pode ser feita a laparoscopia para a realização da biópsia e coleta do líquido para o diagnóstico. O material deve ser enviado para os exames micobacteriológico e histopawlógico. O TT é positivo em 90% dos casos. As pnncipais complicações são as perfurações, a obstrução, a fístulização e a hemorragia. Os principais diagnósticos diferenciais são: doença de Crohn. neoplasia. actinomicose e micobactérias não tuberculosas.
TB de laringe
Os pacientes com TB laríngea queixam-se normalmente de dor. disfag1a e rouquidão progressiva. Para o diagnóstico. é necessária a realização de laringoscopia ou broncoscopia, podendo evidenciar lesão que deverá ser biopsiada. A associação da TB laringe e pulmonar é muico comum, mesmo assim, o material deve ser enviado para exame m1cobacteriológico e hiscopatológico. Caso
102 [ Medicina laborato rial
para o clínico
haja baciloscopias positivas com exame radiológico de tórax sem alterações, a suspeita de TB laríngea se impõe. O diagnóstico diferenoal mais importante é com a paracococcidiodomicose. podendo até mesmo estar associada à TBe neoplasias.
Tuberculose endobrônquica
Na suspeita da TB endobrônquica, a baciloscopia, a culrura e a broncofibroscopia (baciloscop1a negativa. diagnóstico precoce de estenose ou controle) devem ser pedidas. O radiograma de tórax pode ser normal ou apresentar atelectasia pela obstrução brônquica. A grande maioria da TB endobrônq uica está associada à TB pulmonar.
Tuberculose pe ricárdica
A apresentação clínica normalmente tem evolução arrastada e subaguda. Pode apresentar-se com dor corácica sem característica de pericardite. dispnéia, tosse, astenia, febre vespertina, tonteira. sudorese nmurna. Evolui quase sempre para pericardite constritiva. O radiograma de tórax mostra aumento da área cardíaca, o ecocardiograma na fase inicial exibe pequeno a moderado derrame e, na evolução da doença. espessamento do pericárdio e fibrose. A TC de tórax e a ressonância magnética são mais sensíveis ao espessamento do pericárdio.
MICOBACTÉRIAS NÃO TUBERCULOSAS
INTRODUÇÃO As micobaccérias que não estão dentro do Complexo Micobacterium tuberculos1s são chamadas de micobactérias não ruberculosas (MNT). As MNT foram descobertas no século XIX. porém só foram reconhecidas como causa de doença em humanos em 1950 (a doença é chamada de m1cobacterioses). Com o advento da Biologia Molecular e a habilidade de mapear o genoma das bactérias, novas micobactérias foram descobertas. Muitas técnicas de identificação têm sido avaliadas para ajudar a elucidar o poder pacogênico de MNT não mui-
w freq üemes. Porramo, o poder pawgênico de muitas espécies ainda não está claro. Até hoje, mais de 100 MNTs foram descritas. Essas espécies geral mente oportunistas são classificadas segundo seu poder de causar doença no homem, como potencialmente parogênicas ou não-pacogênicas. As MNTs isoladas com mais freqüência no Brasil são o complexo MAC (avium, imracellulare e escroflaceum), M. fortui tum, M. kansasii, M. chelonae e causam principalmente, doença pul monar e ganglionar, pri ncipalmente em paCientes imunodeprimidos, idosos. alcoolistas e portadores de pneumopatias crónicas. Há possibilidade de essas micobactérias simplesmente colonizarem algumas pessoas, sendo importante a necessidade de estabelecerem-se critérios seguros para diferenciar colonização de infecção, como sugerido pela American ThoraC/c Society (2007). Outras espécies de interesse humano foram isoladas, como M. marinum. M. xenopi, M. ulcerans, M. haemophilium, M. szulgai, M. malmoense, além do M. leprae. No entanro, muitas espécies não são patogênicas ao homem, como o M. gordonae, M. terrae, M f/avecens e o M. smegmatts.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓG ICOS A incidência mundial de MNT é de 3,2/100.000 habitantes, após dados de 2002. O acometimento é o dobro em homens na comparação com as mulheres. Os locais mais acometidos são os pulmões. Outras manifestações incluem: doença disseminada, doença da pele, tecido conjuntivo, ósseo e linfadenite. A MNT está presente naturalmente no meio ambiente, tendo sido isolada da água e do solo. Pode ser transmitida por via inalatória, aspiração do conteúdo gasrrimestinal ou infecção localizada na pele. A doença por MNT pode ocorrer em animais, mas a transmissão de animal para humanos parece não ser importa me para a infecção em humanos. Assim, as medidas de isolamento de comatos não são necessárias. Os fatores de risco de doença por MNT incluem tabagismo. doença pulmonar obstrutiva crônica, seqüelas de TB, bronquiectasias, doença gasrroesofágica associada à aspiração crónica, pneumoconioses e imunossuprimidos, como: infecção pelo HIV, alcoolismo e terapia imunossupressora.
Invest igação laboratori al do paciente com micobacterioses
ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS As MNTs são encontradas no solo, na água e em aerossóis, sendo esta última a fonte de infecção mais freq üeme para o homem. Portamo, a porta de entrada mais imporrame não é a via respirarória. A maiscomum é a via gastrintestinal. com a ingestão de água ou alimentos contaminados, aspiração de conteúdo gástrico ou infecção localizada na pele. Os verdadeiros aspectos fisiopatológicos são pouco conhecidos, porém, mecanismo imunológico e genético tem sido escudado na tentativa de elucidar essa doença.
MAN IFESTAÇÕES CLÍN ICAS Em geral. a doença produzida por MNT pode apresentar-se clinicamente indistinguível da doença pelo M. tuberculosis.
Doença pulmonar
Sinais e sintomas de doença pulmonar são variáveis e não específicas. Incluem: tosse crônica, produtiva, adinamia, dispnéia, febre, hemoptise e emagrecimento (geralmente quando doença avançada). Estão geralmente correlacionados com sintomas de doenças pulmonares associadas, sendo de difícil avaliação quanto aos sinais e sintomas da própria doença pela MNT. Não está claro se pessoas HIV negativo podem colonizar o trato respiratório na ausência de invasão tecidual. Por isso é necessário isolar muitas vezes a mesma MNT e evidenciar doença progressiva (RX de tórax e sintomas) para o diagnóstico. Em pacientes HIV positivo é também difícil de avaliar, pois esses pacientes são freqüentemente infectados com MNT. sem evidência de doença pulmonar, pois, a infecção pode ser transi tória, mas pode refletir doença disseminada. Com o advento da triterapia anti-retroviral e uso de medicamentos para prevenção de MNT. a doença tem diminuído nesses casos. Devido à grande dificuldade em diagnosticar a doença por MNT no acometimenw pul monar, a American Thoractc Society (ATS - 2007) sugeriu alguns critérios a serem seguidos para a definição da doença:
103
• apresentação clínica, achados radiológicos e comograficos podem sugeri r MNT. após exclusão de outros diagnósricos; • colera de duas a crês amosrras de escarro com cu lcura posiriva; • cultura posiciva de pelo menos um lavado brônquico e/ou broncoalveolar; • biópsia pulmonar ou rransbrônquica (granuloma e presença de BAAR) e culrura posiriva para MNT; • biópsia pulmonar ou rransbrónquica (granuloma e presença de BAAR) e culrura posiriva em escarro ou lavado brónquico ou lavado broncoalveolar. As culruras devem apresentar mais de 200 colónias (subconfluentes). Para casos quesrionáveis avaliar especial isca. Todos os cmérios devem ser avaliados em conjunto, lembrando sempre que muiras vezes deve-se rerardar o uso das drogas para MNT: • muicos pacientes rêm doença não cavirária, lenra e progressiva que não afera a expecrariva de vida. a seleção desses pacientes requer familiaridade com os mesmos. cerreza de que a doença é indolente, poucos ou esráveis sintomas. se apresentarem sintomas imporrantes, aumento das colónias em culrura, piora baciloscópica ou progressão radiológica, a decisão do rraramento deve ser revisra; • alguns pacientes podem rer associação com oueras doenças de base, que podem limirar a expecrariva de vida; • pacientes com graves ou complicadas doenças de base podem piorar com a associação de medicamentos para mnt; • alguns pacientes podem rer imporrantes efeiws adversos oriundos da rerapia para MNT.
Pacientes sem AIOS
O paciente com acometimento pelo complexo M. avium (MAC) pode apresentar febre de origem obscura e os acomeridos pelo M. kansasii, M. che/onae, M.abscessus eM. haemophilum geralmente apresentam múlciplos nódulos subcutâneos ou abscessos que drenam espontaneamente. Pacientes com AIOS
A doença disseminada geralmente aringe os pacienres que esrão em avançado grau de imunossupressão. Deve-se suspeirar de disseminação quando as células CD4 esrão abaixo de 50. Apresentam freqüentemente febre prolongada, geralmente acima de 39.5 - 40°(. suores norurnos, perda de peso, dor abdom inal. diarréia. Os achados físicos podem ser da própria AIOS em associação a micobacrerioses, como adenoparias rerroperiwneal e hepawesplenomegalia.
Pele, doença do tecido conjuntivo e osso
O agente principal é o M. fortuitum, levando à doença localizada ou formação de abscessos em locais de injeção. A MNT pode acomerer pacientes em uso prolongado de carecer intravenoso e periwneal, cicatriz cirúrgica, rendões, bursas e arriculações pós-rrauma.
linfadenite
Pode aringir os linfonodos submandibulares, submaxilares, cervica l ou periauriculares em crianças, idosos e imunossuprimidos. Os linfonodos aumentam rapidamenre com drenagem para a região sinusal ou localmente.
Doença disseminada ABORDAGEM DIAGNÓSTICA
Ames da infecção pelo HIV, a doença disseminada era rara em indivíduos imunocomperentes. Poderia acomerer indivíduos com doença de base, cais como leucemia, !infama ou uso de imunossupressores.
104 ( Medicina laboratorial para o clínico
Para o diagnósrico laborawrial das MNT. seguem-se os procedimentos baciloscópicos, de culrura e de idenrificação, radiológicos e mérodos moleculares. Algumas peculiaridades são extremamente imporrames na in-
)1---- - - -- - -- - -- - - - - - - - - - - -- - - -- -
terpretação do resultado, pois as MNTs podem causar infecção, doença. colonização ou mesmo ser um isolamento do próprio local de trabalho, devido à prevalência no meio ambiente (contaminação). O teste tuberculínico não tem importância para o diagnóstico das MNTs. O isolamento das MNTs de sítios estéreis deve ser avaliado pela clínica e especialistas da área, para a confirmação da doença e início do tratamento.
Investigação microbiológica Baciloscopia
A baciloscopia não identifica as MTs das MNTs, porém. com colorações especiais, tais como ácido paraaminosalicílico (PAS) e a apresentação morfológica na lâm1na, podem-se sugerir algumas MNT. como. por exemplo, complexo MAC (forma cocóide). Cultura
Após o cresomemo em cultura. métodos de identificação das espécies são realizados, avaliando-se o tempo de crescimento, a morfologia, pigmentação e testes bioquímicos das colônias (provas de crescimento em presença de agentes de in ibidores). As micobacténas são classificadas em grupos, sendo excluídos o complexo Mtb e a não cultivável. o M. leprae. Grupo I - Fowcromogênicas: crescimento lemo. Colónias não pigmentadas que adqui rem cor que pode variar do amarelo ao laranja quando expostas à luz. Grupo 11 - Escotocromogênicas: cresomento lemo. Colônias adquirem cor que pode variar do amarelo ao laranja quando cultivadas na ausência ou presença de luz. Grupo III - Não cromogênicas: crescimento lemo. Colônias geralmente não pigmentadas (cor creme). Grupo IV - Crescimento rápido: desenvolvem colónias nos meios de cultura em sere dias ou menos. Podem ser pigmentadas ou não. O M. tuberculosis é classificado como grupo O, tem crescimento lemo, as colôn1as são não cromogênicas e são de cor creme e rugosas.
Investigação laboratorial do paci ente com mico bacterioses
As provas de crescimento e presença de pigmentos são metodologias básicas para identificar os grupos das micobactérias e espécies. São utilizados: tem po de crescimento e produção de pigmentos, crescimento em presença de agentes inibidores, crescimento em gelose nU[ritiva, crescimento em ágar MacConkey, crescimento em meio com cloreto de sódio a 5%. produção de niacina (pode-se utilizar fitas de niacina). red ução do nitrata (pode-se utilizar fitas de nitrata), catalase a 68° C Beta-glicosidade, hidrólise do tween 80. captação do ferro. uréase, utilização de açúcares (d-fruwse-maniw l-citratO de sódio) e redução do telurita de potássio. O método radiométrico com utilização do p-nitroalfa-acecilamino-8-hidroxipropiofenona (NAP) pode separar as micobactérias do complexo M. tuberculosis de outras micobaccerioses, pois o NAP inibe o crescimento do complexo Mtb. A cromatOgrafia gás-líquido (HPLC) baseia-se na análise de ácidos graxas de cadeia longa, realizada após a saponificação dos lipídios micobactenanos. O traçado obt1do no cromatograma a partir da amostra a ser identificada é comparado com comarogromas padrões. espécies micobacterianas de importância clínica. É um método relativamente simples, mas necessita de pessoal altamente treinado e o equipamento é caro e sofisticado.
Métodos moleculares
Utilizando-se a amplificação do DNA ou R A, existem várias metOdologias moleculares de Identificação das mico bactérias. Sondas genéticas específicas de identificação, PRA, MHMA, entre outras técnicas. têm sido avaliadas. Porém, o mérodo de referênoa para identificação das micobactérias é o seqüenciamento dessas estirpes.
REFERÊNCIAS 1.
11 Consenso
Brasileiro de Tuberculose. D1remzes Brasileiras para Tubercu lose. J Bras Pneumol. 2004:30 supl.l:
557-86. 2.
Bras1l. M1msréno da Saúde. Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmíssive1s e AIDS. Tuberculose - Diagnóstico Laboratorial - BaCJioscop1a. Brasília: Mi-
105
n1stério da Saúde. D1sponível em: http://www.alds.gov.br/ relelab/manual_2004.pdf. 3. Brasil. Ministéno da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Plano Nac1onal de Controle da Tuberculose. Normas Técn1cas Esuurura e Operaoonahzação. s• ed. Brasília· M1msréno da Sa.íde; 2000. 4. Brasil. M1n1sténo da Saúde. Secretana de V1gilânoa em Saúde. Guia do Programa de Vigilância Epidemiológica da Tuberculose Multirresisteme (versão preliminar). Rio de jane1ro: M1n1stério da Saúde; 2005. S.
Brasil. Min1sténo da Saúde. Sociedade de Pneumologia e T1S1ologia. Controle da Tuberculose: uma proposta de Integração ensinO-serviço. 53 ed. Rio de Janeiro: M iniStério da Saúde; D sponível em: http://porral.saude.gov.br/ porral/arqu1vos/pdf/ensino_servico.pdf . 6. CDC. Cemers for Diseases Comrol. GUidelines for the control of \lontuberculous Mycobactena 1n the North Ternrory. The Northern Termory D1sease Comrol Bu llem. 2003;10{1):14-26. Disponível em: hnp://www.m.gov. au/health/cdc/bulletin/March_2003.pdf. 7. Centers for D1sease Comrol and Prevennon (CDC). Centers for D1seases Contrai. GUidehnes for rhe control of Nontuberculous Mycobacrena 1n the North Terntory. The Nortl-ern Termory Disease Comrol Bu ller1n. 2003; lO( 1):14-26. Disponível em: http://www.nt.gov.au/ health/cdc/bulletin/March_2003.pdf.
106 [ Medicina laboratorial para o clínico
8.
Cold1rz GA. Brewer TF, Berkey CS, Wilson ME, Burdick E, F1neberg HV. et ai. Efflcacy of BCG vawne 1n rhe prevemion of ruberculos1s. Mera-analys1s of rhe published literarure. )AMA. 1994;271{9):698-702. 9. Froes GC Coutinho RL. Ávila MN, Cançado LR, Miranda SS. Perfrl e segu1mento dos paCientes portadores de Mycobanenum sp. do Hospital das Clín1cas da Untverstdade Federal de Mtnas Gerats. J Pneumologta. 2003;29{6):365-70. 10. Klaudt K. WHO predicts increase in tuberculosis deaths: map shows fatal spread of TB epidemie. Soz Pravenriv Med. 1994;39(6):395-6. 11. World Healrh Organization GUidelines for rhe prevenrion of ruberculosis 1n health-care facilrr1es 1n resourcelimited settings. Sw1itzerland: World Health Organ1zanon; D1sponível em: http://www.who.int/tb/publicanons/ who_rb_99_ 269.pdf.
11
Marcelo Grossi Araújo Ana Regina Coelho de Andrade Andréa Machado Coelho Ramos
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM MICOBACTERIOSES:
Mycobacterium leprae
A hanseníase é doença infecciosa crônica que apresenta características clínicas peculiares, pois seu agente etiológico, o Mycobacterium /eprae, tem predileção pela pele e pelos nervos periféricos. O seu tropismo por esses órgãos confere os sinais que serão a chave para o raciocínio clínico e diagnóstico, mas, sobretudo, é responsável pelo potencial incapacitante. Ao se iniciar o século XXI, a endemia segue como importante problema de saúde pública em várias regiões do mundo, no Brasil inclusive.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
A hanseníase é conhecida desde a Antiguidade e seu agente etiológico foi identificado ainda no sécu lo XIX pelo norueguês Gehrard Armauer Hansen. Apesar do grande volume de conhecimentos que se tem acumulado desde então, muitos aspectos ainda permanecem obscuros. Atinge predominantemente adultos jovens e estima-se que o número de pessoas incapacitadas pela doença se situe entre dois e três milhões. A implantação da poliquimioterapia (PQT) ou multidrogaterapia (MDT) a partir de 1982 possibilitou expressiva redução do número de casos em registro no mundo. As metas propostas para a diminuição da prevalência foram atingidas pela maioria dos países endêmicos, dos cerca de 5.4 milhões em 1985 para menos de 500.000 casos registrados em 2004. Dos 122 países que tinham a endemia como problema de saúde pública
em 1985 (mais que 1,0 caso/10.000 habitantes), 118 conseguiram baixar a prevalência para menos de 1/10.000 no âmbito nacional. Hoje, a doença permanece como problema de saúde pública em quatro países na África, América Latina e Ásia e o Brasil se inclui entre eles. Apesar da grande redução na prevalência, a detecção anual de casos novos tem se mantido ao longo dessas décadas. sinalizando redução nos últimos anos. Atualmente, trabalha-se na consolidação das metas atingidas, especialmente na manutenção da capacidade instalada em cobertura de diagnóstico e tratamento inclusive de complicações em centros de referência. Em 2006, foram diagnosticados 259.017 casos no mundo. O Brasil foi responsável por 93% dos diagnósticos feicos nas Américas. Entre os casos novos, 2.106 foram diagnosticados com grau dois de incapacidades físicas, ou seja, com seqüelas instaladas. o que significa diagnóstico tardio. Sua distribuição no território brasileiro é heterogênea. A região Sul tem dois estados que já atingiram a meta de eliminação da doença como problema de saúde pública - Rio Grande do Sul e Santa Catarina. As regiões CentroOeste, Norte e Nordeste são as mais afetadas, inclusive com alguns estados exibindo altas taxas de prevalência e de detecção anual de casos novos. É importante salientar que mesmo nos locais onde a eliminação foi alcançada, espera-se o diagnóstico de casos novos durante muitos anos, devido ao longo período de incubação da doença.
Em relação à transmissão, admire-se que as vias aéreas superiores seja m a principal porra de entrada da infecção, na qual o nariz representa papel fundamental. Esta é também a principal via de eliminação doM. leprae. A respeito da pele como porra de entrada e
O M. leprae é um parasito intracelular obrigatório, com predileção pelo macrófago e célula de Schwann, onde se reproduz, por divisão binária, num período de 11 a 16 dias. Não é cultivável em meios artifiCiais, mas existem modelos animais utilizados no seu estudo e repro-
via de eliminação da infecção, sabe-se que, embora
dução, como o tatu e camundongos timectomizados e
pacientes multibacilares possam abrigar grande número de bactérias em úlceras ou outras lesões cutâneas, apenas a inoculação acidental apóia a pele como via de entrada e não existem evidências de que a bactéria possa penetrar a pele íntegra. Os pacientes multibacilares, virgens de tratamento, são considerados fonte de disseminação da mfecção, sendo capazes de eliminar grande quantidade de bactérias viáveis pela via nasal: média de 107 microrganismos viáveis por dia. Tatus e macacos naturalmente doentes já foram encontrados, mas não se tem evidência para considerá-los parte da cadeia de transmissão ao homem. Considera-se que fatores ambientais e/ou relacionados ao hospedeiro tenham papel importante na transição infecção-doença. São raros os casos secundários entre contatos de imigrantes de áreas endémicas que residem em países não endémicos. Os fatores genéticos do hospedeiro têm importância ramo no desenvolvimento ou não da hanseníase como no padrão da doença. O rastreamenro do genoma revelou loo de suscetibilidade no cromossoma 10p13, próximo do gene do receptor C tipo 1 da manose, um receptor fagocítico preseme nos macrófagos; e também no cromossoma 6 do MHC. Os alelos HLA DR2 e DR3 estão associados à forma tuberculóide e o DQ1 à forma wchowiana. Polimorfismo no gene nramp1 está associado a formas multibacilares da hanseníase em africanos e já foi relacionado à imun idade celular para o M. leprae.
irradiados. O descobrimemo de frações antigénicas específicas, em especial o glico-fenólico-lipídico 1 (PGL-1) e o lipo arabinomanana (LAM), vem trazendo gra nde apa rte de conhecimentos e compreensão da hanseníase. Por essas características, é sabido que a produção de anticorpos específicos contra o M. leprae, como ocorre nas formas mulribacilares, é ineficaz para a eliminação dos bacilos. A eficácia da defesa é efetuada pela resposta imunológica celular, capaz de fagomar e destruir os bacilos, a partir da presença de cirocinas, TNF-alfa, IFN-gama e mediadores da oxidação, como os reativos intermediários do oxigénio (ROl) e do nitrogénio (R NI), fundamentais na destruição bacilar no interior dos macrófagos. Isso fica bem ev1denciado nas lesões tuberculó1des, onde há predomínio de células T helper, CD4 + e citoquinas de Th1, como IL-2 e IFN-gama e nas lesões virchowianas, nas quais o predomínio é de células T supressoras, CD8+ e ciroquinas de Th2. como IL-4. IL-5 e IL-10. A repercussão clínica é bem clara, com poucas lesões, poucos bacilos nas formas próximas do pólo ruberculóide e muitas lesões e muitos bacilos nas formas próximas do pólo virchowiano. Seu genoma já é conhecido, mais da metade dos genes funcionais doM. leprae está ausente e foi substituída por genes inarivos ou pseudogenes, o que se admire leve à sua dependência do hospedeiro.
ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS
O M. leprae, agente causal da hanseníase, pode ser considerado um organismo não tóxico, por ser encontrado em grandes quantidades nos tecidos, sem causar sintomas clínicos. A maioria dos sintomas e complicações da doença se deve a reações imunológicas contra os consmuinres antigénicas liberados pelo bacilo. O período de mcubação vana de dois a cinco anos.
108 ( Medicina laboratorial para o clínico
MANIFESTAÇÕES CL ÍNICAS
A hanseníase tem inú meras manifestações clínicas que são agrupadas de acordo com critérios imunológicos, baciloscópicos e clínicos, constitu indo-se, assim, suas classificações. A mais utilizada é a classificação de Madrid, em que são considerados dois pólos estáveis e opostos - virchowiano e ruberculóide - e dois grupos instáveis - indeterminado e dimorfo. Para a realização de atividades no campo, a OMS propõe a classificação determinada pelo número de lesões cutâneas. Os casos com até cinco lesões cutâneas são class1ficados como paucibacilares (PB) e os casos
com mais de cinco são classificados como multibacilares (MB), sendo que a baciloscopia positiva classifica o caso como MB. independemememe do número de lesões. As formas clínicas serão descritas a seguir, segundo a classificação de Madrid e serão apresemadas a partir do grupo inicial ou indeterminado, seguida pelas formas polares tuberculóide e virchowiana e, por último. o grupo dimorfo. Como foi visto ameriormeme. os quadros clínicos observados são resulcantes da resposta imunológica do hospedeiro.
HT é precoce e pode ser grave quando atinge uoncos nervosos sensitivos e mowres. A baciloscopia é negativa (Figura 11.2).
Hanseníase indeterminada (HI)
Caraneriza-se por manchas hipocrômicas com alteração de sensibilidade ou simplesmente por áreas de hipoestesia na pele. As lesões são em pequeno número e podem se localizar em qualquer área do tegumento cutâneo. Não existe comprometimento de troncos nervosos nessa forma clínica. A pesquisa de BAAR é negativa (Figura 11.1).
Figura 11.2 - Hanseníase ruberculó1de (Serv1ço de Dermarolog1a do Hospital das Clínicas da UFMG). \ I l r l 109
Hanseníase virchowiana (HV)
Figura 11 .1 - Hanseníase 1ndetermmada (Serv1ço de Dermarolog1a do Hosp1tal das Clínicas daUFMG). \ r OOIZ11''1 '
Hanseníase tuberculóide ( HT)
Nessa forma clínica, as lesões são constituídas por placas ou lesões anulares com bordas papulosas. cor da pele. eritematosas ou hipocrômicas, em número reduzido. francamente anestésicas e de distribuição assimétrica. Existe, ainda, a HT infantil, em crianças conviventes com portadores de formas bacilíferas. caracterizada por nódulos. placas. lesões tricofitóides ou sarcoídicas. localizadas principalmente na face. O dano neural na
Caracteriza-se pela infiltração progressiva e difusa da pele, mucosas das vias aéreas superiores, olhos. testículos, nervos, podendo afetar, ainda. linfonodos, que podem estar aumentados de volume, fígado e baço. A pele comprometida mostra-se eritemawsa ou acobreada. podem existir manchas hipocrômicas, mas predominam os elementos infiltrativos, ou seja, pápulas, nódulos e placas. A infiltração é difusa e mais acentuada na face e nos membros. Ocorre rarefação dos pêlos nos membros, cílios e supercílios. Nesses últimos. a queda de pêlo é denominada madarose. A infil cração da face, incluindo os pavilhões auriculares. com madarose, forma o quadro conhecido como fácies leoni na. A alteração de sensibilidade é notada nas excremidades e em lesões mais amigas e é mais tardia do que na HT. A HV apresenta baciloscopia fortemente positiva e representa, nos casos virgens de rratamenw, importante foco infeccioso ou reservatório da doença (Figura 11.3).
Investigação laboratorial do paciente com micobacterioses: Mycobacterium leprae
109
Figura 11.3 - Hanseníase wchow1ana (Serv1ço de Dermarolog1a do Hosp1ral das Clin1cas da UFMG)., ., pagmo 111 Hanseníase dimorfa (HD)
As lesões da pele são numerosas e a sua morfologia mescla aspecros de HV e HT, podendo haver predominância ora de um, ora de outro ripo. Compreende placas eriremarosas, manchas hipocrômicas com bordas ferruginosas, manchas eriremarosas ou acastanhadas, com limite interno nítido e limites externos imprecisos (lesões pré-foveolares), placas eritêmaro-ferruginosas ou violáceas, com bordas internas nítidas e limites externos difusos (lesões foveolares). As lesões são anestésicas ou hipoestésicas. As lesões neurais são precoces, assimétricas e freqüentemente levam a incapacidades físicas. A baciloscopia pode ser negativa ou positiva (Figura l1.4).
Figura 11.4 - Hanseníase d1morfa (Serv1ço de Dermarologia do Hospl(al das Clíntcas da UFMG). \ler pag:no 1I Surtos reacionais
Os surtos reacionais em hanseníase ou reações hansênicas são episódios inflamatórios agudos devido à hipersensibilidade aos antígenos bacilares doM. /eprae. São abordados como doença imunológica, demandando
cuidados e tratamento especiais. São situações de emergência e necessitam de atenção e rraramenw adequado e imediaw, procurando-se evitar, assim, a instalação de dano neural irreversível, principal responsável pela manutenção do estigma da hanseníase. Os surws reacionais podem ocorrer ames do tratamenco, na época do diagnóstico, durante o tratamento com a poliquimioterapia ou após o tratamento. Seu diagnóstico é essencialmente cl ínico. Dependendo da época do seu aparecimento, deverá ser feiro o diagnóstico diferencial com recidiva. Essa situação é suspeitada nos pacientes que desenvolvem reações depois de muicos anos de alta e sem imercorrências reacionais anteriores. Nesse caso, a propedêutica é a mesma já descrita para um caso suspeito. Serão discutidos os dois tipos de reações mais freqüentememe observados: a) reação ripo 1 ou reação reversa - associada à hipersensibilidade celular; b) reação tipo 2 ou eritema nodoso hansênico - relacionada à deposição de imunocomplexos. O Quadro 11.1 mostra as diferenças entre os dois tipos de reação: Quadro 11 .1 - Diferenças enrre reação ripo 1 e 2 Sinais e sintoma s Formo clínico
Reação Tipo I
Reação Ti po 11
Tuberculóide e
Dimorfo e virchowiona na maioria dos casos Multibocilores
dimorfo na maioria dos casos Paucibacilores e multiba cilares Área envolvido
Mais localizado nas lesões preexistentes
Generalizado/ sistêmico
Inflamação do pele
As lesões de pele estão inflamadas (eritemo e edema). mas o resto do pele está normal
Novos nódulos sensíveis ao toque, vermelhos/violáceos, independ entemente do localização dos lesões preexistentes do honseníose
Acometimento neural
Freqüente
Menos freqüente
Estado geral do paciente
Bom, sem febre ou com febre baixo
Ruim, com febre e mol·estor geral
Tempo de aparecimento e tipo de paciente
Precocemente Mais tardiamente no durante o PQT; tonto curso do trotamento; em pacientes PB somente nos MB quanto M B
Envolvimento ocular
Fraqueza muscular ao fechamento dos pálpebras
Acometimento de portes internos do olho (lrile)
110 [ Medicina labo rarorial para o clínico ]1-- - - - -- - -- - - -- -- -- - -- - -- - - - - - -- --
O dano neural pode ocorrer sem inflamação de pele e deve ser [ra[ado como uma reação [ipo 1.
fácil realização e estarão alterados na pele, que apresenta dano na inervação, independemememe de sua etiologia.
ABORDAGEM LABORATORIAL
EXAMES GERAIS
O diagnóstico e a classificação da hanseníase são baseados, tradicionalmente, no exame clínico e na análise de esfregaços de lesões cutâneas (baciloscopia). Definese como caso de hanseníase um indivíduo que apresenta uma ou mais das seguintes características e que ainda esrá para completar um curso do tratamento: • lesões cutâneas hipopigmentadas ou avermelhadas, com perda da sensibilidade; • acometimento de nervos periféricos, demonstrado por espessamento neural com perda de sensibilidade; • esfregaço de lesão cutânea positivo para BAAR.
O exame anatomopacológico da pele deve ser realizado nos casos que ofereçam dúvidas para o diagnóstico ou classificação. Esse exame é feico em fragmento de pele obtido por biópsia de lesão cutânea suspeita de hanseníase. As alterações hisropacológicas da hanseníase indeterminada mostram na derme infiltrado inflamatório linfo-h1stiocirário em corno de anexos, vasos e filetes nervosos. O quadro hiscopacológico da hanseníase tuberculóide mostra granulomas constituídos por células epitelióides, células gigantes e halo linfocirário. O infiltrado inflamatório pode agredir a epiderme, os nervos e os filetes nervosos. O quadro hiscopacológico da hanseníase virchowiana é característico. A epiderme mosrra-se arrófica. sendo separada da derme por uma fa1xa estreita de colágeno, livre de infiltrado inflamatório, denom1nada faixa de Unna. A derme e o subcutâneo são comados por histióciros. muiros deles repletos de BAAR e em processo de degeneração li poídica. Tais hisrióciros são as células de Virchow. O quadro histológico da hanseníase dimorfa mostra estruturas granulomarosas ou predominância de macrófagos vacuolizados com positividade de BAAR. Por vezes esses achados coexistem em um mesmo fragmento de pele.
A palpação de nervos é feira com o objetivo de se pesquisar possíveis alterações neurológicas provocadas pela hanseníase. Deve-se fazer a palpação dos nervos acessíveis e a avaliação funcional (sensitiva, motora e autonômica) daqueles ma1s freqüentemente acometidos pela doença. É importante lembrar que qualquer ramo ou tronco nervoso superficial poderá ser afetado. Na palpação, deve ser avaliado o calibre do nervo, a presença de dor, fibrose ou nodulações, sempre em comparação com o nervo contralacerai. Os principais nervos comprometidos são o ulnar, mediano e radial nos membros superiores, o fibular comum e o tibial posterior nos membros infenores e o fac1al e grande auricular no segmento cefálico. O reste de sensibilidade mais difundido e passível de ser executado em qualquer consultório médico inclui a avaliação de sensibilidade térmica, dolorosa e tátil. Para a sensibilidade térm1ca. são utilizados tubos de ensaio contendo água fria e morna. Na pele que tem dano na inervação, não é possível fazer a distinção entre os tubos. A sensibilidade dolorosa é pesquisada com agulha descartável, na pele lesada o paciente não consegue discernir entre a ponta e o fundo da agulha. A sensibilidade tá til pode ser avaliada tocando-se a pele do paciente com ch umaço de algodão e sol1mando que os locais tocados sejam apontados. Em caso de dúvida no reste de sensibilidade. deve se lançar mão de provas complementares, que são o teste da histamina e da pilocarpina. Esses testes são de
INVESTIGAÇÃO MICROBIOLÓG ICA Baciloscopia
Esse é o exame complementar mais útil no diagnóstico, embora possa ser negativo nas formas paucibacilares, conforme já diro. O exame baciloscópico é realizado no momento do diagnóstico. Trata-se de procedimento simples no qual se procede à pesqu isa de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), em material obtido de raspado de tecido dérmico. O material deve ser colhido nos lóbulos das orelhas, cocovelos ou em lesão suspeita, substituindo um dos cotovelos. Não se recomenda a baciloscopia do muco nasal, tendo em vista a possibilidade de confusão
Investigação laboratorial do paciente com micobacterioses: Mycobacterium leprae
111
com micobacrérias atípicas saprófitas, traumatismo e sangramenro nasal. A coloração é feita pelo método de Ziehi-Neelsen e o resultado é apresentado sob a forma de índice baciloscópico (IB), numa escala logarítmica que vai de O a 6+, isro é, de nenhum bacilo em 100 campos
a reação é sempre negativa, assim como em alguns casos de HI e HD e em 5 a 20% da população geral. Atualmente, não se recomenda a aplicação rotineira da reação de Mirsuda.
examinados acé mais de 1.000, em média, por campo, em 25 campos examinados. O IB dos pacientes tratados diminui lentamente até chegar a zero. Essa queda ocorre durante e após o término da poliquimioterapia (PQT). Dimin ui, em média, de 0,6 a 1,0 por ano, o que sign ifica que um paciente com IB inicial de 4+ levaria de quatro a seis anos para se tornar negativo (Figura 11.5).
Figura 11.5 - Mycobactenum leprae em glob1as, corados em vermelho (aumento de lOOOx). Ver pagma 112
A baciloscopia é negativa (IB=O) nas formas tuberculóide e indeterminada; fortemente positiva na forma virchowiana; e mostra resultado variável na forma dimorfa. A baciloscopia negativa não exclui o diagnóstico de hanseníase.
Testes sorológicos
Os restes sorológicos não podem ser utilizados para diagnóstico, pois detectam, indireramente, a presença de bacilos; portanto, não são úteis nos casos paucibacilares, que não apresentam níveis detectáveis de anticorpos séricos. A sensibilidade desces é de 80 a 90% nos casos mulribacilares e 30 a 60% nos casos paucibacilares. O antígeno glico-fenólico-lipídico 1 (PGL-1) é específico do M. leprae e leva à formação de anticorpos da classe lgG e lgM. Os títulos de lgM têm sido correlacionados com a forma clínica e atividade da doença. Níveis aumentados do antiPGL-1 têm sido descritos na HV e rendem a decrescer com o tratamento específico. Por outro lado, na HT os anticorpos tendem a ser negativos. Vários estudos têm sido feitos buscando-se estabelecer ligação da positividade ao antiPGL-1 e o risco de adoecer ou infecção subclínica, mas ainda sem concordância definitiva. Várias técnicas foram desenvolvidas para a detecção de antiPGL-1 - ELISA. MPLA DI PSTICK. Destaca-se o MLF/ow, rápido e simples, que pode ser utilizado com sangue ou soro. É um teste semiquantitativo e imunocromárico, de um só passo, no qual o reagente de detecção com lgM anti-humana vem inserido num dispositivo. Usa tecnologia de fluxo lateral e pode ser feito no campo.
Reação de Mitsuda Métodos moleculares É um teste de aplicação intradérmica e leitura tardia,
feita em 28 dias. É utilizado para classificação e prognóstico, não rem valor para o diagnóstico. O antígeno de Mitsuda é uma suspensão de bacilos, substâncias lipídicas dos bacilos, células e restos de bacilos em solução salina fenicada, obtida de lesões ricas em bacilos (hansenomas), de origem humana ou animal. lnjera-se 0,1 ml dessa solução na face anterior do antebraço e a leitura deve levar em conta a formação de pápula maior ou igual a 5 mm. O teste positivo é encontrado na HT. em alguns casos de HIe HD e em 80 a 95% da população geral. Na HV.
A identificação do M. /eprae pela reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido eswdada em centros de pesquisa, mas não é realizada rotineiramente. É altamente sensível e específica, detecta o M. leprae em 95% dos pacientes multibacilares e 55% dos paucibaci lares.
Outros exames
Muitas vezes deverá ser feito o diagnóstico diferencial com várias dermatoses e neuropatias periféricas, o
112 [ Medicina laboratorial para o clínico )1-- - -- -- - -- -- -- - - - - - - - - - - - - - - - - -
que pode levar à realização de exames complementares mais complexos. Emre estes. o escudo da condução sensitiva e mocora dos nervos periféricos é útil no diferencial com as neu ropatias periféricas. A hanseníase produz lesões do tipo mononeurite múlcipla e os nervos são comprometidos nas suas porções mais distais. nos pomos onde sofrem conscrições anatômicas pelas esuuturas osteoligamencosas e nas partes mais próximas da superfície cutânea. Exames inespecíficos podem moscrar-se alterados espeoalmeme na HV e nos surtos reaciona1s. Na HV de longa evolução, é comum a observação de anemia, leve a moderada, normocírica e normocrômica. A velocidade de hemossedimentação e a proteína C reativa podem estar aumentadas nas reações. assim como os leucócitos. que podem chegar à casa dos milhares (reação leucemóide). O sedimento urinário também pode se alterar durante as reações do tipo 2, assim como enzimas hepáticas (AST. ALT). Exames falso-positivos, como o VDRL e FAN, anticorpos antifosfolípides são descriros na HV. Deve-se lembrar que na HV de longa evolução, com múltiplos episódios reacionais. pode se desenvolver o quadro de amiloidose sistêmica secundária, com comprometimento de vários órgãos. especialmente rins. e da função renal.
TRATAMENTO O tratamento da hanseníase compreende a quimioterapia específica. supressão dos surros reacionais. prevenção de incapacidades físicas e reabilitação física e/ou psicossocial. Esse conjunto de medidas deve ser desenvolvido em serviços de saúde da rede pública ou particular, mediante notificação de casos à autoridade sanitária competente. As ações de controle são realizadas em níve1s progressivos de complexidade, dispondo-se de centros de referência locais, regionais e nacionais para o apoio da rede básica. O Ministério da Saúde (MS) regulamenta o assunto pela portaria de número 1.073/GM publicada em 28/09/2000 no Diário Oficial da União, disponível no site www.saude.gov.br. Na indicação do esquema terapêutico, deve-se levar em conta roda a história clínica do paciente, com especial atenção para alergias a medicamentos, interação de drogas e doenças associadas. A definição do esquema a
ser empregado depende da classificação final do caso. O MS do Brasil adora a classificação operacional citada. que tem os seguintes critérios: • paucibacilares (PB) - têm até cinco lesões de pele. Estão incluídos neste grupo os casos das formas clínicas indeterminada e ruberculóide; • multibacilares (MB) - têm mais de cinco lesões de pele. Estão incluídos neste grupo os casos das formas clínicas dimorfa e virchowiana; • a baciloscopia, quando é positiva. classifica o caso como MB, independentemente do número de lesões. Os esquemas terapêuticos arualmenre adorados são chamados poliquimioterapia (PQT) ou multidrogarerapia (MDT). recomendados pela Organização Mundial de Saúde (OMS). com a finalidade de diminuir os índices de sulfonorresisrência e aumentar a adesão de pacientes ao tratamenco. São empregados desde 1982 e já foram utilizados por mais de 14 milhões de pacientes em rodo o mundo, sendo considerados seguros e eficazes. São formados por duas drogas (esquema PQT paucibacilar - PB) ou três (esquema PQT multibacilar - MB). de acordo com a classificação clínica do caso. Os percentuais de recidiva observados com esses esquemas têm sido considerados baixos As drogas usadas nos esquemas padronizados pela OMS e MS são: nfampicina. considerada bactericida forte; e dapsona e clofazimina, bactericidas fracas. Os esquemas alternativos são previstOs para os casos de intolerância medicamentosa. utilizados pelos centros de referência e fogem ao objetivo deste texto. O MS recomenda os esquemas PQT-PB e PQT-MB da OMS. que têm como pri ncípio a associação de drogas e a inclusão de droga bactericida. O fornecimento da medicação é gratuito em todo o país. O esquema a ser empregado depende da classificação do caso: PB indeterminada e ruberculóide (até cinco lesões). bacterioscopia negativa: a) rifampicina - 600mg/dose. feira sob supervisão; b) dapsona -100 mg/dia, auro-adminisrrada. São programadas seis doses que deverão ser feitas em até nove meses. Grande parte dos pacientes ainda terá lesões clinicamente ativas ao final do tratamento. que sofrerão regressão progressiva até desaparecerem. deixando muitas vezes área de hipocromia ou pele de aspecto cicatricial com sensibilidade diminuída.
Investigação laboratorial do paciente com micobacterioses: Mycobacterium leprae
113
• MB - dimorfa e virchowiana (mais que cinco lesões), bacterioscopia positiva no HV positivo ou negativo na HD; • rifampicina - 600 mg/dose, feita sob supervisão; • clofazimina - 300 mg/dose, feita sob supervisão; • dapsona - 100 mg/dia auco-adminisuada; • clofazimina - 50 mg/dia aura-administrada.
comprometem órgãos ou estruw ras nobres, tais como nas neurites, artrites. mão reacional e orquite. Eventualmente, é necessário o uso de várias drogas simultaneamente.
São programadas 12 doses em até 18 meses. Da mesma forma que nos PB, muiws terão lesões at1vas ao f1nal do esquema, que sofrerão regressão progressiva. A bacterioscopia também se reduz lentamente após a PQT. As doses citadas nos dois esquemas são para pacientes adulcos pesando 60kg ou mais. Para o tratamento das reações, o diagnóstico deve ser preciso para a escolha adequada das drogas. O tratamento precoce das reações é de grande valor para a prevenção de incapacidades, principalmente para evitar o dano neural. A busca por facores desencadeantes deve ser rocineira, especialmente para infecções imercorrences. A reação do tipo 1 ou reversa pode ser tratada com analgésicos ou amunflamatórios não hormonais (AINES), quando o quadro clínico for d1screco e sem neurites. Os pac1ences que apresentam neurire, placas reacionais extensas sobre trajeco nervoso ou com risco de ulceração devem receber prednisona na dose de 1 a 2 mg/kg/dia até regressão do quadro, quando então se 1nioa a redução progressiva do comcóide. A dose de manutenção deve ser mantida por período mínimo de dois meses. A imobilização do membro afetado pela neurite e fisiorerap1a na fase de recuperação são medidas complememares necessárias em alguns casos. Neurites refratárias aos corticóides poderão necessitar de tratamento cirúrgico. As manifestações clín1cas da reação do tipo 2 ou eritema nodoso são bastante polimorfas e muitas vezes têm caráter subencrante, arrastando-se por meses ou anos. As drogas usadas são analgésicos e AINES para casos leves de eritema nodoso e a talidomida é droga de primeira escolha nas reações moderadas. Seu uso em mulheres na idade fértil é regulamentado e deve ser feiro com codos os cuidados para garantir-se contracepção adequada, considerando seus efeicos terarogên1cos. Na impossibilidade de se usar a talidomida, podem ser usadas a clofazimina, pentoxifilina ou prednisona. A prednisona está indicada nos casos graves ou nas reações que
Os contatos domiciliares devem ser examinados em busca de sinais clínicos de hanseníase. É feico o exame da pele e nervos periféricos (exame dermaconeurológico). Os que se apresentam sem lesões deverão ser avaliados quanto à presença de cicatriz de BCG e vacinados, caso não a tenham. São preconizadas duas doses de vacina BCG por via incradérmica, com intervalo de seis meses para os que não foram vacinados. Os contacos saudáve1s e vacinados devem ser aconselhados a relatar imediatamente o surgimento de qualquer lesão cutânea. A vacinação com BCG fornece proteção variável contra a hanseníase. Estudos em diferentes pa íses mostram percentuais que vão de 34 a 80%. A quimioprofilaxia Já foi utilizada no passado e atualmente vem sendo avaliada em escudos desenvolvidos em países endémicos. Atualmeme. não é recomendada como medida profilática no Brasil. A educação dos pacientes é fundamental para o sucesso terapêutico. O paoente precisa saber que alguns dias após o início do tratamento ele já não transmite a doença. podendo levar v1da social normal. O esclarecimento de dúvidas e a discussão de mitos auxiliam na adesão ao tratamento. O acompanhamento mensal. além de ajudar na adesão, permite a educação contínua e a detecção precoce de reações ou de agravamento de incapacidades físicas. Da mesma forma, a educação em saL1de nas comunidades, enfatizando que a hanseníase tem cura e que o tratamento previne incapacidades físicas, é importante para os programas de controle. pois estimula a apresentação precoce de pacientes, ames que ocorra o comprometimento nervoso e surgimento de seqüelas. O diagnóstico precoce e o tratamento adequado com PQT de codos os casos continuam sendo os pomos fundamentais nos programas de controle da hanseníase. É preciso garantir o compromenmenco permanente da sociedade para com o controle da hanseníase, pois essas medidas serão necessárias durante décadas até que a hanseníase possa ser considerada doença do passado.
114 ( M edicina laboratoria l para o clínico
PROFILAXIA E MEDIDAS DE CONTROLE
)1--- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - -
CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS 1.
A hanseníase é uma infecção crônica da pele e nervos periféncos, endêmica em várias regiões do mundo, inclusive no Brasil. Seu diagnóstico baseia-se na demonstração de alterações sensitivas em lesão cutânea, no achado de espessamento neural com repercussões funcionais e/ou na demonstração do M. leprae na pele. Apesar do diagnóstico simples e barato para a maioria dos casos e de ser facilme nte tratada e curada, permanece como importante agravo de saúde pública. Embora considerada eliminada como problema de saúde pública em várias regiões e países, quando se considera a prevalência da doença, ou seja, os casos em registro, a situação quanto à detecção de casos novos (incidência) não tem sofrido impacto importante nas últimas décadas. t preocupante a prevalência oculta (casos esperados e não diagnosticados) e o diagnóstico tardio em muims programas, aspectos que poderão comprometer os progressos alcançados. Permanece o desafio de se tratar a doença imunológica conhecida como reação, que afeca percentual significativo de pacientes, é causa importante de sofrimento físico e emocional e é responsável. em grande parte, pela manutenção do estigma e por perdas econômicas para o indivíduo e a sociedade.
2.
3.
AraÚJO M G. Hanseníase no Bras1l. Rev Soe Bras M ed Trop. 2003;36:373-82. Bmton WJ. Lockwood DN. Leprosy. Lancer. 2004;363:1209-19 Hast1ngs. RC. Leprosy. ew York: Churchill LJvJng-
smne;1994. 4. Lockwood DN, Suneetha S. Leprosy: too cornplex a d1sease for a simple el1m1nation paradigm. Buli World Healrh Organ. 2005:83;230-5 5. Lockwood DN. Leprosy elim1nation-a wrual phenomenon or a realiry1 BM). 2002;324(7352):1516-8. 6. Me1ma A, Smith WC. van Oortmarssen GJ, R1chardus JH, Habbema JD.The future Jnc1dence of leprosy: a scenano analys1s. Buli World Health Organ. 2004;82:373-80. 7. Moschella SL. An Update on the dJagnos1sand Lrearmem of leprosy. JAAD. 2004;51:417-26. 8. Talhan S, Neves RG, Penna GO, OliveJra MLW. Hanseniase. Manaus: Ed1mra Lorena, 2006. 9. World Health Organ1zat10n. Global leprosy SJtua[lon, 2007. Wkly Ep1demiol Rec. 2007;82:225-32.
Investigação laboratorial do paciente com micobact erioses: Mycobacterium leprae
115
/
6tl/\
Ô~Ult'
12
Luciana de Gouvêa Viana
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM MENINGITE INFECCIOSA
INTRODUÇÃO Meningice é um processo inflamacório das menin ges, membranas que revescem as esuuwras anatômicas componemes do sistema nervoso cemral (SNC). As meningites podem escar relacionadas a uma variedade de causas. infecciosas e não infecciosas. As de origem infecciosa, em parcicular a doença meningocócica, a meningite wberculosa, a meningite por Haemophilus influenzae ripo B (Hib), a meningice por pneumococo e as meningites virais são as mais importames na perspeniva da saúde pública, pela magn icude de sua ocorrência, pmencial de uansmissão, pawgenicidade e relevância social. Traca-se de uma doença de notificação compulsória e de investigação obrigacória. Todo caso suspeito deve ser comunicado, pela via mais rápida, ao órgão de saúde do município ou, na impossibilidade deste, à Direwria Regio nal de Saúde à qual o município escá jurisdicionado. Um grave problema enfremado pelo Brasil é a subnotificação dos casos. Recomenda-se, pois, uma ação conjuma dos geswres municipais dos serviços de saúde e cécnicos de vigilância epidemiológica no sentido de consciemizar profissionais de saúde da importância da nmificaçâo oporruna de todo caso suspeito, além dos adequados procedi mentos de busca aciva de casos.
Por outro lado, é fundamental que os serviços de saúde locais se esuuwrem para a realização da invescigação dos casos nocificados. Para cal, pressupõe-se a exiscência de laboratórios locais e macrorregionais com capacidade técnica que possibilitem a realização, em tempo hábil, dos exames laborawriais imprescindíveis ao diagnóstico eciológico. O quadro clínico da doença pode variar de acordo com a etiologia, mas em geral a doença é grave e pode evoluir para óbito. O prognóstico das meningites depende fundamentalmente do diagnóscico precoce e da instituição imediata de uacamemo adequado.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO ASPECTOS EPIDEMIOLÓG ICOS E AGENTES INFECCIOSOS As meningices infecciosas apresemam discribuição universal, ocorrendo de forma endêmica em algumas regiões. Sua cransmissão é favorecida pela aglomeração domicil iar, com aumemo do número de casos nos meses em que a cemperawra ambieme é mais baixa. Os enterovírus cambém apresentam comporcamento sazonal, predominando na primavera e verão. No Quadro 12.1 têm-se os principais agentes etiológicos das meningites infecciosas.
Quadro 12.1 - Agenres enológtcos das meningitesmfecciosas
crescente, são: echovírus 30, 11, 9, 6, e 7; coxsackievírus B2 and A9; echovírus 18 e 16; coxsackievírus B1 e B3; ente-
Bactérias
Escherichia coli Hoemophilus mfluenzoe Klebsrello Lisrerio monocyrogenes Neisseno menil1gitidis Proreus Pseudomonos oerugmoso Solmonello Serraria marcescens Srophylococcus aureus Stophylococcus eprdermidis Srreplococcus do g rupo B Srreplococcus pneumonia Micabocténas Espiroqueto s: Leptospiro,
Vírus
Fungo5
Treponemo
Vírus RNA: Arbovírus Enterovírus HIV Vírus do caxumba Vírus do coriomeningite linfocilário Vírus do sarampo Vírus DNA: Adenovírus Citomegalovírus Epstein Borr Herpes simples tipo 1 e 2 Varicela zoster
Condido Criptococo Hlstop losmo
Outros porosiros
Ameba A ngioslfongylus comonensis Cisticerco Esquistossomo Plosmódio
Strongyloides slercorolis Toxoplosmo Tnponosomo
Meningite virai Vírus são as principais causas de "meningite asséptica", termo usado para defintr qualquer meningite, infecciosa ou não, na qual se observa pleocirose linfocícica sem definição da ettologia empregando-se as metOdologias diagnóscicas usuais. Os enterovírus são responsáveis por cerca de 90%
rovírus 71; coxsackievírus B4 e echovírus 25. Santos et a/. (2006), em trabalho realizado no período compreendido de 1998 a 2003 nos estados do Rio de janeiro, Pernambuco, Rio Grande do Sul e Paraná, analisando 1.022 amoseras de líquido céfalo-raqutdiano (LCR) procedentes de pacientes com idades entre 28 e 68 anos, isolaram enterovírus em 162 (15,8%) casos; destes, o echovírus 30 fo i identtficado em 85,2% dos casos, coxsackievírus B5 em 3,7%, echovírus 13 em 3,7%, echovírus 18 em 3%, echovírus 6 em 1,2%, echovírus 25 em 1.2%, echovírus 1 em 0,6% e echovírus 4 em 0,6%. O vírus da coriomeningite li nfocitária é de ocorrênCia rara, sendo transmitida por roedores pelo conraro direco ou indireto com as suas excretas. A via de u ansmissão é a digestiva, pela contaminação de alimentos com a urina do roedor ou exposição de feridas. Não há evidências da transmissão homem-homem. Os herpesvírus incluem o herpes simples tipos 1 e 2, varicella-zoster, citomegalovírus, vírus Epstein-Barr e hespesvírus humano 6, 7 e 8. As complicações neurológicas associadas à infecção pelos herpes simples tipos 1 e 2 são as mais significativas e representam 05 a 3% das "meningites assépticas". São quadros aurolimttados, porém, quando cursam com encefalite, são potencialmente fatais e estão associados ao HSV-25. Cicomegalovírus e vírus Epstein-Barr podem causar meningite em associação com a mononucleose. particularmente em pacientes imunocomprometidos. No grupo dos arbovírus, merece destaque o vírus do Nilo Ocidental, que nos últimos anos tem sido responsável por vários casos de encefalite e meni ngite em indivíduos acima de 50 anos, pnncipalmente na Aménca do Norte. O vírus da imunodeficiência humana (HIV) pode ultrapassar as meninges precocemente e permanecer no SNC após a infecção inicial. Meningite associada ao HIV
das meningites viróticas nos Estados Unidos. Dados do Centers for Dtsease Contra/ and Prevention (CDC) indi-
pode ocorrer na infecção primária ou tardiamente. Escudos retrospectivos revelam freqüência de 5 a 10% de meningoencefalite aguda em pacientes infectados pelo HIV durante ou após a síndrome mononucleose-/ike_ Em populações não vacinadas, o vírus do sarampo é uma das causas mais comuns de "meningite asséptica". Tal man ifestação pode ocorrer em 10 a 30% dos casos
cam que os enterovírus predominantes, em ordem de-
da doença, sendo usualmente benigna e aucolimitada.
118 [ Medicina laboratorial para o clínico
Crianças do sexo masculino são duas a cinco vezes mais aferadas e o pico de incidência encontra-se entre cinco e nove anos. Casos de meningite associados à vacinação têm sido relatados. O vírus da caxumba é um agente comum em população não imunizada, predominando entre préescolares. escolares e estendendo-se a adolescentes e adulros jovens. Até 50% dos casos evoluem para cura emre sete e 10 dias.
Me ningite bacteriana
Haemophilus inf/uenzae, Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae são responsáveis por mais de 80% dos casos de meningite bacteriana. Listeria monocytogenes contribui com aproximadamente 8% dos casos. destacando-se os sorocipos 1/2b e 4b. os quais estão associados a mais de 80% das meningites causadas por este microrganismo. Streptococcus do grupo B. Staphylococcus ep1dermid1s, Staphylococcus aureus. Klebsiella. Escherichia coli. Serra tia marcescens, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella também são causas de meningite aguda. H. influenza já foi responsável por cerca de 50% de rodos os casos de meningite bacteriana e. arualmeme, responde por menos de 10%. A ma1ona dos episódios registrados ames da introdução da vacinação amiHaemophilus ocorria em crianças com idade inferior a seis anos, com pico de incidência emre seis e 12 meses. No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde. durame o período pré-vacinação de 1990 a 1999. o coeficiente de incidência anual de meningite por Hib em crianças com até um ano e até quarro anos de idade foi de 22,3 e 8,8 casos por 100.000 habitantes, respectivamente. Regisrraram-se 19.9 e 17,1% de letalidade nos respectivos grupos. Dados aruais informam impacro altameme positivo da vacinação anti-Hib a partir de 1999, com redução de 95% na incidência de meningites por H. influenza em menores de cinco anos. A ocorrência de meningite por H. mfluenza em crianças maiores e adulcos sugere a presença de alguma condição de base que favoreça o desenvolvimento da doença. tais como sinusite, mire média, epiglorire. pneumonia, diabetes melico, alcoolismo, espleneccomia e imunodeficiência.
A doença meningocócica (DM), causada pela N. meningitidis, rem ocorrência em praticamente rodo o mundo. Nos últimos anos, a incidência em países desenvolvidos apresema variação de menos de um caso por 100.000 habitantes (França e Estados Unidos) até 4-5 por 100.000 habirames (Inglaterra e País de Gales, Escócia e Espanha). A doença apresenta-se em forma hiperêndemica na região do subSaara africano, sendo que alguns países chegam a apresentar incidência anual de 150 casos por 100 mil habitantes. Os principais sorogrupos de N. meningitidis são: A, B, C Y e W135, sendo que o sorogrupo A rem registrado maior potencial epidêmico. enquanto os subgrupos B e C ocorrem predominantemente de forma endêmica, contudo, também podem desencadear epidemias. O Brasil registrou uma gra nde epidemia de menmglte meningocócica na década de 70. a qual teve ep1centro em São Paulo e alamou-se por mdo Brasil. A parm dos anos 80. houve mudança 1mporrante no comporramenw ep1dem1ológico da doença. com desaparecimento do sorogrupo A e predomínio do sorogrupo B. Durante a primeira metade dos anos 90. observou-se aumento no número de casos nmificados. com pico em 1996 à custa. principalmente, de surtos localizados nos estados de São Paulo, Rio de janeiro e R10 Grande do Sul. A parm de 1996, tem-se observado redução constante no número de casos. de 7.321 naquele ano, para 2.923 casos em 2003. Segundo dados do Sistema Nacional de Agravos Notificáveis da Secretaria de Vigilância em Saúde (Ministério da Saúde), o coeficiente médio de incidência da DM é de 3.32/100.000 habitantes (1994 a 2003) e a letalidade no período corresponde a 19.4%. S. pneumoniae responde por aproximadamente 47% dos casos de meningite bacceriana, com letalidade de 19 a 26%. Existe forte associação entre a ocorrência de meningite e a presença de infecção pneumocócica em foco contíguo ou à distância, como pneumonia. mite média, masmidite. sinusite e endocardite. Esplenecmmia, mieloma múltiplo, hipogamaglobulinemia. alcoolismo, desnutrição. insuficiência renal crônica. neoplasias e diabetes melim são condições associadas à maior susceptibilidade à infecção pneumocócica. L. monocytogenes é responsável por 8% dos casos de meningite bacteriana nos Estados Unidos. com taxa de mortalidade entre 15 e 29%. Os sorotipos 1/2b e 4b estão associados a 80% dos casos. A infecção é mais comum em recém-nascidos, adulros com mais de 60 anos, porta-
lnvesrigação laborarorial do pacienre com m eningire infecciosa
119
dores de câncer e doenças auco-imunes, imunossuprimidos e pacientes submetidos à corticorerapia. Streptococcus do grupo B é um importante agente etiológico de meningite neonatal. Este tem sido isolado em culturas de secreção vaginal e retal de gestantes as-
nica. O Cryptococcus neojormans. um bas1diomicero que se apresenta em sua forma parasitária como levedura anamorfa capsulada. é um fungo cosmopolita, que vive em solos contaminados com excretas de pombos ou de outras aves em regiões tropicais e de climas temperados. De
simomáricas. Acredira-se que ocorra colonização rran-
acordo com aclassificação arual, Cryptococcus neojormans possui três variedades: Cryptococcus neoformans (sorotipo A), var. grubii, Cryptococcus neoformans (sorotipo D), var. neojormans, sendo ambas variedades de ampla distribuição mundial. e Cryptococcus neoformans (sorotipo Be C).
sitória, intermitente e crônica, a qual rep resenta 40% dos casos. Em ad ulros. meningite por Streptococcus do grupo Bestá associada à idade superior a 60 anos. diabetes melito. gravidez e pós-parto, colagenoses vasculares. neoplasias, alcoolismo, falências hepática e renal, bexiga neurogênica. úlcera de decúbito e corticocerapia. Bastonetes Gram negativo aeróbios. tais como Klebsielfa spp, E. coll, Serratta marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Salmonelfa spp, têm se destacado como agentes etiológicos de meningites bacterianas. Tais estão particularmente associados a recém-nascidos. idosos, pacientes imunossuprimidos, pacientes submetidos a cirurgias neurológicas e vítimas de traumatismo craniano. Meningite causada por S. aureus está usualmente associada a cirurgias neurológicas e traumas e a condições como alcoolismo, diabetes melito, insuficiência renal crônica, neo plasias e uso de drogas injetáveis. Infecções adquiridas na comunidade geralmente estão associadas a sinusite, pneumonia e osteomielite. A mortalidade é bastante variável, sendo citadas taxas entre 14 e 77%. S. epidermtdts, por sua vez. está fortemente associado à meningite pós-derivação liquórica. Na meningite pósprocedimentos neurocirúrgicos. têm-se isolado germes anaerób1cos. principalmente o Proptonebactenum acne. As espiroquetas também são agentes etiológicos das meningites. Além da meningite sifilítica, a neurossífilis apresenta-se como três outras síndromes distintas: sífilis memngivascular, neurossífilis parenquimatosa e neurossífilis gomatosa. A incidência de meningite sifilítica é maior nos primeiros dois anos após a infecção e estima-se que ocorra em apenas 0,3 a 2,4% dos casos de sífilis não tratada. Ressalta-se a importância da cc-infecção Treponema/ HIV, pois aproximadamente 1,5% dos paCientes apresentm neurossífilis em algum momento da doença.
Meningite fúngica
A meningite criptocócica se manifesta de diversas formas. destacando-se a meningoencefalite subaguda a crô-
120 (
Medicina laboratorial para o clínico
pertencentes à variedade gattii,limitada às regiões tropicais e subtropicais do mundo. Um sorot1po híbrido AD pode ser identificado por técnicas moleculares. O Cryptococcus neoformans var. gattii tem sido isolado mais freqüentemente de indivíduos imunocompetentes. ao passo que C neoformans var. neojormans está fortemente associado ao estado de imunodeficiência decorrente da AIDS. Ressaltase, também, a importância epidemiológica da doença em paCientes portadores de neoplasias hematológicas e em corticoterapia de alcas doses. Meningite associada à infecção por Histoplasma capsu/atum é rara. Entretanto, em um quarto dos casos de meningite por Histoplasma, a doença está confinada ao sistema nervoso central. Nestes casos. o diagnóstico é problemático. devido à limitação em sensibilidade da cultura e em especificidade das pesquisas sorológicas. Os dados epidemiológicos e co-morbidades do pacientes tornamse extremamente relevantes, pois há forte assoCiação com imunodeficiência. Meningite por Candtda está geralmente associada à doença disseminada e também é rara. Os fatores de risco são os mesmos da candidemia. incluindo terap1a amimicrobiana prolongada, corticoterapia de altas doses. uso de drogas de abuso injetáveis, cirurgia intraabdominal recente, entre outros.
Meningite por outros agentes
A meningite eosinofílica é uma infecção do SNC causada principalmente por hel mintos, porém outras infecções ou processos não infecciosos também podem estar associados. Entre os helmintos. destacase o Angtostrongylus cantonensis. um nematódeo que tem como hospedeiro definitivo o rato (urbano e silvestre). Os hospedeiros intermediários naturais são os moluscos. entre eles caramujos e lesmas.
O homem represema um hospedeiro acidemal, podendo se infectar principalmente por ingestão de moluscos ou por comam direco com suas secreções. Casos identificados no Brasil evidenciam a ingestão de lesmas como provável fonte de infecção. Há relacos na literatura da possibilidade evemual de transmissão do helminto pela ingestão de vegetais e frutas in natura infestados pela formas larvárias infectantes do A cantonenses ou ainda por ingestão de outros hospedeiros como caranguejos e camarões. Tais formas de transmissão têm sido relatadas em países orientais onde a doença é endêmica. Não há registro da ocorrência deste agente no Brasil, o que sugere a introdução recente desta nova espécie em nosso território.
ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS Meningite bacteriana no recém-nascido em geral associa-se à sepse, sendo considerada condição predisponente à sepse e meningite, a imaturidade fisiológica do sistema de defesa do hospedeiro nesse período da vida, sobretudo daqueles nascidos prematuramente. A fonte dos patógenos é habitualmente a mãe ou o ambiente pós-natal. As vias de infecção são transplacentária (ex.: L. monocytogenes), vertical durante o parw (ex.: E. coli e Streptococcus B) ou horizontal após o nascimento (ex.: infecções estafilocócicas adquiridas em berçários). Após o período neonatal. as meningites bacterianas determinadas por Hib, meningococo e pneumococo têm início, em geral, com a colonização da mucosa da nasofaringe. Eventualmente, a meningite pode ser conseqüência da invasão bacteriana a partir de um foco de infecção contíguo ao SNC. por exemplo, maswidite, sinusite e, raramente, otite média, já que nessa situação a meningite comumente é resultado de bacteremia. A colonização da mucosa da nasofaringe determina um estado transitório de portador assintomático do agente infeccioso. Em raras ocasiões, as bactérias invadem a corrente sanguínea após vencerem as defesas locais do hospedeiro, representadas na nasofaringe pela atividade ciliar do epitélio respiratório e pela presença local de lgA secretória. No processo de invasão da mucosa, as bactérias inicialmente secretam enzimas específicas (igA proteases), que clivam e inativam a molécula de lgA local e, posteriormente, agridem as células epiteliais do aparelho
Investigação laboratorial do paciente com meningite infecciosa
respiratório, determinando a perda da arividade ciliar desse epitélio. Em seguida, ligam-se seletivamente às células epiteliais não ciliadas, sendo essa ligação dependente de estruturas presentes nas bactérias (fímbrias) e de recepwres presentes na superfície das células do hospedeiro. Após a invasão da mucosa da nasofaringe, as bacrérias entram no espaço intravascular e necessitam vencer outras barreiras do hospedeiro antes de penetrar no SNC. No sangue, a linha de defesa mais importante é a atividade bactericida da via clássica do sistema complemento associada à atividade fagocitária dos neutrófilos. A habilidade da bactéria de sobreviver na circulação está diretamente associada à sua cápsula de polissacáride, com propriedades antifagocitárias capazes de evitar as defesas do hospedeiro nesse compartimento. Os anticorpos séricos também têm atuação como elementos de defesa do hospedeiro. Como exemplo. citam-se os anticorpos dirigidos à cápsula de polissacáride. Como a cápsula bacteriana constitui-se num antígeno célula Tindependente, a resposta imunológica a ele dirigida não é adequada em crianças menores de dois anos de idade, o que pode contribuir para a maior incidência de men ingites bacterianas nesse grupo etário. O mecanismo de invasão do espaço subaracnóideo (ESA) pelas bactérias, assim como o sítio exaco onde estas penetram no SNC, não são ainda bem conhecidos. Alguns estudos têm sugerido que elas entram no SNC via plexo coróide. É possível que as células do plexo coróide e as capilares cerebrais possuam recepcores para aderência das bactérias, de forma que as mesmas possam ser transportadas para o ESA. Elementos da bactéria, como as fímbrias, aparecem como importante fawr de virulência na penetração do patógeno no SNC. Quando no ESA. as bactérias encontram condições extremamente favoráveis à sua replicação, uma vez que esse espaço é habitualmente desprovido de qualquer mecanismo de defesa capaz de controlar a infecção. Com a replicação das bactérias no ESA, as mesmas liberam componentes subcapsulares ativos, sendo os mais conhecidos e estudados o lipopolissacáride (endowxina) das bactérias Gram negativo e os elementos da parede celular das bactérias Gram positivo (peptidoglican e ácido teicóico). Essas substâncias, uma vez liberadas, estimulam as células cerebrais equivalentes aos macrófagos (astrócicos e células da microglia) e o endotélio capilar cerebral a produzirem ciwcinas, como fator de necrose tumoral
121
(FNT) e interleucina 1 (IL-1), considerados os mediadores que desencadeiam a resposta inflamatória meníngea. Ambos (FNT e IL-1) estimulam a adesão dos neutrófilos às células endoteliais e sua conseqüeme passagem para o ESA Na aderência dos neutrófilos ao endotélio, participa um grupo de glicoproreínas. as denominadas moléculas de adesão, presemes tanto nos neutrófilos quanto no endotélio, que são atívadas pela IL-1 e FNT. Na evolução da resposta inflamatória, outros mediadores são em seguida liberados: outras interleucinas (IL-6,1L-8). faror ativador de plaquetas, metabólitos do ácido araquidônico e proteínas denvadas dos macrófagos. A resposta inflamatória induzida pelas bactérias determina lesão do endotélio com alteração da permeabilidade da barreira hemaro-encefálica. permitindo a passagem de proteínas séricas para o ESA e o conseqüente aparecimento de edema tipo vasogênico. Na gênese do edema cerebral também participam os neutrófilos juntamente com as bactérias, a partir da liberação de substâncias tóxicas no ESA (edema citotóxico) e na produção de exsudato inflamatório, que altera a dinâmica do LCR, originando edema do tipo intersticial. As diferentes formas de edema cerebral são responsáveis por aumento da pressão intracraniana (PIC), que resulta em diminuição da pressão de perfusão cerebral (PPC), com conseqüente hipoxemia e metabolismo anaeróbio. Este último. por sua vez, determina aumento da concentração de lactara e consumo de glicose (hipoglicorraquia). À medida que a 1nfecção progride. a auto-regulação vascular do SNC é perdida, tornando o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) diretamente dependente da pressão arterial sistêm1ca, de maneira que a hipotensão sistémica ocasiona redução do FSC e isquemia tecidual. Em adição, vasculite e fenômenos trombóticos também presentes nas men1ng1tes bactenanas podem levar a áreas de infarto isquêm1co. reduzmdo ainda mais o FSC. A interação de todos esses eventos pode culminar em dano cerebral focal ou d1fuso e Irreversível.
APRESENTAÇÕES ClÍN ICAS As meningites infecciosas agudas apresentam início súbiro, com febre, cefaléia intensa. náuseas. vômiros. acompanhados, em alguns casos, por mamfestações cutâneas como petéquias e sinais de irritação menín-
gea. São características de irritação meníngea: rigidez de nuca; sinal de Kernig (flexão da perna sobre a coxa e desta sobre a bacia ao se elevar o tronco, quando em decúbito dorsal); sinal de Brudzinski (mesmo movimento de flexão. ao se antefletir a cabeça). Dependendo do grau de compromerimemo encefálico, podem ocorrer convulsões, paralisias. paresias, rremores. rransrornos pupilares, hipoacusia e prose palpebral. Delírio e coma podem surgir no início da doença e em casos fulminantes, associados a sinais de choque. Crianças abaixo de nove meses raramente apresentam sinais de irritação meníngea. Outros sinais permitem suspeitar de meningismo: febre, irntabilidade, gnto meníngeo, recusa alimentar. vômiros. convulsões, abaulamento da fontanela, prostração. Meningites men ingocócica e pneumocócica em asplênicos podem manifestar-se como quadro septicêmico (meningococcemia ou pneumococcemia), vasculite e quadro inflamatório intenso, com alta letalidade, septicemia associada à meningite ou apenas meningite. O início do evento é caracterizado por petéquias na conjuntiva e arrralgia e em minuros ou horas essas petéquias podem se disseminar pelo corpo e evoluir para um quadro toxêmico grave, hipotensão arterial, choque e morte. Na meningococcemia pode ocorrer o quadro grave de necrose de supra-renal. conhecido como síndrome de Waterhouse-Friedenckson. com alta mortalidade.
ABORDAGEM LABORATORIAL
Na suspeita clínica de meningite deve-se sempre proceder à punção liquórica, salvo raras contra-indicações, para confirmação diagnóstica e in ício do tratamento. A punção liquórica é freqüentemente realizada na região lombar, entre L1 e Sl. sendo mais indicados os espaços L3-L4, L4-LS ou LS-Sl. A única contra-1nd1cação formal para a punção liquórica lombar (desde que se suspeite de men1ng1te) é a infecção no local da punção. Havendo suspeita de hipertensão endocran iana grave (pressão acima de 40 cm de água), deve-se evitar a retirada de líquor nesse momento. A in formação ao laboratório do sítio de punção é fundamental, pois os parâmetros celulares e químicos vanam em diferentes sítios. A avaliação laboratorial rotineira do líquor inclui: análise macroscópica, análise citológica (contagem total
122 ( Medicina laboratorial para o clínic
e diferencial de células), dosagem de glicose e dosagem de proteínas. Em circunstâncias especiais, tais como na suspeita de meningite in~ecciosa, são necessários exames direcionados à investigação etiológica do processo, tais como coloração de Gram, cultura e pesquisa de amígenos (bacterianos e fúngicos). O volume normal é de 80 a 150 ml em adultos e 60 ml em recém-nascidos. Considera-se possível a retirada de até 20 ml de líquor em um adulto. Usualmente, colhe-se o material em três tubos estéreis, sendo o primeiro destinado às análises bioquímicas e imunológicas, o segundo às análises microbiológicas e o terceiro à contagem de células. Deve-se evitar a utilização de tubos de vidro, devido à significativa adesão de elementos à parede destes, falseando a contagem celular. Uma vez colhido, o material deve ser entregue ao laboratório o quanto ames, com o objetivo de minimizar a degradação celular. Ressalta-se que a refrigeração é contra-indicada, principalmente para cul:uras, devido ao prejuízo na recuperação de microrganismos fastidiosos, tais como o H. influenza e N. memng1tidis (ver capítulo 3).
ANÁLISE MACROSCÓPICA O líquor normal é límpido e incolor como "água de rocha". A turbidez passa a ser percebida quando se tem mais que 200 leucócitOS/l-I Lou 400 hemácias/j..JL. Microrganismos e proteína também podem causar turbidez. Após centrifugação, o líquor sobrenadante é comparado com água para venficar-se a presença de xantocromia, termo utilizado para def mr a coloração rósea, alaranjada ou amarelada do ma renal. Esta pode originar-se de hemoglobina, resultante de l1se artefacual das hemáoas causada por contaminação com detergente do material utilizado na punção ou demora superior a uma hora para análise sem refrigeração; bilirrub na em pacientes ictéricos, melanina. de metástase meníngea de melanoma; rifamp1c1na; caroceno, em pacientes com hipercarotenemia dietétiCa.
ciente de variação observado (24 e 4S%. respectivamente), as referidas câmaras mantêm-se como instrumento padrão para contagem, pois a contagem auromatizada não tem apresentado desempenho adequado devido à ba1xa celulandade liquórica. O valor de referência para contagem roral de leucócitos a partir do segundo mês de vida é de Oa S células/1.1L. Em recém-nascidos, pode-se chegar a 30 células/j..JL. O aumemo do número de leucócitos é denominado pleocitose e está relacionado à vigência de um processo inflamatório liquórico, observado nas meningites infecciosas de diversas etiologias. A presença de hemácias no líquor mdica a ocorrência de hemorragia, que pode ter ocorrido no momento da punção ou ser devido a um processo hemorrágico que atingiu o SNC. Devido à rup tura vascular, existe, além de hemácias, aumento do número de leucócitos, na proporção de um leucócito para cada SOO a 700 hemácias. e aumento da proteinorraquia. 1 mg para cada SOO hemácias. Após ep1sódio hemorrág1co. as hemácias podem ser encontradas no LCR por até três semanas e este pode ficar xancocrôm1co por até seis semanas. Apesar do limitado va lor d iagnóstico. a contagem de hemácias é ÚLil na ap1uxirnação da verdadeira contagem total de leucócitos, empregando-se as fórmulas a seguir:
ANÁLISE CITOLÓGICA A contagem total de células é realizada empregando-se líquor não diluído e câmaras de contagem do tipo Fuchs-Rosenthal ou Neubauer. Apesar do elevado coefi-
Investigação laboratorial do paciente com meningite infecciosa
CTLc = CTL0
enA =
-
CTLA
CTLs x CTH, CTHS
Onde, CTLc
z
Contagem lotai de leucócitos corrigido
CTLa = Contagem total de leucócitos observado CTLA = Contagem total de leucócitos adicionado CTL5 = Contagem total de leucócitos no sangue periférico
A contagem diferenoal de células deve ser realizada em material citocentrifugado e corado com corames hematológicos, tais como o Wright e Giemsa. Na Tabela 12.1 encomram-se os valores de referência para contagem diferencial de células no líquor. Verifica-se pequeno número de linfócitos e monócitos, na proporção de 70:30 em adultos. Recém-nascidos e crianças jovens têm maior proporção de monócitos. serdo possível o achado de até 80% destes nos prime1ros. Baixo número de neu-
123
trónlos pode aparecer no líquor "normal", mas geralmen-
to, tal achado apresenta sensibilidade por volta de 55%
te aceita-se como valor máximo de referência 7%. As meningites bacrerianas são responsáveis pelos aumentos mais pronunciados de neutrófilos no líquor. Tal al-
em relação ao diagnóstico de meningite bacteriana.
teração também é observada nas meningites virais, fúngicas
cefalites virais podem cursar com redução nos níveis de
e wberculosa iniciais. Nescas. porém, após a plena inscalação do processo, predominam os linfócicos, podendo ocorrer
glicorraquia, mas não cão intensa quamo aquela observada nas meningites bacteriana.
Assim, valores dentro da faixa de referência para glicorraquia não excluem esta etiologia. Algumas miningoen-
reatividade linfoplasmociróide e variantes imunoblásticas.
Tabela 12.1 - Valores de referência para contagem dtferencial de células por otocentrifugaçào no líquido céfalo-raquidiano
Tipo celular
Proteína total
A quamidade de proteínas varia com a idade. sendo maior nas primeiras semanas de vida e na velhice. Varia também com o local da punção. No recém-nascido ou na
Adultos(%)
Recém-nascidos (%)
Linfócitos
62 ± 34
20 ± 18
Monócitos
36 ± 20
72 ±22
criança maior e nos adulcos varia até 20 mg% (líquor vemricular), 30 mg% (líquor suboccipital) e de 15 a 45 mg% (líqu-
N eutrófilos
2±5
3±5
H,sliÓC1Ios
Raros
5 ±4
or lombar). Nas meningites bacterianas, a proteína costuma estar elevada pelo menos três vezes o valor normal.
Células ependim01s
Raros
Raros
Eos1nólilos
Raros
Raros
Ourras infecções no sistema nervoso cemral, tais como emprema subdural e abscesso cerebral, também implicam aumemo de neutrófilos no líquor. Aumemo de linfócicos é observado na meningoencefalite sifilítica. em meningrtes por microrganismos não usuais, como L. monocytogenes. e em infecções parasitárias do sistema nervoso cenrral (cisticercose, roxoplasmose). O mesmo pode ocorrer na meningite asséptica secundária a foco
Proteí na C reativa
Vários trabalhos têm demonstrado a habilidade da proteína C reaciva (PCR) na distinção emre meningite bacteriana e virai. Recente metanálise relacou sensibilidade e especificidade superiores a 90% para a determinação da concemração de PCR no líquor e soro no diagnóstico da meningite baCteriana. Por ourro lado, pesquisadores têm registrado diferença significativa na concenrração liquórica de PCR nas meningites por bactérias Gram negativo em relação às Gram positivo. Ressalta-se que tal
séptico adjaceme às meninges.
distinção não pode ser feita pela dosagem de glicose ou comagem de leucócicos no líquor.
ANÁLISE QUÍM ICA
Procalcitonina
Glicose
A dosagem sérica de procalciconina superior a 0,2 ng/ml apresenta sensibilidade e especificidade próximas de 100% no diagnóstico de meningite bacteriana. Esse
Derivada da glicemia, a glicose liquórica em jejum varia de 50 a 80 mg/dl (2,8 a 4.4 mmoi/L), correspondendo a 60% dos valores plasmáticos. Os resultados devem, portamo. ser comparadas à glicemia colhida, preferencialmente. após quatro horas de jejum. Hipoglicorraquia é uma alteração característica da meningite bacteriana, tuberculosa e fúngica. Emretan-
124 ( M edicina laboratorial para o clínico
teste cem adquirido espaço na abordagem laboratorial da doença, particularmeme naquelas situações em que o diagnóstico microbiológico presuntivo mostrou-se negativo e demais testes inconclusivos. Ressaltam-se. porém, o alro cusro da dosagem e restma comercialização no território nacional.
lacta to
se cornam evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. O teste é útil no diagnóstico de
Em pacientes com meningite virai. os níveis de lac-
meningite cripcocócica, m as diversos estudos cientí-
mo estão geralmente abaixo de 25 mg/dL e superiores
ficos ressal t am a baixa sensibilidade: 25%. Esta pode
a 39 mg/dL nas meningites bacterianas. A sensibilidade
ser o rimizada por múlt iplas punções lombares. Pro-
e especificidade do reste giram em rorno de 80 e 90%,
blema semelhante ocorre em relação
respecrivamente, empregando-se como ponto de corre
cool-ácido resistente e o d iagnóstico de tuberculose
30 a 36 mg/dL. Meningite virai, meningite bacteriana par-
meníngea. Nesta situação, a sensibilidade atinge, no
cialmente tratada e meningite tuberculosa apresentam
máximo, 12%.
à coloração ál-
valores intermediários de lacrara, limitando sua aplicação clínica nessas situações.
Cultura Eletrólitos
A identificação m icrobiológica do agente etiológico nas meningites infecciosas é fundamental, do ponto de
Não há utilidade clínica nas dosagens de sódio, potássio, cloretos, cálcio e magnésio no líquor.
vista clínico e epidemiológico. Portanto, rodos os esforços devem ser empreendidos para este fim. A sensibilidade do reste, porém, atinge 80 a 90%. Este percentual pode reduzir-se a menos de 30% após o tratamento.
ANÁLISE M ICROB IO LÓGICA
Estudos têm demonstrado que, em crianças, a cultura rorna-se negativa em 90 a 100% dos casos 24 a 36 horas
Exame microscó pico
após a instituição de terapia adequada. Diversos agentes etiológicos das meningites in-
O exame m icroscópico do líquor após cirocentri-
fecciosas são considerados fastidiosos e podem ser
fugação e coloração de Gram permite o diagnóstico
d e difícil recuperação in vitro. Tal condição impõe
de meningite bacteriana em 60 a 90% dos casos, com
extremo cu idado com a amostra microbiológica na
especificidade próxima de 100%. A positividade ao
fase pré-analítica, sendo recomendada a semeadura
Gram está relacionada à concentração de bactérias
nos meios de cult ivo o mais rápido possível e contra-
no material. Concentrações inferiores a 103 unidades
indicada a refrigeração.
formadoras de colónia (UFC)/mL est ão associadas à positividade ao Gram em torno de 25%. já concentrações maiores ou iguais a 105 UFC/mL correlacionam-
A NÁLISE IMUNOLÓGICA
se com positiviade superior a 97%. O desempenho do reste também está relacionado ao agente etiológico.
Os restes de aglutinação com látex apresentam,
Em relação ao S. pneumoniae, verificam-se 90% de po-
de modo geral, altas sensibilidade e especificidade,
sitividade. Já em relação ao H. influenza, este percentu-
fác il
al é de 86%. Nos casos de infecção por N. meningitidis,
comercialmente para H. influenzae, N. meningitidis,
verificam-se 75% de positividade e em relação a bas-
S. pneumoniae,
tonetes Gram negativo atinge 50%. A possibilidade de
Cryptococcus. A utilidade desta metodologia reside
e
rápida
execução
e
estreptococos
estão
disponíveis
do grupo B e
detecção rende a piorar após o in ício da antibioricore-
particularmente naquelas situações nas quais a
rapia, situação em que se esperam, no máximo, 60%
pesquisa microscópica foi negativa. No Brasi l, o
de positividade, em média.
custo de tai s reagentes é um empecilho à sua
O exame microscópico d irero com tinta nanquim
popularização na assistência laboratorial.
(t inta da China) é utilizado em amostras de líquor,
No Q uadro 12.2 encontram-se os exames labora-
urina, secreções ou exudaros, para visualização de
toriais e respectivas alterações verificadas nas princi-
leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus, que
pais et io logias de meningites infecc iosas.
Invest igação laboratorial d o paciente com meningite infecciosa
125
Quadro 12.2 - Principais exames laboraronais e respectivas alterações nasmeningites 1nfecc1osas Situação
Aspecto do líq uor
Citometria
Cloro
Oo5
Mr.mingile boc· teriono agudo
Turvo ou purulento
>500
Meningite bacteriano agudo em uso de antibiótico
Cloro ou pouco turvo
Menmgrte VIIOI
Glicose
Proteínas
Cultura
2/3 do glicemio
<40mg/dl
Negativo
PMN
Diminuído
>40mg/dl
PosilivCJ
<500
PMN ou MN
Dimrnuido ou normal
N ormal ou aumentado
Positivo Irara)
Cloro
<500
MN
Normal
>40mg/dl
Negativo
Meningrte tuberculoso
Cloro ou pouco turvo
<500
MN
Drmrnuido
>40mg/dl
Positrvo Irara)
Meningrte fung ca
Cloro
<500
MN
Drmrnuído ou normal
>40mg/dl
Negotrvo
clínica liquor normal
Citologia
CONSIDERAÇÕES FINAIS
presunnvo da doença, contribuindo para a decisão médica em relação à instituição da terapia ant1microbiana. A abordagem microbiológica inclui análise microscópica e ISOlamento em cultivo. A análise microscópica complementa o diagnóstiCO presuntivo, merecendo, porém, atenção devido à ba1xa sensibilidade.
Pos,tivo IC neoformans)
REFERÊNCIAS 1.
Dtante da suspeita clínica de meningite infecciosa, encontra-se 1ndtcada a colheita e análise laboratorial do líquor. Entre os exames gerais, rêm-se: citologia, cirometria, dosagem de glicose e proteína e pesquisa de proteína C reativa. Estes têm papel de destaque no diagnóstico
Coloração com tinto da China
2.
3.
Brasrl. Mrnrsrério da Saúde. Srruação da Prevenção e Con· crole das Doenças Transmrssívers no Brasrl. Saúde Brasrl 2004 Uma análise da srruação. Brasília: M rnrsrério da Saúde; 2004. Disponível em: hcrp://ponal.saude.gov.br/ porral/arqu rvos/pdf/caprrulo6_sb.pdf. Brasi l. M inistério da Saúde. Secretaria de Vrgrlâncra em Saúde. Deparramemo de Vigilância I prdemiológrca. Doenças lnfeccrosas e Parasitárias. Volume 11. Anexo 11. Ponarra no. 597/GM, Brasília: M1nrstérro da Saúde; 2004. p.194-8. Santos GP, Skraba I. Olrverra D. Lrma AA, Melo MM.
Kmetzsch Cl. Costa EV. Srlva EE. Enrerovrrus menrngms rn Brazrl. 1998·2003. J Med Vrrol. 2006:78(1}:98·104. 4. Tunkel AR, Scheld WM. Acure menrngrus. ln: Mandei! GL. Bennerr JE. Dolrn R. edrrors. Prrncrples and Prawce of lnfecrrous Drseases. 6'h ed. Orla ndo. Churchrll Lrvrng· stone; 2006. p. 1084-126.
126 [ M edicina laboratorial para o cl ínico } - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Luciana de Gouvêa Viana
13
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL
DO PACIENTE SÉPTICO
A sepse é uma síndrome complexa, de origem infecciosa, causada pela resposta inflam ató ria sistêmica
• remperacura corporal superior a 38°c ou inferior a 36°c; • freqüência ca rdíaca superior a 90 batimentos por minutO;
do indivíduo, caracterizada por manifest ações clínicas diversas e que culmina na disfunção ou falência de um
• freqüência resp iratória supenor a 20 movimentos
ou mais órgãos. A mortalidade em decorrência da sepse é variável, podendo superar 40% dos casos.
por minuto ou pco2 inferior a 32 m mhg; • leucómos superiores a 12.000/mm 3 ou in feriores a 4.000/m m 3 ou bastOnetes (ou formas mais jovens)
A localização do foco infeccioso em um paciente séptico é de fundamental importância, pois a conduta
superiores a 10%.
terapêutica. incluindo a anrimicrobiana e o prognóstico, vão diferir, su bstancialmente, con forme o local da infecção primária. Vários trabalhos científicos destacam a de-
Sepse
fin ição do foco in feccioso primário como uma das principais variáveis interferentes na sobrevida do paciente.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO D EFINIÇÕES
SIRS acompanhada de foco infeccioso.
Sepse grave Sepse acompanhada por disfunção orgân1ca. sinais de hipoperfusão (acidose. oligúria, alteração aguda do
A Soc1ety of Cnt1cal Care Med1cme e o Amencan College
oj Chest Phys1e1ans adoram as seguintes definições:
estado meneai, entre outros) ou hipotensão (PA sistólica in ferior a 90 rnm Hg ou redução superior a 40 mmHg da lin ha de base. na ausência de outras causas).
Síndrome de resposta infla matórioa sistêm ica - SI RS Choque séptico Reação inflamatória do organismo humano a uma série de agressões, 1nfecciosas ou não, adorando-se como pomo
Sep se grave associada a hipoperfusão e h ipoten -
de corte para a caracterização do envolvimento sistêmico a
são persistentes, mesmo após reposição volumétrica
presença de, pelo menos duas, das seguintes condições:
adequada.
Síndrome da disfunção de múltiplos órgãos -SOMO
Estado final da resposta inflamatória sistêmica grave. Na prática clínica, os limites que separam a sepse da sepse grave e esta do choque séptico não são clarameme detectados. Por isso, propõe-se a utilização de um sistema de estadiamento para a sepse que venha caracterizar melhor a síndrome com base em facores predisponentes e nas pré-morbidades, na natureza da infecção subjacente, nas caracrerísticas do hospedeiro e na extensão da disfunção dos órgãos. Outro conceito a ser lembrado é o de bacteremia: presença de bactérias cultiváveis no sangue periférico.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓG ICOS E AGENTES ETIOLÓGICOS A avaliação da freqüência de sepse e seus desdobramentos têm como principal obstáculo a dificuldade de definições bem padronizadas e estudos prospectivas em populações selecionadas. A maioria das estatísticas existentes é apoiada em estudos retrospectivos sobre diagnósticos de altas hospitalares. Nos Estados Unidos, Angus et a/., em 1995, estudaram a incidência an ual de sepse grave com infecção diagnosticada e disfunção aguda de um órgão em sete grandes estados americanos. Os aucores registraram três casos de sepse grave para cada 1.000 habitantes e 2,26 casos para cada grupo de 100 altas hospitalares. A mortalidade geral ficou em 28%, mas variou conforme a faixa etária, sendo 10% em crianças e 38% em idosos com idade superior a 85 anos. Esse estudo constacou, ainda, que os custos decorrentes da sepse foram mais altos em lacrentes, nos não sobreviventes, nos pacientes internados em unidades de terapia intensiva, nos pacientes cirúrgicos e naqueles com falência de mais de um órgão. Uma versão mais recente dos dados do National Hospital Discharge Survey, dos Estados Unidos, revelou que a incidência de sepse aumentou em quatro vezes entre 1979 e 2000, atingindo 240 casos por 100.000 habitantes ao ano (aproximadamente 660.000 casos ao ano). Ressalta-se a maior incidência em homens do que em mulheres e em indivíduos que não pertencem à raça branca. Embora a idade mediana para incidência de sepse baseada no diagnóstico de alta seja de aproximadamen-
128 [ Medicina laboratorial para o clínico
te 60 anos, a taxa de ataque é muito alta em crianças (mais de SOO casos/100.000 habitantes/ano), com recémnascidos de baixo peso tendo alto risco. Em levantamentos na Europa e Estados Unidos, durante os anos 90, aproximadamente 80% dos casos de sepse grave em adultos ocorreram em indivíduos que foram hospitalizados por outra razão. Em 30 a 50% destes casos, e em outras séries, nenhuma etiologia microbiana definida foi encontrada. O primeiro estudo prospecrivo sobre sepse realizado no Brasil, o Brazilian Sepsis Epidemiological Study (BASES study), publicado em 2004, incluiu cinco hospitais privados e públicos de duas regiões do país. Foram avaliados dados relativos a 1.383 pacientes adultos com diagnóstico de sepse internados em unidades de cuidados intensivos. Pulmões e trato respiratório foram as principais fomes de infecção. Registraram-se taxas de mortalidade de 24,2, 33,9, 46,9 e 52,2% para SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico, respectivamente. A mediana de idade para o grupo estudado foi de 65,2 anos. Para pacientes com SIRS sem infecção, a mortalidade foi de 11,3%. Essencialmente, qualquer microrganismo pode causar sepse ou choque séptico, porém, as bactérias são os agentes etiológicos mais comuns. Cerca de 40% dos casos de sepse são devidos a bactérias Gram negativo: Escherichia coli, Klebsiel/a pneumoniae, Enterobacter sp, Pseudomonas aeruginosa. entre outras. Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae e outras bactérias Gram positivo são responsáveis pelos casos remanescentes. Destaca-se o papel dos fungos em paciemes imunossuprimidos. Em nosso meio, os cocos Gram positivo, principalmente os estafilococos, são os agentes mais isolados em hemoculturas, seguidos das enterobactérias (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, entre outras) e os bacilos Gram negativo não fer mentadores da glicose (Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aerugmosa, entre outros). Já as leveduras, especialmente a Candida spp., vêm apresentando freqüência de isolamento cada vez maior em hemocultlvos, principalmente em pacientes imunossuprimidos e/ou recebendo antibioticoterapia de am plo espectro.
ASPECTOS FISIOPATOLÓG ICOS A resposta inflamatória representa o componente central da sepse, pois os elementos desta resposta dire-
Jf - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- -
cionam as alterações fisioparológicas que levam às manifestações clínicas da doença. Durante muiros anos, diversos cientistas acreditaram que o problema da sepse estava direrameme relacionado à exuberante produção de moléculas pró-inflamatórias. Este conceito foi alimentado por quatro informações. A primeira refere-se à associação de níveis elevados de fator de necrose tumoral (TNF) em pacientes com sepse e morre. A segunda diz respeito aos resultados de trabalhos experimentais, nos quais se verificou a indução de quadro semelhante à sepse a partir da administração de moléculas de TNF. Na terceira têm-se outros resultados experimentais revelando que animais que receberam doses letais de endoroxinas apresentaram níveis elevados destes mediadores. E, finalmente, a inibição destes mediadores eleva a sobrevida em modelos animais de choque séptico. Vale lembrar que as cirocinas podem ter significativo incremento e efeito no nível local, sem alterações no sangue periférico. Recente estudo realizado em recém-nascidos revelou que a administração de antagonista de receptores de interleucina 1 (IL-1) provocou significativa queda nos níveis séricos de IL-6. Outro ponto de vista atribui a falha no controle do processo infeccioso à imunossupressão, em detrimento da imunoestimu lação. Alguns estudos indicam que aresposta pró-inflamatória poderia não ser iniciada, enquanto a antiinflamatória estaria preservada, e tal desequilíbrio resultaria na neutralização da resposta inflamatória. Os dados indicariam que a resposta inflamatória na sepse é complexa e, provavelmente, alguns pacientes se beneficiam da neutralização da inflamação e outros se servem de sua resposta inflamatória. Assim, a determinação dos níveis de citocinas parece não ser suficiente para determi nar o quanto um paciente ou modelo experimental é "hiperi nflamatório" ou "hipoinflamarório". Na sepse são verificadas várias disfunções celulares, tanto pela excessiva ativação quanto pela depressão de função. Um exemplo de ativação excessiva seria a geração de produros tóxicos pelos neutrófilos e um exemplo de depressão na função seria a falha na fagocirose e clareamento de organismos invasores. Uma das correntes de investigação concentra-se na indução de apoprose celular e necrose, contribuindo na patogénese da sepse. Apoprose linfocirária parece ser a causa da depleção funcional destas células na sepse, revelada pela falha na produção de citocinas. Em relação aos neutrófilos, não há dúvidas de que uma resposta neutrofílica robusta au-
Investigação laboratorial do paciente séptico
xilia na erradicação da infecção. A dificuldade está em definir resposta apropriada versus resposta exagerada. Em pacientes sépticos, tem-se observado retardo no apopcose neutrofílica, provocando sua persistência prolongada na corrente sanguínea. Como conseqüência, o paciente séptico mantém números elevados de neutrófilos ativados com potencial de injúria. Por outro lado, são justamente estes neutrófilos ativados os responsáveis pela resposta imune inata para combater a infecção. As células endmeliais, por sua vez, representam uma crítica interface entre o sangue e os tecidos e há várias evidências científicas de disfunção destas na sepse.
ASPECTOS CLÍN ICOS O diagnóstico clínico da sepse está baseado em alto índice de suspeita, exigindo-se minucioso exame clínico, considerando-se as informações sobre o estado atual do paciente, seu passado mórbido e possíveis co-morbidades. As manifestações clínicas da sepse decorrem do processo infeccioso primário, do processo inflamatório subjacente e das disfunções orgânicas instaladas ou em processo de Instalação. Os sinais e sintomas da infecção estão naturalmente associados ao sírio primário do processo. As man ifestações clínicas secundárias à ativação inflamatória são inespecíficas e incluem a febre ou hiporermia, taquicardia, taquipnéia e alcalose respiratória, hipermetabolismo sistémico, consumo elevado de oxigénio, hipoperfusão sistémica, acidose metabólica e um estado metabólico hiperdinâmico. Hipotensão sistémica, defeiros microcirculatórios, hipóxia recidual e ativação da cascata inflamatória estão relacionados às lesões de múltiplos órgãos que caracterizam a evolução clínica da sepse até a sepse grave. As disfunções pulmonares e renais são habitualmente reconhecidas nos estágios iniciais. As disfunções neurológicas, hepáticas e gastrintestinais são, gera lmente. reconhecidas clinicamente, mais tardiamente, mas já são perceptíveis em exames laborawriais.
ABORDAGEM LABORATORIAL
A avaliação laboratorial do paciente com sepse é capaz de revelar dois aspectos distintos. O primeiro refere-
129
se à identificação microbiológica do agente agressor e o segundo diz respeiro à identificação das alterações metabólicas e/ou da homeosrasia, essencial na avaliação do compromeri menro sisrêmico e de órgãos específicos.
dem aumentar até 5.000 a 10.000 vezes, com a calcitonina ainda dentro dos limites de referência. Por outro lado, enquanto a meia-vida da calcitonina é de 10 minutos, a da PCT é de aproximadamente 24 horas. Alguns autores têm atri buído à elevação da PCT sérica maior correlação
com bacteremia causada por microrganismos Gram neEXAMES GERAIS A avaliação laborarorial geral do paciente séptico inclui desde a busca de indicadores de resposta inflamatória no sangue periférico (mediadores endógenos e indicadores de resposta de fase aguda) até a pesquisa de indicadores de distúrbios orgânicos e metabólicos.
Indicadores de resposta inflamatória sistêmica
Os indicadores de resposta inflamatória sistêmica carecem, na sua maioria, de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de sepse, mas podem ter valor prognóstico e orientar a resposta terapêutica.
gativo, em comparação com microrganismos Gram positivo. Verificou-se sensibilidade de 75,0%, especificidade de 82,2%, valor preditivo positivo de 83,0% e valor preditivo negativo de 74,0% para dosagem de PCT na discriminação de bacteremia por microrganismos Gram negativo e Gram positivo em pacientes cri ticamente doentes e com hemoculrura positiva. Assim, a determinação da PCT seria útil na orientação terapêutica em pacientes sépticos, considerando-se como ponto de corre o limite de 16 ng/ml. Apesar de seu grande porencial na abordagem laboratorial do paciente séptico, a PCT ainda não pode ser caracterizada como um marcador definitivo de sepse em pacientes com SIRS. Talvez sua maior utilidade no momento seja na exclusão desse diagnóstico. Citoeinas
Proteína C reativa
Ao contrário das CICOCinas e procalciconina, a Proteína C Reativa (PCR) sérica atinge seus níveis máximos após 48 horas, não se correlaciona com a gravidade da resposta do hospedeiro e não é capaz de diferenciar sobreviventes de não sobreviventes de sepse. Os níveis de PCR podem permanecer elevados até vários dias após a eliminação do foco infeccioso, sendo encontrada em muicos processos não infecciosos, tais como doenças reumáticas e auto-imunes, síndromes coronarianas agudas, neoplasias e estados pós-operatórios. A PCRé de valor preditivo pobre para o diagnóstico de sepse e seu poder de avaliar a gravidade do processo não está comprovado. Entretanto, o analito desempenha papel importante na análise evolutiva de seus níveis, guiando a antibioricoterapia em infecções localizadas (Ver capítulo 56).
Pesquisas científicas têm revelado o papel da quantificação de citocinas por cirometria de fluxo. Alguns estudos mostraram melhor desempenho da interleucina- IL6, tradicionalmente considerada um bom indicador de gravidade e prognóstico. Níveis IL6 persistentemente elevados estão associados à insuficiência múltipla de órgãos e morte. Outra importante citocina - fator inibidor de macrófago (MIF- macrophase migrat1on inhibitory factor) - tem s1do considerada na sepse. A MIF é uma proteína pré-formada na glândula pituitária, em linfócitos Te macrófagos e é liberada por vários estímulos, entre eles infecção e esuesse. Elevadas concentrações da MIF parece ser um indicador precoce de maus resultados no paciente séptico.
Indicadores de distúrbios orgânicos e metabó licos
Proca/citonina
A procalcitonina (PCT) é um propeptídeo de 13 kD da calcitonina. O papel fisiológico da PCT e seu sítio de produção não são completamente entendidos. Em indivíduos hígidos, os níveis de PCT encontram-se abaixo de 0,1 ng/ml. Em pacientes com sepse, os níveis de PCT po-
130 [ Medicina laborat orial para o clínico
Hemograma
A análise do hemograma, acompanhado pela hematoscopia, pode fo rnecer informações importantes para o manejo do paciente com sepse. Leucocirose, neutrofilia e desvio à esquerda é um padrão freqüenre, sendo prová-
vel a identificação e inclusões neutrofílicas. Leucopenia ou panciropenia podem ser encontradas e representam marcadores de mau prognóstico. Podem ocorrer eosinopenia e linfopenia . Na série eritrocítica, as alcerações estão condicionadas ao status ericropoiéc1co do paciente e à realização de transfusões sanguíneas. A trombociropenia é marcador prognóstico independente de mortalidade na sepse. Esta pode decorrer da própria doença ou ser resultado do uso de drogas, púrpura pós-transfusional, púrpura trombótica, coagulação intravascular disseminada ou trombociwpenia induzida por heparina. Gasometria arterial e lactato
Na sepse, verifica-se acidose metabólica, caracterizada por pH inferior a 7,35, excesso de base negativa, com redução de bicarbonatO plasmático. A gasometria fornece informações importantes ao médico-assistente em relação à reposição de base e eletrólitos. Esta aponta, por exemplo, acidose lática causada por hipoperfusão e a acidose clorêmica secundária à administração excessiva de fluidos ricos em cloreto. Pode haver elevação dos níveis séricos de lactato, conferindo pior prognóstico aos pacientes. Marcadores de junção hepática
A elevação de alanina aminotransferase e aspartaro aminotransferase é comum na sepse. Esta pode representar lesão hepática isquêmica, toxicidade medicamentosa, ação patogênica direta do agente infeccioso ou resposta à inflamação sistêmica. A elevação da bilirrubina, gama glutamiltransferase e fosfatase alcalina sinalizam a presença de colestase, a qual pode decorrer do processo inflamatório ou ter origem medicamentosa ou obstrutiva. A elevação da bilirru bina indireta pode 1ndicar hemólise. Marcadores de função renal
A avaliação periódica da função excretora renal é fundamental em um paciente com sepse. Geralmente têm-se uremia e oligúria, podendo haver evolução para insuficiência renal. Assim, tOrnam-se essenciais a determinação de creatinina sérica e depuração de creatin ina endógena (clearance de creatinina). A fórmula de Cockroft
Investigação laboratorial do paci ente séptico
Gaulc para estimativa da depuração a partir da creacinina plasmática pode ser utilizada. Estudos recentes têm propostO a utilização da cistatina C e sua depuração como forma mais acurada de avaliação da função de filtração renal, uma vez que esta não sofre as interferências às quais escá submecida a dosagem de creacinina.
DIAGNÓSTICO M ICROBIOLÓGICO
A identificação do agente etiológico da sepse é de fu ndamental importância, bem como o teste de sensibilidade a ancimicrobianos que a complementa. A hemocultura constitui, nesse comexco, fer ramenta essencial, sendo naturalmente acompanhada das investigações microbiológicas presuncivas (análises microscópicas) e cultivos de outros materiais biológicos referentes a infecções localizadas associadas à sepse. Tanto na fase pré-analítica quanto analítica e pós-analítica existem aspeccos significantes relativos à hemocultura e que interferem di reta mente em seu desempenho na identificação de bacteremia.
Fase pré-analítica
Para otimizar o desempenho da hemocultura na identificação de bacteremia, recomenda-se a coleta de amosrras múltiplas em sítios diferences de venopunção, preferencialmeme antes da introdução de amim icrobianos. Em pacientes adultos, duas ou uês amostras de hemocultura seriam o ideal. Já em crianças. a recomendação é a coleta de duas amosuas. Estas devem ser obtidas de locais de punção diferente. A pele deve ser cuidadosamente preparada com álcool 70%, bem como a tampa do frasco de hemocultura, evitando-se, assim, a conta minação da amostra (Ver capítulo 3). O momento da coleta é outro pontO crítico e determinante na sensibilidade do teste. Ao se coletar na ascensão da temperatura, particularmente na vigência de calafrios, há chance de se obter ma1or número de bactérias ou fungos na corrente sanguínea. Coleta em pico febril e no descendente da curva térmica não é indicada. Dependendo das evidências clínicas e epidem iológicas, deve-se considerar a necessidade de utilização de
131
meios de culwra próprios para o isolamemo de bactérias aeróbias, anaeróbias, micobacrérias e fungos. Quanto maior o volume de sangue por amostra, melhor a recuperação do microrganismo. Cada mililirro de sangue a mais coletado aumenta a positividade em 3%. Portamo, deve-se colher o maior volume possível indicado no frasco. Geralmente, tal volume corresponde a 10 a 20 ml em adulws. 5 a 10 ml em crianças e adolescentes Oa 2,0 ml em recém-nascidos. Após a coleca. as amostras biológicas devem ser encaminhadas imediatamente ao laboratório (Ver capítulo 3).
Fase anal ítica
Um dos sistemas mais utilizados no mundo para realização de hemoculcuras baseia-se na detecção da fluorescência emit1da por um sensor nos frascos com meios de cultura. O sistema é de ultra-sensibilidade e moniwra, em Intervalos de 10 minuws. as amosrras de hemoculcura, acelerando o tempo de detecção e fornecendo alarmes visuais e sonoros, no caso de amosuas positivas. Ourro sistema aummatizado de hemoculcura baseia-se na detecção colorimétrica de C0 2 como indicador de crescimento bacteriano. Essas memdologias têm como grande vantagem a detecção precoce de positividade, podendo ating1r 95% nas primeiras 24 horas. Escudos revelaram que 99.5% dos microrganismos isolados em hemoculcuras foram detectados até o quarm dia, após 72 horas de incubação. O valor preditivo negativo até o quarw dia foi similar àquele verificado até o sétimo dia de processamento.
Fase pós-analítica
Uma hemoculcura positiva não confirma, necessariamente, a tnfecção, uma vez que a contaminação da amostra pode ocorrer. Considera-se como nível máximo aceitável de contaminação em hemoculturas para uma instituição 2 a 3%. Porém, escudos têm verificado aumento desses níveis. provavelmente relacionados ao aumento da sensibilidade analítica dos equipamentos auwmatizados. A recuperação de microrganismos sabidamente pawgênicos não gera problemas na interpretação
132 [ Medicina laboratorial para o clínico
do resultado. Por outro lado. a rec uperação de microrganismos como escafilococos coagulase negativos, Corynebactenum ssp e Bacil/us spp sugere contaminação. Entretanto, é essencia l reconhecer que esses microrganismos podem ser a causa de bacteremias verdadeiras, com conseqüênCias desastrosas ao paciente, se não uacadas. Informações adicionais são necessárias para a defini ção do significado clínico do resultado, cais como o número de amoscras positivas para o mesmo microrganismo e a presença de fatores de risco para infecção pelo respectivo agente etiológico. Em relação ao estafilococo coagulase negativo, contaminante bastante comum, um estudo revelou que o valor predicivo positivo de um resultado de hemoculcura é de 55%, caindo para 20% quando o resultado de duas amostras é positivo e para apenas 5% quando o resultado de três amostras é positivo. Apesar de todos os esforços no sentido de isolar o microrganismo causador da infecção, as hemoculturas são positivas em pouco mais de 30% dos casos. Conforme o microrganismo, este percentual pode superar 60%, bem como permanecer em níveis críticos, inferiores a 10%.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A sepse é uma síndrome clínica associada à significativa morbimortalidade. A identificação do agente etiológico é de fundamental importância e influencia diretamente o desfecho final da doença. A realização da hemocultura é essencial, sendo necessária a coleta de amostras múltiplas e em volume adequado para otimizar a sensibilidade do teste. O grande desafio em relação ao resultado de hemocultura reside na definição do microrganismo isolado como agente etiológico do processo ou mero contaminante. Para responder a tal questão, wrna-se fundamental o conhecimen m dos aspectos técnicos em relação ao teste, particularmente aqueles envolvidos na fase préanalítica e que podem interferir na especificidade deste. Ouuos dados essenciais à interpretação do resultado de uma hemocultura dizem respeiw aos aspectos clínicos e epidemiológicos do paciente, os quais destacam a provável etiologia da doença.
)1-- - - - - - - - - - - - - -- -- - - - - -- -- -- - - -
REFERÊNCIAS Charles PE. Lado1re S. Aho S. Quenor )P, Oo1se JM, Pnn S. Olsson NO. Blerrery B. Serum procalmon1n elevac1on 1n cnucally 111 pac1enc5 ar che on5ec of bacrerem1a caused by e1cher Gram negac1ve or Gram pos1t1ve bacceria. BMC lnfen 015. BMC lnfecc 015. 2008;8:38. 2. Hall KK, Lyman A. Updaced rev1ew of blood culrure concam•nar•on. Cl!n M1crOb1ol Rev. 2006;19(4):788-802. 3 Munford RS. Sep5is, 5evere sepsis, and septic shock ln: Mandell GL. Bennect JE, Oolln R, ed1cors. Pnnc1ples and Pracnce of lnfecnous 01seases. 6• ed. Orlando: Chu rch1ll L1v1ngsrone; 2006. p. 906-26. 1.
Investigação laboratorial do paciente séptico
4. RemiCk OG. Parhophys1ology of seps1s. Am J Pachol. 2007;170(5): 14 35-44. S. S1lva E, Pedro Mde A. Sogayar AC. Mohov1c T. S1lva CL. jan1szewsk1 M. et ai. Brazillan Seps1s Ep1dem1olog1Cal Study (BASES scudy). Crit Ca1e. 2004.8251-60. 6. Soc1edade Brasile1ra de Pacolog1a Ciln1ca/ Med1cma Laboraronal. Recomendações da Sooedade Bras1le1ra de Parolog1a Clín1ca/ Med1c1na Laboratonal para coleca de sangue venoso. São Paulo: Sociedade Brasile1ra de Patolog1a Clín1ca/Med1C1 na Laboraronal; 2005. 0 15· ponível em: hrrp://www.sbpc.org.br/u pload/comeudo!320070130154104.pdf.
133
Edilberto Nogueira Mendes Paula Prazeres Magalhães Mireille Ângela Bernardes Sousa Rodrigo Estêvão Teixeira
14
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DIARRÉIA INFECCIOSA AGUDA
A diarréia infecciosa aguda, principal causa de doença diarréica em codo o mundo, concinua sendo um importance problema de saúde pública, especialmence nos países em desenvolvimento, atingindo, indistincamente, codas as camadas sociais e faixas etárias da população. Nas classes menos favorecidas economicamente, a diarréia aguda é responsável por altas taxas de morbidade e mortalidade, estando intimamente ligada à desnutrição que. por sua vez, facilita a persistência do processo infeccioso. Estima-se que entre seis e 60 bilhões de casos de diarréia ocorram anualmente em rodo o mundo e que a evolução para o óbiro atinJa um indivíduo, na maioria das vezes uma criança, a cada 15 segundos. O agente etiológico da diarréia infecciosa multiplicase no traro gasuintesrinal de seu hospedeiro, podendo causar doença clinicamente evidente ou permanecer indefinidamente sem provocar lesão aparente. É eliminado nas fezes no ambiente, ficando disponível para a infecção de outros Indivíduos. A via de transmissão é, na grande maioria das vezes, fecal-oral, razão pela qual os alros índices de morbimorralidade da doença esrão associados a precánas condições de higiene pessoal e domiciliar, de saneamento básico e económicas, enue outros fatores. O microrganismo pode atingir seu órgão alvo de diferences formas, através diversos veículos e a importância relativa de cada um deles altera-se com o nível de desenvolvimento económico da população. A principal forma de uansmissão envolvida na aquisição dos agentes etiológicos do processo é o consumo de água/alimen-
ros contaminados; também podem ser eirados comam homem-homem, com animais e suas excretas ou com objeros contaminados, bem como arividades de lazer em águas poluídas. A uansmissão por meio de alimenros indusuializados acidentalmente contaminados rem se mostrado importante na gênese de surros de diarréia infecciosa em países desenvolvidos. Por outro lado, nos países em desenvolvimento, a maioria dos casos de diarréia infecciosa aguda ocorre de forma endêmica. O número preciso de casos de diarréia infecciosa aguda não é conhecido, seja porque as manifestações clínicas da doença são extremamente variáveis, seja porque a notificação não é feira de maneira adequada. Calcula-se que cada habitante de país desenvolvido apresente pelo menos um episódio de doença gasuinresrinal a cada dois anos. Esras taxas alcançam valores entre cinco e 10 episódios/ano para habitantes de países do terceiro mundo, especialmente crianças com menos de cinco anos de idade. A prevalência calculada de diarréia infecciosa em países em desenvolvimento atinge valores entre 4 e 6 x 109 casos/ano, dos quais cerca de 3 a 5 x 106 evoluem para o óbito. Ao contrário da crença comum, as manifestações das infecções eméricas não estão limitadas ao aparelho digestivo. De faro, as manifestações clínicas apresentadas pelo paciente esrão relacionadas ao microrganismo envolvido e às condições do hospedeiro acometido, podendo estar associadas a praticamente qualquer região do organismo, quais sejam sistema digestivo, nervoso, respiratório
e músculo-esquelético, olhos e pele. Entre os sintomas mais comumente relatados, destacam-se diarréia, náuseas, vômiros, cefaléia, mialgia e manifestações respiratórias semelhantes às do resfriado comum. Manifestações clínicas mais graves, como desidratação, acometimento renal
não apenas o conhecimento de fomes e reservatórios de microrganismos enceropatogênicos, mas também a quantificação da importância relativa das diferences formas de transmissão da doença diarréica. Como mencionado, a gama de agentes infecciosos
com insuficiênciaaguda do órgão e acraso no desenvolvi-
reconhecidos como capazes de causar diarréia é ampla
mento neuropsicomoror, entre outras, podem ocorrer e é possível a ausência do sintoma mais comumente associado às infecções eméricas - a diarréia. A identificação do agente etiológico do processo infeccioso, na maioria das vezes, não é realizada. Diversos fatores contribuem para o fato, entre eles: a falta de recursos técnicos de muitos serviços de saúde; o uso inadequado da tecnologia disponível; o custobenefício do diagnóstico etiológico, especialmente no que se refere às diarréias de origem virótica ou quando se consideram a demora do procedimento e o fato de que o tratamento específico não está indicado na maioria dos casos; e o espectro amplo e crescente de microrganismos considerados agentes etiológicos de diarréia. Entre as causas para essa falha, podem ser incluídas as limitações inerentes aos métodos tradicionalmente utilizados no diagnóstico microbiológico, a extensa gama de agentes etiológicos do processo infeccioso, dificultando sua identificação, e o faca de que muicos microrganismos envolvidos na gênese da diarréia in fecciosa aguda ainda não foram reconhecidos como enteropacogênicos. Entre os métodos mais sensíveis para a identificação dos enteropatógenos reconhecidos, podem ser incluídas as técnicas imunológicas e a reação de polimerização em cadeia (PCR). Tais metodologias, em especial a PCR, possibilitam a identificação rápida de microrganismos, que exigiria infra-estrutura complexa para sua realização por outros métodos, como os vírus, e também a caracterização de microrganismos faci lmente cultiváveis em meios de cultura artificiais, como algumas bactérias, como a Eschenchia coli, que devem ter seus fatores de virulência identificados para serem consideradas enteroparogênicas. Uma grande vantagem do emprego das técnicas de genérica molecular é a possibilidade de determinação do perfil genotípico do microrganismo e de esclarecimento da origem do microrganismo infectante, pela comparação com o perfil do organismo detectado em outras fomes, como ambiente, fami liares e pessoas da proximidade do paciente. Abordagens desta natureza permitem
e encontra-se em expansão. Microrganismos anteriormente não implicados como agentes etiológicos da doença são hoje reconhecidos como importantes na sua gênese, especialmente nos indivíduos com deficiência do sistema imunitário. Rotavirus é um gru po de agentes virais de diarréia aguda extremamente importante, podendo, ainda, ser eirados Adenovirus, Norovirus e Astrovirus. Entre as bactérias, deve-se mencionar o grupo diarreiogênico de E. cali (encerotoxigênica, enceropatogênica, produtora de toxina shiga, encero invasora, enceroagregativa e difusamente aderente), Shigella, Salmonella enterica, Vibrio cholerae e outros vibrios, Campylobacter. Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis, Aeromonas e Plesiomonas shigelloides. Entre os parasitos, merecem destaque Giardia lamblia, Entamoeba htstolyttca, lsospora bellt e Cryptosporidium parvum (ver capítulo 20: Investigação laboratorial do paciente com helmincíases e protozooses intestinais).
PRINCIPAIS AGENTES ETIOLÓGICOS DE DIARRÉIA AGUDA
VÍRUS Rotavirus
Rotavirus representa a causa mais comum de diarréia aguda, em geral grave, em todo o mundo, acometendo, na imensa maioria das vezes, a população pediátrica. Em adultos, está associado à etiologia da diarréia do viajante e também é considerado causa importante de infecção nosocomial. O organismo infecta encerócitos maduros do intestino delgado, levando à atrofia de vilosidades e repopulação compensadora do epitélio por células secretoras imaturas. O mecanismo que induz a produção de diarréia não é bem com preendido, mas parece ser mediado pela diminuição relativa da absorção intestinal, em virtude da redução tanto da superfície absortiva como da síntese de dissacaridases. Tem sido sugerido que o vírus estimula o
136 [ Medicina laboratorial para o clínico )1 -- - - -- - - - - - -- - - - - - - - - - - -- - -- - -
sistema nervoso entérico. levando à secreção inteStinal de água e de elerróliros. Estima-se que seja responsável por aproximadamente um terço de rodas as internações por diarréia e que 6 a 8,7 x 105 casos evoluam para o óbiro. a cada ano, nos países em desenvolvimento. Além da transmissão via água/alimentos contaminados, a grande quantidade de vírus eliminada nas fezes dos indivíduos com rotavirose facilita a disseminação da infecção pessoa-pessoa. A roravirose em neonaros é comum e geralmente assimomática, possivelmente devido a farores maternos de proreção e à imaturidade imesrinal. Durante os dois primeiros anos de vida. ocorrem infecções repetidas por Rotavírus. 50% das quais são assi ntomáticas. Virtualmente, rodas as crianças de países indusrrializados e em desenvolvimento adquirem infecção por Rotavírus ames dos cinco anos de idade. O pico de incidência da doença ocorre entre quauo e 23 meses de idade e crianças de países do terceiro mundo infectam-se mais precocemente que as de regiões desenvolvidas. as regiões no picais. não se observa sazonalidade na disrribuição da infecção. A doença intestinal pelo vírus caracteriza-se por diarréia, com eliminação de grande volume de fezes aquosas, vômiros, febre alta e desidratação.
gem virai. A infecção por Norov~rus acomete indivíduos de todas as faixas etárias, especialmente crianças. idosos e pacientes com doenças debilitantes. A uansmissão do vírus, primariamente pessoa-pessoa, é faci litada pela alta prevalência do microrganismo na comun idade, eliminação de panículas virais por indivíduos assincomácicos e estabilidade do vírus no ambiente. O mecanismo pelo qual Norovírus causa diarréia ainda não está rotalmente esclarecido. Observa-se achatamento de vilosidades e de microvilosidades e hiperplasia de células das criptas, com diminuição da superfície absorriva do intestino delgado. O período de incubação méd1o é de um a dois dias. A doença associada ao vírus. geralmente aurolimitada e de curta duração. é caracterizada por inicio súbito de vómitos e diarréia com eliminação de fezes aquosas. geralmente acompanhada por febre baixa. Astrov1rus infecta primariamente crianças e idosos. Embora os mecan ismos de parogenicidade do vírus sejam pouco conhecidos. observa-se atrofia de vilosidades intestinais, bem como infiluado inflamatório na lâmina própria, levando à diarréia osmótica. Dados de países desenvolvidos indicam que a infecção é mais comum no inverno. O período de incubação é de cerca de um a rrês dias. A diarréia causada pelo organismo rem duração mais curta e é menos grave que outras viroses entéricas; raramente, o paciente apresenta febre.
Outros vírus
BACT ÉRIAS Diversos outros vírus podem estar associados à etiologia da diarréia aguda. Entre eles, destacam-se Adenovírus. Norovírus e Astrovirus. A infecção por Adenovirus ocorre principalmente em crianças com 1dade inferior a dois anos, não rendo sido observada variação na distribuição sazonal da mesma. Aparentemente. o vírus causa doença de forma semelhante a Rotavirus. O período de 1ncubação é de cerca de uma semana. O quadro é usualmente brando. mas pode rornar-se persistente em pacientes com comprometimento do sistema imun itário. Norovírus, antenormente denominado Norwalk ltke v~rus. vem sendo cada vez mais freqüentemente detectado em amostras fecais de indivíduos com infecção entérica, tanto epidémica como esporádica, provavelmente em virtude do desenvolvimento de ensaios mais sensíveis e específicos para diagnóstico de infecções de ori-
E. coli diarreiogênica
E. coli. bactéria anaeróbia faculrativa predominante na microbiota indígena intestinal. é considerada um importante parógeno para seres humanos, envolvida na etiologia de processos infecciosos que podem acometer diferentes locais do organismo. São reconhecidos arualmente seis grupos diarreiogênicos de E. co/í. Deve-se ressaltar que nenhum deles é considerado membro da microbiora in dígena intestinal. sendo a doença diarréica associada ao microrganismo uma infecção de natureza exógena. E. coli enterotoxigênica (ETEC)
O grupo emerotoxigênico de E. coli é constituído por amostras caracterizadas pela produção de fímbrias,
Investigação laboratorial do paciente com diarréia infecciosa aguda
137
denominadas fatores de colonização (CFA), e de enteroroxinas. Os CFA, responsáveis pela aderência do microrganismo ao epitélio do intestino delgado, podem ser agrupados com base em suas características morfológicas, predominando, em amostras isoladas de seres hu-
mitos e na maioria das vezes evolui para a cura em até quatro dias. Geralmente, o pac1ente permanece afebril e apresenta sinais de desidratação, algumas vezes grave, podendo evoluir para choque.
manos. as adesinas CFA/1. CFA/11e CFA/IV.
E. coli enteropatogênica (E PEC)
As enterotoxinas são classificadas, de acordo com sua sensi bilidade ao calor, em termolábeis (LT) ou termoesráveis (ST). As coxinas LT de ETEC são escrurural e funcionalmente semelhantes à enterotoxina colérica. Há dois sorogrupos de LT. LT-1, expresso por amoscras diarreiogênicas para seres humanos e outros animais, e LT-11, observado primariamente em amostras de origem animal. O alvo celular desse grupo de coxinas é a adenilacociclase localizada na membrana basolateral dos enterócicos. A estimulação dessa enzima leva ao aumento dos níveis intracelulares de monofosfaco de adenos1na cíclico (cAMP) e, em conseqüência, à fosforilação de canais de cloreco localizados na membrana apical de tais células. O resultado dessas alterações é o esdmulo à secreção de íons cloreco pelas células das criptas e inibição da absorção de cloreco de sódio pelas células das extremidades das vilosidades, com conseqüente acúmulo de íons no lúmen intestinal. que favorece o transporte passivo de água pela via paracelular. As ST são enterotoxinas de baixo peso molecular presentes em cerca de 75% das amostras de ETEC produroras ou não de LT Dois tipos de ST foram descriros, STa. encontrada em amostras associadas à diarréia em seres humanos. e STb, observada principalmente em amostras 1soladas de suínos. A STa estimula a guanilarociclase, resultando em acúmulo de monofosfaco de guanosina cíclico (cGMP). À semelhança de LT. a roxina induz secreção de íons cloreto e inibição da absorção de cloreco de sódio. Por outro lado, a STb estimula a secreção de bicarbonaco por mecanismo independente da estim ulação de cAMP e cGMP. A infecção por ETEC é uma das causas mais importantes de diarréia em crianças de países em desenvolvimento com idade inferior a cinco anos e de diarréia do viajante. Nos países de clima temperado, a doença é ma1s freqüente no verão e nos países de clima tropical. nos meses quentes e úmidos. A diarréia associada a ETEC é do tipo secretório; a doença rem início súbito, com eliminação de fezes aquosas, sem sangue ou células inflamatórias, é acompanhada habitualmente de vô-
EPEC é um grupo de E. coli dia rreiogênica capaz de induzir efeito A/E (attaching and effacing). que se caracteriza pela aderência do microrganismo e pelo achatamento de microvilosidades dos enterócitos. Observa-se aderência íntima da bactéria ao enteróciro, associada à produção de intimina, codificada pelo gene eae, universalmente presente nas amostras do grupo bacteriano, e poli merização de actina, achatamento de microvilosidades e, logo abaixo do local de aderência, formação de estrutura semelhante a pedestal. EPEC adere-se de forma localizada ao epitélio do intestino delgado, por meio de fímbria denominada BFP (bundle forming pil/us), codificada por genes carreados pelo plasmídio EAF (EPEC adherence factor) . De acordo com a presença/ausência do plasmídio, importante mas não essencial para a produção do efeico A/E. EPEC pode ser classificada em cípica ou atípica, respectivamente. Por meio de um sistema de secreção do tipo II I (SSTT), o microrganismo transporta numerosos efetores cuja ação promove aumento de cálcio intracelular e fosforilação de diversas proteínas, levando a alterações no citoesqueleto e na abso rção e secreção intestinal de água e eletrólitos. A infecção por EPEC está associada à diarréia aguda principalmente em crianças um até dois anos de idade. Crianças sintomáticas ou não e adultos assintomáticos são os principais reservatórios da bactéria. Amostras atípicas de EPEC podem ter como reservatório. além do ser humano. animais como gado bovino e suíno, coelhos e cães. Nos países desenvolvidos, observa-se predomínio de EPEC atípica; nos países em desenvolvimento, EPEC típica ainda é considerada importante agente de diarréia, embora estudos mais recentes demonstrem que EPEC adpica é o grupo predominante em grandes centros urbanos. EPEC causa primariamente dia rréia aguda, com eliminação profusa de fezes aquosas sem leucócitos, muco ou sangue, acompanhada de dor abdominal de intensidade variável. desidratação de diversos graus, vômiros e febre baixa.
138 [ Medicina laboratoria l para o clínico
E. co/i produtora de toxina shiga (STEC)
STEC caracteriza-se pela habilidade de produzir roxina shiga (Srx). Está associada ao desenvolvimento de colite hemorrágica, que pode evoluir para síndrome hemolíricourêmica, um complicação sisrêmica grave da infecção. Duas classes principais de Stx, codificadas por genes carreados por um fago. foram descritas: Stx1, quase idêntica à toxina produzida por Shigella dysenteriae ripo 1, e Srx2, que apresenta similaridade de seqüência de aminoácidos de cerca de 60% com Srxl. A produção de Srx é um prérequisito para o desenvolvimento das doenças associadas ao microrganismo. A ciroroxina, que inibe a síntese protéica em células eucarioras, atravessa a camada epitelial do intestino e atinge seu alvo, o revestimento endotelial de pequenos vasos sangüíneos do intestino, rins e outros órgãos. Além de contribuir para a lesão intestinal, Stx é responsável por complicações pós-diarréia, devido a sua ação sobre o endotélio glomerular e cerebral e ativação de cascatas pró-trombótica e pró-inflamatória. Admite-se que outros farores de virulência possam estar envolvidos no processo, entre eles lipopolissacáride bacteriano. Um subgrupo de STEC denominado E. coli encerohemorrágica (EHEC) apresenta, à semelhança de EPEC. capacidade de induzir lesão A/E no epitélio imesrinal. O sorotipo 0157:H7 é o mais conhec1do representante de EHEC. Entretanto, nem rodas as amostras classificadas como 0157:H7 podem ser consideradas enterohemorrágicas, uma vez que não expressam Stx. Diversos outros sorotipos de E. colt são capazes de produzir roxina shiga, estando associados a quadro clínico indistinguível daquele originalmente atribuído a E. coli 0157:H7 De faro. admitese que a prevalência de diarréia causada por amostras de EHEC é superior ao número de casos associados àq uele sorogrupo do microrganismo. STEC especialmente EHEC é o único grupo de E. coli diarreiogênica cuja origem zoonótica é bem definida. Diversos animais têm sido considerados reservatórios do microrganismo para a infecção de seres humanos, especialmente gado bovino. A doença é adquirida tanto pela ingestão de alimentos e água contaminados, como pelo contara com animais colonizados pelo microrganismo ou com seu ambiente. A infecção por STEC apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, desde quadros mais brandos, como diarréia aquosa sem sangue. a manifestações mais graves, como colite hemorrágica e sua complicação mais frenqueme, a síndrome hemolítica-
urêmica. Colite hemorrágica é caracterizada por elim inação de fezes com grande quantidade de sangue, dor abdominal em cólica. vômiros e ausência de febre, precedida por quadro de diarréia aquosa sem sangue nas primeiras 48 horas da doença. Na maioria das vezes, a doença é autolimitada, com progressão para a cura, sem seqüelas aparentes. Em 5 a 10% dos pacientes, especialmente crianças. a colite hemorrágica pode evoluir, usualmeme em quatro a 13 dias, para síndrome hemolítico-urêmica. caracterizada por anemia hemolítica, trompociropen ia e insuficiência renal aguda. E. coli enteroinvasora (EIEC)
As amostras de EIEC são muico semelhantes a Shigella no que se refere a características bioquímicas e virulência. Os mecanismos de parogenicidade do microrganismo serão descriros no item Shigella. Os dados disponíveis na literatura indicam que a prevalência da diarréia associada a EIEC é baixa. Por outro lado, devido à grande semelhança existente entre Shigella e EIEC inclusive no que se refere à distribuição geográfica do microrganismo, é possível que muitos casos de infecção por EIEC sejam diagnosticados incorrecarnenre corno shigelose. A dose infecta nte de EIEC é aparentemente superior à de Shigella, razão pela qual a transmissão pessoapessoa da bactéria é rara. No que se refere à apresentação clínica, a infecção por EI EC manifesta-se mais com umente pela eliminação de fezes aquosas. mas alguns pacientes podem apresentar quadro típico de shigelose. E. co/i enteroagregativa (EAEC)
EAEC é um patoripo de E. coli diarreiogênica definido pelo padrão agregativo de aderência a células HEp-2, ou seja, na forma de pequenos aglomerados bacterianos, que apresentam grau elevado de auto-aglutinação. A primeira descrição de associação entre o microrganismo e a etiopatogenia da diarréia foi feita no final da década de 80. Desde então, EAEC tem sido considerada um patógeno im portante em diversos cenários clínicos, entre eles diarréia do viajante, diarréia endêrnica em crianças e diarréia persistente. As principais estratégias de virulência desenvolvidas pelo microrganismo são colonização da mucosa dos intestinos delgado e grosso e produção de enterotoxi-
Investigação laboratorial do paciente com diarréia infecciosa aguda
139
nas. Aparentemente, a bactéria induz lesões discretas. mas significativas, na mucosa. especialmente colônica. EAEC produz uma enterowxina denominada ShETl, cujo mecanismo de ação é pouco conhecido, mas que parece contribuir para a diarréia secretória associada ao organismo. Ouua emeromxina elaborada pela bactéria, EASTl, apresenta seqüência de aminoácidos homóloga à da enterowxina STa de ETEC. Essa enterowxina parece contribuir para a gênese da diarréia aq uosa induzida por algumas amostras de EAEC. Admire-se que outros fatores de virulência, entre eles mucinase Pie e roxina Per, estejam envolvidos na erioparogen1a da diarréia associada ao microrganismo. É amplamente reconhecido que o grupo induz aumenco da secreção de muco intestinal. Escudos desenvolvidos em voluntários e pacientes com diarréia do viajante sugerem que a diarréia por EAEC seja aquosa. Na maioria dos casos. a diarréia associada à bactéria caracteriza-se pela eliminação de fezes líquidas, com grande quantidade de muco e sem sangue visível macroscopicamente e acompanha-se de atraso no crescimento da criança acometida. Usualmente, os pacientes são afebris; a doença pode ser prolongada, com du ração superior a 14 dias, em pequeno número de casos, especialmente em neonacos e em indivíduos com infecção por HIV E. co/i de aderência difusa (DAEC)
As amosuas de DAEC constituem um grupo heterogêneo de E. coli diarreiogênica que se adere de forma difusa à superfície de células HEp-2 e Hel a. DAEC expressa tipos diferentes de adesinas, fim briais ou não, que permitem a diferenciação entre subgrupos do microrganismo. Entretanro, os mecanismos de pawgenicidade de DAEC são, ainda, pouco conhecidos. Diversos fawres de virulência descriws para outros grupos diarreiogênicos de E. coli, entre eles sistema de captação de ferro e homólogos de proteínas estruturais e efewras transportadas pelo SSTT. já foram observados em amostras do organismo. Dados relativos à associação de DAEC com a gênese da dia rréia aguda são, ainda, contraditórios. Aparentemente, a suscetibilidade ao microrganismo é influenciada pela idade do indivíduo. De fato, existem evidências de que a bactéria está associada à diarréia aguda em crianças com idade superior a um ano. No
140 ( Medicina laboratorial para o clínico
que se refere a aspecws epidemiológicos e manifestações clínicas da infecção associada a DAEC. existem poucos dados disponíveis na literatura. A maioria dos autores concorda que a diarréia induzida pelo microrganismo é auroli mitada, com eliminação de fezes aquosas e sem hemácias e leucócitos.
Shigella O gênero Shigella 1nclui quatro espécies, S. sonnei, S. flexn en, S. dysentenae e S. boyd11, diferenciadas por meio de propriedades bioquímico-fisiológ1cas e antigên1cas. Todas elas são consideradas agentes etiológicos de infecção intestinal. Shigel/a é capaz de invadir a mucosa colánica, multiplicar-se e disseminar-se entre os enterócicos, induzindo resposta inflamatória aguda e destruição tecidual. A invasão é limitada à superfície epitelial da mucosa intestinal; raramente o microrganismo penetra além da submucosa e, por isco. as infecções extra-intestinais por Sh1gella são raras. A invasão ocorre a partir das células M, sendo a bactéria internalizada por mecanismo semelhante à pinocicose. Após a liberação da vesícula fagocitária, o microrganismo multiplica-se e é liberado pela superfície basal das células M, sendo fagocitado por macrófagos. que sofrem apopcose induzido pelo patógeno, dificultando a lise bacteriana e possibilitando a invasão pela superfície basal dos enteróciros. As bactérias multiplicam-se no interior dessas células e penetram as células adjacentes por meio de protrusões da membrana, resultantes da polimerização de actina induz1da por proteínas eferoras elaboradas pelo microrganismo. Mediadores liberados durante o apoprose de macrófagos e a invasão de enteróciros são quimiotáticos para neutrófilos polimorfonucleares, que lesam a barreira epitelial, faci litando o acesso da bactéria pela via paracelular. Além da capacidade de invasão. Shigella produz enterotoxinas que parecem estar associadas à gênese da diarréia aquosa, característica da fase inicial da doença. Amoscras de S. dysentenae sorotipo I expressam. ainda. uma ciroroxina. Stx. que. como mencionado anteriormente, é virtualmente idêntica à Stxl de STEC. A wxina adere-se a receprores do intestino delgado e bloqueia a absorção de eletróliros, glicose e aminoácidos. No intestino grosso. a wxina liga-se a um glicolípide da célula do hospedeiro e inibe a síntese pro-
téica, levando à morte celular, lesão da microvasculatura do intestino e hemorragia. Shigella é resistente ao ácido gástrico, o que explica sua baixa dose infectante (cerca de 100 células) e, conseqüentemente, a alta contagiosidade da doença. Seres humanos e macacos são os únicos reservatórios naturais do microrganismo. Embora, na maioria das vezes, a doença seja autolimitada, tratamento com drogas antimicrobianas está indicado nos casos graves, usualmente, associados a S.jlexneri ou S. dysenteriae. Habitualmente, a infec: ção por Shigel/a manifesta-se, após período de incubação de um a quatro dias, por diarréia, com eliminação de fezes com sangue, muco e pus, febre alta, cólica abdominal intensa, tenesmo, fadiga, anorexia e mialgia generalizada. Em grande número de casos, a disenteria é precedida por diarréia aquosa, resultante da eliminação de fluidos e eletrólitos, por ação de enterotox1nas sobre os enterócitos. Esta pode ser a única manifestação clínica da shigelose. As principais complicações decorrentes da infecção por Sh1gella incluem distúrbios metabólicos, como hipoglicemia e hiponatremia, e complicações intestinais, como perfuração intestinal, prolapso recai e megacólon tóxico. No caso específico de S. dysenteriae sorotipo I, que expressa Stx, a infecção pode manifestar-se pela eliminação de fezes com grande quantidade de sangue, quadro denominado colite hemorrágica, que pode evoluir para síndrome hemolítico-urêmica, como já mencionado para STEC. A febre e a cólica abdominal que acompanham a doença estão aparentemente relacionadas com a ação neurotóxica da citotoxina. Salmonella ent erica
S. enterica é subdividida em seis grupos, dos quais a subespécie I, que apresenta enorme variedade antigênica, é o de maior interesse na prática médica, uma vez que os demais apenas raramente estão associados a doença em seres humanos. Por esta razão, quando a denominação S. enterica for empregada no decorrer deste capítulo, estaremos fazendo referência à subespécie I do microrganismo. A adesão ao epitélio intestinal ocorre por meio de fímbrias. Proteínas efetoras transportadas pelo SSTT induzem rearranjo do citoesqueleto, com conseqüente formação de protrusões na membrana celular e internalização da bactéria, em vacúolos, nos quais
ocorre multiplicação bacteriana. À semelhança de Shigella, a bactéria invade a mucosa intestinal através das células M; porém, é também capaz de penetrar nos emerócitos pela superfície apical. O microrganismo, liberado pela superfície basal celular, é fagocitado por neutrófilos e macrófagos, o que favorece sua disseminação e, conseqüentemente, a generalização do processo infeccioso. O acúmulo de cAMP no interior de enterócitos estim ula a secreção de eletróliros e eliminação de água, fenômeno provavelmente associado à produção de enteroroxina por alguns sorotipos de S. enterica. O microrganismo encontra-se amplamente distribuído na natureza; aves, bovinos, suínos e répteis, entre outros animais, são considerados reservatórios para a infecção de seres humanos. Portadores assinromáticos também são fome da bactéria. S. entenca é considerada importante agente etiológico de diarréia infecciosa aguda tanto nos países industrializados como nos países em desenvolvimento, sendo a maioria dos casos associada aos sorotipos Typhimunum e Enteritidis. Embora usualmente a doença seja autolimitada, terapia antimicrobiana pode ser necessária para pacientes imunocomprometidos ou para aqueles em que ocorre generalização do processo infeccioso. As man ifestações clínicas da infecção por 5 enterica são variáveis, na dependência do sorotipo envolvido e do estado imunitário do paciente. Diarréia, vômito e cólica abdominal ocorrem na maioria dos casos, logo após o período de incubação, que pode variar de seis a 72 horas. Pode também ocorrer elevação moderada da temperatura corporal e calafrios. Em geral, as fezes não apresentam sangue visível, mas podem conter sangue oculto e leucócitos, em decorrência da resposta inflamatória intestinal. A infecção pode permanecer localizada ou generalizar-se. causando pneumonia, meningite e artrite séptica, entre outras complicações.
Campylobacter
Campylobacter é um dos principais agentes de infecção intestinal em todo o mundo. Entre as espécies do gênero, C. jejuni é a mais freqüentemente associada à diarréia aguda em seres humanos e também a mais
Investigação laboratorial do paciente com diarréia infecciosa aguda
141
bem estudada. Por estas razões, os dados apresentados a seguir referem-se a este microrganismo. Deve-se ressalrar, enu etamo, que outras espécies, como C coli e C upsaliensis, também são agentes importantes de diarréia em seres humanos. Os mecanismos de parogenicidade do microrganismo são ainda pouco compreendidos. O microrganismo exibe flagelos considerados fatores de virulência e existem relatos referentes à produção de adesinas e de toxinas e à capacidade de invasão. Os flagelos conferem à bactéria habilidade para penetrar no muco viscoso que reveste a mucosa intestinal e, desta forma, atingi r o revestimento epitelial. O processo de adesão à mucosa ocorre em várias etapas, por meio de imerações específicas e inespecíficas emre adesinas bacterianas e receptores do hospedeiro, envolvendo, inclusive, a participação dos flagelos. O microrganismo expressa uma enterotoxina semelhante à toxina colérica e várias citotoxinas, entre elas a CDT (cytolethal distending toxin), cujos papéis na fis1opatologia da diarréia por C jejuni não estão ainda esclarecidos. A CDT promove distensão celular e interrupção do ciclo celular na fase G2/M, inclusive em linfócitos T. O microrganismo é capaz de invadir a mucosa dos intestinos delgado e grosso, levando à diarréia inflamatória. A ocorrência de invasão está relacionada com a virulência da amostra bacteriana e com a suscetibilidade individual do hospedeiro e envolve, a exemplo do processo descrito para outros enteropatógenos, alterações no citoesqueleto. Já foi descrita a presença de um homólogo do sistema de secreção tipo IV, codificado por genes plasmidiais, em algumas amostras de C jeJuni. Aparentemente, o microrganismo não é capaz de penetrar de maneira eficiente pela superfície apical dos enterócitos. Evidências sugerem que C JeJUnl invade a mucosa intestinal pela via paracelular ou através das células M. A infecção por C jejuni, microrganismo amplamente distribuído na natureza, é considerada uma zoonose. A bactéria coloniza o trato gastrintestinal de diversos animais, entre eles bovinos, suínos, caprinos e aves, principal reservatório do micro rganismo, associado a mais da metade dos casos esporádicos da infecção. A transmissão da bactéria ocorre, na maioria das vezes, pela via fecal-oral. Nos países em desenvolvimento. a prevalência da campilobacteriose é maior em crianças com idade inferior a dois anos.
ao contrário do que acontece em países desenvolvidos, nos quais é mais comum em crianças com mais de 10 anos. A doença associada ao microrganismo manifesta-se como diarréia aguda, cuja duração é, em geral, de um dia a uma semana, podendo evoluir de forma prolongada. No período de estado, o quadro pode ser indisti nguível daquele causado por outros enceropatógenos invasores. As manifestações mais comuns são mal-estar geral, febre e dor abdominal. além de diarréia, que pode apresentar-se de forma branda. com eliminação de fezes amolecidas, a grave, com eliminação de fezes aquosas em grande volume ou, ainda. fezes com grande quantidade de células inflamatórias ou sangue. A campilobacteriose. embora autolimitada, pode co mplicar-se. como resultado de invasão local, com hemorragia intestinal. adenite mesentérica. peritonite, colecistite e pancreatite, bem como com síndrome de Guillain-Barré, uma doença desmielinizante aguda de nervos periféricos.
Vi brio
Entre os representantes do gênero Vi brio, V cholerae. agente etiológico do cólera, merece destaque pela participação como agente etiológico de infecção intestinal em seres humanos, pela gravidade da doença associada ao mesmo. V cholerae 01. sorogrupo mais bem estudado da espécie. exibe diversas habilidades relacionadas à virulência. como motilidade, produção de adesinas, proceases e enteromxina. À semelhança de C jeJuni, a motilidade, conferida pelos flagelos, e as proteases, que hidrolisam a camada de muco, facilitam o acesso do microrganismo à superfície do enterócito. O pi/lus Tcp (toxin co-regulated pillus), regulado junto com a mxina colérica, promove a colonização do intestino delgado. possibili tando a liberação da mxina colérica na proximidade da superfície do enterócico. A toxina, semelhante à LT de ETEC. liga-se de forma irreversível à membrana das células intestinais, estimula a adenilatociclase e, conseqüentemente, promove aumento da concentração de cAMP, que induz secreção ativa de íons cloro e bicarbonato para o lúmen intestinal, diminuição da absorção de íons sódio e perda de grande volume de água. O sorogrupo 0139 de V cholerae, ao contrário dos demais
142 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1-- - - - -- -- - -- -- - -- - - -- -- - - -- - -- -
sorogrupos não 01, apresenra os mesmos fatores de virulência descricos para o sorogrupo 01. V cholerae é um habitante natural de águas lirorâneas encontrado habitualmente em estuários e ambientes marinhos. no mundo inteiro. A infecção pelo microrganismo acomete exclusivameme seres humanos que, à semelhança de fruros do mar, são imporrames reservatórios da bactéria. Na maioria das regiões geográficas, o cólera é ep1dêmico. excero em alguns países. como a índia, onde a doença é endêmica. A principal caraCterística do cólera é a eliminação de grande quantidade de fezes aquosas. Nos casos mais graves. o indivíduo elimina até um litro de líquido por hora. o que pode provocar desidratação rápida e evolução para choque hipovolêmico e óbito. se o paciente não for tratado de forma adequada. Outras manifestações da doença incluem perda de apetite e vômiro. Além de V cholerae. V parahaemolyticus também é considerado agenre etiológico de diarréia aguda em seres humanos. O hab1tat do microrganismo. à semelhança de V cholerae. é primariamente aquátiCO, sendo comumenre observado em ambientes marinhos e estuannos. bem como na superfície e traco intestinal de animais marinhos. A parogênese da infecção por V parahaemolyticus não é bem conhecida. embora facores de virulência renham sido identificados, entre eles uma enteroroxina. que induz secreção de íon cloreto pelo epitélio inresrmal em conseqüência do aumento de cálcio intracelular. A doença associada ao microrganismo manifesta-se. após período de incubação de até três dias, por diarréia aquosa imensa, cefaléia. dor abdominal em cólica, náuseas, vómitos e febre baixa. Outras espécies de V1bno. como V hollisae, V fluvial is, V mJmJcus e V furnissii, estão raramente associadas à infecção intestinal em seres humanos.
Yersinia
Entre as espécies incluídas no gênero Yersinia, Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis são consideradas enreropatogênicas para seres humanos. Os microrganismos invadem a mucosa intestinal através das células M das placas de Peyer. a exemplo de outros grupos diarreiogênicos já discutidos anteriormente no capítulo. Yersima elabora múltiplos fatores de virulência, quais sejam:
• proteínas de membrana externa (Yops), transportadas por um SSTT. que desempenham diversos papéis na parogênese da infecção pelo organismo; • uma proteína. a invasina, envolvida na adesão bacteriana e na invasão da mucosa intestinal do hospedeiro; • YadA, proteína que favorece a adesão do microrganismo à célula alvo e protege a bactéria contra a ação de farores imunes humorais inacos e do complemento; • um sistema de captação de ferro codificado por genes carreados por uma ilha de parogenicidade; • o antígeno V, com atividade imunomoduladora dependente de receptores To/1-/ike 2; • uma enreroroxina semelhante à ST de ETEC. A regulação desses fatores é complexa e sua expressão visa, em última análise. a auxiliar a bactéria na sua principal estratégia de parogenicidade - impedir a ariv1dade fagocitá na de macrófagos e neutrófilos e neutralizar a resposta imune do hospedeiro. A expressão da virulência de Yersinia é controlada por duas vias independentes. cada uma estimulada por um faror ambiente, temperatura e concentração de íons cálcio. Após atingir seu órgão alvo, o microrganismo adere-se a células intestinais por meio de ligação íntima entre invasinas bacterianas e integrinas expressas por células do hospedeiro. A invasina de Yersima pode, ainda, mediar a invasão bacteriana das células M, estimulando resposta fagocitária. Parece que a ligação íntima patógeno-hospedeiro induz rransdução de sinais. O papel da enteroroxina na virulência da bactéria ainda não é bem conhecido; sabe-se. porém, que se a mesma desempenhar alguma função na gênese da diarréia por Yersm1a, ela deve ser precoce. já que sua produção é interrompida a 37°C. Nesta temperatura, rem início a síntese das Yops. consideradas a principal habilidade de virulência da bactéria. Estas proteínas exibem múltiplas atividades antifagocitárias e tóxicas e são capazes de criar poros para penetração na célula do hospedeiro. A enterire por Y enterocolitica é mais comumente relatada em países desenvolvidos de clima temperado, sendo mais freqüenre no inverno. Suínos são importantes reservatórios para a infecção do ser humano, que pode também ser adquirida pelo conraro com
Investigação laboratorial do paci ente com diarréia infecciosa aguda
143
cães e gatos, entre outros animais. Os principais alimentos envolvidos na transmissão da bactéria são carne de suínos e leite. O microrganismo está associado a um espectro de síndromes clínicas que variam desde enterite aguda não complicada, mais comum
câncer intestinal. e em crianças. A forma de apresentação da doença diarréica causada por Aeromonas varia de quad ros brandos de diarréia aq uosa a formas graves, clinicamente semelhantes à shigelose.
em crianças com aré cinco anos de idade, a ileíre e linfadenite mesentérica. O período de incubação varia de quatro a sete dias e a resolução do quadro ocorre em até 21 dias, na maioria dos casos. A doença caracteriza-se pela presença de febre, diarréia freqüentememe branda, vómitos e dor abdominal em cólica usualmente localizada no quadrante inferior di reito. Complicações tardias, como artrite reativa, miocardite e glomerulonefrite, podem ocorrer numa pequena proporção de pacientes.
Aeromonas
Admite-se que diversas espécies do gênero Aeromonas, em especial A hidrophyla, A caviae e A veronii grupo sobria, estejam associadas a infecções intestinais em seres humanos. O microrganismo produz duas categorias de enterocoxinas: cicocônica, semelhante à coxina colérica, e cicocóxica, também denominada ~-hemolisina ou aerolisina, que induz lesão no epitélio da mucosa intestinal. Além dessas enterotoxinas, amoscras do microrganismo exibem capacidade de invasão e de produção de protease, elastase, fosfolipase, lipase e DNase. O microrganismo é ubíquo, sendo encontrado principalmente em ambientes aquáticos. Parece que seu papel como enteropacógeno é especialmente imporcante em crianças e em adultos com mais de 60 anos. A dose infeccame do microrganismo é mais alta do que a habitualmente descrita para os demais enteropatógenos, o que possivelmente dificulta sua transmissão. A infecção intestinal associada à bactéria geralmente manifesta-se por diarréia aquosa acompanhada ou não por outras manifestações, como febre, vómito, náuseas e cólica abdominal. mais comumente observadas em crianças. Existem também relatos de eliminação de fezes com sangue e muco, que caracterizam quadro de diarréia inflamatória, e de associação de Aeromonas com diarréia crónica, com mais de um mês de evolução. Ambas as situações são mais freqüentemente observadas em pacientes com doença subjacente, como
144 [ Medicina laboratorial para o clín ico
Plesiomonas shigelloides
P. shigelloides, única espécie do gênero, apresenta considerável diversidade antigênica, já tendo sido descritos mais de 100 sorotipos da bactéria. Embora ainda haja controvérsias, relates de casos, escudos microbiológicos e avaliação epidemiológica de surtos sugerem que o microrganismo é agente de d iarréia aguda em seres humanos. Os fatores de virulência da bactéria ainda são pouco conhecidos. O habitat primário do microrganismo é a água e sua aquisição se dá principalmente pela ingestão de alimentos contaminados de origem marinha. Como a espécie exibe capacidade de invasão, a infecção pode manifestar-se como diarréia do tipo inflamatório. Existem também evidências de que a bactéria secreta toxinas termolábil, termoestável e um peptídio similar à toxina colérica, associados ao quadro de diarréia aquosa, bem mais branda que a causada por V cholerae. Os pacientes podem apresentar cólica abdominal. febre e desidratação.
ABORDAGEM LABORATORIAL
A etiologia da diarréia infecciosa é difícil de ser determinada apenas em bases clínicas, pois o mesmo agente pode induzir diarréia por mais de um mecanismo, mais de um agente pode induzir diarréia pelo mesmo mecanismo, a infecção mista não é rara, ao menos nos países em desenvolvimento, e a resposta do hospedeiro influencia a colonização pelo agente e a evolução do processo infeccioso. A solicitação de exames complementares para investigação etiológica da diarréia infecciosa aguda é, na maioria das vezes, desnecessária, uma vez que a maior parte das diarréias de origem infecciosa é aucolimitada . A abordagem laboratorial do paciente está geralmente limitada aos casos graves nos quais hospitalização é necessária, de diarréia persistente ou recorrente e com apresentação
clínica que simula disemeria. Está também 1ndicada nas siruações que envolvam Indivíduos com deficiência do sistema 1mun1tário, que permaneçam em ambiemes fechados (creches, prisões, etc.) ou que têm atividade profissional relacionada com manipulação de alimentos. O diagnóstico laboratorial da diarréia infecciosa é feim uad1c1onalmente por me1o de pesqu1sa de lanoferrina e de leucócitos nas fezes, o que indica processo de natureza inflamatória, detecção do agente etiológico em exame microscópico direto das fezes. isolamenro em meios de cultura artificiais ou métodos Imunológicos, entre eles reaçôes de aglutinação ou ensaios imunoenzimáticos. Com o advento dos métodos de genética molecular, especialmente PCR, a identificação do microrganismo e de seus fatores de virulência tornou-se mais rápida. Embora ainda seja considerado dispendioso, o método é tecnicamente simples, sensível e específico, podendo vir a facilitar o diagnóstico etiológico da diarréia aguda, à semelhança do que já ocorre com d1versas outras doenças infecciosas, especialmente no que se refere à diferenciação dos patotipos de E. coli diarreiogênica.
PESQUISA DE LEUCÓCITOS FECAIS Embora não seja considerado um teste microbiológico clássico, a pesquisa de leucócitos fecais é um exame laboratorial empregado no diagnóstico da diarréia infecc1osa aguda, permitindo discriminar entre diarréia inflamatória e não inflamatória. Admite-se que a presença de leucócitos fecais está relacionada ao aumento de cerca de seis vezes do risco de o paciente apresentar diarréia associada a enteropatógenos invasores. O achado dessas células em espécimes fecais não define a etiologia, mas restringe a gama de agentes etiológicos àq ueles capazes de invadir a mucosa intestinal, o que se reveste de importância na clínica, uma vez que o teste é rápido e pode orientar a decisão de submeter o paciente a tratamento com drogas antimicrobianas. Entre os microrganismos associados à etiologia da diarréia inflamatória, podem ser incluídos Shigella, S. entenca, Campylobacter e EIEC. A seleção de porções da amostra que apresentam muco ou sangue aumenta a chance de detecção de
leucóciws. O teste pode ser realizado pelo exame de preparações a fresco ou pela detecção de lacroferrina. A pesquisa de leucóciws fecais também pode ser feita pela análise microscópica de esfregaços corados com corantes hemarológicos, como Giemsa, Leishman e MayGrünwald, o que facilita a idemificaçào morfológica dos leucóciws. Entre as limitações dessa técnica, podem ser citadas: falta de padronização. necessidade de processamento imediato e impossibilidade de utilização de amostra colh1da por meio de swab ou obitida de fralda.
A fresco
O exame a fresco é realizado habitualmente após a mistura de partes iguais da amostra feca l e de azul de metileno de Loeffler. A preparação deve ser observada em microscópio óptico. com objetiva de 40 x, logo após a colheita do espécime. ão existe consenso no que se refere ao wtoff apropnado para discrim1nar diarréia inflamatória de não in flamatória; valores entre um e 20 leucócitos/campo são propostos por diferentes autores para a diferenciação entre os dois tipos de diarréia infecciosa aguda. Na maioria das vezes. o achado de leucócicos nas fezes de paciente com suspeita de diarréia infecciosa sugere a necessidade de realização de coproculrura.
Detecção de lactoferrina
A técnica mais utilizada para pesquisa de laccoferrina é o teste de aglutinação do látex. Lacroferrina é uma substância encontrada em grânulos de polimorfonucleares neutrófilos, não estando presente em linfócitos e monócitos. O método permite a detecção de concentrações menores que 1 ng de lactoferrina/~L de amostra, o que corresponde à presença de menos de 200 neutrófilos/~L de amostra, número 1nferior ao observado na maioria dos casos de diarréia de natureza inflamatória. Entre as vantagens da técnica. podem ser citadas a possibilidade de armazenamento do espécime fecal. devido à grande estabilidade da substância, de utilização de amosuas colhidas por meio de swab, e de detecção de células difíceis de ser identificadas devido a alterações morfológicas, bem como a elimmação da
Investigação laborato rial do paciente com diar réia infecciosa aguda
145
subjetividade do exame microscópico. Seus principais inconvenientes são a possibilidade de resulcados falsopositivos para crianças alimentadas com leite materno, a inespecificidade, uma vez que não Identifica o agente etiológico, e o custo elevado.
ramo, o procedimento, mais sensível que os mérodos baseados na detecção de antígenos, não é utilizado roti neiramente. A PCR é útil para a confirmação de resultados obtidos por meio de ounas técnicas e para a análise de amosnas que apresentam baixos níveis de partículas virais.
INVESTIGAÇÃO MICROBIO LÓGICA
Bactérias Vírus
Exame direto
A detecção de vírus associados à 1nfecção intestinal pode ser realizada por meio de observação direta em microscópio eletrônico. Embora a técn1ca seja útil. seu emprego está restrito a laboratónos de referência. Cultivo celular de agentes virais não é considerado um mécodo adequado para fins diagnósticos, uma vez que é tecnicamente trabalhoso, demorado e dispendioso. A incorporação de técnicas de imunoensaio mais sensíveis para detecção de antígenos virais nas fezes e o desenvolvimento de mécodos de genética molecular têm contribuído para cornar o diagnóstico de infecções intestinais por vírus mais acurado e, em conseqüência, para esclarecimento da importância clínica desses organismos como agentes de diarréia.
A fresco Embora não seja realizado pela maioria dos laboratórios por razões práticas, o exame a fresco de espéc imes fecais, especialmente empregando-se microscopia de contraste de fase ou de campo escuro, é útil para a identificação de Campylobacter e de Vibrio, com base na morfologia e motilidade típicas dos microrganismos - basronetes curvos que ex1 bem motilidade em dardo ou em saca-rolha. Corado pelo Gram
Uma ampla variedade de técnicas para detecção de anrígenos vira1s em amostras fecais foi desenvolvida nos últimos anos, entre elas ELISA, aglutinação de partículas de látex e imunocromatografia, rodas disponíveis comercialmente para pesquisa de Rotavirus, Adenowus e Astrov1rus. ELISA é uma técn1ca mais sensível que a observação d 1reta em microscópio elecrônico e apresenta especificidade elevada para . detecção de Rotavirus grupo A. O ensaio de aglutinação do látex é menos sensível do que o ELISA. Por outro lado, a 1munocro marografia, teste rápido e tecnicamente muiro simples, apresenta sensibilidade e especificidade semelhantes às do ELISA.
Na maioria das vezes, o exame microscópico de esfregaço de fezes corado pelo mécodo Gram é pouco informatiVO, uma vez que a microb1ota indígena intestinal é muito rica e diversificada e grande parre dos agentes etiológicos de diarréia bacteriana aguda apresenta características morfotintoriais semelhantes às dos membros da referida microb1ota. Por estas razões, a indicação do teste está limitada ao diagnóstico presuntivo de infecção intestinal por Campylobacter e Vibno, bastonetes Gram negativo curvos raramente observados na microbiota indígena intestinal de md1víduos hígidos. O exame apresenta alta especificidade e ba1xa sensib1l1dade. provavelmente associada ao fato de que os microrganismos são bastonetes delgados, o que dificulta sua observação. A utilização de uma outra técnica de coloração, que emprega carbolfucsina diluída (1:1). é mais adequada para a coloração dessas bactérias, aumentando a sensibilidade do teste.
Técnicas de genética molecular
Cultivo
A PCR tem sido desenvolvida para pesquisa de diversos vírus associados à infecção intestinal. Entre-
Embora seJa considerado o método de referência no diagnóstico etiológico da diarréia aguda, o isolamento
Detecção de antígenos
146 [ Medic ina laboratorial para o clínico
do ageme em meios de cultura artificiais é procedimento pouco sensível. demorado e dispendioso, uma das razões pelas quais sua indicação é bastante restrita. Além disco, para alguns grupos bacterianos, apenas o isolamento da baccéria não é suficiente para o diagnóstico. Este é o caso, por exemplo, de E. coli; para este microrganismo, a identificação no nível de espécie deve ser complementada pela pesquisa de fawres de virulência, que diferenciam amostras enteropatogênicas daquelas que fazem parte da microbiota indígena intestinal. A metodologia empregada para detecção da maioria destes e de fawres de virulência de outros grupos de enteropatógenos não é acessível à maior parte dos laboratórios de diagnóstico, por envolver técnicas dispendiosas e de difícil manutenção, entre elas ensaios em modelos animais experi mentais e em cultura de células. O custo da realização de coprocultura para isolamento de todos os enteropatógenos reconhecidos é proibitivo. A decisão relativa aos microrganismos que devem ser incluídos no protocolo de diagnóstico deve considerar, entre outros fatores, a prevalência dos mesmos. A maioria dos laboratórios da nossa região emprega procedimentos que visam ao isolamento de Shigella, S. entenca e alguns patotipos de E. coli. A colheita do espécime fecal (cerca de 5 mL) deve ser feita em frasco de boca larga, inquebrável e estéril. As amostras devem ser processadas o mais rapidamente possível, idealmente no prazo de duas horas após a colheita do material, para possibilitar o isolamento de microrganismos mais sensíveis, como Shigella. Caso não seja possível o processamento em duas horas, podem ser usados meios de transporte, entre eles Cary-Biair e glicerol tamponado. Na impossibilidade de obtenção da amostra por evacuação espontânea, swabs recais podem ser empregados, exceto para a pesquisa de toxinas, de antígenos vi rais e de leucócitos fecais, como mencionado anteriormente O material deve ser inoculado imediatamente nos meios de cultivo ou mantido em meio de transporte até o processamento. Para a recuperação de bactérias enteropatogênicas, são adorados. habitualmente, meios de cultivo seletivos e indicadores. Na maioria das vezes, as culruras são incubadas em atmosfera ambiente (aerobiose), a cerca de 35°(. por um período de aproximadamente 24 horas. Um meio de cultura de baixa seletividade e um de média selerividade, bem como um meio de enriqueci-
menco, são geralmente utilizados para o isolamento de enterobacrérias. O emprego de um meio rico não seletivo, como Ágar Sangue, é indicado, embora sua LI( iIidade para isolamento de enteroparógenos a partir de amostras fecais seja questionável. Entre os meios de cultura de baixa selerividade, podem ser citados Ágar MacConkey e Ágar Eosina-Azul de Metileno, adequados para o cultivo de E. coli, S. enterica, Shigella, Yersinia e P. shigelloides. Ágar Salmonella-Shigella, Ágar Encérico Hekroen e Ágar XiloseLisina-Desoxicolato são considerados meios de média seletividade que favorecem o isolamento de S. enterica e Shigella. inibindo a multiplicação de baccérias gram positivo e retardando ou inibindo a multiplicação de coliformes. Os meios de alta seletividade, como Ágar Verde-Brilhante e aqueles com sulfito de bismuto, não são utilizados na rotina, sendo úteis para o isolamento de S. entenca Typhi de amostras fecais. Caldo Selenito e Caldo Tetrationaco são meios de enriquecimento empregados com o objetivo de favorecer o isolamento de S. enterica. Após incubação a 37•c pelo período de tempo adequado, são realizados subcultivos, a partir do meio de enriquecimento, em meios de média seletividade. Para o isolamentO de Y enterocol1tica, pode ser empregado um meio seletivo e diferencial. como Ágar Cefsulodina-lrgasan- Novobiocina. Na rotina, habitualmente o meio não é utilizado, uma vez que a bactéria desenvolve-se bem em meios de baixa e média seletividade. A temperatura ideal para multiplicação do microrganismo é de 25 a 3o·c. Existem controvérsias no que se refere à necessidade de utilização de técnica de enriquecimento a frio (4°C), em salina tamponada, para favorecer o isolamento de Y enterocolit1ca. Alguns autores sugerem que o procedimento é desnecessário para recuperação do microrganismo a partir de amostras fecais de pacientes com diarréia, devendo ser empregado quando há suspeita de ileíte terminal ou de artrite pós-infecciosa sem diarréia. O isolamento de P. shigell01des pode ser feiro em Ágar Sangue acrescido de ampicilina. Ágar Cefsulodinalrgasan-Novobiocina e Ágar MacConkey. Para o cultivo de Campylobacter. são utilizados meios seletivos que incluem drogas antimicrobianas, adicionados a uma base rica, em sua constituição. É possível que esses meios inibam a multiplicação, inclustve, de algumas espécies do microrganismo. Para alguns aurores, a adição de carvão ao meio de cultura favorece o isolamento da bactéria. A atmosfera ideal de incubação é a de microaero-
Investigação laboratorial do paciente com diarré ia infecciosa aguda
147
filia e, para cul[ivo de espécies [ermofílicas, a [emperarura de incubação deve ser 42•(. o que wrna o procedimento mais seletivo. Entretanto, esta temperatura pode impedir o isolamento de espécies não termofílicas de Campylobacter termofilicas, que também podem causar diarréia. Caso haja suspeica clín1ca de envolvimemo de V cholerae ou a área seja considerada endêmica para o microrganismo, deve ser empregado meio seletivo. como Ágar Tiossulfato-Citrato-Sais Biliares-Sacarose. V cholerae também pode ser cultivado em Ágar MacConkey e em Ágar Sangue. Água Peptonada Alcalina (pH 8.4) pode ser utilizada como caldo de enriquecimento. O isolamento de Aeromonas pode ser realizado em meios rotineiramente empregados para o cultivo de enterobactérias, como Ágar Hektoen e Ágar MacConkey. Meios de cultura seletivos, como Ágar Sangue acrescido de ampicilina ou Ágar Cefsulodina-lrgasan-Novobiocina, também podem ser utilizados, embora os antimicrobianos possam inibir algumas espécies do gênero. Como mencionado para V cholerae, Água Peptonada Alcalina pode ser adorada para enriquecimento. especialmente quando o quadro clínico sugere eliminação de níve1s baixos do microrganismo. O isolamento de possíveis enteropatógenos é seguido pela identificação por métodos bioquímico-fisiológicos e imunológicos (restes de aglutinação com anti-soros específicos). Identificação
Morfonntonal Todas as bactérias diarreiogênicas mencionadas neste capítulo são classificadas como bastonetes Gram negativo. Algumas delas exibem morfologia característica: V cholerae, que pode se apresentar como bastonete ligeiramente curvo. curvo ou em forma de vírgula, e C. JeJuni, bastonete delgado e curvo. em forma de vírgula. de asa de gaivota, de "S" ou espiralada. Como já mencionado, C. Jejuni pode ser mais facilmente identificado quando se emprega coloração por carbolfucsina diluída. BioquímiCO-fisiológica A identificação de bactérias diarreiogênicas obedece às mesmas orientações empregadas para outras
148 [ Medicina laborawrial para o clínico
bac(érias de impor[ância médica. conforme descriw no Capítulo 6. Após observação das características morfológicas. colónias diferentes devem ser submetidas à identificação bioquímico-fisiológica. Habitualmente. as amostras são transferidas para meios de triagem, como o Agar Tríplice Açúcar Ferro, indicado para a idemificação presuntiva de enterobactérias. Postenormente, são usadas baterias de identificação, na maioria das vezes kits comerciais, escolhidas de acordo com os resultados previamente obtidos. lmunológ1ca Na prática, a identificação imunológica de bactérias enteropatogênicas é realizada para Shigelfa. S. enterica, E. colt e. eventualmente, para V cholerae e Y enterocolitica. A técnica utilizada na maioria dos laboratórios de rotina é a reação de aglutinação em lâmina, em pregando-se suspensão bacteriana e anticorpos específicos. A pesquisa de antígenos específicos é necessária para a identificação de espécies do gênero Shtgelfa. De fato, o método é essenCial para a diferenciação entre S.jlexnen e S. boydii e necessária para a confirmação da identificação de S. dysenteriae e de S. sonnei. No que se refere a S. enterica. o procedimento realizado na maiona dos laboratórios de rotina limita-se à identificação de sorogrupos. A determinação dos sorotipos do microrganismo é realizada apenas em laboratórios de referência, uma vez que o procedimento é complexo, em decorrência da enorme diversidade antigênica da espécie. A sorotipagem completa de E. coli diarre1ogên ica é um procedimento inviável para a grande ma1ona dos laboratónos, por ser extremamente trabalhoso e requerer um nLimero elevado de anci-soros específicos. Por esta razão, apenas alguns grupos enceroparogênicos do microrganismo são identificados na rotina, entre eles EH EC e EPEC. A discriminação entre patocipos diarreiogênicos de E. colt baseada em sorotipagem nem sempre corresponde à caracterização realizada por técnicas de genética molecular, consideradas como referência para identificação do microrganismo. Alguns sororipos classicamente incluídos em um determinado grupo diarreiogênico são atualmente considerados membros de outros patotipos enteropatogênicos da espécie. Assim, à luz dos conhecimentos aruais, gerados por estudos que contribuíram para elucidar os mecanismos de patogenicidade do mi-
crorganismo, a sormipagem não deve mais ser empregada como único mémdo para caraccerização dos grupos diarreiogênicos de E. coil. A sororipagem de amosrras baccerianas suspeiras de Y enterocolitica e V cholerae sorogrupo 01 é utilizada na confirmação da idenCificação desses microrganismos. No que se refere ao V cholerae sorogrupos 01 e 0139, o diagnóstico da infecção pode ser feico direcameme das fezes por restes de aglutinação de parcículas de látex recobercas com anticorpos específicos ou por meio do cesce de imobilização microscópica urilizando anri-soros específicos. Mérodos de genérica molecular Além da abordagem 11icrobiológica uadloonal. mérodos de genér1ca molecular, especialmente PCR, podem ser empregados para a iden:ificação de parógenos eméricos. Embora sejam considerados sensíveis e específicos, sua aplicação ainda é muiro resrrira, por diversas razões. entre elas falra de pessoal ueinado e cusro-benefício desfavorável. D1versas regiões do genoma podem ser selecionadas como alvo para essas reações, como seqüências específicas do rDNA 16S, presente em wdas as eubactérias. ou genes que codificam fawres de virulência observados em determinados grupos microbianos, o que permite ramo a Identificação como a genotipagem do microrganismo. A possibilidade de utilização de DNA exrraído direramenre do espécime fecal abre perspeccivas para padronização e aplicação de um mérodo sensível e específico para o d1agnóscico eCiológico rápido da diarréia infecciosa aguda.
suspeira de choque. De forma semelhante, o hemograma não é solicitado na maioria dos :asos. A realização do exame rambém esrá limitada aos casos graves, quando há suspeica de diarréia inflamacória ou de generalização do processo infeccioso. Alcerações no exame são raramente observadas; a principal delas é a leucocirose, detectada especialmente em pacientes com diarréia inflamarória. Deve ser lembrado que, na fase aguda da shigelose, leucopenia pode ser dereccada. Na síndrome hemolítico-urêmica, associada à infecção por S. dysentenae e por STEC. o paciente apresenta anemia e uombociropenia. No caso de infecção por S. enterica. como o microrganismo invade os tecidos mais profundamente, o que favorece a disseminação do processo infeccioso e a ocorrênoa de bacteremia, a solicitação de hemoculrura está ind1cada. REFERÊNCIAS I.
2.
3.
4. S.
6.
7. 8.
EXAMES GERAIS 9.
A soliciração de oucros exames complementares não esrá indicada na maioria das vezes. Dosagem de sódio, porássio e clorecos é recomendada para avaliação de pacienres com s1nais de desidracação importante, especialmente daqueles que apresentam vômiros. Gasometria raramente é solicitada, sendo empregada apenas para acompanhamento dos casos graves. principalmente daqueles com
Investigação laboratorial do paciente com diarréia infecciosa aguda
Baker M , Bamam J. Ca1rncross S. Calderon RL. Chalmers R. Colford )r )M. er ai. Resolv1ng :he global burden of gasrromresr,nallllness; a calI ro acnon. ln: The global burden of 1nfecr1ous d1seases rhrough rhe gastro1nresrinal rracr: a cmical assessmem of exposure. D1sponível em: http:// www.asm.org. Forbes BA. Sahm DF. We1ssfeld AS. Balley & Scon's Dlagnosnc M1crob1ology. 11th ed. Sr. Lou1s: Mosby; 2002. 1069 p. Heesemann J. S1ng A. Trülzsch K. Yersm/Q's srraragem: targenng innare and adaptarive 1mmune defense. Curr Opm Microbial. 2006;9:55-61. Moore JE. Corcoran D. Dooley JSG. Fanmng 5, Lucey B. Matsuda M , et ai. Campylobacce~ Ver Res. 2005;36:351-82. Murray PR. Baron EJ. Jorgensen JH. Pfaller MA. Yolken RH. Manual of Clin1cal M1crobiology. 8• ed. Washingron: ASM Press; 2003. Nataro JP. Kaper JB. D1arrheagen1c Eschench1a col1. Clin M1crob1ol Rev. 1998;11:142-201. NJY081 SK. Shigellos1s. J M1crob1ol. 2005.43:133-43. Ohl ME. Miller SI. Salmonella: A model for bactenal parhogenesis. Annu Rev Med. 2001;52:259-74. Schaechrer M, Engleberg NC. Eisenstein 131. Medoff G. Mechan1sms of M icrobial Disease. 3' ed. Balr1more: Williams & Wilkins; 1998.
149
15
Andreia Maria Camargos Rocha Gifone Aguiar Rocha Taciana de Figueiredo Soares Dulciene Maria de Magalhães Queiroz
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM INFECÇÃO POR
Helicobacter pylori
O Hel1cobacter pylori é responsável por uma das infec: ções bacterianas crônicas mais freqüentes, atingindo cerca de 50%da população mundial. Embora não leve a qualquer conseqüência clínica na maioria dos indivíduos acometidos, a infecção pode resultar em doenças graves, como úlcera péptica duodenal, úlcera péptica gástrica, carcinoma gástrico distal e linfoma gástrico do tipo MALT em 15 a 20% dos casos. Pelo menos sete milhões de casos dessas doenças ocorrem anualmente ao redor do mundo, resultando em centenas de milhares de mortes. O carcinoma gástrico é, atualmente, a 14 3 causa de morce no mundo, mas, considerando-se o envelhecimento da população mundial, é esperado que seja a oitava causa por volca do ano de 2010. O H. pylori foi isolado da mucosa gásuica de seres humanos em 1982 por Warren e Marshall. A descrição do microrganismo e de sua associação com a doença ulcerosa péprica foi cão relevante para a Medicina que os pesquisadores receberam, no ano de 2005, o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina.
DOENÇAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO
não esteja completamente esclarecida, a infecção leva a alterações importantes da fisiologia gástrica, em especial dos mecanismos de secreção ácida que estão intimamente ligados à gênese da doença. Na infecção, especialmente por amostras cagA- positivas e ciroroxigênicas, há diminuição das células D e inibição da produção de somarostatina por essas células, resultando em hipergascrinemia e aumento da secreção ácida. Quando a infecção é limitada à mucosa antral e acom panhada por aumento sign ificativo de gastrina plasmática, a secreção de ácido torna-se excessivamente elevada. Como a infecção também reduz a secreção duodenal de HCo3· e de muco, a mucosa duodenal se rorna permeável e é lesada pelos íons H+ e outros irritantes, sendo substituída por mucosa gástrica metaplásica. Assim, a bactéria presente na mucosa gástrica migra e coloniza as áreas de metaplasia gástrica no duodeno, aumenta a inflamação e lesão, predispondo ao desenvolvimento da úlcera. A extensão da infecção para a mucosa oxíntica e o desenvolvimento de gascrice atrófica favorece a ulcerogênese gástrica ou a carcinogênese, podendo ser acompanhada por alteração dos níveis plasmáticos de gasrrina e diminuição da secreção gásuica de ácido.
ÚLCERA PÉPTICA A infecção pelo H. pylori é o fator causal da maioria das úlceras duodenais e gástricas e a erradicação do microrganismo reduz drasticamente as taxas de recorrência da doença. Embora a patogênese da doença ulcerosa
CARCINOMA GÁSTRI CO Em 1994, a infecção pelo H. pylori foi considerada pela Organização Mundial de Saúde carcinogênica do
tipo I. A hipótese da associação enue a bactéria e o carcinoma gástrico foi fundamentada. inicialmente, na observação de que. entre os indivíduos que apresentam gamite crónica associada à infecção por H. pylori, um grupo evolui com atrofia da mucosa gástrica conside-
cuidadoso à microscopia óptica de corres histológicos de fragmentos de biópsia. processados rotineiramente.
OUTRAS AFECÇÕES
rada condição pré-cancerosa. Foi emão proposm que a infecção pela bactéria poderia evoluir, ao longo de décadas, para condições pré-cancerosas, como atrofia gástrica e metaplasia intestinal, culminando com o aparecimento do carc-inoma gástrico No encanto. foram os resultados obtidos em estudos do tipo caso-controle que vincularam de forma consistente e definitiva o H. pylori ao carcinoma gástrico. Assim. tra balhos desenvolvidos na Inglaterra, nos Estados Unidos e com japoneses residentes nos Estados Unidos demonstraram que a infecção pelo H. pylori precede o desenvolvimento do carcinoma gástrico e que está associada a risco aumentado de desenvolvimento da neoplasia. Recentemente, a doença foi reproduzida experimentalmente em modelo animal infectado pela bactéria.
LINFOMA MALT A mucosa gástrica normal é desprovida de tecido linfóide que surge de forma organizada (MALT). na grande maioria das vezes em decorrência da infecção pelo H. pylori. Nos raros pacientes infectados pelo H. helmannii também há o aparecimento de MALT. O linfoma gámico MALT emerge de um dos compartimentos desse tecido linfóide. quase que exclusivamente da zona marginal. como um linfoma de células B. T dependentes. Ao cessar o estímulo antigênico às células T. com a erradicação do H. pylon, e na dependência do estágio de evolução da lesão e do número de mutações já ocorrido. há regressão completa do tumor, inclusive da monoclonalidade. como rem sido demonstrado em estudos de acom panhamento (por mais de cinco anos) a pacientes tratados apenas com terapia anrimicrobiana. Os critérios pelos quais o diagnóstico de linfoma é feito permanecem até cerro pomo controversos. Distinguir linfoma MALT de infiltrado linfocitário reacional às vezes é uma tarefa difícil e exige experiência do patologista. A identificação de populações clonais por imunociroquímica ou métodos moleculares pode auxiliar no diagnóstico que. entretanto. só pode ser confirmado pelo exame
152 [Medicina laboratorial para o clínico
A infecção pelo H. pylon, embora confinada ao estômago, é acompanhada de resposta imunológica sistêmlca que pode contribuir para o desenvolvimento de doenças de localização extradigestiva. Como essas doenças são multifatoriais. torna-se difícil demonstrar a relação causal. Enrrecanro. consiscenremenre, cem-se observado associação entre infecção por amostras de H. pylori cagA-positivas e acerosclerose. doença coronariana e infano agudo do miocárdio. A infecção cem sido também associada à púrpura trombocitopênica imunológica em até 50% dos adultos com a doença. percentual calculado com base nas taxas de remissão observadas com a erradicação da bactéria. Demonstrou-se anrigenicidade cruzada com antígenos de superfície plaquetária e proteína CagA de H. pylon. A 1nfecção crónica acompanhada de hipocloridria pode, ainda, diminuir a absorção de ferro e vitamina B12 levando à anemia ferropriva e megaloblástica, respectivamente. Finalmente, há estudos associando a infecção às complicações de heparopatias causadas por vírus das hepatites Be C.
CARACTERÍSTICAS DA BACTÉRIA
O H. pylori é um microrganismo Gram negativo esplralado. não esporulado. móvel e de superfície lisa. Mede aproximadamente O.S~m de largura e 2,0 a 3,0 ~m de comprimento e apresenta um número variável de quatro a seis flagelos uni ou bipolares embainhados e com bulbos terminais nas extremidades distais. É uma bactéria microaerófila que cresce bem a 37"C. necessitando de um período de incubação de trê<; a sete dias. O microrganismo produz numerosas enzimas. como fosfatase alcalina, superóxido dismutase, aminopeptidase. desoxirribonuclease e urease. Apesar de ser catalase e oxidase positivo. não reduz nitrato a nitrito. não fermenta a glicose e não hidrolisa o hipurato de sódio. O H. pylori é encontrado na mucosa gástrica, podendo ser isolado do antro, local onde se observa a maior densidade bacteriana. do corpo ou do fundo gástricos.
além de áreas de metaplasia gástrica localizadas em oueras regiões, como no esôfago, duodeno e divercículo de Meckel. O microrganismo distribui-se de forma focal, segmentar ou difusa no interior ou abaixo da camada de muco que recobre o epitélio de superfície e das fovéolas gásuicas. Recentemente, o microrganismo foi isolado do fígado de pacientes com cirrose hepática, sugerindo uma possível participação da bactéria na evolução das hepacopatias crônicas. Apenas o homem e provavelmente alguns primatas são naturalmente colonizados pelo H. pylori, que persiste cronicamente na mucosa gástrica do hospedeiro humano ao longo de coda sua existência.
FATORES DE VIRULÊNCIA DO H. pylori
Entre os fatores de virulência da baccéria, alguns são comuns a todas, como motilidade, microaerofilia, atividade ureásica e lipopolissacárides e estão relacionados à adaptação e persistência do microrga nismo no ambiente gástrico. Outros estão presentes apenas em determinadas amostras, estando associados ao surgimento das doenças. O cagA é um marcador da presença da ilha de patogenicidade cag (PAI cag), consistindo de um fragmento de DNA de 40 Kb, adquirido e integrado ao cromossomo do H. pylon, que contém cerca de 40 genes. A maioria deles codifica proteínas com várias funções, entre elas a translocação da proteína CagA, de 120 kOa, para dentro do cicoplasma das células epiteliais gástricas, onde é fosforilada pelas quinases c-Src e Lyn das células do hospedeiro. Depois de fosforilada, liga-se e ativa a fosfatase celular SHP-2, desencadeando mudanças acentuadas no ciroesquelero e levando à formação de pedestais que permitem mais aderência bacteriana. Vários genes da ilha estão, ainda, envolvidos na estimulação da produção de interleucina 8 (IL-8) pelas células epiteliais gástricas. A IL-8 é um potente fator quimiorácico e acivador de leucócitos polimorfonucleares e macrófagos, contribuindo para uma resposta inflamatória mais acentuada nos pacientes colonizados por amostras PAI cag-posicivas. Outras atividades associadas à PAI cag incluem ativação da transcrição do fator AP-1 e acivação da expressão dos proto-oncogenes c-jos e c-jun, que desempenham papel crucial na proliferação e transformação celular,
predispondo à oncogênese. Pacientes infeccados por amostras cagA-positivas apresentam maior densidade bacteriana na mucosa gástrica, lesões mais graves do epitélio gástrico, infiltrado de leucócicos polimorfonucleares mais imenso e níveis mais elevados de cirocinas pró-inflamrórias IL-1 a, IL-1P e IL-8 do que indivíduos infectados por amostras cagA-negativas, o que torna plausível a associação que tem sido freqüentemente relatada entre a infecção por amostras cagA-positivas e a doença ulcerosa péptica ou carcinoma gástrico. No Brasil, 90,0 a 95,0% das amostras isoladas de adulcos e crianças com úlcera duodenal e 95,0 a 100,0% das amostras isoladas de pacientes com carcinoma gástrico são cagA-positivas. Em pacienres H. pylori-posirivos, porém sem essas doenças, aproximadamente 55,0% das amostras isoladas expressam a proreína CagA. O gene vacA, presente em rodas as amostras de H. pylori, codifica a proteína VacA (citotoxina vacuolizante). uma exotoxina capaz de induzir diretamente a formação de vacúolos intracitoplasmácicos, a destruição de mitocôndrias, a liberação de citocromo e a morte de células epiceliais por apoptose, eventos que lesam a mucosa gástrica. Além disso. a toxina aumenta a permeabilidade epitelial. o que pode facilitar canto a passagem de substâncias tóxicas para dentro do epitélio como a difusão de nutrientes para a camada mucosa, favorecendo a sobrevivência do H. py/ori. VacA ainda estimula a resposta inflamatória da mucosa gástrica por diferentes mecanismos, como, por exemplo, pelo aumento da expressão da enzima ciclooxigenase 2 (COX-2) não somente em células T, mas também em neutrófilos e macrófagos. A proteína, também, participa na modulação da resposta imunológica do hospedeiro, contribuindo para sua persistência. É capaz de inibir a proliferação de células T pela inibição da ativação do fator nuclear de células T ativadas (N FAT), com conseqüente bloqueio da secreção de IL-2. No vacA há duas famílias de seqüências sinalizadoras, denominadas s1 e s2 com as variações s1a, slb e slc, bem como variações localizadas na região média do gene, ml e m2. Padrões distintos estão associados a amostras produtoras ou não da toxina e diferenças quantitativas de produção. As amostras de H. pylori vacA tipo sl são consideradas mais virulentas que as s2 e são mais freqüencemente observadas em pacientes com úlcera péptica e carcinoma gástrico que naqueles com gastrite. Na nossa
Investigação laboratorial do paciente com infecção por Helicobacter pylori
153
população. 85,0 a 90,0% das amos(ras isoladas de crianças e adulcos com úlcera duodenal e 94,0% das amosuas 1soladas de pacientes com caronoma gástrico são do ri po s1, especialmente s1 b. Nos pacientes infectados, porém sem úlcera péprica ou carcinoma gásrrico, apenas cerca de SO.O% das amosrras isoladas são do ripo sl. Em 1998, llver et a/. identificaram e caraccerizaram uma adesina de peso molecular de 78 kDa. situada na membrana externa do H. pylorí, denominando-a blood group antigen-binding adhesm (BabA). Foram identificados três alelos do gene bab: babA1, babA2 e babB. Baba1 e babA2 são idênticos, exceco por uma deleção de 10 pb na seqüência sinal do peptídeo em babA1 , que leva à eliminação do códon de iniciação. As seqüências de babA2 e babB são muico semelhantes nas regiões 3' e 5', mas apresentam variações na região média. Os dois alelos codificam proteínas homólogas pertencentes à família de 32 proteínas de membrana externa de H. pylori, mas somente o produco de babA2 cem a propriedade de se ligar especificamente aos antígenos Lewis b e H-1. Os antígenos de Lewis, relacionados aos grupos sanguíneos ABO, são expressos na superfície das células da mucosa gástrica. A aderência do H. pylori ao epitélio gástrico. mediada pela proteína BabA, parece desempenhar papel crítico na transferência de facores de virulência bacterianos, que produzem lesões no tecido do hospedeirO, seja diretamence ou por me1o de reação inflamatória e/ou de aura-imunidade. Além disso, bactérias que se mantêm mais aderidas ficam menos expostas à eliminação decorrente dos movimentos peristálticos. Assim, supostamente por serem mais capazes de colonizar e de se manterem no nicho, a densidade bacteriana no estômago dos pacientes que expressam o antígeno Lewis b pode ser muico alta. Embora haja estudos assoc1ando a presença do gene babA2 a úlcera péptica e carcinoma gástrico. como a pesquisa do gene foi feita por reação de polimerização em cadeia (PCR), que isoladamente não cem sido considerada satisfatória, os dados devem ser reviscos, sendo necessários experimentos de aderência m v1tro para a caracterização das amostras. A aderência da bactéria à mucosa gástrica é também mediada pela proteína SabA, que se liga a resíduos glicoconjugados de ácido s1álico expressos na superfície das células epiteliais na vigência de processo inflamatóno ou neoplásico. A expressão de ácido siálico, rara na mucosa
154 [
Medicina laboratorial para o clínico
gásrrica normal, é induzida pela infecção pelo H. pylorí, o que contribui para a cronicidade da infecção. A adesina SabA parcicipa da ativação de neutrófilos por mecanismos outros que não envolvem a opsonização da baccéria. Oucros genes, como 01pA e alpAB, que codificam proreínas de membrana exrerna do microrganismo, bem como o gene iceA (mducible by contact w1th eplthelium), têm sido associados à maior virulência das amoscras, embora não se conheçam as funções dos seus producos. Recencemence. foi descrico um novo facor de virulência de H. pylori denominado dupA (duodenal ulcer promotmg gene). O dupA, localizado na região de plasticidade do genoma bacteriano, corresponde à fusão dos genes jhp091 7 e jhp0918 com a 1nserção de uma base que pode ser C ou T. Na desc rição do gene, os aucores moscraram associação com úlcera duodenal. Esses achados, emrecanco, não foram confirmados pelo nosso grupo na população brasileira, indicando possíveis diferenças geográficas.
FATORES DE RISCO LIGADOS AO HOSPEDEIRO
Existem evidências de que facores hereditários participam na gênese das doenças associadas à infecção pela bactéria. Emretanto, só recentemente esses facores começaram a ser identificados. Entre eles, polimorfismos em regiões promocoras de genes que codificam cicocinas pró-inflamatórias, como I L-1 ~. IL-1Ra e TN F-a.. Esses polimorfismos estariam associados ao aumemo da expressão de I L-1 ~ e TNF-a. na mucosa gástrica. Além de essas cicoonas aumentarem a inflamação, elas são inibidores naturais da secreção áoda no estômago. condições que predispõem à atrofia e carcinogênese gáscrica. Entretanto, embora associação com o carcinoma gáscrico tenha sido observada em populações caucasianas, o mesmo não foi visco na Ásia. No Brasil, somente o poli morfismo do gene que codifica o antagonista do recepcor da I L-1 ~ associouse ao carcinoma gáscrico. Quanto à úlcera péptica duodenal. há evidências da participação de fatores genéticos, como a concordância entre gêmeos monozigócicos significativamente superior que entre gêmeos dizigóticos. Concudo, há poucos trabalhos identificando os facores do hospedeiro. Recentemente, nosso
grupo demonstrou correlação inversa e independence entre a presença dos alelos polimórficos dos genes /UB-31 e TNFA-307 e risco de úlcera duodenal perfurada em adulros. Por outro lado, o alelo 2 do gene IL1-RN associa-se à úlcera duodenal em crianças. Como há variações regionais tanto no que se refere aos genes bactenanos de virulência quanto ao padrão polimórfico dos genes humanos que codificam moeinas. escudos avaliando as diferentes populações são necessários e permitirão a identificação de indivíduos com risco aumentado de desenvolver as doenças associadas à infecção pelo H. pylon.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
A infecção pelo H. pylori acomete cerca de 50% da população mundial. Nos países desenvolvidos. a prevalência da 1nfecção em adulros varia de 20 a 50% e vem diminuindo progressivamente nos últimos 10 anos. Já em países em desenvolvimento, a prevalência é de cerca de 70%, atingindo taxas tão elevadas quanro 95% na Áfnca. No Brasil, 60 a 90% dos indivíduos encontram-se infectados. Provavelmente, as variações são devidas a diferenças no nível socioeconôm ico entre as populações estudadas. uma vez que condições de higiene precárias, aglomeração nas moradias e ausência ou deficiência em saneamento básico são farores que favorecem a aqUisição da 1nfecção. O homem é o principal reservatório do H. pylon e a transmissão da bactéria ocorre de pessoa para pessoa. Existem evidências que favorecem a hipótese de que a transmissão pode ocorrer por via fecal-ora l e outras a favo r da transmissão oral-oral, o que sugere a participação de ambas. especialmente nos países em desenvolvimento. A infecção é adquirida predominantemente na infância e a transmissão ocorre principalmente no ambiente fam iliar, espeCialmente de mãe para filho e entre 1rmãos. o que pode ser explicado pelo comaco íntimo existente entre eles. A transmissão mãe-filho pode ocorrer por via oral-oral facilitada por hábiros da mãe. como beijar o filho ou experimentar a comida antes de servi-la ou por via fecal-oral devido a hábicos de higiene tnadequados da mãe. pnncipalmente entre aquelas de nível socioeconômico ma1s baixo.
A prevalência da infecção aumenta significativamente com a idade. o que é atribuído ao efeito coorte. ou seja. a maior prevalência observada em indivíduos mais velhos reflete o risco mais alto de aquisição da infecção que essas pessoas tiveram quando crianças. De fato, as taxas de soroconversão observadas na idade adulca variam de 0.5% nos países desenvolvidos a 1.0% nos países em desenvolvimento.
DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO
Os métodos usados para a pesquisa direta do microrganismo na mucosa gástrica são considerados invasivos, pois os fragmentos de mucosa são obtidos por esofagogastroduodenoscopia. Os métodos não-invasivos, ou indiretos, compreendem a pesquisa de anticorpos anti-H. pylon em amostras de soro, urina e saliva, a pesquisa de antígenos de H. pylori nas fezes e o reste respiratório com uréia marcada com 13(. isótopo não radioarivo. Para o diagnóstico da infecção, rem sido recomendado o uso de pelo menos dois restes. É necessário, também, que os restes não-invasivos sejam validados para a população a ser avaliada.
CULTURA
O isolamento do H. pylori a partir de fragmentos de mucosa gástrica é o método mais específico para o diagnóstico da infecção. Permite, também, o esrudo da amostra quanto à presença de fatores de virulência e à susceptibilidade a antimicrobianos. visando uma terapêutica melhor orientada. Pelo menos dois fragmentos de mucosa gástrica, um do antro e um do corpo, depois de colhidos, devem ser imediatamente colocados em me1o de transporte e mantidos a 4"C por, no máximo, quatro horas ames de serem semeados em meios de cultu ra apropriados. O transporte adequado dos espécimes é essencial para que a viabilidade do microrganismo seja mantida. Antes de serem semeados, os fragmentos devem ser homogeneizados em triturado r de tecido. Como o H. pylon é um microrganismo fastidioso, é necessário, para seu crescimento e isolamento, o uso de meios suplementados com sangue total ou soro de carne1ro ou de cava-
Investigação laboratorial do paciente com infecção por Helicobacter pylori
155
lo. Os meios de culrura devem também comer drogas amimicrobianas, com o objetivo de inibir o crescimento de outros microrganismos que podem competir por nutrientes ou produzir substâncias tóxicas que impedem o crescimento do H. pylori. O meio de cui[Ura Belo Horizome (BHM), desenvolvido no Laboratório de Pesquisa em Bacteriologia da Faculdade de Medicina/UFMG, é um meio seletivo e indicador, constituído de ágar sangue de carneiro suplementado com antimicrobianos e cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). A inclusão do TTC corna as colónias da bactéria mais facilmente reconhecíveis devido à coloração dourada que adquirem. O material deve ser incubado a 3rC por três a sere dias, em condições de microaerofilia (5,0% de 0 2, 7,0 a 10,0% de C02) que pode ser obtida por sistemas comerciais de geração de gases como Anaerocult C ou GasPak. A identificação do H. pylori é feita com base nas características macroscópicas das colónias (puntiformes, circulares, convexas e não hemolíticas), na morfologia da bactéria ao Gram (espiralada e Gram negativo) e no perfil enzimático (urease, oxidase e catalase positivas). Apesar da especificidade elevada do mécodo, os valores de sensibilidade relatados variam de 77,0 a 100%. A experiência do grupo é fundamental para conseguir-se o isolamento da bacténa. No LPB, empregando o BHM recentemente preparado e seguindo as recomendações descritas para transporte e semeadura do material, temse isolado o microrganismo em cerca de 95,0% dos pacientes infectados.
TESTE DA UREASE PRÉ-FORMADA O teste da urease pré-formada baseia-se na presença de grande quantidade de urease produzida pelo microrganismo na mucosa gástrica de indivíduos com infecção. A sensibilidade do teste é maior quando é avaliado pelo menos um fragmento de mucosa da região do antro e um do corpo gástrico. O teste consiste na introdução dos fragmentos em um meio semi-sólido contendo uréia e vermelho de fenol como indicador de pH. A urease pré-formada hidrolisa a uréia em amônia, normalmente presente na mucosa gástrica, elevando o pH, o que é detectado pela mudança da cor do meio de âmbar para rósea num período de até 24 horas.
156 [ Medicina laboratorial para o clínico
É um teste de fácil execução e de baixo cusro, que pode ser feico na sala de endoscopia. Com sensibilidade em torno de 95,0%, resultados falso-negativos podem ocorrer devido à distribuição irregular da banéria na mucosa gástrica ou ao uso de anrimicrobianos ou de inibidor de bomba de prórons. Resultados falso -positivos também têm sido descntos e podem ser devidos à presença de microrgan ismos contaminantes produtores de urease e à infecção gástrica por H. heilmannii. A especificidade do teste é de cerca de 95,0%.
EXAME DIRETO DO ESFREGAÇO CORADO Para a identificação do microrganismo em esfregaços de mucosa gásuica, podem ser usadas as colorações de Gram ou carbolfucsina. A coloração pela carbolfucstna apresenta sensibilidade e especificidade superiores a 90,0% quando comparada à cultura.
PESQU ISA DE H. pylori EM CORTES HISTOLÓG ICOS O H. pylori pode ser identificado em cortes hiscológicos de mucosa gástrica por meio de várias técnicas de coloração, como a de Warthin-Starry, laranja de acridina, Gram, carbolfucsina, Giemsa e Gema, métodos rápidos e de cusco relativamente baixo. A sensibilidade da hemacoxilina e eosina para a detecção do microrgan ismo é muico baixa. Os valores de sensibilidade e especificidade dos demais mérodos de coloração estão em corno de 95,0% e dependem da experiência do parologista, da qualidade do fragmento de biópsia e da densidade bacteriana na amostra.
TESTE RESPIRATÓRIO COM URÉIA MARCADA Semelhantemenre ao teste da urease pré-formada, o teste respiratório baseia-se na atividade da enzima urease produzida pelo H. pylon. O teste consiste na ingestão de uréia marcada com 13C não radioativo, que, sob a ação da enzima presente no estômago de pacientes H. py/ori-positivos, é desdobrada em amônia e co2marcado. Amostras de ar expirado são colhidas ames e depois
da ingestão do substrato e a concentração de carbono marcado é determinada por espectrometria de massa ou de luz infravermelha. É recomendado que o paciente esteja em jejum de no mínimo seis horas. Para retardar o esvaziamento gástrico e permitir que a uréia permaneça mais tempo em contaro com a mucosa gástrica, bem como manter o pH gástrico abaixo de 3,5 para permitir maior atividade enzimática. é oferecida ao paciente uma solução ácida contendo ácido cítrico (4,0 g/100,0 ml para adulco). Alternativamente, essa solução pode ser substituída por suco de laranja (200,0 ml para adulros e 100,0 ml para crianças com menos de 30,0 Kg de peso). Em caso de intolerância ou alergia à laranja, suco de maçã pode ser usado. Por ser inócuo e não-invasivo, o reste respiratório é um dos mais usados no diagnóstico da infecção, sendo o mémdo de escolha para acompanhar o efeiro do tratamento com ancimicrobianos. Estudos realizados em adultos e em crianças com idade superior a seis anos demonstram que o reste respiratório apresenta sensibilidade e especificidade superiores a 95,0% para o diagnóstico da infecção. Resultados falso-negativos são observados quando o paciente está em uso de inibidor de bomba de prótons e ancimicrobianos que podem levar à diminuição da carga bacteriana. Os primeiros devem ser suspensos 15 dias e os ancimicrobianos um mês ames da realização do reste. Por outro lado, o uso de antagonistas de receptores H2 e de antiácidos interfere pouco no resultado do reste, sendo recomendada a suspensão de ambos com 48 horas de antecedência. Outras causas de resultados falso-negativos são gastreccomia parcial, administração de uréia em dose inferior à recomendada e variações no intervalo de tempo entre a colheita da amostra basal e da amostra reste. Resul tados falso-positivos podem ocorrer devido à presença de outras bactérias produtoras de urease na vigência de atrofia gástrica, acloridria e supercrescimenm bacteriano e à infecção gástrica por H. heilmcmnii. Recentemente, tem-se empregado a uréia marcada em fórmula de cápsula para evitar a contaminação com microrganismos da cavidade oral. No LPB, a sensibilidade e especificidade do teste são superiores a 95,0% seguindo-se o protocolo de jejum de seis horas, dose de 75,0 mg de uréia marcada dissolvida em 200,0 ml de suco de laranja e intervalo de 30 minutos entre a colheita da amostra basal e amostra reste.
DETECÇÃO DE ANTÍGENOS DEH. pylori EM AMOSTRAS DE FEZES A detecção de ancígenos de H. pylori em amostras de fezes é feira por mérodo imunoenzimárico empregando anticorpos mono ou policlonais e é indicada para o diagnóstico da infecção, ramo em adultos quanto em crianças. Como é um reste não-invasivo, rem também indicação em escudos epidemiológicos. Acualmente, há vários kits disponíveis no comércio. O reste apresenta sensibilidade e especificidade em torno de 95,0%, sendo relatados valores ainda mais elevados quando são usados anticorpos monoclonais. Deve-se salientar que o transporte e a manutenção das amostras são etapas essenciais para se obterem bons resultados. É recomendado que as amostras de fezes sejam mantidas entre 2,0 e 8,0°( se processadas em até três dias ou a -20,0°( ou -80,0°( se processadas depois desse período. Sangramencos no tratO gasrrincestinal e uso de antimicrobianos e de inibidores de bomba de prórons diminuem a sensibilidade do reste, que não é alterada, entretanto, por antagonistas dos receptores H2 e antiácidos. Embora não-invasivo, não é consenso usar o reste para o acompanhamentO da resposta ao tratamento, pois têm sido observados valores mais baixos de sensibilidade e especificidade. Recentemente. foi lançado no comércio um teste de detecção de ancígeno de H. pylori baseado em imunocromarografia para diagnóstico rápido da infecção. Entretanto, a sensibilidade e especificidade do teste são inferiores às observadas com o reste imunoenzimático.
PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-H. pyfori A infecção pelo H. pylori induz, no hospedeiro, uma resposta imunológica celular e humoral, que resulta na produção de anticorpos anci-H. pylori das classes lgM, lgA e lgG. Os primeiros podem ser detectados precocemente. Os anticorpos específicos da classe lgA e lgG atingem níveis detectáveis, aproximadamente, três semanas a três meses depois do início da infecção aguda e podem ser observados até cerca de dois anos depois da erradicação da bactéria. Assim, especialmente em populações de países onde a prevalência da infecção é elevada, a detecção de lgG é indicativa de infecção em atividade. excero se a bactéria tiver
lnvesrigação laborarorial do pacienre com infecção por Helicobacter pylori
157
sido eliminada de forma espontânea, o que ocorre muito raramente, ou devido ao uso de antimicrobianos. Por outro lado, em países desenvolvidos onde o número de pacientes que recebem tratamento para erradicação do microrganismo é cada vez mais alta e a prevalência da infecção vem diminuindo progressivamente, a presença de anticorpos pode indicar tanto infecção ariva quanto passada. Por essa razão, testes que se baseiam na detecção de anticorpos não estão indicados para controle de cura da infecção. Dentre os vários métodos disponíveis, o ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de anticorpos lgG ami-H. pylori tem sido o mais usado devido à rapidez e simplicidade de execução, reprodutibilidade e baixo custo, existindo inúmeros kits disponíveis comercialmente. A maioria dos testes de ELISA, especialmente os de segunda e terceira gerações, apresenta sensibilidade e especificidade elevadas para o diagnóstico da infecção em adultos e em crianças com mais de 12 anos de idade. Na nossa população, foram observados valores de sensibilidade e especificidade de aproximadamente 95,0%. O immunoblotting também tem sido usado para a detecção de anticorpos ami-H. pylori. Na população brasileira, os valores de sensibilidade e especificidade de um reste disponível no comércio são de aproximadamente 94,0 e 93,0%, respectivamente. Embora anticorpos amifatores de virulência da bactéria possam ser detectados, valores baixos de especificidade, especialmente para anticorpos amiCagA. foram relatados por diversos autores, limitando o uso do immunoblotting para esse fim. Por outro lado, como anticorpos séricos antiCagA podem ser detectados até dois anos depois da eliminação da bactéria, a sua pesquisa é recomendada em pacientes com atrofia da mucosa gástrica e carcinoma gástrico. Testes rápidos usando a técnica de imunocromawgrafia para a pesquisa de anticorpos no sangue coral, soro ou plasma também estão disponíveis comercialmente, entretanto, a sensibilidade e especificidade são bem inferiores às do teste de ELISA. A pesquisa de anticorpos lgG ami-H. pylori pode ser feita, também, em amostras de urina e de saliva, por ELISA. Testes para detecção de anticorpos na urina têm sensibilidade e especificidade superiores a 90,0% em ad ultos, porém a sensibilidade em crianças varia de 60,0 a 70,0%. Testes que avaliam anticorpos na saliva apresentam valores baixos de sensibilidade e especificidade ramo em adultos quanto em crianças.
158 ( Med icina laboratorial para o clínico
PESQUISA DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTICagA Apesar de não ser indicada ordinariamente para o diagnóstico primário da infecção pelo H. pylori, a pesquisa de anticorpos séricos reativos à proteína CagA rem sido recomendada para a detecção de infecção por amostras de H. pylon que expressam o fato r de wulênCia CagA. visto que a correlação emre a pesquisa de anticorpos amiCagA e a detecção do gene por técnicas de biologia molecular é muito elevada. Na nossa população, o teste de ELISA para a detecção de anticorpos amiCagA apresenta, em adultos, sensibilidade de 97.4% e especificidade de 88,9%; e em crianças sensibilidade de 95,3% e especificidade de 87,0%.
TÉCNICAS MOLECULARES Técnicas de biologia molecular são usadas para detecção da presença da infecção, genotipagem dos marcadores de virulência do H. pylori e determinação de susceptibilidade da bactéria aos amimicrobianos tanto em amostras isoladas quanto em fragmentos de biópsia. Para a detecção do DNA bacteriano por PCR, são empregados conjuntos de iniciadores específicos para amplificar regiões conservadas do gene que codifica o RNAr 16S, o ureA ou outros genes específicos do H. pylori. Embora apresente sensibilidade superior a 95,0% para o diagnóstico da infecção, resultados falso-negativos podem ocorrer devido ao transporte e armazenamento inadequados da amostra, à baixa densidade bacteriana, bem como à presença de inibidores da reação quando a pesquisa é feita em outros espécimes como fezes. Em amostras biológicas com número muito reduzido de bactérias, um protocolo de PCRaninhada (nested-PCR) pode aumentar a sensibilidade de uma reação de PCR convencional em até 10 vezes. Embora de custo mais elevado, a PCR em tempo real apresenta excelente acurácia para o diagnóstico da infecção em amostras de fezes. Mais recentemente, a pesquisa de DNA da bactéria em tecido vem também sendo feira por FISH (reação de hibridação in situ com fluorescênc1a). A reação de FISH pode ser feita em tecido congelado ou fixado pelo método de Carnoy's e apresenta sensibilidade de 95,0%. A identificação de fatores de virulência da bactéria pode ser feita por meio de várias técnicas. Entre elas,
)r------ -- - - -- -- - - - - - - - - - - - - - - - -
PCR é a mais freqüemememe adocada. Como há variações regionais no que se refere aos genes que codificam esses facores, os iniciadores das reações devem ser restados para as diferentes regiões. A PCR tradicional é usada para a detecção de cagA, mosaico vacA. e iceA. Alguns aurores propõem PCR-mulciplex com mais de um par de iniciadores em uma única reação, ramo para a detecção de amostras com mais de um gene de H. pylori como para investigação simultânea de genes de virulência. Genes de virulência podem também ser identificados e até quantificados no tecido por meio de PCR em tem po real. A PCR seguida de hibridação {LiPA - fine probe assay) aumenta a sensibilidade de detecção de cagA e mosaico vacA. Ainda, a expressão dos genes pode ser avaliada em cultura da bactéria ou no tecido por rr-PCR. Para a detecção de outros genes de virulência, como babA. dupA, sabA e oipA, a PCR isoladamente não é suficiente. Somente 10 pb na região sinalizadora diferenciam o babA2 (que codifica a adesina BabA) de babA1 e babB, sendo necessário sequenciar essa região para a classificação do gene. Amplificação seguida de seqüenciamento também permite identificar a presença de dupA (inserção de uma base C ou T e fusão dos genes jhp0917jhp0918) e determinar, pelo número de repetições de CT. se o sabA e oipA estão funcionantes.
DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO EM SITUAÇÕES ESPECIAIS Crianças
Embora rodos os métodos dispo níveis possam ser usados para o diagnóstico da infecção em crianças, diferenças têm sido observadas na acurácia dos restes. Como a carga bacteriana é menor na criança, alguns aurores relatam menos sensibilidade do reste da urease, cultura e hisrologia, o que não rem sido observado no LPB. Apesar de existirem relatos na literatura de menos especiflodade do reste respiratório com 13c em crianças na idade pré-escolar, outros trabalhos demonstram especificidade semelhante à observada em adultos, independentemente da idade da criança. Resultados excelentes foram observados na nossa população, ramo para crianças com menos de seis anos (sensibilidade de 88,0% e especificidade de 95,0%) como para as mais velhas (sensibilidade de 100,0%
e especificidade de 98,0%) usando uréia marcada com 13 C na dose de 50,0 mg dissolvida em 100,0 ml de suco de laranja e de 75,0 mg em 200,0 ml de suco para crianças com peso inferior e superior a 30,0 Kg, respectivamente. O reste respiratório com uréia marcada com 13C é também, à semelhança do indicado para adulcos, o de escolha para o acompanhamento de tratamento nessa faixa etária. Há relatos de menor sensibilidade da pesquisa de amígenos nas fezes para o diagnóstico da infecção em crianças com idade inferior a seis anos. Emreranro, o reste apresenta valores de sensibilidade e espeCificidade elevados (cerca de 95,0%) na nossa população. mesmo para as crianças com idade inferior a seis anos (sensibilidade de 100%). Semelhantemente ao reste resp1raróno, a pesquisa de antígenos nas fezes é um reste não-invasivo, que apresenta acurácia elevada para o diagnóstico da infecção pelo H. pylori em crianças, rendo, ainda. como vantagens: maior facilidade de execução e o faro de não ser necessária colaboração da criança. Reações sorológicas não são indicadas para o diagnóstico da infecção na infância devido. principalmente. à baixa sensibilidade dos restes em crianças com menos de 12 anos de idade. Na experiência do LPB há variações na sensibilidade e especificidade do restes de ELISA disponíveis no comércio. sendo necessário padronizá-los para a população. Ainda, mesmo quando o reste é sensível e específico para adulros, os resultados são muito inferiores nas crianças (sensibilidade de 44.4% entre dois e seis anos de idade e 76.7% entre sere e 11 anos). Os restes de ELISA para a pesqu1sa de antiCOrpos na urina e saliva, por serem ainda menos sensíveis e específicos, não são indicados para o diagnóstico da infecção na infância. Por outro lado, a sensibilidade e especificidade da pesquisa de imunoglobulinas anti- H. pylon por immunoblotting são aceitáveis para o diagnóstico em crianças. Na nossa população, valores de sensibilidade de 95,0% e especificidade de 86,0% foram observados para crianças de dois a 16 anos de idade.
Paciente com atrofia gástrica e/ou carcinoma gástrico
Na vigência de alterações da mucosa gástrica, como atrofia e meraplasia intestinal isoladamente ou em associação com o carcinoma gástrico. há redução significativa da densidade bacteriana, com conseqüente queda da
Invest igação laboratorial do paciente co m infecção por Helicobacter pylon
159
sensibilidade dos mémdos diagnósticos. como cultura.
significativa de sensibilidade se a avaliação ocorrer mais
reste da urease pré-formada e teste respiratório. Além d1sso, como os níve1s de antiCOrpos lgG anti-H. pylon são
precocemente: 80,0% com um mês. Embora a pesquisa de antígeno nas fezes seja preconizada por alguns autores,
menores em paCientes com caronoma gástrico que na-
os resultados não se comparam aos do teste respiratório.
queles sem a doença. a sens1b1lidade dos restes sorológi-
COS cambém
é menor nesse grupo de doenres.
Em um estudo caso-controle realizado pelo nosso
REFER~NCIAS
grupo, foi demonmada sensibilidade de 83.5% para cultura. 56.2% para o teste da urease pré-formada, 67,8% para esfregaços corados pela carbolfucsina e 83.5% para ELISA em pacientes com carcinoma gástrico. A associação dos quatro métodos citados detectou a infecção em 95.3% dos paCientes. Portanto, é recomendável que em pacientes com caronoma gástrico sejam usados vários métodos para o d1agnóst1co da infecção. Além d1sso. re-
1. Blaser MJ. Atherton JC. Helicobacter pylon pers1stence: b1ology and disease. J Cl!n lnvest. 2004;113:321·33. 2. Cardinali LCC. Rocha GA. Rocha AMC. Moura SB. Soares TF. Esteves AMB, N ai. [valuar1on of (13C] Urea Brearh resr and Helicobacrer pylon Srool An· t1gen resr for d1agnos1s of H. pylori mfection m chddren from develop1ng country. J Clin M1crob1ol. 2003;41:3334-5.
3.
comenda-se também que se faça a pesquisa de anticorpos antiCagA por ELISA. Além da maioria das amostras associadas ao carcinoma gástrico expressarem a proteína CagA. anticorpos antiCagA podem ser detectados vários meses depois da eliminação da bactéria.
Resistência a antimicrobianos Resistência. especialmente à clariuomiona e ao metronidazol. tem s1do descma com taxas que vanam de reg1ão para reg1ão. No nosso meio. foram observadas taxas de 19.5% para clariuomicina e 53.0% para o me-
2006;55.132· 3
Malfertheiner P, Mégraud r. M1chett1 P. S1pponen P (European Helicobacrer Srudy Group). The year of Helicobacrer 2005. Hel1cobacrer 2005:10(1):1 -70. 5. Oliveira AMR, Rocha GA. Que1roz DMM. Mendes EM. Carvalho AST. Ferran TCA. et ai. Evaluar1on of Enzymel!nked 1mmunosorbenr assay for rhe diagnos1s of Helicobacrer pylori infecuon 111 children from differenr age groups w1rh and w1thour duodenal ulcer. J Ped1ar Gasrroenrerol Nurnuon. 1999;28:157-61. 6. Que1roz DMM. B1nencoun P. Guerra JB, Rocha AMC Rocha GA. Carvalho 1\ST ILlRN polymorph1sm and cagA-pos1t1ve Helicobacter pylon srrams 1ncrease the nsk of duodenal ulcer rn children. Ped1atr Res. 4.
rronidazol. Os métodos microbiológicos indicados para avaliar resistência incluem o E-test e diluição em ágar. A detecção de mutações que conferem resistência
à clamrom1C1na (transição de A~G na posição 2142 ou 2143, e de A-)( na posição 2142) no gene que codifica o RNA 23S pode ser fe1ta tanto em bactéria isoladas quanto em fragmento de tecido recentemente colhido ou congelado por PCR-RFLP (PCR seguida de corte com enzima de restrição). por PCR em tempo real, LiPA ou por FISH.
Controle de erradicação da bactéria O método de escolha para o controle de erradicação da bacténa é o teste respiratório com uréia marcada com 13C. Além de não-invasivo, a técnica apresenta sensibilidade supenor a 95,0%, quando o paCiente é avaliado três meses depo1s do tratamento. Vale ressaltar que há queda
160 ( Medicina laboratorial para o clínico
Guerra JB. Rocha GA. Rocha AMC. Mendes CMC. Sara1va IEB. Ohve1ra CA, er ai. IL-1 gene clusrer and T FA- 307 polymorphlsms m rhe nsk of perforared duodenal ulcer. Gut
2005;58:892-6.
Que1roz DMM. Mendes EM. Rocha GA. lnd1caror medi um for 1solanon of Campylobacrer pylon. J Clm Ml· crobiol. 1987:25:2378-9. 8. Rocha GA. Guerra JB. Rocha AMC. Sara1va IEB. Silva DA. Oliveira CA. Que1roz DMM. IL1RN polymorph1c gene and cagA-pos1uve sratus 1ndependenrly 1ncrease the nsk of noncard1a gasmc carcinoma. lnt J Cancer. 7.
2005:115:678-83.
9. Rocha GA. Rocha AMC. Silva LO. Santos A Bocewicz ACD. Queiroz RM, er ai. Transm1ssion of Hel!cobacter pylon 1nfewon m fam11ies of preschool-aged chddren from Mmas Gera1s. Brazd. Trop Med lnr llealrh. 2003:8:987-91. 10. S1mala-Granr J. Taylor DE Molecular b1ology merhods
for rhe characrenzanon of Helicobacrer pylon mfewons and rhe1r d1agnos1s. APM IS. 2004;112:886-97. 11. Suerbaum S. Pierre M. Med1cal Progress: Hel!cobacter pylori 1nfecrion. N England J Med. 2002;347: 1175-86.
Luciana de Gouvêa Viana
16
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO
PACIENTE COM INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO
A infecção do t raw uri nário (ITU) encontra-se entre
o u cistite o u afecar sim u ltaneamente o trato uriná-
as mais freqüemes infecções bacterianas do ser humano.
rio in ferio r e superior. caracterizando a ITU alta o u
A penas no primeiro ano de vida, acomete preferencial-
pielonefrite. A ITU baixa pode ser sintomática ou
mente o sexo masculino, ocasião em que se encontra
n ão. N o último caso, aplica-se a den o m inação de
freqüememente associada a malformações congênitas,
bacteriúria assintom ática.
especialmente válvu la de urerra posterior. A partir desse
Classifica-se a ITU como não compl icada qu an-
período, há franco predomínio no sexo feminino, com pi-
do ocorre em paciente co m estrutura e função do
cos de incidência associados ao início da atividade sexu-
trato urinário n ormais e fora do ambiente hospitalar.
al, gestação e menopausa.
a quinta e sexta décadas de
Já a ITU complicad a encon tra-se associad a à altera-
vida, observa-se aumento da incidência de ITU no sexo
ção anat ómica ou fu ncional d o t rato u rinário, com -
masculino. particularmente relacionada ao prostatismo.
prometimento em relação à saúde do paciente ou
Define-se como infecção urinária a invasão do trato urinário por microrganismos, desencadeando uma res-
cujo agente etiológico representa microrganismo d e alta virulência.
post a inflamatória. Esse processo infeccioso pode afet ar
A ITU também pode ser classificada pela evolução
os rins, a pelve renal, os ureteres, a bexiga, a urerra, a prós-
clínica. Prop õem-se. para cal critério, três categorias: in-
tata e o epidídimo. Na prát ica médica, a term inologia
fecção urinária isolada, infecção não resolvida e infecção
infecção do rraro urinário tem sido reservada aos pro-
recorrente. A infecção urinária isolada é definida como o
cessos infecciosos envolvendo os rins, a pelve renal, os
primeiro episódio de ITU ou o que ocorre em período
ureceres e a bexiga. Urerrices, prostatites e epididimites
superior a seis m eses após o último evento. A infecção
apresentam-se como entidades clínicas bastante distin-
urinária não resolvida é aquela em que não houve cura,
tas. não sendo alvo da presente abordagem.
tendo como causa mais comum a resistência a antimicrobianos. A infecção recorrente se instala.
em geral,
poucas semanas após um trat am ento eficaz de ITU,
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
com exame comprobatório negativo. Essa pode dever-se
à reinfecção (ocorrência de uma nova infecção por ourra CLASSIFICAÇÃO
bactéria) ou persistência bacteriana (ocorrência de uma nova infecção, pela m esma bactéria).
A infecção urinária pod e com prometer somente
A provável origem do processo infeccioso pode ser
o trato urinário inferior. caracterizando a ITU baixa
empregada com o critério de classificação da ITU em co-
munitária ou hospitalar. Quando não houver evidência clínica e/ou dado laboracorial de infecção no momemo da internação, defi ne-se como infecção hospitalar roda manifestação clínica de infecção que se apresenrar a panir de 72 horas após a admissão. São tam bém convencionadas infecções hospicalares aquelas manifescadas antes de 72 horas de internação, quando associadas a procedimemos diagnósticos e/ou tera pêuticos realizados du ranre este período.
AGE NTES ETIOLÓG ICOS Mais de 95% das infecções urinárias são causadas por um único ageme etiológico. Escherichia coli é a causa mais comum de ITU não complicada, sendo o agente etiológico de 75 a 95% de todas as infecções. Staphylococcus saprophyticus encontra-se em segundo lugar, respondendo por 5 a 20% das mfecções. Apesar do S. saprophyticus ser menos freqüente, esse agente é mais agressivo, tendendo a causar infecções altas e com maior probabilidade de recorrência. Em ordem de freqüência, espécies de Proteus e Klebsiella e o Enterococcus jaecalis ocasionalmente causam infecção urinária não complicada. As infecções urinárias complicadas são causadas por uma variedade maior de microrganismos, bactérias e fungos e a freq üência de 1nfecções polimicroblanas é superior àquela observada nas infecções não complicadas. Apesar da E. coli ainda constar co mo o principal patógeno, outras bacrérias aparecem co m mais freq üência, como Pseudomonas. Proteus, Klebsiel/a e E. faeca lis. Entre os fungos, destaca m-se as espécies de Candida. O ambiente hospitalar é um importame determinante da natureza da flora bactenana na ITU. Espécies de Klebstella. Proteus, Pseudomonas e Enterobacter, estaAiococos e enterococos são os agentes mais freqüentemente isolados em ITU hospitalar. Corynebacterium urealyticum, um bastonete Gram positivo altameme resisteme a amimicrobianos. tem sido reconhecido como um im portame agente nesse contexto. Adenovírus, particularmente tipo 11, tem sido relacionado à cistite hemorrágica em pacientes pediárricos. especialmente do sexo masculino, e em casos de transplante alogênico de medula óssea.
162 (
Medicina laboratorial para o clínico
ASPECTOS FISIOPATOLÓG ICOS Vias de infecção
Exceco nas pnmeiras oiro a 12 semanas de vida, quando a ITU pode ser secundária a uma fome hemacogênica, acredita-se que essa mfecção tenha 1níc1o pela v1a ascendente, seguindo a enrrada de bactérias pela uretra. Acredita-se que o evento inicial seja a colonização da mucosa periureual por bactérias da flora gasuintestinal. As bactérias periureuais podem. então, atingir a bexiga e evemualmente os rins através dos ureteres. Esta ascensão é favorecida pelo refluxo vésico-ureteral. O faw da ITU ser mais freqüenre no sexo feminino reforça a importância da via ascendente na infecção. A uretra feminina é curta e próxima à região perianal. favorecendo a contaminação. Está bem demonstrado que as bactérias que causam infecção urinária colonizam o intróiro vaginal e a região periurerral anteriormenre. A disseminação hematogênica é particularmente característica de organismos virulentos como o Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa e Salmonella spp. Evidências do significado da via linfática na pawgênese da ITU são inexpressivas.
lnteração parasito-hospedeiro
Uma das características da ITU é o faro de que uma única espéc1e bacteriana, a E. colt, não apenas causa a ma1ona das Infecções como também ocasiona uma ampla gama de manifestações clín1cas. Entretamo, apenas poucos sorotipos de E. coli causam infecções em alta proporção. Entre estes, destacam-se: 0 1, 02, 0 4, 06, 07, 0 8, 075, 0 150 e 018ab. lsm remonta ao conceim de cepas uropatogênicas, com características distintas das cepas comensais. Certos sororipos O. K e H estariam a1nda relacionados com manifestações mais graves. como pielonefrite. A aderência aumentada às células uroepiteliais representa um dos principais facores de virulências das enterobactérias. As fím brias são estruturas responsáveis pela aderência da bactéria ao uroepitélio, tendo como recepwr a manose ou a proteína de Tamm Horsfall (fím bna tipo I) e constituinte do complexo antigênico do grupo sangüíneo P. presente em hemácias e células
epiteliais (fímbria P). Outros fatores já reconhecidos na parogênese da ITU são: resistência à atividade bactericida sérica; grande quantidade de antígeno K (K1. K5 e K12) na cápsula. conferindo resistência à fagocitose; presença de aerobactina. importante no crescimento e divisão bacteriana; produção de hemolisina. que provoca lise das hemácias. Estudos têm revelado que os mecanismos de aderência são importantes na patogênese da ITU causada por outras espécies bacterianas uropatogênicas. como Proteus mirabilis e espécies de Klebsie/la. É interessante nocar que S. aureus raramente causa cistite ou pielonefrite. Ao contrário. S. saprophyticus é um agente etiológico relativamente comum de ITU baixo. Este adere significativamente melhor às células uroepiteliais quando comparado ao S. aureus e Staphylococcus epidermidis. Com exceção da mucosa uret ral. o traco urinário é resistente à colonização bacteriana e elimina rápida e eficientemente qualquer microrganismo que renha acesso à bexiga. Clones uroparogênicos provocam resposta inflamatória em wdos os níveis do tram urinário, estimulando a produção de cimcinas e outros facores próinflamatórios. A intensidade e eficiência da resposta são geneticamente determinadas e representam um famr crítico na interação parasim-hospedeiro e desenvolvimento ou não da ITU. A produção sistêmica de interleucina 1~ (ll-1~) e interleucina 6 (IL-6) pode levar à febre e ativação da resposta de fase aguda. A concentração sérica de ll-6 reflete a gravidade da infecção. correlacionando-se com pielonefrite e episódios de bacteremia. A liberação local de interleucina (IL-8) promove o recrutamento de leucócitos polimorfonucleares. resultando em leucocitúna e contribui ndo para a erradicação da bacreriúria. Deficiência em receptores de IL-8 relaciona-se à susceptibilidade à pielonefrite aguda. Apesar da urina ser geralmente considerada um bom meio de cultura, esta possui arividade antibacreriana. Tem sido demonstrado que osmolaridade extrema, alta concentração de uréia e pH baixo são fatores inibidores do crescimento bacceriano na urina. Além disso, o pH e a osmolaridade da urina na grávida rendem a ser mais favoráveis ao crescimento bacteriano, contribuindo para o aumenm da incidência de ITU nesta ocasião. Por outro lado, a presença de glicose na urina melhora as condições para o crescimento bacteriano, enquanto a adição de fluido prostática o inibe.
ASPECTOS EPI DEMIOLÓG ICOS A ITU representa uma preocupação médica em codas as faixas etárias, iniciando com os recém-nascidos, para os quais se estima freqüência de 2,9% para prematuros e 0,7% para nascidos a termo. Meninos são cinco a oim vezes mais suscetíveis à infecção do que meni nas até os três primeiros meses de vida. Depois, as meninas mrnam-se mais propensas à infecção, com prevalência de 1 a 3% nesse sexo na faixa etária de um a cinco anos. Em crianças em idade pré-escolar, a ITU em men inos encontra-se freqüentemente associada a sérias anormalidades congênitas. A prevalência de bacteriúria na idade escolar varia de 0,03% no sexo masculino a 1,2% no sexo feminino. Vale ressaltar que 30 a 50% das crianças com ITU apresentam refluxo vésico-ureteral. Em mulheres adultas não-grávidas, a prevalência da bacteriúria gira em mrno de 1 a 3%. Cerca de 40 a 50% da população feminina apresentarão um episódio de ITU sintomática durante a vida. Nas mulheres grávidas, destaca-se a alta prevalência de bacteriúria assintomática: até 10%. Se não tratadas, 25 a 57% dessas bacteriúrias podem evoluir para infecção sintomática, inclusive pielonefrite. A incidência de bacteriúria aumenta em relação ao número prévio de gestações. Ressalta-se que a ITU na gestante associa-se a mais alro índice de prematuridade, baixo peso e mortalidade perinatal, além de maior morbidade materna. A prevalência de bacreriúria em homens adultos é inferior a 0,1%, aumentando em idosos. Esse aumento está relacionado a doenças prostáticas e instrumentação. Homossexualismo masculino representa fator de risco para ITU, provavelmente relacionado ao sexo anal. Os processos infecciosos, de modo geral. têm incidência progressiva após 65 anos. Reconhecidamente, a ITU, sinromática ou assintomática, é a infecção mais freqüente, independentemente do sexo, estimando-se que acometa aproximadamente 20% das mulheres e 10% dos homens. Esta prevalência praticamente se duplica após os 80 anos, quando as diferenças entre mulheres e homens são menores. Favorecem esse aumento de ITU: a imunodeficiência relacionada à idade, as alterações funcionais e orgânicas do trato urinário, imobilidade e doenças sistêmicas. Observa-se alta prevalência de infecção urinária em pacientes hospitalizados. Geralmente a infecção está re-
lnvesrigação laborarorial do pacienre com infecção do rraro urinário
163
lacionada à insrrumemação. Uma simples carererização em pacieme ambulamrial causa ITU em apenas 1% dos pacientes, enquanto em populações hospitalizadas esse índice atinge 10%. Outra grande preocupação em relação à ITU é sua alra incidência em pacienres rransplamados. Pelo menos 50% dos transplantados renais desenvolverão infecção do uam urinário no período pós-operatório, com cerca de 40% de incidência de bacteremia. Por tal mocivo, alguns pesquisadores advogam o uso profilático de antimicrobianos nessa situação.
APRESENTAÇÕES ClÍNICAS Crianças
A ITU em crianças tende a se manifestar com diferences sintomas. dependendo da faixa etária. Em recémnascidos e crianças até dois anos. os sintomas são bastante inespecíficos: falta de apetite, vômiros, irritabilidade e febre. Em recém-nascidos. pode-se verificar icterícia fisiológica prolongada, associada ou não à perda de peso, em cerca de 30% dos casos. Em crianças com mais de dois anos, os sintomas são mais consistemes e específicos, tais como disúria e dor abdominal.
Adultos
A cistite, quando sintomática, exterioriza-se clinicamente pela presença habitual de disúria, urgência miccional, polaciúria. nicrúria e dor suprapúbica. Febre não é comum. O aspecro da urina geralmente encontra-se alterado, sendo comum o relato de urina turva e avermelhada. A pielonefme é habitualmenre acompanhada de febre. calafrios, dor lombar uni ou bilateral, podendo irradiar-se para o abdome. A grande maioria dos indivíduos idosos apresenta ITU assintomácica. Sintomas. quando presentes. não são de grande valor diagnóstico. Soma-se a isro a ocorrência comum de disúria e incontinência nessa faixa etária, mesmo na ausência de infecção. Quadros de pielonefrite aguda não raro se exteriorizam com sintomas gastrintestinais, dores abdominais incaracterísticas, náuseas e vômiros. A febre pode estar ausente.
164 (
ABORDAGEM LABORATORIAL
A abordagem laboratorial da ITU tem início com a definição do material biológico a ser utilizado para realização dos exames voltados para o diagnóstico presumivo e/ou microbiológico. Os cuidados na colheita, preservação e transporte dos espécimes de urina são da maior importância. A urina deve ser coletada diretamente em frasco estéril. identificada e examinada ou refrigerada o mais rapidamente possível. pois, sob refrigeração. as contagens bacterianas permanecem em ritmo lemo de replicação por 24 horas. Bactérias contaminantes podem multi plicar-se nos espécimes mantidos à temperatura ambiente e invalidar os resultados dos exames. Espécimes de urina podem ser colhidos por aspiração suprapúbica, cateterização, jaro médio de micção espontânea ou com o auxílio de coleror adesivo. A aspiração suprapúbica da bexiga é considerada um mérodo seguro, porém invasivo. Esse proced imento é realizado exclusivamente pelo médico e encontra-se particularmente indicado em recém-nascidos e crianças sem controle do esfíncter urinário. Faz-se a punção direta da bexiga através da parede abdominal, usando-se agulha e seringa. A cateterização uretral já foi considerada o melhor recurso para colheita de urina na bexiga, mas pode favorecer infecção, particularmente em pacientes idosos e acamados. Du rante a cateterização, a urina não deve ser colhida do saco de drenagem, devido à alta probabilidade de contaminação. O cateter deve ser limpo com álcool 70%, diretamente perfurado, em local apropriado. com agulha e seringa para aspirar a urina. Atualmeme. a coleta do jaro médio da urina por micção espontânea, descrita no capítulo 35, é a técnica mais utilizada, seguida pela utilização do coleror adesivo, restrita à população pediátrica. A coleta de urina empregando-se o coletor adesivo é considerada prática e nãoinvasiva, mas a contaminação do material é freqüente. Para minimizar tal risco, aconselha-se a colocação do coletor após a higiene rigorosa da região perineal. efetuando trocas a cada 30 minuros, realizando nova assepsia. Se a criança evacuar simultaneamente, deve-se desprezar o material e realizar nova assepsia. Algumas crianças podem apresentar dermatite local pela cola do coleror, motivo pelo qual esta deve ser rotalmeme removida após a coleta. Estudos realizados com amostras urinárias de
Medicina laborarorial para o clínico )1 --- - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
recém -nascidos obtidas através de saco colewr e aspira-
responde a mais de 105 UFC/ml. Resultados falso-negativos
ção suprapúbica concluíram que o saco coleror fornece resulcados con fiáveis quando utilizado em crianças com
são comuns em infecções com baixa contagem bacteriana na uroculrura quantitativa (entre 102 e 103 UFC/ml).
mais de sete dias de vida. Em crianças mais novas, há maior probabilidade de ocorrência de resultados falsopositivos em conseqüência à contaminação fecal.
DIAGNÓSTICO MICROBI OLÓGICO O isolamento e caracterização microbiológica do agen-
DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO Exame de urina rotina
O exame de urina rortna, abordado no capítulo 35, representa um dos restes mais utilizados na abordagem laboratorial da ITU. Seu papel no diagnóstico presuntivo
te etiológico de dada infecção representa a constatação definitiva desta. Em relação à ITU, tem-se na uroculcura quantitativa o método de referência para tal. A urocultura qualitativa corresponde à caracterização da espécie do microrganismo identificado a partir de provas específicas, geralmente bioquímicas. Além da uroculrura quantitativa e qualitativa, a hemoculrura representa ferramenta alter-
da infecção é relevante, particularmente nas infecções
nativa para o diagnóstico microbiológico da ITU.
não complicadas. A pesquisa de esterase leucocirána por meio da rira reagente apresenta especificidade entre 94 e 98% e sensibilidade entre 75 e 96% para e detecção de uroparógenos, correlacionando-se com uroculrura com mais de 100.000 untdades formadoras de colônia por ml
Urocultura
pela rira reagente, pode ser negativa, particularmente se o agente etiológrco não for nitrato-redutor, como S.
A uroculrura quantitativa da urina é uma técnica baseada no plantio da urina em meios de cultura padronizados, tais como agar Brolacin (Bromothymol-blue Lactose Cystine Agar) e agar MacConkey, utilizando alça calibrada
saprophyticus, E. faecalis e Acmetobacter baumann11. A
de platina 1/ 1000 (0,001 ml ). A contagem de colônias
sensibilidade do reste é bastante variável: 35 a 85%. Proreinúria é um achado comum na ITU.
é feita após incubação por 24 horas a 35°C. O número UFC/ml corresponde ao número total de colônias pre-
(105 UFC/ml). A pesquisa de niuiro, também realizada
A análise microscópica do sedimento urinário apre-
sentes na placa inoculada multiplicado por 1.000.
senta alterações significativas e freqüentes em relação à
O limite tradicionalmente utilizado para confirmar
pesquisa de leucócitOs, hemácias e análise da flora microbiana. Leucocirúria e hemarúria são achados comuns, lembrando que, em relação à primeira, a sensibilidade da pesquisa por meio da tira reagente é superior. Cilindros leucocirários são achados relevantes à sedimemoscopia, sugerindo pielonefrite. Sua ausência, porém, não exclui infecção urinána alta. A presença de bactéria à sedimen-
ITU é a contagem de colónias igual ou superior a 105 UFC/ml. Atualmente, a definição de bacreriúria significativa ou contaminação é mais dinâmica, variando na dependência do quadro clínico e mérodo de coleta do material biológico e agente etiológico, conforme expos-
roscopia pode estar associada à infecção, mas considerase tal achado de baixa espec!ficidade.
tO no Quadro 16.1. Quadro 16.1 - Oeflmção de bactenúria srgnifrcatrva > 102 UFC (coliformes)/ml em mulher sintomático > 10 3 UFC/ml em homem srntomóllco
Gram de gota de urina não centrifugada
O Gram de gota de urina não centrifugada é um reste exuemamente útil no diagnóstico presuntivo de ITU. A presença de pelo menos uma bactéria por campo em 20 campos examinados em objetiva de imersão (1000x) cor-
> JOS UFC/ml em indivíduos ossintomóticos em duas amostras consecutivos
> 10 2 UFC/ ml em poc1enles coteterizados Qualquer crescimento bacteriano em material obtido por punção supropúbico
Investigação laboratorial do paciente com infecção do trato urinário
165
Uma vez definida a significância clínica do resultado da urocukura quanmat1va. procede-se à idenriflcação bacteriana e ao teste de sensibilidade annmicrob1ana.
REFERÊNCIAS
2.
Hemocultura
Na v1gência de ITU em crianças. a bacteremia é mais comum naquelas com menos de 2 meses. em relação a crianças com 1dade entre dois meses e 12 anos. Nesses casos. geralmente ocorre o isolamento de microrganismos idênticos no sangue e urina. Em indivíduos idosos. verifica-se bacterem1a em mais de 60% dos casos de ITU. Nas p1elonefmes, de modo geral. a probabilidade de recuperação do agente por intermédio de hemoculcura g1ra em torno de 25 a 60%. A hemoculcura representa uma poderosa ferramenta diagnóstica e um dos mais importames exames do laboratório de Microbiologia (ver capículo 13). Apesar de representar uma ferramenta para identificação do ageme etiológico da infecção unnária. diversos escudos têm questionado o cusco-efet1vidade da realização de hemoculrura na abordagem da ITU. Os agemes etiológicos isolados na urina não diferem daqueles isolados no sangue, não havendo. porcamo. impacco na terapia anrimicrobiana.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
D1ante da suspeita clínica de infecção do crato urináno. encontram-se indicados: exame de urina rocina. Gram de goca de urina não centrifugada e uroculcura. Os do1s primeiros têm papel de destaque no diagnóstico presuntivo da infecção, contribuindo para a decisão médica em relação à msmuição da terapia ant1m1crobiana. O diagnóstico definitivo de infecção do traco urináno é firmado pelo isolamento do microrganismo na urocultura. A bacreriúna s1gnificariva. habitualmente, caracteriza-se por cresCimento superior a lOs UFC/ml. Valores infenores. porém. devem ser valonzados em orcunsrâncias específicas.
166
Medicina laborato rial para o clínico
Car J, Sheikh A Recurrem unnary tracr 1nfewon 111 women. BM). 2003:327·1204 He1lberg lP. Schor . Abordagem díagnósuca e terapêuuca na mfecção do rrato unnáno - ITU. Rev Assoe Med Bras. 2003:49:109-16
3. Mehnerr-Kay AS. D1agnos1s and managemem of uncomplicared unnary tract 1n ect1ons. Am Fam Phys1c1an 2005;72(3):451-6. 4. Sobel )D. Kaye D. Unnary tract 1nfewon. ln: Mandei! GL. Bennett )E. Dolín R. ed1tors. Principies and Practice of lnfecnous D1seases. 6 1h ed. Orlando: Church1ll LIVIngstOne; 2006. p. 875-905. S. Sociedade Brasile1ra de lnfectOiog1a e SoCiedade Brastle1 ra de Urologia. Infecção do traro unnáno: diagnósuco. Projeto D1retrizes 2004 (home page da Internet]. Disponível em: hnp://www.prOJetodlrernzes.org.br. 6. Zore )). K1ddoo DA. Shaw KN. D1agnos1s and managemem of pediarric unnary uact 1nfecuon.Ciin M1crob1ol Rev. 2005;18:417-22.
17
Rodolfo de Braga Almeida
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DAS URETRITES INFECCIOSAS
A urecrite é um processo inflamatório da uretra, masculina ou feminina. que pode ser de origem infec· ciosa ou não. As urerrires não infecciosas. na grande maioria dos casos, são decorrentes de trauma externo, como o hábiro de ordenhar a uretra após urinar e o hábico masrurbatório. O rrauma interno. como aquele que ocorre após manipulação com instru mentos ou sondas. tam bém pode originar uma urecrite não infecciosa. As urerrites infecciosas são mais freqüentes e pos· suem mais importânoa médica devido à possibilidade de uansmissão sexual dos agentes et1ológ1cos. Podem ser assintomáricas. mas na maioria dos casos se caracterizam por um processo inflamatório da mucosa uretral com conseqüentes s1nwmas de algúria, disúria, às vezes prurido, além de sinais de corrimento extravasando pelo meaw urerral. o qual pode ter aspecro purulento ou seroso. São classificadas etio logicamenre como urerrite gonocócica (UG). na qual o agente etiológico é a Neisseria gonorrhoeae. e uretrite não gonocócica (UNG). As UNGs são as uretrites cuja bacterioscopia pela coloração de Gram e/ou cultura é negativa para o gonococo. mas revelam contagem de mais de cinco leucóciros polimorfonucleares/campo micras· cópico (x1 000), confirma ndo-se a inflamação da ure· era. Essas são causadas por diversos agenres, sendo a Chlamydia trachomatis o principal deles. seguida pelo Ureaplasma urealyticum, Micoplasma hominis, M1coplasma genitalium e o Trichomonas vagina/is.
Raramente. outros agentes infecciosos podem ser
causa de uretrite, a saber: bastonetes Gram negativo, Treponema pallidum, herpes genital e micobactérias.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
As doenças sexualmente transmissíveis (DST) e do traw reprodutivo, ainda que sem transmissão sexual, são responsáveis por importantes danos à saúde das mulheres e seus filhos em wdo o mundo, favorecendo inclusive a transmissão do vírus da imunodeficiênoa humana (HIV). Em 1999, a Organização Mundial de Saúde (OMS) es· rimou um total de 340 milhões de casos novos por ano de DSTs curáveis em todo o mundo. entre 15 e 49 anos, 10 a 12 milhões desses eventos no Brasil. As uretrites infecciosas são, na verdade, indicado· res da saúde sexual e reprodutiva de uma comunidade, particularmente se se levar em coma suas conhecidas conseqüências. No Brasil. as uretrites infecciosas têm alta prevalência. representando cerca de 30% do rotai das doenças sexualmente uansmissíveis. A uretrite gonocócica ainda é freqüeme. Com 339.593 casos de gonorréia notificados em 2005. é a segunda doença de notificação compulsória nos EUA. A taxa de freqüência é mais alta na região sul daquele país, emre os americanos de origem africana e entre adolescemes e adultos jovens de rodas as raças e grupos étnicos. Altas taxas de resistência à penicilina e à tetraciclina têm sido encontradas (15%) e já há identificação de resistência às
fluoroquinolonas e à cefexime. Em 2005. foram nocificados ao CDC (Centersfor Dtsease Contrai and Prevention), naquele país. 976.445 casos de infecção por clamídia entre as mulheres, acometendo principalmente a faixa de 15 até 24 anos de idade, com taxa de 2.700 casos por 100.000 mulheres. Segundo dados do Ministério da Saúde, estima-se que existam. no Brasil. 10 milhões de novos casos de DST por ano, excluindo-se os casos de infecção pelo HIV. A maior incidência é de tricomoníase (4.3 milhões de casos) e, em seguida, infecção por clamídia (1,9 milhão), gonorréia (1.5 milhão), sífilis (937 mil). infecção pelo HPV (685 mil) e pelo herpes genital (640 mil). A uretrite gonocócica é doença pandêmica, infectocontagiosa. cujo agente causador, a N. gonorrhoeae, rem no homem seu único hospedeiro natural e sua transmissão se dá essencialmente pelo ato sexual. sendo excepcionalíssima a contaminação acidental. A gonorréia é contraída, geralmente, de um(a) parceiro(a) sexual assintomáCico(a) ou somente com sintomas mínimos. Estima-se que a eficiência da transmissão após exposição seja de aproximadamente 35% de mulher infectada a um homem não infectado e de 50 a 60% o de homem infectado a uma mulher não infectada. Mais de 90% dos homens com urerrire gonocócica desenvolverão smmmas dentro de cinco dias; menos de 50% das mulheres com a gonorréia terão sintomas. As mul heres com infecções assintomáricas têm alto risco de desenvolver a doença inflamatória pélvica e/ou infecção gonocócica disseminada. Cerca de 20 a 30% das portadoras de gonorréia apresentam cc-infecção por C. trachomat1s. Embora se possa observar maior prevalência de urerrires não gonocócicas sobre as gonocócicas, estas últimas ainda mantêm a liderança entre populações socioculrural e economicamente menos favorecidas. Entre os fatores que mais contribuem para o incremento da freqüência da doença. pode-se citar: mais liberdade sexual, com conseqüente aumento da exposição ao agente causador; novos comportamentos sexuais, prática de sexo sem uso de preservativo. Também favorece a disseminação da doença a prática da automedicação, levando a tratamentos inadequados e ao surgimento de portadores assintomáticos. A resistência do gonococo aos antibióticos é um determinante importante da proposta terapêutica. Estudos mostraram que, na África do Sul, mais de 40%
168 ( Med icina labo ratorial para o clínico
das cepas eram resiscemes à ciprofloxacina; no Brasil. em Manaus, 85% das cepas isoladas eram resistentes à tetraciclina, penicilina ou ambas e houve suscetibilidade reduzida à azitromicina em 21% das amostras. Por outro lado, as mesmas cepas eram suscecíve1s à Clprofloxacina. a especti nomicina e já se observava redução da sensibilidade à ceftriaxona. Uma pesquisa no Brasil está em andamento e deve fornecer. em breve, dados mais consistentes para a avaliação da resistência do gonococo aos antimicrobianos. Nas UNGs. a C. trachomatis é o agente mais comum. Essa bactéria, obrigatoriamente intracelular. também causa o tracoma, a conjuntivite por inclusão no recém-nascido e o linfogranuloma venéreo. A rransmissão da infecção se dá pelo contaco sexual (risco de 20% por aco sexual). sendo o período de incubação, no homem, de 14 a 21 dias. Estima-se que dois terços das parceiras estáveis de homens com UNG hospedem a C. trachomatis no endocérvix. Permanecendo sem tratamento. elas podem reinfectar o parceiro sexual e desenvolver quadro de doença inflamatória pélvica (DIP). O utra conseqüência da infecção é a infertilidade feminina. A infecção por clamídia tem preocupado os urologistas e ginecologistas nos últimos anos, principalmente devido à elevação de sua freqüência e ao predomínio das formas assintomáticas e oligossintomáticas. Nessas. a infecção pode passar despercebida, não sendo pesquisada e muitas vezes permanecendo sem tratamento, o que favorece sua transmissibilidade.
ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS
Normalmente. a uretra pode albergar uma microbiota que se caracteriza pela presença de Staphylococcus epidermid1s. Enterococcus jaecalis, estreptococos alfahemolíticas. os basconeres Gram negativo (Eschench10 coli. Proteus). micobactérias, corinebactérias saprófitas, neisserias não patógenas, micoplasmas e leveduras. incluindo a Candida a/bicans. Na UG. após o intercurso sexual. o gonococo penetra na uretra. fixando-se no epitélio cilíndrico, e multiplica-se. desencadeando um processo inflamatório o qual. após dois a sere dias, deflagra os sintomas de algúria e corrimento uretral.
Nas UNGs, em geral, o processo inflamatório é mais discreto, com disúria ausente ou discreta e com produção de escassa secreção de aspecto seroso ou mucóide. Uretrites pós-traumáticas podem acontecer em 2 a 20% dos pacientes que sofrem cateterização intermitente seguida de insrrumemação ou 1nserção de corpo estranho; e naqueles que fazem o coiro anal. Relato interessante é o faro de que a uretrite é cerca de dez vezes mais provável com a utilização de cateteres de látex do que com cateteres de silicone. As uretrites podem dar origem a outras síndromes infecciosas. como epididimires. orquites. prosrarires. procrires. síndrome de Reirer, irires, pneumonia. mire média ou infecção do trato urinário.
do-se dose única de cefalosporinas e quinolonas. Tais drogas erradicam a N. gonorrhoeae, elim inando os sintomas da infecção, mas usualmente poupam os agentes das UNGs. Tal entidade está condicionada principalmente à co-infecção N. gonorrhoeae/C. trachomatis, verificada em 11 a 50% dos homens com gonorréia. Desres. 75 a 100% apresentarão quadro clín ico compatível com uretrite pós-gonocócica, se forem submetidos a tratamento que não erradique a C. trachomatis. Outro agente etiológico possível para as uretrires pós-gonocócicas é o U urealyttcum. Sabe-se. porém. que a incidência de urerrite pós-gonocócica é baixa, se for realizado tratamento concomitante para as causas mais comuns de UG e UNG.
ABORDAGEM lABORATORIAl MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS Em pacientes com uretrite, a anamnese e o exame clínico da genirália fornecem elementos fundamenta is para o diagnóstico e o tratamento imediato da doença. Em geral. rem-se queixa clínica de disúria, corrimento uretra! e às vezes prurido. A mucosa uretra! se mostra com sinais inflamatórios e com corrimento extravasando o meato uretral. principalmente pela manhã, e com aspecto que poderá ser purulento ou seroso. Na UG, além da disúria e algúria, sua principal característica é a drenagem abundante de corrimento purulento e viscoso pela uretra masculina. Por outro lado. a gonorréia na mulher. em geral. é oligossintomática. manifestando-se menos como uretrite e mais como um quadro de colpocervicire. O acometimento da uretra femin ina, embora ocorra, não se manifesta com quadro clínico de mesma intensidade que no homem. A UNG caracteriza-se. habitualmente, pela presença de corrimento mucóide discreto, com disúria leve e intermitente. Às vezes caracterizada como "gora matinal". A urerrire subaguda é a forma de apresentação de cerca de 50% dos pacientes com uretrite causada por C. trachomatis. Entretanto, em alguns casos, o corrimento da UNG pode simu lar, clinicamente, o da gonorréia. Na mulher, a C. trachomatis, além da cervicire e uretrite, pode levar à OlP e até à infertilidade. Deve-se suspeitar de uretrite pós-gonocócica em pacientes que apresentam sinais e/ou sintomas de uretrite quatro a sere dias após o tratamento de UG. empregan-
Investigação laboratorial das uretrites infecciosas
O laboratório de patologia clínica rem muito a contribuir no diagnóstico das uretrites. t importante considerar a adequada orientação para a coleta das amostras clínicas e o seu transporte e conservação até o processameno técnico pelo laboratório. Diante da suspeita de urerrite e dependendo da forma clínica, têm-se algumas opções de amostras clínicas a serem coleradas para a investigação laboratorial, a saber: secreção e raspado urerrais, secreção e raspado endocervicais e o primeiro jaro urinário, colhido na primeira micção, coleta ou após, no mínimo, quatro horas de retenção urinária. O instrumental para coleta deve ser estéril e o profissional responsável pelo procedimento deve utilizar os equipamentos de prmeção individual adequados. Recomenda-se a utilização de swab de alginaro, dracon ou tamponado. Deve-se evitar o uso de swab de algodão puro não tamponado, que é tóxico para as clamídias. No homem com corrimento uretra!, deve-se colerar a secreção. Mas, nos casos em que tal material é escasso. recomenda-se a coleta do raspado celular da uretra. inseri ndo um swab fino e apropriado, cerca de 4 a 6 cm, promovendo movimentos circulares para provocar a descamação celular. Esse procedimento é fundamental para obtenção de células com os corpúsculos da clamídia. Na mulher, a colera uretra! se faz a 1,5 cm. seguindo os mesmos movimentos da coleta masculina. Está, porém. formalmente indicada a colera de secreção no canal endocervical. em virtude da melhor sensibilidade diagnósrica
169
nesre local. Deve-se evirar a colera com alça bacteriológi-
ocorre
em aproximadameme 95% dos homens simo-
ca. pois é freqüeme a possibilidade de lesões traumáticas.
mácicos. No sexo feminino, porém, tal achado ocorre
No canal endocervical, insere-se o swab aproximadamen-
em menos de 30%. Nestas, deve-se coletar o raspado
re 1.5 cm. promovendo movimentos circulares para obter-
do endocérvix, o qual apresema mais sensibil idade na
se descamação das células colunares do endocérvix.
idemificação do gonococo.
O rransporre das amosuas clínicas coleradas deve ser de ral forma que garama a viabilidade dos m icrorganismos a serem pesquisados
e preserve
as qualidades
CULTURA
necessárias para a execução das técnicas de análise. É indicado um meio de transporte contendo um sistema
O material clínico. coletado com swab de algodão
tampão fosfato com adição de antibióticos e soro bovi-
É ideal o fornecimento, pelo laboratório, de um kit de
dracon. é semeado em meio de cultura específico e incubado em m icroaerofilia para recuparação da N. gonorrhoeae. A cultura permite idemificar a espécie
coleta para infecções genitais, masculinas e feminas, a ser
dos diplococos visualizados. É formalmem e indicada
realizada pelo próprio médico durante a consulta.
para mulheres e também para os pacientes do sexo
no fetal. o que pode ser feito pelo laboratório assistente.
Os exames laboratoriais dos próximos subitens po-
masculino que apresemaram resultado negat ivo ou
dem ser disponibilizados pelos serviços de assistência
duvidoso no exame direto corado pelo Gram, pacien -
médica, para esclarecimento diagnóstico.
tes dos quais não foi possível obter material para tal exame e, ainda, nos casos suspeitos de resistência
à
penicilina. A parti r da cultura, pode-se fazer o antiEXAME D IRETO A FRESCO
biograma e estudos de genética m olecular. Ressalta-se que a cu lt ura é o método de referência para o diag-
Trata-se da microscopia do material clínico coletado, sem fixação
e sem
coloração. Esta revela o número de
A aplicação da cultura na abordagem diagnóstica
T vagina/is e de leve-
das UNGs é limitada. A técnica de isolamemo em cul-
pseudo-hifas. Muito út il na avaliação da
tura celular, considerado o mécodo de referência para
leucóciros/campo, a presença de duras, hifas
e
nóstico da gonorréia.
microbiota vaginal, sendo possível, por meio deste, diag-
o d iagnóstico das infecções por C.
nosticar vaginites e vaginose. Apesar da baixa sensibilida-
sível
de,
é um exame simples, de cusro baixo. rápido e possível
de ser realizado durante a consulta clínica.
e específica, exigindo,
trachomatis, é sen-
entretantO, infra-escrutura
laboratorial para o cultivo de células. Por tal mot ivo, não se encontra am plamente difund ida
e
acessível
à
comunidade. Por outro lado, o resultado da cultu ra para U. EXAME DIRETO CO RADO PELO GRAM O material clín1co é fixado principal utilidade
em lâmina e corado. Sua
é permitir, além da contagem dos
urealyticum deve ser interpretado com cau tela,
à luz da alta prevalência de colon ização em ind ivíduos assimomát icos e sexualmeme ativos. A mesma ponderação d eve ser feita em relação ao isolamemo em cultivo de M. hominis.
leucócitos, a visualização de diplococos Gram negativo (DGN) intracelulares, fato confirmatório da gonorréria. O achado de diplococos Gram negativo extracelulares
IMU NOFLUORESCÊNCIA DIRETA PARA CLA M ÍD IA
não permite estabelecer o diagnóstico de infecção gonocócica, indicando a necessidade da solicitação de cultura para
Neissena gonorrhoeae.
O exame m icroscópico do esfregaço de secreção
O teste de imunofluorescência direta (IFD) corresponde a uma reação específica entre um antígeno MOMP da clamídia
e
um anticorpo monoclonal es-
uretral corado pelo Gram const itui-se em exceleme
pecífico contra esse antígeno, conjugado a uma fluo-
método de diagnóstiCO para o sexo masculino. O acha-
resceína (isotiocianaro de fluoresceína - FITC). Pode-se
do de diplococos Gram negativo intracelulares típicos
utilizar, além da secreção urecral. o raspado uretra!
170 [ Medicina laboratorial para o clínico
e do
endocérvix e o primeiro jaro de urina para realização da imunofluorescência direta para clamídia. Esta técmca tem sido muiro utilizada. apesar de exigir microscópio de fluorescência e ser passível de variabilidade técnica em função da subjetividade do examinador na leitura das lâminas. No entanto, em que pese à sua alta espeofiodade. tem sensibilidade inferior às técn1cas de genética molecular.
TÉCN ICAS IMUNOENZIMÁTICAS Na técniCa imunoenzimática (ELISA), a partir de uma reação antígeno-anticorpo, a presença do antígeno no espécime clínico é revelada pela produção de cor sobre um substraco cromogên ico. Apesar de exigir equipamentos de cusco mais alco, tem a vantagem de ser uma técnica aplicável diretamente sobre as amosuas clín1cas coletadas e permitir rápido diagnóstico. Tipos variáveis de k1ts estão disponíveiS no mercado, sendo que os mécodos de fase líquida têm demonstrado sensibilidade de 96 a 98% quando comparados com a cultura. Como regra geral, o M1n1sténo da Saúde, através do Programa Nacional de DST/AIDS, sugere um ensaio imunoenzimático para teste de u iagem, sendo indicação absoluta a realização de testes confirmatórios, diante de resultado positivo.
TÉCN ICAS DE GENÉTICA MOLECULAR Pode-se utilizar secreção, raspado celular ou urina de primeiro jaco para a realização da reação de polimerização em cadeia (PCR). Essa mecodologia tem se revelado a melhor para a rocina clínica, particularmente no diagnóstico de infecção por C trachomatis. devido à sua alta sensibilidade e especificidade (superiores a 95%). Porém, a PCR ainda coma com grande restrição de acesso aos pacientes, em função de cusco e relativa complexidade operacional. Em recente revisão do uso diagnóstico de testes de amplificação de ácido nucléico disponíveis comercialmente nos USA, utilizando metanálise de estudos publicados, constataram-se excelentes sensibilidade e especificidade para a detecção de C trachomatis em amostras de urina de homens e mulheres. Os resultados foram equivalemes àqueles obt1dos com amostras de swab ureual e cervical, fato não verificado na identificação de N. gonorhoeae.
Investigação laboratorial das uretrites infecc iosas
ABORDAGEM SIMPLIFICADA
O Ministério da Saúde orienta a abordagem sindrômica para o diagnóstico e tratamento das uretrites. de forma a garantir a interrupção da transmissão dos agentes infecciosos (Figura 17.1). Nos pnmeiros passos. pressupõese a poss1bd1dade da realização da bacterioscopia da secreção urerral pelo mérodo de coloração de Gram, o qual poderá informar sobre o número de leucócicos polimorfonuclear (LPMN)/campo microscópico (x100, imersão em óleo). confirmando ou não a urerrite. A bacterioscopia permite também a visualização de diplococos Gram negativo intracelulares, fato confirmatório da UG. Na etiologia não gonocócica, ocorrerá também na bacterioscopia da secreção uretra! pelo método de coloração de Gram a presença de mais de cinco leucócitos polimorfonucleares/campo, às vezes com diplococos Gram negativo extracelulares (neisserias da microbiota e não patógenas). Seguindo esta orientação. se a UG não for identificada neste pnmeiro passo. pode-se solicitar a cultura para neisseria, coletando as amosrras clín icas com Indicação apropriada para cada caso: swab de secreção ureual, raspado de mucosa uretral e urina de jaco inicial após higienização local. t válido destacar que a cul tura é o método de referência no diagnóstico laboratorial da gonorréia, sendo considerada a primeira opção para as mulheres e indicada para homens com suspeita clínica da doença e resultado de bacterioscopia negativo. Nessas mesmas amostras. deve-se acrescentar ao pedido méd1co a 1munofluorescência direta ou ELISA ou PCR para clamídia. Segunda a abordagem simplificada proposta pelo Ministério da Saúde, porém. estas somente estariam indicadas nos casos de cultura negativa para o gonococo. Outras técn1cas mais simples. embora não confirmatórias. podem ter utilidade para o clínico. O achado de onco p1ócicos ou mais por campo (x100) em esfregaços de secreção uretra! corados pelo Gram ou de 10 ou mais piócitos por campo em grande aumento (x40) no sedimento do primeiro jato urinário, somados à ausência de gonococos e aos sinais clínicos, justificam o tratamento como UNG. Em pacientes sintomáticos. CUJOS primeiros exames forem negativos. deve-se colher nova amostra, orientando-os para que fiquem sem urinar durante, no mínimo. quatro horas antes de repetirem o teste e em abstinência sexual.
171
Paciente com suspeito de uretrite
Trotamento empírico poro UG e UNG
Sim : coleto de espécime cl ínico
Pesguisor outros cousas para os sintomas.
G rom com menos de 5 LPMN
Gram com mais de 5 LPMN e DGN introcelulares
Trotamento específico
Gram com mais de 5 LPMN sem DGN
- Clomíd io: PCR, IFD, Elisa ou cultura de célula para Clomídia - Cultura ou técnicas moleculares para micoplosma e ureaplasma
É possível investigar etiolog ia?
Figura 17.1 -Abordagem simplificada das uretrites.
REFERÊNCIAS 1.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Programa Nacional de DST e A IOS. M anual de Controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis. 4• ed. Brasília: Ministério da Saúde: Disponível em: htrp:// portal.saude.sp.gov.br/ resources/profissional/documenros_tecnicos/informes_tecnicos/manual_de_ contro -
2.
4.
Sistemattc Review: Non tnvasive testing for Chlamydta
5.
Trachomans and Neissena gonorrhoea. A m Coll of Physicians. 2005;142:914-25. Cardava CM, Cunha RAF. Detecção de Mycoplasma genitalium, Mycoplasma . fermentans e Mycoplasma.
le_das_dsts-2006.pdf.
penetrans em pacientes com sintomas de uretrite e em
Cenrers for Disease Control and Prevention. Sexually Transmined Disease Survetllance 2005 Supplem ent. Gonococcal lsolate Surve11lance P1oject (G ISP). Annual
indivíduos infectados pelo HIV-1 no Brasil. J Bras Pato! Med Lab. 2002;38(2):111-8. Melles HHB. Doenças causadas por clamídias. ln: Focac-
6.
Report 2005. Disponível em: http://www.cdc.gov/std/ GISP2005/. 3.
Cook RL Hutchion SL Tergard L Bralthwaice RS, Ness RB.
Cenrers for Disease Contrai and Prevention. Sexually Transmined Disease Surveillance 2005 Supp lemem. Ch lamydia Prevalence Monitoring Project. An nual Re-
7.
port 2005. Atlanta: Centers for Disease Conrrol and Prevenrion; Disponível em: http://www.cdc.gov/scd/Chla-
8.
cia R. editor. Tratado de lnfecwlogia. São Paulo: Ediwra A theneu; 2005. p. 735-46. Mirre AI. Infecções do Trato Urinário (U retrites, Prostatites, Epid idim ites e Orquites).ln: Focacoa R, editor. Tratado de lnfectologia. 3' ed. São Paulo: 2005. p. 1993-5. vol. 2. Sociedade Brasi l e ~ra de Urologia. Guia Prático de Urologia. Rio de janeiro: BG Cultu ral; 1999.
m ydia200S/CTSurvSupp2005Short.pdf.
172 [ M edicina laboratorial para o clínico
]1-- - - - - -- -- - - - -- - -- - - - - - - - - -- - - - -- -
Rodolfo de Braga Almeida
18
Marcos Mendonça
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DAS VAGINITES E VAGINOSE
Procurar-se-á neste texto dar àqueles que farão uso dele, em sua lida diária na atenção à saúde das mulheres, informações e ferram entas capazes de contribuir para a conduta clínica e a resolutividade dos casos sob sua assistência médica. As vaginites e a vaginose são, respectivamente, processos inflamatórios e de alterações do ecossistema vaginal que levam a repercussões desconfortantes e negativas para o bem-escar e a saúde das mulheres acometidas. É importante compreender a fisiologia desse sírio corporal, pelas suas particularidades que influenciarão as interpretações dos resultados dos diversos exames laboratoriais que podem ser utilizados para o diagnóstico. As mulheres, mesmo as de melhores condições socioculcurais, confundem, muicas vezes, fluxos cérvicovaginais normais com corrimentos devidos à inflamação. A emissão fluida da vagina, quando fisiológica, é intermitente ou ocasionalmente contínua, inodora, incolor e não acompanhada por ardor ou prurido. A vagina possui um sistema de defesa especialmente represemado pela descamação comínua do epitélio escamoso estratificado e pela acidez do meio. Essa descamação celular está relacionada com os níveis sanguíneos de esrrogênios, estando, portamo, dim inuída fisiologicamente na infância e na pós-menopausa. O meio vaginal é composto de cransudato vaginal. restos celulares e microrganismos, sendo que estes podem ser comensais ou patógenos oportunistas. A microbiota vagi nal indígena é constituída basicamente por
Lactobacillus acidophílus. considerados os responsáveis pela manutenção do pH vaginal. pelo metabolismo da glicose, a partir do glicogênio comido no epitélio de revestimento (Figura 18.1). O pH da vagina situa-se entre 3,5 e 4,5 em mulheres no período de menacme. Meninas pré-púberes e mu lheres no período pós-menopausa têm o pH vaginal em to rno de 7,0. Além dos lactobacilos, fazem parte da microbiora vaginal vários microrganismos, entre os quais, Staphylococcus epiderm1dis, Streptococcus sp, Escherichia coli, bactérias anaeróbias e leveduras como as do gênero Candida.
-, ~
t-
p
/
~
~
,1 .
-'
Figura 18.1 - Esfregaço do ftu1do vag1nal normal corado pelo Gram (x100): microbiora vag1nal com a presença de bastonetes Grampositivos (Flora Doderlein) e células superficiais da mucosa vaginal.
ller oag.na 172
A microbiota vaginal pode ser modificada em várias situações, cais como: comportamento sexual (tipo,
freqüência e número de parceiros); estado hormonal (gravidez. contracepção hormonal e nas diversas fases do ciclo menstrual); sangramento vaginal (mensuuações, sangramentos irregulares e lóquios); corpos estranhos (sutura de cerclagem, diafragmas e tampões) e uso de medicamentos (antimicrobianos e espermicidas). O meio vaginal é hostil ao crescimento de microrganismos parogênicos e pode inibir a transmissão de doenças sexualmente transmissíveis. Porém, quando ocorre ruptura no equilíbrio entre os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro e o potencial de agressão desses microrganismos, podem ocorrer reações Inflamatórias ou alterações do ecossistema local, que favorecem a ocorrência de doença inAamatória pélvica, de infecções pós-cirúrgicas e de adversidades na gravidez. O diagnóstico das vaginites e da vaginose deve se basear em anamnese e exame físico detalhados e em recursos complementares, tais como a determinação do pH vaginal, o teste do KOH, o exame colposcópico, os estudos citobacteriológicos (exame direto a fresco, exame direto corado pelo Gram e Papanicolaou), exames de genética molecular. como a reação de polimerização em cadeia (PCR), culturas e estudo histológico, entre ouu os.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS A vaginose bacteriana (VB) é a afecção mais freqüencemente relacionada às vaginites e ao corrimento vaginal, sendo responsável por aproximadamente 50% dos casos. Todavia, sua prevalência ainda é subestimada, uma vez que metade das mulheres com VB são assintomáticas. Durante a gestação, sua prevalência é similar àquela encontrada em não-grávidas de mesmas características sociodemográficas. Muitas observações têm relacionado a vaginose bacteriana com a atividade sexual, sendo muito mais freq üente entre mulheres sexualmente ativas. t mais freq üente entre mulheres com início precoce da atividade sexual, entre as que referem maior número de parceiros sexua is e entre aquelas com história de ounas infecções genitais concomitantes ou pregressas. Além disso, o aparecimento da vaginose bacteriana é freqüentemente associado à mudança de parceiro sexual. Por outro lado, sua detecção enue virgens é um
174 [ Medicina laboratorial para o clínico
argumento contrário à transmissão sexual como forma única e exclusiva para a aquisição dessa afecção. Outra evidência contra a uansmissão sexual exclusiva decorre dos achados de que o uacamento dos parceiros não previne a sua recorrência. A vaginite por Candida é a segunda causa mais freqüente de vaginites. sendo afecção comum em mulheres durante a vida reprodutiva. As diversas espécies de Candida são mais freqüentemente isoladas da cavidade oral e são detectadas em 31 a 55% dos indivíduos sadios. Candida albicans é o agente causador em 85 a 95% dos casos de cand1díase vaginal. Este Fungo é um organismo comensal dos tratos genital e gasuintescinal e um pacógeno oportunista desses sítios. Outra espécie de fungo, a Candida glabrata, tem sido considerada um saprófita não-patogênico da microbioca de indivíduos sadios, raramente causando infecção em humanos. Contudo, devido ao aumento do uso de terapia imunossupressora e de terapia antimicótica de amplo especuo, a freqüência de infecções de mucosas causadas por C. glabrata tem aumentado significativamente. Aproximadamente 20% das mulheres apresentam C. albicans na vagina sem qualquer sintoma. Ma1s de 75% delas apresentarão pelo menos um episódio de candidíase vaginal aguda durante sua vida e outros 5 a 10% terão candidíase vaginal recorrente. Enquanto a afecção aguda é usualmente associada a fatores predisponentes, cais como o uso de antibióticos, anticoncepcionais orais, gravidez ou diabetes, a candidíase vaginal recorrente geralmente não apresenta facores predisponentes conhecidos, em que pese a algumas suspeitas de ser parte de um fenômeno imunopsicossomácico. Na gravidez, 30 a 35%das mulheres apresentam cultura positiva para C. albicans. A tricomoníase, outrora uma freqüente vaginite, é uma infecção primariamente de transmissão sexual, causada pelo protozoário flagelado Trichomonas vagina/is. Tem sido observada incidência decrescente nos últimos 20 anos e, nos dias de hoje, é responsável por pequenas e variáveis freqüências, dependendo da população escudada. Alguns estudos no Brasil estimam a prevalência das infecções cérvico-vaginais no país. Pode-se afirmar que a tricomoníase tem tido freqüência em franca redução (abaixo de 5%), assim como a gonorréia (1 a 5%), e que tem ocorrido ascensão da infecção por clamídia e da vaginose (10-15%) entre as brasileiras.
ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS
a responder a um estímulo alergênico e a C. a/bicans pode rornar-se um potente alergeno. A instituição de
Para cada entidade clínica das vaginites e vaginose,
imunoterapia promove no organismo uma hipossen -
vale observar os aspecws fisiopawlógicos em separado,
sibilização gradual, com diminuição progressiva dos
apesar de algumas características serem semelhantes.
níveis de lgE e conseqüente queda das substâncias res-
A vaginose baneriana
é definida
como uma sín-
drome caracterizada pelo desequilíbrio da m icrobiota
ponsáveis por reações inflamatórias, que levam à sintomatologia clínica da candidíase.
vaginal indígena. Pode ocorrer agudamente ou espora-
O papel da imunidade mediada por células contra
dicamente e cornar-se uma condição persistente. Essa
a candidíase vaginal ainda é incerto, tanto em huma-
afecção
é marcada por franca d iminuição de laccoba-
nos com o no modelo experimenta l
em
roedores, as-
cilos e pelo crescimento excessivo de ou tros micror-
sim como o papel da imunidade humoral. Enquanto
ganismos, tais como: Gardnerella vagina/is, Mobiluncus sp, Bacteroides sp, Mycoplasma sp, Peptoestreptococcus sp, Prevotella sp, Atopodium sp, Clostridium sp, que pa-
corpos contra a candidíase vaginal. um m odelo expe-
recem atuar sinergicamente. O exaco mecanismo pelo
anticorpos lgA específicos para Candida. Adicional-
quais esses microrganismos causam alteração do meio
mente, vacinação específica para Candida induzindo
vaginal ainda não foi estabelecido. O metabolismo
produção de anticorpos lgM e lgG3 é proterora no
bacteriano anaeróbio cria um meio alcalino que inibe
modelo de vagin ite em roedores.
o crescimento dos laccobacilos, facil itando a replicação
observações clín icas sugerem papel mínimo de antirimental em ratos mostrou evidência de proteção por
Trabalhos experimentais em camundongos têm mos-
dos patógenos. A lém d isso, observa-se número muito
trado controvérsia em relação ao papel da imunidade
diminuído dos lactobacilos produtores de peróxido de
local e sistémica mediada por células na candidíase vagi-
hidrogénio nas pacientes com VB, quando compara-
nal. Estudo recente mostrou que pequena ou nenhuma
das com mulheres saudáveis.
modificação ocorre na porcentagem ou tipo de células
A vaginite por Candida tem como principal agente a
T na vag1na, durante infecção primária ou secundária por
C. a/bicans, que é um microrganismo comensal e patógeno oportun ista da microbiota humana. A maioria dos
Cand1da, onde se observou proteção parcial. Na vaginite por T vagina/is, protozoário flagelado
adulws desenvolve mecanismos fisiológicos de defesa
que tem afinidade pelo epitélio vaginal, verifica-se pH
que controlam o cresci mento e a difusão desse fungo. gravidez, uso de dispositivo intra-uterino, de anovulató-
à multiplicação. Entre os facores de risco associados à contaminação pelo T vagina/is, podem-se ci tar: múltiplos par-
rios e antimicrobianos e diabetes. Níveis aumentados de
ceiros sexuais, baixo nível socioeconômico, tabagismo,
estrogênios, levando ao aumento do teor de glicogênio
história prévia de doença sexualmente transmissível
e à acidificação local, parecem ser responsáveis pelo au-
(DST) e a não utilização de mécodos contraceptivos
mento da incidência dessa infecção.
de barreira. A associação de tricomoníase e outras in-
Alguns fatores são predisponentes à infecção, tais como
vaginal de 5,0 a 7,5, que é muito favorável
A lguns estudos têm demonstrado que a resposta
fecções, com o gonocócica e vaginose bacteriana, tem
imune vaginal é responsável por casos de vaginites re-
sido observada com certa freqüência. Esse fato parece
correntes. Anticorpos lgE contra C. albicans e contra
estar relacionado à produção, pelo protozoário, de hi-
componentes do sêmen, pólen e espermicidas têm sido
drogénio, q ue se liga ao oxigénio, promovendo a sua
identificados no fluido vaginal de mulheres com essa
remoção do ecossistema vaginal e faci li tando o cresci-
afecção. Em muitos casos, a presença de prostaglandina
mento de bactérias anaeróbias.
E2 na vagina e a detecção de eosinófilos no líquido vagi-
A vaginite não constitui manifestação primordial da infecção gonocócica na mulher adulta. No entan-
nal também foram observadas. Pacientes portadoras de candidíase vaginal de repe-
to, a associação com outros m icrorgan ismos, como T
tição podem freqüentemente apresentar rinite alérgica
vagina/is, provoca forte descamação das camadas su-
e história familiar de alergia. A mucosa vaginal. assim
perficiais do epitélio vaginal, tornando a vagina mais
como as outras mucosas, está imunologicamente apta
acessível ao gonococo. Nesses casos, man ifesta-se por
Invest igação laboratoria l da s vaginites e vaginose
175
corrimento amarelado, ardor e queimaçào vulvar, po-
Para ramo, considerando o sintoma de corrimento
dendo estar presentes disúria, polaciúria e hematúria.
vaginal como a queixa mais freqüente dessas afecções,
Dor abdominal pode surgir em decorrência do acome-
torna-se importante caracterizar se tal manifestação
timento secundário das trompas.
devida a fatores fisiológicos ou conseqüentes a doenças,
A queixa de corrimento mucoso, persistente,
após tratamemo de cervicites gonocócicas, ou a
é
sendo que, nesta última situação, englobam-se diversas causas, infecciosas ou não infecciosas.
presença de cervicite mucopurulenta na ausência de
O exame físico consta inicialmente da 1nspeção da
Trichomonas ou Candida, com cultura negativa para
genitália externa e do intró ito vaginal a olho nu, a qual
gonococos, sugere a possibilidade de infecção genital
pode revelar lesões, tais como úlceras, verrugas ou
por
Ch/amidia trachomatis.
nodu lações. Em seguida, o exame especu lar também
Em razão da alta prevalência de parasitoses intestinais
possibilitará a observação de alterações, como hipere-
em nosso meio, merece menção a possível ocorrência de
mia, edema ou lesões nas paredes vaginais. O fluido
vagini tes causadas por
Entamoeba histolytica, Enterobius vermicularis, Schistosoma mansoni e Ascaris lumbricoides,
vaginal poderá ser caracterizado quanto à cor, consis-
entre outros, que, por cuidados precários de higiene, po-
recurso auxiliar, será utilizado o colposcópio, que per-
dem alcançar a genitália interna, provocando corrimento. A vaginite citolítica constitui condição associada às variações hormonais do ciclo menstrual, caracteri-
tência, volume e aderência às paredes da vagina. Como mite a ampliação das imagens em até 40 vezes, como será descrito adiante. Na vaginite por
Candida, o prurido e o corrimento
zada por aumento do número de lactobacilos. Estes,
vaginal são comumente a base para fazer-se o diagnósti-
embora não sejam patógenos de forma direta, podem
co. O exame ginecológico pode revelar edema e/ou eri-
ocasionar vaginite sintomática, por produzir demasia-
tema vulvar, com presença ou não de fissuras. A vagina
da queda no pH vaginal, com conseqüente irritação da
e o colo freqüentemente apresentam-se hiperemiados.
mucosa da vagina, vulva e região perineal, pelo contato
observando-se fluido vaginal, de coloração variável, flo-
com o f luido excessivamente ácido. Manifesta-se por
cular, viscoso e, na maioria das vezes, aderente às paredes
e pelo aumento cíclico dos
da vagina. Por outro lado, a ausência de prurido torna a
corrimento, prurido, disúria
sintomas durante a fase lútea.
candidíase um diagnóstico menos provável. Um estudo
A ação local de alergenos, tais como agentes de lim-
em que se determinou a relação entre critérios clínicos
e sintomas) e as
peza. perfumes ou xampus, também são citados como
(sinais
causas de irritação vaginal.
de corrimento, verificou-se que, na candidíase, freqüen-
Neoplasias do trato genital devem ser consideradas
três principais causas infecciosas
temente não se observa odor desagradável.
no diagnóstico diferencial das vaginites, pois também
Na vaginose bacteriana, o corrimento rende a ser
causam corrimento, tendo-se em mente que os tumores
fl uido, homogêneo, de odor desagradável, o qual se
e uterinas podem cursar com
esta manifesta-
exacerba após o intercurso sexual. Com a ejaculação, o
ção, principalmente o câncer de colo uterino, em razão
líquido seminal eleva o pH vaginal transitoriamente, pro-
ovarianos
de sua alta incidência em nosso meio.
vocando a liberação de aminas que se volatilizam
e são
detectadas pelo seu odor característico. O padrão dos sintomas pode ser cíclico, aumentando progressivamen-
ASPECTOS CLÍNICOS
te desde o meio do ciclo até o final da menstruação e diminuindo logo após. A sua constatação ao exame é
Na história clínica, deve-se investigar o início e a duração dos sintomas
e sinais, tais como eliminação de lí-
sinal preditivo dessa afecção. A vagina e o colo uterino geralmente não apresentam áreas de hiperemia.
quido pelo intróito vaginal. ardor, prurido, odor desagra-
Na vaginite por tricomonas, observa-se quadro
e alterações urinárias. Devem-se avaliar, também,
clínico variável. de acordo com o estágio evolutivo da
os hábitos sexuais, a história menstrual, o método con-
infecção. No processo agudo, o corrimento é em geral
traceptivo utilizado, o uso recente de medicamentos e a
espumoso, profuso
ocorrência anterior de inflamação vaginal.
ocorrer prurido, disúria
dável
176 [ Medicina laboratorial para o clínico
e amarelo-esverdeado. podendo e dispareunia. Não é comum a
ocorrência de erirema vulvar ou escoriação. mas erirema vaginal em geral está presente. O aspectO de "colo em morango", com inúmeros pomos hemorrágicos. é visro em apenas pequeno número de casos. Na infecção crônica, o corrimento persiste, mas as demais manifestações cendem a regredir. Na vaginire citolítica observa-se corrimento, prurido, disúria e intensificação dos sintomas na presença de níveis séricos elevados de progesterona, especialmente na segunda fase do ciclo menstrual ou na gravidez. Esta é caracterizada por aumento do número de lactobacilos que. embora não sejam patógenos. podem ocasionar vaginite sintomática. por produzirem demasiada queda no pH vaginal. com conseqüente irritação da mucosa da vagina. vulva e região perineal pelo comato com o fluido excessivamente ácido. Na infecção causada por papilomavírus humano (HPV), podem ser observadas lesões verrucosas ou tumorações sésseis de tamanho variável, com superfície micropapilar e irregular nas paredes da vagina. No intróito vaginal. as lesões podem apresentar-se ligeiramente mais escuras que a pele circunjacente e nas áreas de mucosa mostram-se hiperemiadas. Nas formas subclínicas da 1nfecção por HPV. de ocorrência muito freqüente, o diagnóstico pode ser presumido com o auxílio da colposcopia e da microscopia (coloração de Papanicolaou); nas formas latentes, a detecção do vírus é feita com técnicas de biologia molecular, como visto a seguir. O exame colposcópico é útil no diagnóstico de vaginites. pois revela detalhes do epitélio inflamado. Ele permite o estudo da superfície do colo e da vagi na, com aumento que varia de seis a 40 vezes. Aplica-se inicialmente solução de ácido acétiCO a 2% ou a 5% por aproximadamente dois minutos. com a finalidade de remover o muco cervical e outros resíduos. facilitando a visualização. Assim, as áreas de hi peremia serão facilmente identificadas à colposcopia. Após a aplicação da solução iodada de Schiller, essas áreas absorvem mal o iodo, sendo então chamadas de "áreas iodoclaras". Nas cervicocolpites. freqüentememe são observados dois tipos de imagens: • colpite difusa: imagem de pomos avermelhados (áreas iodoclaras). que se estende por toda a superfície do epitélio escamoso; • colpite focal : imagem de áreas avermelhadas extensas, que corresponde à confluência dos pontos de colpite difusa.
Investigação laboratorial das vaginites e vaginose
Na infecção por Candida, o quadro colposcópico é caractenzado pelo aparecimentO de um ponti lhado fino. branco. pouco elevado. difuso, sobre a mucosa hiperemiada. Após a aplicação da solução de Schiller. a inflamação aparece como um pontilhado iodoclaro sobre superfície iodoescura. Esses aspeccos colposcópicos, codavia, não são parognomônicos, devendo ser feito diagnóstico diferencial com a condilomarose em pontos brancos. Na vaginose bacteriana. o epitélio escamoso geralmente apresenta aspecm normal, podendo, evemualmeme. apresentar áreas de colpite d1fusa. A 1magem de colpite d1fusa e focal devida à dilatação capilar e hemorragias punriformes está relaoonada à infecção pelo T vagina/is em aproximadamente 90% dos casos. Na vaginite citolítica. a avaliação colposcópica não apresenta características específicas e freqüememente o exame é considerado normal. A forma subclínica da infecção por HPV. bem ma1s freqüente que as lesões verrucosas clinicamente identificáveis. é perceptível somente por meio da colposcop1a e/ou da microscopia. O condiloma plano virai representa a manifestação colposcópica mais freqüence da infecção na cérvice uterina. É visualizado após a aplicação de ácido acético a 2 ou 3%. preferencialmence demro da zona de transformação. mas também enconrrado fora dela e mesmo nas paredes vaginais, de coloração esbranquiçada e lim ites nítidos. Sob visualização col poscópica observam-se mosaicos. pontilhados. leucoplasias ou áreas de epitélio aceto-branco. Tais lesões podem ser ún icas ou múltiplas e geralmente não se coram após a aplicação de solução de Schiller. A vaginite condilomarosa é uma condição clínica observável ao colposcópio, podendo-se v1sual1zar minúsculas micropapilas pontiagudas que ocupam extensões variáveis do epitélio. Essa lesão também se mostra acero-branca. não se corando pela solução de Schiller. Sua detecção. no entanto, exige minucioso estudo colposcópico das paredes da vagina.
ABORDAGEM LABORATORIAL
Para o diagnóstico mais preciso e bom acompanhamento das pacientes. além dos recursos propedêuticas da clínica e da colposcopia, é muito útil comar com os
177
exames laboraroriais, pois, a partir deles, pode-se obter a definição microbiológica da etiologia e/ou das associações de agentes. Coma-se. entre outros, com os seguintes exames:
MEDIDA DE pH VAGINAL A determinação do pH vaginal é importante, pois indica qual o possível agente etiológico da vaginite. É um reste ráp1do, de baixo cusco e de fácil realização. O pH local pode ser medido com o uso de papéis ou fitas reagentes, colocados diretameme na parede da vag1na. Após aproximadamente um minuro. a coloração da fita é observada e comparada com a cor correspondente na escala. Entre as fitas reagentes. para medida de pH. disponíveis no mercado. deve-se priorizar aquelas graduadas em 0,5 e que cubram pelo menos uma faixa de O a 5.0. Na candidíase, o pH do fluido vaginal geralmente encontra-se abaixo de 4,5. O pH vag1nal aumentado, isco é. acima de 4.5. isoladamente apresenta alta sensibilidade (92%) para o diagnóstico de vaginose bacteriana. porém baixa especificidade (62%). Na tricomoníase. o pH vaginal é superior a 4,5 em cerca de 70% dos casos. Em geral, encontra-se emre seis e sete. Deve-se ressaltar. no encanto, que outros facores. além dos infecciosos, podem provocar elevação do pH vaginal. tais como imercurso sexual, presença de muco cerv1cal, reações inflamarónas. sangramentos. antibioticoterapia e alterações hormonais. O pH encontra-se elevado. por exemplo. nas pacientes em pós-menopausa com vaginite arrófica, em função do decréscimo dos níveis de esrrogênios. com conseqüente redução de lactobacilos e alcalinização do me1o vag1nal. Na vag1nite otolírica. em razão do elevado número de laccobacilos. o pH vag1nal encontra-se reduzido.
TESTE DO KO H 10% O teste do KOH 10% (teste de Wijf. teste das aminas ou teste do cheiro) consiste na adição, sobre uma lâmina de vidro. de uma a duas gotas de KOH a 10% a uma gora do fluido vaginal. É considerado positivo quando exala odor desagradável, de peixe. causado pela liberação de aminas (putrescina e cadaverina).
178 ( Medicina laboratorial para o clínico
O teste é muim útil na pesquisa de germes anaeróbios e G. vagina/is. Teste das aminas positivo é altamente preditivo de vaginose bacteriana (94%). Por outro lado, teste negativo não deve excluir o diagnóstico, tendo em vista o faro de ser subjetivo, dependente do olfato do examinador. O cesce de KOH também é positivo na cncomoníase, mas na cand1díase. sem associação, é negativo.
EXAM E DIRETO A FRESCO O exame direto do resíduo vaginal é indispensável para o diagnóstiCO, sendo um recurso simples e prá[lco, podendo ser realizado pelo próprio ginecologista no momento da consulta. A técnica consiste na ad1ção de uma gota do fluido vaginal a uma gota de soro fisiológico entre lâmina e lamínula e observação em microscópio óptico comum. Vários elementos podem ser observados ao exame direco, ta1s como as células ep1teliais descamadas, laccobacilos. cocobacilos. leucócitOs e parasitas, como T. vaginalts e fu ngos. O fluido vaginal de mulheres adultas normais geralmente mostra células ep1teliais. laccobacilos. cocobacilos e raros neutrófilos. A presença de grande número de piócitos (neutrófilos degenerados) sugere inflamação. No emamo. amostras colhidas no período pré-menstrual podem revelar elevado número de neutrófilos. mesmo na ausência de inflamação. Na suspeita de candidíase, o exame a fresco pode ser feiro com uma gma de KOH a 10% em substituição ao soro fisiológico. possibilitando melhor identifi cação de fungos devido à lise dos demais elementos celulares. A C. albicans é o agente causador em 85 a 95% dos casos de candidíase vaginal. A identificação de hifa s sugere infecção por Candida. que é o único gênero de fungo que se reproduz sob esta forma na cavidade vaginal. Por outro lado, o achado apenas de esporos não indica infecção por Cand1da, po1s estes podem apenas representar sua forma saprófita ou mesmo outros fungos, como Criptococos, que podem existir na vagina. sem causar infecção. Nos casos em que a Candida é o único agente agressor. não se encontra número apreciável de polimo rfonucleares. Quando se adiciona KOH a 10% du ra nte
a realização do exame a fresco, podem-se visualizar melhor as hifas, conferindo sensibilidade de 50 a 70% ao mérodo. O encontro de células cujo cicoplasma parece coberco por grande quantidade de cocobacilos, o que dificulra a delimiração de suas bordas (células indicadoras ou e/ue-ce/Is), sugere o diagnóstico de vaginase bacteriana. O número de laccobacilos pode estar reduzido ou estes podem estar ausentes quando as e/ue-ce/Is estão presentes. A existência dessas células é o marcador mais sensível e específico de vaginose bacteriana, com acurácia de 85 a 90%. Entretanto, é necessário um bom microscópio óptico disponível durante a consulta e a experiência do examinador para identificá-las. Outras bactérias, como Mobiluncus, podem ser freqüememente visualizadas como bacilos curvos e finos, lembrando uma vírgula, e de resposta Gram variável à coloração. O encontro de poucos leucócicos refletindo a natureza não inflamatória dessa afecção fortalece seu diagnóstico. O diagnóstico de tricomoníase tradicionalmeme é feito pela observação do procozoário no fluido vaginaL O T vagina/is é facilmente observado ao exame a fresco, devido ao movimento ativo de seus flagelos. Em geral, esses parasicos são duas a três vezes maiores que os leucócicos, os quais se apresentam em grande quantidade. A sensibilidade dessa técnica é variável, entre 38 e 82%. Os Trichomonas móveis são viscos em apenas 50 a 70% dos casos, que são posteriormente confi rmados por cultura. O encontro de altO número de lactobacilos, na ausência de células indicadoras de Gardnerella, Candida ou Trichomonas no exame a fresco do flu ido vaginal, assim como de pequena quantidade de leucócitos e evidência de citólise com núcleos soltos e fragmentos citoplasmáticos, sugere o diagnóstico de vaginite citolítica.
EXAME DIRETO CORADO PELO GRAM Constitui um recurso de fáci l realização e baixo custo, extremamente útil no diagnóstico. A diferente composição química da parede celular dos microrganismos perm ite ou não que o corante penetre de forma permanente. Assim, existem alguns que mantêm o corante azul violeta (Gram positivo) e outros que não o
Investigação laboratorial das vaginites e vaginose
mantêm (Gram negativo). A coloração de amostra do fluido vaginal pelo mécodo de Gram pode demonstrar ou confirmar a presença de vagin1te. Os laccobacilos de Doderlei n consistem em bactérias Gram positivo, de forma curta como cocos ou forma filamentosa, de tamanho variado (Figura 18.1). As células indicadoras (clue-cells) são idenrificadas pelo citoplasma coberto por grande quantidade de cocobacilos Gram positivo, dificultando a delimitação de suas bordas (Figura 18.2). Podem também ser observados G. vagina/is, bastonetes Gram negativo ou Gram variável, pequenos e pleomórficos; e espécies de Mobiluncus, bastonetes curvos Gram variáveLOs fungos, Gram positivo, são facilmente identificáveis, tanto na forma de hifas quanto de esporos (Figuras 18.3 e 18.4). A coloração de Gram, no entanto, não oferece melhores resultados que os obtidos pelo exame a fresco. Este último reflete melhor a característica da população lactobacilar vaginal em relação ao primeiro. Os lacto bacilos são mais facilmente visualizados ao exame direto, provavelmenre pela perda desses microrganismos durante os processos de fixação ou de coloração. T vagina/is também são de identificação difícil em esfregaços corados, já que usualmente essa técnica determina alterações na forma e tamanho desses parasitos.
EXAM E DE PAPANICOLAOU O exame colpocitológico realizado em células esfoliadas das paredes vaginais e das regiões ecto e endocervicais possibilita a observação de alterações sugestivas de vaginites. O exame do material para estudo oncológico do colo uterino poderá se constituir num recurso auxiliar no diagnóstico de infecções não virais. Não se trata, entretanto, de exame de primeira linha. A coloração de Papanicolaou proporciona melhoria no diagnóstico de tricomoníase, visto que é rotineiramente usado em ginecologia no rastreamento de populações com alta prevalência de DSTs. No entanto, nas infecções causadas pelo T vagina/is, pode haver fal ha no diagnóstico quando o esfregaço de Papanicolaou é usado como único método de avaliação. Nessa infecção, deve-se atentar para a grande quantidade de leucócitos, hipercromasia, citólise intensa, pseudo-eosinofilia, vacúolos citoplasmáticos, halos perinucleares e muitos histiócitos.
179
tanto, a baixa sensibilidade da técnica nestes casos limita sua utilização no rastreamento de candid íase
e
vaginose bacteriana. Na infecção subclínica por HPV, a citologia oncótica cérvico-vaginal é o método rastreador mais eficaz. Neste exame, o sinal característ ico da presença do vírus é a coilocitose. Trata-se de alteração faci lmente tden(l ficável
à microscopia, caracterizada po r células superficiais
ou intermediárias de citoplasma claro, vacuolizado, que
Figura 18.2- Vaginose: célula indicadora, m1crobiota alterada com Intensa redução dos lacmbacilos, presença de cocobacilos e bastonetes curvos e finos, Gram lábe1s. Ver oag1t1a 78(
circunda núcleo pequeno, irregular e hipercromático. Pode ser também identificada disceratose nos esfregaços, que corresponde à forre eosinofilia citoplasmática, observável em células menores que as intermediárias,
-
além de núcleos densos e hiperc romáricos. Os achados citol ógicos descritOs são muitO sugestivos de infecção por HPV, principalmente quando não está associada à neoplasia intra-epitelial. Convém ressaltar que a normalidade de um esfregaço cérvi co-vaginal não exclu1esse ripo de infecção .
..
..
CULTURAS
• ~ A cultura do resíduo vaginal só deve ser soltcttada
Figura 18.3 - Esfregaço do flUido vagtnal normal corado pelo Gram (x100): m1crob1ota vag1nal com a presença de bastonetes Gram pos1nvos (Flora Doderle1n) e células superfiCiaiS da mucosa vag1nal. Ver pagma 180
quando os recursos citados anteriormente falharem na identificação do agente causal, visto que a microbiora vaginal nativa é multibacteriana. A cultura de fiUtdo vaginal nos casos de vaginose bacteriana e infecção por T vagmalis não fornece informações mais significat ivas que o exame microscópico isolado. Na candidíase, a culrura possui alta acurácia, mas este recurso só d eve ser considerado se o d iagnóstico pelos métodos anteriores permanece duvi doso ou nos casos de recorrência da infecção. Para a identificação das espécies implicadas na infecção causada por fungos do gênero Candida, é necessária a utilização de métodos convencionais, como o reste do tubo germinativo, a produção de clam tdo conídeos e o s restes
Figura 18.4 - Esfregaço do 0Utdo vaginal normal corado pelo Gram (x100): m1crobiota vag1nal com a presença de bastonetes Gram positivos (Flora Dõderle1n) e células superfic1a1s da mucosa vaginal. Ver pagmo 180
bioquímicos, os quais ajudam a verif icar a assimilação e fermentação de carboidratos correspond entes a cada espécie. M étOdos comerciais autOmatizados que permitem a d istinção de um grande número de espécies de leveduras têm sido propostOs. Pa ra a identifi-
Fungos e células 1nd1cadoras também podem ser
cação presuntiva de espécies de Candida, existem no
evidenciados pela coloração de Papanicolaou. No en-
mercado meios cromogênicos o u fluorogênicos. com
180 [
Medicina laboratorial para o clínico ) 1 - - - - - - - - - - - - - -- - - - -- - - - - -- - - - -- -
a capacidade de determinar a arividade enzimática das leveduras.
EXAMES IMUNO LÓG ICOS E BIOQUÍM ICOS
Alguns pesquisadores têm utilizado o reste de ELISA (Enzyme-lmked immunosorbent assay) no diagnóstico de candidíase. Esse teste vem sendo considerado útil para avaliar a quantidade de leveduras, fornecendo resultados semelhantes aos obtidos pelos mécodos tradicionais de contagem de células fúngicas viáveis. Para o diagnóstico de vaginose bacteriana, tem sido proposto o teste prolina aminopeptidase, por ser rápido, pouco dispendioso e de fácil realização. Este encontra-se, contudo, pouco difundido em nosso meio. A detecção direta de antígenos de T vagina/is em espécimes clínicos utilizando anticorpos monoclonais configura-se como mérodo promissor de diagnóstico rápido de tricomoníase.
ária são utilizadas outras três técnicas biomoleculares menos laboriosas: PCR, captura híbrida e hibridização in situ. Estes recursos permitem a detecção de mínima quantidade de DNA. bem como a ripagem virai. São úteis no reconhecimento da forma latente de infecção por HPV, assim como nos casos em que a coloração de Papanicolaou revela atipias escamosas ou glandulares de signi ficado indeterminado.
RESGATE DA IDÉIA CENTRAL
Encontram-se no Quadro 18.1 os recursos propedêuticas para investigação de vaginites e vaginose. A seguir são apresentados dois algoritmos: o primeiro proposto pelos autores deste capítulo, para Quadro 18.1 - Resumo dos recursos propedêuticos para a investigação de vaginites e vag1nose Anomnese Exame físico
EXAMES MOLECULARES
Recentemente, as técnicas genéticas vêm ganhando espaço na propedêutica complementar das vagi nites. No geral, essas técnicas apresentam alta sensibilidade e especificidade, mas sua aplicabilidade ainda é limitada na maioria dos centros em razão do alco custo e da necessidade de recu rsos humanos e operacionais capacitados a realizá-las. Na tricomoníase, técnicas de DNA recombinante têm sido descritas, com o intuito de aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico. O uso da PCR auxilia na detecção de mganismos não viáveis, contidos em amostras clínicas que tenham sido submetidas à fixação ou à degradação parcial. Esta técnica é superior ao exame a fresco; entretanto, resultados falsonegativos têm sido encontrados quando se compara à cultura. O exame "padrão ouro" para a detecção de DNA de HPV é o Southern 8/ot. No entanto, na prática di-
Investigação laboratorial das vaginites e vaginose
Colposcopio Medido do pH vaginal Teste do KO H l O% ou Teste do cheiro Exame direto o fresco Exame direto corado pelo Gro m Exame direto corado pelo Popanicoloou Culturas* Reoções imunológicas e bioquímicos* Técnicas molecu la res*
·Pouco dtspOtliVel5. No emamo, na ma torta dos ca~os. asseguram o dta.gnósuco co1reto
abordagem laboracorial nas vagin ites e vaginose (Figura 18.5) e o segundo proposto pelo Ministério de Saúde (2005) para abordagem sindrômica de cmrimento vaginal (Figura 18.6).
181
-...... Sinais de acometimento do vagina e/ou do cérvrx?
Exames loborotoriois do resposta rápido.
Fluido voginol • Teste do KOH
•
o Io•o
~~:o t~: vaginal
0
---~
Grom espodo do cérvix Grom
l _ _ j-- ..r--;:;;tad: inconclus•vos
~inoso:
• pH > 4,5 • KOH pottiVO • Microbioto alterado com ~~ l cctobocolos • Presença de células indicadores
Condodíose: • Guolquer pH • Teste KOH negotrvo • Pseudohifos • Aumento d e leucócotos
l
Trocomoniose· • pH > 4,5 • Teste KOH positivo • Movimento flgelor no exame o fresco
:l
Cervicote gonocócico • i leucóci tos • Diplococos Grom negativo intracelulores ou cultura positiva
lcervrcite por clomídio • I leucócitos ~m outros agentes
(~
J
Figu ra 18.5 -Abordagem laboraronal das vagtntres e vagtno~e
T
' ---
Exames mo1s sensiveis • Cultura poro cândido (fungo) • Cultura celular poro tricomanas • Cultura celular poro clomídio • Cultura poro Neisserio • PCR poro trocomono s • PCR poro clomidio • PCR poro Ncisserio
1
Excluído o
lrvest.gor
l outros cousas
Paciente com queixo de corrimento • Parceiro com sintoma • Pacientes com mútiplos parceiros sem proteção • Paciente penso ler sido expo sto o uma DST • Paciente proveniente de região de alta prevalência de go nococo e clomídio
Anomnese e avaliação de risco + exame ginecológico
Critério de risco positivo e/ou sinais de cervite com mucopus/teste do cotonete/frio bilidode/sang ramento do colo
pH vaginal e Teste de KOH a 10%
Aconselhar, oferecer sorologias anti-HIV, VDRL, hepatites B e C se disponíveis, vacinar contra hepatite B, enfatizar a adesão ao tratamento, notificar, convocar e tratar parceiros e agendar retorno
Figu ra 18.6- Abordagem sindrôm ica de commenco vaginal. Fome: M1n1sténo da Saúde (2005).
REFERÊNCIAS 1.
Brasil. M tnlsténo da Saúde. Secretaria de V1gtlância em Saúde. Programa Nacional d e DST e A IOS. M anual de
4.
Fidel )r PL, Vazquez )A, Sobel )D. Candida glabrara: review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease w1t h comparison to Candtda al bicans. Cltn M icrobial Revtews. 1999;12(1):80-96.
Com role das Doenças Sexualmente Transm 1ssíveis. 4• ed. Brasília: M inistério da Saúde; 2006. Disponível em: http:// portal.saude.sp.gov.br/ resources/profissional/d ocumentos_ tecn tcos/informes_ tecn icos/man ual_de_ cont ro le_das_dst s-2006.pd f. ( amargos A F. Melo VH, Carneiro MM, Re1s FM. Gtnecolo-
5.
M endonça M . Vulvovaginite. ln: Pedroso ERP, Rocha MOC Silva AO, ed itores. Clín ica M édica. Os Pnncíp ios da Prática Ambulatorial. São Paulo: A theneu; 1993. p. 1094-99.
gla Ambularorial. 2• ed. Belo Horizonte: Coopmed; 2008. 3. Cemers for Disease Comrol and Prevem1on. Sexu-
6.
ally Transmitted Diseases Treatmem Guidelines 2006. MMWR Recomm Rep. 2006;55(11):1 -1 00.
7.
M endonça M, A lmeida RB, Silva DM, Mirand a CAV. Corri mento vaginal. JBM. 2004;86(5):10-20. M endonça M , A lmeida RB, M iranda CAV. Vagin ites:
2.
Recursos auxiliares para o d iagnóst ico correto. Fem ina. 2005;33(10):729-35
Invest igação laboratorial das vaginites e vagino se
183
19
Marcus de Almeida Magalhães Gontijo Marcelo Luide Pereira Gonçalves Hyllo Baeta Marcel/o júnior
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DAS MICOSES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS
As micoses podem ser definidas como infecções provocadas por fungos. Estes normalmente apresentam como habitat natural o solo ou as plantas, podendo parasitar o homem e outros animais. O parasitismo fúngico depende da produção de enzimas e de mecanismos de escape contra as defesas naturais do hospedeiro. A patogenicidade provocada por estes agentes está relacionada ao oportunismo oferecido pelo hospedeiro. Os fungos ra ramente são transmitidos por contato interpessoal. Apenas os dermatófitos, considerados parasitos obrigatórios, são transmitidos desta forma. A infecção fúngica, superficial ou profunda, relaciona-se pri ncipalmente a fatores do hospedeiro, ao gênero do fungo envolvido, ao tamanho do inóculo e ao sítio de inoculação. Este capítulo abordará as principais micoses superficiais e profundas de interesse médico em nosso meio.
Segundo Ri ppon, essas infecções podem ser classificadas como superficiais, quando limitadas à superfície da pele ou pêlos. ou como cutâneas, quando envolvem propriamente o tegumento e/ou seus anexos. As infecções superficiais compreendem: • pitiríase versicolor: causada por leveduras do gênero Malassezia; • piedra branca: causada por leveduras do gênero Trichosporon (Figuras 19.1 e 19.2); • piedra preta: causada pela levedura Piedraia hortae; • tinha nigra: causada pela levedura Hortaea werneckii.
..
MICOSES SUPERFICIAIS
DERMATOMICOSE São infecções fúngicas envolvendo o tegumento e/ ou seus anexos. Representam a maioria das infecções cutâneas humanas diagnosticadas em serviços de Dermatologia.
.Jra 191 - P1edra branca (lOOX).
A tricomicose axilar ou rricomicose nodular pode produzir nódulos que se confundem com a Piedra branca (rricosporonose). Ela é causada por bacrérias da espécie Corynebacterium tenuis (antiga Nocardia tenuis). Atinge os pêlos axilares e raramente os da região pubiana. É caracterizada pelo aparecimenro de nódulos ou concreções aderidas aos cabelos. Constitui-se por bacilos curros, delicados e embebidos num material gelatinoso, que podem ser identificados pelo exame direro em hidróxido de potássio (KOH) ou pelo Gram. A culrura é difícil. Existem três variedades de tricomicoses: a flava (amarela), a rubra (vermelha) e a nigra (preta). O tratamento é a raspagem dos pêlos e aplicação de álcool iodado. As infecções cutâneas são causadas por fungos ceratinofílicos. denominados dermatóficos, e são referidas genericamente por dermarofiroses. Além dos dermatófiros, outros fungos filamenrosos e as leveduras do gênero Candida também são capazes de causar dermatomicoses.
DERMATOFITOSE
Os dermarófiros são classificados em três gêneros: Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Nem sempre o encontro de dermatófítos nos tecidos cerarinizados é traduzido por dermatofirose, podendo ser uma simples colonização que, quando há sintomatologia, esta é resultante da reação do hospedeiro aos produtos metabólicos do fungo e não devido a invasão de tecidos vivos pelo microrganismo. Deste ponto de vista, o tipo e a gravidade das manifestações clínicas dependeriam da sensibilidade individual do hospedeiro e de sua competência
186 ( Medicina laborarorial para o clínico
imunológica. Em geral, pela própria localização superficial desta infecção, não são observadas alterações celulares no hospedeiro imunocompetente, porém, em pacientes imunocomprometidos, as formas clínicas são mais graves, mais generalizadas e atíptcas. Em alguns casos, reações alérgicas denominadas mícides ou simplesmente "ides" podem ocorrer. As mícides são defintdas como mantfestações cutâneas à distância de um foco infeccioso pri mário em atividade e podem assumir aspectos clínicos os mais variados. Geralmente, ocorrem nas mãos e chegam a uma casuísttca de 21% nos pacientes com dermatofirose, segundo o Prof. Carlos da Silva Lacaz. A espécie do dermatófito é importante para o tipo de mantfestação clínica do paciente e eles se diferem quanro à habilidade de interagir com hospedeiros distintos. Do pomo de vista filogenético, parece provável que as espécies que parasitam exclusiva ou preferencialmente o homem, chamados de anrropofílicos, representam a fase final de um ciclo evolutivo que seria iniciado com fungos que utilizam a queratina no solo, denominados geofílicos, passando depois para aqueles associados a animais, os zoofílicos, para então terminarem nas espécies antropofílicas. Corroborando esta hi pótese, têm-se alguns dermatófitos em aparente processo de adaptação, como, por exemplo, Trichophyton terrestre, que é um geofílico que causa dermacofirose em animais. Da mesma forma. temse o Microsporum nanum. um zoofílico encontrado no porco, que vem causando dermarofirose em humanos. O M. gypseum é um geofílico que causa doença no homem, principalmente na região inguino-crural. onde só era enconrrado antigamente o anrropofílico Epidermophyton floccosum. Alguns autores interpretam esse faro como adaptação emergente dos dermatófitos ao tegumento humano. Assim, diferentes graus de especificidade e adaptação podem ser distinguidos entre os dermatófitos, mas, de modo geral. esses microrganismos tendem a atingir equilíbrio com seu hospedeiro preferencial. Quanto maior a adaptação, menos agressivamente se comporta o fungo e menor é a resposta inflamatória evocada. Com isto, é compreendida a existência de portadores assintomáticos, infecções subclínicas, bem como aquelas de caráter crónico e benigno. Portanto, a manifestação clínica das dermarofitoses é função de características específicas de cada fungo e de cada hospedeiro. As dermarofiroses são referidas muitas vezes como "tineas" ou "tinhas" (do latim, verme ou traça) em virtude
]1- -- - -- - -- -- -- -- - - - - - - - - - -- - - - - --
do contorno geográfico das lesões ter sugerido, aos pesquisadores da Ancigüidade, a presença de vermes adulcos sobre uma superfície lisa ou, de acordo com Rippon, pelo faco de os romanos terem associado as lesões a insews (tinha = larva). De qualquer forma. a nomenclatura é incorrera, mas permanece na literatura, consagrada pelo uso. De acordo com a localização anatómica das lesões. são feiws diagnósticos clínicos de tinha capitis, unguium. corporis, cruris, etc. Alguns fungos micelianos, não dermatófims, podem causar lesões muim semelhantes às dermamfimses. Esses fungos vêm ocorrendo mais freqüentemente em casos de onicomicoses, represemados por Scytalidium dim idia tum, S.hyalinum e Scopulariopsis brevicaulis. Além do tecido ungueal, outros sítios são acometidos, como o espaço imerdigiral e região plantar. Mais raramente espécies de Aspergillus, Fusarium e Acremonium podem estar envolvidas em casos de onicomicoses. Variações na prevalência de determinadas der macomicoses podem ser verificadas em função da faixa etária dos paciemes. Assim. pelo fam da derme das crianças ser menos cerarinizada que a do adulco, é pouco comum a ocorrência de tinha pedis, cruris e unguium. De modo inverso, a tinha capitis ocorre mais em criança do que no adulw, devido à ausência de ácidos graxas de cadeia média (C8-C12) no couro cabeludo de indivíduos pré-puberes. Normalmeme, a tinha cap1tis em crianças é causada pelo M . cams devido ao maior conta to das crianças com o solo e animais. Em adulto a tinha capitis por M. canis é mais comum na mulher devido ao maior conrato com as crianças infectadas. As onicomicoses têm maior ocorrência em faixas etárias mais avançadas (55 a 60 anos). o que estaria relacionado a traumatismos nas unhas. alterações do estado imunológico. avitaminoses, diabetes, entre outros. A ocupação dos pacientes ta mbém é famr determinante da ocorrência de diferentes micoses superficiais e de agentes etiológicos distintos. Assim, profissionais que têm contam com animais (veterinários. etc.) têm mais oportunidade de adquirir infecções por fu ngos zoofílicos. Atletas (maramnistas) apresentam maior freq üência de tinha pedis que a população geral. Esta maior incidência é associada ao uso constante de calçados fechados (tênis), que aumentam a temperatura. umidade e maceração de tecidos dos pés. Tin ha pedis também é muim comLm em nadadores devido às áre-
Investigação laboratorial das micoses su perflciais e profu ndas
as contaminadas associadas a piscinas (pisos adjacentes e vestiários comuns). No que tange à distribuição geográfica de dermacomicoses e seus agentes causais. padrões vêm sendo defin idos com base em numerosos relatos encontrados na
literatura. Enquamo as leveduroses cutâneas, pela característica endógena das infecções causadas por espécies de Candida e Ma/assezia, têm ampla distribuição mundial. as dermarofiroses podem apresemar padrões de ocorrência bem definidos já que, se por um lado algumas espécies de dermatófiws são francamente cosmopolitas, por outro lado existem espécies que são restritas geograficamenre. Correntes migratórias de diferentes naturezas têm alterado continuamente os padrões de distribuição geográfica dos dermatófiws, ocasionando às vezes o surgimento de diferentes doenças em determinadas regiões. No entanto, variações na prevalência de diferentes espécies também vêm ocorrendo em função do tempo e, neste aspecto. o achado mais notável diz respeiw ao aumento do número de infecções causadas pelo Trichophyton rubrum em todo o mundo. Outros fawres. como distribuição clínica da lesão (localização anatómica), também devem ser considerados para maior prevalência de um ou de outro agente de dermatofirose.
FISIO PATOGENIA DAS DERMATOFITOSES A queratinase é produzida por codo dermatófito e é ativa em pH alcalino. As colagenases e elastases atuam em pH neutro. A intensidade dessas enzimas, principalmente a elastase. reflete a intensidade da reação inflamatória. Fungos zoofilícos produzem maior quantidade de proteases que os antropofílicos e causam reação inflamatória mais intensa. o r interdigitale (amropofílico) tem baixo grau de atividade da elastase. provocando menos inflamação no hospedeiro quando comparado com o r mentagrophytes, que é zoofilico. O r mentagrophytes produz menos elastases na pele humana do que em pele de outros animais. Em todo fungo bem adaptado. esta queda na produção de enzimas (reatividade) decresce quando o hospedeiro é aquele a que ele está adaptado. Como a reação inflamatória ocorre na derme e os fungos estão na epiderme, sugere-se que estas enzimas proteolíticas difundam-se nesta direção.
187
Cada espécie de dermarófiw rem uma arividade queratolítica própria e a produção pode variar de cepa para cepa. Por exemplo. o T rubrum, ao contrário do T schoenleinii, produz pouca enzima capaz de fragmentar o pêlo, sendo, portanto, de ocorrência rara neste anexo e cem enzimas capazes de dissolver bem as unhas. Os ácidos graxas, principalmente o undecilênico. produzidos principalmente pelas glândulas sebáceas e pouco pelas sudoríparas. além de baixarem o pH da pele. têm ação anrimicótica. O suor tem poucos ácidos graxas. portanto, rem pouca ação antimicórica, mas possui muitos aminoácidos importantes que favorecem o crescimento fúngico. O T rubrum produz três tipos de querarinases: • peso molecular 93.000; • peso molecular 71.000; • peso molecular 27.000. As duas primeiras querarinases têm forre ação querawlírica quando em pH alcalino. A terceira queratinase foi descoberta no órgão penetrante da hifa do T rubrum, a partir da microscopia elerrónica. tendo ação queratolítica fraca e agindo em pH ligeiramente ácido (pH=4.5), semelhante à tripsina. Esta enzima tem relevante papel na virulência do fungo porque é ela que age nas primeiras duas semanas de penetração. quando o pH da pele está ligeiramente ácido. À medida que vai desdobrando proteínas, vai liberando íons de amónio e o pH da pele vai se neutralizando, começando a agir as enzimas de pH neutro (elastases e colagenases) para. finalmente. agirem as enzimas de pH alcalino (queratinases). Apesar dos dermatófitos serem queratinofílicos, eles não dependem da queratina para crescer nos tecidos. A queratina funciona principalmente como barreira protetora, isolando o fungo da ação de inibidores presentes no soro do paciente.
TIPOS CLÍN ICOS DE DERMATOFITOSES Ti nha corporis
Os dermatófiws produzem resposta imunológica celular e podem curar-se espontaneamente. Nas lesões da pele, onde a disseminação é centrífuga. o centro da lesão vai ficando curado por imunidade local e as bordas ficam reacionárias.
188 [ Medicina laboratorial para o clínico
Normalmente. os dermatófiws produzem pápulas, placas e máculas descamarivas, com bordas serpiginosas. Geralmente, as erupções são exfoliativas, sendo o prurido o principal sintoma. Existe também a história de contam com pessoas infectadas ou animais como gaw. cachorro, coelho, papagaio, etc. A lesão típica da tinha corpons é anular. com bordas descamativas, elevadas, reacionárias, de cor rosa com tendência ao clareamento central. Pode ser uma ou várias lesões. Em pacientes com lesões crónicas. podem ser extensivas e não anular. O T mentagrophytes produz lesão úmida, do tipo vesicular. com foliculite supurariva. O T rubrum produz lesão seca, escamosa, que se dissemina em forma de anel, ficando o centro curado. Geralmente, as infecções por espécies antropofilicas são seguidas da auw-inoculação de outros sítios de infecção no corpo. Os pacientes com tinha do corpo não raro apresentam outras tinhas associadas. O T tonsurans poupa as áreas da barba. pregas. pés e mãos. O E. jloccosum tem preferência pelas dobras e pés, podendo atingi r un has (raro) e tronco. nunca o couro cabeludo. Diagnóstico diferencial
• eczema numular: produz lesões em moeda. múltiplas. geralmente nas extremidades, sem embranqueci menta central; • ptiríase rosada (ptiríase rósea de gilbert): mancha ovalada, rosada, inicialmente ún ica, de elevação mínima e auwlimitanre ao tronco. Aparece a "mancha primitiva", que é a maior mancha, com 2 a 6 cm. seguida por manchas ou lesões múltiplas menores, que vão aparecendo no decurso da doença. após dias ou semanas do aparecimenw da mancha primitiva ou "medalhão", segue-se a erupção. Pode haver prurido; • pitiríase alba: é uma alteração hipopigmentária idiopática que se apresenta por manchas brancas cobertas por escamas finas. afera geralmente meninas de seis a 12 anos e é mais notável na raça negra. É assintomárica, as bordas da mancha são indefinidas, é comum no rosw. sendo que nas mulheres jovens aparece mais na parte superior do braço. A repigmenração pode levar anos. sendo que a cura pode ser espontânea;
• pitiríase versicolor: apesar de ser uma infecção
•
•
•
•
superficial do extraw córneo (dermawmicose superficial), pode produzir descamação fina. Há alceração pigmentária da epiderme. Não causa prurido porque não afeta fi letes nervosos, por ser superficial. Ao exame direto em KO H, aparecem hifas curtas e grossas, sem ram ificação e com blascoconídios em cachos, característica do gênero Malassezia; psoríase: são placas mais grossas, mais descamativas e infiltradas. São de tonalidade prateada (estratificação); impetigo: pode apresentar lesão anular. Geralmente presença de vesículas, pústulas e crostas em lesões anulares levam a pensar em infecção bacteriana, e não micótica; eritema anular centrífugo e granuloma anular: no eritema anular a escama se encontra dentro da borda elevada e no granuloma a borda é mais indurada e não descama; candidose: a candidose da pele aparece como zona eritemacosa rodeada por pápulas e pústulas satélites. As hifas de Candida ativam o complemento, ocasionando púsrulas e inflamação. Produz prurido intenso. A umidade predispõe e as áreas mais afetadas são as intertriginosas. O diagnóstico é feito pelo raspado e exame micológico direto com KOH, em que aparecem as leveduras e pseudo-hifas. Em caso de pústulas. seu exsudado possui alto índ ice de positividade.
Tinha cruris
Normalmente, pacientes com tinha cruns apresentam também tinha pedis porque a transpiração provocada pelo exercício é provavelmente o denominador comum . Portanto, são erupções "desportivas". Normalmente, é transmitida por meio de malhas contaminadas, chão de banheiros. qua rtos de hotéis e freqüentemente dissemina-se por auco-inoculação. Era chamada de "eczema de Hebra" ou eczema marginatum (descrito por Hebra, em 1962) porque tinha coloração acentuada nas bordas. Não afeta o escroto. Seu principal agente é o E. floccosum, porém o T rubrum tem sido atualmente mais isolado no Brasil e em outros países.
Invest igação laboratorial das micoses superficiais e profundas
Quando o T interdigitale estiver atacando a virilha, o que é raro. suspeitar de concomitância com tinha pedis. Diagnóstico diferencial • candidose: intensamente eritematosa e brilhante,
bordas pouco definidas com pápulas e púsrulas satélites e afeta o escroto; • intertrigo: é dermatite irritativa ou rubor congestivo, comum nas pessoas obesas, causada pelo acúm ulo de umidade, junto com o atrito. É erupção menos eritemarosa que a candidose e não está tão limitada como a tinha cruris. São nãoescamosas nem marginadas e o centro da lesão é a prega inguinal. ao passo que a tinha cruris se desenvolve abaixo dessa prega; • dermatite seborréica e a psoríase menos comumente afetam a região inguinal; • eritrasma raramente ocorre e pode ser diferenciado pela lâmpada de Wood, que mostra fluorescência vermelho-coral e o Gram revela bastonetes Gram positivo (Corynebacterium minutissimum).
Tinha pedis
São infecções micóticas que afetam 4% da população em geral. A tinha pedis pode se estender para as unhas dos pés, geralmente de maneira distal e ra ramente proximal. Um pé é mais acometido que o outro e esta assimetria ajuda a diferenciar da psoríase. Geralmente começa entre os dedos do pé, passando para a região plantar e sendo rara no dorso. Os atletas, devido à maior perspiração nos pés. acumulam a umidade no local o que, aliado a traumatismos mecânicos e geralmente à maior exposição a lugares contaminados, como piscinas e ginásios. fazem com que este grupo de pessoas fique mais susceptível à tinha pedis. Pode aparecer de três formas clínicas diferentes: • interdigital: aparece a maceração entre os dedos dos pés. Mais comum em pacientes com hiperhidrose dos pés; • descamativa plantar difusa: ocorre mais nos idosos e é assintomática. A pele aparece seca, com descamação difusa nas plantas dos pés até o cal-
189
canhar. Normalmente vem acompanhada de afec-
ções das unhas; • vesículo-pustulosa: é a forma menos comum e normalmente se diagnostica erroneamente. As vesículas e púsculas aparecem na parte interna
dos pés. Conforme a evolução clínica. a tinha pedis pode ser classificada em: • tinha crônica dos pés: a pele é seca, hiperceracótica. com incensa descamação e apresenta preenchimento pulverulenco dos sulcos da pele. Geralmente, é causada pelo T. rubrum. Distribui-se preferencialmente na região plantar e lateralmente, dando aspecto de "sapato Mocasin"; • tinha aguda dos pés: aparecem erupções vesiculosas (1-2 mm) que podem se agrupar e formar bolhas (tinha bolhosa). Geralmente é unilateral. pegando a planta e o cavum do pé. O agente mais comum é o T mentagrophytes; • tinha inflamada dos pés: geralmente é a evolução da tmha bolhosa e está associada à linfangite ou à celulite. Podem ocorrer no dorso do pé. Os indivíduos atópicos. por não terem reação celular, também não têm resposta inflamatória significativa. Normalmente, esses pacientes têm tinha pedis crônica porque. somado ao fato de ter baixa resposta celular, têm ainda a camada dérmica mais espessa que impede a difusão dos fatores mibitónos séricos e também menor quantidade de glândulas sebáceas secretando ácido undecilênico. Em crianças. por terem pouca quantidade de queratina nos pés. virilha e unhas. os dermatófitos são agentes pouco comuns. Nos casos de tinha pedis em crianças. a espécie mais comum é o T. mentagrophytes, ao contrário do adulro. no qual predomina o T interdigitale.
• dermacite de concato e eczema disidrórico: confundem-se com a forma vesículo-pusrulosa. sendo as vesículas menores e quase nunca dão púsculas; • psoríase pustulosa: é rara. A dúvida é tirada no exame di rem com KOH; • ceratólise plantar: ocorre sob a forma de pequenas erosões ci rculares da camada córnea provocada por bactérias do gênero Corynebacterium; • eritrasma: causada pelo Corynebacterium mmut1ssimum. Produz manchas eritematosas. que depois se tornam pardacencas. com bordas bem delimitadas e descamação. Geralmente com localização interdigital.
Tinha manuum
É pouco freq üente. mas não rara. Geralmente aparece
em paciente com tin ha pedis concomitantemente. Tipicamente aparece em uma das mãos. A descamação é difusa e parecida com a forma descamativa da tinha ped1s. Tem as bordas bem delimitadas dentro da "munheca". O T rubrum pode causar tinha manuum un ilateral junto com tinha pedis bilateral e recebe o nome de tinha "1 mão 2 pés". Esta situação muitas vezes fala a favor de imunossu pressão e interessante é que esta forma de infecção não foi ainda explicada satisfatoriamente. Duas formas clínicas são observadas: • desidrose ou eczemarosa; • hiperqueratótica. Diagnóstico diferencial
• dermame por contato irritatiVO crónico: chamada de mãos dos "lava-pratos". Geralmeme ocorre nas duas mãos e sem bordas bem delimitadas; • psoríase: são mais elevadas. bilaterais. mais eritematosas. com lesões de psoríase em outras partes do corpo. Fazer exame direro em caso de dúvida.
Diagnóstico diferencial
• maceração por hiper-hidrose dos pés: nestes casos o local se torna excelente condição para crescimento secundário de fungos (geralmente Candida), o que fica difícil diferenciar de tinha pedis-interdigital;
190 ( Medicina laboratorial para o clínico
Tinha faciale
É pouco comum. Ao exame físico aparece uma erupção eritematosa na face, em geral ligeiramente assimétrica. Pode não ter a morfologia anular. mas normalmente
tem as bordas bem delimitadas e serpiginosa. Pode haver púsrulas que dificukam o diagnóstico clínico. Diagnóstico diferencial
• dermatite seborréica: lesões simécricas e não são bem delimitadas; • forodermatite: é simétrica e respeita as regiões protegidas pelo sol; • lúpus eritematoso: fazer raspado para descartar fungos.
Tinha unguium - Onicomicose
A invasão da unha causada por dermatófiros é denominada tinha ungwum em fungos não dermatófitos de onicomicose. Porém, de modo geral. onicomicose se refere a qualquer infecção da un ha. Geralmente, as infecções fúngicas da unha são secundárias à tinha dos pés. Pode ser clinicamente classificada como: • superficial: denominada também de 1nvasão branca superficial ou leuconíquia uicofítica. por formar ilhotas brancas por cima da unha. • subungueal: • distal-lateral; • proximal. Quando wda unha está atingida. não se pode prever onde começou a infecção e denomina-se "onicomicose distrófica total". Tem-se como exemplo a invasão pelo Scytalld1um e a Cand1da. A onicomicose proximal é mais rara e atinge planos mais profundos da unha. Os dermatófiros podem causar todos os quatro tipos de invasão. O T mentagrophytes é o principal causador de onicomicose branca superficial. por invasão di reta em cima da unha através de enzimas cerarolíricas do órgão perfurante. Na tinha ungwum ocorrem h1perceratose. descolamento do leito ungueal (onicólise). onicomadese. A utilização da queratina pelos dermacófitos está clara, mas por outros fungos hialinos ainda existem controversas. As espécies de Fusarium e de Acremomum produzem invasão branca superficial clinicamente semelhante aos dermatófitos. já as outras espécies de fungo produzem quase sempre invasão subungueal distal-lateral.
Investigação labo ratorial das micoses superfi ciais e p rofu ndas
Para estudar a ação dos fungos na unha, o prof. Richardson, da Universidade de Glasgow do Reino Unido, desenvolveu um modelo de 1nvasão da unha in vitro por dermatófito, não-dermatófito e por leveduras. Ele inoculou uma suspensão desses fungos na parte ventral de fragmentos de un ha humana, que era incubada a 28°( em placa de Petn esterilizadas. Por meio de microscopia eleuônica. pôde-se observar que o T mentagrophytes degrada completamente a lâm ina ungueal. que a C albicans era capaz de se multiplicar-se por brotamencos. mas era incapaz de invadir a lâmina ungueal. O Fusarium formava canais através da matriz ungueal. que permitia sua penetração na lâm ina ungueal. Asperglilus vers1color só conseguia chegar até a camada intermediária da unha. Os fungos Acremonium sp. e Scopulariopsis brevicaulis não conseguiram invadir a unha nesse modelo. Chegou-se também à conclusão de que variações individuais de unha pod1am modular a patogenicidade do fungo adendo. Existe consenso mundial que nas onicomicoses ela mão predominam as espécies de Candida e dos pés os dermatófiros. Normalmente, a infecção da tinha ungwum começa na queratina do hiponíquio e cai"T'inha para o leito ungueal e daí para a placa ungueal. A unha é sempre invadida secundariamente a uma dermatofirose palmar ou plantar. Somente em crianças ocorre tinha ungwum sem infecção da pele adjacente. O T rubrum é comum na tin ha subungueal distal e proximal das mãos. O T mentagrophytes tem mais poder de invasão das unhas que o T rubrum, talvez por sua maior atividade enzimática. Melanoniquias causadas por fungos são ra ras e podem ser confundidas com melanon iquia longitudinal causada por lesões melanocisticas, porém. o T rubrum. e mais ra ramente o ScytalidJUm dim1diatum. podem produzir também pigmenco preto difusível nas unhas. Os fungos capazes de produzir melanoniquia são (modificado por Perrin e Baran): • Acrothecium mgrum; • Alternaria sp ; • Cand1da sp; • Chaetomium kunze; • Fusanum oxysporum; • 1-/omodendrum e/atum;
19 1
• • • • •
Phyllostictina sydow; Scytalidium dimidiatum; Trichophyton soudanense; T rubrum; Wangiel/a dermatitidis.
Os princi pais fungos envolvidos nos casos de onicomicose (não-dermatófiros) são: • Scopulariopsis brevicaulis: é o único caso em que se encontram con ídios no exame direw, por se encontrarem dentro da placa ungueal, o que faz com que a unha adqui ra cor de canela. O S. brevicaulis é encontrado normalmente no solo, o que provoca onicomicose em un has dos pés de trabalhadores que não usam sapaws; • Scyta/idium dimidiatum confunde-se clinicamente com a infecção por T rubrum, porém causa comurnente paroníquia e onicólise intensa que, às vezes, podem causar rachadura transversal com perda da lârn1na discai. Qualquer ourro fungo hialino ou demáceo pode causar onicornicose: Aspergillus (principal mente as espécies terreus e versicolor), Fusarium, Acremonium, Penicillium, Pyrenochaeta ungwum hominis. Para se provar que o achado desses fungos rem relação com a infecção ungueal e não se rrata de colonização, é preciso isolá-lo repetidamente em cul wra e rer um exame direm positivo. O resultado da biópsia também é importante, pois, geralmente, quando esses agentes colonizadores passam a causar infecção, é sinal de que as barreiras imunológicas estão alteradas ou alguma oucra doença está envolvida. O diagnóstico das enfermidades da unha às vezes pode ser rnuiw difícil, uma vez que urna mesma enfermidade pode ap resentar quadros clínicos variados, assim corno uma malformação pode simular várias doenças. A un ha pode ser afetada por várias doenças ou alterações fisiológicas, como: enfermidades cutâneas e sistêmicas, rumores, infecções, problemas heredi tários, fatores físicos e aré drogas.
Diagnóstico diferencial ocorre hi perqueratinização da matriz (engrossamento). Geralmente, cursa
• psoríase ungueal:
192 ( Medicina laboratorial para o clínico ]1---
assimornaticarnente e ocorre em paciente com pso ríase (10 a 50%). A psoríase afeta mais as unhas das mãos que as dos pés, ao contrário das on icorn icoses. Podem estar com prometida todas ou algumas unhas. A o nicornicose geralmente acomete uma única unha. As lesões mais caraccerísticas são pequenas fossetas múltiplas pumiforrnes na rnarriz ungueal, produzidas pela lesão psoriásica. No leito ungueal aparece urna mancha pardacema semelhante à mancha de azeire; • paroníquia: infecção da prega ungueal. A paroníquia aguda geralmente é pelo Staphylococcus aureus e a crónica geralmente pela Ca ndida a/bicans. A Candida do complexo psilosis é capaz de utilizar a queratina como fonte de azow, podendo ser encontrada freqüentemente parasitando pele e un has, assumindo papel patogênico. Na candidose ungueal, a unha não se torna quebradiça e não se observa massa ceratótica. A onicomicose proximal pode aparecer secundaria mente à paroníquia por qualquer fungo, mas comumente é a Candida que faz esse caminho. Raramente a Candida provoca onicomicose superficial branca. Na paroníquia, as dobras periu ngueais ficam com edema e erirematosas. com dor à pressão, podendo ou não sair pus (contaminação por bacrérias); • traumati smo e envelhecimento ungueal.
Tinha capitis
Como normalmente uma infecção do couro cabeludo se dissemina para os cabelos, a tin ha capitis ocorre junto com a tinha do pêlo do couro cabeludo e o termo tinha capitis é utilizado muitas vezes para designar este acometimento. Os dermatófiws mais prevalemes são: M. canis, M. gypseum e Trichophyton tonsurans. Ao exame físico a tinha capitis pode apresentar-se de rrês formas: • dermari te tipo seborréico; • tin ha dos "pomos negros": tinha do pêlo endotrix; • infecção grave com placas duras (querion), com linfoadenopatia, pústulas e crostas cicatriciais.
----------------------------
Diagnóstico diferencial • alopecia areata (pelada): é idiopática, sem cicatri-
zação. Na periferia, os pêlos estão fraturados. com redução de pigmento e afinamento do talo. São chamados de pêlos "dignos de admiração". Aco-
mere o couro cabeludo em várias placas; • dermatite seborréica (eczema seborréico): carac-
teriza-se por lesões eritematosas e descamativas, sendo as escamas tipicamente gordurosas e amareladas. Sua aparição é concomitante ao acúmulo de atividade das glândulas sebáceas, com grau variável de prurido; • tricotilomania: é uma alopecia traumática autoinduzida. Ocorre o arrancamento ou fricção compulsiva dos pêlos, por transtorno da personalidade.
Tinha dos pêlos o u tinea tonsurante
Corresponde, por tradição, à "tinha propriamente dita". É a tinha responsável pela queda ou tonsura dos cabelos do couro cabeludo. No adulto, pode se estender ao pescoço e face. A invasão do pêlo começa no hostium folicular. A hifa fúngica abandona o estratO córneo e progride descendentemente dentro do espaço virtual. formado entre a bainha externa e a interna do pêlo em direção ao bulbo, retirando os seus nutrientes do canal folicu lar. Existem três tipos de tinhas do cabelo: tinha favosa, tinhas ronsurantes microspórica e tricofítica. A tinha favosa ou alopeciame ou crostosa é causada pelo T. schoenleinii e hoje é rara. Ela tem caráter intrafamiliar, progride pela idade adulta e geralmente ocorre por falta de higiene. Por ser uma infecção crônica, ao chegar à 1dade adulta aparecem lesões exofíticas com crostas que se agrupam conhecidas por javus (semelhante ao favo de mel), de aspecto cerebriforme e odor característico de "urina de rato". Produz sinal característico designado por godet, que é devido à aglomeração de micélios fúngicos em volta do orifício folicular, e tem o aspecw do "pires da xícara". Na tinha favosa, o bulbo é atingido e o cabelo não cresce mais, dando uma alopecia definitiva. Na tinha fávica, a hifa do fungo não se fragmenta, provocando parasitismo filamentoso endotrix, que é exclusivo do favo. Quando as hifas envelhecem, dão origem a cor-
Investigação laboraro rial das micoses superficiais e profundas
pos graxas que aparecem no exame a fresco como "túneis", gotículas de gordura e bolhas de ar dentro do pêlo. Ourros de rmatófitos podem também produzir no couro cabeludo lesões semelhantes às causadas pelo T. schoenleinii, como, por exemplo, o T. Vlofaceum, T verrucosum, M. gypseum, porém esses fungos não invadem o bulbo. As tinhas microspóricas (causadas por fungos do gênero Microsporum) e as tricofíticas (Trichophyton) são as que têm a designação de "tinhas tonsurantes". Variante da tinha tonsurante, o kerion cels1 é constituído por uma lesão de tinha capitis que apresenta intensa reação inflamatória, com múltiplos abscessos que drenam secreção purulenta. Pode provocar alopecia definitiva. Geralmente, tem como agente etiológico um fungo geo ou zoofílico. As tinhas ronsurantes tricofiticas geralmente dão alopecias com placas irregulares, pequenas (da largura do dedo mindinho), dispersas, com formação de crostas gordurosas e múltiplas. Já a tinha microspórica tem área de alopecia mais intensa, mais definida e mais regular, com tendência ao acantoamento e geralmente placas únicas. Sua superfície é geralmente descamativa não-inflamatória (exceção M. canis) e tem evolução mais rápida que a tricofitica. Às vezes pode aparecer a "placa mãe", com mais duas ou três lesões, raramente mais de quatro. Aqui cabe o auforismo: "pequenos esporos, grandes placas". Na tinha microspórica (ectotrix), o pêlo aparece ronsurado a 2 mm acima da implantação e tem descamação do couro cabeludo. Vão, portamo, aparecer "toquinhos" de cabelo, podendo ser apanhados com os dedos e arrancados aos tufos. A tinha tricofítica (endotrix) produz o parasitismo denominado de "pomos negros", porque cortam os cabelos na superfície, deixando as pontas dos cabelos quebradas por debaixo do couro cabeludo, por isso os pêlos parasitados não podem ser apanhados da placa de alopecia com uso de pinça e sim pelo escalpelo, para retirar as raízes dos folículos, por raspagem. Muito raramente podem causar alopecia permanente. A tinha microspórica só aparece em crianças, porque a partir dos 13 anos ela é impedida pela ação fungicida de cercos ácidos graxas de cadeia longa produzidos pelos hormônios gonadais. As causas mais comuns de queda de cabelos depois da puberdade é um foco inflamatório no dente, sinusite, sífilis, etc.
193
Os hormônios gonadais, mais especificamente os andrógenos, controlam não só as glândulas sebáceas, mas também a unidade piosebácea. O tamanho e a atividade secretora das glândulas sebáceas no recém-nasCidos estão aumentados devido à influência dos hormônios maternos, porém com poucos meses red uzem de Eamanho. Depois, voltam a hipertrofiar-se na pré-adolescência. por ação de andrógenos supra-renais, e alcançam seu tamanho definitivo na puberdade por ação de andrógenos gonadais. Não confundir tinha tonsurante com a "pelada" (alopecia areata), que não é micótica nem contagiosa e ataca os indivíduos em todas as idades. Nesta o couro cabeludo é nu e lim po, sem cabelos e sem alteração da epiderme. Na tinha microspórica, há escamas que permitem reconhecerem-se as placas à distância. Tocando com os dedos, há a sensação dos pêlos de uma escova, pela presença de pêlos partidos. Geralmente, até os seis anos predomina o M. cams. A tinha microspórica cura-se até 14 anos e a tricofitica prolonga-se um pouco mais, até os 17 anos. O parasitismo da tinha microspórica é ectotrix (fora do pêlo). As hifas imrafoliculares, ao atingirem a zona ceratogênea do pêlo, emergem para a superfície da haste pilosa. fragmentando-se em aruoconídios que envolvem o pêlo formando uma "bainha de conídios", parecendo "areia fina". Os cabelos, quando examinados sobre fundo escuro, mostram uma capa branca acinzentada na posição inferior, até 03-04 mm acima do couro cabeludo. Este aspecto, quando imenso, pode ser visto na própria cabeça. daí ser a placa microspórica esbranquiçada. Portamo, o tipo de placa e de tonsura permite o diagnóstico de tinha microspórica. Na tin ha tricofítica, o parasitismo é endotrix (dentro do pêlo). As hifas imrafoliculares não emergem na superfície. fragmentando-se em aruoconídios dentro do pêlo. Sabouraud descreveu como "sacos cheios de nozes". Aparecem no cabelo "filamentos", ou seja, rosários paralelos de esporos grandes, enchendo todo o interior do cabelo, sem passar para a cutícula. Os esporos com cadeia de células quadrangulares, em bora maiores que a microspórica, são idênticos na forma e no volume e ordinariamente contíguos. O pêlo é sempre invadido igualmente, tanto na forma endotrix como na ectouix, só que na ecrorrix o fungo torna a sair e na endotrix não. Nas duas formas, as hifas imernas se degeneram com o crescimento do cabelo. O cabelo se quebra acima da zona de esporulação primária
e por isso os filamentos são dificilmente vistos e aparecem só os conídios ao exame microscópico. O M. canis produz parasitismo do tipo ectotrix corta ndo o cabelo a 2 mm do couro cabeludo, dando fluorescência verde claro brilhante quando irradiadas com lâmpada de Wood. A fluorescência é devida ao metabolismo do fungo. Ocorre produção de "pter1dina" que fluoresce, e não o fungo em si. A tinha cricofícica, por ser endotrix, não fluoresce e geralmente dá reação inflamatória, as placas de ronsura são encobertas por escamas esbranq uiçados aderentes que, quando retiradas, aparece o eritema; e é de evolução longa, podendo a inflamação. em certos casos, evoluir para o kerion ce/si. O T rubrum é antropofílico e raro no cabelo, atacando mais o couro cabeludo.
IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DOS DERMATÓFITOS
Para identificar os dermacófitos, usa-se a pesquisa direta em KOH e cultura.
Pesquisa direta
O exame direta é feito entre lâmina e lamínu la com KO H a 20%. A potassa cem por final idade a desagregação das células e a dissociação da queratina, funcionando como clarificador. A parede celular dos fungos resiste à potassa. cujo tem po de ação varia com a natureza do material. Nos cabelos deve-se deixar mais ou menos 10 minutos; em escamas de pele e em raspados subungueais, em torno de 15 minutos até várias horas ou de um dia para o outro, em câmara úmida, no caso de fragmento de unha (Figura 19.3). Na tinha fávica, na qual se observam bolhas de ar com túneis ocupando os espaços vazios deixados pelos micélios desa parecidos (são vestígios do fungo), não se deve deixar a potassa agindo muito tempo para depois examinar, mesmo porque os fragmentas dificultam a observação. Deve-se olhar quase de imediato. No exame direto deve-se ter cuidado para não confu ndir hifas com artefatos, principalmente os formados pelo cimento intercelular da epiderme quando dão cristais de colesterol.
194 [ Med icina laboratorial pa ra o c línico )1-- -- - - -- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -- -
Para se examinar entre lâmina e lamín ula a micromorfologia do crescimenco miceliano, usa-se o lactofenol azul de algodão, que tem a propriedade de corar a hifa. O ácido lático preserva as estruturas que são mortas pelo fenol e coradas pelo azul de algodão, podendo-
Fr ura 1~ 3 A Escamas dérmrcas de unha clarificadas com KOH 20%. Hifas sepcadas e arcoconídros (400X).
b Escamas dérmrcas de unha clanficadas com KOH 20%. I frfas sepradas e arroconídros (400X). Ve1 póg111a 195 Cultura
Os dermácofitos são identificados pelas características macro e microscópicas das colônias. O meio de cultura padrão para crescimento desses fungos é o ágar Sabouraud dexrrose, que possui o pH ácido (5,6) e alto teor de glicose (4%). Estes dois fatores, pH baixo e alta tensão superficial devido à concentração da glicose, impedem o crescimento de bactérias. Atualmeme, o cultivo é feito em Sabouraud modificado por Emmons. no
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
qual o pH é neutro (6,9) e a glicose está em menor concentração (2%). Este meio é mais favorável ao desenvolvimento de certos fu ngos, embora tenha menos ação inibidora sobre as bactérias. Para corrigir este problema, Emmons acrescentou cloranfen icol ao meio. Para evitar contaminação por fungos saprófitos, usa-se para cultura de dermatóficos o meio de Sabouraud acresCido de cicloheximida (actidione) a 400 mg/dl, além de cloranfen icol a 50 mg/dl e glicose a 1% e pH neutro. Esse meio pode ser encontrado já pronto, pelo nome comercial de Micosel® ou Micobiotic@ Existe também o mero de DTM (dermatophytes test medium) que, em síntese. é o micosel acrescido do ind rcador vermelho de feno l. O dermatófito, ao crescer, alcaliniza o meio, virando o indicador para vermelho. O DTM possui pepcona, ága r, glicose, antibióticos e indicador de pH, porém os antibióticos são gentamicina e tetraciclina. É importante que o DTM seja lido até uma semana ou após ser observado o primeiro crescimento, porque muitos "não-dermatófitos" podem eventualmente crescer e produzir a cor vermelha. O DTM serve, portamo, de rriagem e não de meio de identificação dos der matófitos. Deve-se sempre lançar mão das características microscópicas da colônia. já que alguns fungos saprófi tas podem crescer e produzir viragem do indicador no DTM numa incubação mais pro longada (Aspergillus, Alternaria, Acremonium, Fusarium, Scopulariopsis, VertiCJIIium, T terrestre, T fische ri e alguns Chrysosporium). Como esta medida é feita de praxe na identificação do dermatófico, não se trata de um rrabalho a mais. Dispõem-se de poucas provas bioquímicas para identificação dos dermatófitos, porém a marona das espécies dispensa seu uso. Ao examinar uma placa de cultura, deve-se procurar colônias brancas algodonosas e pigmentação. Ainda se pode usar: penetração em cabelo, o ágar vitaminado para Trichophyton e o cultivo em lâmina.
MICOSES SUBCUTÂNEAS E PROFUNDAS MICETOMA Apesar do termo micetoma ter sido criado por Vandyke Carter em 1860 significando "tumor causado por fungo", ele tam bém pode ser provocado por bactérias
195
filamenrosas (acrinomicecos). Quando causado por fungos (eumicecos) hialínos ou demáceos. provoca o micecoma verdade1ro ou eumicecoma. Quando o agente é uma bactéria aeróbica do grupo dos actinomiceros (Nocardia, Streptomyces. Actinomadura), recebe o nome
de aninom1ceroma. Tanro as bacrérias como os fungos causadores de micetama são organismos que vivem no solo e nos vegetais. Infecção bacteriana endógena causada por uma bactéria anaeróbia do gênero Actinomyces (actinobacteriose anaeróbia), saprófita da cavidade oral em humanos (A tsrae/11) e do gado (A bovis), recebe o nome inapropriado de actinomicose devido à sua semelhança com os fungos. Ela produz grão e pode ocasionalmente fisrulizar semelhantemente aos micetomas. A borriomicose é clinicamente muito semelhante ao micetoma, só podendo se diferenciar por exames laboratoriais, que esclarecem o ripo de agente microbiológico envolvido. A borriomicose é causada prinCipalmente pelo Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Ocorre mais comumente no animal após a castração e mais raramente no homem. Winslow classificou os micetomas e a borriomicose como "infecções granulares", por serem produtoras de grãos.
PATOGENIA
Geralmente, o fungo é implantado por traumatismo
e não é transmitido 1nter-humanos. É quase constante a formação da tríade: rumefação (nódulos). fístula com drenagem seropur ulenra ou serossanguinolenta e presença de grãos. que são microcolônias do agente infeccioso e podem ser pigmentados.
ClÍNICA
É uma doença crónica, subcutânea, podendo atingir os ossos. O eumiceroma é mais podal e unilateral, ocorrendo em 80% dos casos nos pés; já o actinomicewma pode atingir qualquer localização do corpo, sendo o tórax o mais comum. A radiografia pode revelar sinais de osreomielire. sendo que o acrinomiceroma atinge mais os ossos com lesões destrutivas (osteólise) e o eumiceroma faz apenas uma invasão focal. As lesões em ambos os casos podem se estender aos músculos, articulações e tendões. As lesões sofrem, com a evolução do processo. uma rumefação deformante e endurecem. Normalmente, o processo bacteriano (actlnomicetoma) é mais inflamatório e supurativo, com secreção mais abundante que o processo micórico (eumicetoma), que produz mais fibrose e menos secreção serossanguinolenta.
EPIDEMIOLOGIA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O eum1ceroma ocorre em pacientes que v1vem na zona tropical e temperada, onde o cl ima é quente, com índices altos de pluviosidade ou quente e seco tipo desértico. O acrinomicetoma, entretanto, é cosmopolita. No eumiceroma, vános fungos estão envolvidos. respeitando-se a incidência fúngica regional. No Brasil. o actinomicetoma é predominante, sendo raro o eumicecoma. Raramente ocorre micetoma em crianças e idosos, sendo mais comum na faixa de 20 aos 50 anos e principalmente em homens (cinco homens para uma mulher). Os principais agemes causadores de eumicetomas são: Madurei/a micetomatis, Madurei/a gnsea. Acremomum spp., Scedosponum apiospermum. entre outros.
196 [ Medicina laborarorial para o clínico
É muito difícil diferenciar clinicamente eumiceroma, accinomiceroma e a bocriomicose. só sendo possível pelos exames laboratoriais. Material usado é a secreção drenada da fiscula e a biópsia do nódulo. O exame anaromoparológico (hematoxilina e eosina - HE) dos eumiceromas revela presença de hifas fúngicas rodeadas pelo fenômeno de SplendoreHoeppil e também de grãos. A coloração de Gram cora os grãos de accinomicecos com suas estruturas fi lamentosas. No exame direto, pode-se pesquisar canto a existência de hifas como de grãos. que podem variar de coloração branca. rosa-amarelada, vermelha. preto-amarronzado. Como regra geral. os fungos pretos produzem grãos pretos e os fungos brancos grãos brancos; já as bactérias
podem produzir grãos brancos. amarelos e vermelhos. A idencificação do ageme é feita por meio da cultura.
TRATAMENTO
No caso dos eumicetomas, o tratamento geralmente é insatisfatório. respondendo muiro mal aos antifúngicos. Os corticóides associados promovem sensível melhora clínica. Os actinomicetomas respondem bem à terapia com sulfa. A associação sulfameroxazol-uimetropim com amicacina tem obtido ótimos resultados. A ressecção de tecidos é de grande auxilio, com resultados compensadores. Não raro a amputação se faz necessária.
ZIGOMICOSE Os fungos asseptados (cenocíticos) de interesse clínico pertencem a duas ordens: • mucorales: causadores de mucormicose; • ento moftorales: causadores de entomofroromicose. Na clínica médica, a entomofroromicose é mais rara, sendo a mucormicose a entidade clínica mais comum e usada como sinónimo das doenças causadas pelos mucorales. Em 1976, Ajello et ai. sugeriram a mudança do termo mucormicose para zigomicose. Os mucorales são patógenos respiratórios e disseminam-se; os entomoftorales são causadores de infecção subcutânea e raramente se disseminam. Os fungos pertencentes à ordem mucorales se encontram na pele, nas mucosas do homem e no meio ambiente, causando decomposição de matéria orgânica. Já os da classe emomoftorales encontram-se relacionados com matéria orgânica em decomposição ou em fezes de répteis.
ENTOMOFTOROMICOSE
A parogenia dessa doença não está bem esclarecida quanto ao modo de infecção e parogenicidade do fungo. O fungo habita insetos coprófagos. utilizando-os apenas
Investigação laboratorial da s micoses superficiais e profundas
como veículo, não se multiplicando neles. Existem também em fezes de batráquios, camaleão e largatos. Os agentes etiológicos são relativos às formas clínicas: • forma subcutânea: Basidiobolus ranarum; • forma cemrofacial: Conidiobolus coronata; • forma visceral: ConidJobolus inconcruns.
CLÍNICA
Geralmente, acomete pacientes imunocompetentes. A forma subcutânea é comum em crianças e rara em adulros, sendo o sexo masculino mais acometido. Causam um cumor mixemaroso que se inicia com nódulos subcutâneos bem aderidos a planos profundos, levando à deformação qualquer parte do corpo. Os nódulos são quentes e dolorosos, mas raramente causam febre e adenopatias. A forma centrofacial ou rinoficomicose começa por inalação do esporo fúngico ou por implantação direta na mucosa por traumatismo. Forma uma massa indolor de tecido nasal, que pode se desenvolver e desfigurar toda a face. Não atinge criança, sendo quase exclusiva de adulto. Podem ocorrer rinite e epistaxe e se propagar ao palato e seios faciais. O tratamento é com azólicos, principalmente cetoconazol, sulfametoxazoltrimetropin e iodeto de potássio, podendo haver cura espontânea. Quando se têm lesões isoladas. pode-se fazer a exérese cirúrgica. A forma visceral acomete tanto crianças como adultos. Produz náusea, vômiros. dor abdominal e diarréia mucossanguinolenta. porém é uma doença rara.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O exame anaromoparológico apresenta caracteristicamente hifas cenocíticas (asseptadas) geralmente circundadas por colar eosinofílico (fenômeno de SplendoreHoeppli). O exame histológico deve ser sempre seguido pelo exame micológico para afastar possível dúvida de contaminação ambiental. Na cultura, o Basidiobolus exibe balisrosporos, que são ejetados violentamente e possuem esporangiosporos globosos. Os de Coniobolus também são ejetados, porém têm conídios grandes com papilas basais arredondadas.
197
ZIGOMICOSE · MUCORMICOSE
queimaduras e contaminação de ceraroses oclusivas. Produzem nódulos necróticos, úlceras preras ou placa s
Causada p or fungos da ordem mucorales, cem
com bordas vermelhas.
Rh1zopus arrhizus, que
A forma ri nocerebral é a que mais ocorre e também
ocorre em 60% de rodos os casos. São fungos opor-
é a m a1s dramática das infecções fúngiCas. sendo geral-
como pnncipal espécie o
tunistas cujos gêneros principaissão: Rhizopus. Mucor
mente facal. O principal ageme é o
e Absidia. Acomete p acienres com queda imunoló-
casos. A lesão se in1cia na cavidade nasal. seguida da inva-
R. oryzae em 90% dos
gica e rem como fawres pred isponentes a gravidez.
são retro-orbirária, chegando ao cérebro com produção
uremia. desnutrição. rransplanres. leucemias. AIDS.
de um exudaro negro. O corre em casos de cetoacidose
diabetes meliro complicada, uso de corcicóides e que-
diabética ou mais raramente em doenças crônicas com
lances do ferro, em que o fungo utiliza o ferro ligado
acidose mecabólica.
a ele ou qualquer outro faror que leve a um quadro
Os princ1pais agentes na forma sistêmica são: R. microsporus, Rh1zomucor pusslius, R. oryzae e Saksenae vesljorm1s. A penetração do fungo é principalmenre
neurrop ên ico. São as infecções fúngicas de evolução mais fulm1nanre entre wdas.
pela 1nalação,
porém
pode ocorrer
ingestão
ou
penetração direra na pele. Ocorre em pacienres com EPIDEMIOLOGIA
granulocitopenia. Afeta pulmão. aparelho digestivo e outros órgãos. No pulmão causa hemoptise e pode levar
Os mucorales são fungos que vivem em estado sa-
à morre por ruprura de uma ve1a ma1or. Normalmente,
profítico no organismo humano. no meio ambiente, no
é necessária a biópsia pulmonar. A infecção secundána
ar. no solo, nos alimentos e materiais orgânicos.
cerebral é d1ferenre da forma rinocerebral. pois aparecem m últ iplos focos no coração
e geralmenre o paciente
morre de infarto. PATOGENIA
Os mucorales produzem esporos que causam infec-
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
ção respiratória. Devido à incompetência ou diminuição dos neutrófilos. ocorre Significativa mulnplicação das
Geralmenre. usam-se a pesquisa h1sroparológica
eo
hifas onundas dos esporos. causando uma invasão de
exame micológico do exsudado ou da bióps1a. A colera
grand e propensão dos vasos sanguíneos. com conse-
do material deve ser realizada na borda da lesão.
qüente trombose. isquem ia. infarto e hem orragia devida
O exame direro aJuda a descartar uma possível sus-
à t rombociropenia. Geralmente, produzem um exudato
peita de contaminação, na qual o fungo aparece com
negro e lesões necróticas com grande resistência aos an-
hifas grossas, assepradas, geralmenre em ângulos próxi-
tifúngicos e alta mortalidade.
mo de 90°. Porém. no caso do escarro, o exame d1 reto e a cultura são geralmente negativos e deve-se fazer a lavagem broncoalveolar. Em pacientes com mfilrrado
CLÍNICA
pulmonar e febre com lavado brônquico positivo. não se deve pensar em conraminação e, se for negatiVO, deve-se
Três formas clínicas podem ser observadas: • cutânea;
fazer uma pesquisa mais invasiva. No exame histológico corado com hematoxilina-eo-
• rinocerebral;
sina aparece o fenômeno de
• sistêmica ou visceral.
os melhores resultados se con segue com colorações ar-
Splendore-Hoeppli. Porém,
gênricas que coram a parede do fungo. A forma cutânea como infecção primária é rara. Ge-
A culrura pode ser feira no Sabouraud. sem ciclohexi-
ralmente, ocorre por traumat ismo, contaminação cirúr-
m ida. A temperarura ótima é 3o·c. com crescimento em
gica. contaminação de ulcerações, picadas de insetos,
torno de quatro dias. Não mascerar o material para não
198 ( Medicina laboraroria l para o clínico
romper as hifas que são asseptadas. podendo escoar seu moplasma e morrer. O fungo consegue crescer a 3rC. o que favorece a separação de o urros fungos pacogênicos. O R. rhizopodiformls (15% dos casos de mucormicose) cresce bem a 50°C. Outros fungos com clín1ca parecida são: Asperg1llus, Fusarium, Pseudallescheria boyd1i.
TRATAMENTO
Os azólicos são ineficazes na mucormicose. Usa-se a anfotericina-8 junco com a correção da doença de base e exérese drástica. O rratamemo com oxigênio hiperbárico pode ter ação fungistática e tem grande potencial como rratamenco adjumo.
Figura 19.4 - Phialophora verrucosa. Ver prcmcl1a cofo11da
EPIDEMIOLOGIA
É uma doença de distribuição mundial, sendo mais
CROMOBLASTOMICOSE É uma micose crônica da pele e do tecido subcutâneo causada por cinco espécies de fungos dematiáceos saprófitas do solo. São eles:
• • • • •
Fonsecaea pedroso/; Fonsecaea compacta; Phialophora verrucosa (Figura 19.4); Cladophialophora carrionii; Rhinocladiella aquaspersa.
A denominação de cromomicose foi adocada em 1935, sugerida por Moore e Almeida. O primeiro caso
descrico com as características clínicas da doença foi em 1914, em Minas Gerais, na cidade Estrela do Sul, pelo médico alemão Max Rudolph, que trabalhava numa companhia de m1neração. A doença se confunde com feohifomicose, que também é causada por fungos negros, porém. no tecido se encontram hifas de cor castanho escuro e não "corpos muriformes" característicos da cromoblascomicose. Os corpos muriformes (denominação dada em 1984 por Matsumoco et a/.) eram chamados incorretameme de "corpos fumagóides" ou corpos escleróticos. São estruturas acastanhadas em forma de moeda, com diâmetro de 5 a 12 ~m e representam a forma dimorfa da hifa no tecido parasitado, onde sofrem septação celular em mais de um plano.
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
comum nos países tropicais e subtropicais. No Brasil, 97% dos casos são causados pela espécie F. pedrosi (Amazônia, Rio Grande do Sul, São Paulo, Rio de janeiro e Minas Gerais) e, na Venezuela, Cuba e Austrália, pela C carrionii. É uma doença rural, cujo contágio ocorre por traumatismo com madeira ou vegetais. Não existe, até o momemo, relaco de comágio inter-humano.
PATOGENIA
O fungo, após inoculado na pele, propaga-se por via linfática e rarameme por via sanguínea, por conseguinte, é rara a dissem inação para outros órgãos, a não ser em casos de paciemes imunodeprimidos ou portadores de doenças graves. A partir do pomo de inoculação, vão aparecendo as lesões características da doença. A evolução é lema, produzindo fibrose tecidual e prejuízo da circulação linfática, provocando elefancíase, geralmeme nas pernas, o que pode levar a confundir com a filariose.
CLÍNICA
As lesões são mais comuns nos membros inferiores, principalmente nos pés, onde o traumatismo por espinhos e gravecos é mais comum.
199
Os achados clínicos podem ser muico diversificados, podendo ocorrer as seguintes formas clínicas: • placas: é a forma mais comum, sendo lesões planas e eritemaro-escamosas, podendo produzir secreção serossangu inolema, confundindo-se, às
gigantes. Deve-se usar a coloração de HE e ácido periódico de Schiff- PAS, pois no Grocott o fu ngo perde a característica acastanhada. A cultura e o exame histológico devem sempre nortear o processo de cura.
vezes. com as formas verrucosas da esporocricose e leishmaniose; • nodular: são nódulos violáceos, macios, lisos, escamado ou verrucoso, que vão crescendo lemamente; • tumoral: nódulos são papilomacosos ou lobulados, cobercos por crostas e escamas, dando o aspecm de couve-flor. Pode confundir com paracoccidiodomicose; • verrucoso: geralmente hiperceratótico; • cicatricial: as placas vão se curando no centro, levando a uma cicatriz arrófica ou hipemófica, que lembra a sífilis terciária. As formas queloidianas são mais raras. As diferences formas clínicas podem estar presentes ao mesmo tem po em um paciente.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico clínico pode ser confirmado pelo achado dos corpos muriformes no exame a fresco com KOH 20% ou na biópsia. onde o material é mais representativo por ser mais profundo. Na hora de colher o raspado da lesão. deve-se procurar os pomos precos. que são microhemorragias chamados de pomos de "pimenta caiana" e é onde se encontram mais corpos muriformes que são aí drenados anavés de microfíswlas (eliminação transepitelial do fungo). O cultivo micológico poderá esclarecer a etiologia da espécie fúngica envolvida. Os fungos causadores da cromomicose têm a característica de não serem inibidos pela cicloheximida usada para inibir fu ngos saprófitas nos meios de culwra, diferentemente dos fungos causadores de feohifomicose. Para classificar a espécie de demateáceo, é sempre necessário fazer o microcultivo para escudo micromorfologico, devido à grande semelhança macromorfológica enrre eles. O exame hisrológico mostra reação granulomatosa e presença de corpos muriformes no interior de células
200 ( Medicina laboratorial para o clínico
TRATAMENTO
O tratamento é difícil e prolongado, com possibilidade de recorrência. Normalmente, faz-se assocração de amifúngicos. HoJe o itraconazol passou a ser o amifúngico de primeira escolha. Pode-se fazer a crioterapia ou excisão cirúrgica no caso de lesões pequenas.
FEOHIFOMICOSE Feohifomicose pode ser considerada mais como uma entidade patogénica do que uma doença com características clínicas próprias e produzida por uma espéc1e de fungo definida. In icialmente. foi proposta esta denominação para englobar de maneira mais fáci l a grande quantidade de fungos negros causando a doença. Segundo Sampaio (1974), é uma doença cutânea ou subcutânea raramente sistémica, causada por vários fungos dematiáceos que se apresentam no tecido em forma de hifa septada acastanhada. células leveduriformes, pseudo-hifas. podendo ou não aparecer os corpos munformes. Ajello. também em 1974, definiu feohifomicose nesses termos e em 1983 McGinn is ampliou o conceito incluindo em feohifomicose todas as doenças causadas por fungos negros. inclusive as micoses ma1s superficiais como Piedra negra e tinha negra; as cutâneas: ceratite micótica, onicomicose, dermatomicose e tam bém as sistém icas com quadros septicêmicos. Porém. este auror sugere que denominações consagradas como, por exemplo, tinha negra e P1edra negra, sejam consideradas variedades de feohifomicose. Portanto, feohifomicose fica quase que restrita aos cistos feohifomicóticos subcutâneos. Em 1991, o subcomitê de nomenclaw ra de micoses da Sociedade Internacional de Micoses Humanas e Animais definiu como qualquer infecção humana ou animal causada por fungos dematiáceos, com exceção da cromoblasrom1cose.
EPIDEMIOLOGIA
É uma doença que ocorre em rodo o continente, com predominância nas regiões tro picais. Ocorre mais em homem do campo na idade de trabalho ativo.
mente, o microcultivo deverá ser feiro para identificação da espécie. Nos exames hisrológicos, HE e PAS são indicados, devendo-se evitar a coloração de Gomori-Grocott porque esconde a cor acastanhada da hifa.
PATOGENIA
TRATAMENTO
Tendo como foco o cisto feohifom icótico, vai ocorrer por inoculação do fungo, que é geralmente saprófita do solo, através de traumatismo com fragmentos de vegetais ou outro instrumento de trabalho qualquer.
Varia com a localização, quadro clínico e tipo de fungo envolvido. A exérese cirúrgica é usada para nódulos e abscessos, podendo curar o paciente. O cecoconazol tem sido considerado uma boa droga de escolha nesses casos. Para lesões extensas e formas sistêmicas, usa-se a anforericina B. Para uso prolongado, o itraconazol está sendo pesquisado.
CLÍNICA
Pode haver quadros agudos e crónicos, porém o cisto é geralmente crónico. Os cistos subcutâneos são geralmente únicos, unilaterais, moles, flutuantes, sem reação inflamatória, não produzem adenite e gomas, porém, podem ulcerar e drenar uma secreção purulenta contendo hifas demáceas. Não raro aparecem lesões tipo abscesso ou em placas. A evolução pode durar anos. A imunodepressão pode ser um fator predisponente. A forma sistêmica geralmente tem como porta de entrada o pulmão, sendo fígado, baço e pâncreas normalmente atingidos e a maioria dos casos ocorre em im unodeprimido. O Cladosporium batianum, fu ngo negro saprófita do solo, tem muita afinidade pelo sistema nervoso central. principalmente pelas meninges e os hemisférios cerebrais.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Pode ser feico pelo exame micológico e hiscológico. No exame direco aparecem hifas escuras com aspecco torulóide. A cultura é feita com Sabouraud simples e acrescida de cicloheximida que, apesar de ser inibidor de fungos dematiáceos, quando permite o crescimento de alguma espécie, serve como meio de identificação. O Cladosporium batianum, por ser termorresistente, pode ser criado colocando-se a cultura em 42°C. Como roda cultura de fungos demáceos se parece macroscopica-
Investigação laboratorial das micoses superficia is e profunda s
ESPOROTRICOSE Das micoses de localização subcutânea, a esporotricose é a única que possui só um agente etiológico específico: o Sporothrix schenckii. t um fungo dimórfico e na natureza se apresenta como filamento e no paciente como levedura em forma de charuto. Causa infecção subaguda ou crónica com lesões nodulares e úlceras na via linfática da pele e raramente nos órgãos internos.
EPIDEMIOLOGIA
O Sporothrix pode ser encontrado no meio ambiente em todo o mundo, sendo muito comum nas Américas, principalmente no Brasil. Foi muito comum na Europa, hoje raro. Vive saprofiticamente no solo e nas vegetações. É encontrado nas cascas das árvores, espinhos, na terra e em todo lugar que tenha decomposição de matéria orgânica. É uma doença de cunho ocupacional, ocorrendo em jardineiro, trabalhadores rurais, madeireiros, etc. Animais que se alimentam de fr utas e se agarram nas árvores para subir podem adquirir e transmitir a esporotricose quando arranham o homem ou outro animal. Aves da família dos psiracídeos (araras, papagaio, etc.) podem tam bém transmitir a doença pelas bicadas.
201
PATOGENIA
Produz na pele lesões piogênicas e granulomawsas. Após a inoculação do fungo, rem período de incubação de sere a 90 dias, numa média de crês semanas. Às vezes, dependendo do tipo de craumatismo ou da reação do organismo, pode se estender até seis meses. A exposição contínua e/ou freq üente ao agente pode produzir infecções subclínicas e o aparecimento de sensibilidade tardia.
primária, ou pelo traro gascrinrestinal por ingestão do fungo, que depois ganha a via sanguínea. A hemocultura é positiva. As lesões cutâneas são variadas e de d ifícil diagnóstico, lembrando sífilis, tuberculose cutânea ou outras doenças infecto-contagiosas. As lesões cutâneas disseminadas são assimomáticas, porém, a forma exrracutânea é geralmente fatal devido à demora no diagnóstico cl ínico.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL CLÍNICA
A espororricose pode causar crês tipos de quadros clínicos: • forma cutânea localizada; • linfangire crônica (Figura 19.5); • dissemi nada. Forma cutânea localizada: ocorre em 40% dos casos de esporocricose. Forma uma lesão cutânea única no local da inoculação, sem nódulos na via linfática. A lesão clínica é wtalmeme inusitada, podendo ter lesão pápulonodular. úlcero-vegerame e verrucosa, placas escamosas, lesão abscedada e outros tipos clínicos, confundindo-se, às vezes, com doenças de várias etiologias e levando a um diagnóstico diferencial muico difícil. Linfangite crônica: ocorre em 60% dos casos. A parcir da lesão inicial onde se forma o cancro de inoculação, vão se formando nódulos firmes seguindo o rrajeto linfático. que normalmente formam canais para drenagem da linfa e do pus e se cronificando. Haverá formação de uma cadeia de nódulos e gomas ascendentes. À medida que os nódulos ficam com a epiderme fina e cheios de pus, pode-se aspirá-lo com seringa para fazer os exames micológicos. Disseminada: é muico rara, ocorrendo em menos de 1% dos pacientes. Geralmente são imunodeprimidos ou possuem facores facilitadores do ripo: diabetes, alcoolismo, etc. Pode atingir qualquer órgão, mas geralmente é a pele a mais acometida e depois os ossos. Quando atinge a pele, é chamada de "cutânea disseminada"; e quando envolve outro órgão, é chamada de "extracurânea". A porta de entrada não está bem estabelecida, sendo mais aceita a disseminação hematogênica após a inoculação traumática, e aí não se descobre a lesão
202 [ Medicina laboratorial para o clínico
A pesquisa direta a partir da biópsia normalmente não demonstra o fungo, porém, raramente podem ser encomradas leveduras em forma de charuto ou disformes. Quanto à cultura, é de fácil recuperação do fungo e pode ser feira em raspado profundo, ou melhor, ainda do tecido biopsiado. O fungo tem esrerigmas e hifas finas semelhantes aos fios de cabelo, o que deu origem ao seu nome (trichum = pêlo). O Sporothrix cresce em torno de quatro dias e a cicloheximida não inibe seu crescimento. A colônia é aderente ao meio de cultura, com aspecto coreáceo e vai se cornando marrom e depois preta com o envelhecimento. No exame histopacológico corado com hemaroxilinaeosina aparecem os corpos asteróides que são característicos, porém não parognomônicos da esporotricose. Dos restes imunológicos, a soroaglurinação do látex é o de primeira escolha, por ser de realização fácil, rápido e muiro sensível e específico.
TRATAMEN TO
Após um século de uso, o iodeco de potássio continua sendo o mais usado para as formas cutâneas localizada e de linfangire. Em caso de esporotricose disseminada (cutânea ou outro orgão), usa-se o itraconazol ou a anfotericina B.
PARACO CCIDIODOMICOSE A paracoccidiodomicose (antiga blasromicose sulamericana) é causada pela inalação de propágulos infectantes do solo.
]1--- - - - - - - - - - - -- - - - -- - - -- - - - -- - - -
O fungo. ao ser descoberw pelo médico Adolpho Lutz, em São Paulo, foi confundido com Coccidioides immitis e a moléstia recebeu o nome de "micose pseudococcidioica", sem classificar o fungo. Em 1930, o m édico Floriano de Al-
Paracoccidioides brasil1ensis. Éum fungo dimórfico, sendo inalado na forma de micromeida criou a denominação:
conídios (formadas na fase miceliana) e converte-se em leveduras no pulmão com formação de granuloma. Caso o organismo não consiga desrruí-la, pode haver disseminação, via linfáCica ou hematogênica ou por continuidade, das leveduras carregadas pelos macrófagos, causando lesões polimórficas, em qualquer orgão.
PATOGENIA
Os microconíd ios, ao se converterem em leveduras, provocam pneumonite devido
à tentativa de eli-
minar o fungo auavés da ação dos macrófagos e do sistema imunitário celular. Esta resposta do organismo vai levar à formação de granuloma ou a uma resposta fagocitária piogênica. Na parede celular do fungo encontra-se a a - 1- 3
à virulência. Possui tam bém antígenos com uns ao Blastomyces dermat1t1s e Lacazia /obo1. glucana, que é relacionada
A ação inibitória do 13-estradiol (hormômo escrogênico) impede a conversão do conídio em levedu ra, fazendo com q ue essa m icose se torne rara em mulheres. A doença pode se disseminar e atingir a pele, mucosas, linfonodos. pulmões. adrenais e sistema nervoso.
EPIDEMIOLOGIA
O
P. brasiliensis é um fungo rural. que vive no solo
de regiões quentes e com alcos índices pluviomécricos
(1.000 a 4.000 mm por ano). É endêmico no Brasil (60% dos casos mundiais), Venezuela e Colômbia. No Brasil ocorre mais nas regiões de cultivo de café, sendo raro no N ordeste. Apesar de ocorrer em a coda A mérica Latina, é raro nas Antilhas e no Chile. Os tatus servem como reservatórios naturais se inFigura 19.5- Esporotricose linfocutânea. Ver prancha color1da
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
feccionando ao escavarem o solo.
203
Os casos disseminados da doença são mais raros e normalmente ocorrem nos adolescentes e imunodeprimidos. Não é muito comum em pacientes com AIOS, por ser uma doença de origem mais urbana, porém, quando ocorre, é de progressão rápida e com aparecimento de lesões cutâneas.
CLÍNICA
Raramente a infecção primária é diagnosticada devido à ausência de manifestação clínica. Normalmente não evolui para doença, sendo autolimitada, porém pode permanece em latência em um nódulo por tempo variável. Quando surgem os primeiros sinais clínicos, iniciando-se a fase da doença, pode regredir espontaneamente, e é denominada "forma regressiva", ou pode evoluir gradativamente. Outra maneira de surgir a doença é por reativação endógena de um foco calcificado. Atualmente, considerando-se o grande espectro de quadros clínicos, imunológicos e hitológicos da doença, tem-se usado uma classificação semelhante à da Hanseníase, em que a doença é classificada em pólos mais benignos ou malignos. Clinicamente pode-se ter as formas: • forma aguda ou subaguda de intensidade moderada ou grave; • forma crônica de intensidade moderada ou grave. Forma aguda ou juvenil ocorre em pacientes com idade inferior a 30 anos - pode ter acometimento brando ou grave. A forma aguda difere da subaguda pela evolução mais rápida (poucas semanas). A doença se inicia com escarro purulento, dispnéia e adenopatia cervical típica, que pode fistulizar com a evolução da enfermidade (fato que ocorre também na tuberculose escrofulácea). Geralmente, o comprometimento dos linfonodos mediastinais ocorre primeiro que os cervicais. Porém, a radiografia e clínica pulmonar são normais. Nesta fase, o paciente tem acentuada depressão da imunidade celular, com grande domínio do fungo, dando lesões nodulares nos lifonodos, orofaringe, intestino, pele e fígado (adenomegalia generalizada), seguidos por necroses e supurações. Pode ser encontrado quadro clínico característico da síndrome de Addison: astenia, hipotensão e pigmentação, quando atinge a supra-renal.
204 (
A forma subaguda parece com a tuberculose, doença com a qual não raro coexiste. A forma crônica ou adulta que acomete indivíduos acima de 25 anos é a mais comum. O paciente, tendo imunocompetência levemente diminuída, produz sinais menores de inflamação e as lesões são mais localizadas, porém, com maior número de granulomas e seqüelas fibróticas. Nessa fase, o pulmão está fortemente comprometido e sempre aparecem lesões simultâneas na boca, com erosão e pontilhado hemorrágico, aspecro denominado por Aguiar Pupo de estOmatite moriforme. Essas lesões progridem e se tornam úlceras vegetantes, o que caracteriza a fase. O paciente não tem febre e a hepatomegalia pode ser dolorosa. A radiografia do tórax apresenta infiltrado retículonodular bilateral, simétrico, basal (2/3 inferiores), com conformação de "asa de borboleta". Pequenas cavitações também podem ser observadas. Apesar da tuberculose ter padrão radiográfico parecido, nunca é basal. Mais raramente, pode ocorrer na forma adulta, paciente com maior depressão celular e comprometimento multi focal. sendo vários órgãos atingidos.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Atualmente, nos laboratórios clínicos o diagnóstico micológico (direto e cultura) e histopatológico (HE, Grocott, PAS) (Figura 19.6) são mais comuns que o sorológico, apesar do exame sorológico ser mais sensível e mais rápido. Isto se deve ao fato de ser difícil a obtenção de antígenos específicos de gp43 (protease de 43 Kda), uma vez que os antígenos puros dão muita reação cruzada. O Paracoccidioides é um fungo de fácil observação e bem caracterizado, tornando o exame direto bastante específico. É um dos maiores fungos encontrados na clínica médica (5-40 ~m), com parede de duplo contorno, contendo vesículas de lipídeos no citoplasma e formando figuras sui generis como de "anel olímpico", "Mickey mouse", "roda de leme", etc. O granuloma apresenta-se rico em células epitelióides e gigantócitos, podendo albergar o parasito. Ao lado do granuloma aparecem células que dão o aspecto supurado. Para estudos epidemiológicos e diagnóstico da fase primária da doença, usa-se a paracoccidioidina em testes de hipersensibilidade tardia. Para diagnóstico soro-
Medicina labor atorial para o clínico ]f-- - - - - - - - - -- -- - - -- - - - - - - - - - -- -
lógico e controle de cura da paracocciodioidomicose, hoje se usa mais a imunodifusão dupla e menos a reação de fixação de complemento devido à sua baixa especificidade e difícil padronização.
conseguem atingir o pulmão, onde são fagocitados pelos histiócicos, mantendo-se intracelularmente. Seu descobridor, Samuel Taylor Darling (1906), por encontrar os histiócicos parasitados apresentando um halo claro em volta da levedura, suspeiwu tratar-se de uma cápsula e lhe denominou Histoplasmo capsulatum. Hoje, a microscopia elecrônica já confirmou a inexistência de cápsula. A imagem vista por Darling sugeria ser um novo tipo de prowzoário semelhante à Leishmania, porém, em 1912, o pawlogista brasileiro Rocha Lima, na Alemanha, relawu este organismo como fungo com presença de macro e microconídio.
EPIDEMIO LOGIA
É uma doença mais urbana, cujo fu ngo fica deposi-
Figura 19.6 - Grocott (400X). Ver prancha colonda TRATAMENTO
O icraconazol em doses diárias de 100 mg por seis meses tem proporcionado sucesso em 93% dos pacientes. Quando o paciente tem persistência da queda imunológica. deve ser seguido com provas sorológicas para finalizar o tratamento. Em pacientes HIV positivo com doença muito avançada, dar anfotericina Baté a estabilização e continuar o tratamento com itraconazol. O óbito pode ocorrer em 3% dos casos.
HISTOPLASMOSE É uma micose muico importante hoje. por ser de cunho oportunístico. afetando pacientes com AIDS, cransplamados, leucêmicos ou qualquer sicuação com drogas que leve à imunossupressão (anciblásticos. altas doses de corticóides). Pode evoluir rapidamente e ser fatal e pode ser causadora de grandes surws epidemiológicos. Causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum var. capsulatum, que se apresenta como levedura à tem peratura de 37"C (parasiw humano) e como fungo m1celiano com micro e macroconídias à tem peracura ambiente. Seus microconídios. por serem muicos pequenos (2 a 4 11m), ficam suspensos no ar e, por inalação,
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
tado em ambientes ricos em nitrogénio presemes em fezes de aves, pássaros e morcegos, sendo mais comum nos galinheiros, celeiros, cavernas, sótãos. jardins abandonados e ocos de árvores. A hiscoplasmose não passa de pessoa a pessoa e se conhecem raríssimos casos de transmissão incer-humana. Comum na região dos lagos nos EUA e no Brasil, pode ser encontrada em codo o país. No Rio de Janeiro. existem áreas com alw índice de infecção, podendo ser consideradas endémicas.
PATOGENIA
Após a inalação dos microconídios presentes no solo, eles se convertem em leveduras no pulmão, causando pneumonite. O fungo. por tropismo, migra para os focos secundários, que são órgãos do sistema retículo-endotelial e nódulos linfáticos (linfonodo mediastinal) que, por via linfática, levam o fungo a outros órgãos (baço, fígado, imestino, medula óssea, supra-renal). Após 10 a 18 dias. entra em combate o sistema imunológico através da ação dos linfócicos T e, principalmente, macrófagos. Vai haver seqüencialmente: formação de granuloma, necrose caseosa. fibrose, calcificação, que vão caracterizar as lesões. Os granulomas se formam também nos linfonodos, baço, medula óssea, intestino, supra-renal e fígado. Quanto mais alw o número de conídios, mais granulomas são formados. por isso. exposição ao fungo.
205
quando em áreas endémicas, leva a quadros clínicos mais ncos. Também é maior a possibilidade de um paciente com AIOS, quando de área endêmica, ter rea tivação da doença partindo de um foco comendo fungo viável. Após a formação dos granulomas, a infecção fica do-
número mínimo de pacientes rem a evolução da doença começando na fase aguda. Esta fa se pode também ser denominada de fase aguda pulmonar primária e geralmente é aucolimitada. A sua gravidade vai depender da idade do paciente, reação do sistema imunológico e da
minada a esse nível nos paciemes híg1dos ou pode cons-
carga de inóculo.
tituir uma forma crônica restrita ao pulmão. Porém, nos imunossuprimidos, em que há queda de linfócico T, a doença pode se cornar progressiva e a disseminação incontrolada e, se não tratada, pode levar o paciente a óbico.
Os principais sintomas são semelhantes à febre influenzae (gripe): febre alta, cefaléia, arrralgia. astenia, muito raramente pa rece eritema nodoso e são de curta duração. O exame radiológico mostra áreas de pneumonite com ou sem adenopatia hilar. A maioria dos infiltrados é resolvida. porém, às vezes, eles endurecem e ficam como infecções residuais, verificandose, ao exame radiológico, a forma de "moeda" característica. A linfoadenomegalia hilar serve para diferenciar de processos bacterianos e viróticos em que ela não existe. Pode ter nódulos solitários e mú ltiplos, que sofrem necrose e calcificação após cinco anos ou mais. Quando esses nódulos não se calcificam, podem ser confundidos com carcinoma broncogênico. especialmente se o paciente é fuma me crônico. Pode ocorrer também uma forma de hiscoplasmose aguda com infiltrado mihar micronodular bilateral difuso, que ocorre normalmente quando a infecção é muito grande como em am bientes fechados e cavernas. Essa forma pode ser confundida com a tuberculose e deve ser feito o exame de BAAR para descartá-la. Os nódulos primários tendem à cura e podem se calcificar após anos e albergar formas viáveis no seu interior, causadoras de reativação da doença. Quando há excesso de depósito de cálcio nos nódulos por estímulo anrigênico normal, forma-se o hisroplasmoma. No exame di reto do escarro, podem ser v1suahzados macrófagos alveolares com histoplasmas inrracelulares. Normalmente, a hiscoplasmose aguda regride após 15 dias do aparecimento clínico da doença. podendo. às vezes. persistir por três meses. Pode também evolwr para hiscoplasmose pulmonar crônica. A hisroplasmose disseminada ou extrapulmonar ocorre por disseminação linfática do histoplasma. Va1 ocorrer disseminação numa incidência de um em 50.000 casos de infecção pulmonar. A mortalidade ocorre numa faixa de 90%. Goodwin, em 1980. segundo o curso da doença. que depende do grau de parasitismo dos macrófagos e de
CLÍNICA
Apesar de grande parte dos casos de histoplasmose primárias ser assimomática e autolimitada, dependendo da carga parasitária inoculada e das condições imunológicas do hospedeiro, eventualmente podem evoluir para quadros clínicos variados. Todo paciente após ser infectado tem disseminação hematológica do fungo, que normalmente vai ser dommada após 14 dias, pela resposta imunológica específica. de1xando pequenos granulomas calcificados como seqüela. As formas mais graves da doença são comuns em crianças com menos de dois anos e adultos com mais de 55 anos. As formas clínicas da histoplasmose podem ser classificadas, quanco ao sítio. em três tipos: • pulmonar assimomática; • pulmonar aguda; • extrapulmonar ou disseminada. As formas assimomática e aguda ocorrem em paCientes 1munocompetentes. A forma disseminada pode ocorrer em pacientes com ou sem imunossupressão. A fa se assintomática da histoplasmose começa no pulmão, por inalação de propágulos infectantes. Logo a seguir, há conversão do microconídio em leveduras e uma pneumonite é desenvolvida no local. A grande maioria dos pacientes (>95%) é assimomárica ou tem Sintomas leves que passam despercebidos. Talvez em pacientes que adquirem um inóculo pesado de microconídios possam ser notados alguns sintomas. A viragem do reste da hisroplasmina para positivo ind1ca infecção primána. A partir do 14° dia, com ação do sistema Imune, a doença normalmente está dominada. Porém. um
206 [ Medicina laboratorial para o clínico }-
disseminação da doença. descreveu rrês ripas de quadros clínicos de hiscoplasmose disseminada causados em pacientes imunocomperentes relativos à idade: • agudo; • subagudo; • cróniCo. Um quarto r1po de histoplasmose disseminada é a oporruníst1ca ou progressiva que ocorre em pacientes com dim1nu1ção da resposta imunocelular. A forma disseminada aguda é tam bém denominada de ripo infantil e ocorre mais freqüentemente em crianças com menos de dois anos de idade. Normalmente. é precedida de um quadro de hisroplasmose aguda com febre, náusea. vôm1tos e diarréia e mais tarde com rosse seca e respiração ofegame. A neutropenia pode resultar em sepse secundária e a trombociropenia pode estar associada à hemorragia (hematêmese. melena, sangramenta da mucosa oral). Ocorre heparomegalia, que nas crianças com menos de um ano vem acompanhada de ascite importante e icter"cia. Radiologicamente, assemelha-se à hisroplasmose aguda. Tem evolução rápida e fata l (duas a cinco semanas) quando não tratada. Hemoculrura e esfregaço periférico podem ser positivos. Polissacarídeos podem ser encontrados na unna (90%) e no soro (50%). O tratamento é feiro com anfotericina 8 e coberto com hidrocortisona para evitar uma crise addisoniana. A fase disseminada subaguda ou tipo juvenil areta mais pacientes adultos até 40 anos. adultos jovens e raramente crianças e adolescentes. O curso da doença dura vários meses. com Febre moderada e intermitente, perda de peso e fraqueza. Na maioria das vezes produz infecções focais. geralmente envolvendo o craro gastrintestinal. que pode ocasionalmente perfurar-se. o sistema nervoso central. supra-renal e endocárdio. A ulceração orofaríngea é comum e característica da fase. A heparomegalia está quase sempre presente e os exames laboratoriais de função hepátiCa são úteis no diagnóstico juntamente com a contagem de hemácias (pacientes com fosfatase alcalina normal não devem ser biopsiados). Hemoculturas e esfregaços sangüíneos são pOSitivos em 50% dos casos. A biópsia do fígado, em 80% das vezes. e a biópsia da úlcera orofaríngea quase sempre são positivas. Sorolog1a na urina e soro é de boa positividade.
Investigação laboratorial das mi coses superficiais e profundas
A fase disseminada crónica aringe adulros com ma1s de 40 anos. Normalmente, ocorre em pacientes com imunossupressào aparentemente normal. Esses pacientes começam a rer pequeno déficit imunológico devido às conseqüências terapêuticas ou à própria doença. com 10 a 20 anos de curso. Às vezes a ulceração orofaríngea que ocorre em cerca de 70% dos casos é a única manifestação clínica do doente. O paciente tem doença suave, com febre baixa e intermitente, perda de peso e fadiga. Pode ter lesões focais com episódios de endocardite, meningite. insuriciência adrenal. nódulos subcutâneos e lesões da pele. Heparomegalia ocorre em 50% dos casos e acometimento esplênlco e pulmonar raramente se verifica. Hemoculrura e esfregaço sanguíneo raramente são positivos e a biópsia de sítios afetados é a melhor tentativa. A pesquisa de polissacarídeo na urina e no soro geralmente é positiva. A fase disseminada progressiva ou oportunística ocorre em pacientes imunodepri midos e está associada à doença de Hodgk1n, lmfosarcoma. leucemia, lúpus eritematoso sistêmico. transplantes. psoríase (altas doses de metotrexate) e pnnc1palmente AIDS, que vem liderando o rankmg dessa doença. A infecção pode originar-se pela reativação de histoplasmas v1áve1s de nódulos calcificados ou por fome exógena. O paciente tem feb re progressiva. Embora o pulmão esteja acometido. os sintomas e sinais são mínimos. Radiologicamente, tem infi ltrado intersncial difuso e linfonodomegalia hilar. Outros órgãos podem ser atingidos com a evolução da doença. Um subgrupo pequeno de pacientes pode morrer de choque séptico devido à coagulação vascular disseminada e conseqüente falência múltipla dos órgãos. A hemoculrura, esfregaço sanguíneo e medular e sorologia são positivos. É uma forma indolente de evolução da forma pulmonar aguda é chamada hisroplasmose crônica pulmonar (atinge homens de mais de 30 anos). Tem a denominação de crônica porque há evolução de um em cerca de 2.000 casos de hisroplasmose aguda devido a defeitos anatômicos do pulmão, levando à doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), principalmente em fu mantes inveterados de áreas endêmicas ou em casos de pacientes enfisematosos. Esta doença é própria dos pulmões
207
e atinge geralmente os lóbulos superiores, lembrando a tuberculose. Não raro podem estar também associadas. A doença tem por característica a cavttação pulmonar, mas casos sem caviração semelhantes à sarcoidose podem acontecer. Quando evolui para insuficiência respiratória, ela se corna faral. No quadro 19.1 encomram-se as apresentações clínicas da histoplasmose. Quadro 19.1 - Apresemações clínicas da htsroplasmose Pulmona r Assrntomótico Pacientes imunocompetentes Agudo
Disseminado Agudo Subagudo
Pacientes imunocompetentes
Crónico Opor tunrsto
Pacientes com comprometimento rmunológrco
D IAGNÓSTI CO LABORATO RIAL
Raros casos de hiswplasmose têm sido diagnosticados pelo lavado broncoalveolar e escarro. Apesar da pesqursa de antígenos polissacarídeos no soro e na urina ser útil. a punção medular com pesquisa direta do fungo corado é sempre feira, seguida pela mielocultura para confirmação diagnóstica. O hisroplasma pode ser também encontrado no sangue periférico corado pelo May Grunwald. A hemocultura é pouco útil. porque, apesar de positiva na maioria dos casos, é muiro demorada (no mínimo 3-5 dias). Para estudo epidemiológico e nos casos de infecção assimomática, usa-se reste de sensibilidade tardia, com hisroplasmina. No exame histopawlógico, usa-se coloração de Grocott. HE(células aparecem pequenas devido à rerração) e o PAS, que ajuda a diferenciar de Letshmama. Exames imunológicos como o látex, reação de fixação de complemento e imunodifusão (adsorvidas com pronase) são muiro úteis para diferenciar doença ativa e inariva e para o prognóstico. A imunodifusão é a mais
208 (
Medicina laboratorial para o clínico
usada, devido a seu baixo custO, facilidade de realização, raptdez e boa reprodutibilidade. Arualmente, a técnica de Western blot tem sido usada devido à sua alta sensibilidade (100%).
TRATAMENTO
Geralmente, é indicado nos casos progressivos da doença em que a anforericina B é sempre usada como terapia primária durante 6-12 meses. Nos casos sem comprometimento geral e sem disseminação sistémica ou de manutenção prolongada, é usado o itraconazol. com eficácia de 90%. Nos episódios em que não possa ser administrado o itraconazol. por ser oral. ou nas formas disseminadas crónicas. usa-se a anfotericna B por 1-2 semanas e, após esse período, faz-se a manutenção com irraconazol. Nas formas pulmonares agudas, a droga de escolha é a anfmericina B na dose de 0,6 a 1,0 mg/Kg/dia até 250 a SOO mg/Kg, dias alternados durante sers semanas. Hidrocortisona venosa é sempre prudente para evitar crise addisoniana. Nas formas disseminadas - anfotericina B intravenosa 0,6 a 1,0 mg/Kg em dias alternados por seis meses (cumulativo de 30 a 40 mg/Kg). Em pacientes sem meningite ou endocardtte, fazer cobenura com corttcóide. Pacientes com menrngtte e tntolerame à anfmenctna B. usar itraconazol (100 a 200 mg/dia) por seis a 12 meses nas formas agudas e subagudas. Na forma crónica. usar 200 a 400 mg/Kg divididas em duas doses por dia por 12 meses.
CRIPTOCOCOSE O Cryptococcus neoformans é o único fungo encapsulado capaz de causar infecção humana. A criptococose ocorre pela resistência capsular à fagocirose e principalmente pela queda de linfócitos T. o que é comum na síndrome da AIDS. O Cryptococcus neoformans apresenta cinco sorotipos: A, B, C De AD. Os sororipos A. De AD pertencem à variedade neoformans e os sororipos Be C à variedade gattl. Recentemente, as variedades foram promovidas à espécie, sendo denominadas então de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii
EPIDEMIOLOGIA
O Cryptococcus pode ser encontrado colonizando a orofaringe e outras partes do corpo. Encontra-se em rodo o mundo, saprofiticamente na natureza. sendo muiro comum nas fezes dos pombos e aves. Arualmente, trabalhos científicos relatam a matéria em decomposição em ocos de árvores tropicais, principalmente no Norte do país, como novo hab1tat. A espécie neoformans é a mais encontrada nas fezes de pombos e pássaros, sendo geralmente urbana, e a espéc1e gattii é ma1s encontrada nas madeiras em decomposição (eucalipro) de narureza rural no Norte do Brasil. No Brasil, 80% dos casos de criptococose são devidos à espécie neojormans. A espécie neoformans é mais comum nos imunossuprimidos e a gattii em pacientes sem supressão imunológica.
CLÍNICA
A cnptococose adquirida por inalação causa uma Infecção pulmonar primária muitas vezes imperceptível. Com a evolução da infecção, pode haver quadro pulmonar de criptococose progressiva e corresponde a 10% dos casos. A disseminação hematológica extrapulmonar é o quadro mais comum (90%), tendo grande tropismo para o sistema nervoso central. devido à dopamina; também podem migrar para a pele, pulmão e qualquer outro órgão ou sistema. Nos casos de criprococose disseminada, o microrganismo freqüentemente é isolado na urina. Ela ocorre quando o CD4 está abaixo de 200 células/dL. Os sintomas, inicialmente, são inespecíficos como qualquer infecção pulmonar crôn1ca. Geralmente, a febre é persistente por vá nas semanas ames de começarem os sintomas de meningite. O C. gatt1 produz mais encefalite que meningite, explicando a latência prolongada de alguns casos. O quadro radiológico também é inespecíftco, podendo apresentar pequenos nódulos periféricos nos brônquios até uma densa massa sugerindo neoplasia, que vai comprimindo o parênquima pulmonar. Geralmente. os achados são bilaterais envolvendo a base, sendo a cav1tação e a calcificação muito raras. ~ uma lesão gelatinosa (devido à cápsula da levedura) e muito raramente granulomatosa ou tuberculólde e não produz derrame pleural. ~ uma Infiltração geralmente interstiCial, com pouco infiltrado inflamatório
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
e com predominância de macrófagos. O C. gatti ao exame radiológico demonstra grande lesão pulmonar.
DIAGNÓSTICO lABORATORIAl
Deve-se realizar o exame de rotina do LCR nos casos de suspeita do acometi mento do sistema nervoso central. Geralmente. ocorre baixa celularidade (< 200 células/mm3) com predomínio de mononucleados, exceto nos casos de infecção pela espécie gatti. em que há predomíniOde polimorfon ucleares e hipercelularidade. A tuberculose sempre deve ser afastada. O diagnóstico micológico pode ser feiro por exame a fresco com nanquim (Figura 19.7) e pela cultura. O método da tinta nanquim ressalta a cápsula no exame direro e se presta mais para pesquisa no líquor do que no escarro ou lavado broncoalveolar. O criptococo cresce bem em Sabouroud sem cicloheximida em temperaturas até 29•e, levando três a quatro dias para seu crescimento. Em temperaturas mais altas ele não sobrevive. Em amostras comaminadas. como escarro. lavado bronqueoalveolar, urina. etc., o meio de STAIB que usa alpiste niger (Guizotia abyssimca) tem melhores resultados. A levedura pode também ser VISta ao exame anatomopatológlco a partir da coloração do PAS e Grocott. que evidencia a parede celular do fungo. A coloração de mucicarmim de Mayer cora a cápsula de vermelho. mas não a levedura, tendo o cuidado de afastar a existência de muco brônqUICO, que também cora positivamente com mucicarmim. Podem ser visualizados isoladameme ou no cito plasma dos macrófagos.
Figura 19.7 - Cryptococcus em tinta da China.Ver págma 209
209
Como mécodo sorológico. usam-se partículas de látex para detecção de antígenos capsulares de xilomananas (glucoronoxilomanana = 90% da cápsula) presentes no líquor. Essas partículas podem ser aglutinadas em 10% dos casos de pacientes com fatar reumatóide positivo, faror este que pode ser absorvido pela enzima pronase. Pacientes com sorologia negativa não devem afastar cripcococose e pacientes com títulos pequenos devem ser considerados evidência presuntiva de criptococose. Para monitorização de cura e em casos de fator reumatóide positivo, pode-se lançar mão da titulação por meio do méwdo de enzima imunoensaio.
TRATAMENTO
por wda a vida aos pacientes com HIV e de seis a 12 meses em pacientes imunocompetentes; • sistema nervoso central (SNC): anfotericina B por duas semanas. seguido de fluconazo l por no mínimo 10 semanas. sempre se observando a contagem de linfócitos T CD4+. Tem sido usada a associação anfotericina B + fluconazol em pacientes imunodeprimidos.
•
pulmonar: fluconazol
ASPERG ILOSE Devido ao seu alw índice de ocorrência e ter sua denominação clínica já consagrada na prática médica. esta hialohifomicose permanece ainda com a denominação de "aspergilose" (infecções causadas por fungos do gênero Aspergíllus).
EPIDEMIOLOGIA
Causada geralmente pela forma assexuada e raramente pela forma sexuada do Aspergíllus. podendo variar quanto às espécies. Das muitas espécies existentes, em corno de 190, somente quatro têm relevância clínica, por serem as mais encontradas nos casos de aspergilose: A fumígatus. A jlavus, A níger. A terreus em ordem decrescente de ocorrência. O A fumígatus é o mais encontrado em solo de clima tem perado e tem um
210 ( M edicina laborawrial para o clínico
conídio muiw pequeno (3 ~m). muito hidrófi lo. ficando faci lmente suspenso no ar, atingindo os brônquios e o espaço aéreo alveolar pela aspiração. Está muito presente em ambientes de construções. nos tubos e filtros do aparelho de ar-refrigerado e nos dejeros ricos em matéria orgânica. O A terreus. por ser resisceme à anfotericina B. merece mais cuidados, porém, felizmente é discutida sua ação patogénica no pulmão. Tem grande predileção pelo sistema nervoso central e é o mais isolado nas onicomicoses por Aspergíllus. A espécie A. jlavus produz uma micocoxina denominada aflatoxina que. quando ac um ulada. pode causar problemas hepáticos. Nos seios paranasais, é a espécie mais isolada. causando obstrução e podendo chegar à erosão do palato. O A mger possui conídios grandes, com destacada predileção pelo ouvido. predominando nas otomicoses e sendo encontrado no pulmão e cavidade nasal. causando aspergiloma. É a espécie mais verificada no solo tropical.
PATOGENICIDADE
A ação parogênica do fungo é devida à produção de metabólitos tóxicos ou por suas propriedades histolíticas. Um fator importante de patogenicidade é a exposição do indivíduo por tempo prolongado em ambiente contendo grande qua ntidade de conídios. O Aspergíllus tem grande tropismo pelos vasos sanguíneos. onde se desenvolve rapidamente formando um tampão capilar. Vai ocorrer obstrução. infarto e necrose tissular. A pawgenicidade do fungo vai depender também do estado imunológico do paciente. Normalmente, a fagociwse feita pelos neutrófilos e macrófagos inibe hifas e esporos fúngicos, já as leveduras são inibidas principalmente pela ação dos linfócicos-T. Portanto, neutropênicos são invadidos por fungos micelianos e pacientes com AIDS por leveduras e fungos dimórficos. que formam leveduras quando a 37"C. A aspergilose invasiva só ocorre em 0.1 a O.S% dos pacientes com AI DS. Estes não têm aspergilose no início da doença. pois os neutrófilos e macrófagos estão íntegros. Com o avanço da doença ocorre queda dos granulócitos devido à toxidade da terapia anriviral (<50 células/dL) e invasão por fu ngos micelianos. A corticoterapia inibe mais o linfócito-T que os neutrófilos e macrófagos. o que dá mais chance às leveduras de invadirem. inclusive as dos
)1-- - - - - - - -- - -- -- -- - - - - - - -- - - - - - -
fungos dimórficos, como ocorre nos rransplanres, excero
Sacadura. em 1968, descreveu o primeiro caso de asper-
nos de medula óssea.
gilose alérgica entre nós. Ela
é mais comum em crian-
Assim como codo fungo, geralmente ames de causar
ças e adolescentes asmáticos crônicos ou portadores de
doença é preciso que ele tenha condições de colonizar
fi brose cística, causando febre, eosinofilia (1.000 célula s/
o hospedeiro. Os tecidos mais externos estão mais ex-
ml) com nível de lgE aumenrado levando a broncoes-
poscos à colonização, como os olhos, ouvidos e nariz.
pasmo (reação ripo
Porém, devido à aspiração dos conídios, as vias aéreas
trado no lobo superior e adenopatia hilar com sinais de
1). O exame radiológico mostra infil-
são as mais colonizadas. Pacientes com facores facili tató-
bronquiectasia. Devido à formação de muco, o paciente
rios como doenças pulmonares crônicas tipo enfisema,
expectora um tampão mucoso marrom escuro. N em
é com
sinusite, fibrose cística e obstrução crônica pulmonar
sempre a cultura resulta positiva. O tra tamento
(DPOC) são mais susceptíveis à colonização.
corticóide para supri m ir a resposta imunológica. O uso prolongado de corticoterapia pode levar a um quadro de aspergilose invasiva, sendo o uso concomitante do
CLÍNICA
itraconazol bastante benéfico. Outro tipo de aspergilose com
mecanismo alérgico
A colonização broncopu lmonar em si não causa do-
é a "alveolite extrínseca alérgica", que ocorre em t raba-
ença e não precisa de tratamento, sendo raramente diag-
lhadores que manipulam forragens ou trabalham em
nosticada em vida. Devido à grande variedade de quadros descreveu a aspergilose como um espectro de doenças.
Aspergi/Jus ou é comum em agricultOres que esrocam malte devido ao Aspergi/Jus clavatus.
A aspergilose pode ser de cunho alérgico ou tóxico, ter
Após oiro horas, desenvolvem quadro de dispnéia, febre.
clínicos provocados pela aspergilose, Rippon, em 1974,
ambientes mofados ricos em conídios de
outro tipo de fungo. Nos EUA
é sorológico e o tra-
lesões primárias e invasivas. O fungo, uma vez colonizan -
mialgia e rosse seca. O diagnóstico
do o indivíduo 1munocompetente ou não, pode evoluir
tam ento é feiro com cort icóide sistêmico
para um quadro alérgico ou para invasão desse tecido.
melhora em três a quatro dias.
e geralmente
Nos indivíduos imunocompetences, a aspergilose rara-
A traqueobronquire invasiva ocorre com formação
mente é invasiva, porém, muito ocasionalmente pode
de placas pseudomembranosas que causam obsuução
invadir primariamente a pele de paciente queimado, ou-
e ulceração. O paciente tem rosse. hemoptise e expec-
VIdo, nariz, brônquio, etc. Nesses indivíduos imunoat ivos,
cora cilindros brônquicos contendo
Aspergi/Jus que dão
é ocorrer inoculação de conídios a partir
exame a fresco e cultura positiva. O diagnóstico pode
de t raumatismo, corpo estranho ou nosocomialmente
ser feiro pela broncoscopia. Apesar de ser mais comum
causando ceratite, peritonite pós-diálise, endocardite por
nos pacientes com AIOS, pode similarmente ocorrer nos
próteses valvares e aspergiloma sinusal ou pulmonar de-
t ransplantados de pulmão.
o mais comum
vido a um defe1to na estrutura tecidual tipo cavidades.
Em se tratando de indivíduos imunodeprimidos. as
No indivíduo imunocompetenre, a aspergilose invasiva é
infecções aspergílicas invasivas que recebem o nome de
rara devido à ação fagocítica dos macrófagos e neutrófi-
"aspergilose invasiva" são quase exclusivas
e vão
ter mui-
los. O macrófago não deixa o conídio se transformar em
ta importância clínica quando o paciente é neucropêni-
h1fa. impedindo sua maturação e, quando algum escapa,
co devido pri ncipalmente à falta do macrófago alveolar.
ele é preso pelo neutrófilo que o elim ina.
Portamo, q uando se diz "aspergilose invasiva". normal-
O paciente imunologicamente ativo após a coloniza-
mente esrá-se implicitamente referindo a um paciente
ção da árvore brônquica pode evoluir para um quadro
neurropênico, apesar dela poder ocorrer em pacientes
alérgico devido a um estado reacionário de hipersen-
imunoativos. Pacientes com menos de SOO célu las/mm 3
sibilidade denominado "pneumonia broncopulmonar
de granulóciros fatalmente vão a óbiro. Aqueles com as-
alérgica" ou por "h ipersensibilidade" ou evoluir para um
pergilose invasiva têm alco risco quando têm medula ós-
quadro invasivo denominado "traqueobronquite invasi-
sea transplantada, indo 60 a 80% a óbito. O s portadores
va aguda", que é rara em pacientes hígidos e neutropê-
de anemia aplástica, leucemias e neoplasias, cujo sistema
nicos e curiosamente com um nos pacientes com A IOS.
m ielóide ou linfóide não funciona devido ao uso de dro-
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
211
gas motóxicas, são os que mais são levados a transplante de medula óssea. Na aspergilose invasiva pulmonar dos transplantados, o fungo é adquirido nosocomialmente e o paciente só vai manifestar a doença depois de três meses, quando já rerornou para casa. E uma doença aguda e fulminante, principalmente pelo d1fícil diagnóstico clínico-laborarorial, o que atrasa a terapêutiCa e leva 95% dos pacientes a óbito. Parologicamente, pode-se resumir a evolução da doença em: angio-invosão ~ trombose ~ infarto = necrose; o que se traduz clinicamente em : dor pleurítico ~ hemorragia pulmonar = hemoptise ~ covitoção.
Esse quadro não é específico do Aspergillus e pode ocorrer com outros fungos oportunistas. A clínica parece de embolia, porém com hemoptise. Arualmente se segue uma padronização para estabelecer o nível de infecção da aspergilose invasiva. levandose em coma: farores de risco inerentes ao paciente, manifestações clínicas, resultados de exames micológicos que colocam a doença em três estágios d1agnóst1COS : 1- definitiva, 2- provável. 3- possível. Os pacientes com câncer podem ter hemoptise de duas mane1ras: 1) Invasão de vasos levando ao infarro. quando o paciente está neutropênico. 2) O paciente está em recuperação da granulopen1a e os neutrófilos invadem a parede dos vasos, resultando em destruição da camada elástica e formação de um aneurisma micórico com ruptura e hemoprise levando-o à morre. Paciente neurropênico com febre persistente ou recorrente, infiltrado pulmonar lembrando pneumon1a bacteriana, porém, não respondendo à rerap1a ant1bacreriana. deve-se entrar com tratamento antifúngico. Às vezes a tomografia computadorizada pode revelar mais precocemente as lesões cavitárias. O lavado broncoalveolar geralmente é negativo para fungos. Quando a aspergilose é parenqulmatosa, o diagnóstico é mais difícil e faz-se biópsia rransbrôn· qu1ca e transtoráxica por aspiração. Outra forma pulmonar de aspergilose menos comum e semi-invasiva é a "aspergiJose crônica necronzante". É uma forma indolente descrita em paoentes com doença pulmonar obstrutiva crônica. pneumoconiose, fibrose císrica. sarcoidose (rara). tuberculose inariva. Há destruição crônica do parênquima pulmo-
212 [ Medici na laborarorial para o clínico
nar, porém sem invasão de vasos sanguíneos. levando ao quadro de fibrose e dilatação brônquica, que muitas vezes facilita a formação de bolas fúngicas devido à formação de caviração. A febre é pouco elevada e causa emagrecimento notório. O exame direco e a cultura para fungo raramente são posicivos e o cracamemo é com icraconazol. Além da aspergilose de localização pulmonar, o paciente imunodeprimido pode rer raramente de maneira primária lesões não pulmonares como no sistema nervoso central. sino-orbital. pele e outras localizações, como a já comentada invasão brônquica causando uaqueobronqu1te 1nvasiva. Quando a infecção fúngica atinge apenas um órgão, geralmente o pulmão, do paciente 1munodeprimido ou não, ela é mvasiva, porém, quando m1gra para outros órgãos. na grande maioria das vezes em neucropên ico ela é classificada como "forma disseminada" e geralmente leva a óbiro em rorno de três semanas por falência múltipla dos órgãos. No Quadro 19.2 enconcra-se o resumo dos aspecros clínicos das aspergiloses.
TRATAMENTO
Normalmente se usa em primeiro tempo a anfotericina B ou o voriconazol por ter formulação parenteral. Após a melhora clínica, pode-se trocar para um antifúngico oral. sendo geralmente o iuaconazol ou vonconazol os mais indicados. O voriconazol se mostrou mais eficaz que a anforericina B, rornando-se o antifúngico de primeira linha para a aspergilose. As equinocandinas, a partir da caspofung1na, podem ser usadas em caso de inrolerância à terapêutica convencional. Têm a vantagem de ser fungicidas contra todas as espécies de Candida.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Os Aspergillus, diferentemente do Fusanum. raramente causam fungem1a e, quando isolados de hemoculturas, deve ser descartada possível contaminação, pois apenas 10% dos isolamenros são significativos. A cultura positiva para Aspergillus no escarro é acrescida de valor diagnóstico quando o exame direro também é positivo. O exame histológico mostra lesões necróticas supurativas e granulomas. As características culturais das principais espécies pacogênicas de Aspergillus resumidamente são:
]1----------- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Quadro 19.2 - Quadro clíntco das aspergiloses Indivíduos imunocomponentes
Indivíduos com comprometimento imunológico Invasão
Inoculação - Toxicose: ingestão de micotoxinos - Nosocomiol : colocação de próteses, diálise peritoneal. - Inoculação de corpo estranho: cerotite - Dono tissulor· quetmoduros, ospergilomo
- Para um órgão superficial: cutõnea primário, stno orb,tal. - Poro um órgão profundo: sistema nervoso cenlral Pulmonar invastva: traqueobronquite invasivo, ospergilose pulmonar invasivo. - Pulmonar agudo ou primário - Pulmonar crónico: ospergilose pulmonar crônico necrottzonte - Poro mais de um órgão: disseminado
Colonização - Manifestação olérgtco asma s.nusi'e alérgico. rin te olérgtco olveal,te extrínseco alérgico osoerg lose brorcopulmonor o érg co pneumol'1io por h.persens·b,l:caoe Invasão - Poro um orgão superficial: rintle, sinusite, olomicose, troaueabronquite agudo - Poro um orgão profundo: troqueabronquite agudo, ospergilose pulmonar tnvosiva. - Poro mais de um órgão· disseminado.
Aspergillus clavatus
Macromorfologia: cresomemo rápido da colônia que tntoalmeme é branca e vai se wrnando esverdeada com o tempo. Micro morfologia: sua vesícula parece com um cownere. Tem as fiálides unissenadas. Aspergillus Jlavus
Macromorfologia: colônia verde amarelada com o reverso branco ou róseo. Pode crescer a 37°C. O apareclmenro de gotículas acastanhadas na superfíoe da colónia geralmeme coincide com a presença de esclerómos. Micromorfologia: seu micélio é f1no, mas de rexcura densa. Tem predominância de fiálides radiadas, porém algumas podem ser colunares, semelhame ao A.jum1gatus. Fiáltdes un1 e b1ssenadas podem ocorrer stmulcaneamenre. Seu con1d1óforo é longo e rugoso (parede espessa). com alguns coníd1os que vão se wrnando rugosos com o envelheomemo. A vesícula, quando jovem, rem forma de cabaça ou btlha. assim como o A jumigatus. porém quando maduras são globosas. Seus conídios são grandes (média de 4 J.Jm).
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas
No exame direw do escarro pode-se encomrar eOSInofdia e cristais de Charcor-Leyden. Aspergillus jwmgat us
Macromorfologia:colónias verde-azuladas ou c1nzas. Crescem bem a 4s·c o que faohra seu 1solamemo. Algumas cepas podem suportar tempera curas de até 6s·c. Micromorfologia: suas ftáhdes têm disposição colunar e nascem do meio para cima das vesículas com formação un1sseriada. Possuem coníd1os pequenos (3 J.lm). Aspergillus 111get
Macromorfologia: sua colônia rem a superfície da cor de carvão e o reverso é branco (não é demáceo). Micromorfologia: rem a cabeça de forma radiada, podendo ter fiálides uni ou bisseriada. Seus conídios são grandes (5.5 a 8,0 J.lm) e alguns podem ser rugosos. No exame direro do escarro. podem-se encomrar cristais de oxalaw de cáloo (produz áodo oxáhco). principalmeme quando o pacieme é d1abér1co e faz aodose metabólica.
213
Aspergi/Jus terreus Macromorfologia: colôntas pregueadas de cor de areia ou amarelo-claro ou canela. Possui pregas radiadas originadas do cemro. Micromorfologia: possui rodas as estruturas pequenas. vesícula e fia loconídios, sendo o menor de w das as espécies de Aspergtllus. A suas fiá lides são blsseriadas, tendo aspecco de leque sobre sua vesícula. As fiálides proximais (profiálides ou merula) tipicamente são mais curtas que as secundárias. Em corte de tecido e em microculcivos a partir de hifas submersas, pode aparecer um conídio secundário (aleuroconídios) de 6 a 7 !Jm, que nasce ao lado da hifa ou às vezes de pequenas projeções de hifa que são pacognomônicas do A. terreus.
CANDIDOSE São infecções oportunistas e endógenas causadas por leveduras do gênero Candida. quase sempre assoCiada a alguma alteração do organtsmo, podendo ser cutâneo-mucosa ou ststêmica (candidemta). Apesar da destgnação "candidíase" ser usada correntemente, o termo "candidose" está sendo mais empregado.
EPIDEMIOLOGIA
A Candida albtcans é a grande causado ra de candidose (60%), seguida pela C. tropicalis e Candida do complexo pstlosts. Outras espécies potencialmente patogênicas são a C. glabrata, C. kruset, C. gwlliermond11, C. kefyr (amiga C. pseudotroptcalts), C. lusJtamae. Por ser de cunho oportunista, teoricamente qualquer espécie das 196 conhecidas pode causar infecção. Algumas dessas leveduras são intrinsecamente resistentes a certos amift:mgicos e estão sendo selecionadas. torna ndo-se emergentes, como é o caso da C. kruset e C. glabra ta, resistentes ao fluconazol, C. lusttamae à anfotenona-Be a C. rugosa à nistatina. A C. a/bicans está l1gada à mucosa do homem e de quase todos os animais, apesar de nunca ter sido isolada de anfíbios. A mucosa digestiva é seu pnncipal habitat e é só através das fezes que ela pode ser encontrada na natureza, pois, apesar de ser saprófita, não v1ve no meio amb1eme, assim como também não é encontrada na
pele humana e de animars. Outras espécres de Cand1da podem ser saprófitas e parasitárias e podem ser encontradas na natureza e na pele.
ETIOLOGIA
Nos casos de endocardite, depois da C. albicans a mais comum é a Candida do complexo psilosis que, por ser um comensal da pele humana. rem um mecantsmo de uansm1ssão exógeno, sendo muito relacionada com o uso prolongado de cateter e nutrição parenteral. T1·ata-se de uma levedura de baixa pacogenicidade e mortalidade. A C. troptca!Js é sempre de origem endógena e rem alto poder de invasão, levando normalmente a uma candidose invasora. principalmente em recepcores de medula óssea ou em paciemes com enfermidade hematológica. A variante sacarose negativa é muico encontrada nos casos de candidose disseminada.
PATOGENIA
A maioria das infecções por Candida ocorre principalmente em pacientes hospitalizados. As infecções nosocomiais são devidas ao aumento de fatores de nsco nesses paCientes. que podem estar isolados ou associados. Os fatores de riscos podem ser devidos àqueles que produzem imunossupressão no paciente ou a facores que facilitam a entrada do fungo como cateter, queimaduras. internação prolo ngada, etc. Para o desenvolvtmemo das candidoses, além dos facores de riscos que estão ligados ao hospedeiro, são 11nportanres também os facores de virulência inerentes a cada cepa do fungo. A candidose é a ún1ca micose em que os do1s ttpos de defesa do organismo- a fagocicose e imunidade celular - têm a mesma importância. A fagocitose (neutrófilo e macrófago) age diretamente nas hifas fúngicas impedindo sua invasão e os linfócitos-T agem nas leveduras impedindo sua fixação na mucosa. A Candida causa mfecção em dois passos, pnme1ro se adere à célula epitelial ou à mucosa. o que é possível devido à existência de receptores de manana na sua parede celular, que vão se ligar à fibronecti na da célula recepcora (faror de aderência da célula).
214 [ Medicina laboratorial para o clínico ~------------------------------
Na fase de aderência, são os linfóciros-T que vão agir remando combater as leveduras e, na falta destes, vai haver disseminação da infecção, como ocorre na AIDS com o aparecimento da candidose mucocutânea. Uma vez aderida, a levedura começa a produzir hifas que, na sua extremidade, secretam enzimas proteolíticas, começando a invadir a mucosa ou pele e esta fase misceliana vai ser combatida pela fagocicose. O paciente com AIOS com a levedura já aderida começa a ter depressão dos neutrófilos numa fase mais avançada da doença, devido à ação tóxica dos antivirais, podendo levar à penetração das hifas com conseqüente candidemia. As mananas da parede celular das leveduras de C albicans são capazes de reduzir a blascogênese de linfócico-T. funcionando como mecanismo de escape da defesa imunológica do organismo.
CLÍNICA
A clínica da candidose apresenta um leque de manifestações que variam conforme seja uma infecção ou uma reação alérgica. As candidoses infewosas podem ser divididas, conforme sua localização, em superficiais e sistêmicas. A cand1dose superficial cutâneo-mucosa ocorre em locais onde a Candida vive saprofiticamente como microbima normal, sendo mais comum a mucosa oral, vaginal e intes(lnal. A candidose vulvovag1nal excepCIOnalmente prema de um fator predisponente para que ela ocorra contrariamente ao que ocorre em outras candidoses. A candidose oral (sapinho) é a mais comum das candidoses superficiais, ocorrendo geralmente em crianças, 1dosos e imunodeprimidos. Pode se apresentar de vários tipos, como: pseudomembranosa (aguda e crónica), eritematosa (aguda e crónica), quedite angular, em placas crôn1ca ou nodular crónica, quando tem aspecto granulado. Ma1s raramente pode causar glossite de evolução crônica chamada de "glossite mediana rombóide", que parece ser uma seqüela da candidose pseudomembranosa aguda. A forma pseudomembranosa é muito comum na AIOS. A candidose eritematosa aguda é também chamada de "candidose aguda oral atrófica" e. como a eritematosa crônica, é encontrada nos usuários de dentadura. A candidose oral pode, em alguns pacientes graves, afetar a língua, faringe e esôfago.
Investigação laboratorial das micoses su perficiais e profundas
A candidose mucocutânea pode se cronificar, afetando ao mesmo tempo a boca, pele e unhas. Geralmente, ocorre em crianças e muito raramente nos adultos. Na infância, geralmente é de causa hereditána (autossômica recessiva ou dominante) ou devida a doenças endócrinas como hi poparatireoidismo associado ao hipoadrenalismo ou devido ao hipotireoidismo. No adulto, pode estar associada ao timoma ou ao lúpus eritemaroso sistêmico. A candidose mucocutânea crónica produz lesões crônicas orais do tipo pseudomembranoso ou em placas, na pele dá lesões crostosas formando o "granuloma candidiásico" e as unhas ficam intensamente distróficas.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Normalmente são feitos o exame a fresco e a cultura. Para identificar a espécie de Cand1da. é preciso fazer o auxonograma e o zimograma, sendo o microcultivo muito útil. Na candidose sistêmica, pode-se fazer detecção de antígenos ou de anticorpos circulames, detecção de metabólicos ou de componentes da parede celular da levedura. REFERÊNCIAS Gontt)O MAM. PrevalênCia de Agentes de Dermawmtcoses em Pactentes Atendidos em 1994 - 19995 na Faculdade de Medtctna e Hospital das Clín icas da UFMG [dissertação]. Belo Horizonte: Untverstdade Federal de Mtnas Gerats; 1997. 2. Lacaz CS, Porco E. Mamns JEC. Vaccan EMH. Melo NT. Tratado de M1colog1a Médica, 9' ed. São Paulo: Sarvier; 2002. 3. Rippon JW. Medical Mycology - The Parhogenic fu ngt and parhogen1c actnomycetes. 3' ed. Ph iladelph1a: W. B. Saunders; 1988. 4. S1dnm JJC. Rocha MFG. Mtcologta Médtca à Luz de Autores Contemporâneos. Rto de jane1 ro: Guanabara Koogan; 2004. 1.
21 5
20
Míriam Oliveira e Rocha
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM HELMINTÍASES E PROTOZOOSES INTESTINAIS
No Brasil, as parasitoses intestinais constituem importante problema de saúde pública, tendo em vista sua elevada prevalência e os sintomas que podem ocasionar. Além dos prejuízos à saúde do homem, podem causar consideráveis perdas econômicas relacionadas à assistência médica, redução da produtividade ou mesmo incapacidade para o trabalho, influindo no desenvolvimento socioeconômico de uma região. Especial atenção deve ser dada às crianças, pelo fato de as parasitoses intestinais poderem interferir no seu desenvolvimento físico e mental. Fatores como saneamento básico, condições socioeconômicas. educacionais e climáticas, aglomeração populacional e hábitos da população influem na prevalência das emeroparasitoses. Nas zonas rurais e nos bolsões de pobreza das grandes metrópoles. onde as pessoas se aglomeram em pequenos espaços e com precária higiene, as condições de vida da população favorecem a transmissão das parasitoses intestinais. Sobretudo nessas áreas mais pobres, na infância e nos imunodeficientes, as parasitoses intestinais continuam a representar um grave problema de saúde pública. A prevalência das parasitoses intestinais no Brasil continua alta e os dados são fragmentados ou mesmo inexistentes para algumas regiões. Em levantamento realizado em 2005, em Campina Grande. na Paraíba. Silva et a/. observaram, entre 742 crianças com idade entre dois e 10 anos de idade, taxa de positividade para enteroparasitoses de 94,1%, sendo de 56.3% para o Ascaris
lumbricoides. A alta prevalência foi atribu ída às condições de pobreza, convívio da população com esgotos sanitários "a céu aberro", insetos, acúmulo de lixo, falta de higiene doméstica, entre outros. Em 1988, um levantamento multicêntrico realizado em crianças de sete a 10 anos, abrangendo 10 estados brasileiros, mostrou taxa de positividade de 55.3%. Em Minas Gerais, essa taxa foi de 44,2% entre 5.360 crianças examinadas, sendo os parasitos mais freqüemes o A lumbricoides (59.5%), Trichuris tnchiura (36,6%). Gwrdia lamblia (23,8%) e o Schistosoma mansoni (11,6%). Em algumas regiões. cem sido observada tendência à queda na prevalência das parasitoses intestinais. Ferreira et a/., em dois inquéritos realizados em São Paulo, em 1984/85 e 1995/96, com crianças entre zero e 59 meses de idade, observaram redução de 30,9 para 10,7% nas enteroparasitoses em geral. decrescendo de 22.3 para 4,8% nas helmintíases e de 14.5 para 5,5% na giardíase. Em Concórdia, Santa Catarina, Tiez Marques et a/. obtiveram, em 2005, positividade de 12,6% num total de 9.024 exames parasitológicos de fezes. em um período de 30 meses, englobando os anos de 2000, 2001 e metade de 2002. Rocha et ai. verificaram, em Bambuí, Minas Gerais, declínio na prevalência das parasitoses intestinais, comparando os resultados de inquéritos anteriores comendo dados obtidos em 2000 com o exame parasitológiCo de fezes de 2.901 escolares, quando a prevalência global foi de 20,1%. O declínio foi associado à imensa urbanização e à melhoria das condições sócio-sanitárias.
Em três mesorregiões de Minas Gerais (Triângulo Mineiro/Airo Paranaíba. Noroeste e Sul/Sudeste), um leva mamemo das helm1míases intestinaiS realizado por Carvalho et ai., em 2002, com 18.973 escolares (sere a 14 anos) da rede pública, utilizando o mérodo de Kato-Katz. revelou positividade geral de 18%, sendo 15% monoparasirados. A prevalência do A. lumbricoides fo1 de 10.3%, de T tnchtura 4.7%, de ancilosromídeos 2,9%. de E. vermicu/aris 1,2%, de H. nana 0.4% e de Taenia sp 0,2%. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS}, no Brasil. em conseqüência do tratamento regular de comunidades entre 1980 e 2000, houve redução de 60% no número de internações de adulros devido à esquisrossomose e de 90% emre as crianças. As parasiroses intestinais concentram-se em áreas de clima tropical. solo quente e úmido. Entretanto, elas não se limitam a essas áreas. acompanhando os deslocamencos de seus hospedeiros. Atividades como a mani pu lação de alimentos por pessoas infectadas contribuem para a disseminação dos parasiros. A mudança de hábicos da população pode favorecer o aparecimento de parasicos ames inex1stenres em uma região ou país. No Brasil. a ingestão de pe1xe cru importado de países onde o Diphyllobotrium /atum (taenia do peixe) já havia sido detectado tem propiciado a infecção por esse parasito. nunca antes relatado no Brasil. A população de nível socioeconômico mais elevado, que rem o háb1w de freqüentar os restaurantes japoneses. onde o praco é serv1do, tem s1do a mais atingida.
HELMINTÍASES INTESTINAIS
Os helmimos (do grego helminthes) ou vermes (do latim vermts} são classificados em três fi los: Acantocephala, que por apresentar pouco interesse médico não será abordado; Nematelminros ou vermes cilíndricos; e Platelminros ou vermes chatos. Entre esses últimos. encontram-se as classes Cesroda, apresentando o corpo segmentado. e Tremacoda. com o corpo não segmentado, ambas de interesse para a Parasirologia Humana. No Quadro 20.1 estão relacionados os principais helmincos parasiws do homem, no Brasil, com seu respectivo habitat. mecanismo de infecção e forma diagnóstica. A infecção pelos helmintos pode ocorrer a partir da ingestão do ovo infectante, penetração ativa de larvas pela pele (ou eventualmente pela ingestão destas) ou
218 ( M edicina laboratorial para o clínico
pela ingestão da forma larvária junco com a carne mal cozida (cisticerco) ou verduras (metacercária). Ocorrendo a infecção pela ingestão do ovo, os parasicos podem desenvolver-se diretameme no intestino (T trichiura. E. vermiculans, Taema, Hymenolepts) ou realizar o ciclo pulmonar (A.Iumbnco1des). Naqueles em que o mecanismo de infecção é a penetração ativa de larvas pela pele (Anciloscomídeos. S. stercoralis. S. mansoni). normalmente ocorre o ciclo pulmonar. Os ancilosromídeos, em caso de ingestão da larva infectante, podem se desenvolver diretamenre no intestino, sem ciclo pulmonar. A penetração de larvas pela pele pode ocasionar manifestações cutâneas. tipo dermame alérgica, com prurido. edema eritema, que geralmente desaparecem quando as larvas, caindo nos vasos sangüíneos periféricos. deixam a pele e são levadas para o coração e em seguida para os pulmões. A migração de larvas através do pulmão, presente nas infecções por A. lumbricoides, Anoloscomídeos, S. stercoralts e S. mansom. causa edema inflamatório alveolar. que é acompanhado de rosse, expeccoração e. nos casos graves, pode evoluir para pneumonia (síndrome de Lóefler). Vários farores influem no aparecimento de Sintomas no paciente infectado por helmintos intestinais. Entre eles pode-se citar a carga paraSitária, o sistema 1mune, estado de sensibilização. estado nutricional e idade do hospedeiro. Nas helm1ntíases. a carga parasitária tem relação direta com o número de formas com as quais o paciente se infectou. po1s esses parasitos são organismos pluricelulares. que não se multiplicam no organismo do homem. Auro-111fecção pode ocorrer no paras1t1smo por E. vermtculans. S. stercoralis, Hymenolepis diminuta e Taenta solium. nesse último dando origem à cisticercose. Hiperi nfecções podem ocorrer em algumas situações de grande importância clínica na estrongiloidose. como no paciente imunodeftciente. As manifestações gastrintestinais, tais como cólica abdom1nal. diarréia ou constipação, náuseas e vôm1cos. algumas vezes acompanhadas de anemia. perda de apetite, emagrecimento e irritabilidade. consticuem os sinromas mais sugestivos das helmintíases intestinais.
PROTOZOOSES INTESTINAIS
Os protozoários intestinais parasiros do homem pertencem a quatro fi los: Sarcomastigophora. carac-
)~------------------------------
terizado pela presença de flagelos (Gwrdia lamblw) ou pseudópodes (amebas); Apicomplexa. caracterizado pela presença de uma estrutura denominada complexo apical (Cryptosporidium parvum, lsospora bel/i, Cyclospora cayetanensis, Sarcocystis hommis); Ciliophora, apresentando cílios (Balant1dium coli); e Microspora, caracterizado pela formação de esporos (Microsporídeos). Os prorozoários são organismos unicelulares que se desenvolvem diretamente no intestino e, diferentemente dos helmintos, multiplicam-se no interior do hospedeiro, com maior ou menor intensidade, dependendo de farores como o sistema imune, estado nutricional. microbiota intestinal e acidez do suco gástnco. A E. his tolyttca pode attngir localizações extra-intestinais, como o fígado, pulmão, cérebro, pele
ou órgãos da cavidade peritoneal, embora esses achados sejam pouco freqüentes no Brasil. No Quadro 20.2 estão relacionados os principais prorozoários parasitos intestinais do homem no Brasil, bem como seu habttat. mecanismo de infecção e forma diagnóscica. A transmissão das protozooses intestinais ocorre pela via fecal -oral, predominantemente pela ingestão de água ou alimentos contaminados com cistos ou oocistos dos parasitos. A transmissão direta de pessoa para pessoa constitui mecanismo de infecção particularmente importante na giardíase e criptosporidiose, em instituições coletivas. como creches e orfanaros. entre membros de uma mesma fa mília e entre homossexuais.
Quadro 20.1 - Principais helmim os parasrros rm estinais do homem. no Brasi l, com seu respect rvo habrtat, mecanrsmo de infecção e forma dragnóstica
Espécie (Filo/ Classe)
Ascoris lumbricoides
Habitat do verme adulto
Ingestão do ovo contendo o larva infectante
Ovo não embriona do
Intestino grosso
Ingestão do ovo contendo o larva infectante
Ovo não embrionado
Intestino grosso. Fêmeas grávidos migram poro o região períonol
Ingestão d o ovo contendo o larva infectante. Pode ocorrer auto-infecção
Ovo (lorvo do ou não emb rionado). fêmeo d o porosito
lntest no detgodo
Penerroçã o oliva pelo pele ou rngestão do larva Frlorróide
Ovo não embrronod o Em fezes envelhecid o s: ovo lorvodo ou eventualmente o la rva robditórde
Intestino d elgado
Penetra ção oliva pelo pele ou ingestão d o larva Filorióide. Pode ocorrer aula-infecção
Lorvo robditóide
lntes;ino delgado
Ingestão d e carne d e boi crua ou mal cozid o, contendo cisticercos
O vo
(Nemolelmrnto)
Enterobius vermicularis (Nemotelminto) Ancilostomídeos (Ancy/os/omo duodeno/e
e Necoror omerrconus) (Nemotelmrnto)
Slrongyloides slercoralis (N emo telmínto)
Toenro soginoto (Piatelmrnto/Cestoda)
Forma diagnóstico
Intestino d elg ado
(N emotelminto)
Trichuris lnchruro
Mecanismo de infecção
(Cyslicercus bovis) Taenio sofium {Piotelminto/Cestoda}
Intestino delgado
Ingestão de carne d e porco crua ou moi cozido, contendo cisltcercos. A ingestão dos ovos d o porosito levo à c isticercose
Teníose: Ovo Cisticercose (Cyslicercus ce llulosoe): visib ilizoçã o d o cisticerco, a través de métodos d e diagnóstico por imagem
Hymenolepis nono (Piatelmrnro/Cesroda)
Intestino delg ado
lnges;ão do ovo ou de insetos contendo o larva c istrcercórde
Ovo
Hymenolepis dimrnuto (Piatelminto/Cestodo)
Intestino delg a do
Ingestão de insetos contendo o larva cislicercóid e
Ovo
Schrstosomo monsoni {Piotelminto/Tremotodo}
Sistema porto
Penetração de cercórios pelo pele
Ovo
hepático {Piatelminlo/Tremaloda}
Vias biliares
Ingestão de à guo ou verdura s contaminad o s com o s meto cercório s
O vo
Foscio/o
Investigação laborarorial d o paciente com helmint íases e protozooses in test inais
219
Quadro 20.2 - Principais protozoários parasitos intestinais do homem. no Brasil, com seu respectivo habitat. mecanismo de infecção e forma diagnóstica Espécie (Filo)
Giordio Iomb/ia
Habitat
Forma d iagnóstico
Intestino delgado
Ingestão de cistos com águo ou olimen· los conlominados; transmissão direfo de pessoo·pessoo, contoto sexuol
Em fezes diorréicos: trofozoíto Em fezes formados: cisto
Intestino grosso
Ingestão de c istos com águo ou alimentos contaminados; conta to sexual
Em fezes diarréicos: trofozoíto Em fezes formadas: cisto
Intestino grosso
Não esclarecido. Há suspeito de que ocorro por meio do ovo de E. vermiculoris
Trofozoíto. Essa omebo não apresento cistos
Intestino delgado
Ingestã o de oocistos com águo ou olimen· tos contaminados. tronsmrssão dlfeto de pessoa-pesso a ou onrmol·pessoo. Pode ocorrer auto-infecção interno ou externo O oocisto que sai nos fezes tá é infectante
Oocisro esporulodo
Intestino delgado
Ingestão de oocistos com águo ou olimen· tos contaminados. O oocisto eliminado com os fezes só se torno infectante após 2-5 dias
Oocisto não esporulodo
Intestino delgado
Ingestão de cistos
Em fezes diorrércos trofozoito Em fezes formados cisto
Intestino grosso
Supostamente ingestão de cistos
Formos vocuolor, granular, omebóide, cístico, o vocuolor e globular
Intestino delgado
Ingestão de carne de bovrnos e suínos, conta minado com so rcocistos maduros
Ooc isto esporulodo ou esporocistos
(Sorcomastigophoral Amebos' (Sorcomostigophoral
Mecanismo de infecção
Entomoebo histolytico também no fígado, pul· mão, cérebro e pele
Oientomoebo fragilis (Sarcomasligophoro)
Cryptosporidium porvum IApicomplexol
lsosporo bel/i (Apicomplexol
Bolontidium coli ICiliophorol
Blostocyslis hominis (Sorcomastigophorol
Sorcocystis homims, S. suihommrs (Aoicomplexol
' Encamoeba hrsrolyuca, Entamoeba dispor. Enramoeba ha11manm. Entamoeba cair, lodamoeba bürschi!J, E1rdolunax nana
A prevalência das protozooses intestinais varia de região para região, conforme as condições de saneamento básico e o nível socioeconômico-educacional da população. Nos países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, as taxas de prevalêneta são mais elevadas do que nos países desenvolvidos. Nesses últimos a G. lamb!ta é o parasito intestinal mais freqüentemente encontrado. Há relatos de surtos epidémicos de diarréia, causados pela G. lamblta ou C parvum, sendo famoso o ocorrido em Milwaukee, Estados Unidos, onde milhares de pessoas se infectaram com oocistos de C parvum. As epidemias têm sido atribuídas ao tratamento inadequado do sistema de abastecimento de água ou à sua contaminação com fezes humanas ou de animais. naq uelas que são consideradas zoonose, como a criptosporidiose e possivelmente a giardíase. A prorozoose intestinal que apresenta maior prevalência no Brasil é a giardíase. as taxas variando confor-
me a localidade e população estudadas e a metodologia empregada. Em diferentes levantamentos realizados em crianças. entre os anos de 1988 e 1995. foram observadas taxas de prevalêneta da G. /amblia de 13,8 a 63.3%. Em 1997. no Rio de Janeiro. foram encontrados 4,2% de resultados positivos para G. lamblia, entre crianças com menos de um ano de idade. Há controvérsias quanto à patogenicidade de alguns protozoários intestinais, como o Trichomonas hommts. Dientamoeba Jragilts e 8/astocyçtis homints O apr~reci mento de sintomas nas infecções por 8. hommts tem sido associado à imunodeficiência. Alguns protozoários intestinais, como a Entamoeba colt, Endolimax nana, lodamoeba bütschlii. Chilomastix mesnili, são destituídos de atividade patogénica. Mesmo em grande quantidade ou na vigência de imunodeficiência, esses microrganismos não serão patogénicos e não determinarão manifestações clínicas. não necessitando.
220 [ Medicina laboratorial para o clínico ] 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - -
portamo. de tratamemo. O relam desses prowzoários no resulrado do exame parasiwlógico de fezes, além de permitir a padronização dos laudos laborawriais, é um indicativo da comaminação fecal-oral. O curso clínico das prowzooses imestinais depende de fatores relacionados com o parasiw e/ou hospedeiro. Emre estes podem ser citados a virulência e a pawgenicidade das várias amomas do parasiw, o número de formas infenantes ingeridas, a idade, o estado nutricional. dieta e resposta imune do hospedeiro, bem como infecções concomitantes e a microbima intestinal. O impacw clínico é maior nas crianças, em indivíduos desnutridos ou imunodeficentes. As alrerações mais freqüentes são semelhantes àquelas observadas nas helmintíases, ou seja, manifestações gastrintestinais como a diarréia, cólica abdominal. flatulência, náuseas, vômiws. anorexia, má-absorção, perda de peso, irritabilidade. É importante chamar a atenção do profissional da área de saúde para a realidade do Brasil, país em desenvolvimento, constituído de desigualdades sociais graves, salientando-se a freqüência das parasiwses intestinais na prática clínica e a necessidade de se incluir o exame parasitológico de fezes entre os exames complementares solicitados. Mesmo com a moderna e complexa tecnologia médica, as parasitoses imestinais continuam a ser diagnosticadas principalmeme a partir desse exame.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS SUGESTIVAS DE HELMINTÍASES E PROTOZOOSES INTESTINAIS
Os si ntomas gastrimestinais constituem as principais manifestações clínicas decorremes das infecções por parasitos intestinais, variando dos casos assimomáticos até formas graves, menos freqüemes. Fatores como a carga parasitária, estado nutricional, sistema imune, estado de sensibilização e idade do hospedeiro têm grande influência no aparecimemo dos sintomas. Crianças, imunodeficiêntes e desn utridos têm mais possibilidades de ap resentar formas graves. No Quadro 20.3 encon tram-se alguns sinais e sintomas sugestivos de entero parasitos. Uma dermatite alérgica pode ocorrer nas helmintíases em que o mecanismo de infecção do homem é através da penetração da forma larvária pela pele e sintomas como tosse, sibilas, dispnéia, hemoptise e infiltrado pul-
monar naqueles que apresentam ciclo pulmonar. A eosinofilia é um achado freqüeme nas helmintíases, sendo mais pronunciada na fase pulmonar. Manchas cutâneas hipocrômicas associadas à deficiência de vitaminas A e C podem estar presemes. Quadro 20.3 - Principais sinais e sintomas decorrentes das parasiwses intestinais Cólica abdominal Diarréia Náuseas e vómitos Perda de apetite Emagrecimento Prurido anal Irritabilidade Anemia Eosinofilia Presença de sangue ou pus nas fezes
O EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES
Sendo o Brasil um país onde a prevalência de parasiwses intestinais ainda é considerada elevada, o exame parasiwlógico de fezes (EPF) deveria assumir mais importância na prática médica. No entanto, muitas vezes, as parasitoses intestinais não fa zem parte da hipótese diagnóstica e o EPF não é incluído entre os exames complementares solicitados. Em várias situações, esse exame bem executado poderia evitar a realização de procedimentos mais complexos, invasivos e onerosos. como a endoscopia digestiva, exames de imagem e biópsias. Freqüentememe, observam-se infecções parasitárias com formas graves e complicadas em pacientes que se submeteram a procedimentos diagnósticos de alta tecnologia, sem que fosse realizado o EPF, necessário para o diagnóstico da doença. O EPF, comparado com outros métodos, é barato, de fácil execução. não-invasivo. constituindo-se diagnóstico de certeza. o encontro de uma das formas do parasito nas fezes. Em contrapartida, o desempenho do microscopista e a escolha do(s) método(s) de exame de fezes executado(s) têm relação direta com a eficiência do exame. No EPF são pesquisadas as diferences formas parasitárias que são eliminadas com as fezes, ou seja, ovos e larvas de helmintos, trofozoíws, cisws e oocistos de prowzoários.
Investigação laboratorial do paciente com helminríases e protozooses intestinais
221
FASE PRÉ-ANALÍTICA
fase pré-analít ica inicia-se com a solicitação do clínico e inclui a requisição correta do exame, a orientação do paciente para a coleta das fezes, o transporte para o laboratório e o cadasuamemo da amosua fecal. O médico contribui e participa do processo ao informar na requisição do exame, quando possível, o parasiro a ser pesquisado e/ou o mérodo a ser realizado, direcionando o laboratório para a execução do(s) mérodo(s) mais indicado(s) para as diferentes situações. Vale ressaltar que o exame parasirológico de fezes não se resume a um único método, mas é constituído por vários, que serão empregados de acordo com a solicitação médica ou mediante a suspeita de determinado parasiro intestinal. Portamo, é de extrema importância a imeração médico-laboratório, no sentido de o primeiro informar A
o para sim alvo de sua suspeira clínica, quando houver. O laboratório irá executar um ou mais métodos, de acordo com a requisição médica. A solicitação correta contribui sign ificativamente para a eficiência do EPF no diagnóstico das parasiroses intestinais. No Quadro 20.4 estão relacionados os vários mémdos empregados no EPF. seus fundamenros e aplicações. Esses dados poderão aj udar o médico na requisição correta do EPF. O método de Graham (ou da fita adesiva), embora não seja uma técnica de EPF, é empregado no diagnóstico de E. vermicu/aris e Taenia sp, cujos ovos são encontrados freqüememente na região perianal e mais raramente nas fezes. Nesse mérodo, os ovos presentes na região perianal ficarão aderidos a uma fita adesiva aplicada nessa região Distendida sobre uma lâmina de microscopia, a fi ta adesiva funcionará como lamínula, sendo verificada a presença de ovos.
Quadro 20.4 - Principais métodos de exame parasitológico de fezes: fu ndamemos, aplicações e formas parasitárias detectadas Método
Processo de concentração das formas parasitárias
Formas parasitários que podem ser encontrados
Direto*
N ã o utilizo p rocesso d e concentração. As formas parasitários são encontrados quando presentes em grande quantidad e
O vos e larva s de helmintos, cistos de protozoários, oocistos maiores (como o de /sospora belh1. Trofozoítos. em fezes recém-emitidas
Hoffmon, Pons e janer ou Lutz
Sed imentação espontâneo
Ovos e larvas de helmintos, crsros de protozoários, oocistos maiores (como o de /sosporo bel/i). Muito utilizado na rotina do EPF
Método de MIFC (Biogg e/ a /1 Método de Ritchie (formol-éterl Coprotest
Centrifugação* *
Ovos e larvas de helmintos, cistos e oocistos de protozoários. M uito utilizado na rotina do EPF
Centrífugo-flutuação no sulfato de zinco
Ovos leves, cis:os e oocistos de protozoários. Especialmente indicado poro a pesquiso de cistos de protozoários.
W illis
Flutuação espontâneo
Ovos leves, em especial de onciloslomídeos. Não é indicado poro o pesq uiso de cistos. Pouco usado, pois os ovos leves pod em ser diagnosticados, também, por centrifugação ou sedimentação espontânea
Boermann-Moroes Ruga i
Migração otrvo dm larvas
Larvas de helmintos Indicados poro o diagnóstico do Strongyloides slercora/is
Koto-Kotz
Tamisação das fezes, empregando tela que permite o passagem dos ovos e retém os detritos maiores
Ovos de helminlos. Poro o pesquiso de ancilostomídeos e Hymenolepis sp, o lâ mina deve ser examinado a té uma hora depois d e preparado
Sheother
Flutuação em solução de sacarose
Oocistos de coccídeos Especialmente rndicado poro Cryplosporidium porvum e Cyclosporo coyetonensis
Hema toxilina Férrico e Tricrômico*
Centrifug ação d os fezes, seguida de coloração específico
Trofozoítos e cistos d e Giordio e amebos
Faust
et o/.
· Únrcos métodos que permrcem a visrbrhzação de uofozoítos de protozoános ·-Para a concentração de OO
222 (
Medicina laboratorial para o clínico
Após a execução do méwdo de concentração, algumas formas parasitárias precisam ser coradas, permitindo, assim, examinar detalhes da morfologia, necessários à sua identificação. Larvas de helmintos e cisros de prorozoários podem ser identificados corando-se o material com Iugo!. Para a detecção de oocisros de C parvum e C. cayetanens1s, é necessána a execução do mérodo de concentração, seguida de um dos mérodos de coloração indicados para esses parasiros. Por essa razão, é necessário que, no pedido do exame, o médtco solicite especificamente a pesquisa desses parasiros. A identificação dos cisros e trofozoíros de amebas é facil itada quando o material é corado pela hemaroxilina férrica ou uicrômico. Entretanto, esses mérodos são pouco utilizados na rotina do EPF, por serem trabalhosos, dispendiosos e demorados. No Quadro 20.5 encontram-se as colorações mais utilizadas no EPF, suas indicações e as formas parasitárias detectadas por elas. Apesar da dtversidade de mérodos de EPF, os mais empregados são aqueles que permitem o diagnóstico de vários parasitos intestinais, são de fácil execução e pouco onerosos. Entre todos os apresentados no Quadro 20.4, os mais utilizados são o da sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e janer) e os da centrifugação (MIFC e Ritchie), constituindo-se os mérodos de rotina do EPF (Figuras 20.1 e 20.2). O mérodo de Hoffman, Pons e Janer
é realizado com fezes frescas, enquanto o MI FC e Ritchie utilizam fezes colhidas em conservante. No nosso servtço, realizamos um desses métodos em todas as amostras fecais que dão entrada no laboratório. Os casos de suspeita de esuongiloidose deverão ser informados ao laboracório. para a realização, além do método de rotina, do método de Baermann-Moraes (Figura 20.3) ou o de Rugai, que são mais sensíveis para a pesquisa de S. stercoralts, detectando larvas em situações nas quais outros métodos não são capazes. O mesmo se aplica aos casos de suspeita de esquistossomose. quando são realizados o método de rotina e o método de Kato-Katz, esse último mais sensível que os demais para o diagnóstico do S. mansoni. (Figura 20.4) Para a pesquisa de coccídeos intestinais (C. parvum, C. cayetanensis e /. bel/i), deve ser feita a concentração dos oocisros a partir de um dos métodos de centrifugação (MIFC. Ritchie ou Coprotest), aumentando-se o tempo de centrifugação para 10 minutos. Em seguida, o material é corado por um dos mérodos derivados do Ziehi-Neelsen ou pela safranina-azul de metileno. (Figura 20.5) O método de Willis (flutuação espontânea). apesar de rápido e de simples execução, é pouco utilizado por se restringir à pesquisa de ovos leves, que podem ser deteccados, também, por outros mécodos, como a centrifugação.
Quadro 20.5 - Colorações empregadas no exame parasicológico de fezes Formos parasitários poro os quais é indicado
Indicação/Utilização
Lugol
Larvas de helmintos, trofozoítos e cistos de protozoários
É o corante usado no rotina do EPF, após execução do métod o direto ou de um dos métod os de concentraçã o
Hematoxilino férrico
Trofozoítos e cistos de omebos e
Principalmente poro o pesquiso de trofozoítos em fezes diorréicos Pouco utdizodos no rotina por serem trabalhosas. dispend1osas e demorados. embora permitam v'sib,l·zor detalhes do morfologia facilitando o identificação
Coloração
Giardia Iomb/ia Tricrõm1c0
Ziehi-N eelsen modificado e suas variações
Oocistos d e coccídeos: Cryplosporidium porvum,
Sa fronino-azul de meltleno
Cyclospora coyetonensis e lsosporo be/1;
Aurommo e suas variações
Oocislos de coccídeos: Cryptosporidium porvum,
Cyclospora coyetonensis e lsospora bel/i Chromotrope R (tricrõmico modificado)
Esporos de microsporídeos
Sempre que houver suspeito de um desses parasitos. é necessá rio executa r uma dessas colorações após a concentração d a s fezes pelos métodos indicados Mais dispendioso e menos especifico que os onleflores. necess1ta de m1croscóp10 de imunofluorescênc1o paro o exame da lõm1no Sempre q ue houver suspeita de microsporídeos intestinais
(Enterocytozoon bieneusi e Encepholitozoon mtestinolis)
Investigação labora toria l do paciente com helmintíases e protozooses intestinais
223
situação. a grande maioria dos laboratórios realiza um dos métodos de rotina (sedimentação espontânea ou centrifugação) capaz de diagnosticar vános parasitos. É interessante notar que. freqüentemente, mesmo quando a anamnese e os sintomas do paciente levam
o profissional a suspeirar de um parasim em parricular. ele não coloca essa informação na solicitação do EPF. No Brasil. onde o poliparasitismo é freqüente. o laboratório não deve realizar apenas um método que seja muito específico para determinado parasito. Figura 20.1 A- Método de Hoffman, Pons e janer: fezes diluídas em água. sendo filrradas em gaze com o1ro dobras. Vet pag1110 L,,
Figura 20.2 A -Método de MIFC (Biagg et ai.). Material necessário. Ver págma 224
Figura 20.1 B- Método de Hoffman. Pons e janer: sed1memação _ das fezes em cálice cônico. Ver pagmo 224 O mérodo de Faust et a/. (cenuífugo-fluruação no sul-
faro de zinco) é o que mais concentra os cistos de protozoários. fornecendo o maior número de cisros por campo microscópiCO (Figura 20.6). Entretanto. os mérodos de cemnfugaçào. realizados com uês amostras feca1s colhidas em d1as alternados. rêm apresentado bons resultados para a pesqwsa de mros. Em casos de suspeita de giardíase ou amebíase. quando o pacieme está eliminando fezes formadas e os cistos não foram detectados pelos mérodos de centrifugação. mesmo com a coleta das três amostras. a execução do mérodo de Faust estaria indicada. As semelhanças das manifestações clín1cas determinadas pelos d1feremes parasitos intestinais dificultam. muitas vezes, que o médico suspeite de um parasito em especial, impossibilitando a indicação do método a ser executado ou do parasito a ser pesquisado. Nessa
224 [ Medicina laborarorial para o clínico
Figura 20.2 B- Tubos comendo as fezes em conservante, após filtração em gaze; após acrescentar o éter; após agitação vigorosa; após centrifugação, mostrando as camadas de éter. gordura e detritos. conservante e o sedimento e cubo comendo apenas o sedimento, após a retirada das camadas superiores. Ver pag1na 224
Figura 20.3 -(A e B) Método de Baermann-Moraes; (C) Método de Rugat '· , primO a color•oa
• . Figura 20.4- Preparação de lámtna pelo método de Karo-Karz. ~ t' t'fdt
f·
~
,,
Figura 20.5 A- Ooosros de C parvum (lOOX). Ver pag"1a 225
h4
A coleta adequada da amostra fecal tem relação dtreta com a qualidade do EPF. O paoeme tem partiCipação ativa nesta etapa, po1s é ele quem vai coletar as fezes. sendo fundamemal a sua colaboração. O médico pode auxiliar, reforçando, jumo ao seu paoeme. a 1mportânoa de se coletar corretamente as fezes, segwndo as tnsuuções do laboratório. A defecação deverá ser feita num recipiente seco e limpo ou em um pedaço de jornal, transfenndo-se parte das fezes, recolh1das de diferentes porções do bolo fecal, para o frasco própno. que deve ser de boca larga, com boa vedação e capaodade aproximada de 50 ml. Fezes eliminadas no solo ou no vaso sanitário são inadequadas ao EPF.
Figura 20.5 B- Oocistos de I. bell1 (40X), corados pelo Método de Hennksen e Pohlenz (denvado do Ztehi-Neelsen). , r 1~ 11 1
Investigação laborarorial do paciente com helmtnríases e prorozooses intestinais
225
I
I
I
I
•
,
F1gura 20.6 B Coleta da película, com o auxílio de uma alça de plauna. \lc ' tJcio:t'•l J '6 Figura 20.6- Método de Faust et ai. Em (A) Tubos de Wassermann, mostrando as vánas etapas do método. Em 1. 2 e 3 fezes diluídas em água após 1•. 2• e 3• cemnfugações. Em 4, após centrifugação com ZnS04 a 33%, mostrando a película superficial. onde estão as formas paras1tanas mais leves (ovos leves. CIStos e ooosms). Em (B), coleta da película. com o auxilio de uma alça de platina. Ver ptancha colonda
Dependendo do método de EPF a ser executado, pode ser necessária a coleta de fezes frescas ou em conservante e uma ou mais amostras fecais. As fezes frescas devem ser env1adas rapidamente ao laboratório ou mantidas em geladeira. O uso de conservantes dispensa o uso da geladeira ou o envio imediaro para o laboratório, evitando-se também a urgência na realização do exame. Ao utilizá-los, as instruções devem ser passadas ao paciente de forma clara e por escrito. Os conservantes devem ser utilizados na proporção de três partes deste para uma parte de fezes, transferido-as para o frasco com o conservante, logo após a evacuação e homogeneizando-se o material. Não existe um conservante adequado a todas as formas parasitárias. Os mais empregados são o formal a 10 % e o MIF (mercurocromo ou mertiolaro, iodo e formal), indicados para ovos e larvas de helmmtos. o stos e oocistos de prorozoários. É1m-
226 [ Medicina laboratorial para o clínico
portante lembrar que esses conservantes não preservam trofozoítos de prorozoários (Giardia e amebas). eliminados em fezes diarréicas. Em fezes frescas, os rrofozoíros degeneram após 30 minuros, impedindo a sua detecção. Por isso, havendo suspeita desses paras1ros, o méd1co deve relatar essa informação no pedido de exame. para que o laboratório possa dar a orientação correta do paciente. Nesse caso, as fezes diarréicas devem ser coletadas no próprio laboratório, para exame imediato. A omissão dessas informações pode levar a resultados falso-negativos. O mérodo de Hoffman, Pons e Janer (sedimentação espontânea) normalmente é executado com fezes frescas. Já nos mémdos de centrifugação, as fezes são colhidas em conservante, o que facilita a coleta de várias amostras de fezes (amostras múltiplas). A pesquisa de larvas pelo mémdo de Baermann-Moraes implica a migração ariva das larvas, requerendo. porramo, fezes frescas e recém-elim1nadas. A conservação das fezes em geladeira d1minui a viabilidade das larvas e, conseqüentemente, a sensibilidade do mémdo. O conservante conhecido pela sigla SAF (aceram de sódio, acido acético e formol) veio substituir o Schaudi nn, que era preparado com biclorem de mercúrio e, portamo, muiro tóxico. É ind icado na coleta das fezes para a execução do mérodo da hemaroxilina férrica ou cricrômico, quando se faz a pesquisa de cisros e crofozoíros de prorozoários. A elimmação das formas paras1ránas nas fezes não é homogénea, podendo vanar ao longo dos dias e do bolo feca l. Por essa razão. o laboratóno freqüemememe solicita que o paciente faça a colera de várias amosrras de fezes em dias diferences, constituindo-se estas em amostras múltiplas ou seriadas. Esse procedimenro aumenta a sensibi lidade do EPF para o diagnóstico dos vários parasiros intestinais. A colera de três amosrras de fezes em dias alternados é o esquema mais preconizado. Amostras múltiplas são especialmente indicadas para alguns parasiros como a G10rdia lamb/JQ, que apresenta os "períodos negativos", quando trofozoíros e cistos desaparecem das fezes. Estes têm durabilidade de sere a 10 d1as e não apresentam penodicidade, podendo levar a resultados falsonegativos. É importante ressaltar que, em algumas situações, como em caso de suspeita de esquisrossomose, pode ser necessário o exame de fezes seriado, com um número maior de amostras. Para isso, o paciente deverá coletar uma amostra de fezes por semana, du rante cinco
a seis semanas. Normalmente, o laboratório solicita fezes frescas para possibilitar a realização do método de KatoKatz, o mais indicado para o diagnóstico do S. mansoni, além do mérodo de rotina. A coleta das fezes para o EPF dever ser realizada an tes dos exames de imagem do cubo digestivo, pois as preparações uti lizadas nesses exames, como laxantes, óleos minerais, contrastes comendo bário, iodo, emre outros, interferem no EPF. Caso os exames de imagem sejam prioritários, deve-se aguardar uma semana para coletar as fezes. Como a maioria dos sintomas das parasicoses é gastrimestinal, deve ser recomendado ao paciente que antiácidos, bismuto e sulfaco ferroso sejam iniciados após a coleta de fezes.
FASE ANAlÍTICA O exame macroscópico das fezes permite verificar sua consistência e odor, a presença de elementos ano rmais, como muco ou sangue, e de vermes adulros ou parte dele, como, por exemplo, a fêmea de Enterobius vermicularis ou proglotes de Taenia. No exame microscópico é feita a pesquisa das diferences formas parasitárias que são eliminadas com as fezes, ou seja, ovos e larvas de heimimos, uofozoícos, cisros e oocisros de procozoários. Os métodos quantitativos permitem determinar o número de formas parasitárias por grama ele fezes e, conseqüenrememe, a imensidade do parasitismo. Não são muico empregados devido à sua pouca aplicabilidade clínica, pois a dose dos medicamentos atualmeme usados no tratamento das parasiroses intestinais leva em coma o peso corporal do paciente e não a imensidade do parasitismo. Por isso, quase rodos os mécodos usados no EPF são qualitativos. Entre os métodos quantitativos, têm -se o Karo-Katz e o de Scoii-Hausheer. Para facilita r o encontro das formas parasitárias nas fezes, são utilizados os vários processos de enri quecimento e coloração já citados nos Quadros 20.4 e 20.5. Nenh um dos mérodos de EPF é capaz ele diagnosticar, simultaneamente. rodas as formas parasitárias. Alguns permitem o d iagnóstico de vários parasitOS intesti nais, sendo, por isso, chamados de métodos gerais e muito usados na rotina do EPF. Entre estes, estão o método da sed imentação espontânea (Hoffman, Pons e Jan er) e os mérodos de centrifugação.
Quando o médico não especifica o parasito a ser pesquisado ou o méroclo a ser realizado, o que acontece na maioria das requisições de EPF, e não há indicação para a pesquisa de um parasitO em especial. o laboratório, normalmente, executa apenas um mérodo geral. Os métodos específicos são indicados para a pesquisa de um parasito em parricular. É extremamente importante que o médico relate a sua suspeita clínica, pois alguns parasiros exigem métodos específicos para seu diagnóstico e não serão detectados se for executado apenas um dos mérodos de rotina (métodos gerais). Quando solici tados pelo méd ico, os métodos específicos são executados, concomitantemente com os métodos de rotina. Vale lembrar que os honorários pagos aos laboratórios pelo EPF são extremamente baixos. A realização de vários mérodos, necessários em várias situações, sem a requisição méd ica, estará sendo subvencionada pelo laboratório. É importante reconhecer a importância do EPF no diagnóstiCO das parasitoses intestinais, remunera ndoo adeq uadamente, pois deixar de diagnosticar e tratar as parasitoses intestinais ocasio nará gastos muito mais elevados ao sistema de saúde. A pesquisa nas fezes, de oocisros de C. parvum, C. cayetanensts e /. bel/i, coccídeos intestinais desencadeadores de diarréia, requer conduta diferenciada. É necessária a realização de um processo de concentração seguido de coloração específica, que só será realizada quando houver a solimação no ped ido de exame. Os oocisros de I. bel/i, pelo seu tamanho maior, podem ser concentrados a partir dos métodos de centrifugação (MIFC, Ritchie, Coprotest) ou de flutuação (Faust ou técnica de Sheather). Entretanto, para concentrar os oocisros de C. parvum e C. cayetanensis, que são muico pequenos e leves, deve-se utilizar a técnica de Sheather ou os mécodos de centnfugação, aumemando-se, nestes últimos, o tempo de centrifugação de um para 10 minucos. Com o material obtido, faz-se uma coloração específica, sendo as mais utilizadas aq uelas derivadas do Ziehi-Neelsen ou a safranina-azul de metileno. Corantes fluorescentes, como a auramina, são preconizados por alguns autores. Entretanto, além da necessidade de um microscópio de imunofl uorescência para o exame da lâmina, essa metodologia pode apresentar inespecificidade, podendo ser necessána a validação de um resultado positivo com o emprego de um outro corante, como os citados anteriormente.
Invest igação laborato rial do paciente com helmintíases e protozooses intestinais
227
O EPF não apresenta boa sensibilidade para o diagnóscico de alguns parasitos intestinais, como o Enterobius vermicularis e Taenia sp.. No ciclo biológico do E. vermicularis, a fêmea não faz postura de ovos na luz intestinal. A fêmea grávida, repleta de ovos, migra, à noite, do ceco para a região anal, onde se rompe devido ao arrim ou ressecamemo, liberando milhares de ovos. Portamo, o diagnóstico desse parasiw deve ser feiw pelo mérodo de Graham (mémdo da fira adesiva), no qual a parte aderente de uma Ata transparente é colocada em contaro com a região perianal, ficando os ovos aderidos nela. Esta é distendida sobre uma lâmina de microscopia, funcionando como uma lamínula, sendo posteriormente examinada ao microscópio para a pesquisa de ovos. Evemualmeme, pode ser encontrada uma fêmea ou parte dela. Para obter-se boa sensibilidade com esse mémdo, é importante que a coleta seja feita pela manhã, logo que a pessoa acorde e sem que se faça qualquer tipo de higiene na região perianal. Os ovos de E. verm1cularis eventualmente encontrados nas fezes devemse ao rompimento de uma fêmea durante a manipulação da amostra fecal, aos poucos ovos que saem pelo poro genital da fêmea ou àqueles que são arrastados junco com o bolo fecal. quando este passa pelo ânus. Os ovos de Taenia sp também não costumam ser expulsos com as fezes. Com a eliminação das proglores. alguns ovos permanecem na região anal. podendo ser diagnosticados da mesma forma que o E. vermicularis, com o emprego da fita adesiva. Não é possível fazer o diagnóstico específico a partir dos ovos, ou seJa, dizer se o paciente está infectado pela Taenia solium ou Taenia saginata. Para isso, é necessário fazer a tamisação das fezes. na qual todo o conteúdo de uma defecação é misturado com água e passado através de uma peneira (tamis), onde ficarão retidas as proglores porventura presentes. O exame das ramificações uterinas das proglotes grávidas, após clarificação com ácido acético. permite o diagnóstico específico. Concluindo. a interação médico-laboratório é extremamente importante; a maneira como o médico faz a solicitação do EPF pode direcionar o(s) método(s) a ser (em) executado(s). tornando o exame mais eficiente no diagnóstico das parasitoses intestinais.
FAS E PÓS-ANAlÍTICA Após a execução do exame. inicia-se a fase pósanalítica, que inclui a análise da consistência dos resul-
cados, liberação do laudo, transmissão e arquivo dos resultados e consultaria técnica. Sedi mentos de fezes comendo as várias formas parasitárias, bem como lâminas permanentes, podem ser armazenados, servindo como material de consulta. Na apresentação dos resultados do EPF, devem conscar os seguimes dados, importantes para a interpretação e análise da consistência dos resultados: • Identificação do paciente; • data; • nome do médico; • consistência das fezes; • forma(s) parasitária(s) e nome(s) específico(s) do(s) parasito(s) encontrado(s); • método(s) executado(s); • observações. Todos os parasitos encontrados devem ser relatados, sejam eles patogênicos ou não. O encontro de emerocomensais é um bom indicador das condições sócio-sanitárias de uma determinada região, indicando a possibilidade de infecção com parasitos patogênicos, uma vez que o mecanismo de infecção é o mesmo. Acrescente-se a isso a necessidade de padronização dos laudos emitidos pelos vários laboratórios. O relato da consistência das fezes é importante para a análise e interpretação dos resultados. Por exemplo, se as fezes diarréicas de um paciente com suspeita de giardíase ou amebíase são enviadas ao laboratório acompanhadas de um pedido de EPF, no qual não consta a suspeita clínica, possivelmente o laboratório executará o método de rotina. Como este não permite a detecção de rrofozoítos. forma da G. /amblia e amebas eliminada em fezes diarréicas. o resultado será falso-negativo. Ao verificar no laudo a consistência das fezes examinadas e o método executado, o médico perceberá que realmente não seria possível o encontro de uofozoítos, solicitando a repetição do exame, caso julgue conveniente. Q uando as fezes são entregues no laboratório colhidas em conservante, às vezes não é possível relatar sua consistência no laudo do exame. Seguem-se dois exemplos de laudos de EPF. É conveniente que, diariamente, sejam feitos os registres dos resultados do EPF. anotando-se o número de exames positivos e negativos e com cada um dos parasitos intestinais. Ao final do mês, esses dados são
228 ( Medicina labora[Qrial para o clínico ]1-- - -- - - - - - - - - -- -- - -- - -- - -- - - - --
quantificados e colocados em uma tabela ou gráfico. Desta forma, o laboratório poderá verificar quais os parasitos mais prevalentes na região. Quando for observado o aumento ou diminuição súbita na prevalência de um parasito, a causa deverá ser pesquisada. Esta pode ser devida a uma mudança da clientela, introdução de modificações na execução do método usado no EPF, a adoção de um novo método com sensibili dade diference ou mesmo a troca do microscopista, cujo desempenho reflece diretamente na qualidade do exame. As tabelas ou gráficos de prevalência permitem, também, que o laboratório avalie a conveniência de acrescencar, à rotina do EPF, métodos específicos para determinado parasito que tenha elevada prevalência na região. Como exemplo, pode-se citar a incl usão do método de Kato em regiões endêmicas para esquistossomose ou do método de BaermannMoraes, onde a prevalência da estrongiloidose é alta.
EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES NOME DO PACIENTE: IDADE: SEXO: MÉDICO: DATA: CONSISTÊNCIA DAS FEZES: PASTOSAS M ÉTODO(S) EXECUTADO(S): HOFFMAN PO SE JANER (SEDIMENTAÇÃO ESPON TÃN EAl RESULTADO: OVOS DE Ascoris lumbncoroes LARVAS DE Strongylordes stercoralis CISTOS DE G1ardio Iomb/ia
EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES NOME DO PACIENTE : IDADE: SEXO: MÉDICO: DATA: CONSISTÊNCIA DAS FEZES DADO NÃO DISPONÍVEL (FEZES COLHIDAS NO CONSERVANTE). MÉTODO($) EXECUTADO($): M IFC IBLAGG ET Ali RESULTADO: NÃO FORAM ENCONTRADOS, NA AMOS-
~~~~~~f6u~~~~g~\~~~EDPER6i6~~I~6sCISTOS, OBSERVAÇÃO: EXAME REALIZADO COM TRÊS AMOSTRAS DE FEZES COLHIDAS EM DIAS ALTERNADOS.
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS EMPREGADOS NO DIAGNÓSTICO DAS PARASITOSES INTESTINAIS
Apesar do surgimento de metodologias mais complexas, a maioria das parasitoses intestinais continua a ser diagnosticada pelo EPF, que apresenta uma série de vantagens Já citadas anteriormente. Por outro lado, o EPF é uma metodologia que depende do desempenho do microscopista, consumindo considerável tempo na análise das lâminas. Como há variação no nú mero de formas parasitárias eliminadas com as fezes. o exame pode ser ineficaz quando estas se encontram em pequeno número. As dificuldades em se demonstrar a presença das formas parasitárias nas fezes e o freqüente questionamemo, por parte dos médicos, de resultados negativos em pacientes com sintomatologia compatível com uma das parasitoses intestinais fizeram com que se buscassem novas metodologias. A pesquisa de anticorpos no soro, seja através da reação de imunofluorescência, hemaglutinação, reação imunoenzimática (ELISA) ou outros, de maneira geral é pouco utilizada, pois freqüentemente continua a apresentar positividade após a cura, dificultando a interpretação dos resultados. Pode ser útil em algumas situações, como no diagnóstico da amebíase invasiva, intestinal ou extra-intestinal, pois altos títulos de amicorpos só são observados quando a E. histolytica invade os tecidos. Nos casos de parasitismo pela E. htstolytica sem invasão de tecidos ou na infecção por E. dispa r, a reação é negativa ou com títulos baixos. É especialmente indicada em casos de suspeita de amebíase extra-intestinal. pouco freqüente no Brasil. O teste de ELISA de captura tem sido empregado para a detecção de ancígenos do parasito nas fezes, não dependendo, portanto, da resposta imune do paciente. É uma metodologia de fácil e rápida execução. cuja leitura pode ser feita visualmeme ou no leitor de ELISA. não requerendo, assim, equipamentos especiais. Encontramse disponíveis no mercado ktts para a pesquisa de coproantígeno de G. lambi ta e C parvum. todos apresemando alta sensibilidade e especificidade. Há. também, vários ktts para o diagnóstico da E. histolytica, todos com boa sensibilidade, mas apenas um é capaz de diferenciar a infecção pela E. histolytica e E. díspar, dando resultado positivo apenas para a primeira. Em países desenvolvidos, essa metodologia vem sendo muito utilizada. No Brasil, devido ao elevado custo, seu uso é ainda restrito.
Investigação laboratorial do paciente com helminríases e protozooses intestinais
229
Ensaios imunocromarográficos também têm sido restados para o diagnóstico da G. /ambl~a, C. parvum e E. histolyt1ca. Nesses, os anrígenos do parasito são capcurados por anticorpos específicos, imobilizados em uma membrana, sendo revelados por reação imunocromacográfica. Também são de execuções simples e capazes de revelar mais amostras positivas do que os mérodos convencionais de microscopia, além de permitir o diagnóstico simultâneo de E. histolytica/E. dispa r e C. parvum e G. /ambila. No Brasil ainda são pouco utilizados. A reação de imunofluorescência direta também tem sido utilizada para a detecção de ciscos (G. lamblia) ou oociscos (C. parvum. I. bel/i ) de protozoários. Nessa reação, as fezes suspeitas são colocadas em uma lâmina, adicionando-se, em seguida, o anticorpo específico marcado com uma substância fl uorescente. Tam bém cem o seu emprego limitado devido ao custo elevado, apesar de apresentar alta sensibilidade e especificidade. A reação intradérmica é muico utilizada para o diagnóstico da esquistossomose. É uma reação de hipersensibilidade Imediata, cuja sensibilidade pode va riar de 95%, em homens maiores de 20 anos, acé 65% em mulheres e jovens, havendo, portanto, a possibilidade de resultados falso-negativos. A especificidade da reação é boa, embora outros tipos de cercária possam levar a resultados falsopositivos. É indicada principalmente para levantamentos epidemiológicos. As reações negativas têm alto valor preditivo. As reações positivas indicam que o paciente cem ou ceve a infecção, devendo o resultado ser validado a partir do EPF e apenas mediante o encontro de ovos nas Fezes é que o tratamento deve ser recomendado. Alguns clínicos solicitam a pesquisa de anticorpos específicos, realizada por meio da reação de imunofluorescência ou ensaio imunoenzimático (ELISA). Em ambas as reações é observada a persistência de positividade após a cura, apesar de alguns trabalhos mostrarem que, em animais, a reação de ELISA se tornou negativa quatro meses após o tratamento. A interpretação dos resultados é ainda controversa.
CONSIDERAÇÕES SOBRE O TRATAMENTO DAS PARASITOSES INTESTINAIS O tratamento das parasitoses intestinais apresentou nítido progresso nas últimas décadas. Hoje, a maioria dessas parasicoses pode ser facilmente tratada, muitas
230 ( Medicina laboratorial para o clínico
vezes em dose única, alguns medicamemos apresemando amplo espectro de ação. O correto rracamento deve ser precedido da comprovação diagnóstica pelo EPF ou outra metodologia adequada. O uso indiscriminado de medicamencos para parasitoses incestinais sem comprovação diagnóstica tem s1do adorado não só pela população em geral, mas também por agentes da saúde (médicos, enfermeiros, farmacêuticos, etc.). A demora na liberação do resultado do EPF, especialmente na rede pública, e os poucos efeitos colaterais dos medicamentas, que normalmente se restringem a cólicas abdo minais, vômicos e enjôo. muitas vezes levam o médico a rratar a diarréia e outras manifestações gasrrintestinais compatíveis com parasitoses, sem esclarecer sua causa. Outras vezes é o paciente que não se dispõe a fa zer o EPF, não colaborando na coleca das amostras de fezes, necessárias para o diagnóstico seguro, insistindo no tratamenco sem a comprovação diagnóstica. Os vermífugos mais utilizados são aq ueles polivalentes. mebendazol ou albendazol. que nas doses comumente empregadas agem apenas contra alguns helmintos. O albendazol apresenta boa eficácia para a giardíase, mas a dosagem e a duração do tratamento são diferentes. Uma das maiores dificuldades no EPF é a diferenciação das amebas que são encontradas no intestino do homem. Emre estas, tem-se: Entamoeba histolytica, E. dispor. E. hartmanni, E. coli, Endolimax nana, lodamoeba bütsch/111 e D1entamoeba jragilis. A (mica que pode ser patogênica, determinando as úlceras imestinais ou os abscessos extra-intestinais, é a Entamoeba h1stolyuca e, portanto, segundo a OMS, é a única que deve ser tratada. As demais amebas intestinais do homem não são patogênicas, não necessitando, pois, de tratamento. O seu relato no EPF se justifica, como dito anteriormeme, pela padronização dos laudos, para que médico e paciente fiquem cientes de que há uma fonte de contaminação fecal-oral, e pela possibilidade de erros na idemificação, tendo em vista a dificuldade na diferenciação das amebas. Sua presença pode servir como um bom indicador das condições sócio-sanitárias. Algumas vezes, esse relato faz com que o paciente insista no tratamento, mesmo o médico informando não ser necessário. Vale ressaltar que esses microrganismos não são pacogênicos, independentemente da quamidade presente e do sistema imune do paciente; e mesmo quando presentes
em grande quantidade ou no paciente imunodeficiente, não necessitam ser tratados. A E. dtspar. morfologiCamente semelhante à E. htstolyuca. foi reconheoda como uma espécie diS(Inta em 1997. Essa espécie seria a responsável pela maioria dos casos assintomáticos de infecções anteriormente ambuídas apenas à E. htstolyttca. Trabalhos postenores têm mostrado, entretanro. que essa ameba pode causar alterações superficiais na parede intestinal. levando ao quadro de colite não disentérica. A partir da microscopia. só é possível identificar com segurança a E. htstolyttca quando são observados trofozoícos com hemácias fagocitadas. Nas demais situações. o laudo deverá ser liberado como E. histolyttca/E. dispar. indicando que o paCiente pode estar com uma das duas amebas. Conforme recomendações da OMS. o médico deve fazer o tratamento. caso seu paciente renha sintomas comparíveis com a infecção por E. htstolyttca ou se em sua família houve algum caso recente de amebíase. entendendo-se por amebíase a infecção pela E. histolytica. sinromácica ou assincomática. A OMS não recomenda o tratamento de paoentes com a E. dispar. mas a impossibilidade de diferenciar essas duas amebas pela microscopia cem trazido dificuldades no cumprimento dessa recomendação. Para o tratamento dos casos assintomácicos ou de colite não d1sentérica, devem ser usados os amebicidas que agem diretamente e apenas na luz intestinal (ceclosam e ecofam1da). O metromdazol e outros denvados lmidazólicos (orn1dazol, n1tro1midazol. secnidazol e t~nidazol}. que agem canto nos tecidos como na luz intestinal. são também utilizados com bons resultados. Os amebicidas tissulares (cloridraro de emetina. cloridraco de diidroemetina e a cloroquina). pela sua elevada toxicidade. devem ser reservados para os casos em que os dema1s medicamencos não apresentam bons resultados.
os parasiros que podem ser diagnosticados através de cada um deles permitem a contribuição mais efetiva do médico. à medida que. sempre que possível. seja espeCificada a suspeita clínica na requisição do exame. Isso permitirá que o laboratório execute o(s) método(s) mais indicado(s) para as diferentes siruações. O EPF é imprescindível para o correto tratamento das manifestações gastrintestinais. mesmo que seja para a exclusão das parasiroses intestinais como causa dos sintomas apresentados pelo paciente. REFERÊNCIAS 1.
2.
3.
4. S. 6. 7.
CIMERMAN. B. & CIMERMAN. S. Paras1tolog1a Humana e seus fundamentos gerais. São Paulo: Atheneu. 1999. 37Sp. DE CARLI. GA Paras1tolog1a Clín1ca: seleção de métodos e técn1cas de laboratório para o d1agnóst1co das parasitOses humanas. R1o de ]ane1ro: Atheneu. 2001. 801p. FERREIRA. A.W & ÁVILA. S.L.M. DiagnóstiCO Laboratonal das Pnne1pa1s Doenças lnfecc1osas e Auto-Imunes. 2 ed. R1o de ]ane1ro: Guanabara-Koogan, 2001. 443p. NEVES. D.P. Paras1tologia Humana. 11 ed. R10 de janeiro: Atheneu. 2005. 494p. Rey. L. Bases da Parasirolog1a Méd1ca 2 ed. R10 de ]ane1ro· Guanabara Koogan. 2002, 379p Rey. L. Paras1 tolog1a. 3 ed. R1o de )ane1ro: Guanabara Koogan, 2001, 856p. Vallada. E.P. Manual de exame de fezes: coprolog1a e paras1tolog1a. Rio de ]ane1ro: Athereu. 1993. 201p.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente capítulo não pretende ser um manual técnico sobre o EPF. mas. sobretudo. uma abordagem d1ngida aos clín1cos. mostrando como a requis1ção do exame pode melhorar a eficiência do EPF, contribuindo para o diagnóstico correco e seguro das parasiroses 111testina1s. Os conheomentos sobre os vários métodos utilizados nesse exame. seus fundamentos, indicações e
Investigação laboratorial do paciente co m helm intíases e protozooses intestinais
231
21
Henrique Neves da Silva Bittencourt Gustavo Henrique Romani Magalhães Rosa Ma/ena De/bane de Faria
A ORIGEM, O DESENVOLVIMENTO E A FUNÇÃO DAS CÉLULAS DO SANGUE
HEMATOPOESE A hemacopoese compreende a formação. desenvolvimento e especialização das células sanguíneas (Figura 21.1). É um processo contínuo e imenso para atender as necessidades diárias do organismo, substituindo os elementos figurados do sangue que têm tempos de existência limitados: os neutrófilos sobrevivem apenas algumas horas em circulação, as hemácias têm duração de até 120 dias e alguns linfócitos T de memória podem durar anos. Assim, estima-se que, a cada dia, seja necessária a produção de cerca de um trilhão de células (10 12), de forma que durante toda a vida de um indivíduo seria produzido um cotai de 4x1016/células. A hemacopoese está organizada num contínuo de proliferação e diferenciação celular a partir da célula-tronco hemaropoética. Células-tronco hematopoéticas têm, então, a propriedade de diferenciar-se em rodos os elementos figurados do sangue (hemácias. leucócicos e plaquetas). mantendo. ao mesmo tempo, a capacidade de auro-renovação. que permite a manutenção de uma quantidade de células-tronco suficientes para a produção desses elementos figu rados durante coda a vida. Com finalidade didática, a hematopoese pode ser dividida em três compartimentos: a) Compartimento de células-tronco - com capacidade de auro-renovação e pluripotencialidade, as verdadeiras células-tronco hemacopoéticas caracterizam-se pela chamada divisão assimétrica. processo em que são geradas duas células.
uma delas mantendo as propriedades originais da célula-tronco e a outra que irá diferenciar-se progressivamente. Esta célula "comprometida" com a diferenciação perde progressivamente a capacidade de auto-renovação. enquanto se diferencia em células progenitoras hematopoéticas comprometidas. Em algumas situações, porém, esta chamada divisão assimétrica pode ser substituída por divisões simétricas. Por exemplo, quando há destruição maciça dos progenirores hematopoéticos comprometidos, como no caso de quimioterapia, as células-tronco hematopoéticas dividem-se simetricamente em novas células-tronco primitivas para garantir um pool suficiente para a rápida recuperação da hemaropoese. Por outro lado, existem situações em que a necessidade é aumentar a produção de células maduras para atender perdas súbitas de elementos do sangue. como em hemorragias maciças. Nesta situação, pode ocorrer a divisão simétrica de várias célulastronco hemaropoéticas em células progenitoras com prometidas. b) Compartimento de progenitOres - formado por células capazes de proliferar in vitro e se diferenciar sob efeiro de diversas citocinas e fatores de crescimento. As células progenitoras comprometidas já demonstram alguma diferenciação e não conservam a capacidade de auro-renovação de longo prazo característica da célula-tronco.
·-·-~~
@
/
CFU-E
~-~ o
I
CFU '\_
@-~- ;·}: ~
CFU-MK
GEMM '\_ CFU!
~
hemácios
~~ ~ -
-
(j)
plaquetas
~~eutráfilo ~
monácito
(!) linfático B
CFU-B CFU-L----
~ ------CFU-T
linfático T
Figura 21.1 - Esquema simplificado da hematopoese.
Nesse período, já se podem distinguir dois progeniwres principais: o progeniwr linfóide e o mielóide. O progenimr mielóide diferencia-se em um progenitor granulocítico-monocítico e um progenitor eritrocítico-megacarioblástico. c) Compartimento de células hematopoéticas maduras - consiste nos precursores tardios (progeniwres linfóides, monocíticos, granulocíticos, eritrocíticos e megacariocíticos). em que cada um deles se d1ferencia e prolifera até dar origem, respectivamente, aos linfócims Te B. granulócims (neutrófi los, basófilos e eosinófilos), monócitos/ macrófagos. hemácias e plaquetas. A hematopoese inicia-se no período embrionário. a chamada hematopoese primitiva começa no saco vitelino, em wrno do 19° dta após a fertilização, seguida da hematopoese definitiva que principia pouco depois. na região aórtica-gonadal-mesonéfrica (AGM). Enquanto a hematopoese primitiva é transitória e gera apenas eritrócitos, a hematopoese definitiva gera todos os tipos de células sanguíneas (granulócitos.linfóciros, monómos. plaquetas e eritrócitos). Na quana semana de gestação, o fígado começa a ser povoado por células-tronco hematopoéticas e rapidamente assume o papel de pnncipal sítio hematopoético. Após 14
234 ( Medicina laboratorial para o clínico
a 20 semanas de gestação. a hematopoese transfere-se progressivamente para a medula óssea, que sediará a produção das células sanguíneas até a morte do indivíduo.
CARACTERIZAÇÃO DA CÉLULA-TRONCO HEMATOPOÉTICA
A célula-tronco hemacopoética constitui uma pequena porção das células nucleadas da medula óssea, em mrno de 0.5% em um adulto. Não é possível identificá-la com base apenas nas características morfológicas. pois ela é indistinguível de outras células em estágios mais avançados de diferenciação. Hoje é possível identificar com razoável precisão uma população de células presentes na medula óssea, mas também no sangue periférico e no sangue de cordão umbilical. que possuem características funcionais muito próximas daq uelas esperadas para a cél ula-tronco hemampoética. Esta identificação é proporcionada pela presença de determinados marcadores na membrana celular e a ausência de expressão de outros marcadores. Isso é feito rotineiramente por meio da marcação de antígenos presentes na superfície das células com d iferentes anticorpos liga-
dos a moléculas fl uorescentes e posterior análise da presença ou ausência de cada ancígeno pela citometria de fluxo. Dentre os marcadores, o CD34 é o que encontra am plo uso clínico. Trata-se de uma glicoproteína de 115 kda, que funciona como molécula de adesão semelhante à sialomucina, entretanco, sua real função na célula ainda não foi bem definida. O anrígeno CD34 é expresso nas diversas células-tronco hemacopoéticas provenientes da medu la óssea, sangue periférico, sangue de cordão umbilical e do fígado fetal. A população de células CD34 positivas comém progenitores com capacidade clonogênica e células capazes de reconstituir a hematopoese após insuficiência medular provocada por irradiação. Embora não seja uma molécula que defina especificamente a célula-tronco hematopoética, esses dados sugerem que a célula-tronco hematopoética está com ida na população de células CD34 positivas.
REGULAÇÃO EXTRÍNSECA DA HEMATO POESE Microambiente
Embora boa parte da hematopoese seja regulada pela expressão de diferences genes, diversas células, muitas delas de origem não hematopoética, auxiliam nesse processo. Elas compõem o chamado microambience medular, do qual fazem parte os fibroblastos, adipócitos, osteoblasros, cél ulas endoteliais e macrófagos, além da matriz extracelu lar. Essas células são responsáveis pela produção de citocinas, quimioci nas e fatores de crescimento, muitos dos quais fundamentais em diferences fases da hematopoese, além de prover moléculas de adesão e nichos específicos para o desenvolvimento da hematopoese.
Citocinas I fatores de crescimento
Uma série de citocinas/fatores de crescimento regula a diferenciação, auto-renovação e adesão das célulastronco hematopoéticas e seus progenitores na medula óssea, a partir de efeitos estimulatórios, co-estimulatórios e/ou inibitórios. O efeito sobre a hematopoese pode ser direto ou indireto, pelo estímulo de secreção de outras
A origem, o desenvolvimento e a função das células do sangue
cicocinas. Existem cicocinas que awam em linhagens específicas da hematopoese, como a eritropoietina e o GCSF (fator estimulador de colônia granulocítica), outras atuam em diversas fases. Um grupo importante de citocinas são os fatores estimuladores de colônias. Nesse grupo pode-se incluir o G-CSF, GM-CSF (fator estimulador de colônia granulocítica e monocítica), eritropoetina e trombopoetina. Modelos animais com knock-out de gene para cada um desses fatores levam a uma hematopoese deficiente na linhagem celular estimulada. Várias dessas citocinas são utilizadas, hoje, na prática clínica: G-CSF para acelerar a recuperação de neutropenia pós-quimiorerapia e mobilização de células-tronco hematopoéticas para transplante e eritropoetina para anemia decorrente da sua deficiência, como nos pacientes com insuficiência renal crônica. Um outro grupo compreende o ligante do Flt3 e o SCF (stem ce/1 factor), que têm importa me papel de co-estimulação, interagindo com uma série de citocinas, principalmente nas fases precoces da hematopoese. Já outras citocinas podem exercer efeitos supressores, como a interleucina 1 em altas doses (supressão da mielopoese) ou utilizada por tempo prolongado (supressão da eritropoese). Outras interleucinas (2, 7 e 10, por exemplo) têm ação predom inante sobre os linfócitos (T e B), regulando o sistema imune.
O ERITRÓCITO E A ERITROPOESE
A eritropoese é o processo natural de produção de eritrócitos que ocorre na medula óssea. No estágio maturativo eritróide (Figura 21.2), o proeritroblasto é a célula mais imatura morfologicamente identificável, de grande tamanho, com nucléolos e citoplasma discretamente disforme. A partir desta célula originamse, por reprodução celular, o eritroblasto basófilo, que após 24 a 48 horas se transfor ma por maturação em eritroblasto policromático. Esta célula vive em média 24 horas e se diferencia em eritroblasto ortocromático que, 12 horas depois, perde o seu núcleo e dá origem ao reticulócito. O reticulócito é um eritrócito grande e imaturo, com RNA ribossômico em quantidade variável no citoplasma. O reticulócito permanece na medula óssea um a três dias e, em seguida, é liberado para a circulação, onde permanece por um
235
ou dois dias, perde todas as organelas, reduz seu volume e torna-se eritrócito.
são cisalhame. os eritrócitos têm marcante influência nas propriedades reológicas do sangue. Sua principal função é supnr o meio interno de oxtgênto necessário ao metabolismo dos tecidos. Além disso, participa no transporte de C02, gás que também é veiculado em dissolução no plasma. O eritrócito é uma célula que demora oito dias para ser formada na medula óssea. Ao atingir sua maturação. passa ao sangue periférico. onde vive 120 dias, em média. Ao se aproximar de 100 dias de vida. as funções bioquímtcas da célula se tornam lentas e falhas. A forma discóide e a plasticidade celular se deformam naturalmente e sua captação pelo sistema mononuclear esplêmco torna-se inevitável (Figura 21.4).
Eritrócito
Figura 2 1.2 - Esquema da maturação erirróide. (BFU-E: burstjor-
mmg umt·erythro1d: CFU-E: colonyjormmg umt-erytro1d).
O ERITRÓCITO MADURO As células vermelhas são discos bicôncavos com diâmetro de aproximadamente 7,6 f.im e espessura de aproximadamente 1.0 f.im no centro e 2,8 f.im na borda (Figura 21.3). O número de entrámos é de 5 a 5.5 milhões por mm 3 de sangue nos homens e de 4.5 a 5 milhões por mm3 nas mulheres, ocupando aproximadamente 45% do volume do sangue. Os eritrócitos têm cor amarela-pálida, quando vistos ao microscópio de grande aumento, em delgada camada de sangue fresco; mas, quando superpostos em várias camadas, adquirem matiz avermelhado. Não possuem núcleo e compõem-se de um constituinte lipóide que parece estar em grande concentração na membrana plasmática e. fundamentalmente. de uma proteína contendo ferro, a hemoglobina. Em um eritrócito há cerca de 300 milhões de moléculas de hemoglobina que ocupam 95% da célula eritrocitária. As propriedades semipermeávets de sua membrana permitem ao eritrócito absorver líquido por osmose de meio hipotõnico e. no meio hipertônico, ele se enruga, murcha. Dada sua elevada concentração no sangue e sua capacidade de agregar-se e deformar-se com o nível da ten-
236 ['Medicina laboratorial para o clínico
Figura 21 .3- Foromtcrografia elerrôntca de varreduta de erirróciro.
Figura 21.4 - Foromicrografia eletrônica de varredura de entróciro senescenre.
DESTRUIÇÃO DOS ERITRÓCITOS
Após cerca de 120 dias em circulação, em virtude de seu esgoramento metabólico e alterações degenerativas, as hemácias são removidas e destruídas tntracelularmente no sistema mononuclear fagocitário, especialmente no baço. fígado e medula óssea.
Vários famres contribuem para o mecanismo pelo qual os eritrócitos senescentes são reconhecidos e eliminados da circulação, entre eles os principais são a redução da capacidade metabólica e a oxidação da hemoglobina. Um mecanismo am plamente aceiw para explicar a eliminação de hemácias envelhecidas é a formação de agregados proté1co de banda 3 (uma das mais abundantes proteínas transmembranas da hemácia), estabilizados por moléculas de hemoglobina oxidadas (hemicromos). Esses agregados seriam reconhecidos como antígenos por anticorpos lgG autólogos e complemento. Com a deposição de uma densidade crítica de anticorpos e moléculas de complementos, as hemácias senescentes seriam reconhecidas e eliminadas. Uma vez fagocitada, a hemácia é decomposta em seus componentes, sendo os mais importantes a membrana e a hemoglobina. A hemoglobina é decomposta em globina e heme que, por sua vez, com a abertura do anel da promporfirina, libera o ferro e forma a bilirrubina. O ferro permanece no macrófago e será reaproveitado para síntese de hemoglobina.
GRANULÓCJTOS E MONÓCITOS
Sob a denominação de granulócims. incluem-se os três tipos de leucócitos que no estágio maduro contêm grânulos específicos no citoplasma: neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Essas células são produzidas na medula óssea, passam algumas horas no sangue e, atravessando as paredes dos vasos, vão para os tecidos. onde exercem suas funções, em especial a fagociwse e a destruição de agentes patogénicos. Já as células do sistema de fagóciws mononucleares, representadas no sangue periférico pelo monócito, originam-se também na medula óssea. Após serem liberadas. transitam pelo sangue periférico. onde permanecem por cerca de oito horas e depois migram para os tecidos em que, diferentemente dos granulócitos, têm sobrevida maior, podendo chegar a meses.
O NEUTRÓFILO E O FAGÓCITO MONONUCLEAR Os neutrófilos (Figura 21.5) são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico de adulws. Neutrófilos
A origem, o desenvolvimento e a função das células do sangue
maduros são células altamente especializadas no exercício da fagocitose e destruição intracelular de bactérias. principalmente por mecanismos que envolvem a ativação de peroxidação e uso de proteínas de seus grânulos cito plasmáticos, como lisozimas, defensinas e proteínas catiônicas, entre outras. Os neutrófilos são produzidos na medula óssea a partir de células progenitoras totipotentes, sob a ação de numerosos mediadores, em especial os fato res G-CSF e GM-CSF. As granulações do citoplasma dos neutrófilos são de quatro tipos: grânulos primários ou azurófilos (presentes mais precocemente no desenvolvimento dos neutrófilos), grânulos secundários ou específicos (predominantes nos neutrófilos maduros), grânulos terciários (de gelatinase) e vesículas secretórias (úteis na adesão do neutrófilo à célula endotelial).
-
Figura 21.5 - Focomicrografia de esfregaço de sangue penfénco momando neutrófilos segmentados. Vu prancl.a colonda
Após a liberação para o sangue periférico, os neutrófilos têm meia-vida de seis a sete horas. A massa de neutrófilos maduros disponível como reserva na medula óssea para liberação é cerca de 10 a 15 vezes maior do que a massa de neutrófilos que se encontra no compartimento intravascular em um determinado momento. Essa grande massa de neutrófilos pode ser mobilizada muito rapidamente, em resposta a agressões variadas ou a diversos estímulos. Os neutrófilos não se distribuem homogeneamente no compartimento circulatório: cerca de 50% estão. de faw, retidos próximos da parede dos vasos, especialmente nos pequenos capilares e em tecidos com pulmões e baço. e são chamados de neutrófilos marginais. Numerosos fatores podem modificar essa distribuição de neutrófi los; por exemplo, o exercício ou a adrenalina mobiliza células marginalizadas para a circulação, fazendo aumentar a contagem de neutrófi los sem que haja liberação significativa de células da medula óssea.
237
As células do sistema de fagóciros mononucleares têm como precursores mais imaturos os monoblasros e promonócicos. Após maturação e liberação para o sangue periférico (Figura 21.6), essas células migram para diferences tecidos, onde desempenham papéis importantes na defesa do organismo, principalmente contra parasiros imracelulares (Mycobacterium tubercu/osis. P. carinii, coxoplasma, emre outros). Nos tecidos, as células de rivadas dos monócicos recebem denomi nações especiais, emre elas: células de Kupffer no fígado, osteoclastos nos ossos, macrófagos na pele e pulmões. Elas são precursoras também de células gigantes mononucleadas, observadas em focos de inflamação crônica, como em tuberculose e paracoccidioidomicose. Os monócitos ainda participam da resposta imune através da indução de resposta a antígenos. pelo seu papel de célula apresentadora de amígenos (células dendríticas).
IL-5 com conseqüente aumento do número de eosinófilos circulantes são os casos de pacientes com asma.
Figura 21.7 - Forornicrografía de esfregaço de sangue periférico rnosuando eosinófilo. Ver pógma 238 Já os basófilos (Figura 21.8) são os granulócicos mais escassos do sangue e caracterizam-se pela presença de grandes grân ulos metacromáticos. que são ricos em histamina, seroconina, sulfaco de condroi ti na e leucocrienos. Os basófi los têm similaridades funciona is com os mastócitos, mas são células distintas. Como principais fontes de histamina em circulação, eles são os principais responsáveis pelas reações de hipersensibilidade imediata em anafi laxia, asma e urticária.
Figura 21.6- Fotomicrografia de esfregaço de sangue periférico mosuando rnonóciro. Ver prancha coionda
O EOSIN ÓFILO E O BASÓFILO
Os eosinófilos (Figu ra 21.7) representam até 3 a 5% dos leucócicos em ci rculação. São caracterizados por núcleo bilobulado e numerosas granulações alaranjadas no cicoplasma, variando de 0,5 a 1,5 IJm. São ricos em peroxidase, arilsulfatase, fosfatase ácida e fosfolipase. Os eosinófilos têm atividade pró-inflamatória e citotóxica considerável, participando da reação e patogênese de numerosas doenças alérgicas, parasitárias e neoplásicas. O principal componente dos grânulos do eosi nófilo é a proteína básica maior (PBM), capaz de destrui r larvas de parasicos e células tumorais. Três cicocinas têm papel central na diferenciação dos eosinófilos: IL-3, IL-5 e o GM-CSF. Destas, a mais importante é a interleucina IL-5. Clinicamente, um exemplo clássico do aumento da
238 [
Figura 21.8 - Foromicrografia de esfregaço de sangue penfénco rnosuando basóf1lo Vet pra ncha co/onda
PLAQUETA
Como todas as outras células da medula óssea. os megacariócicos são derivados das células-tronco hemacopoéticas. A uombo poese é decorrente de proliferação e diferenciação megacariocítica. que culmina com a produção das plaquetas. A produção plaquetária diária em um adulco chega a 100 u ilhões e, quando há demanda, essa produção pode ser aumentada em até 10 vezes.
Medicina laboratorial para o clínico ]1---- -- - - - - -- - -- - - -- - -- -- - -- - -- -
Entre as várias cicocinas estimulantes da produção das plaquetas, a mais conhecida e importante é a trombopoetina (TPO). A TPO é uma prmeína de 60 a 70 KDa, responsável não somente pela maturação dos megacarióciws, mas também pela formação de grânulos específicos das plaquecas e expressão de prmeínas específicas da membrana plaquetária, como as glicoproteínas llb/llla, recepwres do fibrinogênio e do fawr de Von Willebrand. A TPO é produzida nos hepatóciws e sinusóides hepáticos e em células do túbulo proximal nos rins e seu nível plasmático varia inversamente à massa de megacarióciws e plaquetas. As plaquetas são formadas pela fragmentação do ciwplasma do megacariócito. Há uma expansão do ciwplasma megacariocítico nos últimos estágios de sua maturação. o que propicia o desenvolvimento de membranas de demarcação e dos grânulos específicos. Esse processo se desenvolve junto aos sinusóides endoteliais da medula óssea. Assim, essas células emitem projeções cimplasmáticas através da barreira endmelial. atingindo a luz desse endotélio, onde então as plaquetas são liberadas como pequenos fragmentos de ciwplasma dos megacariócitos previamente demarcados. As plaquetas vivem, em média, 10 dias na circulação sanguínea, sendo, enrão, removidas ou utilizadas na hemostasia.
liNFÓCITO
Os linfóciros constituem cerca de 20-40% dos leucóciros no adulto. São também o principal constituinte dos tecidos linfóides (linfonodos e baço). Originam-se das células-tronco hemawpoéticas da medula óssea e podem ser divididos em três grupos ou classes de células: os linfóciws B, os linfócicos Te os linfócicos NK (natural killer - matadores naturais). Essas três classes representam a porção mais importante do sistema imune, pois constituem as células efetoras desse sistema.
LINFÓCITO T
O linfóciw T tem seu nome derivado do seu local de maturação, o timo. Seus precursores migram da medula óssea para o timo para esse amadurecimenw no qual o linfócito T começa a expressar uma molécula de superfície única, conhecida como recepror da célula T
Aorigem, o desenvolvimento e a função das células do sangue
(TCR - T-cell recepror). Esta molécula apresenta especificidade para ligar-se a um determinado antígeno. Ele é obtido pela recombinação de alguns genes expressos em diferentes ponros do DNA. Graças a isso, é possível serem geradas mais de 1015 diferences moléculas de TCR. Assim, uma diversidade de linfóciros T, cada um com a sua especificidade, são gerados, o que possibilita o reconhecimento dos diferentes antígenos. Muitos deles gerados no timo apresentam especificidade contra antígenos presentes nas próprias células do organismo. O próprio timo, num processo chamado seleção negativa, elimina esses linfóciros T "auto-reativos", que reconhecem antígenos próprios (se/f) ou reconhecem de maneira intensa moléculas próprias do HLA. Os li nfócitos T que saem do timo apresentam tolerância contra os antígenos e moléculas do HLA presentes no organismo. Além de expressarem na sua superfície o TCR, os linfóciws T apresentam, em sua grande maioria, moléculas de superfície características chamadas de CD4 e CD8. Porém, os linfócitos maduros irão apresentar somente CD4, somente CD8 ou, ainda, não expressarão nenhuma delas (o chamado linfóciw T CD4-CD8- gama-delta). Ao chegar ao timo, os precursores dos linfócitos T não expressam nenhuma das duas moléculas. Na maturação, irão apresentar simultaneamente os dois marcadores (CD4+CD8+) e somente após terão sua especificidade CD4+ ou CD8+ definida. Cada uma dessas duas moléculas confere função específica ao linfóciw T. A molécula CD8 caracteriza o linfócitO T citotóxico, que reconhece antígenos apresentados pelas moléculas de HLA da classe I. O marcador CD4 caracteriza o linfóciw T chamado he/per ou auxiliar, que reconhece antígenos apresentados pelas moléculas de HLA de classe 11 e que são responsáveis pela ativação dos linfóciws T citotóxicos e linfóciws B. Tanto os linfócitos T auxiliares quanto os citmóxicos. ao saírem do timo, são chamados de noives ou ingénuos, pois ainda não sofreram ativação pelo contaro com os antígenos específicos. Ao entrar em contam com um antígeno, ele é ativado e uma resposta primária ocorre. Em dois dias ele se wrna um linfoblasw, de dimensões maiores e sofre uma série de miwses. A interleucina 2 participa de maneira fundamental e wda uma população clonai é gerada. Uma parte das células wrna-se efewra e outra se rransforma em células de memória. Quando novamente expostas ao mesmo antígeno, estas células apresentam resposta secundária e nova população clonai é gerada.
239
LI NFÓCITO B
O lmfóciro Bganha esca denominação porque, nas aves, ele sofre maturação na bursa de Fabricius. Na verdade, o local de maturação na maioria dos mamíferos é a medula óssea. Os linfócitos Bmaduros, liberados para a circulação, caracterizam-se pela presença de moléculas de imunoglobulinas (anticorpos) na sua membrana e pela síntese destas para o meio extracelular. que são glicoproteínas com especificidade antigénica. Assim como no receptor TCR do linfócico T. a imunoglobulina é sintetizada a partir da recombinação de seqüêncras do HLA presentes em diferentes porções do DNA. Nessa recombinação, são geradas duas cadeias idênticas de polrpepcídeos, chamadas de pesadas, e outras duas cadeias idênticas. chamadas de leves. Na porção terminal de cada uma dessas cadeias é que se encontra a região que irá se ligar ao anrígeno e que possui uma especificidade definida. Estima-se que um total de 10 11 anticorpos com diferences especificidades possa ser gerado. Todo esse mecanismo, também chamado de rearranjo do gene da imunoglobulina. ocorre na medula óssea. O linfócito B que sai da medula óssea apresenta as moléculas de imunoglobulinas ligadas à sua membrana celular. Esses linfócicos são chamados de noives ou ingénuos, por não terem ainda encontrado um antígeno com especificidade para sua 1munoglobulina. Sua meia-vida no plasma é muito curta (três dias a oito semanas) se não encontrar um antígeno. No momento que encontra um antígeno, ele sofre ativação, proliferação e diferenciação. gerando uma população de células especializadas em produzir anticorpos circulantes, os plasmócitos, e uma ouua população que conservará a capacidade de produzir anticorpos quando encontrar no futuro o mesmo antígeno, que são os linfócicos Bde memória. Também aqui ocorre um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno e a chamada uoca de classes das imunoglobulinas. Além da capacidade de secreção de anticorpos. os linfóCitoS Btambém podem apresentar antígenos. No momenco em que um antígeno é ligado à cadeia de lmunoglobulina presente na membrana, esse complexo é internalizado, processado e peptídeos resultantes do antígeno são apresentados pelas moléculas de HLA classe 11 aos linfócitos T auxiliares. Quando ocorre a interação linfócico Be linfócico T auxiliar, este último secreta uma série de citocinas que concribui para a ativação do linfócico B. Assim, na ativação dos linfócicos B, os linfócicos T auxiliares são adjuvantes es-
240 ( Medicina laboratorial para o cl ínico
senciais. Embora possa ocorrer ativação dos linfócitos B independentemente dos linfócitos T. a presença deste último é fundamental para a geração da "memória imunológica". Assim como nos linfócicos T, uma proporção dos linfócitos Bproduzidos na medula óssea tem afinidade contra antígenos presentes no organismo. Ocorre ainda dentro da medula óssea uma seleção negativa, onde esses linfócrtos B"auto-rearivos" encontrando antígenos próprios (se/f) na medula óssea entram em apopmse e são eliminados.
LINFÓCITO NK
Os linfócicos NK ou matadores naturais são células com características únicas. Não expressam o receptor da célula T ou imunoglobulina na sua superfície, não tendo, por isso, especificidade. Constituem até 10% dos linfócitos Circulantes. Originam-se de precursores comuns dos linfócitos presentes na medula óssea. Foram descobertos em 1976, ao se observar a presença de linfócicos com capacrdade crtotóxica conrra tumores na ausência de imunização prév1a. Eles atuam por dois mecanismos discinros. Podem reconhecer a ausência ou redução de moléculas do sistema HLA na superfície das células (recurso relativamente comum empregado pelos tumores para escapar do sistema imune). Nesse pomo, recepcores inibidores presentes na superfície do linfócito NK (que normalmente se ligam às moléculas do HLA de classe I) não encontram o seu ligante e são aeivados, levando ao apopcose da célula alvo. Alternativamente, o linfócito NK pode exercer sua atividade através da cicotoxicidade anticorpo-dependente, em que pode reconhecer anticorpos ligados a tumores ou a células infectadas por vírus e que já renham sido reconhecidas pelo siscema imune.
REFERÊNCIAS 1. 2.
3.
4.
Ho AD. Kinetics and symmetry o f divisions of hematopoletic stem cells. Exp Hematol. 2005;33:1-8. Quesenberry PJ. Colv1n G. /\bed1 M. Perspective: funda · mental and cllnical concepts on stem cell homing and engraftmem: a JOurney to n1ches and beyond. Exp Hematol. 2005;33:9-19. Shizuru )A, Negrin RS, We1ssman IL. Hemarop o1et1c stem and progenitor cells: cl imcal and preclln1cal regenera· tion o f the hematolym pho1d system. Annu Rev Med.
2005;56:509-38 We1ssman IL. Stern cells: umts of developmem, units of re· generation, and units in evolunon. Cell. 2000;100:157·68.
)1--- - -- - - - - -- - - - - - -- - - - - - - - -- - - - -
Marcelo Eduardo de Lima Souza Rosa Ma/ena De/bane de Faria
22
O ESTUDO DO SANGUE PERIFÉRICO
ATRAVÉS DO HEMOGRAMA
O hemograma é o conjunto de análises de parâmetros quantitativos e morfológicos das células sanguíneas, composto de eritrograma, leucograma e contagem de plaquetas. Foi desenvolvido ao longo de décadas, desde o relato da primeira contagem de eritrócitos, em 1852, por Vierordt, seguida, pouco depois, pela contagem global de leucócitos. Preyer, em 1871, descreveu o primeiro método para a dosagem de hemoglobina e Ehrlich, em 1877, elaborou o primeiro corante que permitiu a diferenciação dos leucócitos, melhorada pelo uso do corante de Romanowsky, uma associação de azul de metileno e eosina. Esse corante foi posteriormente modificado por vários pesquisadores, que criaram os diversos corantes panópticos hoje utilizados para a contagem diferencial manual de leucócitos. No início da década de 1970, foi desenvolvido o primeiro equipamento que permitiu a automatização parcial do hemograma, com a introdução, na década seguinte, da automação completa, inclusive para a diferenciação de leucócitos. À introdução de cada nova tecnologia para a realização do hemograma seguiu-se a diminuição do tempo despendido e da dificuldade para a realização do exame. Isto trouxe uma massificação do uso do hemograma, que passou a integrar a "rotina" de avaliação laboratorial de todos os pacientes, gerando custos para o sistema de saúde nem sempre justificáveis. Sem dúvida, diversas siruações clínicas e epidemiológicas, exposição a agentes tóxicos para medula óssea, entre outras, são indicações para a realização do hemograma, de forma periódica e justificada. Não há, conrudo, lugar para a realização de hemogramas
indiscrim inadamente na prática da Medicina baseada em evidências. Tal como os demais exames complementares, o hemograma deve ser solicitado com o objetivo de confirmar ou afastar uma hi pótese diagnóstica.
PROCESSAMENTO DO HEMOGRAMA A determinação dos vários parâmetros que compõem o hemograma pode ser feita de duas fo rmas: manual e automatizada. Ainda que a contagem automatizada seja mais rápida e mais precisa, os métodos manuais não podem ser de rodo abandonados, por serem necessários em siruações específicas, que serão discutidas adiante, nas quais o método automatizado está suscetível a erros. Diante dessas situações, cabe ao profissional do laboratório tomar a decisão de usar a metodologia manual, não sendo necessário que o médico-assistente solicite especificamente a adoção do método manual (já que os laboratórios de hemarologia bem estrururados dispõem de protocolos para essa cornada de decisão).
MÉTODOS MANUAIS Contagens manuais de células
São realizadas diluindo-se o sangue e depositandose a diluição em um hemocirômerro ou câmara de
comagem de células. A mais com um é a câmara de Neubauer, que se assemelha a uma lâmina de microscopia, mas mais espessa e com plarôs lacerais sobre os quais se fixa uma lamínula. Emre os plarôs larera1s há uma área rebaixada em 0.1 mm, onde há o desenho de um recículo de 9 mm quadrados que, por sua vez. é d1v1d1do em nove parres menores que 1 mm quadrado cada. As contagens são rea lizadas em um ou mais retículos, específicos para cada elemento figurado e os resu ltados expressos em número de células por mm cúbico, em unidades convencionais, ou litro, no caso de un1dades internacionais. Apresentam várias causas de erro, que devem ser afastadas: diluição imprecisa, preenchimenro incorrero da câmara, distribuição errónea das células nos quadrados da câmara e erros de identificação do elemento figu rado, que ocorre principalmente no caso das plaquetas. Desce modo, a concagem manual de células e plaquetas deve ser rescrita a sicuaçàes onde a contagem auromatizada apresenta grande possibilidade de erro.
Dosagem de hemoglobina
Realizada por mérodo colorimétrico. O sangue é diluído em uma solução com cianero de pocássio e ferrooanero de potássio, que converte a hemoglobina em oanomecahemoglobina. A seguir, a absorbância da solução é med1da em especcrofotômetro, em comprimento de onda de 540 nm e a dosagem da hemoglobina obtida pela comparação da absorbância da solução freme a uma curva de calibração. O resultado é expresso em g/dl ou g/L.
M enisco
100%
Plasma Plaquelas Leucócitos ---llorl:--
-
---
45%
Hematócrito
0%
Figura 22.1 - Represemação esquemática da centrifugação do sangue rotai para obtenção do hematócrito.
Contagem diferencial de leucócitos
É feita pela identificação de cada leucómo quan-
ro ao tipo celular (neucrófilos, eosinófilos, basófi los. monócitos e linfóciros), ao estágio de maturação e à presença de alterações morfológicas celulares. São contados e classificados separadamente, 100 ou 200 leucócitos, observando-se critérios para evitar que a discribuição irregular dos leucócitos no esfregaço Introduza um viés por erro de amoscragem maior que o existente. Esse erro de amoscragem ocorre porque a contagem diferencial de 100 ou 200 células é pequena diante do número global de leucóciws. A contagem diferencial de um número maior de leucóciws reduziria essa causa de erro, mas a relação cusw/benefício desse procedimenco não o JUStifica.
Avaliação quantitativa das plaquetas pelo exame do esfregaço de sangue O hematócrito É medido. manualmente, pela centrifugação a altas rocaçàes por minuco. de um cubo capilar com o sangue rotai do paciente. Após a centrifugação, a alcura da coluna de eritrócicos compactadas é medida e comparada com a alcura da coluna do sangue rotai, agora separado em crês camadas: emrócicos; leucóciros e plaquetas; e plasma. O percentual do volume ocupado pela coluna de eritróciros é o valor do hematócriro expresso em percentual ou em fração do volume roral (Figura 21.1).
242 ( Medicina laboratorial para o clínico
Pode ser realizada pelo méwdo de Fônio modificado ou pela contagem do número de plaquetas por campo de maior aumenw, é pouco precisa. mas necessária nos casos de plaquecopenia, para confirmar o resultado obtido por méwdos auwmatizados. Na presença de grande discrepância entre os resultados, está indicada a contagem de plaquetas em câmara de Neubauer. Outro benefício da inspeção do esfregaço no caso de plaquecopenia obtida em contagens auwmarizadas é a pesquisa da presença de grumos de
plaquetas. Esses grumos indicam que a contagem não pode ser relatada e que outra amostra deve ser colhida para realização do exame.
MÉTODOS AUTOMATIZADOS O hemograma é habitualmente realizado em equipamentos auromatizados, que apresentam grande exatidão, precisão e rapidez. Os primeiros equipamentos eram capazes de fazer apenas a contagem de eritrócitos e determinação do volume corpuscular médio, com med1da indireta do hematócrito e contagem global de leucócitos. Posteriormente, foram introduzidas modificações que permitiam também a dosagem de hemoglobina e a contagem de plaquetas. Os equipamentos hoje disponíveis (analisadores hemarológicos) realizam também a contagem diferencial de leucóciros por citomema de fluxo. Para a contagem de células, a impedância elétrica foi o primeiro mérodo a ser largamente utilizado e ainda hoje o é, no caso da contagem de erirrócitos e plaquetas e, em alguns equipamentos. na contagem global de leucómos. O método baseia-se na resistência que os eritrócitos e plaquetas impõem à condução de uma corrente elétrica entre dois eletrodos mergulhados em uma solução eletrolítica: há um elerrodo no interior de um tubo com uma pequena abertura que se comunica com o recipiente onde está a solução na qual se pretende contar as células. Se nenhuma célula há na abertura do tubo, a corrente elémca se faz sem obstáculos entre os do1s elerrodos. Entretanto, se há alguma célula na abertura do tubo, ocorre uma oposição ao fluxo da corrente elétrica. Os analisadores hematológicos comam com um sistema de tubos internos e câmaras. Para que as células sejam contadas, o sangue diluído comido nas câmaras é aspirado para dentro do tubo, de tal forma que se faz um fluxo de um volume pré-determmado da diluição comida na câmara para dentro do tubo. Durante esse fluxo, todas as células que passam pela abertura do tubo geram pulsos de resistência elérrica, que não só são contados, permitindo a quantificação das células, mas também avaliados pela magnitude, fornecendo a determinação do volume da célula que passou pelo tubo de abertura.
O estudo do sangue periférico através do hemograma
Contagens de eritrócitos e plaquetas
São, de modo geral, realizadas em um único sistema, isto é, em mesmo tubo e câmara do equipamento. O sangue é diluído com solução 1sotônica, portanto, incapaz de promover a lise dos erirrócitos, na câmara de diluição, e a diluição aspirada. Todas as partículas com volume de 1 ou 2 a 20 femolitros - fL (variável entre os equipamentos) são contadas como plaquetas e aquelas com volume de 35 ou 50 a 200 fL, como eritrócitos. Esse método permite, por recu rso computacional, a construção de histogramas, gráficos que demonstram a distribuição de freqüência das células quanro ao tamanho (F1guras 22.2 A e 22.2 B).
"'o "ü ·o E Cl>
:r:
50
100
200
300
fl
-º
Cl> :> CT
o
o: hemácios microcíticos
2
10
20
30
fL
Figura 22.2 A - Histogramas de entrómos e plaquetas, demosrrando micromose.
Dosagem de hemoglobina
t realizada a partir da diluição feita para a contagem de leucócitos, por método colonmémco, após d1lu1ção do sangue com solução que lisa os eriuócitos e conver-
243
são da hemoglobina em cianomerahemoglobina. Outros métodos que não usam a conversão da hemoglobina em cianometahemoglobina, mas sim sódio lauril sulfato ou imidazol, foram introduzidos recentemente no mercado.
A contagem diferencial de leucócitos (diferencial de cinco partes. que compreende a separação dos leucóciros por tipo celular) é realizada por um ou mais dos seguintes métodos. pelos diferences equipamentos disponíveis: • dispersão da luz (laser): uriliza o princípio da ciro-
mwia de fluxo para avaliar parâmeuos rais como "'o
'ü
·o
E
(1)
I
50
100
200
300
fl
tamanho. lobulação nuclear e granulosidade pela detecção da luz do laser em quatro ângulos diferentes. Com base na análise da dispersão da luz, os leucócitos são classificados em neutrófilos. linfócitos. monóciros. eosinófilos e basófilos. de acordo com a distribuição das células segundo os parâmetros citados. O gráfico que compara as células de acordo com tamanho e complexidade permite visualizar a distribuição dos leucócitos (Figura 22.3);
Tamanho
2
10
20
30
fl
Figura 22.2 B- Hlsrogramas de emrómos e plaquetas. demosrrando plaquetas g1ganres.
Complexidade
Figura 22.3 - Representação esquemática da separação dos leucócitos por cirometria de fluxo. ve, prancha colonda
Contagem global de leucócitos É realizada no sangue diluído e hemolisado. À câmara onde ocorreu hemólise segue-se um tubo pelo qual a solução é aspirada. Por impedância elétrica, as células com volume entre 35 e 450fl são camadas como leucócitos. Alguns equipamentos que não dispõem de citômerro de fluxo unlizam o volume dos leucócitos para fazer uma "contagem diferencial de três partes", separando-se os leucócitos em três grupos: linfócitos; monócitos. eosinófilos e basófilos; e neutrófilos. respectivamente. Essa "contagem de três partes" é muiro inferior àquela realizada pelos analisadores hematológicos (que fazem "contagem diferencial de cinco partes") e exigem sempre a contagem manual de leucócitos pelo exame do esfregaço sanguíneo.
244 [
Medicina laboratOrial para o clínico
• absorção da luz: alguns analisadores associam à dispersão da luz um segundo canal com uma reação citoquímica na qual a peroxidase de neutrófilos. eosinófilos e monóciros é detectada; • condutividade elétrica: os granulóciros são identificados pela condutividade de uma corrente elétrica de alta freqüência; • impedância elétrica; • radiofreqüência; • fluorescência do DNA. Embora os fabricantes de equipamentos adorem diferences estratégias pela associação de um ou mais princípios à dispersão da luz. os analisadores hematológicos
hoje disponíveis apresentam eficácia semelhante na separação dos tipos de leucócitos. Vários estudos comparativos entre diferences equipamentos mosuam que eles são muito eficazes na contagem diferencial de leucócitos, especialmente quando não há presença de linfócitos reacionais e blastos na amostra, que pode ser suspeitada com mais eficácia em um equipamento do que em outro. Também são razoavelmente eficazes na detecção da presença de neutrófilos mais imaturos (promielócitos, mielócitos e metamielócitos), mas geralmente não o são na detecção de bastonetes, ou seja, muitas vezes são incapazes de detectar desvios à esquerda que ocorram apenas por aumento de bastonetes. Quando há suspeita da presença de uma dessas alterações, os equipamentos em item alarmes (flags) que obrigam à realização da inspeção do esfregaço sanguíneo. Deste modo, os laboratórios de hematologia utilizam critérios para seleção das amostras que deverão ser submetidas à inspeção microscópica, com base nesses alarmes, nas hipóteses diagnósticas onde a avaliação morfológica dos leucócitos pode agregar mais informações, como na suspeita de infecções e doenças hematológicas primárias. Habitualmente, também são usadas como critérios: quaisquer cicopenias, leucocitose, seja pelo aumento do número de um ou mais tipos leucocitários, e alterações nos índices hematimétricos e volume plaquecário méd io (Quadro 22.1).
Quadro 22.1 - Critérios utilizados pelos laboratórios de hematologta para submissão de amostras à microscopia. durante o processamento do hemograma ~~------------------------------
Hipótese diagnóstico Presença de alarmes (flags) emitidos pelo máquina Desvio à esquerda Doenças hematológicos primários Citopenias Leucocitoses Alterações nos índices hemotimétricos Alteração no volume plaquetório médio
--------------------------------.-c]
Concluindo, pode-se afirmar com segurança que a contagem diferencial realizada pelos equipamentos é eficiente, sendo acé melhor que a contagem manual em
O estudo do sa ngue peri férico at ravés do hemogra ma
vários casos, já que o número de células contadas para a classificação dos leucócitos é muito maior do que na contagem manual. mas não é capaz de substituí-la em todos os casos. Por este mocivo, é importante que o laboratório seja informado sobre os dados clínicos e epidemiológicos do paciente, já que esses dados influenciam na tomada de decisão acerca da realização da contagem diferencial manual de leucócitos e análise morfológica dos eritrócitos, além da análise dos resultados liberados pelo equipamento.
CAUSAS DE RESULTADOS ERRÔNEOS EM MÉTODOS AUTOMATIZADOS
detecção de causas de erro nos hemogramas automatizados deve ser feita pelos profissionais do laboratório que, ao perceberem-nas, devem adorar medidas que vão desde a solicitação de nova amostra até a adoção de métodos manuais. Contudo, também é conveniente que aqueles que analisam os resu ltados de seus pacientes tenham conhecimento das limitações do exame. A
Importantes causas de erro
Fase pré-analítica:
• amostra identificada incorrecamente; • amostra diluída, isco é, colhida em veia onde há infusão de líquidos; • hemoconcencração por escase venose decorrente do uso prolongado do torniquete; • amostra hemolisada; • coagulação parcial do sangue, que pode ocorrer em casos de punções venosas difíceis; • amostras velhas, mantidas a temperatu ra ambiente por 24 horas ou em geladeira por 48 horas, são inadequadas para análise, pois ocorre lise dos leucócitos nessas situações, ocasionando contagem de leucócitos falsamente diminuída, com contagem diferencial prejudicada pelas alterações morfológicas e falso aumento da contagem de plaquetas, uma vez que fragmentos dos leucócitos podem ser contados como plaquetas;
245
• características intrínsecas da amosua do paciente, tais como: hemólise in vivo, lipemia, proteínas anómalas, fragilidade dos leucócims (observada na leucemia hnfóide crónica, em algumas leucemias agudas e. algumas vezes. no paciente urêmico em uso de imunossupressores), ecc. É importante lembrar que as contagens aummatizadas de plaq uetas em pacientes com leucemias devem ser sempre confirmadas por mémdo alternativo, uma vez que blasms frágeis podem se fragmentar durante o processamento da amostra pelo equipamento. Esses fragmenms de células são contados como plaquetas, gerando valores acima do real, o que pode induzir ao erro de não se prescrever transfusão de concentrados de plaquetas em situações nas quais a transfusão é necessária. Fase analítica:
• mau funcionamento do contador aucomarizado de células; • manipulação incorrera do equipamento; • Interpretação incorrera dos resultados do comador automatizado; • não realização de exame microscópico do esfregaço sanguíneo; • Interpretação errónea do exame microscópico (realizada por examinador não qualificado). Fase pós-ana/itrca:
• • • • •
transcrição/digitação do resultado; fornecimento verbal do resultado; fornecimento telefónico do resultado; transmissão do resultado v1a fax; transm1ssão do resultado via Internet. ainda que hoJe seja bastante segura.
O Quadro 22.2 apresenta o impacm no hemograma. das condições mais comuns de erro. na maioria dos equipamentos. As alterações artificiais da contagem de eritrócims. dosagem de hemoglobina e hematócrim repercutem nos índ1ces hematimérricos. como se discutirá adiante.
ERITROGRAMA
O eritrograma é a parte do hemograma que avalia a série erirrocítica e compõe-se da contagem de eritrócicos. dosagem de hemoglobina. determinação do hemacócrito e índices hemacimétricos.
ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS Volume corpuscular médio {VCM)
O VCM foi proposm inicialmente por Wintrobe e calculado a parm da contagem de eritrócims e hematócrim, refletindo o volume médio dos eriuócims. O cálculo aplicado é: VCM = (hematócrito x 10) I contagem de eritróciros em milhões por mm 3. O resultado é expresso em fL ou 1-1m 3. Arualmente. como os equipamenms já determinam o VCM. ocorre cálculo inverso: o hematócrim aummanzado é obtido pela fórmula: Hematócrico = (VCM x contagem de eriuócims em milhões por mm 3)/ 10, com hematócriro expresso em valor percentual ou fração de volume. O VCM é parâmetro muim útil na classificação das anemias. permitindo diferenciá-las em microcíticas, quando o VCM encontra-se abaixo do valor de referência. normocíticas (dentro dos limites de referência) e macrocíticas, quando aoma do valor de referência. A determinação do VCM não é útil apenas para o médico-assistente: valores alterados permitem ao profissional do laboratório. após inspeção do esfregaço. identificar possíveis causas de erro. Quando determinado por método auwmatizado. são as seguintes as causas de erros: • aumento artificial: auroaglunnação de eritrócicos. leucocicoses extremas, plaquetas gigantes em grande número e hiperglicemia maior que 600 mg/dl; • diminuição artificial. pelos mesmos mo(lvos que causam a falsa diminuição da contagem de enrróciros.
Hemoglobina corpuscular média ( HCM)
O HCM é a medida da massa de hemoglobina presente, em média, nos eritróciros. Embora seja parâmetro pouco útil para o clínico. é útil para o prof1ssional do la-
boratório como um indicador de conuole da qualidade dos analisadores hemarológicos. É calculado pela seguinte fórmula: HCM = (hemoglobina em gldl I contagem de eriuóciros em milhões por mm 3) x 10. O resultado é expresso em picogramas (ou micromicrogramas).
É também indicador importante para a detecção de
causas de erro, já que não há possibilidade de resultados superiores a 37,5gldL, ponto de saturação da hemoglobina. Amostras com esses resultados devem sempre ser avaliadas quanto à presença de interferentes, o que faz com que esces dois últimos parâmetros (HCM e CHCM) sejam importantes para a avaliação da confiabilidade de um determinado resultado.
Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) RDW (red ce/1 distribution width)
Mede a concenuação média de hemoglobina nos erirróciros. Auxilia na classificação das anemias em normocrômicas ou hipocrômicas. mas muitas vezes não se correlaciona de modo perfeiro com a observação de hipocromia no esfregaço de sangue. É calculado a partir da hemoglobina e hematócriro: CHCM = (hemoglobina em gldl I hematócriro em %) x 100. com resultados expressos em gldL. Encontrase diminuído nas anemias microcíticas e hipocrômicas, mais freqüentemenre na anemia ferropriva do que nas demais. Contudo, sua utilidade no diagnóstico dessa condição é pequena, já que a queda do CHCM nesses casos ocorre mais tardiamente do que a queria elo VCM. No caso de esferocitose, pode apresentar valores acima de 36gldL.
Trata-se da variação da distribuição dos eritróciros quanto ao tamanho e reflete, de forma matemática, a diferença do tamanho dos eritróciros de uma determinada amosua (anisocirose), com resultado expresso em valores percentuais, com valores de referência de 11,5 a 15,5% Apresenta alguma utilidade na classificação das anemias microcíticas, já que, habitualmente, é maior nas anemias ferroprivas do que nas talassem ias e anemias de doença crônica. Sua eficácia na distinção dessas condições é razoavelmente baixa, mesmo quando se empregam fórmulas matemáticas que correlacionam RDW e V('M 011 hemoglobina, isto é. não permite, por si só. classificar uma anemia microcítica como ferropriva ou não e não dispensa a avaliação da cinética do ferro.
Quadro 22.2- Causas comuns de erro no hemograma automa[izado Erros
Condições presentes na amostra
Aumento de leucócitos
Amostro colhido em heporino, e presença no amostro de: poroproteínos, crioglobulinos, criofib rinogênio, eritroblostos circulantes, grumos d e plaquetas, eritrócitos resistentes à lise (comuns em RN). fibrino
Diminuição de leucócitos
Coágulo. fragilidade dos leucócitos, oglulinoçã o de leucócitos por outo·onticorpos
Aumento de eritrócitos e hemo· tócrito
Plaquetas gigantes, leucocitose (tão mais importante quanto mais g rave o anemio). criog lobuli· nos, criofibrinogênio, lipemio, :>oroproteinemios
Diminuição de eritrócitos e hemotócrito
Criooglutininos, hemólise in vitro. microcitose extremo, coágulo
Aumento de hemoglobina
Leucocitose (tão mais importante quanto mais intenso e mois g rave o anemio). crioglobulinos, criofibrinogênio, lipemio, poroproteínos, amostro hemolisodo
Diminuição de hemoglobina
Coágulo
Aumento de plaquetas
Crioglobulinos, criofibrinogên io. hemólise in vivo e in vitro, microcitose extremo, fragmentos de leucócitos
Diminuição de plaquetas
Coágulo, p laquetas gigantes, grumos de p laquetas, aglutinação ploquetário induz ido pelo
EDTA
O estudo do sangue periférico auavés do hemograma
247
Para o profissional do laboratório. é útilcomo indicador da necessidade de avaliação morfológica dos eritróciros.
AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ERITRÓCITOS
cias entre diferences observadores, mesmo experientes. quando as alterações são pequenas. A variação de tamanho do eritróciro é melhor percebida pelo contador eletrônico do que pelo olho humano, ao microscópio. Portanto, o RDW fornecido pelo
contador eleuônico é superior ao regisuo de anisocimse. A avaliação morfológica dos eritrócitos é feita pelo exame microscópico do esfregaço de sangue corado pelos corames panópticos. A inspeção é realizada na transição emre "corpo e cauda" do esfregaço. onde os eritróciros estão próximos uns dos outros. sem superposição (que ocorre na "cabeça" do esfregaço) e sem alterações de forma determinadas pela forças físicas envolvidas na distensão do sangue. que ocorrem na "cauda". São avaliados: tamanho, coloração, forma dos entrócitos e inclusões citoplasmáticas. As figuras 22.4 A e B ilustram algumas alterações morfológicas eritrootárias. Os eritrócitos morfologicameme normais são normocíticos e normocrômicos (apresemam coloração habitual e, portamo, comeúdo normal de hemoglobina). Os laboratórios de hemarologia adoram duas posturas diferences quando deparam com avaliação microscópica dos eritróciros normal, ao esfregaço: alguns relatam normocitose e normocromia. outros não fazem menção a essa condição e relatam apenas evemuais alterações encontradas. Em ambos os casos. de alguma forma deve ficar claro para o clínico que a avaliação microscópica foi realizada.
feito pelo examinador, resultante da análise do esfregaço ao microscópio. As condições clínicas mais freqüentemente associadas a essas condições estão descritas no quadro 22.3.
Avaliação da coloração dos eritrócitos
Quanto à coloração. os eritróciros podem ser avaliados por: • conteúdo de hemoglobina. classificadas como normocrômicas, quando a palidez central característica das eritrócitos não ultra passa o terço médio do diâmetro da hemácia; e hipocrômicas, quando a palidez central é maior. A hipocromia traz como conseqüência a microcitose, pois 95% do peso seco da hemácia correspondem à hemoglobina; • policromatofilia ou policromasia. condição na qualas eritrócitos apresentam cor róseo-azulado como conseqüência da presença de RNA ribossomal residual. São eritrócitos jovens que, em colorações supravita1s específicas, apresentam-se como renculómos.
Avaliação do tamanho dos eritrócitos Avaliação da forma dos eritrócitos
Normalmente, os eritróciros apresentam pequena variação de tamanho, decorrente do envelhecimento da célula: os eritróciros mais jovens são maiores e os mais velhos menores. Essa condição é denominada anisocirose fisiológica, que não é relatada pelos microscopistas. A presença de anisocirose significativa é relatada quando os eritrócitos apresentam variação de tamanho ma1or que a habitual. Pode ser decorrente de microcitose, macrocitose ou de ambas. O parâmetro para avaliação do tamanho dos eritrócitos, ao microscópio, é o tamanho do núcleo do pequeno linfócitO. que tem o diâmetro aproximado de 8,5 J..lm, enquanto os eritrócitos de tamanho normal têm o diâmetro médio de 7,2 J..lm. Como se pode prever, há razoável grau de subjetividade, não sendo incomuns as divergên-
248 [Medicina laboratorial para o clínico
No esfregaço de sangue normal. os eritrócitos são, em sua maioria, circulares. com palidez central, decorrente de sua forma tridimensional de disco bicôncavo. Uma minoria deles (até 10%, em pessoas sadias) apresenta forma ligeiramente ovalada, também com a palidez central. Em condições anormais, os eritróciros podem assumir formas diferentes, sendo chamados de poiquilócitos, cuja presença é denomi nada poiquilocirose. Alguns poiquilóciros são comuns a várias condições diferentes e, portantO, têm menor significado clínico quanto à orientação acerca da causa de anemia. lsro é o que ocorre com ovalóciros (ou eliptócicos). que podem também ocorrer em pequena proporção em pessoas sadias; e os equinócitos (ou eritróciros crena-
das), que mu itas vezes são artefa ruais, seja por armazenamento prolongado do sangue, seja por excesso de anticoagulante ou por artefara devido contara com álcool utilizado para a punção venosa, durante a confecção do esfregaço. Outros poiquilóciras, como os esferócitos e os drepanóciws (eritróciws falciformes), fornecem informações cl ínicas importantes para prosseguir-se uma investigação diagnóstica. Além dessas condições clín icas, há que se fazerem ressalvas com relação ao exame microscópico de eritróciras de recém-nascidos: são freqüentes os poiquilóciras (equinóciros, esferóciros e esquizócitos em pequena quantidade), sem significado clínico. O Quadro 22.4 associa os diferentes poiquilóciros às condições clínicas em que ocorrem.
Inclusões e ritrocitárias
Inclusões que podem ser observadas no citoplasma dos eritróciros fornecem importantes informações clínicas. São elas: • corpúsculo de Howell-)olly: inclusão citoplasmática redonda, basofílica, geralmente única e intensamente corada. Trata-se de fragmento de material nuclear, presente em pequena quantidade de eritrócitos na medula óssea de pessoas sadias, mas não é observado no sangue periférico, uma vez que é removido pelo baço. É encontrado
no sangue periférico nas seguintes condições: eritropoese acelerada, como a que ocorre nas crises hemolíticas agudas; asplenia seja por esplenecromia ou aura-esplenectomia da anemia falciforme; eritropoese extramedular, que ocorre na mielofibrose primária; • pontilhado basófi lo: pequenas inclusões basofílicas dispersas no ciraplasma do eriuócira, compostas de agregados de ribossomas. Coram-se pelos corantes básicos pelo RNA ribossomal. Demonstram a existência de eritropoese acelerada e/ou diseritropoese. Aparecem nas anemias megaloblásticas, talassem i2s, hemoglobinas instáveis e anemias hemolític2s; • corpúsculo de Pappenheimer (ou side rassema): é inclusão basofílica composta de agregados de ferritina. Os eritróciros que os contêm são chamadas sideróciros. Não são habitualmente visíveis nas colorações panópticas, sendo melhor evidenciados pela coloração ciroquímica para demonsuação de ferro (coloração do azul da Prússia). Aparecem nas anemias sideroblásticas e intoxicação pelo chumbo; • anel de Cabot: é estrutura em forma de anel ou oiro, de cor vermelha ou púrpura, remanescente do fuso mitótico. Sempre está relacionado com eri uopoese anormal e aparece nas anemias megaloblásticas, inroxicação pelo chumbo e outras anemias diseritropoéticas;
Quadro 22.3- Alterações morfológicas dos eritrócicos quanto ao tamanho (causas mais freqüences) Causas de microcitose Congênitos
Adquiridos
Ta lassem ias Doença do hemoglobina E Anemia sideroblástico congênito
Anemia ferroprivo Doenças crônicos Hipertireoidismo Intoxicação pelo chumbo Síndrome mielodisplásico
O estudo do sangue periférico através do hemograma
Causas de macrocitose Congênitos
Anemio de Blockfon-Diomond Síndrome d e Down
Adquiridos
Hemorragias Anemia s hemolíticas Anemio megoloblástico Síndrome mielod isplásico Doenças hepáticos Alcoolismo Uso de fenitoíno Uso de drogas que interferem com o síntese de DNA (quimioterápicos, imunassupressores, ontiretrovirois)
249
Quadro 22.4- Signtficado clímco da potqudomose Poiquilócito
Condições nas quais ocorrem
Ovolócrtos ou eliptócitos
Anemio ferrop rivo, talassemia, anemio megoloblástico, ovolocitose hereditário
Equinócitos ou eritrócitos crenodos
Hepotopotio (principalmente quando associado á insuficiência renal). que,modu ros extensos, deficiência de algumas enz:mas eritrocitár,os
Esferócitos
Esferocitose hereditário, anemio hemolítica auto-imune, transfusão de concentrado de entrócitos
Esqurzócrtos ou entrócitos fragmentados lburr cells, helmet cellsl
Anemias hemolíticas microongiopálicos (CIVD, síndrome hemol ítico·urêmico). hemólise mecônrco (como próteses de válvulas ca rdíacos)
Drepanócitos ou eritrócitos falciformes
Doença folciforme.
Acontócrtos
Acontocrtose hereditário, hipobetolipoproteinemio hereditário, desnutrição, distúrbios do metabolismo lipídico secundários à d oença hepático
Do criócitos ou eritrócitos em goto
Mielofibrose (primário ou secundário). talassemia major, anemio megoloblástico
Cod ócitos ou eritrócitos em alvo
Icterícia obstrutivo, doenças hepático s, doença do hemoglob nc C doença ·a dor me, tolossemros. deficiência oe lec:tino-co esterot-oc;l-tronsfe,ose
Estomotócitos
Estomotocitose hereditário, doença hepá ico a lcoólico, outros doenças hepáticos avançados
Ouerotócrto ou hemácro "mord ida·
Delrcrêncio de gkose-6-fosfoto-desidrogenose
Figura 22.4 A - Foromrcrografia de esfregaço de sangue penfénco mamando esferómos, antsomose e policromamfilia. Ver prancha colouda
• microrganismos: parasiws tmra-erirromarros como o plasmódio, nas diversas formas da malária, e a Babesia sp podem ser observados no esfregaço de sangue periférico na presença dessas infecções. Comudo, para o dtagnósrico da malária, o mérodo mats sensível é o exame da gora espessa. Ourros parasiros, como as filárias e os rripanossomas, podem ser observados ao exame do esfregaço, mas não são parasiws imra-erirrocirários. Outros achados importantes:
250 [ Medicina laboratorial para o clínico
• erirroblastos circulantes: não são visros no sangue de pessoas sadias, excero no caso de recém-nascidos. Sua presença indica erirropoese acelerada, infiluação da medula óssea ou eriuopoese exrramedular. A exrsrência de numerosos erirroblasros circulames é achado caracrerísrico das crises hemolíricas; • formação de rouleaux: consisre na presença de pilha de eri rrócitos. Aparece nas anemias graves e nas condições em que há aumento de proreínas plasmáricas - como o fibrinogênio, reagenre de
fase aguda e hipergamaglobulinemias do mieloma múltiplo e outras gamopatias.
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
mas o alro custo do método automático faz com que ele não seja usado na maioria dos laboratórios. O resultado da contagem de reticulócitos é expresso em percentuais e abordagens diferentes são utilizadas para sua interpretação:
• considerar apenas o valor da contagem percentuA contagem de reticulóciws não Faz parte do hemograma, mas, por motivos didáticos, faz parte deste capítulo. Reticulócitos são eriuóciros jovens que apresentam RNA ri bossomal residual. São normalmente liberados pela medula óssea e terminam a maturação celular (síntese de hemoglobina e desaparecimento dos ribossomas) em aproximadamente 72 horas após a entrada na circulação. Em condições normais, são retidos pelo baço por 24 a 48 horas, sendo que nas últimas 24 horas de amadurecimento, ames da transformação em eritróciros maduros, aparecem no sangue circulante. Quando a quantidade de RNA residual é grande, esses eritrócitos jovens são vistas como policromatófi los no esfregaço de sangue corado pelos corantes panópticos. Essa coloração, contudo, não é adequada para a correta detecção dos reticulócitos, que são mais bem evidenciados por coloração supravital com o "novo azul de metileno" ou azul de cresil brilhante. Nessas colorações supravitais, duas a três gotas do sangue em EDTA são incubadas com volume semelhante de solução de um desses corantes, a 37°( por 15 minutos. Após a incubação, é feito um esfregaço, que é seco ao ar e examinado ao microscópio com objetiva de grande aumento. Nesse aumento, os reticulócitos ap resentam-se como eritrócitos com grânulos azulados, que nos reticulócitos mais imaturos são numerosos e formam grumos ou filamentos reticulares. Nos reticulócitos mais maduros, apenas alguns poucos e pequenos grânulos são vistos. A contagem de reticulócitos manual é feita à microscopia, estabelecendo-se seu percentual entre a popu lação de eritrócitos. Habitualmente, são contados 1.000 eritrócitos e diferenciam-se entre eles os que são maduros dos que apresentam grânulos ou retículos, conhecendo-se, assim, o percentual de reticulócitos. A contagem manual apresenta alto coeficiente de variação, de até lO% em diferences contagens do mesmo observador. Isto não ocorre com as contagens automatizadas disponíveis nos analisadores hematológicos mais modernos, por citometria de fluxo com fluorescência,
O estudo do sangue perifé rico através do hemograma
al de reticulócitos, com valor de referência de 0,5 a 1,5%. Essa análise traz consigo um viés na avaliação da interpretação do resultado no caso de pacientes anêmicos, como demonstrado a seguir. É a forma rotineira que a maioria dos laboratórios libera seus resultados, cabendo ao clínico aplicar uma das abordagens a seguir; • correção do valor percentual pelo valor do hematócrito: consisre em ponderar a contagem de reticulóciros pela imensidade da anemia, obtendo-se o chamado "índice rericulocirário", que é calculado da seguinte forma: Índice reticulocitário = percentua l de reticulácitos x hematácrito do paciente I hematácrito normal
Considera-se como hematócrito normal o valor de líS%, sendo o valor de referência do índice reticulocitário de 1,0%. Assim, um paciente com contagem de reticulócitos de 1,5%, mas com hematócriro de 25%, apresenta o seguinte índice reticulocitário: 1.5% x 25% I 45% = 0,8%, demonstrando-se que não há eritropoese suficiente para corrigir a anemia. Observe-se que ,analisando apenas o valor percentual da contagem de reticulócitos, o resultado permitiria a interpretação de uma eritropoese normal, o que, no caso, não é real; • conversão do valor percentual em valores absolutos, pela seguinte fórmula: Contagem absoluta de reticulácitos = (contagem de eritrócitos x contagem percentual de reticulácitos) I 100
com valor de referência de 50.000 a 100.000 por ~m3. Desta forma, um paciente com contagem de eritrócitos de 2.250.000 por ~m 3 e contagem percentual de 1,5% tem 33.750 reticulócitos por ~m 3 . Essa forma de interpretar a contagem de reticulóciros ta mbém permite a sua avaliação levando-se em conta o grau de anemia do paciente.
251
Dá-se o nome de reticulocitopenia à diminuição dos valores de rericulóciws e reticulociwse ao seu aumento. A contagem de reticulócims permite avaliar a resposta da medula óssea diante do quadro de anemia e, com isto, auxiliar na classificação das anemias, dividindo-as em regenerativas e h1porregeneracivas ou arregenerativas, além de permitir avaliar resposta ao tratamento eficaz. Eum exame laborawnal de baixo custo, disponibilizado pelo SUS e de grande contribuição no diagnóstico e seguimento das anemias.
acompanha esse aumento a presença, em menor ou maior número, de metamielócitos, mielóciros e pró-mielócicos. Agumas das principais situações que justificam o desvio a esquerda: • infecções baccerianas; • reação da medula óssea à infiltração neoplásica; • hiperregeneração medular, v1sta nas anemias hemolíticas; • resposta aguda ao trauma.
LEUCOGRAMA Consiste na contagem global e diferencial de leucócitos, por mécodo manual ou automático, como já apresentado anteriormente. A contagem d1ferencial de leucócitos visa classificá-los quanto aos tipos celulares e estágio de maturação e identificar atipias celulares e inclusões citoplasmáticas. Quanto à morfologia. os leucócitos são classificados em polimorfonucleares e mononuleares. Polimorfonucleares são os leucócitos que, no seu estágio maturativo mais avançado, apresentam o núcleo com segmentações e compreendem os seguintes tipos celulares: neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Leucóciws mononucleares são aqueles que não apresentam lobulação nuclear: monócitos e linfócitos (Figura 22.5). Figura 22.5 - Representação esquemática das células do sangue. A: erirróciro; B: neutrófilo segmentado; C: eosinófilo; D: basófilo; E:
NEUTRÓFILOS São os leucócitos mais populosos entre os adulcos. Apresentam o ciwplasma róseo, com grânulos finos azulados. Quanto à segmentação nuclear, são classificados, por ordem crescente de maturação, como mielócitos (núcleo esférico ou levemente achatado), meramielócicos (núcleo reniforme), bastonetes (núcleo em forma de bastão, geralmente encurvado) e segmentados, mais maduros, com dois a cinco lóbulos. No esfregaço de sangue normal. predominam os neutrófilos segmentados, com pequena presença de neutrófilos bastonetes (vide valores de referência. por faixa etária). Eventualmente. pode ser visto metamielócito ou mielócico ao exame do esfregaço. sem implicações clínicas. Dá-se o nome de desvio à esquerda ao aumento do número de bastonetes neutrófilos no sangue circulante. Quando é acentuado, com alco número de bastonetes,
252 [ Medicina laboratorial para o clínico
monócito; F: linfóCito; G: plaqueta. Vet ptancl1o to:o,•tiO Alterações morfológicas dos neutrófilos: são detectadas ao exame do esfregaço, sendo as mais importantes: • granulação tóxica: trata-se da persistência de grânulos azurófdos no citoplasma de neutrófilos maduros, com coloração azul-escuro. Ocorrem em infecções bacterianas e outros estados inAamatórios que demandam granulopoese acelerada. Habitualmente. quando presente. é relatada de forma semiquanmat1va: d1screta, quando presente em 5 a 25% dos neutrófilos; moderada, entre 26 e 50% dos neutrófilos; moderadamente acentuada, entre 51 e 75%; e acentuada. quando presente em 76 a 100% dos neutrófilos. De modo geraL é mais acentuada quanto mais imenso o processo desencadeante. Contudo, não deve ser usada como parâmetro de gravidade do processo infeccioso ou inflamatório, por ser variável em diferentes baterias de colorações, devido à variabilidade e instabilidade das características tinto-
•
•
•
•
•
•
•
riais em colorações realizadas em diferentes momentos. Quero motivo para evitar sua valorização excessiva é a natural e esperada subjetividade que ocorre entre diferentes observadores; corpúsculo de Dõhle: estrutura redonda. oval ou fusiforme, azul-pálido e geralmente única, algumas vezes encontrada na periferia de neutrófilos em Infecções bactenanas; vacuolização citoplasmática: é observada em infecções bacterianas graves, geralmente acompanha-se de granulação tóxica. representando processo de autólise; outras inclusões citoplasmáticas ocorrem em anomalias hereditárias. como nas anomalias de ChediakH1gash1, de May-Hegglin e de Alder-Reilly. que além dessas 1nclusões apresentam outras alterações laboraronais e/ou clínicas. Essas inclusões podem aparecer também em outros leucóciros; hipogranulação de neutrófilos: caracteriza-se por palidez do citoplasma ou pouca evidenciação dos grânulos neutrofílicos. Pode ser encontrada nas síndromes m1elod1splásicas e nas síndromes mieloproliferativas. espec1almeme na leucemia mielóide crônica; bactérias e fungos: eventualmente. em quadros de sepsis graves. bactérias podem ser observadas nos citoplasmas de neutrófilos. Em casos de hisroplasmose disseminada e grave, como pode ocorrer em pacientes gravemente imunossuprimidos, são observadas estruturas redondas ou ovóides. com evidência de cápsula. sugestivas de Histoplasma capsulatum; hipersegmentação de neutrófilos: mais de S% de neutrófilos com cmco lóbulos nucleares ou um neutrófilo com seis ou mais lóbulos caracteriza a hipersegmemação. que ocorre freqüentemente nas anemias megaloblásticas; anomalia tipo Pelger-Huet: caracteriza-se pela diminuição da lobulação nuclear. que pode se manifestar ramo na presença de numerosos neutrófilos com núcleos na forma de bastão (com poucos neucrófilos com núcleos bi e trilobulados) até diante de vários neuuófilos com núcleo redondo ou ovóide, pequeno e com cromatina organizada em grumos grosse1ros. na completa ausência de neutrófilos segmentados. Como condição hereditár a e benigna. ocorre na anomalia de Pelger-Huet. completamente assintomár1ca. De forma adquirida, acompanha situações neoplásicas. como as
O estudo do sangue periférico através do hemograma
síndromes mielodisplásicas e mieloproliferativas crônicas. No caso da anomalia de Pelger-Huet, quando heterozigora, pelo faro de haver numerosos núcleos com a forma de bastonetes, há possibilidade de caracterização de um falso desvio à esquerda; • picnose nuclear: demonstrada pela verificação de núcleos pequenos. completamente densos. sem paracromatina visível. Ocorre em quadros sépticos graves. porém mais freqüentemente é percebida como artefato, em esfregaços feitos várias horasapós o sangue ter sido a colerado.
EOSINÓFILOS São leucócitos com grân ulos alaranjados, brilhantes. grandes e individualizáveis. O núcleo é geralmente bilobulado. Bastonetes eos1nófilos e mesmo formas mais jovens (metamielócitos e mielócitos) podem ser encontrados em síndromes hipereosinofílicas e na leucem1a mielóide crônica. Eventualmente apresentam-se desgranulados ou exibem granulação mista. isro é. além dos grânulos eosinofílicos têm também grânulos basofílicos. Ambas as situações podem ocorrer em síndromes mieloproliferativas e mielodisplásicas.
BASÓFILOS Caracterizam-se pela presença de grânulos de cor azulescuro. grandes e que, nos basófilos segmentados. encobrem completa ou parcialmente o núcleo. Quando desgranulados. demonstram núcleo segmentado e retorcido. Formas imaturas podem ser encontradas nos sangue periférico no caso de síndromes mieloproliferat1vas, especialmente na fase acelerada da leucemia mielóide crôn1ca, na qual estão presentes em número aumentado.
MONÓCITOS São os maiores leucócitos. com núcleo ovalado ou reniforme, com cromaDna de padrão delicado e Citoplasma amplo. de cor azul-acinzentado e com poucos e finos grânulos inespecíficos. Eventualmente, podem apresentar vacúolos citoplasmáticos.
253
Em pacieme com hisroplasmose disseminada. o fungo pode ser observado em seu ciroplasma. Muiro raramente. em paoentes com leishmaniose visceral com alro nível parasitário./e1shmâmas podem ser encontradas parasitando monóciros.
LI NFÓCITOS São leucóciros com núcleo arredondado. cromatina densa e homogênea. Cerca de 90% dos linfóciros circulantes são chamados de "pequenos linfócitos". por apresentarem cimplasma muiro escasso. algumas vezes com escassos grânulos azurófilos. Os demais, "grandes linfóciws", rêm cicoplasma mais amplo. azul-pálido. No passado. os morfologisras classificavam separadamente os dois ripas de li nfócitos, o que caiu em desuso pelo faro dessa classificação não fornecer informação clínica úcil.
Linfócitos reacionais
Em pacienres com viroses ou em uso de alguns medicamentos. podem ser encontrados no sangue periférico linfóciros reacionais. São linfóciros com ari pias morfológicas variáveis: aumenro de basofilia ciroplasmárica ou aumenro do tamanho de ciroplasma. com basofilia penférica, que às vezes se moldam às células vizinhas. núcleo grande e com croma rina mais frouxa. às vezes com nucléolo inconspícuo. Os linfómos reaciona1s não devem ser inrerprerados como blasros. embora. às vezes. haja dificuldade de diferenciação morfológica enrre os dois. Algumas vezes. para estabelecer o diagnóstico morfológico prec1so do linfóciw reacional,o profissional do laboratório necessita de informações clínicas do pacienre. Reforça-se, assim, a necessidade de fornecer ao laboracório dados clínicos e h1póteses diagnóscicas, uma vez que a correlação clínico-laborawrial pode ser necessána para a obcenção de resulcado adequado. Os linfóows reaoonais. por alguns chamados de hnfóciros atípicos ou "viróciros", são linfóciws arivados para a resposta imune celular e humoral após o processamento de anrígenos apresentados pelos macrófagos. No passado. cosrumava-se chamá-los de células de Downey, classificadas em ripas I, 11 e III, sendo a última encontrada em cerca de 50% dos paoenres com mononucleose mfecciosa pelo vírus de Eprein Bar r. Aclassificação de linfóciws atípicos segundo
254 ( Medicina laboratorial para o clínico
Downey e posreriormenre ourros auwres não demonsrrou utilidade clínica. pelas baixas sensibilidade e especificidade. Além da mononucleose infecciosa, linfócicos reacionais acima de 20% do coral de leucócitos são observados nas infecções por ciromegalóvirus. heparires virais e hipersensibilidade ao ácido para-amino-salicílico. fenicoína e mefenroína. L1nfociroses reacionais aré 20% podem ocorrer em ourros quadros infecciosos. como: caxumba. sarampo. pneumonia arípica. gripe. resfriados. riquersiose e brucelose. A presença de aré 5% de linfóciros reacionais circulantes não apresenta relevância clínica. a menos que haja manifestações clínicas correspondentes.
PLAQUETOGRAMA Consiste na contagem de plaquetas, manual ou auromacizada. Os analisadores hemarológicos fornecem ourros dois parâmerros. o MPV (volume plaquerário médio) e PDW (coeficiente de variação da distribuição do tamanho das plaquetas). O MPV encontra-se aumentado em plaquetas grandes. o que pode ocorrer em hemorragias agudas, em plaqueropenias secundárias à destruição imunológ1ca. algumas vezes em síndromes mieloproliferarivas e em septicemias. O valor clín1co do PDW ainda não esrá bem escabelecldo. sendo aparenremenre úril na d1srinção da rrombomose reaoonal. quando se enconrra demro dos valores de referênCia da rrombomem1a essencial. na qual esrá aumenrado. A análise microscópica do esfregaço sanguíneo. cuja importância na confirmação dos resu ltados aucomarizados já foi discutida, permite a observação de algumas alterações morfológicas: • plaquetas gigantes: são grandes fragmentos de megacarióciros, geralmenre com formam redondo, com diâmetro de 6 a 50 ~m. São observadas na púrpura rrombociropênica imune. quando ocasionalmente apresentam formara filamentoso ("plaquetas em forma de cobra"). síndrome de Bernard Soulier e anomalia de May-Hegglin; • plaquetas cinzentas: são plaqueras hipogranuladas. presentes em condições hereditárias associadas à diminuição ou ausência de grânulos alfa e densos das plaquetas.
)1-- - -- - - - - - - - - -- -- - - - - - - - - - - - - --
VALORES DE REFERÊNCIA DO HEMOGRAMA Quadro 22.S · Valores de referência do hemograma para adulws Parâmetro
Sexo masculino
Sexo feminino
Erilrócilos (milhões/mm3 ou M/pl)
4.3 - 5.7
3.8 - 5.100
Hemoglobina (g/dl)
13.5- 175
12- 16
Hemolócrito (%1
39- 49
35- 45
VCM(fl)
80- 100
80 - 100
HCM(pg)
26-34
26-34
CHCM (g/dl)
31-36
31 -36
Leucócilos (milhores/mm3 ou K/ pl)
4 - 11
4- 11
Neutrófilos (milhmes/mm3 ou K/j.JL)
2.0·70
20-7,0
Neutrófilos bastonetes (milhores/mm3 ou K/!JL)
0.0- 0,700
0,0 - 0.700
Neutrófilos segmentados (milhores/mm3 ou K/!JL)
1 85-6,60
I 85 -6,60
Linfócitos (milhores/mm3 ou K/!JL)
1,0-3,0
10-3,0
Monócilos (mdhores/mm3 ou K/fJL)
0.2- 1,0
0.2- 1.0
Eosinófilos (milhores/mm3 ou K/pl)
0,02-0,50
0,0 2-0,50
Bosófilos (milhores/mm3 ou K/!JL)
002- o 10
0.02-010
Plaquetas (milhores/mm3 ou K/!JL)
150- 450
150-450
~et culóc:tos
0,5 1.5%
05 .1,5%
Quadro 22.6 · Valores do referêncra do emograma para cnanças
Idade
Eritrócitos (milhões/ mm3 ou milhões / fJL)
Hemoglobina (g/ dL)
Hematócrito
RN (cordão)
3.9-5.5
13.5 - 19.5
1 o 3 dtos
4 -6.6
2 semanas
YCM (fL)
HCM (pg)
CHCM (g/dL)
42·60
98. 118
31 . 37
30-36
14.5-22.5
45. 67
95. 121
31 ·37
29-36
3.6-6.2
12.5 - 20.5
39 · 62
86 ·124
28 · 40
28-36
I mês
3 - 5.4
10· 18
31 ·55
85. 123
28. 40
29-36
3 - 6 meses
3.1 - 4.5
9.5- 13.5
29- 41
74 . 108
35.25
30·36
1 0'10
3.7- 53
105-13.5
33.39
70 86
23 31
30 -36
2-6 anos
3.9 -5.3
11.5- 13.5
34 - 40
75-87
24 .30
30-36
6- 12 anos
4 -5.2
11.5-15.5
35. 45
77-95
25.33
30 -36
O es[udo do sangue periférico a[ravés do hemograma
(%)
255
Quadro 22.7 - Valores de referência da comagem global de leucóciws (milhares/mm3 ou
K/JJL) para cnanças
~~------------------------------
Idade
leucócitos
RN
10 -26
1 ano
6 - 18
4 o 7 anos
5 - 15
8- 12 anos
4.5-13.5
- =:J Quadro 22.8- Valores de referêncra de concagem diferencial de leucócitos (milhares/mm 3 ou K/iJL) para crianças
Idade
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Eosinófilos
Basófilos
Bastão
Segmentado
RN
175
7,05
2- 11.5
0.3-3.1
0.05- 1
0 -0.3
1 ano
0.35
0,65-8.15
4 - 10.5
0.05- 1
0.05-0.7
0-0.2
4 anos
o- 1.0
1.5- 6. 5
2- 8
0 - 0.8
0.02-0.65
0-0.2
6 onos
0- 1.0
1 5 -6
1.5-7
0-0.8
0-0.6
0-0.2
10 anos
0- 1.0
18- 6
1 5- 6.5
0 -0.8
0-0.6
0-02
14 onos
o- 1.0
1.8-6
12- 5.8
0-0.8
0-0.6
0-0.2
Quadro 22.9- Valores de referêncra de concagem de plaquetas e reticulócitos. Plaquetas /milhores/mm3 ou K/~1) = 150 - 450 Reticulócitos: 2,0 o 6,0% no RN, quedo poro valores de adultos até o final do segundo semana
CONVERSÃO DE UNIDADES CONVENCIONAIS PARA UNIDADES INTERNACIONAIS
Quadro 22.10- Conversão de unrdades convencronais para unidades incernacronais
Unidades convencionais
Fato r
Unidades internacionais
Leucócitos
milhores/ mm3
106
10 9/L
Entróctlos
mtlhões/mm3
JOÓ
J01 2jL
Hemoglobina
g/dl
10
g/L
Hemorócrito
%
0,01
(valor absoluto - froçõo de volume)
Plaquetas
milhores/mm3
106
109/L
Reticulócitos
%
0.01
(froçõo de número)
256 ( Medicina labora torial para o clínico
)1-- - - - - - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - - - -
REFERÊNCIAS 1.
Barn B. Blood Cells: a Prancal GUtde. London: Blackwell SCtence; 1995. 2. Barn BJ. Dragnosrs from the Blood Smear. N Engl J Med. 2005;353:498-507 3. Hemaropathology Index lhomepage da lmernet]. Salt
S. Mons MW, Davey FL. Basrc Examrnanon of Blood. ln: Henry JB. edrtor. Chnrcal Dragnosrs and Management by Laborarory Methods. Phrladelphra: W. B. Saunders. 2001. p. 479-519 6. Perkrns SL. Examrnatron of the Blood and Bone Marrow. ln: Greer JP. Foerster J. Lukens JN, Rodgers GM, Paraskevas F. Glader B. edrtors. Wrnrrobe's Clrnrcal Hemarology. Phi-
Lake Clry: Flonda Srare Unrversrry College of Medrcrne;
4.
Drsponível em: http://www.medltb.med.utah.edu/WebPath/ HEMEHTML/HEMEIDX.htmiR1 lmage Atlas Categorical Index [homepage da Internet]. Charlottesvrlle: Carden jennrngs Publtshrng; Drsponível em: http://tmage.bloodline.net/category
O esrudo do sangue periferíco através do hemograma
ladelphia: Lipprncon. Williams & Wilkins: 2004. p. 3-25. 7.
Ryan OH Examinatron of the Blood. ln: Beutler E, Coller BS. Lrchtma n MA. Kipps TJ. Seligsohn U. edrtors. William's Hematology. New York: McGraw-Hrll; 2001. p. 9- 16
257
23
Cristiane Monnaísa Firmino da Silva Rosa Ma/ena Delbone de Faria
O PACIENTE ANÊMICO
O termo anemia (do grego, an = privação, haima = sangue) refere-se à redução da concentração de hemoglobina ou das células vermelhas no sangue. Considera-se que qualquer uma das medidas, hemoglobina, hematócrim ou concentração de hemácias por unidade de volume pode ser utilizada para estabelecer o diagnóstico de anemia, porém a hemoglobina é preferida, em parte, devido à maior acurácia e reprodutibilidade que as outras. A escala de normalidade sofre variação de acordo com estilo de vida, altitude de residência, sexo e idade. Não há evidências de que os valores normais de hemoglobina variem nas diferentes raças ou regiões geográficas, exceto pelo efeito da altitude; e os mesmos critérios para adultos aplicam-se a idosos. Em termos de prevalência, segundo a OMS, 30% da população mundial é anêmica, sendo que em crianças menores de dois anos essa taxa pode chegar a 50%.
atribuídas a distúrbios da regulação do volume plasmático e não a desordens hemarológicas. O exemplo mais comum de anemia relativa é a anemia da gravidez, cuja baixa de hemoglobina, especialmente em idade mais tardia, está associada a alterações do volume plasmático. Anemia materna é um problema comum em obstetrícia, fazendo-se sempre necessária a distinção entre anemia absoluta e hidremia. Outra condição problemática e comumente associada à desproporção do hematócrim e massa mtal de hemácias é a insuficiência renal, uma vez que a anemra absoluta tem sido identificada como um importante predrwr de morbidade e mortal idade em população dialítica. Doenças cardíacas e distúrbios hidroeletrolíticos também são causas de anemia relativa.
ANEMIA ABSOLUTA ETIOPATOGENIA
Em relação à massa rotai de hemácias, as anemias podem ser classificadas em relativas e absolutas.
ANEMIA RELATIVA A anemia relativa é caractenzada por uma massa rotai de hemácias normais. Tais condições são usualmente
A anemia absoluta ou anemia verdadeira reflete a verdadeira queda da concentração de hemoglobina total e conseqüente redução da massa eritrocitária circulante. De acordo com a resposta medular, as anemias absolutas podem ser regenerativas, hiporregeneracivas e arregenerativas. Anemias regenerativas respondem ao estímulo da erirropoetina, cursam com hiperplasia eritróide medular e reticulocirose em sangue periférico. exemplo típico, anemias hemolíticas e de perda sangüínea aguda.
Anemias hiporregenerativas e arregenerativas são as que não conseguem levar a eriuopoese a termo, quer seja por falta de nutrientes, resposta insuficiente à eriuopoetina. deficiência de eritropoetina ou insuficiência de parênquima medular, por isso cursam com reticulóciros dentro da normalidade, reticulociropenia ou ausência de reticulócitos na circulação. São exemplos as anemias carenoa1s, anem1a de doença crônica, anemia da insuficiência renal, anemia por infiltração da medula e aplasia de medula óssea.
CLASSIFICAÇÃO FISIOPATOGÊN ICA DAS ANEMIAS As anemias podem ser agrupadas. de acordo com a fisioparogênese. em crês categorias: • anemias por diminuição ou defeiro da produção de hemácias; • anemias por aumento da destruição das hemácias; • anemias por perda sangüínea.
Anemia por diminuição ou deficiência de produção de hemácias
Constitui a maioria dos casos de anemia e são decorrentes de interferências na maturação e diferenciação das células. Fazem parte desse grupo: anemia aplásrica e doenças correlatas. invasão medular, defeiros da síntese de DNA como na deficiência de folaro e vitamina Bl2, deficiência de ferro, anemia de doença crônica e anemia sideroblástica.
Anemia por aumento de destruição de hemácias
Em condições normais as hemácias têm vida média de 120 dias a partir da saída do reticulóciro da medula óssea, sendo, após esse período, destruídas por macrófagos, em órgãos como fígado, baço e medula óssea. Ocorre anemia hemolítica quando as hemácias são destruídas prematuramente no imravascular ou, mais freqüentemente, no extravascular. Na hemólise extravascular, as hemácias são removidas da circulação por macrófagos no baço, por um mecanismo normal, porém acelerado. Exemplos de hemólise extravascular acontecem na anemia hemolítica auroimune, desordens da menbrana das hemácias e deficiência
da enzima piruvato-quinase. Hemólise intravascular ocorre quando as hemácias sofrem lise e liberam seu conteúdo no próprio plasma. Exemplos de hemólise imravascular são vistos na deficiência da enzima G6PD. hemoglobinúria paroxística noturna e hemólise medicamentosa.
Anemia por perda aguda
Anemia secundária à perda aguda ocorre quando um grande volume de sangue é perdido pós-trauma, lesões vasculares ou cirurgia. As manifestações clínicas vão depender da causa e da gravidade da hemorragia.
CLASSIFICAÇÃO MORFOLÓGICA DAS ANEMIAS
O uso de índices hematimétricos na abordagem diagnóstica das anemias é de grande valor e deveria ser tomado sempre como o primeiro passo. A estimativa da média do volume corpuscula r (VCM) permite classificar as anemias em microcíticas. normocíticas e macrocíticas. Anemia microcítico - VCM < 80fl Anemia normocítica - VCM entre 80fl e 1OOfl Anemia macrocítica - VCM > 1OOfl
ANEMIA MICROCÍTICA Traduz, excero na microestenocirose hereditária (ver capítulo 24), a deficiência quantitativa de síntese hemoglobina, seja por deficiência de ferro, pelo impedimenro na utilização do mesmo ou pela insuficiência de síntese de globina. As principais possibilidades diagnós(lcas são: anemia por deficiência de ferro, talassem ias e anemia sideroblástica. A anemia de doença crônica pode apresentarse microcítica, porém, mais comumeme é normocítica.
ANEMIA NORMOCÍTICA Diferentemente das anemias microcíticas e macrocíticas, não existe um mecanismo parogênico bem estabelecido e comum. Estão agrupadas aqui a anemia de
doença crônica, anemia pluricarencial (associação de deficiência de ferro, ácido fálico e/ou vitamina Bl2), anemia da insuficiência renal, anemia falciforme, enzimopatias eritrocitárias, esferocirose hereditária e anemias secundárias à infiltração medular.
Os sinais e sintomas das anemias refletem a hipóxia não corrigida dos tecidos e a participação de mecanismos compensatórios. Os primeiros sinais e sintomas geralmente aparecem como diminuição da tolerância ao trabalho, dispnéia, palpitações ou os sinais decorrentes de ajusre cardiorrespirarório. A palidez geralmente é percebida por amigos ou familiares.
ANEM IA MACROCÍTICA Nas anemias macrocíticas, além do volume aumentado do eritrócito, são observados também aumento das dimensões da célula como diâmetro e espessura, devido ao retardo ou impedimento da síntese de DNA. A primeira consideração a ser feita durante a investigação das anemias macrocíticas é a investigação sobre uso de drogas, como hidroxiuréia e zidovudina, e o uso de álcool, causas importantes de macrocitose. A segunda refere-se às carências nutricionais, especialmente deficiência de vitamina B12 e folaro. Anemias da aplasia de medula óssea e da mielodisplasia freqüentemente apresentam-se macrocíticas. Devido ao elevado número de reticulócitos na circulação periférica, as anemias hemolíticas, especialmente durante crises de hemólise, podem ser macrocíticas.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
As manifestações clínicas da anemia dependem de fatores, como: • redução da capacidade do sangue carrear oxigénio; • grau de alterações do volume sanguíneo; • capacidade com que os sistemas pulmonar e cardiovascular têm de compensar a anemia; • manifestações associadas à doença de base que resultam no desenvolvimento da anemia. A concentração de hemoglobina não é o único determinante dos sintomas observados, a concomitância de doenças pulmonares e cardiovasculares contribui para exacerbar os sintomas. Se a anemia se instala de modo insidioso. o paciente pode ficar bem. até que os níveis de hemoglobina caiam abaixo de 8 g/dl. Em pacientes portadores de anemia ferropriva, anemia perniciosa ou ourros tipos de anemia de instalação lema, os níveis de hemoglobina podem chegar a 6g/dl, até que se iniciem os sintomas.
O paciente anêmico
SINTOMAS OCASIONADOS PELA HIPÓXIA A hipóxia decorrente da baixa concentração de hemoglobina pode causar vários sintomas: no sistema nervoso central. irritabilidade, cefaléia, tonturas. lipotímias, escotomas, insônia e astenia psíquica; no sistema muscular, fatigabilidade e dores em membros inferiores; no miocárdio, dispnéia de esforço. taquica rdia. palpitações. sopro sistólico. dor anginosa e insuficiência cardíaca.
SINTOMAS OCASIONADOS PELOS MECAN ISMOS COMPENSATÓRIOS Os mecanismos compensatórios objetivam redistribuir o fluxo sangüíneo de forma a priorizar os tecidos mais nobres. Desta forma, podem ser observados, como conseqüência desse processo. palidez, anorexia. náuseas, diarréia, dispnéia de esforço, taquicardia, palpitações, dor.
OUTRAS MANI FESTAÇÕES Algumas manifestações clínicas associam-se a determinados tipos de anem ias, particularizando-as, como na anemia por deficiência de ferro, em que a pele pode ter alterações de elasticidade e tônus. resultando em aparência seca, enrugada, os cabelos podem ficar finos. acinzentados. as unhas quebradiças e. na boca, língua com atrofia de papilas e queilose angular. Úlceras de perna e dor óssea são observadas em pacientes portadores de anemia fa lciforme, parestesias na deficiência de vitamina B12, icterícia na anemia hemolítica, febre nas anemias associadas a leucemias e organomegalias quando há concomitância de li nfaproliferação e/ou mieloproliferação.
261
CONSIDERAÇÕES FINAIS Diame de um pacieme com suspeita clínica de anemia, a realização do hemograma e a contagem de reticulócitos permitirão a classificação morfológica e nortearão a propedêutica complememar mais específica. A Figura 23.l mostra o fluxograma para investigação inicial do pacieme anêmico.
[ Volume Corpuscular M édio ]
I
Foleifo rme Esferocitose Enzimo patia s Hemólise
Hemólise
Esferocitose
Talassem ia
Auto-imune
Figura 23.1 - Fluxograma para investigação do paciente anêmico.
REFERÊNCIAS 1.
2.
Erslev. AJ. Clinical Manifestations and Classificarion of Eryrhrocyte Disordens. ln: Beurler E. editor. Williams Hemarology. 6ch ed. New York: McGraw-Hill; 2001. p. 369-74. Levin, A Anaemia in rhe parienr wirh renal insufficiency: documeming rhe impacr and reviewing rrearmem arraregies. Nephology Dia! Transplem. 1999;14:292-5.
262 [ M edicina laboratorial para o clínico
3.
4.
Oski, FA, Brugnara, C and Nathan, DG. A diagnosrc approach to rhe Anem ie Paciem. ln: Nathan, DG, Oskin SH, Ginsburg. D, Look. AT. Hamarology of lnfancy and Childhood. Philadelphia: Saunders; 2003. p. 409-18. Tefferi A. Hanson CA lnwards. DJ. How to lmerpret and Pursue an Abnormal Complete Blood Cell Counr in Adults. Mayo Clin Proc. 2005;80(7):923-36.
1 ] - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -- - - -
Rachel Aparecida Ferreira Fernandes Maria Christina Lopes Araújo Oliveira Rosa Ma/ena Delbone de Faria
24
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM ANEMIA MICROCÍTICA
As anem1as microcít1cas constituem um grupo de doenças caracterizadas pela redução do volume corpuscular médio das hemácias (VCM). Os valores mínimos aceitos como normais, para o VCM, correspondem à média esperada para determinada faixa etária. menos dois desvios-padrão. Ass1m. considerando-se as grandes diferenças entre os valores de referênc1a segundo a idade. o uso de tabelas que considerem esta variável é recomendável para o diagnóstico correm (Tabela 24.1). A produção de hemácias com VCM no rmal depende. sobretudo. da síntese de hemoglobina e esse processo requer mecanismos metabólicos intactos de formação das moléculas heme e de globina. além de suprimento adequado de ferro. Qualquer interferência no processo de hemoglobinização das hemácias causa redução da concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), que está associada à formação de células microcíticas. Na prática clínica. as três causas mais freqüentes de microcirose são a defiCiência de ferro, as talassemias (redução na produção de globinas) e as anemias sideroblásticas (redução da síntese de moléculas heme), embora também possam ser causadas por anemia de doenças crônicas ou anemia da inflamação. deficiência de cobre ou inroxicação pelo chumbo.
ANEMIA FERROPRIVA
A carência de ferro é a deficiência nutricional mais comumente observada em seres humanos. A sua ele-
vada prevalência. especialmente em crianças. gestantes e adulros com perda sangüínea crônica, além de seu estreito paralelismo com condições socioeconômicas precárias, torna essa doença um problema de saúde pública. Embora os termos deficiência de ferro e anemia ferropriva sejam utilizados, freqüentemente, de forma intercambiável. a anemia constitui a manifestação mais tardia desta carência específica e surge quando as reservas orgânicas se esgotam em virtude do balanço orgânico persistentemente negativo entre a oferta e a demanda desse nutriente. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS). 30% da população mundial apresentam anemia ferropriva. sendo que esta taxa entre lactentes chega a quase 50%.
METABOLISMO DO FERRO O ferro é um micromineral encontrado em todas as células dos seres vivos. Embora esteja envolvido em diversas reações metabólicas do organismo e seja indispensável para a replicação celular, quando em excesso pode tornar-se tóxico. causando lesões oxidativas em várias estruturas biológicas vitais. Desta forma, a regulação de seu conteúdo no organismo deve ser rigorosamente efetuada. No ser humano. a quantidade de ferro corporal varia entre três e cinco gramas, estando cerca de 80% desse total nos compartimentos metabolicamente ativos. na
forma de hemoglobina, mioglobina, rransferrina, citocromooxidases. transferases. catalases. entre ourros. e os 20% restantes disuibuem-se. nos compartimentos de armazenamento, entre a ferritina e hemossideri na, que se localizam no fígado (30%), na medula óssea (30%). no baço e em oucros cecídos. A hemoglobina, responsável pelo transporte de oxigênio através do sangue, e a mioglobina, pigmento vermelho dos músculos que armazena oxigênio para a sua utilização durante a concração, contêm, respectivamente, em wrno de 65 e 10% do ferro corporal. A transferrina detém apenas 1% do ferro corporal total e sua principal função é transportar o ferro liberado do catabolismo da hemoglobina ou absorvido pela mucosa intestinal até a medula óssea. onde será utilizado na síntese de hemoglobina (Tabela 24.2). Tabela 24.1 -Valores mínimos de VCM e HCM. de acordo com a idade e sexo. ao nível do mar VCM {fl)
HCM (pg)
Sangue de cordão
98
31
1 5emono
88
28
2 semanas
86
28
1 mês
85
28
2 meses
77
26
3 o 6 meses
74
25
6 meses o 2 anos
70
23
2 o 6 ono5
75
24
6 o 12 anos
77
25
12 o 18 anos (sexo feminino)
78
25
12 o 18 anos (sexo masculino)
78
25
Ac1mo de 18 anos
78
25
Idade
Adaptado de. Dallman. P.R. ln: Rudo lph. A. Ed. Pediatrics. 16 ed. New York: A ppleton-Century-Crofts. 1977:111.
Para que o organismo conserve a quantidade deste mineral dentro de (imites adequados para cada estágio de crescimento. a absorção diária de ferro exógeno deve ocorrer em quantidades próximas daquelas que foram perdidas no mesmo período. uma vez que não existe mecanismo de excreção fisiológica de ferro. Esse
264 ( Medicina laboratorial para o clínico
mecanismo regulador é realizado principalmente pela placenta, no feto. Após o nascimento, essa regulação possui várias vias moduladoras: a) via reguladora da dieta (conhecida como bloqueio mucoso); b) via reguladora do estoque (parece interferir no nível da proteína cransporcadora de metal divalente - DMT1); c) via reguladora eritropoética (a diseritropoese favorece a absorção do ferro). Tabela 24.2 - Distribuição do ferro de acordo com os compartimentos orgânicos
Compartimento
Homens (mg)
Mulheres (mg)
% total de Fe
Hemoglobina
2000.0
1700,0
65.0
Estooues
1000,0
300,0
30.0
M ioglobino
300.0
150,0
3,5
20,0
15,0
0 ,5
3,0
3,0
0,1
Outros tecidos Transporte
A absorção do ferro ocorre. sobretudo. no duodeno e se dá por duas vias distintas: uma para o ferro-heme e outra para o ferro não-heme. Alimentos de origem animal. por comerem o ferro-heme. derivado da hemoglobina. mioglobina e outras hemoproteínas, representam uma importante fonte alimentar de ferro. pois permitem a elevada absorção desse oligoelemento em sua forma intacta (hemina), sem sofrer infl uência de associações dietéticas ou fa tores endógenos. como acontece na absorção do ferro não-heme. proveniente de outras fontes alimentares. Na forma não-heme, os complexos férricos devem ser inicialmente reduzidos para a forma ferrosa. que é mais facilmente absorvida. Essa conversão é facilitada por fatores endógenos. como o ácido clorídrico, contido nas secreções gástricas, bem como por alguns componentes da dieta, como o ácido ascórbico, o citrato e a frutose. Determinados componentes da dieta, por outro lado, podem atuar como" dificultadores" da absorção do ferro-não heme, como os fosfatOs, os fitaws das fibras, os polifenóis dos cereais e o tanato dos chás. por formarem complexos insolúveis ao se ligarem ao ferro. Para ser absorvido do lúmen intestinal. o ferro é reduzido da forma férrica para a forma ferrosa, por uma
redutase localizada na borda em escova do emeróciro e ligada ao transportador Divalent metal transporter 7, (DMTl), que permite, por sua vez, a imernalização da molécula de ferro na célula da mucosa intestinal. Uma vez no citoplasma do enteróciro, o ferro poderá ser armazenado nesta célula como ferricina ou poderá atravessar sua membrana basolateral, através de uma proceína denominada ferroportina. Neste momento, o ferro é novamente oxidado para a forma férrica e, a seguir, alcança o plasma, de onde é transportado pela cransferrina para compartimentos de depósito ou para os eritroblascos da medula óssea. Na superfície do eritroblasco, a cransferrina, ligada ao ferro, fixa-se a um receptor específico, formando um complexo que é endocitado e. subseqüentemente, se desfaz na presença de acidificação do meio. Nem a cransferrina nem o seu recepw r são degradados nesse processo. sendo devolvidos para a membrana plasmática. O ferro é, então, transportado para as mirocôndrias para ser acoplado à procoporfirina, por ação da heme sintetase e conseqüeme formação do heme, que será incorporado à molécula de globina. completando o processo de hemoglobinização. Além do ferro absorvido da dieta, o ferro reciclado de hemácias senescentes degradadas pelo sistema mononuclear fagocitário ou o ferro mobilizado dos compartimentos de estoque também constituem fonte de ferro para a hemoglobinização ericrocitária. As perdas corporais de ferro são pequenas e relativamente fixas, ao redor de 0,9 mg/dia em indivíduos adultos. A maior parte dessa perda (0,6 mg por dia) se dá pelo trato gascrintestinal, por meio da esfoliação das células da mucosa ou por extravasamento de glóbulos vermelhos. A perda de ferro pode ainda ocorrer por descamação da pele, do epitélio urinário e, nas mulheres, também pela menstruação e lactação. Em crianças, segundo a OMS, a perda basal diária de ferro é de 0,21 mg de 0-12 meses; 0,25 mg de 1-2 anos e de 0,34 mg dos 2-6 anos de idade.
CAUSAS DE CARÊNCIA DE FERRO
Genericamente, o balanço negativo do ferro corporal pode ser secundário à menor ingestão do nutriente, aumento das necessidades fisiológicas. aumento das perdas, menor absorção intestinal e defeiros no trans-
Investigação laboratorial do paciente com anemia microcítica
porte ou no metabolismo, que resultam em menor oferta efetiva do nutriente para a medula óssea. É importante lembrar que muitas vezes esses fatores não atuam isoladamente, mas associados entre si. A carência de ferro de origem exclusivamente alimentar é rara,
pois a quantidade de ferro absorvido da dieta aumenta à medida que os esroques diminuem. Assim, a maior prevalência da anem ia ferropriva em crianças e gestantes, quando comparada aos adulcos de uma mesma população, deve-se à associação da carência dietética à maior demanda fisiológica do nutriente. A Tabela 24.3 mostra a estimativa das necessidades mínimas de ferro, de acordo com o sexo e faixa a etária; e a Tabela 24.4, a homeostase do ferro durante a gravidez. O aumento das perdas por sangramento constitui a principal causa, isolada ou associada, de anemia ferropriva em adultos (Tabela 24.5). A cada 2 ml de sangue perdido perde-se cerca de 1 mg de ferro. Tabela 24.3 - Necessidades mínimas de ferro, de acordo com o sexo e fase da vida
Fase da vida
Necessidade Mínimo diária para síntese diário a ser de Hb (mg) ingerido (mg)
Lactentes
1,0
10,0
Crianças
0,5
5,0
Mulheres 12 o 15 anos Mulheres em idade fértil Mulheres grávidos
2,5
25,0
2.0
20,0
3,0
30,0
Homens e mulheres pós-menopausa
1,0
10 ,0
Tabela 24.4 - Homeosrase do ferro durante a gravidez Sede de consumo de ferro Fetal
Necessidade (mg)
Placentário e cordão umbilical
QO
Expansão do mosso eritrocitório do gestante Perda songüíneo no porto
150
500 150
265
Tabela 24.5 - Causas de deficiência de ferro Aumento de demando
Gestação Prematuridade Infância Adolescência
lngesto insuficiente
Geralmente associado às cousas de aumento de demando
Perda songüíneo
Songromentos gostrintestinois em adultos varizes esofogionos gastrites úlceras neoplosios divertículo de M eckel doenças inflamatórios d iverticulose doença hemorroidório Songromentos gostrintestinois em crianças doença do refluxo gostro-esofógico into lerância o proteína do leite de vaca doença celíoco enteropotio ambiental parasitose intestinal Songromentos genitourinórios menorrogia neoplasia infecções crónico s
Distúrbios obsortivos
Outros
Hipocloridrio Ressecçõo intestinal o u desvio de trânsito Doença celíoco Doenças intestinais inflamatórios crónicos Excesso de cereais, to notos, fitotos e fosfatos no d ieta Doação regular de sangue Trauma Malformação vascular extenso Deficiência de tronsferrino, por perda, no sínd rome nefrótico Deficiência congênito de tronsferrino
amilofagia), papilas linguais hipotróficas, queilose angular, escleras azuladas, coiloníquia, unhas e cabelos opacos e quebradiços. O aparecimento dos sinais e sintomas da anemia é insidioso e gradual, sendo a palidez o sinal clínico mais comum. As alterações cardiocirculatórias (sopros,
taquicardia, B3) são manifestações mais tardias e sugerem quadros mais intensos de anemia. O baço é palpável em aproximadamente 10% dos pacientes e apresenta aumento discreto a moderado, cuja patogênese é desconhecida.
O LABORATÓ RI O E O S DIFERENTES ESTÁGIOS DA AN EM IA FERROPRIVA
Os resultados de exames laboratoriais variam conforme o grau de carência do ferro, por isso, é importante salientar que, entre o estado eu trófico e a anemia ferropriva, existem situações intermediárias em que as características laboratoriais da doença se mesclam, como mostra o Quadro 24.1.
O depósito de ferro e a eritropoese
Depósito de ferro
Na eventualidade de um balanço negativo de ferro, o organismo recorre imediatamente aos estoques para garantir todas as funções metabólicas desse micronucriente. Por isso, nas fases iniciais de carência, a dosagem de ferritina está reduzida, mas não ocorre comprometimento da hemoglobinização das hemácias nem da contagem de reticulócitos. Técnicas analíticas para avaliação do estoque de ferro
MANIFESTAÇÕES ClÍNICAS
Como o ferro se encontra envolvido em diversas reações metabólicas e oxidativas do organismo, além de ser essencial para a replicação celular, na anemia ferrop riva pode-se observar não só as manifestações próprias da anemia, como também sinais relacionados à própria deficiência de ferro, com ou sem anemia instalada, tais como: atraso de desenvolvimento cognitivo, diminuição da capacidade laboral, maior susceptibilidade a infecções, queda na curva de peso ou ganho insuficiente de peso em lactentes, astenia, perversão do apetite (geofagia, pagofagia,
266 ( Medicina laboratorial para o clínico
Ferritina sérica: a ferritina não é verdadeiramente uma proteína extracelular, porém seu nível sérico, ainda que pequeno, reflete os estoques de ferro teciduais. A ferritina circulante encontra-se principalmente sob forma de apoferritina (não ligada ao ferro) e é uma proteína de fase aguda, por isso sua dosagem poderá elevar-se em processos inflamatórios, infecciosos ou malignos e gerar equívocos na avaliação propedêutica, caso não seja analisada com visão crítica dentro de um contexto clínicoepidemiológico. Pode ser determinada, de forma segura, por restes imunoquimioluminescentes, imunoenzimáticos, radioimunológicos e imunorradiométricos.
Quadro 24.1 - Estágios de desenvolvimento da Anemia Ferropriva
Parâmetros Ferro medular Ferritino sérico (fig/l)
Estágio 3
Depleção do estoque
Eritropoese deficiente
Anemia ferropriva
normol
diminuído
diminuído ou ausente
diminuído ou ausente
Estágio
normal
diminuído
diminuído
diminuído
(100 ± 60)
(< 30)
/lO)
(
normal
normal
aumentado
aumentado
Capacida de total de ligação d o ferro (CTLF)
{330 ± 30)
Índice de Sa turaçã o do Tronsferrino (1ST)
norma l {20 o 55%)
normal
normal
normal
Ferro sérico (~g/dl)
1
Estágio 2
Estado eutrófico
{1 15 ±50) Índice de onisocitose iRDW)
normal
normal
(390)
(410)
diminuído
diminuído
(15%)
(< 15%)
diminuído
diminuído
(<60)
(<40)
aumentado
aumentado
(14 o 15%)
(>20%)
Hemoglobina
normal
normal
normal
diminuída
Volume corpuscular médio IVCM )
normal
normal
normal
d iminuído
Adaptado de Suom1nies P ec at. 1988
Ferro medular: o escudo do depósiw de ferro medular. por técnicas específicas de coloração com azul da Prússia, técnica de Perls. Valores de referência: • depósito intersticial de ferro: ++/++ +; • sideroblastos (eritroblastos com grânulos de ferro no citoplasma): acé 30%; • sideroblastos em anel (eritroblastos com grânulos de ferro cincundando o núcleo): ausentes. Interpretação: é um reste de coloração citoquímica para ferro, realizado em esfregaço de medula óssea, bastante fidedigno na sem iquantificação do estoque de ferro do organismo. Na anemia ferropriva, classicamente há diminuição ou ausência de ferro medular. Situações que cursam com aumento dos depósicos de ferro: hemossiderose ou hemocromatose, calassemias, anemia megalobláscica, anemia siderobláscica e as anemias das doenças crónicas ou da inflamação. Sideroblastos em anel são patogênicos e estão presentes na anemia refracária com sideroblascos em anel e nas anemias sideroblásticas. Uso clínico: diagnóstico diferencial de anemias microcíticas super postas, em que a ferritina não é fidedigna para retratar o estoque do ferro, como na associação de anemia ferropriva e anemia de doença crónica.
Investigação laboratorial do paciente com anem ia microcítica
Eritropoese
A medula óssea sediará uma hiperplasia microencroblástica secundária à depleção dos estoques de ferro, com inversão da relação grânulo: eriuóide (G:E). Os precursores eritróides apresentarão citoplasma pequeno, basofílico e com contornos irregulares, devido à insuficiente maturação citoplasmática gerada pela deficiência de ferro, que prejudica sobremaneira a hemoglobinização. Conseqüentemente, cem-se um eriuoblasto com assincronia de maturação enue o núcleo (mais maduro) e o ciwplasma (pouco hemoglobinizado - imaturo). Raramente será necessário escudo morfológico da medula óssea para diagnóstico de anemia ferropriva.
A captação e o transporte de ferro
Na persistência de balanço negativo de ferro corporal. com depleção dos estoques, observa-se diminuição na dosagem do ferro sérico, aumento da capacidade tocai de ligação do ferro (CTLF) e diminuição do percentual de saturação da CTLFou índice de saturação da uansferrina (1ST). A dosagem do ferro sérico, amplamente utilizada na prática, possui como princípio a separação do ferro de suas proteínas de ligação e determinação de sua
267
concentração por métodos colori métricos. Apresenta como limitações uma grande variabilidade biológica circadlana (altos valores pela manhã e menores à noite), além de sofrer influência do conteúdo de ferro ingerido e, na presença de processos inflamatórios, seu resultado poder estar diminuído. Para diagnóstico diferencial das anemias microcíticas, a dosagem de ferro deverá ser sempre realizada e analisada em conjunto com a CTLF, 1ST e ferritina sérica. A CTLF constitui uma medida funcional da transferrina e é inversamente proporcional aos estoques de ferro. É determinada saturando-se a rransferrina com ferro e. posteriormente. removendo-se o excesso de ferro não ligado com um absorvente, que mantém intacto o ferro ligado à rransferrina. Determina-se o teor de ferro no filtrado. Está aumentada na anemia ferropriva e diminuída nas doenças infecciosas e inflamatórias, a despeito do ferro sérico poder estar diminuído. O índice de saturação da rransferrina (1ST) é calculado a partir da divisão da concentração do ferro sérico pela CTLF e multiplicado por 100; é expresso em porcentagem e reflete, mais sensivelmente, o conteúdo de ferro no organismo. O 1ST diminui na deficiência de ferro, mas tam bém nas doenças crônicas. Nestas últimas, entretanto, a queda é menor e a capacidade de ligação de ferro também diminuída auxilia no diagnóstico diferencial entre as duas Situações clínicas (ver capítulo 25).
refletir, tão somente, a presença de uma pequena população de células microcíricas que, por isso. ainda não impactou no VCM. A presença dessa heterogeneidade no tamanho das hemácias (anisocicose). numa fase inicial da doença, sem alteração do VCM, pode ser precocemente identificada pela medida do coeficiente de variação do volume das hemácias RDW (Red ce/1 Distribution Width). Valores do RDW acima de 20% são fortemente sugestivos de anemia ferropriva, enquanto valores entre 15 e 20% também podem estar associados às anemias hemolíticas.
TALASSEMIA$ As talassemias constituem um grupo hererogêneo de distúrbios genéticos, caracterizados pela redução ou ausência da síntese de uma ou mais cadeias de globina (alfa. bera, gama, zera ou epsilon). Em decorrência da hemoglobin ização deficiente, observa-se a formação de hemácias hipocrômicas e microcíticas. Conforme a cadeia de globina afetada. as talassem ias são denominadas alfatalassemia, betatalassemia, gamatalassemia, erc. Entre elas, a alfa e a betatalassemias apresentam importância clínica maior, em função da prevalência e variabilidade de apresentações.
ESTRUTURA E SÍNTESE DA HEMOGLOB INA (HB) O ferro hemoglobínico e a microcitose
O ferro é essencial na síntese de hemoglobina. cuja etapa final corresponde à sua incorporação no anel de protoporfirina ligado ao componente heme. Assim, na carência de ferro, a protoporfirina se acumula nos glóbulos vermelhos e a sua dosagem está aumentada. Sua análise apresenta grandes vantagens, que incluem a evidência de alreração bastante precoce no processo de ferropenia. necessidade de pequena amostra de sangue na sua execução, além de não sofrer influência pelo uso do ferro. Entretanto, não permite distinguir a deficiência de ferro da anemia de doença crônica e pode estar aumentado na intoxicação pelo chumbo. A anemia ferropriva é classicamente microcítica e hipocrômica. Todavia, nas suas fases iniciais a observação de valores de VCM dentro da faixa de referência pode
268 [
Medicina laboratorial para o clínico
As hemoglobinas normais são moléculas globulares, sintetizadas durante a erirropoese e constituídas por dois pares de cadeias globínicas, ligadas a uma molécula de heme, formada pela condensação de quatro núcleos pirrólicos e um átomo de ferro na forma de Fe++. Os tipos de cadeias de globina podem variar, conforme a fase de desenvolvimento do indivíduo, como mostra a Tabela 24.6. Todas as cadeias de globina, sintetizadas no redculo endoplasmático dos precursores eritróides até a fase de reticulócito, têm estrutura muito similar e são formadas por uma seqüência de 141 aminoácidos (cadeia alfa) ou 146 aminoácidos (cadeia beta). O gene responsável pela síntese de cadeias beta é único e localizado no cromossoma 11. enquanto o gene alfa é duplicado e localiza-se no braço curto do cromossoma 16. Os indivíduos têm, portamo. dois genes beta e
quacro genes alfa acivos. o que favorece a grande heterogeneidade de possíveis alterações genéricas. Além da determinação genérica. a síntese de globina também sofre controle parcial pela quantidade de moléculas heme produzidas. Por exemplo, na anemia ferropriva, na qual há deficiência na síntese do heme, há a concomicance redução na produção de globinas. Tabela 24.6 - Tipo de hemoglobina predominante de acordo com as fases de desenvolvimento humano
As alfacalassemias. mais freqüemememe. são causadas por deleções gên icas. As lesões moleculares responsáveis pela betatalassemia são, em sua maioria, mutações pontuais que afetam a qualidade ou a quantidade do RNAm produzido. A Tabela 24.7 mostra os genócipos das calassemias.
Tabela 24.7 - Des1gnaçào genérica das ralassemias Designação
Fase de desen- Cadeias Tipos de volvi menta globínicas hemoglobina Período Hemoglobina Gower I Ç2 E2 embrionário Hemoglobina Portlond Ç2 i2 Hemoglobina Gower I I a2 E2 Período fe1ol a2 y2 Hemoglobina Feto! Nascimento Após o Ó mês de vida 0
a2 y2 a2 ~2 a2 ~2 a2 li2 a2 '12
Hemoglobina Fetal Hemoglobina A Hemoglobrno A195-97%1 Hemoglobina A2 102-03%) Hemoglobina Fetal (01-02%)
Gene beto normal awaa
~+
~++
aO a+
As moléculas das hemoglobinas normais ap resentam quatro níveis estruturais de organização: primária. secundária, reroária e quaternária. A estrutura terciária da hemoglobina resolve um Importante problema biológico. pois garante que seus aminoácidos polares, hidrófilos. fiquem na superfície da molécula, assegu rando a sua solubilidade no cicoplasma da hemácia, além de criar uma cavidade forrada por aminoácidos hidrófobos, onde fica a molécula de heme pouco solúvel. A associação dos pares de cadeias globínicas em tetrâmeros. em que cada cadeia se aglutina a uma molécula heme. determina a estrutura quaternária final da hemoglobina.
PATOGENIA MOLECULAR E CELULAR Nas talassemias, existe mais de uma centena de alterações genéticas. agrupadas em grandes deleções, pequenas deleções ou mutações pontuais, que determinam redução ou ausência da síntese de uma das cadeias globínicas em decorrência das alterações quanmativas ou qualitativas do RNA mensageiro (RNAm), essencial no processo de tradução de uma cadeia peptídica de globina.
Investigação laboratorial do paciente com anemia microcítica
Definição
HPFH
Gene alfa normal Gene beta anormal; ausência de produ· ção de cadeias beta Gene beta anormal, produção de 1O o 15% de cadeias beta Gene beta anormal; discreto redução no produção de cadeias beta Deleção dos quatro genes alfa, ousêncro de produção de cadeias alfa Deleçãa de em um dos cromossomas; produção diminuído de cadeias alfa Persistência hereditário do HbF; talasse· mio sem deleção que resulto em maior produção de HbF
Fisiologicamente, a síntese das cadeias alfa e bera é equilibrada, ou seja, são produzidas quantidades semelhantes de ambas as cadeias. Entretanto, como nas talassemias, a síntese de uma das cadeias de globina está diminuída ou ausente, este equilíbrio é perdido e o excedente de cadeias globínicas normais precipita-se no citoplasma da célula. As alterações estrutu rais das hemácias devem-se à interação entre esses precipitados e as proteínas do cicoesquelero da membrana celular, que incluem alteração do flu xo de cátions através da membrana citoplasmática, formação de irregularidades na sua superfície externa. formação de antígenos externos susceptíveis à ação de anticorpos específicos e. finalmente. diminuição da capacidade de deformação da célula. Esse processo acaba por culminar na destruição precoce da hemácia e. em alguns casos. ocorre antes do estágio final de maturação da hemácia, ainda na medula óssea. denominado "eritropoese ineficaz".
269
Nas síndromes betatalassêmicas, as alterações na membrana celular tendem a ser mais graves, uma vez que as cadeias alfa, por serem menos solúveis que as cadeias beta, apresentam mais toxicidade para as hemácias. Isso explica, parcialmente, as diferentes manifestações clínicas emre as calassem ias. Na tentativa de compensação da hemólise e/ou da eritropoese ineficaz, ocorre resposta medular com expansão da massa de precursores ericróides. Associada às lesões estruturais descritas. a deficiência de hemoglobinização no processo de maturação eritróide determina a hipocromia e microcitose características das talassemias.
TIPOS E FORMAS ClÍNICAS As manifestações clínicas da talassemia são bastante hecerogêneas e multifatoriais. Dependem do tipo e número de genes de globina comprometidos, além de estarem associadas às conseqüências simultâneas da hemólise, da anemia crônica, da hiperplasia eritróide na medula óssea, que leva a deformidades ósseas, e da sobrecarga de ferro corporal secundária ao tratamento com transfusões de hemácias.
~-talassemias
Existem três formas clínicas: talassemia maior, talassemia intermediária e talassemia menor (Tabela 24.8). A talassemia maior ocorre quando os dois genes beta são afecados e corresponde à forma mais grave da
enfermidade. As manifestações surgem no primeiro ano de vida e a necessidade de transfusões é precoce. Nas crianças mais jovens com doença de curta evolução não há alterações ósseas e a esplenomegalia é discreta. Na ausência de tratamento, o quadro clínico se agrava progressivamente e a morte ocorre ainda na primeira década de vida. A talassemia intermediária geralmente resulta da combinação de defeitos genéticos. As manifestações clínicas predominantes são: esplenomegalia. redução da massa muscular e alterações faciais. Os pacientes mantêm níveis de hemoglobina entre 7 g/dl e 11 g/dl e não dependem de transfusões regulares. Na sua forma mais leve, a talassemia menor ou traço talassêmico. os pacientes são habitualmente assintomáticos. O nível de hemoglobina está apenas ligeiramente diminuído. Reduções mais acentuadas podem ocorrer na presença de infecções e durante a gravidez.
a -talassem ias
Podem apresentar-se clinicamente como: hidropisia fetal. doença da hemoglobina H, traço alfa-talassêmico ou como portador silencioso (Tabela 24.9). A forma mais grave, causada pela deleção dos quatro genes alfa, é a hidropisia fetal. Como não há síntese de cadeias alfa, as HbA e HbF não são formadas. Ocorre morte intra-uterina ou logo após o nascimento. A doença da hemoglobina H, causada pela deleção de crês genes alfa, apresenta-se com graus variáveis de anemia hemolítica, esplenomegalia e alterações ósseas.
Tabe la 24.8 - Sínd romes ~-calassêm icas Tipo de hemoglobina Genótipo
Manifestações HbA
HbA2
Talassemia menor ~ talassemia l~+/~1 ~ talassemia l~/~1
J. J.
i i
Talassemia intermediário ~+S talassemia I~+S/~+S)
J.
J.
i
J.J.J. J.J.J.J.
variável variá vel variável
i i
Talassemia maior ~+ talassemia !~+/~+) ~+ talassemia !~+/~) ~ talassemia 1 130/ 1301
ausente
270 [ Medicina laboratorial para o clínico
HbF nl ou nl ou
nl ou
i i
Anemio hemolítica leve, hipocromio e microcitose Anemio hemolítica moderado, necessidade transfusional, hipocromio e microcitose Anemia hemolítica severa dependente de transfusão, hipocromia e microcilose
i
Tabela 24.9- Síndromes 0:-talassêmtcas Tipo de hemoglobina Manifestações
Genótipo HbA
Hb Boris
HbH
97 - 98%
0-2%
ausente
Parâmetros hematológicos normais
Portador silencioso
·waa
N ormal ou anemio hemolítica leve, hipocromio e microcitose
a-Talassemia menor /o.a a/ a
90 - 95% 90 - 95%
5 - 10% 5 - 10%
ausente ausente
.j.
25-40%
2 -40%
Anemia hemolítica moderada, necessidade transfusional pequena, hipacromia e microcitose
ausente
80%
o- 20%
Anemio hemolítica severo com morle intra-útero ou neonotol
Doença do HbH -; a Hidropsio fetal
I
No traço alfa talassêmico, em que há deleção de dois genes alfa, os pacientes podem se queixar de fraqueza, cansaço e algum grau de palidez. O tipo mais comum entre as a -talassemias, a do portador silencioso, ocorre devido à deleção de apenas um gene alfa. O paciente é assintomático, com parâmetros hemarológicos dentro da normalidade.
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTI CO DAS DIFERENTES FORMAS DE TALASSEMIAS Exames complementares são essenciais para o diagnóstico diferencial entre as talassem ias e outras anemias microcíticas e hipocrômicas e para a determinação do tipo e forma de talassemia. É bastante comum, na prática clínica, a necessidade de diferenciação entre anemia ferropriva e talassemia menor, a fim de evitarem-se iatrogenias na abordagem terapêutica dos pacientes. O depósito de ferro, a eritropoese e a contagem de reticulócitos
Nas talassemias, as alterações estruturais das hemácias ocasionam sua destruição precoce e subseqüente estímulo para produção medular, evidenciada pela hiperplasia eritróide. A despeito do aumento da eritropoese, os pacientes apresentam variados níveis de hemoglobina e de contagem de reticulóciros em função da ocorrência do fenômeno de eritropoese ineficaz.
Investigação laboratorial do paciente com anemia microcítica
O depósito corporal de ferro encontra-se aumentado e pode ser evidenciado pela dosagem elevada da ferritina, pesquisa de ferro medular, biópsia hepática ou escudo hepático por ressonância magnética.
A captação e o transporte de ferro
Nas ralassemias, o defeitO de hemoglobinização deve-se apenas ao déficit ou ausência de formação das cadeias de globina. Assim, como não ocorre deficiência de ferro, os exames para análise de sua captação e transporte (CTLF e 1ST) estão dentro dos valores de referência e são úteis no diagnóstico diferencial com a anemia ferropriva .
A hemoglobina e a microcitose
A dosagem de hemoglobina pode estar bem abaixo dos valores de referência na ~-talassemia maior e na forma grave da doença da hemoglobina H ou discretamente diminuída nos portadores de traço talassêmico. Níveis entre esses extremos são observados na formas intermediárias da doença. A inadequada hemoglobinização, pela síntese insuficiente de cadeias globínicas, determina a formação de hemácias microcíticas e hipocrômicas. Na talassemia menor, d iferentemente da anem ia ferropriva, em que se observa intensa anisocitose, não ocorre aumento do RDW.
271
A eletroforese de hemoglobina
Na prática clínica, a eletroforese de hemoglobina, especialmente com avaliação quantitativa das hemoglobinas A, A2. Fe de Bart. está 1ndicada para o diagnóstico diferencial entre os tipos e formas clínicas das ralassemias. Na ~-talassem ia. a eletroforese de hemoglobina mostra elevação da HbA2. Na forma intermediária, esse aumento de HbA2 é acompanhado por elevação de HbF e redução de HbA. Na beta-talassemia maior. a concentração relativa de HbF está entre 20 e 100%. os níveis de HbA2 entre 2 e 7% e de HbA entre Oe 80%. A análise cuidadosa do traçado eletroforético em pH alcalino permite a visualização de bandas de HbH. sugerindo a -talassemia. Entretanto, como a HbH é de difícil visualização por ser instável e se desnaturar com facil idade. é importante que o profissional de laboratório seja informado pelo médico requisitante sobre a intenção de investigação da a -talassemia. A pesquisa de HbH deve ser feita preferencialmente nas hemácias de sangue penférico, pela pesquisa de corpúsculos de inclusão. formados pela precipitação dos tetrâmeros de cadeias beta ou pela pesquisa dos corpos de Heinz, constituídos de Hb instável. No traço alfa-talassêm1co. a concentração de HbH situa-se em torno de 2%. enquanto na doença da hemoglobina H a sua concentração annge até 20%. Na hidropisia fetal não ocorre síntese de cadeias alfa e, assim, não há síntese de HbA nem de HbF. A eleu oforese mostra apenas Hb de Bart, além de pequenas quantidades de HbH e Hb Porrland. O portador silencioso da alfa-talassemia não apresenta alterações à eletroforese de hemoglobina e o único meio seguro de diagnóstico é a análise do DNA.
O estudo molecular
A partir da década de 70, a utilização de méwdos de análise do DNA tem sido muiw importante para o emendimenw da gênese das talassemias e de suas formas clín1cas. Atualmence. na prática clínica, o estudo molecular é reservado para o diagnóstico do estado de portador silencioso ou do traço alfa-talassêmico. Mais raramente. a análise do DNA está indicada na intenção de aconselhamento
272 [ Medicina laboratoria l para o clínico
genérico ou de realização do diagnóstico intra-uterino. nas ~-talassem ias. Para 1sso. é essencial que se faça o estudo molecular com determinação do aleio talassêmico presente em cada um dos pais. O diagnóstico da doença no feto é alcançado a partir da constatação, de ambos os alelos anorma1s dos pa1s, no DNA obtido de células das vilosidades coriôn1cas. entre a nona e a 20• semanas de gestação.
ANEMIAS SIDEROBLÁSTICAS
As anemias sideroblásticas são causadas por alterações no transporte e metabolismo do ferro corporal e constituem um grupo heterogéneo de doenças que têm em comum a presença. na medula óssea, de sideroblastos em anel (eritroblastos comendo numerosos grânu los de ferro arranjados em torno do núcleo). São caracterizadas por defeito na síntese da molécula heme, essencial à hemoglobinização das hemácias, levando à formação de células microcíticas e hipocrômicas.
A SÍNTESE DO HEME NA CÉLULA ERITRÓIDE O heme é uma molécula planar formada pela condensação de quatro núcleos pirrólicos, comendo em seu centro um áromo de ferro na forma Fe++ Desempenha papel fundamental em muitas reações bioquímicas e sua síntese ocorre no tecido eritróide, para ser incorporado à hemoglobina, ou, em menor escala, no fígado, onde é utilizado como parte do citocromo P450. Desse processo de síntese participam oito enzimas, sendo quatro citoplasmáticas e quatro mirocôndriais. Seu primeiro passo consiste na condensação de glicina à succinii-CoA dando origem ao ácido aminolevulínico (ALA). Ocorre na mitocôndria e é catalisado pela enzima ALA smtetase (ALA-S). sob ação do co-faror piridoxil S'fosfato (forma ativa de vitamina B6). Os próximos quatro passos da síntese do heme ocorrem no citoplasma. com a participação das enzimas ALA dehidratase (ALA-O), monopirrol porjobilinogêneo (PBGD). uroporj1rinogêneo III sintetase (URO-S) e uroporfirinogenêo decarboxilase (URO-D). Inicialmente, duas moléculas de ALA se condensam formando uma molécula pirrólica. A partir daí, o processo prossegue e culmina na formação citoplasmática de uma molécula tetrapirrólica.
Finalmente, de novo na mirocôndria, com a parricipação das enzimas coproporfinogêneo oxidase (CPO), protoporfirinogêneo oxidase (PPO) e Jerroquelatase (FC), a molécula tetrapirrólica é convertida em proroporfirina IX que, por sua vez. inclui o átomo de ferro na sua estrutura, finalizando, assim, a síntese do heme, essencial na hemoglobinização dos eritrócitos.
ETIOLOGIA E PATOGÊNESE A partir do entendimento do processo de síntese do heme, tornou-se claro que as alterações nas enzimas erirrocirárias, essenciais para a formação da protoporfirina IX, ou alterações em proteínas envolvidas no metabolismo do ferro prejudicam a produção normal do heme e constituem o mecanismo eriopatogênico em alguns tipos de anemia sideroblásrica. Em outras situações, entreramo, esse mecanismo ainda permanece desconhecido. As anemias sideroblásticas podem ser hereditárias, com alterações genéticas hererogêneas ou adquiridas, reversíveis ou não. As formas hereditárias apresentam padrão de herança autossômico, ligado ao cromossoma X ou associado a defeiros congêniros esporádicos. As formas adquiridas podem ser associadas à deficiência de piridoxina (vitamina B6) ou idiopáticas e determinadas por uma disfunção clonai na stem ce/1 pluripotente. As anemias sideroblásticas reversíveis são aquelas secundárias a drogas que prejudicam a síntese do heme ou alteram o metabolismo mirocondrial do ferro. O chumbo, por exem plo. ini be as enzimas que participam da síntese do heme e a isoniazida produz anemia pela depleção do co-fator piridoxina. Têm sido relatados, também, casos de anem1a sideroblásrica associadas ao uso de cloranfen icol ou álcool. Independentemente de serem genéricas ou adquiridas, todas as formas de anemia sideroblástica levam ao acúmulo de ferro nos precursores eritróides, determinando formação dos sideroblastos em anel. Acredita-se que quatro fatores participem na patogênese do acúmulo de ferro mirocondrial: 1) o ferro intracelular é direcionado principalmente para a mirocôndria; 2) o ferro não pode ser utilizado pela falta de proroporfirina IX; 3) há falta de heme para agir como mecanismo regulador de feedback negativo na captação de ferro; 4)
Investigação laboratorial do paciente com anemia microcítica
o ferro pode deixar a micocôndria somente após ser inserido na proroporfi rina IX. Como visto, na eventualidade de acúmulo de ferro corporal, a absorção desse mineral é reduzida. mas não é completamente interrompida. Deste modo, impõe-se uma sobrecarga corporal. Ocorre completa saturação da transferrina plasmática e o excesso de ferro não ligado à transferrina se liga à albumina, ao ciuato, aos aminoácidos ou a outras pequenas moléculas, formando complexos de baixo peso molecular, altamente tóxicos para as células. Esses complexos, captados preferencialmente por tecidos não-hematopoéticos, acabam por se depositar no fígado, rins, coração, tecido endócrina e pele, determinando lesões teciduais e comprometimento funcional desces órgãos. Dessa maneira. podem ocorrer diabetes, insuficiência hepática. cardíaca ou renal e, nas crianças, o crescimento e o desenvolvimento sexual podem estar comprometidos.
O LABORATÓRIO NO DI AGNÓSTICO DAS AN EMIAS SID EROBLÁSTICAS A propedêutica laboratorial nas anemias sideroblásrica é vasta e envolve desde análises séricas até biópsia de tecidos. A chave para o diagnóstico é a presença na medula óssea de sideroblastos em anel numa proporção superior a 15% dos eritroblastos e detectados pela coloração com azul da Prússia. Morfologicamente, os sideroblastos são observados em estágios mais tardios de maturação dos erirroblastos nas anemias sideroblásticas congên itas. ao passo que nas formas adquiridas eles ocorrem em todos os estágios de maturação dessas células.
O depósito de ferro e a eritropoese
Embora a sobrecarga de ferro seja demonstrada pelo aumento na dosagem do ferro sérico, na saturação de transferrina, na dosagem da ferririna ou pela ressonância magnética hepática. renal ou cardíaca, a biópsia hepática é considerada o mérodo mais sensível para esta análise, além de proporcionar dados para determinação do prognóstico, ao demonstrar o grau de agressão hepática e/ou cirrose. A despeito do excesso de ferro, a hemoglobinização é deficiente, pelo defeito na síntese da molécula heme,
273
e contribui
para o fenômeno de eriuopoese ineficaz.
Observa-se hiperplasia eritróide na medula óssea, mas ocorrem anemia e reticulociropenia. Na anem1a sideroblástica hereditária ligada ao cromossoma X, o nível de proroporfirina eritrocítica livre
CONSIDERAÇÕES FINAIS O estudo da cinética do ferro é imprescindível na investigação das anemias hípocrômicas e microcícicas. A anemia de doença crónica, abordada no capítulo 25,
de procoporfinna conseqüente ao déficit na at1v1dade da
pode apresentar-se com VCM e HCM subnormais, por isso deve integrar o elenco das anemias que se benefi-
enzima ALAS.
ciam da cinética do ferro para diagnóstico diferencial,
(PEL) escá diminuído e reflete a diminuição na produção
além das anemias ferropriva, talassêmicas e sideroblásciA captação e o tra nsporte do ferro
A captação de ferro pela célula eritróide não está alterada na vigência de diminuição da síntese do heme, levando ao acúmulo de ferro no interior da célula. O fer-
cas. como mostra a Tabela 24.10. Com base nos objetivos propostos para este capítulo, sugere-se a utilização do fluxograma a seguir pa ra a investigação laboratorial do paciente portador de anemia microcítica (Figura 24.1).
ro também continua a ser transportado normalmente para a mitocôndria, onde ele se deposita sob a forma de ferritina. produzindo os sideroblastos em anel.
O ferro hemoglobínico e a microcitose
O denominador comum em todos os tipos de anemia sideroblástica é a alteração na síntese do heme nos precursores eritróides, prejudicando a produção de hemoglobina e levando à formação de hemácias hipocrômicas e microcít1cas ou com formas anómalas.
À análise do sangue penférico. observa-se diminuição dos níve1s de hemoglobina, anisocitose, aumento do RDW e poiquilocicose. Podem ser encontrados, a1nda, siderócitos (hemácias hipocrômicas com depósi to de ferro, os corpúsculos de Pappenheimer). A contagem de reticulóciws está diminuída e reflete a eritropoese ineficaz. Leucócitos e plaquetas são normais, mas podem estar diminuídos na presença de esplenomegalia (hiperesplenismo).
Figura 24.1 - Fluxograma paramvesngação dasanem1as m1crocíncas.
Tabela 24.10- DiagnóstiCOd1ferenC1al das anemias microcíticas hipocrômicas. de acordo com a cinénca do ferro Anemio ferroprivo
Anemio de doença crônico
Talassem ias
Anemia sideroblástica
Fe sérico
.!.
.!.
normal
i
CTLF
i
.!.
normal
normal
1ST
,J,
normal
normal
normal
Feml1na
,J,
norf11al ou i
normal ou i
i
274
Medicina laboratorial para o clínico
REFERÊNCIAS 1. Alcindor T, Bridges KR. Sideroblascic anaemias. Br J Haemarol. 2002;116(4):733-43. 2. Brugnara C lron deficiency and eryrropiesis: new diagnosric approaches. Clin Chem. 2003;49:1573-8. 3. lans FH, Urban )E, Keffer )H, Kroft SH. Discriminaring be-
Scuarr HO, Nachan DG. The rhalassem1as. ln: Nathan DG, Orkin SH, G1nsburg O, Look AT. Narhan and Osk1's Hemacology of lnfancy and Childhood. 6th ed. Ph1ladelph1a: Saunders; 2003. p. 842-919. 6. World Health Organizanon/Un1ted Nanons Children's
rween iron deficiency anemia and anemia of chronic di-
Fund/Unired Narions Un1vers1ry [l-Iame page da imer-
sease us1ng rrad1nonal ind1ces of iron srarus vs rransferrin recepwr concemration. Am J Clin Parhol. 2001;115:112-8. Roy CN, NC Andrews. Recenr advances in disorders of 1ron mecabol1sm: muranons, mechanisms and modifiers. Hum Moi Gener. 2001;10(20):2181-6.
ner] lron deficiency anaem1a. Assessmenr, prevenr1on and conrrol. A guide for programme managers. Geneva: World Health Organization/United Nations Chddren's Fund/Unired Nations Universiry; 2001. Disponível em: http://www.who.int/nurririon/publicatiOns/en/ida_assessment_prevention_control.pdf
4.
Investigação laboratorial do pacienre com anem ia microcítica
5.
275
Rachel Aparecida Ferreira Fernandes Camila Silva Peres Cancela Paulo do Vai Rezende Rosa Ma/ena Delbone de Faria
25
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM ANEMIA NORMOCÍTICA
As anemias normocíticas constituem um grupo caracterizado pela presença de hemácias com VCM dentro dos limites de referência. específicos para cada faixa etária. No que diz respeiro à fisiopatologia, podem ser secundárias ao aumento da destruição das hemácias. a sangramentos agudos ou à diminuição da eritropoese. É im portante lembrar que, como o VCM reflete a média do volume das hemácias, em alguns casos de anemias caracteristicamente microcíticas ou macrocíticas esse índice pode estar normal, tão somente por se tratar de quadro inicial com número ainda reduzido de células morfologicamente alteradas. Portanto, para o diagnóstico diferencial, o contexto clínico deve ser rigorosamente considerado na orientação da propedêutica laboratorial mais apropriada para cada caso. Discutir-se-ão neste capítulo as anemias hemolíticas por defeitos intrínsecos do eriuóciro e as anemias por déficit de eritropoese associadas às doenças crônicas e à insuficiência renal. As anemias hemolíticas por defeiros extrínsecos do eriuócito e a anemia aplástica serão abordadas no capítulo 26.
na medula óssea, no baço ou no fígado. A sobrevivência da hemácia, por este período, depende tanto da garantia da sua atividade metabólica. a despeito da ausência de núcleo, quanto da sua capacidade de deformabilidade e resistência ao passar por capilares sinusóides com diâmetros inferiores ao seu ou por microambientes com diferentes osmolaridades. A integridade da escrucura da membrana celular e a solubilidade do conteúdo citoplasmático consticuem os principais determinantes da maleabilidade dos eritrócitos. Assim. qualquer alteração na atividade enzimática dos eriuócitos ou na sua maleabilidade, especialmente devido a defeitos na estrutura da membrana ou na solubilidade do seu conteúdo citoplasmático, culmina na sua morte precoce.
ESFEROCITOSE HEREDITÁRIA (EH) A EH corresponde, dentro do grupo de anemias hemolíticas. por defeitos na estrutura da membrana celular. a mais prevalente, com freqüência estimada em 1/1.000 a 2.500 nascidos vivos entre os descendentes do norte europeu. Caracteriza-se por hemácias morfologicamente esféricas e asmaticamente frágeis.
ANEMIAS HEMOLÍTICAS POR DEFEITOS INTRÍNSECOS DO ERITRÓCITO Estrutura da m e mbrana eritrocitária
Após a liberação da medula, os eritrócitos vivem cerca de 90 a 120 dias até serem removidos da circulação sanguínea pelos macrófagos do sistema mononuclear fagocitário
Embora represente apenas 1% do peso total do eriuócito. sua membrana desempenha importante papel na
preservação da ln[egridade celular, par[icipando de várias funções metabólicas, tais como a resposta à emropoetina, a captação da molécula de ferro essencial à síntese de hemoglobina. a retenção de componentes vitaiS, como o fosfaco orgânico. a remoção de decriros metabólicos e a garantia da capacidade de deformabilidade celular, além de manter a superfície da célula "escorregadia", evitando sua aderência ao endmélio e subseqüente obstrução da microcirculação. É consticuída por lipídios. proceínas e apenas uma pequena proporção de carboidracos. Os ltpídtos correspondem a cerca de 50% do peso da membrana celular e estão estruturados em uma dupla camada de fosfo lipídios. onde se intercalam glicolipídios e colesterol. Pelo menos uma dúzia de proceínas maiores e centenas de proteínas menores fazem pane da membrana erirrocirária e podem ser classificadas em integrais e periféricas. As proceínas integrais são aquelas que atravessam coda a dupla camada de lipídios (glicoforinas e banda 3), enquanto as proceínas periféricas (especcnna, anquirina, rropomiosina, fi lamentos curtos de accina, aducina, proceínas 4.1, 4.2 e p55) interagem com as proceínas integrais e com os lipídios na superfície da membrana, mas não penecram a camada bd1pídica. Figura 25.1. As proceínas periféricas formam, na face cicoplasmárica da membrana celular. o cicoesqueleco, que constitui o principal determinante da elasticidade e estabilidade morfológica da hemácia. Quanto à permeabilidade, normalmente a membrana é impermeável aos cárions e alramence permeável aos ânions e água. Uma importante característica das membranas normais é a capacidade de mancer consrance o volume emrocirário. mesmo em ambientes osmoncamenre inóspiros, por meio da troca de ân1ons e água através de canais específicos.
Etiopatogenia
Na EH, o defeico celular primário é a perda de área da superfície de membrana em relação ao volume, levando à alteração morfológica, em esfera, caracterizada por diminuição na capacidade de deformação da célula e conseqüente redução na sua sobrevida. A EH pode decorrer de uma deficiência ou disfunção, única ou combinada, das proceínas da membra na plasmática, sem simultâneo comprometimenco primário dos componences hpíd1cos.
278 [ Medicina laboratorial para o clínico
I Gltcof01ino A 1
Especlnno-Anquiuno-Bondo3 tnii!IDÇDO
Figura 25.1 - Representação esquemáttca da estrutura da membrana emromária.
Em microambiences físico ou qu1m1camente agressivos às hemácias, esse desequilíbno entre o componente lipídico e procéico da membrana cicoplasmárica leva à formação, em sua superfície externa, de vesículas que se desprendem causando dimin uição da relação área de superfície/volume celular. Assim, o eritrócico assume forma mats esférica, denominada esferócito. O baço é o exemplo mais clássico de ambiente hostil às hemácias e pnncipal local de formação do esferóciro. Neste órgão, o diâmetro e stnuosidade dos vasos esplênicos associados ao baixo pH, às altas concentrações de radicais livres tóxicos produzidos pelo carabolismo dos fagóciros e aos baixos níveis de glicose e ATP contri buem para a perda de membrana ericrocitária, cujo processo ocorre vagarosamente. A cada passagem pelo baço, a hemácia sofre graus variáveis de lesão até que é retirada da circulação pelos fagóciros. A velocidade e tntenstdade das lesões celulares podem aumencar em derermtnadas condições biológicas, como, por exemplo. nas tnfecções. Em aproximadamente 75% dos pacientes, o padrão de herança da doença é aurossômico domtnance, mas raramente pode ser não-dominante ou representar mutações de novo. O defeito molecular básico é heterogêneo e envolve, principalmente, mutações nos genes da bera especrrina, anquiri na, banda 3 ou da proteína 4.2. Em cerca de 60% dos casos de EH, as anormalidades bioquímicas correspondem à deficiência de especrrina,
isolada ou associada à deficiência de anquirina. Nesses pacientes, o grau de instabilidade da dupla camada lipídica. bem como da fragilidade osmótica da célula, é proporcional ao grau de deficiência da especuina. Ra ros casos de duplo dominante, especialmente de banda 3 e espectrina, evoluem com hemólise muito grave e resultam em morte fetal ou no período neonatal.
são medular, mais comumeme o parvovírus B19. Podem causar quadros muico graves de anemia. As crises megaloblást1cas devem-se à deficiência de folaro secundária ao aumento de demanda, pela hiperplasia erirróide medular, sem correspondente aumento na oferta. É mais comu m em pacientes grávidas ou que não fazem uso de áCido fólico suplementar.
Manifestações clínicas
O laboratório no diagnóstico da esferocitose hereditária
As manifestações clínicas da EH podem ocorrer em qualquer época da vida e apresentam gravidade exrremamente variável. desde ausência de sintomas até incompatibilidade com a vida. A esferocirose típica é caracterizada pela história fam iliar positiva e evidência de hemólise, reticulocicose, esplenomegalia e icterícia. A maioria dos pacientes cem hemólise incompletamente compensada, com anemia leve a moderada. Só uma pequena proporção de pacientes apresenta anemia grave. Nestes, as manifestações clínicas incluem as complicações da anemia crónica não compensada. tais como retardo de crescimento, arraso da maturação sexual, úlceras de membros inferiores ou expansão medular com deformidades ósseas, principalmente de face. A icterícia é observada em cerca de 50% dos pacientes, em pelo menos um episódio durante a vida, e é ma1s Intensa em infecções virótlcas. No período neonaral. ela pode ser muito grave, sendo necessário o diagnóstico diferencial com anem1a hemolítica do recém-nascido. A hemólise crónica, com icterícia persistente, predispõe à formação de cálculos biliares, sendo esta uma complicação comum da esferocicose, especialmente em adolescentes e adultos. A esplenomegalia é detectável em torno de 50% das cnanças e em 75 a 90% dos adultos. Raramente é extensa. Durante a evolução da doença, poderão ocorrer crises periódicas que agravam o quadro clínico basal. São as denominadas crises hemolíticas, aplásricas ou megaloblásricas. As crises hemolíticas são comuns em crianças e cursam com piora da anemia e da icterícia, além do aumento do grau de esplenomegalia e da contagem de rericulócicos. Estão tipicamente associadas a infecções viróricas. As crises aplásricas ocorrem depois de processos infecciosos que induzem supres-
Investigação laboratorial do pacienre com anemia normocírica
Além das alterações hematológicas específicas da EH, é imporranre lembrar que, em graus vanáve1s, pode-se
observar, ainda, aumento de bilirrubina indireta, aumento da desidrogenase láctica e diminuição da hapcoglobina, refletindo elevação da destruição de eritrócitos. O hemograma e a contagem de reticulócitos
A característica fundamental da EH é a presença de numerosos esferócitos no esfregaço de sangue periférico, embora não sejam pacognomônicos e possam estar presentes, também, nas anemias hemolíticas imunes. Os valores de hemoglobina são extremamente variáveis e a concentração de hemoglobina corpuscular média está aumentada (entre 35 e 38%) em cerca de 50% dos pacientes. A contagem de rericulócicos está elevada. O RDW pode estar aumentado em decorrência do aumento de hemácias jovens circulantes, porém em níveis inferiores aos observados na anemia falciforme. Na vigênc1a de crises, aplásrica e megaloblásrica, a contagem de rericulócicos diminui e o grau de anemia se agrava. A curva de fragilidade osmótica
t o exame mais útil para o diagnóstico. Consiste em submeter hemácias a soluções salinas progressivamente mais hiporônicas. Esse reste é capaz de evidenciar alterações da superfície do eriuócico, pois, devido à menor relação superfície/volume, as células alteradas são lisadas em soluções de osmolaridade mais baixa (Figura 25.2). Na vigência de curva de fragilidade osmótica normal, o exame aumenta sua sensibilidade, incubando a amostra por 24 horas (Figura 25.3).
279
100
--- ---
90 80
--
Faixo normalizado
'\ \
Paciente \
Contro le
\ \ \
70
\
\ \
-~
60
E
50
~
40
7õ C1>
\
''
''
I
''
''
--- ---
\ \
''
30 20
''
''
10
''
o 0,10
0,20
0,30
0 ,35
0,40
0,45
0,50
0 ,55
0,60
0,65
''
''
0,75
''
' 0,85
% NaCI
Figura 25.2 -Curva de fragilidade osmócica, com desv1o rípico para à direica, em paoence com Esferocicose hered1cária.
EN ZIMOPATIAS ERITROCITÁRIAS
O teste de fragilidade osmótica com resultado dentro da normalidade não exclui o diagnóstico de EH e pode ocorrer em 10 a 20% dos casos. O teste pode ser negativo na associação com anemia ferropriva e na fase de recuperação da crise aplá'>LiLé!, quando o número de hemácias jovens, ainda sem perda de membrana, está aumentado. No período neonatal, o diagnóstico é dificultado pela presença da hemoglobina fetal, que torna as hemácias mais resistentes à lise osmótica. Nessa fase, o diagnóstico poderá ser feico pelo estudo do sangue dos pais. Casos de difícil diagnóstico podem ser investigados por testes adicionais. como análise das proreínas de membrana, quantificação das proceínas de membrana ou determi nação do defeito molecular pelo estudo da mutação. O estudo
A hemácia mad ura apresenta metabolismo bastante peculiar, em função da ausência de núcleo e de organelas citOplasmáticas essenciais para a síntese lipíd 1ca, procéica e fosforilaçào oxidaciva. Assim, a energia necessária para a manutenção da capacidade redutora celular e do funcionamento da bomba de sódio -pocássio, que asseguram a integridade desta célula, especialmente quando submetida a escresse oxidacivo, provém exclusivamente do metabolismo da glicose citoplasmática. Qualquer deficiência, quali tativa ou quantitativa, nas enzimas envolvidas no ciclo metabólico da glicose eritrocitária pode levar à morte celula r precoce, causando anemia hemolítica com espectro cl ínico variado. Dentre as alterações enzimáticas, a deficiência de glicose-6-fosfacodesidrogenase (G6 PD) constitui a mais comum, seguida da deficiência de piruvatoquinase (PK).
molecular
O estudo molecular para detecção do gene envolvido no processo patogênico celular é muito raramente indicado no diagnóstico da EH e não tem aplicação na prática clínica. Estudos moleculares têm mostrado que achados morfológicos específicos estão associados a determinados defeitos de proceínas, entretanto, ainda restringem-se a estudos científicos.
280 [ Medicin a laboratorial para o clín ico
Defeito molecular e patologia celular
A glicose é capeada pela hemácia através de carreadores de membrana, independentemente da ação da insulina, e seu metabo lismo se dá por duas vias meta bólicas distintas, como está esquematicamente representado na Figura 25.4.
100 Faixo normalizado
90
Paciente
80
Controle
70 Q)
"'
Curva pré-incubação
60
':(5
E Q)
50
~
40
I
30 20 10
o 0, 10
0,20
0,30
0 ,35
0,40
0 ,45
0 ,50
0,55
0 ,60
0,65
0 ,75
0 ,85
% NaCI
100
------
90
Fa ixo normalizada
.... ....
80 70
Paciente
.... ....
'I
Controle I I I
Q)
.~
Curva pós-incubação
I
60
I I
':(5
E Q)
50
~
40
I
I
'' ' ' ....
30 20
''
''
10
' ' ... __ ' '
o 0,10
0,20
0,30
0,35
0,40
0, 45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,75
-0,85
% NoCI
Figura 25.3- Curva de frag1hdade osmótica, de um mesmo paCieme, ames e após 1ncubação.
Em condições fisiológicas, a via glicolítica de Emb-
Uma segunda via para o metabolismo da glicose ce-
den-Meyerhoff (anaeróbica) é responsável por aproxi -
lular é a via das pentoses ou aeróbica. Embora em con-
madamente 90% d o metabolismo da glicose eriuocitária
dições fisiológicas esta via contribua com cerca de W%
e
determina a produção de adenosina-uifosfaro (ATP)
do metabolismo da glicose erirrocitária, em vigência de
através da conversão de glicose em ptruvaro. Várias en-
est resse oxidativo (infecções, drogas), ela sofre mais ati-
zimas participam dessa via
e qualquer defe1ro em
algu-
vação e responde por até 90% da glicó lise celular. Nessa
ma delas apresenta potencial de hemólise, podendo ser,
via metabólica, a enzima G6 PD converte a glicose eritro -
ou não, clinicamente significativa. A enzimopatia mais
citária em nicorinamida adenma dinucleotídeo fosfato
comum dessa via é a deficiência de PK, seguida da de-
(NADP) e na sua forma reduz1da (NADPH). Além de
ficiência de glicose-fosfaw-isomerase (GPI), ambas com
participar de reações celulares para a produção energéti-
padrão de herança aurossômica recessiva.
ca, a NADP e NADPH participam como co-faror na re-
Investigação laboratoria l do paciente com anemia normocítica
281
dução do glurarion (GSH), de fundamental importância na proceção do eritróciro contra lesões oxidativas e na preservação de grupos sulfidrilas.
Via d e Embden-Meyerholf. ou onoeróbica
Via dos Pentoses ou oeróbia
GPI ..._)
X (hemizigoros). Nas mulheres, a deficiência enzimática dependeria da ocorrência de mãe portadora e pai afetado. A deficiência de G6 PD apresenta prevalência aumentada nas regiões da África e Ásia tropicais, Mediterrâneo e Oriente Médio, acometendo mais de 200 milhões de pessoas em wdo o mundo. No Brasil, a doença acomete cerca de 2 a 10% da população, com mais incidência em negros, pardos e descendentes de povos do Mediterrâneo. Mais de 300 variantes da enzima já foram descritas. As mais comuns são denominadas G6 PD A , A+ e s- (ou mediterrânea), sendo esta última usualmente associada a manifestações clínicas mais importantes.
Manifestações clínicas
G6PD. glicose 6 fosfam desidrogenase: GPI. glicofosfato isomerase; PK, piruvatoquinase; \JADP, ntcot~namida ademna dtnucleotídeo fosfam: NADPH, mcocinamida adentna dtnucleotídeo fosfato {forma reduZida): GSH, glutation; GSSG, glumion (forma reduztda); ATP, adenostna tnfosfato.
Figura 25.4 - Fluxograma simplif1cado do metabolismo da glicose na hemáoa.
A G6 PD está presente no citoplasma da maioria das células somáticas. Entretanto, sua carência nas hemácias apresenta impacro mais evidente do que em oueras células, pois em situações de sobrecarga oxida tiva, o consumo de glucation das hemácias, sem adequada reposição secundária à sua incapacidade de síntese, provoca rápida exaustão das reservas citoplasmáticas, com subseqüente lesão irreversível da membrana celular e hemólise precoce. O gene que codifica a G6 PD localiza-se na região celomérica do braço longo do cromossoma X, o que impl ica um padrão de herança mendeliana ligada ao X. Assim, os homens apresentam mais chances de apresentar manifestações clínicas da doença quando herdam o gene, uma vez que possuem somente um cromossoma
282
Medicina laboratorial para o clínico
A grande maioria dos pacientes com eritroenzimopatias é assintomática. Na eventualidade de manifestações clínicas, elas estarão sempre ligadas à hemólise. Deficiências enzimáticas na via Embden-Meyerhof (ex: deficiência de PK) causam esgocamento energético precoce e destruição celular, mesmo na ausência de esrresse oxidacivo. Entretanro, por serem bem mais raras que as deficiências enzimáticas da via aeróbica, ap resentam menos importância clínica. Por outro lado, as enzimopatias da via das pentoses, além de serem mais prevalentes, apresentam manifestações clínicas mais freqüentemente. A deficiência de G6 PD destaca-se entre essas enzimopacias, por sua elevada prevalência, e pode manifestar-se com formas clínicas distintas, incl uindo a forma hemolítica clássica, icterícia neonacal ou forma hemolítica crônica. A forma hemolítica clássica caracteriza-se por crises de hemólise aguda e, em geral, o paciente apresenta-se em situação de equilíbrio, sem alterações cl ínicas significativas. Todavia, qualquer esu esse oxidacivo desencadeado por processos infecciosos ou agentes oxidantes naturais ou artificiais (Tabela 25.1) poderá provocar hemólise. O grau de hemólise está associado à variante enzimática deficiente e ao tipo de "agressor" envolvido. Entre 24 e 48 horas do início do processo, pode haver elevação de temperatura, fadiga muscular, mal-estar gerai, dor abdominal ou lombar, náuseas, diarréia e hematúria. Ao exame físico, o paciente pode apresentar-se pálido, iccérico, com heparoespleno megalia e distensão abdominal. Dependendo da intensidade da anemia, pode-se observar
comprometimento hemodinâmico (taquicardia, hi potensão e até choque). Usualmeme, as crises hemolíticas são aurolimitadas, com resolução completa e de forma espomânea em cerca de sete dias. A normalização dos níveis de hemoglobina varia entre três e seis semanas, conforme o grau de destruição das hemácias. Tabela 25.1 - Drogas que devem ser evitadas na deficiência de G6 PD Antimaláricos
Analgésicos
Primoquino 1
Acido ocetilsolicilico4 Acetofenetidino
Pomoquino Cloroquina2
Sulfonamidas e sulfonas
Anti-helminticos
Sulfonilomide Sulfopiridine Sulfodimidine Sulfocetomide Sulfosolozino Sulfixosozo lo Dopsono 3 Sulfoxo ne G lucosulfono sódico Septrin (G iibenclomido)
Beto·noftol Stibofen N iridozol
Outros antibacterianos
Miscelânea
Nitrofurontoino Furozolidono N itrofurozono Acido nolidíxico Cloronfenicol Acido porominosolicílico Ciprofloxocin
Anologos do vitamino K5 Naftalina Pro benecide Dimercoprol Azul de metileno Arsino Azul de toluidino M e pocrine Henno
1Doses reduzidas podem ser adm1n1stradas sob superv1são. se necessáno Pode ser adm1n1suada sob superv1são para profllax1a ou tratamento de Malána 3Pode provocar hemóltse em Indivíduos saudáveiS.emaltas doses 4 Paraceramol é uma alrerna(lva segura >Menad1ol 01 mg por v1a parenteral pode ser utilizado com segurança para pro· filax1a da doença hemorrágica do recém-nasodo. Mod1ficado de WHO WorkingGroup: Glucose 6-phosphare dehydrogenase denciency. Buli WHO 1989;67:601. 2
A icterícia neonaral constirui uma forma clínica me-
nos comum. Pode apresentar-se como icterícia fisiológica mais intensa ou mais prolongada. Raramente observa-se aumento de bilirrubina ao nascimento. A manifestação inicial ocorre emre o segundo e terceiros dias de vida e pode haver elevação acentuada dos níveis de bilirrubina, com risco de kernicterus. A icterícia, geralmente, é mais significativa que a anemia, exceto na eventualidade
Investigação laboratorial do paciente com anemia normocítica
da ocorrência de infecções congénitas ou adquiridas ou de comam com medicações, quando o recém-nascido pode apresentar quadro mais grave de anemia. Um pequeno grupo de pacientes apresenta algum grau de hemólise crônica. mesmo em siruação de equilíbrio (sem o estresse oxidativo). Acredita-se que, apesar de haver função enzimática preseme, exista oxidação contínua de grupos sulfidrila. com lesão da membrana eritrocitária e hemólise extravascular. O paciente apresenta anemia crônica. reticulocitose. icterícia e esplenomegalia de intensidades variáveis.
O laboratório no diagnóstico das enzimopatias eritrocitárias
A hipótese diagnóstica das eritroenzimopatias normalmente é formulada após confrontar-se com um quadro clínico suspeico de anemia hemolítica. com elevação da dosagem sérica de desidrogenase láctea, hiperbilirrubinemia com predomínio de bilirrubina indireta e redução de haptoglobina, entretanto. a confirmação diagnóstica é realizada por avaliação laboratorial da atividade enzimática específica. O hemograma e a contagem de reticulócitos
Na ausência de outras doenças hemacológicas associadas, o hemograma constata a presença de anemia normocítica e normocrômica, de intensidade extremamente variada, com níveis de hemoglobina de até 2.5 g/dl. À hematoscopia, pode-se observar anisocicose, poiquilocitose com células denteadas, esquizócicos, policromatofil ia e corpúsculos de Heinz (precipitados de hemoglobi na desnaturada). A série granulocítica geralmente apresenta-se normal ou elevada, mas com infecções pode ocorrer leucocicose com desvio para a esquerda e granulações tóxicas. A contagem plaquetária é geralmente normal. Os pacientes apresentam reticulocicose variável. com valores que podem chegar a 30% ou mais. Avaliação da atividade enzimática
A avaliação da atividade enzimática pode ser realizada direta ou indiretamente. A forma indireta consiste na
283
medida da concentração de metabóliros intermediários das vias de glicólise, utilizando o raciocínio de que o bloqueio enzimático em um pomo da via do metabolismo da glicose gera aumemo da concemração da substância imediatameme amerior à enzima afetada e redução do componeme imediatamente seguime. No caso da deficiência de G6 PD, pode-se observar a diminuição de formação de NADPH por espectoforometria. Emretamo, o diagnóstico de certeza da enzimoparia será realizado após a dosagem enzimática específica. O espectro da faixa de normalidade para as enzimas da via anaeróbica é grande, mas a maioria dos indivíduos homozigotos apresema valores de atividade inferiores a 25%. Na via aeróbica, os testes mais comuns para avaliar a deficiência de G6 PD são os semiquamitativos de redução da metemoglobina. mérodos de fluorescência e colorimétricos. Alguns cuidados devem ser tomados na avaliação clínico-laboratorial das eritroenzimopatias. Sabe-se que a atividade enzimática nos granulócitos e nos retlculócitos é maior que nas hemác1as maduras, desta forma, a exclusão dos granulócitos da amostra é essencial para evitarem-se resultados falso-negativos que também podem ocorrer se o teste for realizado durante ou logo após uma cnse hemolítica aguda, quando há aumento da comagem reticulocitária. Outra causa de equívoco, na dosagem da atividade enzimática específica, pode decorrer da sua realização após transfusão de hemácias com adequada função enzimática. determinando resultados normais em um indivíduo doeme. Mais recemememe, com o avanço da Biologia Molecular, estudos genéticos podem ser utilizados na identificação de variantes da doença, bem como no estabelecimento de perfis genocípicos regionais e familiares.
ANEMIA FALCIFORME O termo doença falciforme é genérico, usado para determinar um grupo de alterações genéticas caracterizadas pelo predomínio da HbS nas hemácias. Essas al terações incluem a anemia falciforme (homozigose para HbS), as duplas heterozigoses, ou seja. as associações de HbS com outras variantes de hemoglobinas, tais como,
284 ( Medicina laboratorial para o clínico
HbD. HbC e as inrerações com ralassemias. As síndromes falciformes incluem a~nda o rraço falciforme (HbAS) e a anemia falciforme associada à perSIStência de hemoglobina fetal (HbF). A anemia falciforme (HbSS) é a doença hereditária mais comum no Brasil. Decorre de uma mutação no gene que codif1ca a cade1a beta-globina, localizado no braço curto do cromossoma 11. gerando a hemoglobina S (HbS), em substituição à hemoglobina A (HbA) normal. A HbS teve sua origem no comineme africano e sua introdução no Brasil remete ao período da imigração forçada de negros, durante a escravidão. Embora a sua real ino dênoa não seja conhec1da, estima-se que ela varie entre 3 e 8% da população brasileira, conforme a intensidade do fluxo da população negra em cada região do país.
Fisiopatologia
Na anemia falciforme, a mutação no cromossoma 11 determina a codificação da valina em substituição ao ácido glutâmico na posição 6 da cadeia beta-globina. Esta pequena modificação estrutural permite comatos intermoleculares. impossíveis na hemoglobina normal. que provocam a polimerização da HbS em gel viscoso, causando diminuição da capacidade de deformação do eritrócim e alterações da sua membrana celular. A polimerização da HbS, progressiva e proporcional ao grau de hipóxia celular, altera a forma maleável da hemácia normal, bicôncava, para a forma rígida de foice. Este processo, denominado falcização, pode ser revertido se houver restauração do aperte de oxigênio para a célu la, antes que ocorra deformação permanente da sua membrana ciroplasmática. A falcização das hemácias pode ser influenciada por alguns fatores, como grau de desidratação celular, porcentagem dos t1pos de hemoglobina dentro dos eritrócims (HbA. HbS. HbC. HbF), tempo ao qual a célula é submetida à hipóx1a, alteração térmica e do equilíbrio ácido- básico. A presença de outras hemoglobinas dentro da célula 1nfluenoa a falcização, porque exerce efeito de d1luição, diminuindo a oportunidade de contato encre as moléculas de HbS. A influência sobre a polimerização da HbS varia com o tipo de hemoglobina não-S que está presente dentro da célula. A hemoglobina que menos participa do polímero é a HbF. Clinicamente, ní-
veis elevados de HbF associam-se à menor gravidade da doença. A desidratação celular favorece o processo de falcização, uma vez que aumenta o comato intermolecular de HbS conseqüente à elevação da concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM). O processo de polimerização é proporcional ao período de tempo de desoxigenação. Portamo, nas reg1ões onde a circulação é mais lenta, como nos sinusóides esplênicos. existe maior probabilidade de falcização das hemácias. Na presença de acidose, a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio é diminuída, causando desoxigenação Intracelular. Assim, ocorre polimerização da HbS e falcização do eritrócim. A recorrência de episódios de falcização e desfalcização, independenrememe dos famres que os causaram, faz com que os ericrócims sofram alterações da membrana citoplasmática. Tais alterações constituem a principal razão para que os eritrócitos falciformes sejam seqüestrados e prematuramente destruídos pelo sistema mononuclear fagocitário, especialmente no baço. diante de tecido esplênico viável. O processo de deformação das hemácias por polimerização da HbS leva à incapacidade de deformação das hemácias em locais de microcirculação sinuosa e subseqüente obstrução do fluxo sangüíneo, com infarto e reação inflamatória do teodo afetado. A hemólise e o processo vaso-oclusivo, juntos, constituem as bases fisiopacológicas para as manifestações clínicas e complicações da anemia falciforme.
Padrões da herança
A hemoglobina A (HbA) é codificada por genes lndependentes, com formação de duas cadeias alfa e duas beta, de forma que cada indivíduo passa para sua prole um dos genes. Quando não há presença de hemoglobinopatia, encontram-se, normalmente, indivíduos com HbAA. A transmissão do gene ocorre através de herança aurossômica recessiva. O indivíduo é considerado doente, ao apresentar homozigose para o gene alterado (HbSS) e portador do traço falciforme, se possui um gene normal e um alterado {HbAS). Portamo, pais heterozigotos com traço falciforme (HbAS) têm probabilidade estatístiCa de 25% de conceberem filhos sem alteração genética, 50% de heterozigotos e 25% com anemia falciforme.
Investigação laboratorial do paciente com anemia normocítica
Manifestações clínicas
Uma característica marcante da anemia falciforme é sua grande variabilidade clínica. Alguns pacientes apresentam quadro grave e estão sujeims a inúmeras complicações e freqüenres hospitalizações, enquanto outros têm evolução mais ben1gna. Tanto fatores hereditários quamo adquiridos contribuem para essa variabilidade clínica. Níveis de HbF, concomitância de talassemia e alteração genérica específica constituem fatores hereditários associados à gravidade da doença. Entre os fatores adquiridos, a condição socioeconômica com conseqüentes variações nas qualidades de alimentação, de prevenção de infecções e de assistência médica tem sido considerada a principal determinante da evolução clínica da doença. As prinopais manifestações clínicas estão listadas na Tabela 25.2.
O laboratório no diagnóstico da anemia falciforme
No Brasil, até recememente o diagnóstico da anemia falciforme era realizado pela eletroforese de hemoglobina, apenas após a suspeita cl ínica em paciemes sintomáticos. A partir de 1998, foi instituída no estado de Minas Gerais, de forma pioneira. a triagem neonatal para a doença, permitindo o diagnóstico precoce ames de qualquer manifestação clínica. O diagnóstico pela triagem neonatal. utilizando técnicas de focal ização isoelétrica da hemoglobina ou por cromatografia de alta resolução no "teste do pezinho", vem apresentando 1mpacto positivo na sobrevida e qualidade de vida dos doentes. em função, sobretudo, do suporte terapêutico de suporte antiinfeccioso e da abordagem precoce e específica das inrercorrências. O hemograma e a contagem de reticulócitos
A anemia é normocítica e normocrômica, com níveis variáveis de hemoglobina. t comum verificar-se um padrão 1ndividual de hemoglobina basal relativamente estável. A microcitose pode estar relacionada à assoCiação com ferropenia ou talassemia. O esfregaço de sangue periférico pode revelar achado de hemácias falciformes, poquilocitose, hemácias em alvo, corpúsculos de HoweiiJolly e eritroblastos. Leucocimse pode estar presente,
285
mesmo na ausência de processos infecciosos ou crises álgtcas. A contagem plaquetária usualmente apresenta-se elevada, com possibilidade de diminuição em sttuações de hiperesplenismo ou seqüesrro esplênico agudo.
A eletroforese de hemoglobina e a focalização isoelétrica A detecção efetiva das d tversas formas de doenças falciformes requer diagnóstico preciso, baseado princi-
é geralmente aumenta-
palmente na eletroforese, qualitativa e quantitativa. de
da, compatível com o quadro de hemólise e regeneração
hemoglobina. A eleuoforese de hemoglobina é um mé-
medular.
rodo que possibilita a identtficação dos diferentes tipos
A contagem de reticulóciros
de hemoglobina a partir de uma amostra de sangue periTabela 25.2 - Manifestações clínicas e laboratoriais associadas à Anemia Falciforme
férico. Como o teste pode ser realizado tanto em recém nascidos como em adultos, deve-se ter em mente que o padrão eletroforético normal é dtferente. conforme a
Manifestações relacionadas à hemólise
idade do paciente, devido à diferença no predomínio da
Polidez, icterícia, fraqueza, baixo peso, esplenomegolro (olé os 4 anos de idodel. hepotomegolia e colelitíose (dor no quadrante superior direito do abdome, náuseas, vómitos e pioro do icterícia)
capítulo 24).
Manifestações relacionadas a fenômeno vaso-oclusivo
(pH 8,6), sobre acetaco de celulose, onde a amostra
Ósseo
Pulmonar
Neurológico
Crise álgico com duração de 4 o 6 dias, desencadeado por hipóxio, infecções. febre, ocidose, desidratação, exposição ao frio, trauma e exaustão físico. Associo-se à febre, prostração e sinais inflamatórios locais. Osteonecrose é complicação freqüente Febre dor torácico toquipnéio, dispnéio hrpoxemio e rnfiltrodo rodiológrco pulmonar É multifotoriol e envolve mfecção, folcizoçõo rntropulmonor e tromboembolismo de tecidos necrólicos, caracterizando o síndrome torácico agudo Alterações de consciência, déficits neurológicos focais, convulsões, poresios, afasias, confusão mentol ou cefoléio
Peniano (seios P11opismo. associo-se o infecção, trauma, cavernosos) abuso de álcool, uso de maconha ou otividode sexual Esplênico
Atrofio esplênica, predisposição o infecções por bactérias encapsulados
Outros manifestações Baço (olé 5 anos de idade)
Medula óssea
Outros órgãos
Seqüeslro esplênico - aumento súbito do baço com queda abrupto de hemoglobrno e aumento do contagem de reticulócitos. Se não houver mtervenção em tempo hábil, existe o risco de evolução poro choque hipovolêmico e óbito em algumas horas Crise oplósrca, inibrção medular seletiva dos precursores eritrocíticos (porvovírus 819). Polidez progressiva, fraqueza, quedo do hemoglobina e da contagem de reticulócitos. Usualmente é transrtórro. com recuperação medular em 5 o IO dias Retinile, tubulopotios e glomerulopatios, úlceras crónicos de pele e insuficiência cardíaco
produção de cadeias de globina alfa, beta e gama (ver A técnica pode ser realizada em meio alcalino
é submetida a um campo elétrico. com distribuição das bandas relativas a cada tipo de hemoglobina, de acordo com sua carga elétrica, e comparada a um modelo padrão conhecido. Pode ser necessário reali zar novo teste em meio ácido para diferenciar HbA2 e HbC. que apresentam migração semelha nte em meio alcalino (Figura 25.5).
A-- ------- - -F
s
A2/C -
AA
AS
S/Po
s;p.
tal
tal
AC
se
+
AC
Figura 25.5 - Represemaçào esquemártca do padrão elerroforértco em pH alcalino. das prinCipais hemoglobinas encomradas em nossa população.
A focalização isoelétrica também pode ser utilizada
e baseia-se na separação dos tipos d e hemoglo-
bina, conforme seu ponw isoelétrico (p i), colocando a amostra em uma mistura contendo valores de pH conhecidos, distribuídos em um gel. Assim, ao comparar o padrão encontrado com os valo res conhecidos de p i de cad a hemoglo bina, pode-se visualizar cada banda correspondente ao término do exame (Figura 25.6).
286 [ Medicina laboratorial para o clínico
ss
--------- --
A- -s
A2
AA
RN AA
RN AS
deficiências de vitaminas. hiperesplenismo. hemólise autoimune, disfunção renal. radioterapia e quimioterapia podem agravar a anemia. A Figura 25.7 mostra. de forma esquemática, os eventos envolvidos na fisiopatogêse da ADC. +
RN RN RN RN RN SS S/Po S/p. AC S/C tal tal Figura 25.6- Represemaçào esquemáttca do traçado elecroforénco de neonaros. por focalização isoelénica. O estudo molecular
Técnica de digestão com enzimas de resmçao ou de seqüenciamento gênico em produtos do gene da ~-globtna obtidos por amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) possibilita a identificação da mutação pontual no códon 6 do gene, responsável pela formação da HbS. Além de permitir o diagnóstico preciso da doença. as técnicas de biologia molecular permitem a realização do diagnóstico no período incra-uterino a partir da oitava semana de gestação. utilizando-se células fetais de vilosidades, e também têm tido grande aplicabilidade clínica na confirmação diagnóstica da suspeita de assooação de doenças falciformes com a alfa talassemia.
ANEMIA DE DOENÇA CRÔNICA
A anemia da doença crônica (ADC) é a segunda mais prevalente depois da anemia causada pela deficiência de ferro, exceco em recém-nascidos. Ocorre em pacientes com ativação imune aguda ou crônica, secundário a processos inflamatórios e/ou infecciosos crônicos e neoplasias. Essa condição também tem sido conhecida como anemta da inflamação. A Tabela 25.3 apresenta suas causas mais freqüemes.
FISIOPATOLOG IA Os mecantsmos que interferem na eritropoese da ADC são multifatoriais e relacionam-se à doença sobrejacente, quer seja pela infiltração da medula óssea por células tumorats ou pela ação de microrganismos. como na infecção pelo HIV e hepatite C. As células tumorats também podem produzir citocinas pró-inflamatórias e radicais livres que danificam as células progenitoras eritróides. Sangramentos,
Investigação laboratorial do paciente com anemia normocítica
Tabela 25.3 - Causas subjacentes de Anemta de Doença Crónica Doenças Associadas
Prevalência Estimada
Infecções Virais (incluindo HIV) Bacterianos Parasitários Fúngicos Cônce• Hemotológico Tumores Sólidos Auto·imune Artrite reumatóide lúpus eritematoso sistêmico Vasculite Sorcoidose Doença inflamatório intestinal Reje,çõo crôn•co após transplante oe órgão sólido Doença e inflamação renal crônico
18 - 95%
30- 77%
8 - 71%
8 - 70% 23 - 50%
Fonte: We1ss & Goodnough. 200S.
Desregulação da homeostase do ferro
Uma característica típica da ADC é o desenvolvimento de distúrbios na homeostase do ferro, com aumemo da captação e retenção do ferro nas céluas do sistema mononuclear fagocitário. Isso acarreta o desvio do ferro da circulação para os depósicos e limita sua disponibilidade para as células precursoras eritróides e eritropoese. O interferon-y (INF-y). o lipopolissacáride e o fator de necrose tumoral (TNF-a ) aumentam a expressão da proteína transportadora de metal divalente (DMT1), com aumento na captação de ferro pelos macrófagos. Esses estímulos inflamatórios também diminuem a expressão da ferrroportina. proteína que atua na liberação do ferro, o que promove a retenção do ferro no sistema mononuclear-fagocitário. Além disso. as citocinas. como a interleucina-10 (IL-10). podem induzir anemia através da estimulação da aq uisição de ferro mediada vta transferrina para os macrófagos e pela estimulação translacional da expressão da ferritina.
287
FÍGADO Aumento da expressão de hepcidlna
Inibição da absorção do ferro
Inibe '·, Ferroportina 1
..............
----~ r "' .....
----.l Fe..
------., •,
..........
Inibição de produção de EPO
Figura 25.7- Representação esquemá[ica dos eventos envolvidos na ADC.
A hepcidina. prmeína de fase aguda ferro-regulada, com-
que o interferon-y parece ser o inibidor mais potente. Os
posta de 25 aminoácidos, está envolvida na diminuição da absorção duodenal do ferro e no bloqueio da liberação de ferro pelos macrófagos. A hepcidina pode ter papel central na anemia da doença crónica. A expressão da hepcidina é induzida pela ll-6 e lipopolissacáride e inibida pelo TNF-a.
mecanismos subjacentes envolvem indução de apoptose mediada por citocinas, inibição da expressão de receptores da erirropoetina nas células progenitoras, diminuição da produção e atividade da erirropoetina e redução da expressão de outros fatores hematopoéticos. Além disso, as citocinas exercem efeito tóxico direto nas células pro-
Proliferação diminuída das células progenitoras eritróides Em pacientes com anemia de doença crónica, a proliferação e a diferenciação das células precursoras erirróides estão prejudicadas devido aos efeitos inibitórios exercidos pelo interferon-a, ~ e y, TNF-a e interleucina-1, sendo
288 ( Medicina laboratorial para o clínico
genitoras, promovendo a formação de radicais livres lábeis semelhantes aos macrófagos do microambiente medular.
Resposta diminuída à eritropoetina A erirropoetina regula centralmente a proliferação das células erirróides. Sua expressão relaciona-se inversa-
mente com a oxigenação tecidual e com os níveis de hemoglobina. A resposta à eritropoerina na ADC é inadequada para o grau de anemia na maioria das condições. As citocinas interleucina-1 e TNF-a inibem diretamente a expressão da erit ropoetina in vitro. A responsividade das células progenitoras eritróides à eritropoetina parece estar relacionada inversamente com a gravidade da doença crônica subjacente e com a quantidade de citocinas circulantes, uma vez que, na presença de altas concentrações de interferon-y ou TNF-a . são necessárias quantidades de eritropoetina muito maiores para restabelecer a formação de unidades formadoras de colônias eritróides.
MANIFESTAÇÕES ClÍN ICAS Não existem manifestações clínicas específicas da ADC. De modo geral, os sintomas e sinais associados são bastante heterogéneos e devem-se. sobretudo, à doença de base. Incluem febre, emagrecimento, artralg1a. alterações de pele e subcutâneo, hepatomegalia. esplenomegalia e, nas crianças. pode ocorrer arraso do desenvolvimento cognitivo ou "achatamento" na curva de ganho pondero-estacural. A anemia é, na maioria dos casos. leve ou moderada e causa graus variáveis de palidez. Diferentemente do que ocorre na anemia ferro priva, não são observadas alterações relacionadas à ferropenia, tais como perversão do apetite. queilose angular, alterações de unhas ou escleras azuladas. A realização de anamnese detalhada e de exame físico cuidadoso é essencial para orientação propedêutica e elucidação do diagnóstico da doença de base. pois a rem1ssão da anemia dependerá do tratamento específico desta doença.
nóstico diferencial entre anemia ferropriva e ADC e da sobreposição de ambas é possível através do uso adequado do laboratório, como mostram a Figura 25.8 e a Tabela 25.4.
O estoque de fe rro e a eritropoese
A ferritina é usada como marcador dos depÓSitoS de ferro. Nível de ferritina de 30 ng/ml possui bom valor predi tivo positivo para anemia ferropriva (92 a 98%). Nos pacientes com ADC. entretanto, os níveis de ferritina estão normais ou aumentados (maior que 100 ng/ml). refletindo o aumento do estoque de ferro no sistema mononuclear fagocitário. além do aumento na ferritina devido à arivação imunológica do processo inflamatóno. O receptor solúvel da rransferrina (sTfR) é um fragmento de receptor de membrana, que se encontra aumentado na deficiência de ferro, nas anemias hemolíticas e na policitemia e pode estar diminuído na anemia da IRC e nas anemias aplásticas. O valor de referência varia de 1.3 a 3.3mg/L. Em contraste, os níveis de sTfR não estão Significativamente diferentes do normal na ADC. A dosagem do sTfR é útil na diferenciação entre ADC pura (com ferri ti na normal ou alta e sTfR baixo) e ADC acompanhada de deficiência de ferro (com ferritina entre 30 e ·100 ng/ ml e sTfR elevado). A razão entre sTFR e o logaritmo da concentração sérica de ferritina (sTRF/IogFT) é < 1 para a ADC e > 2 para ADC associada à deficiência de ferro. A dosagem de proroporfirina eritrocitária livre está elevada e reflete a impossibilidade de ligação do ferro à protoporfirina, na etapa fi nal da síntese da molécula heme. A medida dos níveis de eritropoetina é útil apenas quando os níveis de hemoglobina estão aba1xo de 10 g/ dL, pois os níveis de eritropoetina permanecem dentro dos limites normais para níveis de hemoglobina mais altOS. Percebe-se despro porção entre os níveis de eritropoetina e hemoglobina.
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DA AN EMIA DE DOENÇA CRÕNICA A captação e o transporte de ferro
A anemia é, comumente, normocrômica, normocítica e hipoproliferativa, porém pode ser hipocrômica e microcítica (VCM e HCM subnormais). Considerando-se que nas doenças crônicas a anemia pode refletir uma complicação da própria doença ou estar associada ao seu tratamento. o diagnóstico de ADC deve ser bastante criterioso. O diag-
Investigação laboratorial do paciente com anemia normocitica
Embora o ferro corporal rotai esteja normal ou aumentado em função do aprisionamento nos macrófagos. o ferro sérico está ligeiramente diminuído, devido principalmente ao aumento da hepcidina e diminuição da ferroportina, induzido pela resposta inflamatória.
289
Evidências clínicos e bioquímicos de inflamação
Saturação de tronslerrino < 16%
Determinar receptor solúvel de tronslerrino
Anemia de doença crõnica com deficiência de ferro
Anemio lerropivo
Anem io de doença crônico
Figura 25.8 - Fluxograma para d1acnóstico diferenoal entre anem1a de doença crónica. anemia ferropnva e sobrepostção de ambas.
Tabela 25.4 - Marcadores laborarona1s que d tferenoam a Anem1a de Doença Crôntca da Anem1a Ferropnva
Variável
Anemia da Doença Crônica
Ferro
Reduzido
Tro'15fer~ no
Red~z,do
c
Anemia Ambas as Ferropriva condições Reduzido
Reduztdo
Aumentado
Reouz1do
A capaCidade de ligação do ferro (CTLF) é um exame tmporrante para o diagnósnco dtferenoal com a anemia ferropriva, pois na AOC apresenta-se dtminuída. Assim. o índice de saruração de uansfernna (1ST). calculado a partir do resultado da dosagem do ferro sérico e da CTLF, esrá geralmente normal ou dtscretamente diminuído.
No1mol Saturação do Tronsfemno
Reduzido
Reduzido
Reduzido
Fentttno
Normal o Aumentado
Reduzido
Reduztdo o N o1mol
Receptor Solúvel do Tronsferrno
Norma
Rozo· do Recer·o1 Sou-.~1 ao Tron5fer~ino pe o log Femtino
Bo·~o
Níveis de Citocmos
Aumentados
1<11
Aumentado
Normal o Aumentado
Alto{>2)
Aro{>2l
Normais
Aumentados
290 [ Medicina laboratorial para o clínico )--
O hemograma e a co ntagem de reticul ócitos
A ADC geralmente intcia-se durante os pnmeiros meses da doença de ba~e - A anemit~ É' geralmente branda (hemoglobina de 9.5 mg/dL) a moderada (hemoglobtna de 8mg/dl). As hemáoas são normocrômtcas e normocíticas, raramente hipocrômicas e microcíttas e, o RDW freqüentemente é normal, mas pode estar um pouco elevado. Acontagem absoluta de reticulóocos é baixa (<25.000/ f..IL), reflexo da produção dimtnuída de eritrómos.
ANEMIA DA INSUFICIÊNCIA RENAL A anemia está presente na insuficiência renal (IR) aguda ou crónica, independentemente da sua etiologia, e pode preceder, em meses, as manifestações clínicolaborawriais específicas da uremia. Na doença renal crônica, a anemia é geralmente mais grave e acomete até 98% dos pacientes com taxa de filtração glomerular inferior a 30 ml/minuto e que não recebem tratamento com reposição de eritropoetina exógena. A anemia nos pacientes com insuficiência renal está clarameme associada ao aumento na morbidade e mortalidade neste grupo.
FISIOPATOLOGIA Assim como na ADC. na anemia da IR a fisiopatologia é multifatonal e envolve inibição da eritropoese, alteração do metabolismo do ferro, além de diminuição na sobreVIda das hemácias. Todos estes fatores resultam diretamente da falência das funções endócnna e depurativa dos rins. A inibição na produção medular de eriuócitos tem sido considerada o mecanismo mais importante no desenvolvimento da anemia. Embora esteja associada principalmente à diminuição na secreção da eritropoetina (EPO), pelas células justaglomerulares, a inibição da eritropoese pode ser atribuída, também, a uma inadequação na resposta dos precursores eritróides ao estímulo da EPO, mediada por substâncias como a ribon uclease. hormônio da paratireóide ou lipoproteínas, cujas concentrações séricas apresentam-se elevadas nos pacientes com uremia. O aumento da creatinina sénca em aproximadamente 133 ~-tmoi/L está associado à perda da relação linear inversa, normal, entre as concentrações plasmáticas da eritropoetlna e hemoglob1na. O nível de hipóxia indutor de produção de eritropoetina, na IR. necessita ser progressivamente maior. A homeostase do ferro está alterada na IR. comprometendo o processo de hemoglobinização das hemácias. A perda de ferro ocorre por sangramentos secundários à uremia e, principalmeme, pela diálise. Pacientes em hemodiálise podem perder de 2 a 5 g de ferro por ano. enquanto a perda normal nesse período é em torno de 350 a 700 mg. Além disso, na doença renal crónica
Investigação laboratorial do paciente com anemia normocítica
ocorre diminuição dos níveis de tranferrina e liberação de cirocinas inflamatórias. que atuam prejudicando a disponibilização do ferro para a síntese da hemoglobina. A redução na sobrevida dos eritróciws. contribuindo para instalação da anemia. é observada em até 70% dos pacientes com quadro avançado de insuficiência renal. A observação de que erirrómos normais têm sobrev1da diminuída quando rransfundidos em pacientes urêmicos sugere que a morte celular precoce, na IR, esteja associada a mecanismo exuacorpuscular. Durante hemodiálise, os eritrócitos estão expostos a agressores químicos e fís1cos diversos, que contribuem para sua remoção precoce da circulação pelo sistema mononuclar-fagocitário. A toxicidade celular pelo cobre, cloramina ou nitratos, aquecimento excessivo das células e as alterações de osmolaridade do ambiente constituem exemplos destes agressores. Na IR aguda. a diminuição de eritropoetina também está presente. porém o mecanismo mais freqüente gerador de anemia é hemolítico. As principais causas de anemia por hemólise na IR aguda estão listadas na Tabela 25.5.
Tabela 25.5 - Causas de anemia por hemólrse na Insuficiência Renal Aguda Transfusões incompatíveis Deficiência de GqPD Sepse por closlridium Púrpura trombocitopênico trombótico Síndrome hemolítica urêmico CIVD no sepsis ou no gestação
Malária Eclômpsio Hipertensão maligno Vasculite Sislêmico Síndrome de Goodposture Drogas lmitomicino, ciclosporino e cisplorino)
MA NIFESTAÇÕES CLÍN ICAS As manifestações clínicas da anemia da IR se mesclam com as manifestações da própria doença de base. Na maioria dos casos o paciente queixa-se de palidez. fadiga, dispnéia e ouuos sinais de compensação cardiovascular da anemia.
291
A anem ia na insuficiência renal crônica piora a qua-
CONSIDERAÇÕES FINAIS
lidade de vida dos pacientes, aumentando o número de internações e a gravidade das complicações cardiovasculares.
De forma geral, as anemias norm ocrômicas e normocíticas reservam ao médico e a seus portadores entidades nosológicas de manuseio clínico complexo e, não raramente, de cura im provável.
O LABO RATORIO NO D IAGNOSTICO
Diante de um paciente com anemia normocrômica
DA ANEMIA DA INSUFICIÊNCIA RENAL
e normocítica, deve-se sempre lembrar de doenças hemolíticas e sistêmicas, principalmente as inflamat órias
Na avaliação laboram rial da anemia da IR, não existem alterações pamgnomônicas que sugiram o comprometim ento da função renal. A anamnese
e exame
crônicas e neoplásicas. Diagnóstico correro
e no
tempo
preciso pode influenciar sobremaneira a qualidade de vida e a sobrevida desses indivíduos.
físico cuidadosos podem sugerir o diagnóstico. A dosagem de creatinina é indispensável para o diag-
REFERÊNCIAS
nóstiCO de pacientes com anemia insidiosa, normocrô1111Ca e normocítica, clássica da IR crônica. Já na anemia da IR aguda os restes laborawriais gerais que identificam hemólise, além da pesquisa específica da causa hemolítica. são muiro impo rtantes para defin ição do quadro.
A eritropoese
2.
3.
O exame da medula óssea mostra hipoplasia eriuóide, principalmente por diminuição da eritropoetina, e
4.
podem ser observados macrófagos com aumento de depósiw de ferro. 5.
O hemograma e a contagem de reticulócitos
6.
A anemia da IR é, geralmente, normocítica e normocrômica. Menos freqüentemente, pode haver leve macromose associada à deficiência de falam. O grau de
7.
anem1a está relacionado com a gravidade da doença e a maioria dos paciemes apresenta hematócriro entre 15 e
8.
30%. A hemaroscopia é normal, mas pode mostrar equinóciros e acamóciws. principalmente em pacientes com uremia grave e na IR aguda. O RDW é normal, a menos que exista déficit real de ferro corporal associado. A comagem de reticulócims habitualmente é normal o u baixa, refletindo o m ecanismo hipoproliferativo da anem1a.
292
Medicina labo ratorial para o clínico
9.
Brasil. M1n1stério da Saúde. Manual de doenças ma1s 1mporrames. por razões étn1cas. na população afro-descendeme [home page da lmerner]. Brasília: Min1sréno da Saúde. Disponível em: hnp://bvsms.sa ude.gov.br/bvs/ publicacoes/cd06_09.pdf Campanaro CM, Loggetto SR, Braga )AP. Def1ciênc1a de Enz1mas Erirrocitá11as (Eri rroenz1mopanas). ln: Braga )AP. Tone LG, Loggerto SR. Hematolog1a para o Pediatra. São Paulo: Atheneu; 2007. p. 57-63. Dever GJ. Plarr OS. SICkle Cell 01sease. ln: Narhan DG. Ork1n SH, Ginsburg D, Look AT. Narhan and Osk1's Hematology of lnfancy and Ch ildhood. 6th ed. Philadelph1a: Saunders; 2003. p. 790-841. Gallagher PG, Lux SE. Disorders of the erythrocyte membrane. ln: Nathan DG, Orkln SH, Ginsburg D, Look AT. Narhan and Osk1's Hematology of lnfancy and Chlldhood. 6rh ed. Ph1ladelph1a: Saunders; 2003. p.S60-84. G1llesp1e BS, lnrig JK, Szczech LA. Anemia management 111 chroniC kidney d1sease. Hemodiallnt. 2007;11(1):15-20. Luzzato L. Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deflciency and Hemolytic Anemia. ln: Nathan DG, Ork1n SH, Gmsburg D. Look AT. Narhan and Osk1's Hematology of lnfancy and Ch1ldhood. 6th ed. Ph1ladelphia: Saunders; 2003. p.721-42. Nairz M , Weiss G. Molecular and clin ical aspects of 1ron homeostasis: from anem1a to hemochromatos1s. Wien Kl1n Wochensch r. 2006;118(15-16):442-62 Nurko S. Anemia in chron1c kidney d1sease: causes, d1agnosis. rreatment.Cieve Clin JM ed. 2006;73(3):289-97 We1ss G. Goodnough LT. Anemia of chronic disease. N Engl JMed. 2005;352(10):1011-2 3.
Nelma Cristina Diogo Clementina Fernanda Maria Lodi Rosa Ma/ena Delbone de Faria
26
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM ANEMIA MACROCÍTICA
A macrocitose é definida como uma condição sanguínea na qual o eritrócito é maior que a média normal. Macrocitose é relatada em relação ao volume corpuscular médio (VCM). O VCM varia de 80 a 100 fenrolitros (fL) e tem relação com a idade e valor de referência do laboratório. As anemias macrocíticas são classificadas, inicialmente, naquelas com erirropoese megaloblástica na medula óssea, definida pela presença de eritroblasros maiores que o normal com núcleo mais imaturo que o ciroplasma, e aquelas com erirropoese normoblástica cujos eritroblastos são de taman ho normal. São causas de anemias macrocíticas não megaloblásticas: alcoolismo, síndromes mielodisplásicas, hepatopatias crônicas, anemias hemolíticas, anemia aplástica, hipotireoidismo e uso de medicamentos como anriconvulsivanres. quimioterápicos e antivirais. A causa mais comum de macrocicose é o uso de álcool. que mesmo em pequenas quantidades, princi palmente em mulheres, pode elevar o VCM acima de 100fl. sem anemia ou qualquer alteração na fu nção hepática. O mecanismo desse aumento do VCM é desconhecido. Em doenças hepáticas o volume pode elevar-se devido ao aumento do depósito de lipídeos na membrana dos eritróciros e este aumento é mais importante nas hepawpatias alcoólicas. A mielodisplasia é uma causa freqüenre de macrocitose nos idosos e existem alterações quantitativas e qualitativas também na série branca e plaquetas, podendo ter distúrbio de maturação e eritropoese megaloblástica. As drogas que afetam a síntese do DNA. como hidroxiuréia e azatioprina, podem causar macrocirose
com ou sem alterações megaloblásticas. A gravtdez e o período neonatal são causas fisiológicas de macrocitose e já foi descrita macrocitose em membros de uma mesma fam ília o que sugere uma predisposição genética, não necessitando de intervenção terapêutica ou investigações futuras. A causa mais comum de anemia megaloblástica é a deficiência de vitamina B12 e/ou de ácido fólico. A tabela 26.1 apresenta as principais causas de macrocirose.
ANEMIAS MEGALOBLÁSTICAS
As anemias megaloblásticas são um subgrupo das anemias macrocíticas nas quais a medula óssea exibe eritropoese megaloblástica. Acualmenre, com a realização dos testes de dosagem da vitamina B12 sérica e do falara sérico ou eritrocitário, além dos outros metabólitos, muitos pacientes com anemia megaloblástica podem ser diagnosticados sem o escudo morfológico da medula óssea. As causas mais comuns de anemia megaloblástica são a deficiência de vitamina B12 e/ou folato. Na deficiência mínima ou subclínica destas vitaminas pode existir macrocitose sem anemia ou não ter nem macrocitose nem anemia.
DIST ÚRBIOS DA MU LT IPLICAÇÃO CELULA R
A anemia megaloblástica é o resultado clínico e morfológico da síntese diminuída do ácido desoxirribo-
nucléico (DNA). causada pela falha na conversão da homocisceína em mecionina. Nesra reação, a vicamina 812 recebe o grupo mecil do metilfolam se transformando em merii-B 12e transfere o grupo meril para a homocisteína. convertendo-a em metionina. transformando simulcâneameme o 5-metil-tetraidrofolam em tetraidrofolaro, a forma ativa do folato que participa da síntese da timidlna. Na ausência da vitamina 8 12, o folaro pemanece na forma 5-metil-tetrahidrofolaro. levando à deficiência da cc-enzima do folam necessária para síntese da timidina e do DNA. A rescrição da síntese do DNA leva à anemia megaloblástica. A síntese do ácido ribonucléico (RNA) permanece normal. pois a timidina não é constituinte da molécula de RNA. logo. enquanto há restrição na síntese de material gênico, a síntese proréica mantêm-se inalterada. Como resulcado, os componentes cimplasmáticos. durante o processo de divisão celular, são sintetizados em quantidades normais, contudo. a mimse na maioria das vezes. não acontece. por insuficiência de material gênico. Uma célula de grande volume. com cicoplasma maduro e núcleo 1maturo é o produm deste processo. por esse motivo as anem1as por deficiência de vitamina B12 ou falam são denominadas megaloblásticas.
CAUSAS DE DEFICIÊNCIAS DE ÁCIDO FÓLICO E VITAM INA B12 A deficiência de ácido fálico associa-se freqüentemente a baixa ingesta do nutriente, aumento de demanda e má-absorção intestinal. A principal fonte de folaro encontra-se em vegetais folhosos crus. A deficiência de vitamina B12 pode ser causada por absorção defioente e. ma1s raramente, ingestão insuficiente. A má-absorção de vitamina B12 ocorre em paCientes com diversas condições gastrintestinais e está relacionada à diminuição ou falta de produção do fator intrínseco associada a hipocloridria ou acloridria, causada tanto por mecanismo auto-imune ou por atrofia gástrica. A absorção da vitamina B12 ocorre no íleo terminal e depende do fawr intrínseco que é uma glicoproteína produzida pelas células parietais da mucosa gástrica. No estômago a vitamina B12 é liberada do alimento na presença do ácido clorídrico. liga-se à proteína R (haptocorrina) e, após sofrer a ação das proteases pancreáticas, associa-se ao fator intrínseco para ser absorvida no íleo.
294 [ Medicina laboratorial para o clínico
A anemia perniciosa é a causa mais comum de deficiência de vicamina 812. A anemia perniciosa é o escágio final da gastrite auto-imune (gastrite crônica atrófica do tipo A) que compromete o fundo e o corpo do estômago por mecanismos tais como a agressão por auw-amicorpos anticélula parietal e antifaror intrínseco. A presença de auco-amicorpos contra células parietais ocorre em 90% dos pacientes com anemia perniciosa, em 30% de parentes de primeiro grau desses e em pacientes com outras doenças auto-imunes (tireoidite de Hashi moro. doença de Graves. doença de Add1son, síndrome de Sjogren. vitiligo. diabetes melito tipo 1, miastenia gravis). Os anticorpos contra o fator intrínseco são mais específicos do que os anticorpos anticélula pariental. Existem dois tipos de anticorpos. sendo que o tipo I ocorre em 70% dos pacientes com anemia perniciosa e bloqueia a ligação do fator Intrínseco à vitamina B12. O tipo li liga-se ao complexo fator intrínseco-vitamina B12 e impede a sua fixação no receptor da mucosa ileal. presente em 35 a 40 % dos pacientes com anem1a perniciosa. Na ausência do faror intrínseco. menos de 2% da vitamina B12 ingenda é absorvida. comparada com 70% quando esse está presente. O Helicobacter pylon é causa reconhecida de gastrite atrófica do tipo B. podendo levar à diminuição da absorção de vitamina B12. O tratamento da lllfecção pode melhorar os níveis reduzidos dessa vitamina. A história dietética rorna-se importante na investigação porque a vitamina B12 é produzida por bacrénas que habitam o tubo digestivo de animais e produros como carne e derivados são a única fome de vitamina B12 para os homens. não sendo encontrada em frutas e vegetais. Apesar da deficiência dietética ser ra ra, vegetarianos estritos. que não consomem carne, peixe. ovo. queiJO ou leite por vários anos. têm níveis baixos de B12 e podem desenvolver macrocirose ou anemia megaloblást1ca. Mulheres. que são apenas moderamente vegetarianas. podem se rornar deficientes em vitamina B12 durante a gravidez e lactação e suas crianças podem tam bém nascer com deficiência desta vitamina.
MANIFESTAÇÕES ClÍN ICAS As manifestações clínicas da deficiência de falam e vitamina B12 refletem a necessidade de ambas as vitaminas para a divisão de rodos os tipos celulares. Os
achados clínicos incluem palidez. icterícia e glossire. Os pacientes têm sintomas anêmicos de instalação gradual, adapatando-se freqüentemente a níveis muiw baixos de hemoglobina. Além disso, pode manifestar distúrbios gamintestinais. perda de peso e infertilidade. Os sinromas e sinais devido à neuropatia periférica e à degeneração subaguda combinada ou desmielinização focal da substância branca cerebral são encontrados em alguns casos de deficiência de B12. mas não na deficiência de folato. Estes sintomas são parestesias nas extremidades, dificuldade para deambular, fraq ueza muscular e memória deficiente. Achados menos comuns incluem deficiência visual devido neurite ou atrofia ótica, distúrbios psiqutátricos. impotência e dificuldade de controle retal e da bexiga. Os sinais neurológicos incluem perda do sentido de simetria, ataxia, sinal de Romberg positivo e raramente paraplegia espásttca. Alguns escudos relataram uma associação de depressão com batxos níveis de folaro. Tabela 26.1 -Causas de anemias macrocít rcas Reticulocitose Doença hepático Alcoólico Síndrome mielodisplásica Eritraleucemia (LMA- M 6) Deficiência d e ácido fólico lngesta insuficiente Aumento de demando (gestação, crescimento, hemólisel M á·obsorção (doença inflamatório intestinal) Drogas que interferem no absorção e no utilização do fotolo Perda excessivo em p rocessos diolít.cos Deficiência de Vitamina B12 Absorção d iminuído (deficiência de fotor intrínseco - gos· trile crónico o trófico e gostrectomia ) M ó·obsorção (doença inflamatório intestinal) Inibição competitivo do absorção (infestação pelo Di· phyllobotrium !atum e síndrome do oiço cego) lngesta rnsufiente Aumento de demando
Investigação laboratorial do paciente com anemia macrocítica
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DAS ANEM IAS MEGALOBLÁSTICAS
A eritropoese inefica2 ("hemólise intramedular"), envolvendo os precursores megaloblásticos, leva a um aumento da bilirrubina indireta no soro, diminuição da haproglobina e um aumento da desidrogenase lática. freqüemememe acima de lOOOU/ml. Existe também uma discreta diminuição da vida média dos eritróciros circulantes com contagem absoluta de reticulóciros diminuída. A subutilização do ferro leva a um aumento da saturação da transferrina e aumento dos depósitos de ferro.
Alterações citológicas da medula óssea
As manifestações morfológicas da deficiência de vitamina B12 e folaro são indistinguíveis. Todas as células em proliferação, incluindo as células epiteliais do traro gastrintestinal (mucosa bucal. língua, intestino delgado), cérvix, vagina e útero exibem megaloblasrose, mas as alterações megaloblásticas são mais marcantes na medula óssea e sangue. O estudo morfológico da medula óssea mostra hipercelularidade com hiperplasia das três linhagens sendo mais evidente na série eritróide, com diminuição ou inversão da relação grânulo-eritróide. Extste um assincronismo importante na maturação núcleo-citoplasmática durante o processo de divisão celular e a maioria das células filhas geradas morre na medula óssea ou torna-se células megaloblásticas em "parada de maturação" nos diferentes estágios do oclo celular. Os proeritroblastos são maiores que o normal e as alterações megaloblásticas são mais evidentes nos eritroblastos em estágios intermediários e nos orrocromáticos. Os megaloblastos ortocromáticos mostram o ciroplasma hemoglobinizado e núcleo imaturo, com cromatina fina e rendilhada. É freqüente o achado de lobulação nuclear, pontilhado basófilo e remanescentes de DNA como corpúsculos de Howell-jolly e anéis de Ca boc. Há uma proliferação celular mais lenta com numerosas figuras de mitose. A granulopoese também é anormal, com células grandes e cromatina rendilhada. O metamielóciro e o bastonete gigante são considerados patognomônicos de megaloblastose (células de Tempka-Braun). A granulação cito plasmática não é afetada. Os megacariócitos podem estar em número
295
e podem apresencar hiperseg-
dereccar suficiência ou deficiência. A dosagem da concen-
mencação associada à liberação de fragmentos do eiraplasma e plaquetas gigantes na circulação
tração da vitamina 812 sérica pode ser normal em mais de 5% dos pacientes com deficiência documentada. O limite
normal ou aumencado
inferior do valor de referência para a dosagem sérica de vitamina B12 é variável e depende do método empregado. O hemograma e a contagem de reticulócitos
Consideram-se, de modo geral, 200 pg/ml como pomo
A avaliação do esfregaço do sangue periférico pode
de corte, valor esse derivado de vários estudos nos quais os pacientes tinham deficiência da vitamina B12 definida
mostrar macroovalócitos, anisocitose, poiquilocitose e neutrófilos hipersegmentados. O volume corpuscular
por critérios clínicos e hemarológicos quando comparados com controles normais. A dosagem é considerada muiro
médio (VCM) está aumencado. Se houver coexistência de deficiência de ferro, doença crônica ou síndrome talassêmtca o VCM pode estar normal ou baixo. A hipersegmentação dos neutrófilos é definida pelo achado de um neutrófilo com 6 lóbulos ou mais ou 5% dos neutrófilos com 5 lóbulos ou mais. A hipersegmenração dos neutrófilos pode ser detectada em estágio precoce, quando a hemoglobina e o VCM ainda estão dentro da
específica para concentração sérica menor do que 100pg/ ml. Nesta concentração foi encontrada a especificidade
faixa de referência da normalidade. Em estágios mais avançados, freqüentemente há leucopenia e plaquetopenia, caracterizando a pancitopenia megaloblástica. A leucopenia e plaquetopenia, que compõem as manifestações hematológicas periféricas da anemia megaloblástica, habitualmente não geram sintomatologias clínicas. A contagem de reticulócitos está normal ou diminuída, pois, devido à eritropoese ineficaz, a maioria dos eritroblastos rem morte intramedular e uma percentagem pequena de erirrócitos maduros; cerca de 20% apenas são liberados para o sangue periférico.
de 90% em um escudo, mas apresenta pouca discriminação para concentrações séricas entre 100 e 200 pg/ml. A concentração do folato sérico, apesar de típicamente baixa em pacientes com anemia megaloblástica por deficiência de folato, reflete a curta duração do balanço do folaro. Uma única refeição hospitalar pode normalizar o folato sérico em pacientes com deficiência de folaro. Apesar da presença de um adequado esroque tecidual, a gravidez, a ingestão de álcool, o uso de alguns anticonvulsivantes ou poucos dias de diminuição da ingestão dietética podem diminuir a concentração sérica de folato. Apesar da concentração do folato eritrocitário teoricamente ser um melhor indicador do folaro tecidual e não estar sujeito a essas flutuações, existe problemas na interpretação, devido à diminu ição do folato eritrocitário em presença de deficiência de vitamina B12. Por isso, a dosagem do folaro sérico deve ser obtida como teste inicial (rabeia 26.2).
Dosagem das vitaminas
Tabela 26.2 - Correlação entre os níveis séricos de vitamina B12 e folato sérico e eritrocitário em diferentes situações clínicas
Os testes laboratoriais, para dosagem sérica de vitamina B12 e folato, devem ser solicitados em pacientes com VCM elevado, mesmo tendo limitações devido à sua baixa sensibilidade e especificidade.
Situação clínica
A determinação da concentração sérica da vitamina B12 amda é o exame inicial para o rastreamento da deficiência desta vitamina. Os laboratórios utilizam diferentes métodos para dosar a vitamina B12 , como quimioluminescência e radioimunoensaio, resultando em diferentes faixas da normalidade, porém nenhum é padrão de referência para
De hc1ê ncio Vitamino B12
t
Defi ciênc ia foi ato
Normal
t
t
Deficiênc ia de ambos
t
t
t
essa dosagem. Além disso, existe limitação importante na habilidade de uma única medida de vitamina B12 sérica
Normal
Vitamina B12 200-900 pg/ml
Fo iato sérico 5-1 6ng/ ml
Foi ato eritrocitá rio >150ng/ ml
N ormal
N ormal ou 7 (3-5) ou t (<3)
Normal
N ormal ou
t
t
296 [ Medicina laboratorial para o clínico )1----- - -- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - -
Dosagem dos metabólitos A utilização dos metabólicos, homocisteína e ácido merilmalôn1co auxilia na determinação da sensibilidade e especificidade das concentrações séricas da vitamina B12 e folaro. Os vários fluxogramas existentes aconselham as dosagens do ácido metilmalônico, homocisteína ou ambos principalmente quando as concentrações séricas da vitamina B12 estão entre 200 e 300pg/ml ou quando a concentração de folaco é duvidosa. As concentrações séricas da homocisteína assim como as concentrações séricas e urinárias do ácido metilmalônico estão elevadas na deficiência de vitamina B12 devido à diminuição do metabolismo. Apenas a homocisteína está elevada na deficiência do folaco. pois o folato não participa no metabolismo do ácido metilmalônico, essencial para o tecido nervoso. A dosagem dos metabólicos também deve ser indicada para pacientes com valores limites de folato de 2 a 4 ng/ml. naqueles com suspeita de deficiência combinada de vitamina B12 e folaco e em pacientes cuja dosagem do folato sérico não pode ser facil mente interpretada, como a refeição hospitalar recente ou a anorexia. Na ausência desses fatores, uma concentração sérica <2ng/ml é diagnóstica de deficiência de folato (tabela 26.3). Uma vez detectada qual destas vitaminas está deficiente, orientada pelo exame clínico, a causa da deficiência deve sempre ser investigada e determinada. A investigação gastrintestinal é mandatária na deficiência de vitamina B12, pela alta relação com distúrbios absortivos. Os exames freqüentememe realizados para a investigação causal são: endoscop1a digestiva alta com b1ópsias de corpo e fundo gásrricos; pesquisa do 1-/e/icobacter pylori no tecido gástrico biopsiado; exames radiológicos do intestino delgado; colonoscopia com biópsia de íleo terminal e testes sorológicos para doença celíaca (anticorpos antiendomísio e amigliadina). Em alguns casos hereditários o diagnóstico só poderá ser realizado pela análise de mutações genéticas.
ANEMIAS HEMOLÍTICAS POR DEFEITO EXTRÍNSECO DO GLÓBULO VERMELHO
As anemias hemolíticas compreendem um grupo de doenças em que a sobrevida das hemácias está
Investigação laboratorial do paciente com anemia macrocítica
diminuída devido a um aumemo da destru ição e a medula óssea não é capaz de compensação, mesmo aumentando sua produção. Estas doenças estão associadas a sinais de aumento do catabolismo da hemoglobina e aumento da produção das hemácias manifestando-se com icterícia, colelitíase, esplenomegalia e reticulocirose. As anem ias hemolíticas por defe1ro extrínseco do glóbulo vermelho podem ser devidas à fixação de anticorpos à membrana da hemácia ou por ruprura mecânica das hemácias devido à deposição de fibrina na microcirculação, como na coagulação inrravascular disseminada ou pela presença de próteses valvares mecânicas. Elas podem ser classificadas como macrocíticas ou normocít1cas, na dependência da intensidade da reticulocitose.
ANEMIAS HEMOLÍTICAS IMUNES
A anemia hemolítica imune é a condição clínica na qual anticorpos da classe lgG ou lgM se ligam a antígenos da superfície da hemácia e iniciam a destruição das hemácias via sistema do complemento ou sistema mononuclear fagocitário. As anemias hemolíticas imunes são classificadas como auto-Imune, aloimune e induzidas por drogas baseadas no estímulo antigênico responsável pela resposta imune
CLASSIFICAÇÃO Anemia hemolítica auto-imune
A anemia hemolítica auro-imune (AHAI) ocorre por defeiw na imunorregulaçào do indivíduo e é caracterizada pela produção de anticorpos contra amígenos eriuocitários próprios. Como os auto-anticorpos são dirigidos contra amígenos de alta incidência. eles têm reatividade contra hemácias alogênicas também. A AHAI possui incidência de 1 a 3 casos por 100.000 por ano nos Estados Unidos. A AHAI é classificada de acordo com a temperatura característica de reatividade do auwamicopo amieriuocitário. Os auto-anticorpos quentes reagem mais fortemente em temperaturas próximas de 37"C e geralmente são
297
da classe lgG
e somente em
grande quantidade conse-
Anemia hemolítica induzida por droga
guem ativar a via do complemento. Exibem diminuição da afinidade a temperacuras mais baixas e em geral não
A hemólise imune induzida por drogas é classificada
causam problema para a ripagem A BO sendo responsá-
de acordo com três mecanismos de ação: adsorção da
veis por 70% dos casos de A HAI. A sede da hemólise é
droga (hapteno induzida), complexo imune e auro-anti -
extravascular, especialmente esplênica, local em que os
corpo. São m ediadas por anticorpos lgG e lgM e levam a
macrófagos possuem recepwr para essas lgGs. A fagoci-
um reste posittvo da antiglob ulina, sendo clínica e soro-
cose parcial do erirrócico pelo macrófago esplênico, para
logicamente indistintas da AHAI.
remoção do anticorpo, acarreta lesão da membrana eritrocitária com conseqüente formação de esferócico.
O tratamento com penicilina em altas doses é um exemplo do mecanismo de hemólise por adsorção à
Os anticorpos frios ou crioaglutininas são da classe
droga, na qual o medicamen ro ligado à mem brana d a
lgM e ligam-se às hemácias mais fortemente em tempe-
hemácia estimula a produção de anticorpo lgG. Quan-
raturas próximas de 0-4°(. tipicamente mostram afinida-
do grandes quantid ades da droga cobrem a superfície
de diminuída em temperaturas fisiológicas e arivam fa-
da hemácia, o anticorpo se liga à membrana e causa a
ci lmente a via do complem ento, cu rsando com hemólise
hemólise exuavascular.
exrravascular, com sede hepática predominantem ente e
A hemólise induzida por quin ina é o protótipo do
hemólise intravascular menos freqüentemente. O ser-
mecanismo d e complexo imune, na qual a droga induz a
viço de hemoterapia pode suspeitar de AHAI mediada
produção de anticorpo lgM .
por lgM quando a ripagem ABO do paciente apresentar
O complexo droga-anticor po liga-se à membrana
resultado duvidoso, devendo ser repetido o reste a 37"(
eritrocitária e inicia a arivação d o com p lemento resu l-
lavando as hemácias do paciente com sal ina aquecida.
tando em hemólise intravascular. A alfa- m etildopa é o
Segundo a etiologia, a AHAI pode ser primária ou
exemplo clássico de indução de anticorpo antieritró-
idiopática quando não mostra associação com outras
cito, apesar do m ecanismo exato ser desconhecido,
doenças; e secund~rias Cau ças secundárias pod em ser
a d roga talvez altere a proteína da memb ra na celu lar
determinadas em 20 a 80% dos casos e incluem doenças
tornando-a antigênica e induzi ndo a produção de an-
linfoproliferariva s, doenças au to-im unes, infecções, im u-
ti co rpos antieritrócito d o t ipo lgG, levando à hemó li-
nodeficiências e neoplasias.
se excravascular.
Tabela 26.3 - Correlação entre os resultados das dosagens séricas de vitamina Bl2 e folaw e a contribuição da avaliação dos metabóliros
Vit Bl2 pg/ ml Folato ng/ ml
Diagnóstico
Metabólitos?
normal
Não
> 300
>4
< 200
>4
!.
B12
200 - 300
>4
!.
Bl/
> 300
<2
!. Foloto
Não
< 200
<2
!. Foloto +B12?
Sim
2·4
J.Folato7
Homocisteína 5-14mM
i
i
normal
normal
i
i i
J. Falata Raramente J. B12
normal
i
!. Folato Raramente !.
normal
normal
Interpretação
N ão Sim
normal
ou ,J, Folmo? >300
Ácido metilmalônico 70-270nM
Sim
!. B12 Exclui !. B12 !. Folato +
B12
B12
normal
298 ( Medicina laboratorial para o clínico Jf---- - - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - - -- - - -
Anemia hemolítica aloimune
A hemólise aloimune é uma reação hemolítica grave causada por uma reação transfusional aguda por sangue incompatível. A transfusão, por exemplo, de hemácias do grupo sanguíneo A no receptor do grupo O, que tem anticorpos antiA do tipo lgM circulantes, leva à fixação do complemento e uma hemólise inrravascular imediata. Em poucos minutos o paciente desenvolve febre, tremor, dispnéia, hipotensão e choque. Uma reação hemolítica transfusional tardia pode ocorrer de três a 10 dias após a transfusão e é causada por tículos baixos de anticorpos a antígenos menores da hemácia. Estes anticorpos são gerados rapidamente após uma exposição a antígenos erirrocitários e levam à hemólise extravascular, com início e progressão mais gradual quando comparados com a reação transfusional aguda.
MANIFESTAÇÕES ClÍNICAS
O paciente pode queixar-se de dispnéia e cansaço devido à anemia; taquicardia em repouso e sopro cardíaco podem estar presentes. A urina pode ficar escura e dor nas costas pode ser relatada por pacientes com hemólise inrravascular, em decorrência da hemoglobinúria. A pele pode estar pálida e amarelada devida à associação de icterícia ao quadro anêmico. Esplenomegalia é comum.
positiva para heme, na fita, em ausência de erirróciros numa urina de cor castanho avermelhada. O ferro da hemoglobina pode ser estocado nas células tubulares renais como hemossiderina e a hemossiderinúria pode ser detectada nas células tubulares descamadas no sedimento urinário, pela coloração do azul da Prússia, após uma semana do início da hemólise.
O hemograma e a contagem de reticulócitos
A anemia da hemólise é usualmente normocítica, mas a reticulocirose importante pode levar à macrocitose por aumento do VCM devido ao tamanho médio do reticulócito ser 150fl. O esfregaço de sangue periférico é um exame importante na avaliação de qualquer anemia. As hemácias devem ser analisadas para pesquisa de morfologias parognomônicas como esferóciros ou esquizóciros, assim como a observação dos leucóciros e plaquetas é essencial para diagnóstico de doenças hematológicas malignas coexistentes. A reticulocicose é um achado característico da hemólise indicando a resposta normal da medula óssea à destruição dos eritrócitos. Em alguns pacientes a medula óssea é capaz de compensar cron icamente a hemólise mantendo uma hemoglobina normal e estável.
Teste de Coombs O LABORATÓ RIO NO DIAGNÓSTICO DAS ANEM IAS HEMOlÍTICAS IMU NES
A destruição das hemácias é caracterizada por um aumento da bilirrubina indireta, da desidrogenase lática e pela diminuição nos níveis da haproglobina. A hemoglobina e a desidrogenase lática são liberadas na circulação quando as hemácias são destruídas. A hemoglobina é convertida em bilirrubina não conjugada no baço ou pode ser ligada no plasma a haproglobina. O complexo hemoglobina-haproglobina é rapidamente retirado pelo fígado, levando a níveis diminuídos ou não detectáveis da haptoglobina. Quando a hemólise intravascular é muiro grave, a capacidade de ligação da haptoglobina é excedida e a hemoglobina livre é fi ltrada pelo glomérulo, levando à hemoglobinúria que é detectada pela reação
Investigação laboratorial do paciente com anemia macrocítica
O teste da antiglobulina ou teste de Coombs baseiase no princípio de que anticorpos específicos anriglobulina humana atuam como uma ponte para a aglutinação de erirróciros envolvidos por imunoglobuli na humana ou complemento, figura 26.1. Quando o teste de Coombs é utilizado para detectar anticorpos diretamente na superfície do eritróciro é chamado Coombs di reco, já quando utilizado para detectar anticorpos antieritrocitários circulantes chama-se teste de Coombs indirero. O soro de Coombs (anriglobulina humana) pode ser de reagente poliespecífico ou monoespecífico. O poliespecífico é constituído de anticorpos antilgG policlonais e anticorpos monoclonais anri C3b e C3d. O soro monoespecífico possui reagentes anti lgG; anti lgM; anti lgA; anti C3b; anti C3d; anti C3; anti C4 e anti C4b.
299
{y
~ {y
~
{y
{y
+
{y {y
6-
entrócitos
lgG
2 11
<(
f:/
{y
{y
"'/:,;
congênicos, como anemia de Fanconi, diskerarose congênira e as mutações do gene da telomerase (TERT). A incidência da anemia aplásrica adquirida na Europa e América do Narre é em torno de 2 casos por mtlhào da população por ano. Na Ásia, a incidência é 2 a 3 vezes matar.
c:r A
+
{y
ETIOLOG IA E PATOGEN IA
<( <(
A
ont1lgG humano !soro de Coombs)
A
eritrócitos sensibilizados 3
J:>
{y
\~
aglutinação erit1ocitária visível Figura 26.1 - Ilustração esquemática do resre de Coombs clirero. Embora seja um reste muiro sensível. um resultado negativo não exclui a presença de anticorpos antierirrocitános. Esttma-se que para positivar o teste de Coombs seJam necessárias cerca de 10 a SOO moléculas de lgG ou C3 por eritróciro. A tabela 26.4 apresenta as aplicações do teste de Coombs em siruaçãoes clínicas dtversas. Tabela 26.4 - Aplicações do resre de Coombs Situação clínica lnves11goçào de auto-anticorpos Reoções hemolifl· cos tronsfus1onois Doença hemolítica perinotol Anticorpo 1nduzido por droga
Coombs direto positivo
Coombs indireto negativo
positivo
positivo
positivo no neonalo positivo no mãe pOSIIIVO
negativo
ANEMIA APLÁSTICA
A anemia aplástica é definida como panciropenia assooada à hipoplasia de medula óssea na ausência de infiltrado anormal e sem aumento de reticulina. Anemia aplásrica pode ser secundá na a uma variedade de doenças, incluindo a anemta aplástica adquirida e estados de falência medular
300 [ Medicina laborarorial para o clínico
São descmos como agentes causais: radiação ionizante, benzeno, quimtoreráptcos, antibacrerianos (cloranfenicol), sais de ouro, antiinflamatórios não hormonais, antitireoidianos, vírus tipo hepatite não A, não B, não C parvovírus, vírus Epstein-Barr. doenças au ro-imunes como a fasci ice eosinofílica, desordens congênicas ou hereditárias incluindo a Anem ia de Fanconi, a Discerarose congênita e Anemia de Blackfan- Diamond. A anemia aplástica é denominada idiopática, nos casos em que não há evtdência de um agente causal. siruação encontrada em 50 a 75% dos casos. Os facores etiológicos positivamente assooados com anemia aplástica no Brasil foram tintas, solvemes orgânicos e inseticidas organofosforados. Não se encontrou associação com o cloranfenicol. hepatites, dengue, irradtação ou baixo nível socioeconômico. Dados clínicos e laboratoriais sustentam o papel do ststema tmune na patogênese da anemia aplástica. Várias drogas imunossupressoras, incluindo a globulina anmimocitica (ATG), a ciclosporina (CSP), alcas doses da ctclofosfamida ou corticosteróides, têm produzido melhora na matona dos pacientes com citopenias graves. ln vitro, percebe-se ini bição da cultura de unidades formadoras de colónias hemaropoiéticas pelos linfócitos do paciente e m v1vo. Podem-se detectar linfóciros cicotóxicos ativados circulantes e produção aumenrada de citocinas típicas de resposta Thl especialmenre inrerferon-gama, faror de necrose tumoral e interleucina-2. As células T ativadas localmente na medula óssea provavelmenre induzem morte celular das células-tronco e progenitoras hematopoiéticas mediadas pelo Fas. Recentemenre, foram descritas mutações no gene TERC telomerase e da rranscriprase reversa (TERC gene) num grupo de pacientes com anemia aplástica associada a telomeros curtos e atividade da telomerase marcantemente reduzida. Parentes de pacientes com estas mutações também apresentam cttopentas leves e comparti-
mento normal ou reduztdo das células rronco. Murações complexas no gene da relo mera se podem representar um fator de risco genético para falência da medula óssea.
Tabela 26.6 - Classificação da anemia aplástica de acordo com o agente causal Anemia aplástico adquirida A nemio aplástico secund ário
CLASS IFICAÇÃO
Irradiação Drogas e quím1cos
A anemia aplásrtca pode ser classificada de acordo com a gravidade e agente causal. A avaliação da severidade da anemia apláscica é importante na decisão do cracamenco e cem significância prognóscica, rabeias 26.5 e 26.6. Tabela 26.5 - Class1f1cação da Anemia Aplástlca de acordo com a defin1ção de sevendade
Agentes c1totóxicos Benzeno Reoções ;d,ossincrás1cos Cloronlenicol Antiinflomotórios não hormo1 OIS Anticonvulsivo ntes
Anemio aplástico grave
Do is dos três crité1ios N eutrófilos< Plaquetas <
0,5
x
10 61 l
20 x I 06 I l
Reticulócitos <
20 x I OóI L
Anemio aplástico muito grave
Mesmos cr,té11os do grave e neunóiilos < 0,2 X ]QÓI L
Anemio aplástico moderado
Ausência dos critérios de g rave e muito g rave
Sois de ouro Outros drogas e químicos Vírus Vírus Epstein-Borr Vírus do Hepolle (nõo·A nõo·B, nõo·C. nõo·G) Porvovírus HIV Doenças auto-imunes
MANIFESTAÇÕES CLÍNI CAS Fosciite eosinof'lico
A maioria dos pacientes com anemia aplástica procura atenção médica devido a sintomas resultantes das citopenias. Todas as séries podem estar diminuídas ou uma série pode dominar o quadro clínico. A mataria dos pacientes não apresenta sintomas sistémicos, se ocorrer perda de peso, dor ou diminuição de apetite um diagnóstico diferencial deverá ser investigado. O sangramento é a manifestação mais alarmante da pancicopenia e freqüentemente leva o paciente ao médico. Plaqueropenia se manifesta por petéquias, equimoses, gengivorragia e epistaxe. O aumento do fluxo menstrual e o sangramenco vaginal irregular podem ocorrer em mulheres jovens. Nos pacientes com anemia aplásttca associada à hemoglobinúria paroxística Norurna existe relato de urina escura que é causada pela hemoglobina livre. Hematúria macroscópica e sangramento digestivo são raros ao diagnóstico. Sangramenco grave de qualquer órgão pode ocorrer, mas é usualmente tardio e associado às infecções ou procedimentos invasivos.
Investigação laboratorial do paciente com anemia macrocítica
H ip oimunoglobulinemio T1momo Doença do enxerto contra o hospedeiro em imunodek1entes Hemoglobinúr1o paroxística noturno Grov1dez Anemio oplásllco idiopólico
Anemia aplástico hereditária Anemio de Fonconi Diskerotose congénito Síndrome de Shwochmnon·D1omond Disg enesio reticular Trombocitopen1o omegocor1ocítico Anemio a p lástico familiar Preleucemio Sínd romes não hemotológicos (Down, Dubowitz, Seckel(
301
A habilidade dos pacientes em se adaptar à queda gradual da hemoglobina é marcante. O paciente anêmico pode relatar fad iga, lassitude e dispnéia aos esforços, entretanto, alguns indivíduos coleram níveis de hemoglobina muito baixos. Dencre as manifestações clínicas relacionadas às ciropenias, a infecção é a manifestação menos freqüente ao diagnóstico. Febre na apresentação da doença pode ocorrer, mas sinais específicos e de localização da infecção são incomuns. Em crianças e adulcos jovens, a baixa estatura, as manchas café com leite e as anormalidades esqueléticas devem alertar para a possibilidade de Anemia de Fanconi, embora alguns pacientes com Anemia de Fanconi não apresentem estes sinais clínicos. A leucoplasia, a distrofia das unhas e a pigmentação da pele são característicos de disceracose congênita, outra forma hereditária da anemia aplástica. História de icterícia, usualmente 2-3 meses ames, pode indicar uma anemia aplástica pós-hepatite. Muitas drogas têm sido implicados na etiologia da anemia aplástica. Uma história detalhada de codas as exposições por um período de 6 meses ames da apresentação deve ser obtida. Similarmente, a história ocupacional do paciente pode revelar exposição a químicos e pesticidas que têm sido associados à anemia aplástica.
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DA ANEMIA APLÁSTICA Hemograma e contagem de reticulócitos
Pacientes com anemia aplástica apresentam graus variáveis de pancitopenia. Na maioria dos casos o nível de hemoglobina, a contagem de neutrófilos e plaquetas estão uniformemente diminuídos, mas em fases precoces de doença, cicopenia isolada pode ocorrer, particularmente plaquecopenia. A morfologia das hemácias é freqüenremenre normal no exame do esfregaço sanguíneo, embora possa ocorrer anisopoiquilocitose. Os contadores celulares automatizados freqüenremenre mostram macrocitose e tamanho plaquetário normal. Neutropenia marcante é freqüenre e a contagem absoluta de neutrófilos é o fator prognóstico mais importante; granulações tóxicas nos neutrófilos podem ser percebidas. Embora a linfocitose relativa seja comum, a maioria
302 ( Medicina laboratorial para o clínico
dos pacientes apresenta contagem absoluta diminuída de monócicos e linfócitos. A contagem de reticulócicos está freqüememente diminuída, isto é mais pronunciado quando a contagem é feita por contadores aucomatizados.
Exame da medula óssea
O aspirado medular é usualmente obtido sem dificuldades. Se ocorrer resistência para a coleta o diagnóstico de outra doença da medula óssea deve ser pensada. O material aspirado é geralmente hipocelular, rico em gordura e com quantidades variáveis de células hematopoéticas residuais. Diseritropoese é comum, usualmente com características megaloblastóides. Megacariócitos e precursores granulocíticas estão diminuídos ou ausentes. Os linfócitos, macrófagos, plasmócitos e masrócitos predominam. Nos estágios precoces da doença, hemofagocicose pelos macrócitos pode ocorrer. A biópsia de medula óssea é fundamental para estimar a celularidade medular (relação tecido adiposo/ tecido hematopoético), avaliar a morfologia das células hematopoéticas residuais e excluir infiltrados anormais. Na maioria dos casos o material é completamente hlpocelular, mas em alguns casos podem ocorrer áreas celulares ao lado de áreas hipocelulares. Assim, o fragmento de biópsia deverá medir pelo menos 2 cm. Cuidado deve ser tomado para evitar biópsias tangenciais (a medula subcortical é normalmente hipocelular). A hiperplasia focal de células eritrocíticas ou granulocíticas pode ser observada. Os agregados linfóides podem ocorrer algumas vezes, particularmente na fase aguda da doença ou quando a anemia aplástica é secundária à doenças auco-imunes, como artrite reumatóide e lúpus eritematoso sistêmico. A reticulina está normal e células anormais estão ausentes. Blastos não estão presentes na anemia aplástica e a sua presença pode indicar síndrome mielodisplásica hipocelular ou evolução para leucemia.
Estudo citogenético
A exigência de citogenética normal da medula óssea para o diagnóstico de anemia aplástica está sujeita a con-
]1-- - - - - - - - -- - - - - - - -- -- - - - - - - - - - -
rrovérsias. Arualmenre. acredita-se que cerca de 11% dos paCientes com anem1a aplásrica apresentem clones com alterações cirogenéricas. Cerras alterações como rrissomia do cromossoma 8 rêm sido descritas. Os linfócicos do sangue periférico devem ser examinados em rodos os pacienres abaixo de 35 anos, para avaliação de quebras cromossôm1cas (induzidas por diepox1burano ou micomicina-C) características da anemia de Fanconi.
Outros exames
O teste para detecção de clones da hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) por cicometria de fluxo das hemácias e granulócicos deverá ser feico para estabelecer a presença de um clone HPN. Marcação para CDSS, CD59. glicoforina ( anrígeno específico para eritrócicos) e CD15 para granulócicos deve ser fe1ta. Pelo menos 1/3 dos pacienres com anemia aplástica irá apresentar clones HPN de vários tamanhos. É provável que alguns pacienres possam desenvolver HPN clinicamente significante no curso de sua doença. HPN tem sido descrita em crianças. mas é menos comum. O teste de HAM (hemólise em meio ácido) detecta a presença de clone s1gnificanre de HPN com evidência laboracorial de hemólise e deverá ser realizado em todos os pacientes ao diagnóstico.
de da célula em concluir o processo mitótico. aring1ndo quase o dobro do volume eritrocitário normal. por isso. o valor do VCM é um faror importante a ser considerado no raciocínio diagnóstico diferencial das anemias macrocíticas. Em pacientes portadores de pancitopenia com macrocitose, reticu/ociropema e aumenro de DHL, a hipótese de anemia megaloblástica é muito pertinente, ao passo que anemia macrocínca associada a reticulocitose e aumenro de DHL sugere AHAI. Panciropenias que expõem a risco de vida, combinadas ou não com macroCItose, reticulocicopenia e DHL normal, são freqüenres em pacientes portadores de anem1a aplásnca. REFERÊNCIAS 1.
2.
3.
4.
5. 6.
7.
CONSIDERAÇÕES FINAIS 8.
Dianre de paCientes portadores de anem1as macrocítlcas, deve-se sempre estar aremo para a gênese da macrocitose, lembrando que nas anemias megaloblásricas o valor do VCM costuma ser muito elevado, pela dificulda-
Investigação laboratorial do paciente com anemia macrocítica
Ások AC. Megaloblastic anemias. ln: Hoffman R. Benz )r
EJ. Sharul SJ. Furie B. Cohen l i). Silberstein LE. McGiave P.
9.
ed1rors. Hemam logy. Bas1c pnnciples and prawce. 4 ed. New York: Churchill liv1ngsrone; 2005. p. 519-56. Beutler E. L1chtmana I. Cller S. K1pps ). Aplast1c anem1a. ln: Beurler E. ed1tor. W1lhams Hematology. 5rh ed. New York: M cGraw Hill; 1995. p. 238-56. Guinan CC. Aplast1c anem1a: managemenr of pediamc panenrs. Hematology Am Soe Hematol Educ Program. 2005:104 -9. Hoffbrand W, Provan D. ABC of clincal haematology: MacrocyrJc anaem1as. BMJ. 1997:31 4; 430-3. llvas AM. Nexo E. 0 1agnosJSand rreatmenr of v1ramin B1 2 defio ency. An updare Haemarolog1ca. 2006;91(11) 1506-12 Mac1eJewsk1J. RISJtano A. Aplasuc anem1a: M anagemenr of Adules Parienrs. Hemarology Am Soe Hematol Educ Program. 2005:11 0-7. Marsh W. Managemenr o f acquired aplasnc anaem1a. Blood Rev. 2005;19(3):143-51. Marsh JC. Ball SE, Darbysh1re P. Gordon-Smith [(. Keldan AJ. Mamn A, et ai. GUJdel1nes for rhe Diagnos1s and managemenr of acqUired aplasnc anem1a. Br J Haemarol. 2003:123(5):782-801 Toh BH, van DrieiiR, Gleeson PA. Pern1oous anem1a. N Eng) Med. 1997;337:1441-8.
303
Ana Beatriz Firmato Glória
27
José Roberto de Faria
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DESORDEM LEUCOCITÁRIA
INTRODUÇÃO
dos neutrófilos (basronetes mais segmentados) evidenciados na contagem d iferenoal dos leucócitos. As
Os valores normais da comagem dos leucóciros no
contagens dos neutrófilos variam com a idade, sexo,
sangue periférico variam de 5.0 a 10.0 x 109/L. Valores inferiores a 3.5 x 109/L e acima de 11.0 x 109/L são conhe-
dade é diferente para determi nadas populações. No
cidos, respectivamente, como leucopenia e leucocirose.
entanto, para a maioria da população o l1mite de 1.5
raça e, por este motivo, o limite inferior da normali-
Os leucócitos circulantes são um grupo heterogê-
x 109 /L é considerado o valor inferior da normalidade.
neo de tipos celulares (neutrófilos, monócitos, basó-
Indivíduos de raça negra têm valores inferiores de nor-
filos, eosinófilos, linfócitos B, linfócitos T e linfócitos
malidade m ais baixos: 1,0 x 10 9/L.
Natural kliler), cada um deles com f unções e propor-
A neutropenia é classificada, de acordo com os va-
ções bem definidas na população de leucócitos glo-
lores da contagem absoluta de neurrófilos, em discreta,
bais. Devido a esta heterogeneidade dos leucócitos,
moderada e grave. Esta classificação tem valor para pre-
tanto os valores globais quanto os valores das conta-
dizer o risco de infecções graves. Neurropenia discreta
gens diferenciais são afetados em diversas situações
corresponde a valores entre 1,0 e 1.5 x 10 9/L; a mode-
clínicas. As avaliações das mudanças quantitativas e
rada a valores entre 0.5 a 1,0 x 109 /L; e grave a valores
morfológicas dos leucócitos circulantes são impor-
inferiores a 0,5 x 10 9/L. As causas de neutropenia são desordens hetero-
tantes pistas para a definição diagnóstica.
gêneas, adquiridas ou hereditárias, com mecanismos fisioparológicos diversos e com evolução clínica be-
VARIAÇÕES DOS NEUTRÓFILOS
nigna ou grave. Por isro, a avaliação da cinética normal dos neutrófilos
VARIAÇÕES QUANTITATIVAS
e a determinação de desordem here-
ditária ou adquirida são importantes na classificação dessas causas. Por sua vez, a classificação facilita o ra-
Neut ro penia
ciocínio clínico para definição da investigação laboratorial necessária.
A neutropenia é definida como redução significa-
Os neuuófilos são originados de um pool de pre-
tiva do número absoluro dos neutrófilos circulantes.
cursores medulares normais por meio de processos de
A contagem absoluta dos neutrófilos é calculada mul-
diferenciação. divisões celulares e maturação. No am-
tiplicando-se o total de leucócitos pela porcentagem
biente medular há o compartimento mitótico, que são
precursores com capacidade replicativa (mieloblasros, promielóciros e mielócims), e o compartimento não mitótico (metamielócitos, bastonetes e segmentados), que estão nos estágios finais da maturação e permanecem como um reservatório apto para rápida liberação se solicitado. Após liberação, no sangue periférico os neutrófi los podem se mover em dois compartimentos. Aproximadamente metade das células circula livremente e constitui o pool circulante. A outra metade constitui o pool marginado ao endotélio vascular. Os neutrófilos circulantes são contados nas amostras de sangue periférico enquanto que os do pool marginado não são. Há livre intercâmbio entre estes dois compartimentos. Após aproximadamente seis a 12 horas da liberação medular, os neutrófilos movem-se para o espaço extravascular onde realizarão suas funções. O Quadro 27.1 distribui as neutropenias de acordo com o compartimento envolvido. A neutropenia também pose ser classificada, de forma simplificada, em adquirida e hereditária (Quadro 27.2). Neutropenias hereditárias
As duas principais formas de neutropenia hereditária são neutropenia cíclica, também conhecida como hematopoese cíclica, e neutropenia congênita grave ou agranulocitose grave da infância. A neutropenia cíclica é uma doença rara na qual as contagens de neutrófilos, no sangue periférico, oscilam dentro de um período aproximado de 21 dias. O nadir (nível mais baixo) da contagem de neutrófilos é próximo de zero e tem a duração em mrno de três a 10 dias e o pico é próximo do normal. Nos períodos de neutropenia os pacientes são sintomáticos e podem apresentar febre, úlceras na cavidade oral e infecções várias. Édescrita esta mesma periodicidade em doenças adquiridas tais como leucemia mielóide crónica, síndromes hipereosinofílicas e leucemia linfocítica de grandes linfócitos granulares. A neutropenia congênita grave ou agranulocitose grave da infância é geneticamente muito heterogênea e a maioria dos casos parece ser esporádica, o que é consistente com uma doença freqüentemente fatal. As manifestações geralmente iniciam-se precocemente. em torno de três meses de idade, e são infecções bacterianas recorrentes e graves associadas à neutropenia grave. Pode ocorrer monocitose compensatória.
306 ( Medicina laboratorial para o clínico
Quadro 27.1 - Distribuição das neU[ropenias de acordo com o compartimento envolvido Ano rmalidad es do co mpartimento medular Ouimioteropio (agentes citotóxicos e não citotóxicosl
Radioterapia Deficiências vitomínicos (ácido fálico e vitamino B121 Agentes químicos (benzeno, bismuto, orsênicol Neutropenios congênitos Neutropenios imunomediodos Infecções virais e bacterianos (AIOS, porvovirose. hepatite. tuberculose! Substituição infiltrotiva do medu la óssea (leucemias, linfomos, mielofibrose. neoplosios não hemotológicas) Falência do medula ósseo (anemia a plástico)
Anormalidades do co mpa rtimento sangüíneo Pseudoneutropenio - desvio de neutrófilos do poof circulante poro o marginal (hereditá rio ou constitucional e secundário o infecção bacteria no, desnutrição e malária! Seqüestro intravasculor (como no hiperesplenismo)
Anormalidade do compartimento extravascular Aumento do utilização (infecções gra ves e anafilaxiasl
Neutropenias adquiridas
As neutropenias adquiridas são. também, doenças relativamente raras e serão abordadas nesta seção: neutropenia imune primária e secundária, neut ropenia induzida por drogas, neutropenia benigna crónica e idiopática. Neutropenias imunes A neutropenia imune é o resultado da presença de anticorpos direcionados contra antígenos neutrofílicos específicos que medeiam a destruição dos neutrófilos ou por seqüestro esplênico das células opsonizadas ou por destruição mediada por complemento. Pode ser aloimune ou auto-imune, ser primária ou secundária a doença auto-imune e se apresentar de forma seletiva ou associada a outras ciropenias periféricas. A neutropenia aloimune neonatal é causada pela sensibilização materna por antígenos dos neutrófilos
fecais, o que resulta na produção materna de anticorpos lgG antineutrófilos fecais. Estes anticorpos alcançam o feto via placenta. Os neonatos desenvolvem neucropenia transitória com recuperação espontânea após período mediano de sere semanas. Quadro 27.2 - Causas de neuuopen1a
Hereditárias
Adquiridas
Neutropenia familiar benigno
Induzido por drogas ou toxinas
Agronulocitose grave do mfã ncio - síndrome de Kostmann
Pós·infeccJoso
Neutropenia cíclico
Doenças auto-imunes
Síndrome de SchwochmonDiomond-Oski
Desordens leucêmicos
Síndrome de Chediok-Higoshi
Desordens linfoproliferotivos
Disgenesio reticular
Hiperesplenismo
Disquerotose congénito
Deficiência nutricional
Síndrome do hiperimunoglobulino M
Aplosio puro de série bronco
reumatóide e lúpus eritematoso sistêmico. Na artrite reumatóide a neutropenia é usualmente conseqüente ou da síndrome de Felty (críade de artrite reumatóide + esplenomegalia + neutropenia) ou da leucemia linfocítica de grandes linfócitos granulares. Neutropenia induzida por drogas A neutropenia induzida por drogas é uma reação idiossincrásica que resulta em neucropenia grave ou agranulocimse. Vários mecanismos patogênicos estão relacionados, entre eles a descruição mediada por mecanismos imunes, inibição da granulocicopoese, coxicidade direca nas células hemacopoéticas ou microambiente medular. As neutropenias desse grupo têm elevada taxa de complicações infecciosas. As drogas mais comumente associadas à agranulocitose são medicamencos antitireoidianos (carbamizol, mecimazol, tiouracil), sulfonamiadas, cefalosporinas, penicilinas, cloranfenicol e anticonvulsivantes (carbamazepina, ácido valpróico). O Quadro 27.3 lista as principais drogas capazes de induzir neutropenia.
A nemio aplástico
Quad ro 27.3 - Drogas capazes de 1nduzi r neuuopenia Hemoglob1núrio paroxislico no1urno Desordens metabólicas Neutropenia neonotol oloimune N eutropenia auto-imune
A neucropenia aum-imune primária ocorre predominantemente em crianças abaixo de crês anos de idade e é uma doença rara. Os pacientes apresentam neutropenia crôntca moderada a grave e infecções geralmente não graves. Muitas destas crianças exibem remissão esponcânea durante a evolução. Neucropenia auro-im une primária em adultos é rara, sendo habicualmence secundária a alguma síndrome auto-imune subjacente. A neutropenia auco-imune secundária em crianças é rara e pode estar associada à síndrome linfoproliferativa auto-imune. Esta síndrome é caracterizada por cicopenias auto-imunes associadas à adenopatia e esplenomegalia. Nos adultos, a neutropenia auto-imune secundária é mais comum e ocorre principalmente associada à artrite
Classe
Drogas
Antiorrítmicos
O uinidino, propranolol, procaina mido
Antibiólicos, quim1oterápicos e ontivirois
Cloronfen icol, penicilina, sulfonamidos, rifompiCino, voncomicino. JSOniazida, goncJCiovir, zidovudino
Antimaláricos
Dapsono, quinino, pirimetamino
An'iconvulsivonles
Fen,toíno, corbamazepino, himetadiono
H ipoglicemiontes
Tolbutomida, clorpropomido
Anti-hioertensivos
Coptopril, olfo-metildopo
Antiinflomotórios
Fenil butazona, sais de ouro, ibuprofeno, indometocino
Anlilireoidionos
Prnrillinwoc:il, tin11rnc:il, metimn7nl
Diuréticos
Acetozolomido, hidrodorotiozida, clortolidono
Citotóxicos
Alquilontes. ontimetobólicos, ontrociclicos, inibidores do topoisomerase, análogos do plolino e agentes antimicrotúoulos
O utros
lnterferon, alop urinol, etanol, levamizol, metron idazol, estreptoquinose
Investigação laboratorial d o paciente com d eso rdem le ucocirária
307
'-'e .~roo rl a herJ~na crutli.CI A neutropenia benigna crónica não imune compreende um grupo heterogêneo de desordens que compartilham a presença de neutropenia seletiva em um paciente saudável (citogenética medular normal. ausência de doença auto-imune subjacente e de defiCiências nurnciona1s e mielodisplasia), com pouco ou nenhum risco aumentado de infecções. São descritas formas familia res e não familiares. A forma familiar é uma desordem benigna, autossômica dominante e os afetados têm neutropenia moderada a grave associada a: monomose relativa, linfocitose e eosinofilia variável. Geralmente, são assimomáticos ou oligossimomáticos. A celularidade da medula óssea é normal, com parada de maturação da séne granulocínca. a forma não famtliar não ex1ste um padrão de comprometimento familiar e os pacientes também apresentam curso clínico sem infecções graves ou recorrentes. a despetto da neutropenia prolongada, moderada a grave. A celularidade da medula é aumentada e ocorre parada de maturação. Como a maioria dos pacientes é assintomática, muitos são diagnosticados por meio de hemograma realizado por ouuos motivos.
Uma avaliação essencial no dtagnóstico diferenCial da neuuopenia é a garamia de que a comagem absoluta dos neutrófilos está realmence reduzida. Anormalidades no compartimemo dos neutrófilos no sangue periférico podem ser responsáveis por desvios destas células do pool circu lame para o pool marginado. As células do pool marginado não são concadas durante a concagem auromática de células, por isro uma concagem manual da diferencial dos leucócitos é desejável para confirmar o dado aucomatizado. Esta siruação é denominada pseudoneutropenia. A pseudoneutropenia pode ser constitucional e, nesta forma, ramo a produção quamo a unl1zação dos neutrófilos são normais, com aumento do pool marginado e redução do pool circulance. Não tem repercussão clínica. A pseudoneutropenia adqwrida geralmeme ocorre como resposta a infecções sistêmicas agudas e subagudas nas quais o aumemo da demanda de neutrófilos no compartimentO extravascular esgota, numa fase inicial, o
308 [ Medicina laboracorial para o clínico
compartimento de reserva medular. Há, também, a pseudoneutropenia laborarorial, que resulta da aglutinação dos neutrófilos in vitro como resultado de paraproteinemia ou uso de cerros anticoagulantes. Falsa neutropenia também pode ocorrer se a contagem de células for realizada após longo incervalo da coleta da amostra a ser examinada.
Neutrofilia
A neuuofilia é tida como a contagem de neutrófi los acima de 7.5 x 109/L. Ocorre ou por aumento na liberação de neutrófilos do compartimento de reserva medular e/ou por um desvio dos neutrófilos do compartimento marginado para o compartimento circulante do sangue periférico (demarginação). Isto acontece como resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos e patológicos. Esses estím ulos (fatores granulocitopoéticos, glicocorticóides, interleucinas) governam a produção e o tráfego dos neutrófilos. Na prática clínica, a leucocicose com neutrofil ia é o ti po mais comum de leucocitose. No microambiente medular, células produroras de fatores de crescimento respondem aos processos inflamatórios, aumentando a produção de fato res estimuladores de colónias granulocítico/macrofágico. Estes estim ulam a produção e a maturação de neutrófilos no compartimento mitótiCO, aumentando, desta maneira, o compartimento de reserva medular. Nestas situações, há incremento da velocidade de liberação de neutrófilos para o sangue periférico; e formas imaturas (basronetes e meramielócicos) podem ser liberadas do pool de reserva para o sangue periférico. As causas mais comuns de neutrofilia estão descritas no Quadro 27.4.
ALTERAÇÕES Q UA LITATIVAS DOS NEUTRÓFILOS As alterações qualitativas dos neutrófilos podem ser herdadas ou adquiridas, associadas a doenças benignas, malignas ou sem significado clínico. O Quadro 27.5 aborda, sinteticamente, as alterações qualitativas mais comuns dos neutrófilos, separando-as em hereditárias e adq uiridas.
Quadro 27.4 -Causas de neutrofilia Congênitas
Secundárias
Defeito de adesão leucocilório
Infecções agudos (bacterianos, virais, fúng icos, riquetsioses)
Neutrofilia id iopática
Inflamações crônicos (doenças auto·
crônico
tmunes e reumáticos)
N eutrofilia hereditário
Reoçõo leucemóide (infeccioso, neoplásico)
Reoçõo leucemó1de de síndromes cangênilas
Estresse (físico, emocio nal, térmico, elétrico)
Urticária frio familiar
Ind uzido por drogas (glicocorticói· des, lítio, epinefrino, fotor estimulador de colônio gronulocítico e gronulocítico mocrofógico)
• síndrome de Chédiak-Steinbrinck-Higashi - anomalia hereditária caracterizada pela existência de grandes lisossomas peroxidase positivos, oriundos da fusão granular por atividade descontrolada da membrana granular. Podem estar presentes neutropenia, plaquecopenia e disfunção plaquecária. Propensão a infecções e sangramentos; • anomalia de May-Hegglin - anomalia hereditária rara, caracterizada por corpúsculos Dohle like, trombocitopenia e plaquetas gigantes. Propensão a infecções e sangramento; • granulação tóxica - anomalia adquirida, relativamente comum, refere-se às granulações azurófilas (grânulos primários) em células mais maduras, habitual mente resultantes da aceleração da granulopoese, como acontece nas infecções e du rante o uso de fator estimulador de colónia granulocítica; • corpúsculo de Dohle- composto de RNA ribossômico, são ovais e medem cerca de 1-51-1. coram-se em cinza e estão presentes associados a quadros infecciosos e situações de estresse; • vacuolização - vacúolos fagocíticos podem ser encontrados em diversas situações, como: autofagocitose desencadeada por álcool, radiação e antibióticos; fagocicose bacteriana e fúngica, geralmente maiores que os de autofagocicose, e freqüentemente associados a granulações tóxicas e corp úscu los de Dohle; • necrobiose - célula apoptótica, com aspecco de núcleo explodido, com cicoplasma pálido e com pouca ou nenhuma granulação.
Estímulo medular (anemio he mo lítica. recuperação pós-falência) Asplenio e hiposplenio Endócrinas (cetoacidose. acidose táctico, tireotoxicose)
Alterações morfológicas do núcleo dos neutrófilos
• anomalia de Pelger-Huet - anormalidade hereditária comum (1/6.000) caracterizada por hipossegmentação nuclear neutrófila, sem comprometimento da função celular; • pseudopelger-Huet - anormalidade adquirida; os neurrófilos são hipossegmentados, geral mente hipogranulares, com freqüente comprometimento da função celular. Associa-se a doenças consuptivas, reações medicamentosas, infecções, mielodisplasia, leucemia mielóide crónica e leucemias agudas; • hipersegmentação - pode ser hereditária (sem significado clínico) ou adquirida, como nas deficiências de vitamina B12 e/ou ácido fálico.
Alterações morfológicas do citoplasma dos neutrófilos
• anomalia de Alder-Reilly - anomalia hereditária que cursa com diminuição da degradação de mucopolissacarídeos, gerando deposição de lipídeo no citoplasma do neutrófilo. Esses corpúsculos de Alder-Reilly são metacromáticos e podem ser confundidos com granulações tóxicas. O distúrbio pode estender-se aos eosinófilos e basófilos;
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DA VARIAÇÃO DOS NEUTRÓFILOS
A investigação laboratorial das variações quantitativas dos neutrófilos deve ser individualizada pela apresentação clínica e pela gravidade da neurropenia/neutrofilia. Na propedêutica da neutropenia, todo esforço deve ser feico na avaliação clínica para tentar identificar: • qual(is) dos compartimentos da cinética dos neutrófilos está(ao) comprometido(s) (medular, periférico, extravascular); • tempo de evolução da alteração (hereditária x adquirida);
Investigação laboratorial do paciente com desordem leucocitária
309
Quadro 27.5 - Alterações qualitativas dos neutrófilos Hereditárias
Adquiridas
Nucleares
Nucleares
Anomalia de Pelger-Huêl
Pseudopelger-Huel
Hipersegmentoçõo heredilária
Hipersegmentoçõo megoloblástica Necrabiose
Citoplasmáticos
Citoplasmáticos
Sí11drome de Chédiad-•gashi
G ranulação tóxico
Anomalia de May-Hegglin
Corpúsculo de Dóhle
Gro'lutação de Alder-Re lly
Degranulação Vacuolização
• repercussão clínica (infecções recorrenres. gravidade das infecções); • grav1dade da neutropenia. Para tanto, é necessária uma busca ariva destes achados clínicos. que podem direcionar o raciocínio diagnóstico e estabelecer a propedêutica laboratorial. necessária para cada caso. Esta busca é realizada na anamnese e no exame fís1co. É imporcante, entre outras: • avaliação do crescimento e desenvolvimento e anormalidades no fenóti po (hereditária?); • história fa miliar, idade de início e hemogramas anteriores (fa miliar? crônica7); • exposição a drogas (associada a drogas?); • Radiação ionizante e terapia mielmóxica (lesão medular?); • aftas. infecções periódicas, hemogramas seriados com contagens oscilantes (cíclica?); • grupos de risco para infecções por vírus B e C da hepatite e HIV (associada a infecções?); • sintomas e sinais sugestivos de doenças reumáticas (imune7); • achados físicos assoCiados como palidez. petéq uias e equimoses. adenopatias. hepatoesplenomegalia, atrofia de papi las linguais (distúrbio medular não seletivo?); • tipo. gravidade e freqüência das 1nfecções (benigna?).
310 [ Medicina laboratorial para o clínico
Na avaliação inicial de um paCiente neutropênico é impresCindível defin1r se há cménos para diagnóstico de neutropenia febnl. situação na qual a conduta terapêutica é uma emergência médica e a propedêutica para esclarecimento da etiologia deve ser empregada com urgência. Além disto, é imperioso definir se neutropenia é isolada (selet1va) ou assoctada a outras citopenias (bt ou pancitopenia). Isto porque, excetuando as situações indu bitáveis de deficiência de vitamina B12 e/ou folato ou h1peresplenismo. a neutropenia não seletiva é um forte indicador de comprometimenw medular e da necessidade do estudo da medula óssea por meio mielograma, biópsia de medula óssea. análise do cariótipo da medula óssea. imunofenmipagem para determinação de população clonai e análise das alterações genéticas moleculares, de acordo com a indicação clínica. Estes exames não devem fazer parte da rotina da avaliação de um paCiente neutropênico e o emprego deste arsenal laboratorial está condicionado às hipóteses diagnósticas feitas por meio da história clínica e exames laborawriais iniciais simples como o hemograma automatizado e a avaliação morfológica das células. Nas neutropenias seletivas raramente estão indicados e a propedêutica adicional é orientada pela gravidade da neutropenia e repercussão clínica. A avaliação do hemograma auwmatizado e do esfregaço de sangue periférico com contagem manual da diferencial de leucóciws é o primeiro e um dos mais im portantes passos laboratoriais dessa investigação. É simples. não oneroso e de amplo acesso. É importante verificar o volume corpuscular médio das hemácias (VCM). Macroovalóciws. alterações morfológicas dos neutrófilos (hi pogranulação, hipossegmentação, hipersegmentação) podem sugerir comprometimento medular com distúrbios de maturação/diferenciação por diversas causas. Dependendo desses achados, associados aos dados clínicos, podem ser necessárias dosagens de vitamina 812. ácido fálico e seus metabóliws. bem como o estudo da medula óssea citado. Nas neutropenias imunes. o uso de testes para detecção de anticorpos am1neutrofíhcos não é multo empregado na prática médica porque a incidência elevada de resultados falso-positivos pode complicar a Interpretação. Além dtsto, os neutrófilos são células frágets e tendem a agluttnar. espontaneamente. in vttro e sofrer lise celular durante a manipulação laboratorial. Isto explica os anticorpos detectados em certas populações de não
neurropênicos bem como a ausência de correlação entre o nível do anticorpo derecrado e o grau de neutropenia. Em relação à investigação da neuuofilia, a história clínica e o exame físico permanecem indispensáveis para guiar a propedêutica laborarorial. Na maioria das vezes a causa rorna-se aparente e é, geralmente, um processo infeccioso agudo. Aqui também a análise manual da contagem diferencial de leucóciros é desejável. lsro é necessário para definir a proporção e o ripo de formas imaturas. a presença ou ausência de desvio para a esquerda escalonado, a associação ou não com eriuoblasrose, que são situações, dependendo do quadro clínico, indicadoras de escudo medular. Nas siruações de neuuofilia reacional a um processo agudo, a fosfatase alcalina leucocitána é elevada, sendo reduzida nas doenças mieloproliferativas crôn1cas. É adequado analisar a morfologia dos neutrófilos e os achados de granulações tóxicas, vacúolos eiraplasmáticos, corpos de Dóhle e desvio para a esquerda, sugestiVOS de processos inflamatórios agudos (infecciosos, trauma, pós-operatório), exposição a determinados tóxicos e determinadas neoplasias. Nessas situações de estresse agudo há incremenro na liberação de glicocorticóide, que induz à demarginação dos neutrófilos, eosinopenia e basopenia. Por este morivo, h
VARIAÇÃO DOS EOSINÓFILOS
EOSINOFILIA A eosinofilia é defin1da por um valor de eosinófilos, no sangue penférico, acima de 05 x 109 /L. Os eosinófilos são produz1dos na medula óssea e a proliferação e diferenCiação são influenciadas por cirocininas, a principal delas é a inrerleucina-5. São células predom~namememe t1ssulares, com menor proporção de células circulantes no sangue periférico. Os eosinófilos
contêm grânulos específicos com características catiônicas responsáveis tanto pela típica coloração quanto pelas funções celulares. A associação entre eosinófilos e doenças alérgicas é conhecida há anos. Um achado freqüenre nas vias aéreas de asmáticos é um aumemo no número de eosinófilos ativados que rem cerra correlação com a gravidade da doença. Apesar dos eosinófilos estarem intimamente associados com a parogênese das doenças alérgicas, não há evidências absolutas da relação causa-efeiro. Nestas doenças, a eosinofilia geralmeme é menor que 1,5 X 109/L. Dermatite atópica também é associada à eosinofilia e parece que tais células têm papel fu ndamemal no desenvolvimento e manutenção do quadro clínico. Os eosinófilos têm sido associados a doenças inflamatórias do trato gastrintestinal como esofagite eosinofílica, gasrremerite eosinofílica e colite eosinofílica. Alguns destes casos podem estar associados à alergia a determinados alimenros. Na gastrenterite eosinofílica a associação com eosinofilia é variável. Os infiltrados pulmonares associados à eosinofilia são descritos como síndrome PIE (pulmonary injiltrate and eosinophilia) e faz parte de uma vanedade de doenças tais como síndrome do infiltrado pulmonar transitório (Lójjler), angiíte granulomatosa alérg1ca (Churg-Stauss), aspergilose broncopulmonar alérgica, vasculite de hipersensibilidade, reações a drogas, síndrome hipereosinofílica e infestações parasitárias. Eosinofilia também é encontrada associada à exposição a tóxicos. Em 1981, na Espanha, ocorreu a epidemia da síndrome do óleo tóxico. Era caracterizada por eoslnofilia, pneumonite e redução da massa e força muscular. Estudos revelaram a associação da síndrome com óleo de cozinha ilegal. Em 1989, nos Estados Unidos, ocorreu aumento na incidência da síndrome eosinofilia e mialgia associada à ingestão de L-triptofano. As sínd romes hipereosinofílicas idiopáticas (SHE) são um grupo heterogêneo de desordens, caracterizadas por elevadas contagens de eosinófilos no sangue periférico e tissular que resultam numa grande variedade de comprometimento orgânico. Em 1975, Chustd et ai. estabeleceram critérios diagnósticos, que são: • eosinofilia acima de 1.5 x 109/L por ma1s de seis meses. Geralmente alcançam valores superiores a 50.0 x 109 /L. sem células blásticas;
Investigação laboratorial do paciente com desordem leucocitária
311
• ausência de causas identificáveis para a eosinofilia
mecanismos de distribuição dos eosinófilos, acarretan-
após exaustiva avaliação (exclusão de reações de
do sua redução no sangue periférico. Exemplos dessas
hipersensibilidade, infecções parasitárias, neopla-
situações são infecções agudas, neoplasias dissem inadas,
sias, exposição a tóxicos);
trauma grave e pós-op eratório de grandes cirurgias. Au-
• lesões ou disfunções de múlt iplos órgãos, princi-
sência de eosinopenia durante um evento bacteriano
palmente coração, sistema nervoso central e pele, relacionados à eosinofilia. Estes envolvimentos são
agudo deve sugerir insuficiência supra-renal concomitante ou doença mieloproliferativa.
extremamente variáveis desde relativamente assintomático à endomiocardiofibrose fatal. Atualmente, com os avanços na bio logia m olecular
Quadro 27.6 - Classificação dos subtipos de síndro me hipereosinofílica
e imunologia, têm sido identificados subtipos distintos de SHE, com epidemiologia, patogênese e prognósticos
Variante mieloproliferativa
diferentes. São classificadas como variantes mieloprolife-
Evidências definitivas
rativas e linfoproliferativas baseadas em evidências defi-
Presença de gene d e fusão FIPlll-PDG FRa
nitivas e supor tivas (Quadro 27.6). Eosinofilia também pode ocorrer associada a neoplasias hematológicas primárias (linfóides e mielóides) e carcinoma broncogênico. A eosinofilia associada à neoplasia pode preceder o diagnóstico da malignidade.
Clonalidade eosinofílica demonstrado por citogenético ou outro método Evidências suportivas (presença de quatro ou mais das evidências a seguir) Aumento do nível sérico de triptase
Nos indivíduos portadores de AIDS, eosinofilia é com umente encontrada, provavelmente secundária a infecções parasitárias ou reações ao uso de sulfametoxazol-trimecop ri m. Além das sulfas, outras drogas
Aumento do nível sérico de vitamino B12 Esplenomegalia Anemio, trombocitopenio
est ão correlacionad as com eosinofilia tais como interleucina-2, facor estimulador de colónias granulocítico-
Aumento d o número de precurso res mielóides circulantes
macrofágico, ni t rofu rancoína, p enicilinas e tetraciclina,
Eosinófilos displósicos
entre outras. Infecções por helmintos são as causas mais comuns de eosi nofilia, moderada a acentuada. A relação entre invasão tissular por helmintos e eosinofilia é pro porcional e tem sid o reconhecida há anos. Nas infecções
Mielofib rose Aumento do número de mastóc itos no medula óssea
Variante linfoproliferativa
bem localizadas ou unicam ente intralu minal, a eosino-
Evidências definitivas
fi lia pode estar ausente. A despeito disso, o papel dos
População de células T aberrantes, definido por imunofenótipo
eosinófilos nas infecções por helmincos perman ece controverso. As infecções por protozoários, com exceção de lsospora belli e Diemamoeba fragilis, não estão
Rearran1o clonai de células T definido s por PCR Aumento do produção d e c ito cinos eosinofilopoéticos
associadas a eosinofilia.
Evidências suportivas Aumento de imunoglobulino E
EOSINOPENIA Eosinopenia isolaoa geralmente é um evento secundário a situações clínicas que cursam com aumento da
Manifestações cutâneo s p redominantes História de otopio Responsivo aos esteróides
liberação de glicocortlcóides, prostaglandinas, adrena lina e outras citocininas. Estes mediadores interferem nos
312 [ Medicina laboratorial para o clín ico )1-- - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - -
A eosinopenia primária habicualmente ocorre nos estados de falência medular e está associada a outras cicopenias.
O LABORATÓRIO NO DI AGNÓSTICO DA VA RIAÇÃO DOS EOSINÓ FILOS
Os exames laboracoriais que devem ser solicitados na avaliação das variações dos eosinófilos devem obedecer a suspeitas clínicas formuladas por meio da análise dos dados da história clínica e exame físico. Para tanto. é necessário incluir no interrogaróno a avaliação geográfica e hábicos dietéticas que permitam a avaliação do risco de exposição a helmincos. Nessas sicuações. restes para documentação de infecções parasitárias devem ser solicitados. tais como exame de fezes para pesquisa de ovos e larvas do paras1co e/ou restes sorológ1cos específicos. No entanco. determinadas infecções por helm1ntos que cursam com eosinofil1a não apresentam o parasico nas fezes. Por isco. exames de fezes negativos não excluem a helmintíase como etiologia da eosinofilia. Nas sicuações de forre suspeita clínica. a realização de biópsia de determinados tecidos (por exemplo, para diagnóstiCO de rriquinose). demonstração do parasico no sangue periférico (por exemplo. nas filarioses) e med1da de anticorpos específicos (por exemplo. para coxocaríase) podem ser adequados. Por me1o da história clínica e exame físico é possível direcionar o raciocínio para o d1agnósrico dos estados de hiperrearividade imune. doenças sisrêmicas com compromerimenw gasrrimesrinal e pulmonar. bem como a associação com exposição a determ inadas drogas. Geralmente essas situações prescindem de propedêutica laboratorial complementar para definição da eosmofilia. Nas suspeitas clímcas de síndromes hipereosinofílicas o laboratório Lem papel muiw importante e decisivo no diagnóstico. Os exames laboraconais são indispensáveis no esrabeleomento dos critérios para defin1ção dos subtipos. A avaliação complementar requer. então. hemograma aucomatizado (para avaliação de citopenias associadas). contagem manual da diferencial dos leucócicos (observação das características morfológicas como eosinófilos displásicos. granulações anómalas). dosagem de lgE sénca. dosagem de vitamina Bl2 e mptase séri-
ca. mielograma e b1ópsia de medula óssea (avaliação da celularidade. fibrose e alterações quantitativas e qualitativas dos eosmófilos na medula). Exames tecnicamente mais "sofisticados" como cariótipo convencional. biologia molecular da medula óssea e FISH (anormalidades cimgené[icas e de[ecção do gene de fusão anômalo) bem como imunofenotipagem (para detecção de popu lação clonai aberrante) são necessários nessa avaliação diagnóstica.
VARIAÇÃO DOS BASÓFILOS BASOFILIA
A basofilia é a contagem de basófilos no sangue periférico superior a 0.15 x 109/L. Crescentes evidências têm sugerido que os basófilos são componentes importantes na defesa imune contra helmintos. Eles liberam histamlna e lnterleucina-4 como resposta a infecções por helmintos e participam da resposta imune. No entanto. a basofilia ocorre raramente nas infecções parasitárias e não é um marcador útil na suspeita de paras1Lose. Há correlação entre basofilia e uma variedade de doenças alérgicas. principalmente rinire alérgica. polipose nasal, asma. dermatite arópica e alergia a derermmadas drogas. A assooação com doenças hemacológicas é bem descma e. de forma geral. está relaoonada a prognóstiCO desfavorável. Basofilia pode ser encontrada nas leucemias transitórias associadas à síndrome de Down. na leucemia megacarioblásrica. nas leucemias agudas com rranslocações cromossômicas específicas. nas doenças mieloproliferativas crôn1cas e na mascociwse sisrêmica. Na leucemia mielóide crónica a basofilia absoluta é invariavelmente presente e pode preceder as manifestações clínicas.
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓST ICO DA VARIAÇÃO DOS BASÓFILOS
A precisão da conragem automática dos leucócicos é maior que a manual. No encanto. o aumemo da porcenragem de basófilos detectado nos contadores aucomáricos muico freqüentemente está relacionado com pseudobasofiha e não sign1flca uma verdade1ra basofilia. É necessário confirmar as contagens elevadas pelo método
lnves[igação labo rawrial do pacience com desord em leucoci[ária
313
manual. Este é o passo laboracorial primordial na avaliação da basofilia. Como a basofilia geralmente faz parte de um quadro clínico e laboratorial associado a outras anormalidades, o restante da investigação será direcionado pelas hipóteses clínicas.
VARIAÇÃO DOS MONÓCITOS E MACRÓFAGOS Os monócitos, macrófagos e suas células precursoras são os componentes do sistema mononuclear fagocitário. Este sistema é essencial para a vida e cumpre importantes e versáteis funções, tais como remoção de células mortas, senescentes e estranhas; regulação da função de outras células imunes e hematopoéticas por meio da síntese de citocininas; processamento e ap resentação de antígenos nas reações imunes; fagocitose de microrganismos e células neoplásicas; remodelamento ósseo, entre outras.
A monocitose é conceituada como a contagem absoluta de monócitos no sangue periférico superior a 0,8 x l 09 /Lem crianças e a 0,5 x 109/L nos adultos. O sistema mononuclear fagocitário participa de todas as reações inflamatórias granulomatosas e é por este motivo que a monocitose é freqüente nos pacientes com doenças infecciosas granulomatosas (tuberculose, sífilis, infecções fúngicas, brucelose, endocardite bacteriana subaguda, entre outras), doença intestinal inflamatória e sarcoidose. Determinadas doenças neoplásicas podem cursar com monocitose discreta como linfoma de Hodgkin e adenocarcinomas. Nas leucemias mielomonocíticas crónicas a monocitose excede a 1,0 x 109/L e é persistente. O Quadro 27.7 reúne as causas mais freqüentes de monocitose.
ANORMALIDADE FUNCIONAL MONOCÍTICO MACROFÁGICA
O sistema fagocitário mononuclear é um dos componentes do sistema de defesa do hospedeiro. Defeitos fagocitários pri mários precisam ser incluídos no diagnóstico diferencial das febres e infecções recorrentes nas crianças e, ocasionalmente, nos adultos. O diagnóstico precoce é essencial porque as manifestações infecciosas
podem ser sueis e a intervenção terapêutica reduz a taxa de morbimortalidade. O defeito do sistema mononuclear fagocitário pode Quadro 27.7 - Causas de monocitose Infecções bacterianas tuberculose, endocard ite bacteria na subag udo, micobacterioses, sífilis, brucelose Fase d e recuperação d e infecções ag udas e ag ronulocitose lnfeccções por pro tozoários ma lá ria , tripanossomíase, Ca lazar Neoplosio s ma ma , estô mago e ovário Doenças auto-imune artrite reumatóide, lúpus eritemotoso sistêmico Doenças granulomatosa s sarcoidose, retocolite ulcerativo, enterite regio nal, do ença de Chron, pa racoccid ioidomicose Terapia crônica com doses elevadas de esteróides
ser devido ao comprometimento da função dos macrófagos ou da função esplênica. No comprometimento da função macrofágica são descritas doenças que apresentam defeitos no eixo interferon-interleucina-12 e cursam com aumento de incidência de infecções disseminadas por microrganismos intracelulares (micobactérias, principalmente) manifestadas desde a infância. Não ocorre a formação de granulomas. Têm herança genética variável e podem ser autossômicas dominante ou recessiva. Em relação ao comprometimento da função esplênica, esta pode ocorrer pela ausência congênita do baço, após esplenectomia ou por hipofunção (hemoglobinopatias, oclusão vascular). Há, então, perda ou redução da função dos macrófagos esplênicos, com conseqüente aumento da susceptibilidade a infecções por bactérias capsuladas.
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DA VARIAÇÃO DOS MONÓCITOS E MACRÓFAGOS
A rotina laboratorial na investigação da monocitose é orientada pela história clínica e exame físico que formularão as suspeitas diagnósticas. É importante buscar evi-
314 ( Medicina laboratorial para o clínico )f---- - -- - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - --
dências clínicas das principais causas de monociwse, ou seja, doenças infecciosas e não infecciosas granulomawsas, doenças mieloproliferativas e ourras neoplasias. A análise do hemograma para determinação da contagem global de leucócitos, da associação com outras ciwpenias, desvio para a esquerda e presença de células imaturas associados à inpressão clínica são fundamentais para orientar a necessidade ou não de futu ra propedêutica específica, como estudo de medula óssea. A análise do mtelograma, cariótipo de medula óssea e estudo molecular estarão indicados nas suspeitas clínicas de doenças mieloproliferativas (agudas ou crônicas), mas não devem ser empregadas rotineiramente nas suspeitas de doenças granulomarosas. Na suspeita clínica de anormalidades funcionais do sistema monocírico macrofágico. é importante a determinação do defeitO genético. A análise do esfregaço do sangue periférico é útil na detecção de corpos de Howe/1jo//y, corpos de Pappenheimer. células em alvo que são indicadores de hipoesplenia e asplenia.
O Quadro 27.8 apresenta as principais causas de linfocitose.
LI NFOPENIA A linfopenia é considerada a contagem de linfóc itos no sangue periférico inferior a 1.5 x 109/L. A população de linfócitos é heterogênea e é constituída por células com diferentes ongens, meia-vida. localização e fu nção. Habitualmente, cerca de 20% dos linfócitOs periféricos têm o imunofenótipo B e 70% têm o imunofenótipo T.
Quad ro 27.8 -Causas de linfocicose Infecções agudas Coqueluche Mononucleose infeccioso pelo EBV HepOii es virais Linfocitose infeccioso agudo
VARIAÇÃO DOS LINFÓCITOS Infecções crônicas
LINFOCITOSE
Brucelose Tuberculose
A linfocirose é definida como a contagem absoluta no sangue periférico ao ma de 5.0 x 109/L. As crianças têm maior proporção de linfócitos que os adulros. A causa mais comum de linfociwse é infecção virótica. Quatsquer tnfecções viróticas podem cursar com linfocicose. Geralmente. valores superiores a 15,0 x 109/Lsão encontrados na mononucleose infecciosa, enquanto que valores moderados. abaixo de 15.0 x 109/L, são usuais nas outras viroses. tais como sarampo, varicela. hepame. adenovirose. caxumba, ciromegalovirose. entre outras. Raramente as infecções bacterianas causam linfocitose. A coqueluche é uma dessas exceções. Usualmente, a contagem leucocitária global varia de 15,0 x 109 /L a 30,0 x 109/L. sendo 80% pequenos linfóci ros. Outras doenças infecciosas eventualmente podem evoluir com linfocitose moderada. Atualmente, o diagnóstico de leucemia linfóide crênica é feiro com contagem de linfócitOs acima de 5,0 x 109/L, assooada ao imunofenótipo característico.
Sífi11s secundário Sífilis congênilo Desordens hemato p oéticas l eucemia linfóide crônico Tricoleucemio Alguns linlomos Doença de cadeia pesado Linfocitose relativa Coxumoo Rubéola Tireolox,cose Fase de convalescença de infecção agudo Mo1orio dos situações associados o neuhopenio
Investigação laboratorial do paciente com desordem leucocitária
315
Tamo a redução na produção quamo o aumento na destruição ou alterações no tráfego dos linfóciros podem ser responsáveis pela linfopenia (Quadro 27.9). Essas anormalidades podem ser adquiridas ou congênitas. A causa mais freqüenre de red ução na produção de linfócitos é a desnutrição protéico-calórica. Desnucrição grave causa at rofia de todos tecidos linfóides. sendo a imunidade celular mais comprometida que a humoral. Agentes imunossupressores. bem como radiação ionizante, podem lesar as cél ulas progenitoras e comprometer a replicação e diferenciação dos linfóciws. culminando com linfopenia. Algumas infecções viróticas podem evoluir com linfopenia secundária à infecção das células linfóides (sarampo, pólio, varicela, AIDS). Nas síndromes de imunodeficiência primária, a resposta imune está comprometida por alterações complexas e heterogêneas nos mecanismos regulatórios imunes. O tráfego dos linfócitos está comprometido nas siruações de resposta endócrina-metabólica ao esuess agudo (trauma. cirurgias, infecções. hemorragias). Ocorre redistribuição dos linfócitos no sangue periférico devido a elevados níveis de gltcocorticóide endógeno. O uso de glicocorticóide exógeno é, também, causa de linfopenia. A presença de anricorpos antilinfócitos associada a doenças auto-imunes e/ou infecções viróticas é responsável pelo aumento da destruição de linfócitos As lesões da solução de continu dade de estruturas que compõem os órgãos linfóides, tais como lesão do ducro wrácico e enteropatia perdedora de proteínas. são responsáveis pelo aumento da perda de linfócitos, determinando linfopenia.
mononucleose infecciosa pelo EBV, cicomegalovirose e infecção por HIV.
Quadro 27.9 - Causas de linfopen ia
Anormalidades na produção de linfócitos Desnutrição p roléico-colórico lmunossupressão lmunodeficiência congênito ou o dquirda Infecções virais linfomo de Hodgkin
Doença gronuloma toso sistêmico Q uimioterapia citostálica Radiação Reo çã o d "ossincrósica o drogas
Alterações no tráfico de linfócitos Cirurgia Trauma Hemorra g1o Infecções agud os - bacterianos. fúngicos e vira is Aumento d e glicocorticóides Doença gronulomatoso sistêmico Li nfoma de Hodgkln
Destruição ou perda de linfócitos
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS DOS LINFÓCITOS
lnlecçõ o virai Destruição mediada por anticorpos
A linfocitose atípica é tida como uma linfocitose absoluta com mais de SO% de linfócitos. sendo que 10% ou mais têm morfologia atípica. Essas células atípicas variam no tamanho e forma. têm um núcleo que pode ser oval. reniforme ou lobulado e o citoplasma geralmente é abundante, vacuolizado e não é granulado. Por meio da imunofenotipagem, essas células foram identificadas como linfócitos T-CD8 positivo. Este quadro é inespecífico e encontrado em várias infecções viróticas. como
316 ( Medicina laboratorial para o clínico
Enteropa tia perdedora de p ro teínas Insuficiência ventricular direito crãnico Ruptura de aucta torácico Circulação extrocorpóreo Doença do enxerto contra hospedeiro
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DA VARIAÇÃO DOS LINFÓCITOS
da série vermelha (eritroblastos) e/ou células muito imaturas da séri e branca (reação leucoemroblástica). Exceto nas si tuações de recuperação de anem ia
Os exames laboracoriais devem ser solicitados baseados na suspeit a clínica.
É essencial a avaliação microscópica da comagem d1ferencial de leucócicos para análise adequada da mor-
hemo lític a aguda grave. infecções agudas graves e múltiplas fraturas, a reação leucoeri uoblásrica su-
gere com promecimemo, primário ou secundário. da medula óssea.
fologia dos linfócicos, com atenção para os linfócicos
Um dos aspeccos imporrames da detecção de rea-
acípicos e formas anormais, como as enconuadas nas
ção leucemó1de é o diagnóstico diferencial com leuce-
leucemias de células pilosas. linfomas T cutâneos e ou-
mia mielóide crônica (Quadro 27.10).
eras desordens linfoproliferanvas. A propedêut ica laboracorial deve seguir o raciocínio clínico, feico por meio da anamnese e exame físico, para definir a necessidade de exames sorológicos confirma-
Quadro 27.10 - Diagnóstico d iferencial entre reação leucemó1de e leucemia m 1elóide crônica
cónos de infecções virócicas; investigação específica de
Reação
Leucemia mielóid e
leucemóide
crônica
cornurnente presente
inlreqüente
Esplenomegalia
ausente
p resente
Hepatornegal o
ouserte
prese~·e
Infiltração local
ausente
pod e estar presente
Reoção •eucoeritroblóstico
cornumente presente
presente
Desvio "1a'urot"vo grorulocit•co
escalonado
não escalonado
Célula blóstica
ausente
oresente
da microscopia. é fundamemal para determinar o com-
Bosofilio
ausente
comumente presente
ponence celular responsável pelo aumemo dos glóbulos
Fosfatase alcalina
aumentado
ausente ou dim1nuído
brancos. bem como para guiar a investigação laboraco -
de neutrófilos
rial necessária para o diagnóstico.
AnomaJ,os c tológ,co s
ausentes
presentes
ousenle
p1esente
ti9,22l
ausente
presente
Gene de fusão bcr/ obl
ausente
presente
Caracter ísticas
determinadas infecções (wberculose, sífilis e febre t ifóide, emre ouuas); imunofenmipagem do sangue periféri-
Clínicas
co para definição das proporções das subpopulações de linfócicos (como na AIOS) e/ou presença de linfocicose clonai (doenças linfoproliferacivas). A necess1dade de testes ad1oonais, como mielogra-
ma, biópsia de medula óssea. cariót ipo. escudo molecular bem como mécodos de imagem só devem ser reali zados se, na avaliação do diagnóstico diferencial clínico, forem julgados impresondíveis.
Febre e outro s rnonifesloções de processo ·n· ;larnotório I nieccioso agud o ou suboguao
Sangue periférico
REAÇÃO LEUCEMÓI DE A leucocicose é o aumemo no número de leucócicos globais aoma de 11,0 x 109/ L e é uma siwação comum na prática m édica. A análise m orfológica, a partir
Reação leucemóide é a leucocitose acima de
25,0 a 30,0 x 10 9 /L por alguns autores e de 50,0 x 10 9/L por o utros. G era lmenre. é reacional a liberação de várias ci tocininas nas situações de infla mação aguda e subaguda, tais como infecções. cirurgias, traumas. intoxicações e determ inadas neoplasi as. Caracteriza-se por leucocitose neutrófila com desvio
à esquerda escalonado. Os pacienres
Medula óssea Fibrose Alterações moleculares
não têm doença medular primária e, h abitualmente, não h á. no sangue periférico, células nucleadas
Investigação laboratorial d o paciente com d esordem leucocitária
317
CONSIDERAÇÕES FINAIS O papel do laboratório na avaliação do paciente com variações nas contagens dos leucócims é complementar às informações clínicas obtidas por meio da anamnese e exame físico. Os exames laborawriais inicialmente necessários são simples, acessíveis, sem dificuldades técnicas e permirem ou a defin ição diagnósrica ou determinam a necessidade de propedêutica mais complexa num número resrrim de pacientes. Arualmente, os métodos automáticos para obtenção da contagem diferencial de leucócitos reduzem o rempo e o custo dos exames, com aumento da acurácia. No entanto, a análise automática é incapaz de identificar e classificar rodos os :ipos celulares e é insensível para
318 ( Medicina laboratorial para o clínico
detecção de células anormais e imaruras. Esta etapa é fundamental e muito importante na avaliação laboratorial das desordens leucocirárias, porque as informações obtidas confirmam a existência da alteração e governam, associada à clínica, a futura propedêutica. REFERÊNCIAS 1. Mitre E. Nutman TB. Basophis. basophilia and helminth infections. Chen lmmunol Allergy. 2006;90:141-56 Rodak BF. Hemawlogy: Clinical principies and applicarions. 2nd ed. Pennsylvania: Elsevier Science; 2002. 3. Sh1bata K, Watanabe M, Yano H, Funa1 N, Sano M. lmportance of basophilia 1n haematopo1enc d1sorders. Haematologia. 1998;29(3):241-53. 4. Swck W, Hoffman R. White blood cells 1: non-mal1gnanr disorders. Lancet. 2000;355:1351-57. 2.
]1-- - - - - - - - - - -- - - - - - - -- - -- - - -- -- -
Evandro Maranhão Fagundes
28
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM MIELODISPLASIA
As síndromes mielodisplásicas (SMD) são doenças caracterizadas por alterações genéticas adquiridas nas células-tronco hemaropoéticas que provocam insuficiência da medula óssea ou morte premawra das células (hemawpoese ineficaz). O resultado é o surgimento de citopenias com pmencial importante de morbimortalidade e elevado risco de transformação para leucemia aguda, usualmente do tipo mielóide. A doença pode
281). É importante para o diagnóstico a existência de displasias em pelo menos duas linhagens celulares. São consideradas displasias: erirropoese megaloblastóide, maturação celular assincrônica do núcleo e citoplasma nas linhagens eritrocítica ou granulocítica e alterações morfológicas na linhagem megacariocítica. Quadro 28.1 - Classificação FAB para mielod1splasias
surgir de novo ou pode seguir-se à exposição a agentes mutagênicos, como quimioterápicos e radioterapia para tratamento de neoplasias.
Tipo Anemio refrolória (AR)
As síndromes mielodisplásicas acometem tipicamente o paciente idoso. A idade mediana no momento do diagnóstico é de aproximadamente 69 anos e a incidência pode atingir até 30 casos em cada 100.000 pessoas com idade igual ou maior que 70 anos. Os mecan ismos envolvidos na etiopatogenia são o aumento de apoprose e a elevação da produção de ciroquinas inibitórias da hematopoese, como o fawr de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) decorrente do aumento da angiogênese (neoformação vascular). No processo de
Características Medula óssea com < 5% de bloslos
Anemio refrotório com Medula ósseo com < 5% de sideroblaslos em anel (ARSA) blaslas e ::2: 15% de sidero· blaslos em anel Leucemia mielomonocílico crõnica (LMMC)
~ 20%de blaslos na medula óssea e > 1.000 monócilos/ mm3 no songue periférico
Anem1a refralária com excesso de bloslos (ARES)
5% a 20%de bloslos na medula óssea
Anemia refralório com excesso de bloslos em lransformação (AREB·T)
21% o 30% de bloslos no medula óssea
evolução da doença para leucemia aguda, ocorre diminuição de apoprose e expansão do clone anormal.
ClASSIFICAÇÃO DAS MIElODISPlASIAS
A classificação FAB não considera outras ciropenias isoladas como diagnóstico de mielodisplasia, nem con-
A classificação Franco-Ameri cana-Bri tânica (FAB), de 1982, reconhece cinco tipos de mielodisplasias (Quadro
sidera as alterações cromossômicas ou moleculares que são de conhecimento mais recente. Para a FAB, o paciente que apresentar ~ 30% de mieloblasws na medu-
la óssea cem o diagnóstico de leucemia mielóide aguda (LMA). A Organização Mundial de Saúde (OMS) elaborou uma nova classificação em 2001. que acrescenta novas siwações hemacológicas e aspectos genéticos. Essa classificação fornece informações prognósticas e auxilia na decisão cerapêucica (Quadro 28.2). É imporrame o reconhecimento, pela OMS, da possibilidade de mielodisplasia mesmo quando existe displasia em apenas uma linhagem celular, quando não ocorre anemia, mas se verifica outra citopenia; e da dificu ldade de diferenciar entre síndromes mieloproliferativas e mielodisplasias. A classificação define LMA como neoplasia com ; : : 20% de mieloblastos na medula óssea. Essa questão tem importante implicação terapêutica. Quadro 28.2 - Classificação OMS para mielodisplasias Tipos
acúmulo de ferro. Ocorre cambém aumenco na incidência de infecções devido à neutropenia ou anormalidade funcional dos neutrófilos. Algum grau de neutropenia pode estar presente em até 60% dos casos. A plaquetopenia e anormalidade funcional das plaquetas são responsáveis por hemorragias que podem ocorrer em cerca de 40% dos pacientes. Como esses achados não são específicos de SMD, a avaliação de um paciente com essa suspeita diagnóstica deve excluir outros distúrbios que possam provocar tais sinais e sintomas. Assim, a história clínica deve investigar: exposição prévia a agentes quimiorerápicos ou irradiação; história familiar de SMD ou LMA; relatos de infecções recorrentes e/ou hemorragias; e história de alcoolismo ou consumo/exposição a drogas. No exame físico deve-se procurar hepatomegalia e esplenomegalia, além de palidez.
Características
Anemio refrotó rio com displo· sio em uma único linhagem
Necessário observação por seis meses e exclusão de outros doença s
Anemio refrotório com síndrome 5q·
<5% d e blostos, micromego· coriócitos no medula ó sseo e trombocitose no sangue periférico
Citopenio refro tório corr dis· plosio em múltiplos linhagens
Requer displosio em mais de umo linhagem celular
Anemio refrotório com sideroblostos em anel
Displosio em pelo menos uma linhagem. ~ 15% d e sideroblo stos em anel
Citopenio refrotório com displosio em múltip lo linhagem e sideroblostos em anel
s
Anemio refrotó rio com excesso de blo tos I
> I 0% d e blostos
A nemio refrotório com excesso d e blostos 11
Mielodisplosio: leucócitos
Síndrome mielodisplósic::J/ mieloprolifero tivo
M ieloprolifero tivo: leucócitos> 13.000/mm3
ABORDAGEM lABORATORIAl A SMD caracteriza-se por alterações displásicas nas células do sangue. Essas alterações são observadas à hematoscopia do sangue periférico e à análise do esfregaço de medula óssea no mielograma.
HEMOGRAMA
10% de blostos
s l3.000/mm3
Formo nã o classificad o
MANIFESTAÇÕES ClÍNICAS
Os principais sinais e sintomas do paciente com mielodisplasia estão associados à anemia, o que é observado em até 80%dos casos. Os pacientes freqüentemente são dependentes de transfusão de hemácias e apresentam
320 ( Medicina laboratorial para o clínico
A anemia usualmente é normocítica e normocrômica, mas pode ser macrocítica e, no caso da anemia refratária com sideroblastos em anel, pode ser microcítica. É comum a presença simultânea de hemácias macro e microcíticas. Os macrovalócitos são as anormalidades eritrocitárias mais bem reconhecidas na mielodisplasia. Outro indicativo de displasia de linhagem eritrocítica é a existência de hemácias em lágrimas, eritroblastos, ponteado basófilo e corpos de Howeii-Jolly. A anemia geralmente está associada à baixa contagem de reticulócitos. Na linhagem granulocítica, observa-se neutropenia, mielócitos e metamielócicos circulantes. Os neutrófilos podem apresentar hi pogranulação no citoplasma ou eventualmente grânulos grosseiros. A segmentação do núcleo é freqüentemente reduzida e essa anormalidade é conhecida como pseudoPelger-Huet. Células imaturas (blastos) podem ser vistas no sangue periférico. Basto-
netes de Auer no citoplasma de células imaturas, ocorrênCia mais comum na LMA. é indicativa de AREB-T. O aumento de monócitos é comum e pode ocorrer em outras formas de SMD, além da LMMC. Nesta última, porém, a monocitose > 1.000/mm3 no sangue periférico é um pré-requisito para o diagnóstico. Na linhagem plaquetána, as alterações quantitativas são freqüentes. A rrombocitopenia ocorre com gravidade variável e a rrombocicose é menos comum e geralmente está associada a uma síndrome específica caractenzada pela deleção do braço longo do cromossoma 5, a chamada síndrome do 5q-. As alterações morfológicas apresentam plaquetas gigantes e formas hipogranulares.
A biópsia de medula óssea complementa as lnformações obtidas pelo mielograma e fornece outras. Trata-se do exame mais adequado para avaliar a celularidade e para verificar a localização dos elementos imaturos, fibrose, agregados e infiltração de linfócitos. Os
precursores hemaropoéricos mielóides normalmente se localizam nas áreas paratrabeculares da medula óssea. Nas SMDs podem estar localizados nas áreas centrais da medula, o que é conhecido como loca lização anormal dos precursores imaturos (ALI P). Os ALIPs podem ser encontrados em qualquer tipo de SMD, porém são mais freqüemes nos casos mais avançados e com risco mais alto de transformação leucêmica.
MIELOGRAMA E BIÓ PSIA DE MEDULA ÓSSEA
IMUNO FENOTIPAGEM
Na avaliação do IT'ielograma. deve-se contar no mínimo 200 células e 20 megacarióciotos para que os aspectos displásicos possam ser observados. As alterações verificadas no esfregaço de medula óssea incluem hiperplasia da linhagem eritrocítica, que se apresenta com aspectos megaloblastóides, projeções citoplasmáticas. pontes imercitoplasmáticas, vacúolos no citoplasma, multinucleação e destruição prematura do núcleo (cariorrexe). A coloração de azul da prússia permite pesquisar a existência de grânulos de ferro no moplasma do eritoblasto. A célula que contém mais de c1nco grânulos é considerada um sideroblasto anormal. Quando os grânulos de ferro estão dispostos em volta do núcleo e ocupam mais de um terço do espaço pennuclear, o sideroblasto é chamado de sideroblasto em anel. Na linhagem granulocítica, além das alterações descritas no sangue periférico, pode-se observar aumento do número de blastos, assincronismo de maturação encre o núcleo e o citoplasma e formas com aspecto monocitóide. Os bastonetes de Auer são mais faolmence visualizados no esfregaço de medula óssea do que no sangue periférico. Porém, as anormalidades que mais auxiliam no diagnóstico de SMD estão na linhagem megacariocítica. Estas incluem micromegacanóotos, de agrupamentos (c/usters) de megacariócitos, hipolobulação incluindo formas mononucleares, formas multinucleadas com dispersão dos núcleos no citoplasma e hipogranulação. As formas hipolobuladas ou mononucleadas são comuns na síndrome 5q-.
A imunofenotipagem por citomeuia de fluxo pode auxiliar na distinção entre blastos de origem m1elóide e blastos de origem linfóide. Porém, isto é raramente necessário em SMD. A aplicação mais importante talvez seja em casos nos quais o diagnóstico não ficou bem definido pelo mielograma, biópsia de medula óssea e/ ou citogenética. A imunofenoripagem pode ser importante na detecção de células monocíticas, uma vez que estas podem eventualmente ser confundidas com células granulocíticas, na avaliação do número de blascos pela análise da expressão do imunofenónpo CD34 e na avaliação de apoptose.
Investigação laboratorial do paciente com mielodisplasia
CITOGENÉTICA CLÁSSICA As anormalidades cromossômicas clonais ocorrem em até 50% dos casos de SMD primária e em até 80% dos que são secundários à exposição a drogas e irradiação. As anormalidades cromossômicas podem ser detectadas pela técnica de citogenética de banda G. Algumas alterações estão associadas a síndromes específ1cas, como é o caso da síndrome 5q-, que se caracteriza por anemia macrocítica, contagem de plaquetas normal ou elevada e megacariócitos anormais. Os pacientes com essa síndrome apresentam bom prognóstiCO e tendem a ter boa resposta terapêutica com talidomida. Outras alterações cromossômicas ocorrem na SMD e incluem translocações, deleções, inversões e inserções nos cromossomas.
321
Alterações numéricas como monossomias e trissomias também podem ocorrer. A cirogenética é importante na definição do prognóstico do paciente (ver prognóstico).
ESTUDO MOLECULAR Não é surpresa que inúmeros genes tenham sido associados à SMD. Estudos de biologia molecular utili7ando técnica de reação de polimerase em cadeia (PCR) identificaram mutações do RAS, NF1, FMS e fusão do TEL-PDGFB, enue ouuas alterações. No entanto, diferentemente das leucemias agudas, em que a biologia molecular tem sido empregada para identificar grupos com prognósticos bem definidos e estabelecer terapêutica, na SMD a biologia molecular ainda não alcançou sua aplicabilidade na prática clínica.
DIAGNÓSTICO E DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
O diagnóstico de SMD baseia-se na história clínica, exame físico, avaliação do hemograma, do aspirado e biópsia de medula óssea, além da citogenética. No entanto, as alterações não são específicas e um protocolo de exclusão de doenças hematológicas e não hematológicas deve ser estabelecido. Portanto, além desses exames, fazem-se
necessárias dosagens das vitaminas B12 e ácido fál ico, dosagem de ferritina sérica, dosagem dos hormônios tireoidianos e TSH, exames de avaliação das funções hepática e renal, pesquisa de doenças auto-imunes, pesquisa de hemoglobinúria paroxística noturna e sorologias para hepatites virais, HIV, roxoplasmose e cicomegalovírus.
IMPORTÂNCIA DO LABORATÓRIO NO ESTUDO PROGNÓSTICO
Os pacientes com AREB e AREB-T apresentam, de modo geral. expectativa de vida de cinco a 12 meses, enquanco aq ueles com AR e ARSA podem viver por três a seis anos. A proporção de u ansformação para LMA é de aproximadamente 50% nos casos de AREB e AREB-T e de menos de 15% nos casos de AR e ARSA. Em 1997, foi desenvolvido um sistema de escore para auxiliar no prognóstico de pacientes com SMD. Esse sistema, que é conhecido como lnternational Prognostic Score System (IPSS), determina quatro categorias de risco de acordo com as ciropenias, porcentagem de blastos na medula óssea e alterações cromossômicas (Tabela 28.1). Como a idade do paciente é também um faror prognóstico importante, o IPSS foi ajustado para a idade. A Tabela 28.2 demonstra as probabilidades de sobrevida e transformação para LMA aj ustadas pela idade, de acordo com a categoria do IPSS.
Tabela 28.1 - Sim'ma Internacional de Escore Prognóstico (IP55) para mielodisplasias Variável de Prognóstico
Valor do Escore
o % blostos no medula ósseo
0,5
5- 10
Cariótipo *
Bom
Intermediário
Citopenios
0-1
2-3
1,5
2,0
11 - 20
21 -30
1,0
Ruim
Categoria de Risco
Soma dos Escores
Bo1xo
o
Intermediário 1
0,5 - 1,0
Intermediá rio 2
1,0- 2,0
Alto
;;::20
*Canónpo- bom: normal, alteração do Y, dei(Sq), dei (20q); rUim: presença de~ 3 anormalidades ou anormalidades do cromossomo 7; 1ntermed1áno: rodas as outras anormalidades
322 (
Medicina laboratorial para o clínico )1-------- - - - - - - - - -- - - - -- - - - - - -- -
Tabela 28.2 - Sobrevida e sobrevtda sem u ansformaçào para LMA de pacientes com mielodisplasias, de acordo com o IPSS aJUStado para a idade Sobrevida mediana em anos
Idade
Baixo risco
Intermediário 1
lntermedióro 2
Alto risco
5 60 anos
11.8
5.2
1.8
0.3
> 60 anos
4,8
2,7
1,1
0,5
Sobrevida mediana em anos para tranformação em LMA em 25% dos pacientes s:; 60 onos
> 60 anos
9,4
CONSIDERAÇÕES FINAIS As SM Ds são um conjunto
6,7
0,7
0,2
2, 7
1,3
0.2
REFERÊNCIAS
de doenças das cél ulas
l
precursoras hemacopoéticas que apresentam morbimorralidade elevada e risco signi ficativo de transformação leucêm tca. Seu diagróstico baseia-se num conjunto
2.
de achados clínicos e laboraroriais. Apesar da sofisticação crescente dos exames complementares, propedêuti-
3.
cos, a propedêutica mais importante para diagnóstico e avaliação
de prognóstico na SMD é artesanal e consiste
no exame cuidadoso dos esfregaços de sangue periférico
<í.
e medu la óssea, da avaliação da biópsia de medula óssea e a detecção de anormalidades citagenéticas pela banda G. A im unofenotipagem e o escudo de biologia molecular podem ser ut ilizados em situações especiais.
5.
6.
Investigação laboratorial do paciente com mielodisplasia
Bowen D, Culligan D, Jowirr S. Kelsey S. Muftt G. Oscier D. et ai. Guideltnes for diagnosts and therapy of adult myelodysplastic syndrome. Br J Haemarol. 2003;120(2):187200. Greenberg PL. Baer M R, Bennerr JM. NCCN Pracuce Gutdelines for myelodysplas(lc syndrome. verston 3.2006. ln: Complete ltbra ry of NCCN Guideltnes [CD-ROM]. Greenberg PL. Young NS. Gattermann N. Myelodysplastic syndromes. Hematology Am Soe Hematol Educ Program. 2002:136-61. List AF. Sandberg AA. Doi\ DC. Myelodysplas(lc syndromes. ln: Greer JP. Foersrer J. Lukens JN. Rodgers GM. Paraskevas F. Glader B. Winrrobe's Clinical Hemarology. ll [h ed. Ph tladelphia: Ltpptncott Wtlltams & Wilktns; 200<í. p. 2207-3<í. Lorand-Merze I. Contributçao da citomen ia de fluxo para o diagnóStiCO e prognÓS(ICO das síndromes mielodisplástcas. Rev Bras Hematol Hemoter. 2006;28:1 78-81 Magalhães SMM, Lorand-Metze I. Síndromes mtelodtsplástcas: protocolo de exclusão. Rev Bras Hematol Hemoter. 200<í;26:263-7.
323
Sandra Guerra Xavier Cybele de Andrade Paes Teresa Bunte de Carvalho
29 N
INVESTIGAÇAO LABORATORIAL DO PACIENTE COM LEUCEMIA AGUDA
O termo leucemia aguda refere-se a um conjunto heterogêneo de doenças caracterizadas por acúmulo clonai de células hemaropoéticas imaturas na medula óssea, que diferem em relação à patogênese. às anormalidades genéticas. às características clínicas e à resposta terapêutica. Na medula óssea normal ocorre a hematapoese, processo que envolve a produção contínua dos vários tipos de células sangüíneas maduras a partir de precursores imaturos. bem como a regulação balanceada da sua diferenciação. proliferação e apoptase. A transformação leucêmica tem início quando uma dessas células precursoras acumula alterações que lhe conferem vantagem proliferativa ou de sobrevivência sobre as demais. As leucemias agudas são subd ivididas em leucemia linfóide aguda (LLA). que tem sua origem em progenirores linfóides, e leucemia mielóide aguda (LMA), por sua vez originada em precursores mielóides. No Brasil. assim como em vários países desenvolvidos, não se conhece o número real de casos novos de câncer diagnosticados a cada ano pelos serviços de saúde, em função da ausência de um sistema de registro que cubra codo o território nacional. o que faz com que as estimativas an uais de incidência continuem sendo de grande valia. Dados do InstitutO Nacional de Câncer (INCa) estimaram, no ano de 2006. 234.570 casos novos para o sexo masculino e 237.480 para sexo feminino. Uma vez que o percentual dos tumores infantis observados nos
Registras de Câncer de Base Populacional brasileiros variou entre 1 e 4%. depreende-se que os tumores infantis deverão corresponder a valores compreendidos aproximadamente entre 4.700 e 19.000 casos novos.
CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS AGUDAS
O objetivo de qualquer sistema de classificação das leucemias é identificar entidades biológicas distintas por etiologia, mecanismos de leucemogênese. características clínico-patOlógicas e prognóstico, visando a traçar estratégias terapêuticas mais adequadas a cada uma delas. A cicologia e a cicoquímica são fundamentais no diagnóstico e na classificação das leucemias agudas. A avaliação inicial visa à distinção entre leucemia aguda e outro processo neoplásico ou reativo, à diferenciação entre as LMA e LLA. bem como à sua subclassificação. Nos anos 70, um grupo de hematopatologistas na França. Estados Unidos e Inglaterra propôs um sistema de classificação que ficou conhecido como FAB (francoamericano-britânico) e que incluía não só a morfologia. como também características cicoquímicas, definindo assim os subtipos FAB M1 a M6 para as LMAs e L1 a L3 para as LLAs. Alguns anos depois. foram definidos os subtipos MO e M7, graças à inclusão de critérios imunofenotípicos para melhor caracterização dos casos de LMA minimamente diferenciada e megacarioblástica. respectivamente (Tabelas 29.2).
Tabela 29.1 - Estimativa para o ano de 2006 das taxas brmas de incidência por 100.000 e de número de casos novos de leucemia (aguda e crônica) segundo o sexo Brasil consolidado
Minas Gerais
Belo Horizonte
Homens
Mulheres
Homens
M ulheres
Homens
M ulheres
Casos
5330
4220
540
430
90
80
Taxa bruta
5,82
4,45
5,56
4 .35
8,00
6,21
Fonte: INCa (lnsmulO Nac1onal de Câncer- R1o de Janeiro)
Tabela 29.2 -Classificação FAB das LMAs
e a caracterização de alterações genético-moleculares MO
lMA com diferenciação mínimo
MPO+ por método imunológico ou ultro·estrulurol CD34 + ou CD13+ ou CD33+ ou C D11b+
Ml
lMA sem maturação
MPO+ em mais de 3% dos blostos Blostos: mais de 90% das células nucleodos do MO
M2
lMA com moluroção
Blostos: >30% e <90% dos células nucleodos do MO Componente monocítico <20%
M3
leucemia promielocítico agudo
Predomínio de promielócílos anormais
M4
leucemia mie'omonocítica agudo
Bloslos: >30% e <90% dos células Componenre monocítico >20% e <80% dos células não erilróides e/ ou > 5.000 monócitos/m m3 no SP
M5
l eucemia mono· cítico agudo
Componente monocítico >80% dos células não eritróides
Mó
leucemia eritróide agudo
Eritroblostos >50% dos células nucle· odos do MO Blostos: >30% dos células não elitróides
M7
leucemia mego· riocítico agudo
Megocorioblostos >30% dos células nucleodos do MO lpor método imunológico ou ultro-estruturoll
FAB: Class1f1caçâo franco -americano·bmânica: LMA: leucemia mieló1de aguda; MPO: mieloperox1dase: CD: clusrer d1fferem1anon; MO: medula óssea; SP: sangue penférico
A classificação FAB ainda é o sistema que permite uma categorização uniforme das leucemias mielóides agudas, considerando-se a morfologia e a citoquímica, métodos acessíveis à maioria dos centros médicos. Já as leucemias linfóides agudas são dependentes da imunofenoripagem para sua categorização. Nas últimas décadas, métodos diagnósticos mais refinados (imunológicos, cirogenéticos e moleculares) permitiram determinar a origem e a linhagem celular, o estágio de maturação e o tipo de anormalidade cirogenética ou molecular envolvido nas leucemias agudas. A detecção
326 ( Medicina laborarorial para o clínica
possibilitaram a identificação de alguns subgrupos biológicos e prognósticos distintos e levaram à elaboração de propostas de outros sistemas de classificação. A categorização das leucem ias agudas segundo esses parâmetros tem grande importância, não só no tratamento a ser administrado, mas também na resposta obtida, já que contribui para a criação de protocolos terapêuticos nos quais os pacientes são tratados de acordo com critérios prognósticos relevantes. Assim, um paciente de alto risco beneficia-se de uma terapêutica agressiva, enquanto aquele em que a doença é de risco mais baixo é poupado dos efeitos colaterais da terapia antitumoral. Recentemente, um comitê especial da Organização Mundial de Saúde (OMS) propôs uma nova classificação, que representa um avanço conceituai imponante em relação às outras, já que incorpora as alterações genético-moleculares como fatores primários para a determinação de gru pos nosológicos (Tabelas 29.3 e 29.4). A crescente disponibilidade de diferentes técnicas para detectar cais alterações possibilita a viabilização dessa abordagem diagnóstica em centros de referência para o tratamento das leucemias agudas. No Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), pela disponibilidade dos métodos diagnósticos mencionados, é possível uma abordagem multidisciplinar no diagnóstico e acompanhamento das leucemias agudas.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
As manifestações clínicas das leucem ias agudas são explicadas pela fisiopatologia da doença e decor-
rem. geralmente, da inibição da hemaropoese pelas células leucêmicas
Tabela 29.4 - Classtficaçào proposta pela OMS para as LLAs
e da infiltração d a m edula óssea
e de ourros órgãos pelo clone leucêmico. As mani-
I. LLA de precursor B
festações mais co muns são palidez cutâneo-mucosa,
l lA com o t(9;22)(q34;q 11); BCR-ABl
hemo rragias
e
febres. A presença de febre pode ser
lLA com o r[1;19)(q23;p131; E2A-PBX 1
à
LlA com o t(12;21 l(p12;q22); TEl-AMll
decorrente de processo infeccioso ou secundária
produção de cirocinas pelas células no rmats ou leu-
LLA com anormalidades do região l l q23, gene Mll
cémlcas. Podem ocorrer também linfadenomegal ia,
11. LLA de precursor T
heparomegalia, esplenomegalia, além de acometi-
III. Leucemia de células de Burkitt
mento testicular e do sistema nervoso central (SNC). A infiltração da pele e da gengiva é infreqüem e e mais com umeme encontrada na LMA. Nas crianças,
é co mu m o bservar dores ósseas e arrralgia. manifes-
O LABORATÓRIO NO DIAGNÓSTICO DAS LEUCEMIAS AGUDAS
tações raras nos adultos.
O HEMOGRAMA Tabela 29.3 - Classificação proposta pela OMS para as LMA
I. LMA com translocações citogenéticas recorrentes lMA com o ~18.21l[q 22;q22). AMLl-ETO l PA com o r[15; 17)(q22;q2 1) [PM l·RARal e variantes, lMA com eos,nófilos anormais no medula ósseo- .nv[ 16) lp13;q22l ou rP6;1 6l[p1 3;ql ll. CBF ~·MYH1 1 lMA com anormalidades do 11q23 [Mll )
11. LMA com displasia de múltiplas linhagens
No hemograma, anemia normocítica e normocrômica e plaquetopenia geralmente estão presentes na maioria dos pacientes no momento do diagnóstico. A contagem global de leucócitos pode estar aumentada. normal ou diminuída; é freqüente a presença de neutropenia e de blastos circulantes. O clínico deve esrar aremo à possibilidade de erro na contagem elerrônica das plaquet as: os blastos são células mais frágeis, que se rompem facilmente - a comagem
com SMD ou ooenço mielaprol ferorvo prév•o
desses fragmentos celulares pode superestimar a conta-
sem onlecedentes
gem de plaquetas. o que pode ser mutto importante do
III. LMA e SMD relacionadas a terapias
pomo de visra clínico. O coagulograma geralmente esrá normal. exceto
relacionados o agentes olouilontes relacionados o inibidores do topoisomerose
11
outros tipos
IV. LMA não categorizada nos itens anteriores
na leucem ia pro m ielocírica aguda (LPA) - FAB-M 3 e. mais raramente. nas leucemias monocír icas e LLA de linhagem T. O exame do líquor deverá ser sempre realizado nos
LMA com mínimo diferenciação
casos de suspeita de LLA e de LMA monocírica (FAB-
lMA sem maturação
M4 ou M S). pois é mais freqüente a infi ltração do SNC
LMA com maturação
nesres subripos.
leucemia mielomonocí ico agudo leucemias monoblástico e monocítico agudo leucemia eritrocítico agudo leucem•o megocorioc:tico agudo leucemia bosofilico agudo Ponmielose agudo com mietofibrose Sorcomo gronulocítico
O perfil metabólico gera lmente não mostra alcerações significativas no paciente com leucem1a aguda. mas é freqüenre a elevação da desidrogenase lácrica
e
do ácido úrico, refletindo rápida destruição e regeneração celular. Diante de uma suspeit a clínica e inicialmeme de um hemograma alterado, o diagnóstico das leucemias agu-
OMS Orgamzaçào Mund1al de SaJde: LMA leucemiam1el61de aguda; LPA: leu·
das deverá incluir. pelo menos, o escudo morfológico.
cem1a prom1elocittca aguda; SMD: síndrome m1elodisp ás•ca
citoquímico e imunofenodpico da medula óssea.
lnvemgação laborarorial do paciente com leucemia aguda
327
A CITOLOGIA DO ASPIRADO DE MEDULA ÓSSEA O diagnóstico das leucemias agudas é fi rmado pelo mielograma, obtido pela punção aspirativa da medula óssea, que revela a substituição do tecido hematopoético normal por células leucêmicas imaturas de aspecto monomórfico. Segundo a classificação FAB, o diagnóstico é confirmado quando mais de 30% das células nucleadas presentes na medula são blastos. Por outro lado, a classificação da OMS considera o ponto de corte de 20% de blascos na medula ou no sangue periférico, na ausência de alterações genéticas recorrentes (Tabelas. 29.3 e 29.4). Colorações citoquímicas como, por exemplo, a mieloperoxidase e as esterases, são úteis na distinção entre a LMA pouco diferenciada e a LLA, bem como na identificação de alguns subtipos de LMA.
A BIÓ PSIA DE MEDULA ÓSSEA No paciente com leucemia aguda, a biópsia de medula óssea geralmente não é essencial para o diagnóstico. No entanto, em algumas situações ela representa a única opção diagnóscica, como nos casos de: • medula óssea hipocelular; • fibrose medular, comum na LMA megacarioblástica (FAB M7); • medula óssea acentuadamente infiltrada por células neoplásicas, impossibilitando sua aspiração.
O ESTU DO IMUNOFENOTÍPICO PELA CITOMETRIA DE FLUXO A conuibuição da imunofenotipagem pela cicometria de fluxo multiparaméuica no diagnóstico das leucemias agudas está bem estabelecida, permitindo a definição correta da linhagem celular em aproximadamente 98% dos casos, dado fundamental na definição da abordagem terapêutica. Os diferences tipos de células leucêmicas (usualmente precursores mielocíticos ou linfocíticos) podem ser identificados por simples análise citológica e citoquímica. Em muitos casos, no encanto, é necessário o emprego de reagentes imunológicos para identificar aspectos particulares da diferenciação celular.
A identificação sensível e específica das células neoplásicas, sua acurada enumeração e caracterização fenotípica representam o principal objetivo da imunofenotipagem no estudo das leucemias. Esta técnica permite análise multiparamétrica, quantificação antigênica e rápido screening de grande número de células, visando à identificação da linhagem celular implicada no processo de proliferação clonai: mielóide ou linfóide. Na medula óssea normal, a diferenciação dos precursores hemacopoéticos apresenta grande heterogeneidade morfológica e de expressão ancigênica. Nas leucemias agudas, os marcadores celulares mostram semelhança com aqueles presentes nas células hemacopoéticas normais. O valor diagnóstico da imunofenotipagem por citomeuia de fluxo da medula óssea ou do sangue periférico é importante nas seguintes situações: • definição das leucemias que não são obviamente mielóides, a fim de se diagnosticar positivamente as LLAs; • reconhecimento de todos os casos de LMA-MO (minimamente diferenciada) e LMA-M7 (megacarioblástica); • identificação de diferences subtipos imunológicos nas LLAs; • definição das leucemias indiferenciadas, nas quais não é possível a determinação de uma linhagem celular específica; • monitoramento de doença residual mín ima no controle de tratamento das leucemias, pelo reconhecimento de imunofenótipos aberrantes, não expressos nas células no rmais; • identificação das leucemias bifenot ípicas nas quais um único clone leucêm ico expressa marcadores de duas linhagens distintas, mielóide/li nfóide Bou T ou linfóide B/linfóide T; • identificação das leucem ias de linhagem mista, nas quais dois ou mais clones leucêmicos expressam marcadores de linhagens distintas. Diversos painéis de anticorpos monoclonais foram padronizados para a imunofenotipagem das leucemias agudas visando ao seu diagnóstico e sua classificação baseados no grau de diferenciação ou maturação das células leucêmicas, com importantes implicações prognósticas e terapêuticas. Entre eles, estão os propostos pelo European Group for the lmmunological Characterization
328 [ Medic ina laboratorial para o clínico ]f -- - -- - - -- - - - -- - -- - -- - -- - -- - -- -
of Leukem1as (EGIL). o US-Canad1an Consensus Group e o Bnt1sh Commitee for Standards in Haematology (BCSH).
lmunofenotipagem nas le ucemias linfoblásticas agudas
A pesquisa dos amígenos celulares expressos pelos linfoblasms permite que a LLA seJa classificada de acordo com a l1nhagem e com o estágio de diferenciação das células linfóides. As Figuras 29.1 e 29.2 moscram os esquemas do imunofenótipo das células linfóides B e T. respeCtivamente, durante sua diferenciação. Celulo-konco lonfóóde
Célula Pró-S
Colula Pro-B
•
Célula 8
alula8
•ntermed,ór•o
madura
•O ;
o
•
•
Plo$mÓC1t0
••
I
slg
~~g
I
L
@_o 3s
"-
HLA.OR
>
L TdT/CD34
clgM
J
< CD19
- --
L
-J
CDS
COlO
da célula. À medida que a célula se diferencia, há subseqüente expressão de CD24, COl O, cadeia intracimplasmácica de imunoglobulina (ciJ) e. f1nalmence. a cadeia de imunoglobulina de superfície (K e jJ). As LLAs de lmhagem B podem ser subclassificadas em pró-B. comum, pré-8 e 8 madura. refletindo a seqüência normal de maturação das células B. A Tabela 29.5 mostra a classificação imunológica das LLAs segundo critério EGIL. Os casos de LLA com um e pré-B apresentam prognósticos similares. enquanto o prognóstiCO do subc1po pró-8 é pior, mesmo quando se exclui o grupo de crianças de alto-risco. menores de um ano de idade. A LLA-B madura é o subtipo mais raro. ramo em criança s como em adulms. e requer tratamento qUimiorerápiCO com esquemas alternativos. A class1ficação imunológica das LLAs de linhagem T baseia-se no estágio de maturação dos blastos, análogo ao dos timómos Imaturos (pré-T). Intermediários e maduros. A expressão do antígeno CD3 no moplasma cel ular define o comprometimento com a linhagem. Os demais marcadores T apresentam expressões vanáveis e o TdT (termmal deoxinucleoridil uansferase) é positivo na ma1ona dos casos.
CD79n
~CD22 I
Tabela 29.5 - Classificação imunológ1ca das leucem1as agudas (EGIL, 1995)
CD22
Figura 29.1 - Esquema de d1ferenoaçào da linhagem linfo1de B
Celulo-tronco
TimÓC+IO
Timócito
lonfóode
comum
maduro
Pró-hmócito
• •
~
•
lC1
>
TdT cCD3 -
-->
CD4/ CD8
Unf6cilo T helper/
J
~ .......
•
lonfócolo T ahvodo
• [ HLA-DR
I
CD3
>
--,
Figura 29.2 - Esquema de diferenoação da linhagem linfó1de T
Leucemia linfobláslico agudo ILLAI L1nhogem B B-l lpró-B) B-lllcon-u-nl B-llllpré-81 B-IV (B-moourol Linhagem T TI (pró-TI T l(pré-Tl T-111 (T cort•colj TIV I~ mod ,ro;
T- a;
~
e T- y/ 'õ
LLA com expressão de I ou 2 marcadores rn1elóides (LLAMy) 2 .Leucemia m1eloblóstico agudo ILMA) Mielomonocítico Entrocílico lpreoce/imoturo e modu·ol M egocoriocítico (M7) LMA pobremente diferenciado ILMA-MO) LMA TdT+ LMA com expressão de 1 ou 2 marcadores linfóides (LMA-Lyl 3 LelJcemio ogudc b1fenor p,co
Os marcadores am1gênicos que identificam os blasms de li nhagem B são CD19, CD79a e CD22. sendo o último detectado mais precocemente no citoplasma
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda
li leucem1o agudo indiferenciado
329
lmunofenotipagem nas leucemias mielóides agudas
utilidade, uma vez que as células apresemam as mesmas
Na leucemia mielóide aguda, o diagnóstico imunofe-
características imunológicas da forma hipergranular. A imunofenotipagem é de utilidade no diagnóstico
norípico é geralmente estabelecido pela presença de an-
da LMA-M6 (eritroleucemia), particularmente quando
cígenos associados à diferenciação mielóide e na ausência
as células apresentam morfologia muico primitiva. Os
de antígenos linfóides B ou T. Os principais marcadores associados à diferenciação mielóide são CD1 17, CD13,
anticorpos mais utilizados são CD71 (receptor de transferrina) para a identificação das células 1maturas e a antl-
CD33, CD6S, antimieloperoxidase (antiMPO), CD11c,
glicoforina A, expressa nas células mais maduras.
CD14, CD64, CD41, CD61 e CD71 e não apresentam correlação precisa com os diferentes subtipos morfológicos da classificação FAB. A Tabela 29.6 apresenta, resumidamente, o padrão de reatividade com anticorpo monoclonal (ou policiona!) mais comumente observado nas categorias de LMA da classificação FAB. A LMA-MO não pode ser identificada apenas pelas técnicas de morfologia e as principais reações ciroquím icas são negativas. A imunofenotipagem nesses casos é de grande valor no diagnóstico diferencial com as LLAs. As células, mais primitivas, geralmente expressam os marcadores de células precursoras, antiMPO e podem expressar CD7, um marcador de linhagem T. A LPA (LMA-M3) corresponde a 10%a 15% das leucemias mielóides agudas e é facilmente diagnosticada pela análise morfológica. Estudos de marcadores de superfície mostram que as células da LPA apresentam um imunofenótipo característico quando comparado a outras LMAs: alta expressão de antígenos mielomonocíticos e ausência de antígenos monocíticos, de CD34 e de HLADR. Na forma M3 variante, hipogranular, o diagnóstico morfológico é mais difícil. sendo a imunofenocipagem de
As células da leucemia megacarioblástica (LMA-M7) podem ser facilmente confundidas morfologicamente com as da LLA. O estudo imunofenotípico é de grande valor para o diagnóstico, sendo mais específico que a ciroquímica e mais viável que a ciroquímica ultra-estrurural utilizada na pesquisa de peroxidase plaquetária. Os marcadores dessa linhagem identificam glicoproteínas (gp) plaquetárias nas membranas dos megacarióciros: CD61 (gp llla), CD41 (gp llb e o complexo llb/llla) e CD42a e b (gp IX e lb).
lmunofenotipagem nas leucemias bifenotípicas
Na leucemia bifenotípica, um único clone de célu las leucêmicas expressa marcadores de duas linhagens. mielóide e linfóide B ou T, ou, ainda, a concomitância de marcadores li nfóides B e T. A imunofenotipagem é essencial para a confirmação diagnóstica. mesmo quando os blastos não são cicologicamente uniformes. O sistema de pontuação (score) proposto pelo European Group
for the lmmunologic Classificatwn of Leukaemia (EG IL) e modificado pelo comitê especial da OMS é recomendado e utilizado internacionalmente.
Tabela 29.6 - Padrão de rearividade monodonal (ou polidonal) observado nas caregorias de LMA de classificação FAB
LMA MO Ml M'P
Marcadores de células precursoras
Marcadores Mielóides
Marcadores Monocíticos
TdT
HlA-DR
CD34
CD1 3
CD33
CD11 7
+I- I-
+
+
+
+I-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
MJO
CD15
CDllb
+
+
+I+I -
+I -
M4
+
+ 1-
+
+
M5
+ + 1-
+I+I-
+
M6C
+I. +I-
+I+I . +I -
+I-
+
M'l"
+
-'- 1 -
+
+ +
CD14
+
+
+
+
+I-
°CD19 +I - em M2 com r(8.21}; b CD36 eanugiiCofonna p051uvos: c CD9. CD36. CD41, CD42a. CD42b. CD61 pos1rivos:d CD9 positiVO.CD2 ~ I·
330 [ Medicina laboracorial pa ra o clínico )1-- - - - -- - - -- - - -- - -- - - - - -- - - - -- - -
lmunofenotipagem nas leucemias indiferenciadas
Alterações citogenéticas recorrentes nas LMAs
A leucemia aguda indiferenciada é rara e as células leucêm1cas não apresentam evidências de diferenciação mielóide ou linfóide, por não possuírem marcadores específicos para uma determinada linhagem. Os blastos geralmence expressam marcadores inespecíficos como CD34. HLA-DR, CD38 e podem apresemar TdT e CD7.
Cerca de 70% a 80% dos paciences com LMA apresencam alteração cromossómica clonai ao diagnóstico, tendo sido descritas mais de 100 anomalias estruturais e/ ou numéricas, como [ranslocações recíprocas. inversões. inserções, deleções. isocromossomos, isodicênuicos, crissomias e monossomias. Nos paciences com LMA, o cariótipo distmgue, com algumas discordâncias encre os vários investigadores. três grupos de risco: favorável. 1mermediário e desfavorável: • grupo de risco favorável - inclui as alterações t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21) e inv(16) (p13;q22)/t(16;16)(p13;q22); • grupo de risco desfavorável - inclui principalmente as deleções dos cromossomas 5 e 7, a r(9;22) (q34;q11), a inv(3) e os carióripos complexos; • grupo de risco imermediáno - inclu1 o cariót1 po normal e outras alterações cicogenéticas não descncas nos grupos ameriores.
Doença residual mínima ( DRM)
A DRM é defi nida como a quamidade de células leucêm1cas res1duais presemes no organ1smo após um curso de tratamenco, não detectáveis pelas técnicas morfológicas convencionais. Nos últimos 15 anos, ocorreu grande desenvolvimenw de méwdos laborawria1s para a idencificação e quamificação da DRM, alguns baseados na Investigação de anormalidades cromossômlcas ou genéticas (cicogenética convencional, hibridação m s1tu com fluorescência - FISH, reação em cade1a da polimerase - PCR) e outros baseados em téc nicas imunológicas. como a microscop1a de fluorescência e a imunofenotipagem por cirometria de fluxo, que pro piciam análise qualitativa e quantitativa de um número elevado de células. No Brasil, mesmo nos cencros de referência em diagnóstico e tratamenco oncológico, o elevado cusco de alguns desses procedimencos e a necessária capacitação técn1ca de profissionais que atuam na área laboracorial são facores limitances ao escudo da DRM.
A CITOGENÉTICA CLÁSSICA O emprego da ciwgenética convencional no diagnóstico das leucemias agudas evidenciou alw número de akerações cromossôm1cas não aleatónas e o seu escudo molecular permitiU a idencificação de vários genes envolvidos na leucemogênese. O estudo de grandes séries de pacientes com leucemia aguda demonstrou que o cariótipo constitu i o fator prognóstico mais importante para a estratificação de risco, quando analisado individualmente. Por esta razão. as principais alterações genéticas recorrences foram Incl uídas na proposta de classificação da OMS.
Investigação laboracorial do paciente com leucemia aguda
t(8;21)(q22;q22)
A t(8;21)(q22;q22) ocorre em cerca de 12% dos casos de LMA de novo em crianças e 5% a 8% em ad ul cos jovens. sendo raramente observada em pacientes acima de 55 anos. Apesar de fortemente associada ao subtipo FAB M2, tam bém pode ser encontrada em pacientes com morfologia FAB M1, M4 e com LMA secundána à tera pia. Vários escudos observaram que a t(8;21)(q22;q22) associa-se a um prognóstiCO favorável na LMA. inv(16)(p13;q22) I t(16;16)(p13;q22)
Um grupo de pacientes com LMA apresenta precursores eosinofílicos anormais na medula óssea (FAB LMA-M4Eo) e a maioria desses pacientes apresenta a inv(16)(p13q22) ou. menos comumente, a r( 16;16) (p1 3;q22). que têm fortes semelhanças moleculares. Raramente esta alteração pode ser encontrada em casos de LMA M2, M4, M5 e em pacientes com LMA secundária à tera pia. A inv(16) foi observada em cerca de 10% das LMAs de novo nas crianças e nos adulcos jovens. sendo incomum em pacientes com mais de 45 anos. Vários escudos de-
331
monsrraram que pacientes com LMA e inv(16)/t(16;16) apresentam prognóstico favorável. t(15;17)(q22;q2 1)
A LPA, Inicialmente reconhecida por sua evolução desfavorável dev1do a uma grave síndrome hemorrágica, caracteriza-se, na maior parte dos casos, pela presença de uma alteração cromossômica única, a r(15;17)(q22;q21). Awalmeme, devido ao rraramemo com o ácido all-trans re[lnó1co (ATRA), esre subtipo de LMA é incluído no grupo de bom prognóstico. A r(15;17)(q22;q21) rambém é derecrada em aproximadamente 7% das crianças e 15% dos adultos JOVens com LMA de novo, mas é rara em indivíduos acima de 45 anos. Alterações envolvendo a região 11q23
As alterações envolvendo a reg1ão 11q23 são alvo de grande imeresse por parte dos generiosras, por três motivos: • essa região cromossômica é uma das ma1s freqüememence envolvidas em rearranjos cromossômicos nas neoplasias humanas; • essas são as alterações cirogenéricas mais freqüenres nas leucemias de lacrences (em torno de 75%); • ocorrem ramo em leucemias de origem celular mielóide, como linfóide e de linhagem m1sra. Nas LMAs, essas alterações podem ser encontradas em todos os subripos FAB, mas predominam nos subtipos M4 e MS e freqüenremente esrão associadas às LMAs secundárias à terapia, especialmente as que se desenvolvem após a exposição a 1n1bidores da topo1somerase 11. Vários estudos demonstraram que. ramo nas LMAs quanto nas LLAs, os rearranjos que envolvem a região 11q23 são forres predirores Independentes de evolução clínica desfavorável, estando freqüenremenre associados à má resposta ao tratamento qU1mimeráp1co e a características de apresentação de alto risco. Entretanto, o significado prognóstico dessas aberrações cromossôm1cas não é uniforme. De faro, alguns estudos relatam que paoentes com LMA que apresentam a r(9;1 1)(p22;q23) evoluem mais favoravelmente do que aqueles com outras rranslocações envolvendo a mesma reg1ão, o que é de fundamentallmportânoa na escolha de tera p1as ~nd1v1duahzadas.
332 [ Medicina laboraronal para o clín1co
Trissomia do cromossoma 8
A presença de um cromossoma 8 extra é a alteração numérica ma1s freqüeme na LMA. Essa anomalia geralmente ocorre em doenças da linhagem m1eló1de e, é mais comumence observada nos subcipos FAB M2, M4 e MS. Em relação ao prognóstico, não há consenso na literatura no que se refere à rrissomia do cromossoma 8. Alguns estudos classificam esra alteração como de risco intermediário, enquanto outros a consideram de alco risco.
Alterações citogenéticas recorrentes nas llAs
A exemplo das LMAs. o uso cada vez ma is freqüente de técn icas cicogenéticas e a experiência acumulada demonstraram que aproximadamente dois terços dos pacientes com LLA apresentam alterações cromossômicas recorrences ao d1agnósrico. De acordo com as alterações mogenér1cas. os pacientes com LLA podem ser caregonzados em do1s grupos: • grupo c1cogenético desfavorável - 1nciU1 a r(1;19) (q23;p13). a r(4;11)(q21:q23), a t(9;22)(q34;q11) ou a r(8;14)(q24;q32). além de alterações mais raras como a h1pod1ploidia (número inferior a 46 cromossomas por célula) ou a para-haplo1d1a (número cromossômico próx1mo do haplóide); • grupo mogenérico favorável - inclui a t(12;21) (p12;q22) ou número modal acima de 50 cromossomos. t(12;21)(p 13;q22)
A r(12;21)(p13;q22) é observada em cerca de 25% das crianças com LLA de precursor Be define um subgrupo distinto de pacientes que apresentam, geralmente. um a 10 anos de idade, imunofenóripo B comum e um prognóstico favorável. Trata-se de uma alteração críptica. ou seja, de difícil identificação pela citogenética convencional. fazendo-se necessária a utilização de FISH ou RT-PCR para sua detecção. Hiperdiploidia
A hi perdi ploidia é definida como a presença de um número maior ou igual a 47 cromossomas por
)1---- - - -- -- - - - - - - - -- - - -- - -- - -- -
célula. Os casos de hiperdiploidia com mais de 50 cromossomas ocorrem freqüentemente em crianças com LLA (30%). mas são raramente observados em adultos. Essa alteração geralmente envolve rrissomia dos cromossomas 4. 6, 8. 10, 21, 22 e X e associa-se a fatores de bom prognóst ico como idade entre um e nove anos, baixa contagem de leucócitos e imunofenótipo comum ou pré-B.
t(8;14)(q24;q32)
A t(8;14)(q24;q32) é observada em pacienres com LLA-B madura, que equivale à fase leucêmica do linfoma de Burkitt e apresenta morfologia FAB-L3. Essa alteração. considerada de mau prognóstico, é enconrrada em 2% a 5% de todas as LLAs de crianças ou adulms e os pacientes apresenram freq üentemente envolvimento do SNC e/ou abdominal ao diagnóstico.
t(9;22)(q34;q11)- Cromossoma Philadelphia
O ESTUDO MOLECULAR A t(9;22)(q34;q11) é observada em aproximadamente 30% dos adultos e 5% das crianças com LLA. Tanto nos adultos como nas crianças. a presença dessa translocação associa-se à alta contagem de leucócitos com percentagem significativa de blastos e a um prognóstico desfavorável. Na maior parte dos casos. o fenótipo é de precursor B; mais raramente, essa alteração pode ser observada nas LLAs de linhagem T ou nas LMAs. Alterações envolvendo a região 11q23
Nos pacientes com LLA a t(4;1 1)(q21;q23) é a alteração mais comum envolvendo a região 11q23. seguida pela t(11;19)(q23;p13.3) que, no entanto, não é específica desse subtipo de leucemia aguda e ocorre, tam bém, em pacientes com LMA. Tanto os pacientes adultos como as crianças com a t(4;11) geralmente apresenram contagem de leucócitos elevada. morfologia FAB-L1 ou L2. fenótipo B mais Imaturo com cc-expressão de antígenos monocíticos ou de linhagem T. bem como doença extramedular e resposta desfavorável à quimioterapia convencional. t(1;19)(q23;p13)
A t(1;19)(q23;p13) é vista em diferences tipos de LLA de linhagem Be. mais raramente, pode ser observada em pacientes com LMA ou linfoma de células T. Essa alteração associa-se fortemente ao imunofenótipo pré-B. representando em corno de 25% das crianças e menos de 5% dos adultos com este subtipo de LLA. Embora o prognóstico dos pacienres pediátricos e adultos com a t(1;19) seja desfavorável. o uso de quimioterapia em altas doses tem melhorado a evolução desse grupo de pacienres.
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda
O desenvolvime nco da biologia molecula r desvendou, nos últ imos 10 anos. a grande d iversidade molecular envolvida na pacogênese das leucemias Cerca de 200 anomalias genéticas foram identificadas e a maioria delas pode ser relacionada com a desregulação de vias que controlam o ciclo celular. apopcose e diferenciação. Dois mecanismos moleculares foram observados nas rranslocações cromossômicas envolvidas em leucem ias (Figura 29.3): O primeiro. restrito à linhagem li nfóide, envolve a justaposição de um prow-oncogene a um dos elementos regulatórios dos genes das imunoglobulinas (nos linfócitos B) ou do receptor de células T (nos li nfócitos T), o que resulta na expressão desregulada do gene translocado. A t(14;18)(q32;q21) e a t(8;14)(q24;q32). que envolvem a justaposição de regiões situadas no gene da cadeia pesada da imunoglobulina aos genes BCL2 e MYC. respectivamenre. são exemplos desse tipo de translocação na linhagem B. O outro mecanismo envolve a fusão de dois genes. na qual os pontos de quebra se situam em ínrrons de cada um dos genes envolvidos, mantendo intacta a região codificante de ambos. O resu ltado da rranslocação é a geração de transcritos e proteínas quiméricas com funções alteradas. Exemplos desse modelo são a t(9;22)(q34;q11), que origina o gene de fusão BCR-ABL. e a t(4;1 l)(q21;q23). que resulta no gene MLL-AF4. Nas leucemias agudas. este é o mecanismo mais freqüenre e a presença desses produtOs quiméricos nos blasros le ucêm icos pode ser detectada por mécodos moleculares. Uma das principais razões para a utilização de métodos moleculares no diagnóstico das leucemias
333
agudas é que, ao contrário da cirogenética convencional. esses cesces independem do sucesso de culturas celu lares e da obtenção de metáfases. Além disso, a presença de alterações genéticas "crípticas", isto é, detectáveis por metodologia molecular em ausência de evidência ci rogenética, é descrita cada vez mais freqüentemente na literatu ra. Uma outra aplicação do escudo molecular é a identificação de alvos para o moniroramento de doença resid ual mínima (DRM) e para a terapêutica dirigida. O diagnóstico e o acompanhamento das leucemias demandam a utilização de diversos métodos, alguns sofisticados e complexos. exigindo pessoal treinado e expenente, o que é uma limitação para muitos centros. A Tabela 29.7 mostra as principais vantagens e limitações de cada um desses métodos, bem como sua sensibilidade para a detecção de células leucêmicas residuais. Expressão desregulada
A
Exl
Segmentos J
Ex 2 / '
Segmento C E
5'
t
Ponto de quebro -
AAAA AAAA AAAA
-
Oncoproteina superexpresso
AAAA
Alterações moleculares nas LMAs
AML1·ETO
A t(8;21) resulta na fusão do gene AMU - Acute Myeloid Leukemia 1 (cromossoma 21q22) com o gene ETO - Eight Twenty One (cromossoma 8q22), com a formação do gene de fusão AMU-ETO (no derivativo do cromossoma 8). O transcritO AML 1-ETO pode ser detectado por reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa (RT-PCR) em rodos os pacientes que apresentam a t(8;21) e em alguns pacientes sem evidência da translocação pela aná lise do cariótipo (translocação críptica). CBF~·MYH11
Tanto a inv(l6)(p13;q2 2) quanto a t(16;16)(p13;q22) resultam na fusão do gene CBF~ - Core Binding Factor. subunidade B(cromossoma 16q22) com o gene da cadeia pesada da mtostna, MYH11- Myosm Heavy Chatn 77 (cromossoma 16p13), gerando o transcrito de fusão CBFB-MYH11. A detecção das alterações do cromossoma 16 pode ser difícil pela cirogenética convenc1onal. dado o extremo polimorfismo da região envolvtda. Asstm, em pacientes com LMA, é necessária a utilização de FISH ou RT-PCR para obter-se um diagnóstico preciso da presença da inv(16)/t(16;16).
B Ex 1
Ex 2
Ex 1
Ex 2 Ex J
~~~--D00-3'
Alterações que envolvem o gene do receptor a do ácido retinóico (RARa)
t
Ponto de quebro CJCJO AAAA
RNAm quimérico Proteína com funçã o alterado
Figura 29.3 - Modelos de uanslocações cromossôm1cas nas leucemias. A: Ativação gên1ca por justaposição com os genes de recepmres de ancígeno (lg ou TCR). O promoror do proto· oncogene (à esquerda) pode permanecer 1ncacro. mas está suJelro à regulação por elementos de acivação do gene da lg ou TCR (à direita). 8: Fusão gêniCa. Do1s genes hipoténcos são JUStaposros como resultado da translocação. A uanscnção do gene qUiménco resultante começa no promotOr do gene no exuemo 5' e prossegue até o sÍtiO de pohaden1lação do gene no exuemo 3'. O RNAm produz1do codificará uma proteína quimérica com função alterada. lg - lmunoglobulina; TCR recepmr de células T; Ex - éxon; E - enhancer. Adaptado de Hassan R, 2000
334
Medicina laboratoria l para o clínico
A t(15;17)(q22;q21) resulta na fusão do gene PML P.romyelocytic leukemia (cromossoma 1Sq22) com o gene RARa - Retinoid Acid Receptor a (cromossoma 17q21), gerando o transcrito de fusão PML-RARa (no derivatiVO
do cromossoma 15). Alguns estudos mostram que a LPA não é uma doença uniforme e aproximadamente 10% dos pacientes não apresentam evidência citogenética e/ ou molecular da t(15;17). Cerca de 1% dos casos de LPA pode estar associado à t(1 1;17)(q23;pll ), que resulta na fusão do gene PLZF- Promyelocytic Leukemia Zinc Finger (cromossoma 11q23) com o gene RARa e caracteriza-se por ausência de resposta ao ATRA. Outros genes parceiros do RARa incluem o NPM1 - Nucleophosmin, o NuMA - Nuclear M itotic Apparatus e o STATSb - Signal Transducer and Actlvator of Transcript10n Sb, associados à t(S;17) (q3S;q21), t(11;17)(q13;q21) e der(17), respectivamente.
Tabela 29.7 - Mérodos unlizados no d1agnósnco e acompanhamento das leucemias agudas
Método Morfologia
Vantagens Baixo custo
Limitações Discordância interobservadores
Sensibilidade para DRM
5%
Acesso em todos os centros lmunofenotipagem
Rapidez Anó,ise de grande número de células
Alto custo
Citogenética convencional
Baixo custo Análise cromossómica individualizada e do conjunto
Necessidade de obtenção de metófoses longo lempo de execução
FISH
Rapidez Detecção em núcleos interfósicos
Alto custo Detecção de alterações especí'icos
O, I - 1%
PCR; RT-PCR
Baixo/médio custo Rapidez
Detecção de alterações específicas
0,0001 - 0,1%
Os transcrims PML-RAR 2 são usados como alvo tanto para a detecção de células leucêmicas por RTPCR ao diagnóstico. como para a monimração da DRM. Ademais. a LPA é um exemplo significacivo da uti lização do estudo molecular na identificação de alvo para terapêutica dirigida: a partir da descoberta do envolvimento do gene RARa , foi observada a sensibilidade peculiar dos blastos leucêmicos ao ATRA. o que revolucionou o rratamenm da doença. atualmenre considerada o subtipo de LMA com o maior potencial de cura. Alterações envolvendo o gene MLL
O grupo de pacientes com cariótipo normal representa 40% a 50% dos adultos com LMA e cerca de 20% a 30% das cnanças. Nesses pactentes. a primeira alteração genética descrita foi a duplicação parcial em tandem do gene MLL - Myel01d/Lymph01d Leukem1a ou Míxed L1neage Leukem/0. Essa alteração foi observada em 8% a 10% dos paoemes e fot a primeira a defmir um subgrupo de pacientes com mogenética normal e prognóstico desfavorável. O gene MLL foi identificado em alterações recorrentes (deleções, duplicações, inversões e cranslocações recíprocas) envolvendo a região llq23. observadas nas leucemias agudas e síndromes mielodisplásicas (SMD). Dados experimentais demonstram que é um gene es-
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda
1 - 5%
1%
sencial para a hemampoese. Até o momento, cerca de 30 genes parceiros para o gene MLL foram descritos, sendo que nas LMAs a maioria das translocações envolve o 9p22. o 19pl3.1 ou o 6q27. Há relatos na literatura da ocorrência de alterações crípticas envolvendo o gene MLL. Por esta razão, é necessário o emprego de metodologia molecular. como FISH e/ou RT-PCR para a pesquisa dessas alterações. Mutações do gene FL T3
Outro gene muito estudado nos últimos anos como alvo diagnóstico e tera pêutico na LMA é o gene FLT3 - FMS-Iíke tyrosme kínase 3. que cod1fica um receptor tiresina quinase transmembrana e participa da regulação dos processos de proliferação e diferenciação das células hemaropoéticas no rmais. As mutações do gene FLT3. presentes em cerca de 30% dos pacientes com LMA podem ser de dois tipos: as duplicações internas em tandem (DIT-FLT3) e as mutações de pomo. ambas detectáveis por metodologia molecular. Vários estudos demonsrraram que as DIT-FLT3 estão associadas a pior prognóstico. tanto em adulros quanto em crianças. Atualmeme. estão em curso alguns estudos clínicos utilizando inibidores do gene FLT3 associados ao tracamenro convenoonal, mas os resulcados ainda são Inconclusivos.
335
Mutações do gene NPM1
O gene NPM1 - Nucleophosm in - codifica uma proteína núcleo-citoplasmática multifuncional, localizada principalmente no nucléolo e que está envolvida em processos como síntese proréica, crescimento e proliferação celular. Escudos recentes mostraram que aproximadamente 55% dos adultos com LMA e cariótipo no rmal apresentam mutações do NPM1. Nesses estudos observou-se que a presença dessas mutações, na ausência de D1TFLT3, identifica um subgrupo de evolução signi ficativamente melhor dentro do grupo de cariótipo normal. A detecção citoplasmática da proteína NPM por imunohistoquímica é altamente sugestiva de mutações do NPM1, que pode ser confirmada por vários métodos citogenérico-moleculares. Futuramente, melhor esclarecimento do papel das mutações do NPM1 na leucemogênese poderá levar à sua inclusão na classificação da OMS, bem como ao desenvolvimento de novas drogas específicas.
co m o gene AML7 (21q22), gerando o produto de fusão TEL-AML7, foi um dos pri meiros exemplos de rranslocação críptica descritos na literatura. Assim, é necessário o emprego de métodos moleculares como FISH ou RTPCR para a sua detecção, sendo que em nosso meio a RT-PCR é mais freqüentemente empregada devido ao custo mais baixo. Ade mais, os uanscritos TEL-AML1 podem ser utilizados para a monitorização de DRM.
Alterações envolvendo o gene MLL
Como já foi citado, dentre as alterações envolvendo o gene MLL nas LLAs, a t(4;11)(q21;q23) é a mais comu m. Esta alteração resulta na fusão dos genes MLL e AF4 - ALL7 f used gene from chromosome 4, gerando o gene de fusão MLL-AF4. Os transcritos MLL-AF4 podem ser detectados por metodologia molecular e podem ser utilizados ao diagnóstico e no acompanhamento da DRM. E2A-PBX1
Alterações moleculares nas llAs
A t(1;19)(q23;p13.3) resulta na fusão dos genes E2A - transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer
BCR-ABL
binding factors E12/E47) e PBX1 - Pre-B-ce/1 leukemia transcription factor 1, gerando o transcrito de fusão E2A-PBX1, que pode ser detectado por métodos mole-
A t(9;22)(q34;q11) ou cromossoma Philadelphia resulta na fusão dos genes BCR - Breakpoint Cluster Region (cromossoma 22q11) e ABL- Abelson (cromossoma 9q34), gerando o transcrito de fusão BCR-ABL, que pode ser detectado por métodos moleculares. Conforme eirado previamente, a presença dessa alteração associa-se a um prognóstico desfavorável nos adultos e nas crianças e pode ocorrer canto nas LLAs de precursor B como, mais raramente, nas LLAs T ou nas LMAs. Tais características associadas à possibi lidade de ocorrência de rranslocações crípticas justificam a pesquisa molecular dos transcritos BCR-ABL ao diagnóstico. Além disso, a monitorização quali tativa e quantitativa desses transcritos pode ser utilizada para o acompanhamento da DRM ao longo do tratamento. TEL-AML1
A t(12;21)(p13;q22), que resulta na fusão do gene
culares tanto ao diagnóstico como durante o acompanhamento para monitorização da DRM. Alterações mo leculares nas LLA-T
Cerca de 50% dos pacientes com LLA-T apresentam alterações cromossômicas estruturais identificadas à citogenética convencional. Alterações numéricas são raras, à exceção da tetraploidia, vista em torno de 5% dos casos e sem significado prognóstico. Com a utilização de métodos moleculares, foi revelada a ocorrência de várias alterações crípticas, sendo as mais comuns: • as deleções intersticiais crípticas envolvendo o cromossoma 1p32, que ocorrem em até 30% das crianças com LLA-T; • as translocações envolvendo o TCR, presentes em aproximadamente 35% dos pacientes;
TEL - Translocation-f.ts- Leukemia (cromossoma 12p13)
336 [ Medicina labo ratorial para o clínico
]f-- - - -- - - - - - - -- - - -- - - - -- -- - -- - -
• a t(10;11)(p13;q14), que resulta na formação do gene de fusão CALM·AF10 e é encontrada em cerca 10% dos pacientes. Como o fenótipo está associado ao genótipo, algumas das anomalias genéticas recorrentes observadas nas leucem1as agudas correlaCionam-se com subEipos FAB, 1munofenóE1pos e comportamentos clín1cos distintos (Tabelas 29.8 e 29.9).
EXEMPLO DA ABORDAGEM MULTIDISCIPLINAR UTILIZADA NO DIAGNÓSTICO E ACOMPANHAMENTO A UM PACIENTE COM LEUCEMIA AGUDA
CASO CLÍNICO MMG, 7 anos, cor parda, sexo masculino. natural e res1dente em Manhuaçu, MG, hígido até 10 dias atrás, quando iniciou quadro de adinamia, palidez, dores ósseas nas pernas, equimoses e petéquias disseminadas pelo corpo. Há cinco dias procurou assistênCia médica em sua cidade, sendo real1zado hemograma que ev1denciou anemia, leucomose com predomínio de células acípicas e rrombomopema. Nessa ocasião foi encaminhado ao Ser· viço de Hemacologia do Hospital das Clín1cas da UFMG.
EXAME F[SICO Prostrado. palidez cutâneo-mucosa acentuada, presença de petéquias e equimoses em tronco e membros infenores, lmfonodomegalia cervical, axilar e ingUinal b1· lateralmente. Temperatu'a axilar: 37,2°(. abdome flácido, indolor à pal pação superficial e profunda, fígado palpável a 5 cm do RCD, baço pouco doloroso e endurecido palpável a 3 cm do RCE, testículos sem anormalidades à palpação. Sem outras alterações significativas ao exame clínico.
EXAMES LABORATORIAIS AO DIAGNÓSTICO • hemograma: Hemoglobina: 5,6 g/dL Hematócrico: 16,5%
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda
Hemácias: 2.100.000/mm 3 GL: 92.000/mm 3 (segmentados 2%; linfócicos 5%; blascos 93%) Plaquetas: 12.000/mm 3 DHL: 960 U/L
Acido úrico: 9.5 mg/dL • mielograma: material obtido por punção asplrauva medular. hipercelular. infiltrado por 95%de célu· las blásticas de tamanho variável e heterogéneo. As células ma1ores apresentam núcleos com cromat1· na rendilhada, alguns com chanfraduras e indentações. Citoplasma basofílico abundante, às vezes vacuolizado. um a dois nucléolos evidentes. Os blascos menores contêm núcleos com cromatina condensada e cicoplasma escasso. O quadro morfológico sugere d1agnóstico de LLA (Figura 29.4); • imunofenotipagem de amostra de medula óssea (Figura 29.5): a reatividade das células blásticas (90%) frente aos marcadores ant1gênicos foi: CD45. CD34. HLA-DR, CD79a, CD22. CD19, COlO - poSitivos; lgM, COla, CD2, CD3, CD4, CDS, CD7. CD8. MPO. CD13. CD14, CD33 - negativos; • conclusão: leucemia linfoblástica aguda comum (LLA B·ll da classificação EGIL); • citogenética (Figura 29.6): 46,XY,t(9;22)(q34;q11) [18)/46.XY[2]; • observação: caso não fossem obtidas metáfases suficientes para a análise, podena ser utilizado mécodo de FISH para a pesquisa do gene de fusão BCR-ABL. A Fig. 29.7 mostra o resultado esperado. O paciente iniciou tratamenro quimioterápico segundo o protocolo do Grupo Brasileiro para Tratamenco da Leucem1a Lmfoblást1ca Infantil (GBTLLI-99), grupo alco risco, em julho de 2003.
EXAMES LABORATORIAIS NA RECIDIVA • mielograma e imunofenotipagem: medula óssea totalmente infiltrada por linfoblasms. com imunofenótipo de LLA comum (LLA B-11 da classificação EGIL); • citogenética:4 LS,XY.add (1 )( p36 .3),c(9;2 2;19) ( q 3 4; q 11; p 13. 3),? de I( 9 p), de r ( 16) (? q 2 2;?) (14)/46,XY[06);
337
• pesquisa do gene de fusão BCR-ABL (Figura
civo de cracamemo quimiocerápico, recebeu predntsona,
29.8): resulrado - foi derecrada a presença do gene
hidroxiuréia. cirarabina e mesilaro de imarinib, não sendo
de fusão BCR-ABL. isoforma e1a2;
obrida remissão da doença. A criança faleceu 01ro meses
• observações: gene de fusão BCR-ABL derecrado
após a recidiva.
por PCR Mulriplex, com sensibilidade de derecção
de uma célula leucêmica em 1.000 células normais. Escudo de hisrocomparibilidade não evidenciou doadores aparenrados comparíveis. Co mo esquema alcerna-
Tabela 29.8- Correlação entre as pnnc1pa1s alrerações genéricas nas LMAs com subupo FAB, 1111unofenór1po e aspecms clín1cos Alteração Citogenético G enes envolvidos
Subtipo FAB
lmunofenótipo
Comentários
t(8.21llq22;q221
M!ILI-ETO
M2 (cerco de 90% dos casos!; ombém Ml eM4. Mos apenas 20% dos LMAs·M2 opresen· Iom o t(8;21)
Usualmente LMA de novo; eosi· DR, CD34 CD33 nofilio medular; vó1ios grous de CD13, CD15; expres· são freqüenle de CD19 displosio. Bom prognóstico. eCD56
tnv( l6)1p13q22)
CBFP·MYH /1
Virtuolmen·e todos os cm0s de !\114Eo. ;ornbém M2 e Mt.
CD33 > CD13 CD15, COlá CDllo. CDllc. CD36 CD6ll, CD4 ow CD2 - '
Usualmente LMA de novo. Bom prognósltCO
t(15; 17)1q22;q211
PML-RARa
M3. M3v
DR H CD34 geralmente H CD33 > CD13, CD15, CD44, CD2 +/-, CD9+/-, CD56 +/-
Usualmente lMA de novo; quadro de CIVD; responsivo ao ATRA. Bom prognóstico.
t(ll;l7)1q23;pll)
PLZF-RARo.
M3, M3v: outros
Não responsivo ao ATRA.
tl 11,1 71!ql3;q21)
NuMo·RARa
M3; M3v; outros
Aoorentemente responsivo ao ATRA.
'15 171!q35:q21)
NPM-RARa
M3. M3v: outros
Aoorente'T'erte respors.vc ao ATRA
Tronslocoções envolvendo o llq23
MU
t(9;llllp22;q23) t!ll.l 9)(q23,p13.1) t(11;19)(q23;p13.3)
MLL-AF9 MLL-ELL MU·ENL
M4 e M5o; menos comumente outros subtipos (M 1, M2, M 5bl e SMDs
Duolicoção po•c1ol em 1onde"' do gene MLL
MLL exons 2·6
8-10% dos pacientes com ca riótipo normal. Prognósflco desfavorável.
Duplicação 1n1erno em tandem do gene FLT3
FLT3 exons 14·15
20-30% dos pacientes; fotor prognóstico mais importante no grupo de cariótipo no1mol. Prognóstico desfavorável.
NPMI exon 12 (mo tono)
55% dos adultos com coriót1po normal No ousêncto de DIT FLT3, parece tdenttficor gruoo de melhor prognóstico.
IDIT-FLT31 Mutações do gene
NPMI
338 [ Medicina laborarorial para o clínico
Se d1ferencioção monocítico· CD34H, CD33 > CD I3, CD14, CD41ow, CDl l b, CDll c, CD36, CD64, CD4 low, CD2 +/. Mos sem padrão definido.
LMA de novo e LMA secundá· rio e SMD após exposição o inibidores do ropoisomerose 11. Significado prognóstico não é uniforme. maioria associado o prognóstico desfavorável.
Tabela 29.9- Correlação enrre as principais alterações genéucas nas LLAs com subnpo FAB. 1munofenónpo e aspecws clín1cos
Alteração Citogenética Genes envolvidos
Subtipo FAB
lmunofenótipo
Comentários
Geralmente LLA de precursor B. mo1s raramente LLA-T e LMA.
Prognóstico desfavorá· vel nos odullos e nos
Fenótipo B mais imaturo com co·expressõo de antígenos monocíticos ou de linhagem T.
Conlagem de leucócitos elevada, doença extramedular frequente. Prognóstico desfavorável.
t!9;22)1q34;ql l j
BCR-ABL
tl4; 1l)iq21;q23 1
MLL-AF4
tll ;1 9)!q23;pl3)
E2A·PBXI
Forte associação com o imuno- Geralmente prognóstico lenótipo pré·B laproximodomen· desfavorável nos adultos te 25% dos crianças e menos e nas crianças. de 5% dos adultos). Roromenle linloma de células Tou LMA.
rll2;2 1)!p13;q22)
TEL-MIILI
Geralmente imunafenót1pa B comum
25% dos crianças com LLA de precu1sor B, geralmente entre I e 10 anos de idade. Prognóstico favorável Alteração críoti co, necessária utilização de FISH ou RT·PCR
lmunofenót1po B comum ou pré-B.
Bom prognóstico. Geralmente trissomia dos cromossomas 4, 6, 8, 10, 21 , 22 e X.
crianças. LI ou L2
Hiperdiploidia
Figura 29.4 - Fotomicrografia de esfregaço de aspirado de medula óssea (May-Grünwald-G1emsa. x 1000), Leucem1a linfoblásrica aguda. Medula óssea h1percelular mf1luada por ilnfoblasLOs pleomórf,. cos apresemando grande variabi l1dade em formaw e tamanho. Vc, pram!!o colo11da
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda
339
~
...---.-------..
ô
~ -
Antígenos positivos: CD79a CD45
fC534l
~ CD lO
10' 10' lgO iffiC
10'
IO'f
HLA-DR Antígenos negativos: CD3
CDS CD7 CD 13 CD33 Mieloperoxidase
Figura 29.5- D1agrama esquemánco de imunofenmipagem por citometria de fluxo. O diagrama mosrra os gráficos de dispersão do caso descrito. A seta azul1ndica a população de células blásticas a ser escudada. A população destacada em vermelho apresenta positividade para os antígenos CD10 e CD19, definindo o subtipo LLA comum. Ver prancha colonda
--
'"'
~~
.. ,
~- ai "*~
.t ...
•
q
!11'!'1
!}
~~
tl~
!Je
~~
-..
.'
' ..."
~
i
A!
•
I l
Figu ra 29.6 - Cariónpo masculino de medula óssea evidenciando uma translocação entre os cromossomas 9 e 22.
340
Medicina laboratorial para o clínico
Figura 29.7 - Hibridação in s1tu com fluorescência para pesquisa do gene de fusão BCR-ABL. Hibridação in s1tu com fluorescência de sonda especifica para pesquisa do gene de fusão BCR-ABL em nucleo inrerfásico de medula óssea. A sonda é composta da m1stura de duas sondas de DNA, uma para o gene ABL (laranja) em 9q34 e a outra para o gene BCR (verde) em 22q11.2. Nas células com translocação entre os cromossomas 9 e 22, um s1nal verde é observado no cromossoma 22 normal (seta ma1or), o s1nal laranja pode ser visto em ambos os homólogos do cromossoma 9 (setas menores) e um sinal amdrelo da fusão, resultante da presença dos sinais verde e laranja junws, é verificado no cromossoma 22 derivativo (seta vazada). Coloração de fundo: DAPI (cortesia do Setor de Citogenética do Serv1ço de Med1c1na Laboratonal do Hospital das Clín1cas da UFMG). Vet prancr1a color.da
PM
1
2
3
REFERÊNCIAS 1.
Batn BJ. Leukaemta diagnosts. Berltn: Blackwell Publtshtng: 2003.
Figura 29.8- Detecção do gene de fusão BCR-ABL por PCR. Linha 1: detecção de banda de 805 pb correspondente ao gene consutun· vo BCR. para venficação da qualidade do cDNA: Linha 2: detecção de banda de 480 pb (seta), correspondente à tsoforma ela2 do gene de fusão BCR-ABL. e da banda de 805 pb correspondente ao gene BCR: Linha 3 - controle da PCR. PM - padrão de peso molecular 100 pb. Gel de agarose 2%.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O reconheCimemo da heterogeneidade clínico-biológica das leucemias agudas ressalta a Importância do estudo multid1sciplinar, tamo na etapa do diagnóstico quanto no monitoramento da terapia. Além das Implicações práticas, especialmeme no manejo clínico, a classificação e a subclassificação das leucemias agudas contribuem para o conhecimento progressivo da biologta dessas doenças. posstbilttando a descoberta de novos marcadores prognósticos relevames e recursos terapêuticos ma1s específicos.
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda
2. Bene MC Cascoldt G. Knapp W, Ludwtg WD. Matures E. Orfao A. er ai. Proposals for rhe tmmunologtcal classtftcanon of acure leukemtas. European Group for the lmmunological Characterizarion of Leukem1as (EGIL). Leukemta. 1995:9:1783-6 3. Harns NL, jaffe ES, Dtebold J. rlandnn G. Muller-Hermeltnk HK. Vardtman J. er ai. The World Health Organtzarton classtficatton of neoplasms of the hematopoieuc and lympho1d t1ssues: reporr of rhe Cltntcal Advtsory Commtttee meenng - Atrlte House. Vtrgtnia, November. 1997. Hemacol ). 1999;1:53-66. 4. Mrózek K. Bloomf1eld C. Chromosome abcrranons. gene murarions and expression changes, and prognos1s tn adult acure myelotd leukem1a. Hemarology Am Soe Hemawl Educ Program. 2006:169 77. 5. Mrózek K. He1nonen K. Bloomf1eld CD. Prognosnc value of cyrogeneuc ftndtngs tn adults w1th acure myelotd leukemta.lnr I Hematol. 2000:72:261-71. 6. Szczepansky T. Orfao A. van der Velden VHJ, San Mtguel JF. van Dongen JJM. Min1mal restdual dtsease tn leukaemta panems. Lancet Oncol. 2001;2:409- 17.
Sttes úre1s:
lnsmuco Nactonal de Câncer http://www.tnca.gov.br Atlas Ch10mosome Canw (Atlas de Cllogenénca) http://arlasgeneticsoncology.org/ Ltvro Educactonal Anual da SoCiedade Amencana de Hemacologla http://www.asheducatlonbook.org/ Atlas de Hematologta http://image.bloodl1ne.net/
341
Daniel Dias Ribeiro Ana Flávia Leonardi Tibúrcio Ribeiro Rosa Ma/ena De/bane de Faria
30
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DISTÚRBIO HEMORRÁGICO
O SISTEMA HEMOSTÁTICO
das principa1s vias da ancicoagulação. A fibrinólise
é fa-
vorecida pela produção do ativador do plasminogênio O sistema hemostático é responsável por manter o
tecidual (tPA) e ativador do plasminogênio uroquinase
sangue flu1do no intravascular e por permitir que este,
(uPA). A agregação plaquetária é inibida pela liberação
quando exposto a estímulos adequados (lesão endote-
da prostaciclina
lial), form e o plug hemostático. Após a cicatrização do
perfície endotelial.
endotélio, este coágulo formado deve ser quebrado. Para
1 2
(PG I2) e do óxido nítrico (ON) na su-
O endotélio lesado
é capaz de expor substâncias pró-
manter esse equilíbrio necessita-se de níveis adequados
coagulantes, ta1s como o fator de von W illebrand, fator
de fatores pró-coagulantes e anticoagulantes, número e
tecidual e colágeno, entre outras. A resposta inflamatória
função plaquetária normais, ·endotélio íntegro e um sis-
que lesou o endotélio ou que ocorre em função da sua
tema fibrinolítico funcionando corretamente.
lesão é responsável pela diminuição da u ombomodulina
O sistema hemostático é composto pelo endotélio,
e aumento do 1nibidor do ativador do plasminogênio 1
plaquetas, fatores pró e anticoagulantes, fatores pró e
(PAI-1). Tem-se, então. a ativaçâo da coagulação, diminui-
antifibrinolíticos.
ção da ação dos anticoagulantes naturais e bloqueio da fibrinólise.
ENDOTÉLIO PLAQUETAS O endotélio normal mantém o sangue fluido devido
à produção de inibidores da coagulação e da agregação
A participação das plaquetas na hemostasia é par-
plaquetária, modulação do tônus e permeabilidade vas-
te fisiológica fundamental. Sua ação envolve adesão ao
cular. Ele protege, como um envelope, as substâncias
endotélio lesado, agregação plaquetária com a forma-
pró-coagulantes do subendotél io. O endotélio possui
ção de uma superfície de fosfolípides na qual ocorrem
propriedades anticoagulantes, pró-fibrinolíticas e de
várias reações da coagulação e liberação de substâncias
inibição da agregação plaquetária. A trombomodulina,
pró-coagulantes através da secreção de seus grânulos.
produzida e secretada pelo endotélio, ativa a proteína
No primeiro momento. substâncias como o colágeno
C que, quando em cantata com a rrombina e o sulfa-
e. principalmente, o fator von W illebrand são expostos
to de heparina, presentes no endotélio, potencializam
e promovem a adesão plaquetária. As glicoproteínas lb
a antitrombina (AT). Tais mecanismos constituem duas
IX-V (GPibiX-V) constituem o sítio de ligação das plaque-
cas ao endocélio lesado. Após esca fase inicial, ocorrem,
fato de sofrerem um a gamacarboxilação em sua porção
simultaneamente. a agregação e a ativação plaquerária. A
aminot erminal, dependente da vitamina K, para serem
primeira decorre da interação emre as plaquetas através
capazes de exercer as suas funções.
da ligação das glicoproteínas llb IIIa (GPIIbll la); a segunda
A via intrínseca pode ser definida como a via da co-
resulta da secreção de substâncias pró-coagulantes dos
agulação que possui todos os seus ativadores no inte-
grânulos densos, grânulos alfa e lisossomos, o que ocorre
rior dos vasos, sendo composta pelos fatores VIII, IX, XI,
após a centralização destes, devido à contração do ci-
XII, calicreína, pré-calicreína e cininogênio de alto peso
toesqueleto plaquetário. A ativação plaquetária culmina
molecular. Os chamados fatores de contaw (fatores XI,
com a formação do tampão plaquetário.
XII, calicreína, pré-calicreína e cininogên io de alto peso molecular) passaram a ter a sua importância como prócoagu lantes questionada, pois apenas a deficiência do
FATORES PRÓ -COAGULANTES
faror XI leva
à tendência de sangramento aumentado,
enquanto a deficiência do fator XII pode estar associada Embora, tradicionalmente, a coagulação seja dividida
à trombose. Por outro lado, essas proteínas participam
e comum, essa divisão não
da respost a in flamatória, ativação do sist ema de comple-
em vias intrínseca, extrínseca
in vivo. Atualmente, sabe-se que, após o fator VIl
mento, fibrinól ise, angiogênese e formação de citocinas.
ser ativado pelo fator cecidual, o complexo fator V ll-fator
Portanto, pode-se ter deficiência do fator XII, mas sem
tecidual é capaz não só de ativar o fator X, através da via
tendência ao sangramento e com provável facilidade de
extrínseca, como também da via intrínseca, por meio da
formação de trombos.
ocorre
é útil in vitro, em
brinogênio. Uma vez ativada pelas vias intrínseca e/ou
que são avaliadas separadamente as vias intrínseca e co-
extrínseca, é responsável pela conversão da protrombina
mum das vias extrínseca e comum. Praticamente todas
em trombina. Após sua ativação. o fator X, juntamente
ativação do fator IX. Entret anto, tal divisão ainda para se observarem as reações da coagu lação
as reações da coagulação são reações enzimáticas nas quais um zimogênio (enzima na forma inativa)
é clivado,
originando uma serino protease (forma enzimática ativa). A via extrínseca
é a principal
A via comum é composta pelos fatores 11, V, X
com o cálcio, fosfolípides
e
fi-
e o fator V, formam o complexo
protrombinase, que fará a conversão da protrombina em trombina, quando, então, a trombina formada
é capaz de
via de ativação da co-
interagir em vários pontos da coagulação, retroativando-se.
agulação, sendo composta por elementos sanguíneos e
Originam-se, assim, ações pró-coagulantes tais como con-
vasculares. Tem como co m ponente crítico o fator teci-
versão do fibrinogên io em fi brina.jeedback positivo sobre
dual, que é uma proteína intrínseca de m embrana, com-
os fatores V, VI II, IX, XI
e XI I (potencializando
em muitas
post a por cadeia única de polipeptídeo. O componente
vezes a formação do coágulo) e ativação do fator XIII, que
p lasmático de maior importância da via extrínseca é o
funciona como estabilizador da fibri na formada. A uombi-
fator VIl, que pode ser ativado pelo faror tecid ual, mas
na ainda é capaz de ativar a via da proteína C (anticoagu-
que também é capaz d e au to-at ivação, pela cl ivagem,
lante natural) e de inibir a fibrinólise por intermédio do ini-
transformando-se na sua forma ativa. O complexo fator
bidor da fibrinólise ativado pela trombina (TAFI). O fator V
e intrín-
é, na verdade, um co-fawr do fator X, sintetizado no fígado
Vl l-fator tecidual ativa as vias co mum (fator X)
seca (fator IX). O principal inibidor da via extrínseca da coagu lação
é o inibidor da via d o fator tecidual (TFPI).
e presente nos grânulos alfa das plaquetas; ele possibilita a interaçâo do fator X com a membrana de fosfolípides.
Este é sintetizado por macrófagos e células endoteliais após indução por endoroxinas e cirocinas, como as interleucinas e o fator de necrose tumoral. O TFPI se liga
ANTICOAGULANTES NATURAIS
ao complexo fator Vlla-fator tecidual e faror Xa, inati -
(INIBIDORES DA COAGULAÇÃO)
vando-os. O fator VIl é uma proteína vitamina K d ependente, como os fatores 11 e X da via com um, fator IX da via intrínseca
eo
e
O maior inibidor dos ativadores de contato é o ini-
os anticoagulantes naturais, proteína C
bidor Cl (primeiro componente do sistema do comple-
seu co-fato r, a proteína S. Todos têm em comum o
mento), que é responsável pela inibição de até 90,0% do
344 ( Medicina laboratorial para o clínico ]1---- - - - - - - -- - - - - -- -- - - - - - - - - -- -
faror XII arivad o e de aproximadamente 50,0% da cali-
(porencializando a coagulação) e at1vação da v1a da pro-
creína. Enrretanw, a deficiência do inibidor C1 resulta em
teína C (limitando a cascata da coagulação). A simples
e não em rrombose. O faror XI ativado tem
formação do coágulo, entretanto, apesar de possibilitar
como principal inibidor a a l anritripsina, mas a inibição
a cicatrização do vaso lesado, não resolve o problema da
da elastase dos neutrófilos é função muiro mais crítica
funcionalidade do mesmo, já que o fluxo sangüíneo fica,
angioedema
desta, já que sua deficiência leva ao quadro de enfisema
no mínimo, prejudicado dev1do ao rrombo formado. As-
pulmonar e insuficiência hepát ica em vez de tendência à
Sim sendo, é de extrema importância funcional que esse
formação de coágulos.
trombo seja "dissolvido" no momento exaro.
A am irrombina, conhecida anteriormente como an-
Os mecanismos responsáveis pela lise do coágulo são
titrombina III, é potente anticoagulante natural. Exerce a
conhecidos como sistema fibrinolícico, que é composro
sua ação a partir da inacivação, principalmente, dos fato-
por substâncias pró e anrifibrinolíticas. A plasmina exerce
res lia, Xa, IXa e Xla. Essas serino-proreases se ligam à an -
o papel central na fibrinólise. Embora pouco entendido,
ritrombina e formam complexos inacivos. Entretanto, a
mas, precisamente orquestrado em relação ao tempo. as
crombina ligada à fibrina não pode ser inarivada pela AT.
células endoteliais liberam substâncias pró-fibrinolíticas,
Esta cem como potenCJalizador de sua ação a heparina
como o cPA. Juntamente com o uPA. o tPA lisa o plasmi-
endógena ou exógena. A deficiência de ATestá ligada ao
nogênio, principalmente o ligado à fibrina, t ransformado-
risco aumentado de trom boem bolismo venoso. O co-
o em plasmina, protease capaz de d issolver o coágulo.
fator 11 da heparina inaciva selecivamente a crombina na
Embora apenas pequena quantidade de plasminogênio
presença de heparina.
se ligue à fibrina durante a formação do coágulo, esta é
Como eirado anteriormente, a via da proteína C é ou-
suficiente para a fibrinólise fisiológica. Trata-se de pro-
tro potente mecanismo de anticoagulação. Após o estí-
cesso balanceado, pois durante a formação do coágulo
mulo pela trombina, a crombomodulina, associada ao co-
quantidades variáveis de U:1-antiplasmina (inibidor da
fator proteínaS, ativa a proteína C sendo responsável pela
fibrinólise) são inseridas no trombo. O equilíbrio dessas
inativação dos fatores Va e VIlla, cofarores de coagulação.
substâncias no trombo é que dica a veloc1dade e a in-
Recentemente. foi descrito o inibidor da via do fator
tensidade de dissolução do coágulo. Outro inibidor da
cecidual (TFPI), que atua sobre o complexo fator tecidual
fibrinó lise é o PAI-1. que impede a ação dos ativadores
e fatores VIla e Xa, inibindo a principal via do início da
do plasminogênio (tPA e uPA). Descrito recentemente, o
coagulação.
TAFI impede que o plasminogênio ou o rPA se liguem à
A U:1-macroglobulina é um inibidor secundário ou
fibrina, diminuindo, assim, a fibrrnólise. Esta é mais uma
de retaguarda de vários famres da coagulação e enzimas
interação entre a formação do coágulo e a sua fibrinóli-
fibrinolíticas. Quando ligadas a esse inibidor, as enzimas
se mediada pela trombina. Logo, quando se cem pouca
ainda possuem alguma atividade; logo, esse complexo
uombina, observa-se não só menos formação de fibrina,
funciona corno reservatório enzimático, já que, assim,
como também mais facilidade de fibrinólise.
outros 1nibidores não são capazes de inativá-las. Nenhu-
Uma vez iniciada a fibrinólise, produtos de degrada-
ma doença da hemostasia foi associada à deficiência da
ção do fibrinogênio e da fibrina (PDF) passam a circular
U:1-macroglobulina.
no sangue. Os PDFs são os produtos de degradação da fibrina e do fibrinogênio propriamente ditos e os D-dímeros (DO), que são os produtos de degradação
SISTEMA FIBRINOlÍTICO
da fibrina estável, isto é, após a ação do fator Xll la. Os PDFs e o DO são marcadores da produção de uombina
A fibrina estável é o produto final da coagulação. Du-
e posterior fi brinó lise. Por possuírem pequenas quan-
em
rante todo o processo rem-se a rrombina como princi-
tidades de uombina
pal elemento, por atuar em múltiplos sítios de ligação,
à ativação disseminada da coagulação, que é antago-
tais corno: imeração com o fibrinogênio (levando à for-
nizada pela anticrombina. Durante a lise do coágulo,
mação da fibrina); ativação do fator XIII (possibilitando
pequenas quantidades de plasmina livre também são
a estabilização da fibrina); ativação dos fatores V e VIII
liberadas na circulação, o que poderia promover um
lnvesrigação laborarorial do pacienre com disrúrb1o hemorrágico
sua superfície, podem levar
345
"estado lítico", corno observado com o uso de drogas pró-fibrinolíticas como a estreproquinase. a uroquinase ou o ar1vador recombinante do plasminogênio, com conseqüente tendência ao sangramento. A ~ antiplasmina é capaz de inibir rapidamente a plasmina livre circulante, prevenindo sangramento secundário diante de plasmina livre circulante. O processo da hemostasia é extremamente equil ibrado, permite a formação rápida do trombo, promovendo a hemosrasia, mas, também, impede resposta trombogênica além do sítio lesado ou por tempo superior àquele necessário para a reconstituição do vaso. Um desequilíbno em qualquer parte desse processo pode propiciar doença hemorrágica ou trombótica.
DISTÚRBIOS HEMORRÁGICOS
As doenças hemorrágicas são classicamente divididas em primárias e secundárias. Os distúrbios hemorrágicos da hemostasia primária são aqueles que afetam a formação inicial do plug plaquerário: plaquetopenias, d1sfunções plaquetárias (trombopatias) e a doença de von Willebrand. Os distúrbios hemorrágicos da hemostasia secundária são aqueles que envolvem a formação da fibrina: deficiência de qualquer um dos fatores pró-coagulantes. Os exemplos mais clássicos são as hemofilias A e B.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A história clínica é o prediror de risco de sangramenro mais importante. A necessidade de confirmar ou excluir uma desordem hemorrágica é comum na prática clínica. Esta abordagem depende do quadro clínico. Pode-se, a partir de uma abordagem simples. diminuir custos e o tempo gasto com esses pacientes. As prinopais questões a serem respond1das na história clínica são: • há realmente tendência ao sangramento7 • esta é uma condição adqu1rida ou fami liar? • qual fase da hemostasia está aferada? • o sangramento pode estar sendo induzido por drogas? • há outra doença que pode estar causando ou agravando o sangramento?
Com estas questões resolvidas, direCtona-se a propedêutica complementar.
Há realmente tendência ao sangramento?
Essa questão pode ser respondida investigando-se a história clínica, familiar e uso de drogas. As principais queixas são: facilidade na formação de hematomas, equimoses. petéquias, sangramento mucoso espontâneo, menorragia. sangramento aumentado após trauma, cirurgia ou parto. A associação desses sintomas fortalece a suspeita clínica de distúrbios de hemostasia. Entretanto, sangramentos em sítios isolados, epistaxe ou menorragia, por exemplo. normalmente têm como causa uma lesão local. A definição quanto ao risco de sangramento, em pacientes com os chamados pequenos distúrbios de hemostasia, é extremamente difícil. Apesar do conhecimento das alterações no genótipo, que levam a distúrbios hemostát1cos. ter aumentado nos últimos anos. ainda ex1ste incapacidade em pred1zer qua1s são as pessoas com risco de sangramento aumentado, po1s nem sempre as alterações genotíp1cas estão diretamente relacionadas às fenotípicas. Esse fato contrasta di reta mente com uma demanda cada vez maior por informações completas e pela busca de padrões mais altos de segurança quanro à saúde e qualidade de vida. É grande a necessidade de ferramentas capazes de padronizar e sistematizar o risco de sangramento e a investigação dos distúrbios. A diferenciação entre pessoas sem tendência ao sangramemo daquelas com pequenos distúrbios de hemostasia nem sempre é clara. Algumas escalas foram criadas para medir a intensidade das manifestações hemorrágicas. O problema é que muitas pessoas saudáveis relatam sintomas e sinais hemorrágicos. A definição de quem merece ser investigado se torna um problema. Arualmente, esta decisão é tomada avaliando-se a história clínica e familiar dos indivíduos. Facilidade em sangrar: os hematomas e equimoses devem ser valorizados principalmente quando forem volumosos, localizados no tronco e sem trauma prévio. Aparecimenro súbito de múltiplos hematomas e equimoses pode refletir a existência de uma doença adquirida. que inrerfere de maneira direta na hemosrasia, como a cirrose hepática, a plaquetopenia auto-imune e a presença de inibidores adquiridos dos farores da coagulação. A
346 [ Medicina laboratorial para o c línico )~------------------------------
utilização de medicamentos ou suplementos alimentares com interferência na função plaquetária pode aumentar o aparecimento de equimoses e hemacomas em pacientes com distúrbios congênitos de proteínas da coagulação. As anormalidades dos vasos sangüíneos e dos tecidos que os sustentam favorecem o aparecimento de equimoses e/ou petéquias sem que exista qualquer alteração primária da hemostasia. A púrpura melancólica, as vasculites, a púrpura senil, o sangramenco causado pelo uso do corcicóide, a púrpura de mulheres relacionadas com o ciclo menstrual e a síndrome de Ehlers-Danlos são alguns exemplos. Sangramemos mucosos: são achados comuns em pacientes com distúrbios da fase primária da hemostasia. Epistaxe de repetição, sem associação com o clima seco ou lesão local, que piora com o aumento da idade e leva o paciente ao médico para cauterização, com história de sangramento em outro local, sugere a existência de distúrbio da hemostasia. Sangramemos gengivais só devem ser valorizados quando são repetitivos, sem doença periodomal associada e com higiene oral adequada. Hematúria, hemoptóico, melena e sangramento retal são achados infreqüentes em doenças hemorrágicas e, quando presentes, uma possível causa local deverá ser afastada. Menorragia: é definida quantitativamente como a perda de sangue acima de 80 ml por ciclo menstrual. Apesar de ser um sinal freqüente em portadores de doenças hemorrágicas, tem como causa mais com um as alterações endometriais uterinas ou hormonais, além de ser de difícil quantificação. Algumas questões destacam menorragia verdadeira: anemia ferropriva secundária a perdas catameniais, consumo de grande número de absorventes higiênicos por ciclo menstrual, coágulos no fluxo menstrual e período de sangramento superior a oiro dias. A menorragia acomete cerca de 10% das mulheres durante sua vida reprodutiva e pode ser a manifestação mais proeminente de um distúrbio congênito da hemostasia, presente em até 20% das adolescentes que procuram atendimento médico devido à menorragia. Sangramemo pós-uauma, cirurgia ou parto: são bem sugestivos de doença hemorrágica. A história de sangramento após extração dentária é muito útil, já que vários pacientes foram expostos a este risco. As exodontias são verdadeiros desafios para o sistema hemostático, pelas limitações anatômicas para uma boa hemostasia e pela verificação de enzimas fibrinolíticas na saliva. O questionamento direto sobre sangramento excessivo após
ronsilectomia e sobre necessidade de hemorransfusão em cirurgias em que habitualmente esta prática não é necessária também é informação importante. O parro é uma siruação de esrresse hemostático. Pacientes portadores de doença de von Willebrand têm aumento do faror de von Willebrand e do famr VIII durante a gestação, porém podem apresentar sangramemo no pós-parto, já que estes são fatores de meia-vida curta e dimin uem rapidamente com o térm ino da gravidez. Sangramentos musculares e articulares: são característicos de deficiências congênitas, moderadas a graves, dos fatores VIII e IX da coagulação. Também podem ser vistos nas deficiências moderadas a graves do fibrinogênio e dos fatores 11, V, Vil e X. Hemaruoses espontâneas são raramente vistas em ou tras coagulopatias, à exceção da doença de von Willebrand tipo 3. com menos de 5% de atividade do fator VIII. Os sangramentos musculares podem ser encontrados nos pacientes com deficiência adquirida do fator VIII.
Esta é uma condição adquirida ou familiar?
A idade à apresentação do sangramento, a duração dos sintomas, a resposta a situações de esrresse hemostático prévios e a história familiar muitas vezes definem se distúrbio hemorrágico é adquirido ou congênito. A dificuldade está nos pacientes com distúrbios leves, que muitas vezes têm a história fam iliar pobre e as manifestações hemorrágicas pouco sugestivas ou até mesmo podem nunca ter sido expostos a situações de risco para sangramento, no passado. A história fam iliar algumas vezes é falsamente negativa. Cerca de 1/3 das hemofilias é por mutação recente, logo, sem história famil iar de sangramemo. Nas doenças autossômicas recessivas e algumas autossômicas dominantes, em sua forma heterozigótica, a história familiar é negativa para hemorragia.
Qual fase da hemostasia está afetada?
A caracterização do ti po de sangramemo é útil no diagnóstico diferencial do distúrbio hemorrágico. O sangramemo cutâneo-mucoso (equimoses, petéquias, epistaxe, gengivorragia, menorragia) é típico de alterações na fase primária da hemostasia: plaquetopenia, disfun-
Investigação laboratorial do paciente com d istúrbio he morrágico
347
ção plaquetária, doença de von Willebrand e doenças do endorélio. Os sangramemos articulares ou musculares sugerem problemas com os famres da coagulação. A deficiência do fawr XIII (fawr estabilizador da fibrina), em geral. moscra-se como uma lesão que volta a sangrar, tipo sangramemo pelo coro umbilical em recémnascidos. Estas alterações hemorrágicas são sugestivas de determinados distúrbios; para a confirmação são necessários testes laborawriais.
hipotireoidismo e doenças que causam falência ou infilcração da medula óssea. A avaliação da história clínica e o exame físico são fundamentais no diagnóstico desses distúrbios e nunca devem ser substituídos por exames laboratoriais. Pacientes pol itraumatizados, submetidos à transfusão maciça, podem evoluir com sangramento secundário à plaquetopenia dilucional.
EXAME FÍSICO O sangramento está sendo induzido por drogas?
Várias são as drogas de uso roti neiro que alteram a hemostasia e causam sangramenros, mas podem apenas estar favorecendo a hemorragia em paciemes com distúrbio de hemostasia. O histórico do uso de drogas é fundamental. Pacientes anticoagulados (em uso de inibidores da vitamina Kou heparina) apresentam risco de sangramento aumentado. Os antiagregantes plaquetários podem "desmascarar" distúrbios hemorrágicos leves, como a doença de von Willebrand tipo 1. A corticoterapia prolongada facil ita a formação de equimoses devido à deterioração do colágeno do subcutâneo. O ácido acetilsalicílico (AAS) e os antii nflamatórios não esteróides que inibem a cicloxigenase-1 são as drogas mais freqüentemente utilizadas que levam à disfunção na fase primária da hemostasia, por promoverem disfunção plaquetária. Os amiinflamatórios não esteróides seletivos da cicloxigenase-2 têm pouca imerferência na função plaquetária, não sendo capazes de aumentar ou causar sangramento espontâneo, porém podem induzir hipercoagulabilidade. Alguns medicamentos fitoterápicos interferem na função plaquetária, sendo o mais comum deles a Ginko bilobae. Oucros exemplos são a vitamina Ee os concentrados de ômega 3.
Há outra doença que pode estar causando ou agravando o sangramento?
Distúrbios adquiridos da hemostasia são normalmente secundários a doenças sistêmicas. A avaliação clínica desses pacientes passa pela busca de uma doença sistêmica. Sangramentos estão freqüentemente presentes em pacientes com insuficiência hepática, insuficiência renal.
348 ( Medicina laboratorial para o clínico
O exame físico faz parte da avaliação dos distúrbios da hemostasia e compõe, com a história clínica, uma das principais ferramentas para condução diagnóstica e uso racional da Medicina Laboratorial. Muitos pacientes portadores de distúrbios hemorrágicos apresentam exame físico sem qualquer anormalidade. Grandes hematomas em regiões pouco expostas a traumas são indicativos de alteração da coagu lação. Seqüelas arciculares devido à hemartroses recorrentes são freqüentes em hemofílicos. Petéquias estão presentes nas trombocitopenias, mas raramente nas crombopatias. Telangectasias em face, lábios, língua e mucosa nasal sugerem o diagnóstico de telangectasia hemorrágica hereditária.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL Como descriw nas sessões ameriores, o exame clínico é indispensável na avaliação do risco de sangramento e o estudo laboratorial não é capaz de substituí-lo, devendo, sempre que utilizado, sucedê-lo. Por exemplo: os testes de triagem da hemostasia podem não ser capazes de predizer o risco de sangramemo no pré-operatório, a propedêutica é realizada para confirmar a existência de um distúrbio clinicamente suspeito. Por outro lado, a avaliação laborawrial é fundamental na determinação do diagnóstico etiológico do paciente que sangra. Há grande interesse no desenvolvimento de testes globais da hemostasia, que permitam predizer o risco de sangramenta ou trombose, mas até o momento não existe um único teste capaz de fornecer esta informação. Freqüentemente o clínico tem que combinar diversos resultados de exames com a apresentação clínica para chegar a um diagnóstico etiológico.
)1----- -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - -- - -
Devido à natureza dos ensaios que avaliam a hemoscasla, a coleta do sangue e o manejo deste até a realização dos testes é fundamental para a confiabilidade dos resultados. A repetição de exames previamente alterados. em pacientes sem história de sangramento, muitas vezes afasta a hipótese de distúrbios da hemosrasia, ou seja, têm-se resultados normais. A pesquisa dos distúrbios hemostáticos deve segUir uma seqüência lógica de exames e a avaliação clínica permite direcionar a investigação. A avaliação básica é composta dos seguintes testes laboratoriais: contagem de plaquetas e tempo de sangramento de ivy modificado, tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativado, ensaio de mistura. tempo de trombina e dosagem do fibrinogênio.
Contagem de plaquetas
A contagem de plaquetas faz parte do hemograma e é rotineiramente realizada em contadores eletrônicos hematológJcos, utilizando o mesmo canal de contagem dos eriuócitos, diferenciando as células por limiares de volume, plaquetas < 20 fL e eriuócitos > 30 fL. Alguns cuidados devem ser tomados ames de ser liberado um resultado de plaquetopenia obc1do e. conseqüentemente, classificar um paciente como plaquetopênico, principalmente quando não existem manifestações hemorrágicas assoc1adas. O exame microscópico do esfregaço sangüíneo, por profissional experiente, é Imprescindível d1ame de resultado de plaquetopen1a emitido pelo contador eleuônico. Causas de pseudoplaquetopenias: • grumos de plaquetas formados devido à falha técnica na punção venosa quando as plaquetas são arivadas ames de entrarem em comato com o anticoagulante no tubo de coleta; • agregação plaquetária induzida pelo EDTA (ácido etileno diamino terra-acético), anticoagulante utilizado para coleta de amostras para realização do hemograma; • aglutininas plaquetárias; • satelirismo plaquetário, mediado por igG ou lgM, promove adesão de plaquetas nos neutrófilos. Todas essas situações são capazes de fazer com que a contagem de plaquetas realizada pelos mais modernos contadores eletrônicos de hematologia seja falsamen-
te baixa. A visualização ao microscópio de satelitismo plaquetário e grumo de plaquetas evita uma extensa propedêutica para plaquetopenia. Freqüemememe a contagem de plaquetas por métodos manuais, como a contagem na câmara de Neubauer ou a contagem de plaquetas na lâmina (contagem pelo mécodo de Fônio), é capaz de esclarecer esta dúvida.
Avaliação da função plaquetária
O tempo de sangramento (TS) de ivy modificado é um TS com padronização suficiente para ser aceito como teste avaliador da função plaquetária. O tamanho, a profundidade e a direção da lesão (corte) devem ser reproduríveis e para que isto ocorra é necessário que um dispositivo produzido com este propósito seja utilizado, o template. A pressão nos capilares deve ser padronizada. por este mot1vo o teste é realizado no membro superior na sua face medial com o esfignomanómerro a 40 mmHg durante todo o proced imento. Utilizando um papel de filtro, o sa ngramemo deve ser enxugado a cada 15 segundos, com cuidado para não tocar a incisão e provocar a remoção do plug plaquecário em formação. O tempo de sangramemo alargado sem outras anormalidades nos exames da hemostasia não é capaz de predizer o risco de sangramenco, logo. tem l1mitações quando usado como teste de tnagem na aval1ação préoperatória. Acredita-se que essa avaliação deve fazer pane de uma abordagem de triagem para o paciente com sangramemo sugestivo de alteração primária da hemostasia (cutâneo-mucoso), porém o TS pode ser normal em algumas doenças que afetam a fase vásculo-plaquetária da hemostasia, como, por exemplo, a doença de von Willebrad tipo 1. Vários aparelhos têm sido produzidos com o Intuito de substituir o tempo de sangramemo na avaliação da fu nção plaquetária. Um dos mais estudados na atualidade é um aparelho produzido pela DadeBehring, o PFA 100. Este tema reproduzir m v1tro o que ocorrem vivo. O sangue total sem amicoagulame é imroduzido em capilares com diferences ativadores das plaquetas e a velocidade de formação do plug plaquetário é medida. O s estudos ainda são inconclusivos sobre sua real utilidade.
Investigação laborato rial do paciente co m dist úrbio hem orrágico
349
A realização da curva de agregação plaquetária com o uso de arivadores plaquetários só esta indicada nos casos com forte suspeita de distúrbio de hemosrasa primária. A medida da agregação plaq uetária é realizada pela avaliação da transmissão da luz após o comato das plaq uetas a serem testadas com os agregames plaquerários (ADP, colágeno, ristocerina, epinefrina, ácido araquidônico e trombina, entre outros). A confiabilidade do teste para avaliar a função plaquetária vai depender muito de como a amostra é manipulada, devendo ser realizado no máximo até duas horas após a coleta do sangue.
Tempo de protrombina (TP)
Descrito por Quick et ai., em 1935, o tempo de protrombina avalia a integridade da via extrínseca e da via comum (fatores VI l, fibrinogênio-1, protrom bina-li, V e X). Trata-se de teste simples que mede o tempo de formação do coágulo em plasma citratado (anticoagulante utilizado para testes de hemostasia) após a adição da trombo piastina (fator tecidual) e da recalcificação. O alargamento no tempo de protrombina reflete a diminuição ou disfunção de um ou mais desses fatores ou a presença de algum inibidor que possa estar interferindo na reação, como, por exemplo, o anticoagulante lúpico. O tempo de formação da fi bri na não depende somente da concentração plasmática dos fatores da coagulação das vias extrínseca ecomum, mas também da concentração e do tipo de fator tecidual utilizado na reação. Por este motivo, tromboplastinas diferentes têm sensibilidades diferentes das deficiências dos diversos fatores. O tipo de leitura da formação da fibrina que os diferentes insuumentos utilizam também interfere no tem po de protrombina. Na tentativa de diminuir essas diferenças, criou-se uma tromboplastina de referência a partir da qual todas as outras são aferidas, padronizando-se o teste entre os laboratórios. Esta aferição é expressa como o índice de sensibilidade internacional (ISI) da trom boplastina. A razão normatizada internacional (RNI) é o resultado de uma fórmula matemática em que o tempo de protrombina do paciente é dividido pelo tempo de protrombina do controle e elevado ao 151. O RN I foi criado para uma monitorização mais fidedigna de pacientes em uso de anticoagulante oral, pois corrige a variabilidade do teste no que se refere à atividade
enzimática da tromboplastina, impedindo intervenções desnecessárias na posologia do anticoagulante, evitando retromboses e sangramentos.
Tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa)
Avalia a integridade da via intrínseca e da via comum (fatores XII, XI, IX, VIII, X, V, 11 e 1). É considerado parcial porque o reagente utilizado, ao contrário da rromboplastina usada no TP. não contém a apoproteína da tromboplastina, é composto basicamente de fosfol ipídeos. A reação ainda necessita de um ativador como a sílica ou o caulim. O alargamento no TTPa reflete a diminuição ou disfunção de um ou mais dos fatores citados ou a constatação de algum in ibidor que possa estar interferindo na reação, como, por exemplo, o anticoagulante lúpico. A composição dos diferences fosfolípides utilizados nos reagentes do TTPa varia consideravelmente e interfere na sensibilidade deste no diagnóstico das deficiências de fatores e de inibidores da coagulação. Usualmente é necessário que um fator isolado esteja com sua arividade próxima de 30% para que o TTPa se alargue. É recomendado que cada laboratório padronize seu TTPa, em níveis terapêuticos de anticoagulação com a heparina, localmente, correlacionando este com algum teste que mede a atividade da heparina diretamente (dosagem do anti X ativado ou titulação com o sulfato de protamina). Em algumas situações, quando o fator VIII está aumentado, tem-se TTPa falsamente normal mesmo diante da deficiência de algum outro fator.
Ensaios de mistura
Ensaios de mistura são utilizados para avaliar o TP ou TTPa alargados, que vão distinguir entre a deficiência de algum facor e a verificação de algum inibidor da coagulação. Nesse teste, mistura-se o plasma normal com o plasma do paciente na proporção de 1:1 e em seguida realiza-se o teste que havia sido previamente alterado, imediatamente e após incubação por 30, 60 ou 120 minucos a 37°C. Quando há deficiência de algum faror da coagulação, o ensaio de mistura é normal imediatamente e após incubação. Na presença de algum anticorpo ad-
3SO [ Medicina laboratoria l para o clínico Jf---- - -- - - - - -- - - -- - -- - - - - - - - - - -
quirido contra fatores da coagu lação, o ensaio de mistura
CORRELAÇÃO CLÍNICO~LABORATORIAL
vai permanecer alrerado, principalmente após o período de incubação a 37°C.
Fibrinogênio
PACIENTES COM HISTÓRIA DE SANGRAMENTO, TTPA E T P PRO LONGADOS
Doenças congênitas
Teste de Clauss: grandes quantidades de trombi-
Deficiências congénitas dos fatores da coagulação que
na são adicionadas ao plasma a ser testado de form a
compõem a via comum vão prolongar o TTPa e em maior
que a reação ocorra independente da quantidade de
imensidade o TP. As deficiências dos fatores I (fibrinogên1o),
trombina presente na amostra. Vá rias diluições são
11
realizadas para aumentar a sensibilidade do teste em
recessivo. Nas disfibrinogenemias, como na deficiência do
(protrombina), V e X são raras e de carácer autossômico
qualquer nível de inibidores (hepari na e produtos de
fibrinogênio, o tempo de trombina encontra-se alargado.
degradação de fibrina). O mesmo procedimento é
Ao contrário dos pacientes com defiCiência congén ita, os
realizado com um plasma sabidamente normal e as
pacientes com disfunção congênica do fibrinogênio (disfi-
curva s das diluições são comparadas para que se ob-
brinogenemias) apresentam, em aproximadamente 50% dos
tenham resultados nu m éricos. Esse teste é capaz de
casos, fenômenos rromboembólicos e não sangramenro.
detecta r as deficiências quantitativas e fu ncionais do fibri nogên io.
Doenças adquiridas Tempo de t rombina (TT)
Os inibidores da coagulação relacionad os aos fatores da via co mum da coagulação são ra ramente encontra-
Ava lia a formação do coágulo após a adição de trom -
dos. O mais com um desces é o inibidor contra o faror V,
bina ao plasma citratado. Reflete a ação da rrombina sobre
que se manifesta após o uso d a crombina bovi na tó pica
o fibrinogênio durante a formação de fibrina. A crombina
(utilizada em procedimentos odonrológicos), quando
quebra o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídios A e
anticorpos contra o fator V humano são desenvolvidos
B, formando os monômeros de fibrina que reagem entre
por reação cruzada. Raramente pacientes portadores d e
si e formam os polímeros de fib rina. O prolongamento no
anticoagulante lúpico desenvolvem a deficiência do fa-
tempo de rrombina reflete a deficiência ou anormalidade
tor 11 com manifestações clínicas importantes. A am iloi-
à deficiência d os fatores da coagulação
estrutural do fibrinogênio. Este estará alterado nas hipo-
dose pode levar
fibrinogenemias ou disfibrinogenemias familiares, em pa-
vitamina K dependentes, 11, VIl, IX e X, mais comumente
à absorção d esces fatores pelas fibras
cientes com manifestações de coagulação inrravascular
o fator X, d evido
disseminada ou em pacientes com insuficiência hepática
amilóides. Outras alterações adquiridas que p odem
avançada. As gamopatias monoclonais, principalmente
prolongar o TP e TTPa são: coagulação incravascular
por lgM ou lgA, podem alargar o Tl por interferir na
disseminada, insuficiência hepática, paraproteinem ias e
polimerização d a fibrina. Clin icamen te, o inib idor mais
terapia com heparina o u anticoagulante oral.
importante que causa o alargamento do TT é a heparina não fracionada. O tem po de repti lase pode ajudar a diferenciar o alargamento de TT, já que o veneno de cobra
PACIENTES COM H ISTÓRIA DE SANGRAMENTO,
utilizado como acivador da reação (Bothrops atrox) induz
TTPA PRO LO N GADO E T P NORMAL
a formação do coágulo de fibrina, agind o direcamenre sobre o fi brinogênio, como a rrombina, mas, diferentemen-
Doenças congênitas
te desta última, não sofre interferência da heparina. Logo, um tempo de rrombina alterado com tempo de reptilase normal sugere heparina na amostra.
Esta categori a inclui as hemofilias clássicas (deficiência do fator VIII e IX) e a deficiência do faror XI. As
Investigação laboratorial do paciente com distúrbio hemorrágico
351
hemofilias A e B são indistinguíveis em suas apresentações e manifestações clínicas, sendo a primeira (deficiência do fator VIII) quatro a cinco vezes mais comum que a segunda. Aproximadamente 30% das hemofilias são devidas a novas mutações, logo, com história famil iar negativa para a doença. Os sinais e sintomas surgem logo após o nascimento, principalmente nos pacientes com hemofilia grave ou moderada (atividade dos facores VIII ou IX menor que 1% e entre 1 e 5%, respectivamente), já os pacientes com hemofilia leve (fatores VIII ou IX entre 5 e 30%) apresentam sintomas apenas quando expostos a situações de estresse hemorrágico. A doença de von Willenbrand (DvWb) foi descrita em 1926 por Erik von Willebrand, pediatra finlandês. É a doença hemorrágica congénita mais prevalente, encontrada em 1 a 2% da população geral. Porém, em estudos com base nos sintomas hemorrágicos, a prevalência da doença foi de 30 a 100 casos por milhão, semelhante à prevalência da hemofilia A Esta grande diferença de prevalência se deve ao fato de que a DvWb é muitas vezes oligossintomática e pode passar desapercebida durante toda a vida. O fator de von Willebrand (FvWb) é sintetizado pelo endotélio e megacariócitos e é fundamental para a adesão plaquetária ao endotélio lesado. Além disso, é responsável também por estabilizar e transportar o fator VI II na circulação. As principais manifestações clínicas decorrentes de sua deficiência estão relacionadas a defeito na fase primária da hemostasia (equimoses, epistaxe, gengivorragia e hipermenorréia) e à diminuição dos níveis de facor VIII circulante (sangramento aumentado pós-estresse hemostático: cirurgias e traumas). O fator VI II não carreado pelo FvWb torna-se mais suscetível à proteólise, tendo por isso sua meia-vida encurtada na deficiência do FvWb, o que acarreta nível sérico diminuído. A DvWb é dividida em três grandes subtipos: Tipo 1 - corresponde a 60 a 80% dos casos e é caracterizado por deficiência quantitativa leve a moderada do fator de von Willebrand. Tipo 2 - representa 10 a 30% dos casos e é caracterizado por apresentar defeitos qualitativos no fator de von Willebrand. É subdividido em quatro grupos: 2A - com ausência dos grandes multímeros; 2B - que apresenta alta afinidade do FvWb às plaquetas e ausência dos grandes multímeros; 2M - com defeito qualitativo do FvWb sem associação com deficiência
de multímeros; 2N - com defeito no "sítio" de ligação do FvWb com o fator VIII. Tipo 3 - representa 1 a 5% dos casos e é caracterizado por deficiência quantitativa grave do fator de von Willebrand, que se encontra em nível inferior a 1% e com dosagem de fator VIII entre 1 e 10%. Por isso, a doença de von Willebrand tipo 3 apresenta manifestações hemorrágicas como nas hemofilias, porém com o agravante de o defeito também envolver a hemostasia primária. Na grande maioria dos pacientes portadores da doença de von Willebrand, o TTPa está normal, apenas nos pacientes com tipo 3 da doença e com o tipo 2N pode-se encontrar o TTPa prolongado.
Doenças adquiridas
O distúrbio adquirido mais comum com estas características é a presença de inibidores contra o fator VIII da coagulação. Inibidores contra os fatores IX e XI são raramente descritos. Mais comumente encontrado em idosos (média de idade 61 anos), pode estar presente em crianças e adultos jovens, principalmente no período pós-parto. Difere da hemofilia congénita na apresentação clínica por manifestar sangramentos musculares e equimoses mais freqüentemente do que hemartroses (sangramento característico do hemofílico). Inibidores adquiridos do fator de von Willebrand também justificam TTPa alargado. Ocorrem em associação a doenças auto-imunes, lifoproliferativas, mieloproliferativas, hipotireoidismo e alguns medicamentos.
PACIENTES COM HISTÓRIA DE SANGRAMENTO, TP PROLONGADO E TTPA NORMAL Doenças congênitas
A deficiência do fator VIl classicamente produz esse quadro. Provavelmente, são necessários apenas 10 a 15% de atividade do fator VIl para que a hemostasia se processe adeq uadamente. A história de manifestações hemorrágicas é extremamente variável. Em pacientes com deficiência grave têm-se sangramento intra-articular, hematomas musculares, assim como sangramento cutâneo-mucoso. Nem sempre o risco de sangramen-
352 ( M edicina laboratori al para o cl ínico )~-----------------------------
w esrá direramenre relacionado aos níveis de faw r Vil, já que alguns pacientes apresentam, associado à deficiência quantitativa, alterações da função do faror VIl. Pacientes com deficiência leve do faror VI/, apesar de apresentarem o TP prolongado, não têm risco de sangramemo aumentado.
Doenças adquiridas
O TP é mais sensível do que o TTPa e por este motivo altera-se mais precocemente nos pacientes com insuficiência hepática ou deficiência de vitamina K. Essa maior sensibilidade se deve ao faro de que o faror VI l é de síntese exclusiva hepática e com meia-vida curta, de aproximadamente sete horas. Em geral, quando a insuficiência hepática ou a deficiência de vitamina K é grave o suficiente para causar sangramentos, o TTPa também já se encontra alargado.
Doenças adquiridas
Drogas, suplementos nutricionais e o estado urêmico são capazes de interferir na função plaquerária e precipitar manifestações hemorrágicas.
PACI ENTES SEM HISTÓRIA DE SANGRAMENTO, COM TESTES DA COAGULAÇÃO ALTERADOS Doenças congê nitas
As deficiências do faror XII, pré-calicreína e cininogênio de alro peso molecular levam ao prolongamento do TTPa sem qualquer manifestação hemorrágica. Como citado anteriormente, pacientes com deficiência leve do fator VIl (usualmente acima de 20%) apresentam o TP alargado, sem man ifestações hemorrágicas.
Doenças adquiridas
PACI ENTES COM HISTÓRIA DE SANGRAMENTO, TS PROLONGADO, PLAQUETOMETRIA NORMAL, TP E TTPA NORMAIS Doenças congênitas
Estes são os pacientes portadores de plaquecopatias envolvendo disfu nções plaquetárias intrínsecas, mais comumente por deficiência de gl icoproteínas de membrana ou defeitos na secreção plaquetária. A DvWb tipos 1, 2A, 28, 2M também compõe esse grupo. Em geral, são pacientes com sangramento do tipo cutâneomucoso e com história familiar positiva ou não. No caso de DvWb, apesar da história de sangramento bem documentada, o paciente pode apresentar codos os testes para a avaliação da hemostasia normais, mesmo os específicos para a doença. Por ser uma proteína de fase aguda, os níveis séricos do FvWb podem estar normais em pacientes com DvWb em vigência de qualquer processo inflamatório, após exercício físico vigoroso e após estímulo ad renérgico. Seus níveis variam também de acordo como o ciclo menstrual e com o uso de anticoncepcional oral. Para que o diagnóstico da DvWb seja confirmado, muitas vezes é preciso repetir os exames específicos para a doença algumas vezes.
O anticoagulante lúpico é capaz de alargar o TTPa sem risco aumentado de sangramento. Na verdade, são pacientes com risco aumentado de fenômenos tromboembólicos, principalmente quando exposros a grandes cirurgias, períodos de imobilização prolongada, terapia de reposição hormonal feminina e gestação. Não raramente, pacientes que apresentam TTPa alargado sem sangramenro assooado procuram avaliação com o hemarologista para a realização de preparo pré-operatório, com o objetivo de diminuir a chance de sangramento durante a cirurgia e deixam o consultório com indicação de profilaxia para trombose devido a presença de anticoagulame lúpico.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante de um paciente com <..J Ueixa de sangramento, é importante verificar a importância clínica desse evemo e se corresponde a um distúrbio do sistema hemostático. A Tabela 30.1 reúne, de forma sintética, as principais situações clínicas geradoras de sangramento, as man ifestações hemorrágicas ma1s freqüemes e os resultados esperados para os testes laboraroriais de triagem para estudo da hemostasia.
Investigação laboratorial do paciente com distúrbio hemorrágico
353
Tabela 30.1 -Correlação entre as principais situações clínicas geradoras de sangra menta, suas ma nifestações hemorrágicas
e
os resultados esperados nos testes labo ratoriais de triagem para estudo da hemostasia
Situações clín icas
Manifestações hemor rágicas mais freqü entes
Plq
TS
TP
TIPa
TT
Fb
nl
nl
nl
i
nl
nl
Adquiridas Uso de AAS
equimoses
nl
nl
n/
Uso de heparina
equimoses
nl
nl
nl ou
Uso de Warfarina
eq uimoses
nl
nl
i
nl ou
i
nl
nl
Deficiência de Vitar11inu K
equimoses, epista xe, hematomas
nl
nl
i
nl ou
i
nl
nl
Insuficiência Hepática
eq uimoses, hematomas
!.
i
i
i
i
!.
Insuficiência Renal
equimoses
nl
i
nl
nl
nl
nl
Coagulação lntravosculor Disseminada
petéqu ias, equimoses, geng ivorragio, epistaxe, he matomas, hemotúria
!.
i
i
i
i
!.
Púrpura Trombocitopênica Imunológico
petéquias, equimoses, gengivorragia e epistaxe
!.
i
nl
nl
nl
nl
Leucemia aguda
petéquias, equimoses, geng ivorragio, epistoxe e sangramento SNC
!.
i
nl
nl
nl
nl
Vasculites
Petéquias e equimoses
nl
i
nl
nl
nl
nl
Inibidores adquiridos dos fa tores VIII, IX e XI
hematomas musculares e hemartroses
nl
nl
nl
i
nl
nl
Inibidor adquirido do fator VIl
hematomas musculares e hemortroses
nl
nl
i
n/
nl
nl
Doença de Von Willebrond
equimoses, gengivorragio, e menorrogio
nl
i
nl
nl
nl
Hemofilias
Hemartroses e hematomas
nl
nl
nl
i
nl
nl
Deficiência do fator Vil
hematomas musculares e hemortroses
nl
n/
i
nl
nl
nl
Disfibrinogenemias e hipofib rinogene mias
hemato mas musculares
nl
n/
i
i
i
i
Vasculopatios
petéquias e equimoses
nl
i
nl
nl
nl
nl
Ploquetopotios Congénitos
equimoses
nl
i
nl
nl
nl
nl
i
Congénitas nl ou
i
Plq: plaquetas; TS: tempo de sangramenw; TP: tempo de prouombma; TTPa: tempo de tromboplastina parcial; TT: tempo de trombrna e Fb: flbrinogênio.
REFERÊNCIAS l
Bom bel i T, Spahn DR. Updates in perioperative coagula-
2.
tion: physiology and management o f thromboembolism and haemorrhage. 2004;93(2):275-87 Colman RW, Clowes AW, George }N, Goldhaber SZ, Mard-
4.
haber SZ. Hem osrasis and t hrombosis: basic principies & clinical prac tice. sth ed. Philadelphia: Lippincott Williams
er V} . Overview of Hemosrasis. ln: Colman RW, Marder V}, Clowes AW, George }N, Goldhaber SZ. Hemosrasrs and thrombosis: basic principies & clinical practice. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & W ilkins; 2006. p. 3-16. 3. Greaves M, Wat son HG. Approach to diagnosis and managemem of mild b leeding d isorders. J Thromb Ha-
Kon kle AB Clinical Approach co the Bleeding Patienr. ln: Colman RW, Marder V}, Clowes AW, George }N, Gold-
S. 6.
& Wdkrns; 2006. p. 1147-58. Mannucci P M. Treatmem of von W illebrand 's d isease. N E}M 2004;351:683-94. Rodeghiero F, Tosetco A. Casraman G. How co estimare b leeding risk in mild bleed ing d isorders. } Thro mb Haemost. 2007; 5 suppl1:157-66
emosr. 2007;5 supp/ 1:166-74
354 [ Medicina laboratorial para o clínico
)1--- - - - - - - - -- - - -- -- - -- - - - - - -- -- - -- -
Daniel Dias Ribeiro
31
Ana Flávia Leonardi Tibúrcio Ribeiro
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM TROMBOFILIA
O termo trombo filia é definido como predisposição a desenvolver trom bose em conseqüência de alterações em qualquer parte do sistema hemostático (endotélio, plaquetas, fatores pró-coagulantes, fatores anticoagulantes, fatores pró-fibrinolíticos e fatores antifibrinolíticos), adquiridas ou congênitas.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Três tipos de manifestações clínicas são descritos em portadores de alterações na hemostasia que levam os pacientes a um estado de hipercoagulabilidade: • tromboembolismo venoso; • tromboembol ismo arterial; • complicações gestacionais como abo rtamento de repetição, perda gestacional após a 10• semana sem causa obstétrica, com feto morfologicamente normal, doença hipertensiva específica da gravidez, entre outr2s. Independentemente de qual seja a manifestação clínica do paciente, o estudo das trom bofilias só deverá ser realizado quando se tem um exame confirmatório do episódio clínico. É freq üente o hematologista aval iar pacientes com suspeita clínica não confirmada de trombose venosa profunda encaminhados para a investigação de trombofilia. Sabe-se que a sensibilidade e especificidade do diagnóstico clínico para as tromboses venosas
são de aproximadamente 30%. Logo, em 70% das vezes a ausência do diagnóstico preciso leva a uma investigação desnecessária.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL
Durante os últimos anos, as rrombofílias contribuíram substancialmente para aumentar a demanda sobre os laboratórios clínicos para restes que avaliem a hemosrasia. Antes de 1993, apenas 5 a 15% dos pacientes com trombose apresentavam alguma alteração da hemostasia que pudessem explicar o desenvolvimento de fenômenos tromboem bólicos. As descobertas do fator V de Leiden (resistência à proteína C), a mutação no gene da protrombina e a hiperhomocisteinemia modificaram esse cenário. Diferentemente das deficiências de antitrombina, proteínas Se C que estão presentes em menos de 5% dos pacientes com trombose e em menos de 1% na população geral, o fator V de Leiden está presente em 25% dos pacientes com trombose e em 5% da população em geral e a mutação do gene da procrombina em 10% dos pacientes com trombose e em 3% da população em geral. Entretanto, essa investigação nem sempre está indicada, pois não basca que o paciente apresente algum fenômeno tromboembólico para que a propedêutica seja realizada. Alguns pontos são de extrema importância ames de se iniciar a avaliação laboratorial das trombofilias: quais são candidatos, o momento e o local ideal
dos testes, o método a ser utilizado e a melhor estratégia para um cusro-benefício favo rável.
PO R Q UE ESTUDAR AS TROMBOF ILI AS? A propedêutica deve ser realizada somente quando seus resultados puderem interferir na conduta médica. No campo das trombofilias. esses resultados não 1rão modificar a conduta imed1ata com o paoente. Pacientes com trombose devem ser conduzidos durante o quadro inicial de fo rma idêntica, independentemente de terem o u não alguma trom bofilia. Cada caso é avaliado individualmente quanto ao risco de recorrência da trombose e de sangramento associado à anticoagulação oral e a cond uta será manter o u não o anticoagulante. O estudo das trombofilias é um dos marcadores de risco para recorrência da trombose. Alguns aurores classificam as uombofilias como baixo e alto risco de recorrênc ia. Nas trombofilias de alto risco. na maio ria das vezes, a anticoagulação é por tempo indeterminado. Consideram-se alto risco de retrombose os portadores de homoz1gose para alguma mutação, dupla heterozigose, SAAF (Síndrome do anticorpo antifosfolípide) e deficiência de antit rombina. As defic1ências das proteínas C e S são consideradas. por alguns aurores. como alto risco e por outros como ba1xo risco. Do ponto de vista dos aurores. estas duas últimas deficiências devem ser tratadas como de risco intermediário e a presença destas, isoladamente, não 1nd1cana o tratamento po r tempo indeterminado. As demais cro mbofilias são tratadas como baixo risco de retrombose e na maioria das vezes há indicação de se suspender a ant1coagulação com seis meses a um ano de tratamento. No momento da avaliação para a suspensão da terapia, levam-se em consideração: a presença ou não de fatores desencadeantes para a trom bose, o local da trombose, a idade do pacientes. a história de trombose na família. a seqüela de trombose no sítio acometido, os valores do dímero D um mês após a suspensão da anticoagulação, as s1cuações de risco de trombose a que o paciente foi exposto no passado e o risco de sangramemo associado ao anticoagulante. Muitas vezes a decisão sobre a suspensão ou não do uatamento deve ser tomada em conjunto com o paciente.
356 ( Medicina laboratorial para o clínico
A existência das trom bofilias é im portanre para os parentes de primeiro grau dos pacienres que apresemam a lguma uom bofilia congênita documentada, sendo estes os possíveis portadores assintomáticos. Nestes, a profilaxia p rimária deve ser oferecida em situação de risco de trombose, lndependememenre da idade (em geral ac1ma de IS anos d e idade). A gestação, o pós-parto, assim como o uso de anriconcepcional o ra l e a terapia de reposição hormonal por si só aumentam o risco de trombose e a orientação para esses pacientes é realizada de acordo com o tipo de trombofil ia encontrada. Devido à alta incidência d o fator V de Leiden e do gene mutante da protrombina, um inapropriado screening em pacie ntes assintomáticos passou a ser rea lizado. O alvo desta pesqu isa fora m as pacientes sadias que estavam iniciando o uso do a miconcepcional o ral. O custo-benefício desse screening foi altamenre desfavorável. Com o objetivo de prevenir um episód io de trombose por ano, o anticoncepcional o ral deve ser evi tado em 400 mulheres portadoras do fa tor V de Leiden e. para encontrar este número de portadoras, aproximadamente 10.000 m ul he res assintomáticas devem ser testadas. Deveriam ser estuados dois milhões de mulheres assintomáticas a fim de se evitar uma m orte por trom boembolismo pulmonar por ano.
QUEM SÃO OS PACIENTES ELEITOS PARA O ESTUDO DAS TROMBOF ILIAS? Mesmo que a prevalência de uma trom bofilia seja muito elevada, sua pesquisa não é justificável na população assintomática. A investigação de rodas as uombofilias conhecidas é indicada para todos os pacientes com episódio de tromboembolismo venoso idiopática e com menos de 50 anos. Apesar da 1dade e da presença o u não de algum faror desencadeame serem importantes quando se avalia o risco de recorrên cia da trombose. estes não são vistos como fatores li m itantes para a ind icação de se escudar ou não as trombofilias. Os pacientes podem ser divididos em dois gru pos: os fracamente trombofílicos e os altamente trombofílicos. Os fracamente t rombofílicos são aq ueles acima
de 65 anos, com um fawr de risco bem documemado, sem trom bose recorrente, história familiar negativa para trombose e obstruções em locais usuais (membros inferiores ou nos pulmões), nos quais a pesquisa laboracorial de uombofilia é desnecessária. Os altamente trombofílicos são os que apresentaram fenômeno tromboembólico ames dos 50 anos, com história familiar positiva para trombose (parentes de primeiro grau) ou com quadro de trombose de repetição. Alguns pacientes não se encaixam em nenhum dos dois grupos e a literatura não é clara na maneira como estes pacientes devem ser abordados, sendo assim, cada caso deve ser avaliado individualmente. Pacientes com complicações gestacionais com indicação de estudo para trombofilias são: a) aqueles com três ou mais abortamentos ames da 10 • semana de gestação, sem causa apareme; b) uma ou mais mortes feta is, de fetos morfologicamente normais, após a 10• semana de gestação; e c) um ou mais parcos prematuros. ames da 34 3 semana de gestação, de fetos morfo logicamente normais, devido à insuficiência placentária, pré-eclampsia ou eclampsia. A força de associação dessas complicações gestacionais é bem estabelecida com a SAAF, o que não ocorre com as demais uo mbofilias. Entretanto. atualmeme. ainda há indicação de se estudar rodas as trombofilias conhecidas nessas mulheres. Nos pacientes com quadro de trombose arterial sugere-se a seguinte conduta: em jovens com facores de risco para doença arterial (fumo, dislipidemia, obesidade, diabetes melito, sedentarismo e hipertensão arterial) deve-se pesquisar a SAAF, a hiper-homocisteinemia e os níveis do fator VIII. já em jovens sem facores de risco para doença arterial, o screenmg compleco deve ser realizado.
QUAL O MELHOR MOMENTO PARA SE INVESTIGAREM AS TROMBOFILIAS? O quadro agudo do trom boembolismo venoso Interfere nos resultados dos exames (exceco nos testes que utilizam análise molecular do DNA). Os testes realizados no plasma (dosagens de antitrombina, proceína S e C e resistênoa à proceína C ativada) estão indicados após quatro a seis meses do fenômeno
Investigação laborato rial do pacie nte com tro mbo fi lia
rromboembólico. O uso do anricoagulame oral inrerfere nas dosagens das proceínas C e S (vitamina K dependentes) e na verificação da resistência à proteína C ativada. São necessárias no mínimo duas semanas de suspensão do anricoagulante oral para que essas dosagens possam ser realizadas com segurança. Agestação, os dois primeiros meses do pós-parco, o uso de anticoncepcional oral e a terapia de reposição hormonal também interferem nas dosagens dos anticoagu lantes naturais (ami rrom bina. proteína S e C). O uso das heparinas diminui os níveis de amitrombina e positiva a pesquisa do anticoagulante lúpico. A resposta inflamatória secundária ao fenômeno tromboembó lico pode imerferir na pesquisa da SAAF, positivando as dosagens das cardiolipinas e da 13-2 gllcoproteína I. Estas devem ser pesquisadas após o primeiro mês da trombose. Para que o diagnóstico da SAAF seja confirmado, é necessário que os critérios clínicos e laboratoriais sejam preenchidos. Duas dosagens positivas com imervalo de 12 semanas das cardiolipinas. da 13-2 gl icoproteína I ou do anticoagulante lúpico são necessárias pa ra confirmação do diagnóstico, sendo que as dosagens das cardiolipi nas lgM ou lgG devem ser iguais ou superiores a 40 MPL e 40 GPL, respectivamente. O Quadro 31.1 sintetiza os principais facores determinantes do momento de investigação das trombofilias.
QUAL O LABORATÓRIO IDEAL PARA A REALI ZAÇÃO DOS TESTES PARA TROMBOFILIAS? Laboratórios especializados em hemostasia são os mais adequados para essas pesquisas. São testes caros, em geral mal remunerados pelo sistema único de saúde e pela maioria dos convênios, o que, muitas vezes, inviabiliza a realização em laboratórios que têm pequena demanda de exames para a aval1ação das uombofilias. O volume de exames realizados pelo mesmo laboratório é importante para diminuir o número de controles e calibradores utilizados, por d1minuir a perda de reagentes que, uma vez colocados em uso não, podem ser guardados; e por aumentar a experiência do serviço, que possui várias particularidades técnicas. É de extrema imponância a correlação laboratorial com o quadro clín1co.
357
Quadro 31.1 - Fatores que interferem e determinam o mamemo de investigação laboratorial das trombofilias Tipo de exame laboratorial
Fatores interferentes
Momento adequado para real ização
Dosagem plasmático de onlilrombino, proteínas Tromboembolismo agudo C, S e pesquiso de resistência à proteína C oliva do
4 o 6 meses após o fenômeno lromboembólico
Dosagem plasmático de proteínas C. S e pesquiso de resistência à proteína C olivedo
Uso de anticoogJionte oral
Mínimo 2 semanas após suspensão do cn ticoagulcnte oral
Dosagem plasmático de onlilrombino, proteínas C e S
Gestação, os deis p rimeiros meses do pós-porto, uso de anticoncepcional oral e terapia de reposição hormonal
Dosagem plosmólico de ontitrombino e pesquiso de anticoagulante lúpico
Uso de heporina
Após suspensão do heporina
Dosagem de cordiolip inas e (:1-2 glicoproteíno I
Trombo embolism:::J agudo
l mês após o fenômeno tromboembólico
Testes moleculares para análise do DNA
Não sofrem esses interferência s mencionados
QUAIS TESTES DEVEM SER REALIZADOS NO ESTUDO DAS TROMBO FILIAS? Os pacientes considerados de risco para rrombofilias, os altamente trombofílicos, devem ser pesquisados sobre rodas as alterações da hemosrasia que sabidamenre predispõem à trombose. por meio dos restes: resistência à proteína C arivada, faror V de Leiden, mutação da protrombina, homocisteina, síndrome do anticorpo anrifosfolípide, deficiências de antirrombina, proteína C e S e dosagem do faro r Vlllc. Situações clínicas não relacionadas direramente com a coagulação, mas que podem interferir na hemostasia, são: disfunções renal e hepática. doenças auto-imunes, doenças mieloproliferativas e, em casos selecionados, como dos pacientes com trom bose de veia hepática e de veia porta, indica-se a pesquisa da hemoglobinúria paroxística norurna por citometria de fluxo. Nos fracamente trom bofílicos, pesquisam-se apenas as trombofilias adquiridas e as trombofilias congênitas mais comuns. Aqui também é importance pesquisar as sicuações clínicas não relacionados diretamenre com a coagulação, mas que podem interferir na hemosrasia.
MONITORIZAÇÃO LABORATORIAL DA ANTICOAGULAÇÃO ORAL
Há mais de 50 anos os cumarínicos ou antagonistas da vitamina K(AVK) são os principais anticoagulantes orais. Sua eficácia foi estabelecida a partir de estudos bem dese-
358 [ Medicina laboratorial para o clínico
nhados para a prevenção de: rromboembolismo venoso, rromboembolismo em pacientes com prótese de valvas cardíacas ou fibrilação arriai, pacientes com alto risco de infarro agudo do miocárdio (IAM), acidente vascular cerebral, infarro recorrente ou morre em pacientes com IAM. O uso dos AVK é um desafio para a prática clínica, pelas seguimes razões: presença de janela terapêutica estreita, dose-resposta variável entre os indivíduos, interações com drogas e alimentos, controle laboratorial de difícil padronização, problemas de não adesão ao tratamento e dificuldade de comunicação entre o paciente e o médico.
MECANISMO DE AÇÃO DOS ANTI COAGULANTES ORAIS Os AVKs produzem o seu efeito anticoagulante por interferirem no ciclo da vitamina K. A enzima vitamina K epóxido-redutase, uma das responsáveis pela "redução" da vitamina Ko em vitamina K1, é bloqueada pelos AVKs. Desta maneira, não há a formação de vitamina K2, a principal responsável pela gamacarboxilação do N terminal nas proteínas vitamina K-dependenres. Sem a gamacarboxilação, estas proteínas são não funcionais, ou seja, na presença de AVKs ocorre síntese de proteínas, porém não funcionames. O efeito dos AVKs pode ser antagon izado por pequenas doses de vitamina K1 . Esta, em excesso, acumula-se no fígado e pode fazer com que os paciences se tornam resistentes aos AVKs por até uma semana. As proteínas da coagulação vitaminas K-dependentes são: os
farores pró-coagulames 11, VIl. IX e Xe os amicoagulames na curais prmeínas C e S. Devido ao fator 11 possuir meia-vida de 96 horas e a proteína C de sete horas. nas primeiras 96 horas há diminuição dos níveis séncos desse amicoagulame nacural (proteína C) sem a diminuição do principal
pró-coagulame (rrombina - faror 11), estabelecendo-se estado de hipercoagulabi lidade. Por este motivo a heparina deve ser associada por no mínimo onco dias no início da anc1coagulação com AVK, sendo retirada após dois dias consecutivos com o AVK em níveis terapêuticos.
Tabela 31.2 - Ajuste da dose de manutenção da warfarina. RNI alvo de 2,0 a 3,0 RNI
Ação
1,1 o 1.4
Aumentar em 20% o d ose
15o 19
Aumentar em 10% o dose
2,0 o 3,0
Sem alteração
3,1 o 3,5
Diminu•t em 10% o dose
> 3,5
Ver tabelo de hiperonticooguloçõo
AJUSTE DA DOSE DO ANTICOAGULANTE ORAL A monicorização dos AVKs é feita por meio do RNI (razão da normatização internacional), índice derivado do tempo de prmromb1na como tentativa de padronização interlaboratorial. Vá nos são os organogramas para o acompanhamento dos pacientes em uso de anticoagulante oral. O esquema a seguir é o utilizado no Ambulatório de Hemostasia do Serv1ço de Hematologia do Hosp1tal das Clínicas UFMG. Antes do 1nício da anticoagulação. é necessário conhecer o TTPa e RN I basal do paciente. A dose inicial da warfanna (AVK) é de 5 mg por dia nos adultos e de 0,2 rng/kg nas crianças. Os pacientes idosos podem se beneficiar de doses iniciais menores (2.5 mg/dia). A parm do segundo dia. o RNI é realizado diariamente até que se tenha, em dois dias consecutivos. um RN I na faixa desejada. O tempo mínimo de associação warfanna e heparina é de cinco dias. quando então se pode suspender a heparina. As Tabelas 31.1 a 31.7 apresenram as bases do controle do anticoagulante oral nas diversas situações do dia-a-d1a desses paoentes. Tabela 31.1 - Ajusre da dose da warfanna do segundo ao quarro dta de uso. R I basal de 1.0 a 1.3
Tabela 31.3- Ajusre da warfarina em caso de hiperanricoagulação. RNI alvo de 2,0 a 3,0 RNI
Ação
3.0 o 3,5
Diminuir em 10% o dose
3.6o Ll,O
Dtmtnutr em 20% o dose
<'l ,1 o 5,0
Diminuir em 25% o dose
51o60
Diminuit em 25% o dose Mo'lte• susoenso por 1 dia
6.1 o 7,9
Diminuir em 33% o dose Manter suspenso por 2 dias
>80
DimtnUir em 50'7~ o dose M anter suspenso por 3 dias
Tabela 31.4 - AjusLe da warfanna em caso de htperanricoagulação. RNI alvo de 3,0 a 4.0 RNI
Ação
<'l,1 o 5,0
Dim1nuir em 15% o dose
o 6,0
D'mlnui• em ?0% o cose
51
6 ,1 o
RNI
Ação
1,1 o 1,4
Repetir dose inicial
1,5 o 1,9
Adm1n1strar 50% do dose inicial
2.0o 3,0
Administrar 50% do dose inicial
3, 1 o 3,5
Adm1n1stror 25% do dose inicial
>3 5
Suspender o~é RNI < 3,5 e remicior com 50% do dose anterior
lnvesrigação laboratorial do paciente com trombofilia
> 8,0
7.9
Diminuir em 33% o dose Manter suspenso por 2 dias Dim.nuir em 50% o dose Mor•er suspenso por 3 d m
Pacientes com RN I acima de 6,0 devem ser acompanhados de perto com RNI diário. As tabelas devem ser usadas caso não haJa sangramenta ativo ou risco de sangramenro iminente.
359
Tabela 31.5 - Recursos milizados para a correção do RNI em situações de risco de sangramemo RNI
Vitamina K
6,0 a 8,0 sem sangramento ou com
2,5 mg via oral. Se for desejável a normalização do RNI em 24 a 48
sangramento menor
horas
> 8,0 sem sangramento
2,5 mg via oral.
> 8,0 com songromento menor ou risco
0,5 mg venoso ou 2.5 mg via oral
> 8,0 com sangramento Vitamina K 5 mg venosa PFC 20 ml/kg CCP 50 unidades/kg
maior
PFC: plasma fresco congelado; CCP: concentrado de complexo protrombíniCo (fatores 11, VIl, IX, e X).
Tabela 31.6 - Preparo de pacientes em uso de AVK para pequenos procedimentos cirúrgicos (pacientes sem trombofilia). Obter o RNI S a 7 dias antes do procedimento RNI
Ação
2,0 a 3,0
Suspender
3,0 a 4,0
Suspender 5 dias antes
> 4,0
Suspender 6 a
3 a 4 dios anles
7 dias antes
Tabela 31.7 - Preparo dos pacientes em uso de grandes procedimentos cirúrgicos
AVK
Tempo
Ação
Dia - 5
Suspender warforim HBPM dose terapêutica Heporina SC TTPo 1,5 o 2,5 o controle
para
Dia- 4 o dia - 1 Manter heparina. M onitorizar plaquetas e TTPa Dia - 1
Dia do cirurgia
HBPM ou heporina não fracionado em doses terapêuticas (último dose 24 horas antes do procedimento) Medidos mecõnicos. Dose profilótico de heporina 6 o 12 horas após o término do procedimento
Dia + 1
Observar sangromentos, se possível aumentar a heporina e iniciar AVK
Dia +2
Heporina em dose terapêutica e AVK
Dia +5
Ver RNI. Se 2 dias consecutivos no faixo terapêutico, suspender heporino
Se não houver sangram e mo, reiniciar a warfarina na tarde do procedimento cirúrgico. Repetir o RN I cinco a sete dias após a cirurgia. Caso haja risco aumentado de trombose, manter o paciente com dose terapêutica de heparina de baixo peso molecular (HBPM). Esta deve ser iniciada no dia da suspensão da warfarina e suspensa quando o RN I estiver na faixa terapêutica após a ci rurgia. No dia da cirurgia, o paciente deve receber dose profilática de HBPM após o procedimento, que deve ser realizado 24 horas após a última dose da HBPM (quando em doses te rapêuticas) e 12 horas após a última dose da HBPM (quando em doses profiláticas). No primeiro d ia pós-operatório, a dose de HBPM deve ser aumentada para dose te rapêutica e o anticoagulante oral reiniciado. O reajuste do anticoagulante oral deve ser realizado utilizando-se dose semanal. Ex: 5 mg por dia = 35 mg por semana. Aumento de 10% = mais 3,5 mg por semana; seis d ias da semana 5 mg e um dia 7,5 mg, evitar ao máximo dividir o comprimido em quarcos, mesmo que inviabilize o ajuste preciso. Todas as vezes que houver mudanças na forma de administração do anticoagulante oral, um novo RNI deve ser real izado sete a 10 dias após o início da nova dosagem. Esta conduta é a recomendada para os pacientes que já estão em uso do anticoagulante oral há algum tem po. Como a meia-vida do facor 11 (protrombina) é de 96 horas e este é o facor mais importante no risco de sangramento e retrombose nos pacientes anticoagulados, dosagens do RNI em intervalos inferiores a cinco dias vão refletir as mudanças ocorridas nos faco res VIl e IX, que possuem meias-vidas menores, e têm menos importância na anticoagu lação dos pacientes.
MONITORIZAÇÃO LABORATORIAL DA HEPARINIZAÇÃO
As heparinas são uma mistura heterogênea de glicosaminoglicanos que tiveram suas propriedades antitrombóticas descobertas há mais de 90 anos. Exercem seu efeico anticoagulante de maneira indireta, atuando sobre seu co-fator, a antitrombina. As heparinas se ligam à antitrombina levando a uma mudança na conformação da molécula, o que converte a antitrombina
360 ( Medicina laboratorial para o clínico )1--- -- - - - - -- -- - - - - -- - -- - - - -- - - - --
de um inibidor lemo da uombina a um inibidor extremamente rápido.
Esquema utilizado no Ambulatório de Hemostasia do Serviço de Hemarologia do Hospital das Clfnicas UFMG
MECAN ISMO DE AÇÃO DA HEPARINA
Pacientes adu ltos. Heparina não fraci o nada:
Heparina (5.000 Ul/ml ) - amp/5 ml As heparinas são heterogêneas no que d1z respe1w ao tamanho das moléculas. atividade anticoagulante e propriedades farmacocinéticas. Seu peso molecular varia de 3.000 a 30.000 dalrons, com média de 15.000, contando com aproximadamente 45 cadeias de monossacarídeos. Apenas um terço da dose adminisrrada se liga à antitrombina e é responsável pela maior parre do efeiro anticoagulante. Os dois terços restantes têm pouca atividade anticoagulante em doses terapêuticas, mas em alras concentrações podem exercer sua ação anticoagulante por intermédio do co-faror li da heparina. O complexo heparina antitrombina (HAT) inativa a trombina e os fa tores Xa, IXa, Xla e XI la. A trombina e o faror Xa são os mais sensíveis à ação do complexo heparina-anritrombina. sendo a trombina 10 vezes mais susceprível à inativação. Após a mudança na conformação molecular da antitrombina causada pela heparina. o faror Xa é inativado sem que haja necessidade de ligação com a molécula da heparina. Por outro lado, a inibição da trombina depende de uma tripla ligação (crombina. heparina e antirrombina). Esta é a diferença básica entre o mecanismo de ação das heparinas não fracionadas e as de baixo peso molecular (HBPM). As HBPMs inibem o faror Xa em proporções até quatro vezes maiores. que inibem a trombina exatameme por serem moléculas menores. em que não é possível que ocorra a tri pla ligação (moléculas com menos de 18 sacarídeos perdem a capacidade de se ligarem simultaneamente à trombina e anticrombina). A inibição limitada da trombina faz com que um dos testes usados para monirorizar a ação das heparinas perca sua sensibilidade quando doses terapêuticas de HBPM são usadas (o TTPa não se alarga durante o uso das HBPM).
AJUSTE DE DOSE DA HEPARINA Vários são os organogramas para o acompanhamento dos pacientes em uso de heparina (Tabelas 31.8 e 31.9).
Investigação laborato rial do paciente com trom bofil ia
Diluição padrão: 02 ampolas (50.000 Ul/10ml ) + 490 ml SF 0,9 %. 100 UI de heparina/ml. Dosagem: Ataque- 5.000 UI endovenoso em bólus. Manutenção - 18 UI/kg/hora (dose tmcial)
Esquema utilizado no Ambulatório de Hemos tas ia d o Serviço de He matologia do Hospital das Clín icas UFMG Pacientes pediátricos. Heparina não fra cionada: Ataque: 75 a 100 UI/ kg EV em bólus
Manute nção: 28 UI/ Kg/ hora < 2 meses de idade e 20 UI/Kg/ho ra > 2 meses de idade (dose inicial)
SUSPENSÃO E NEUTRALIZAÇÃO DA HEPARINA
No caso de cirurgias eletivas. as heparinas de baixo peso molecular devem ser suspensas 12 horas ames, quando em doses profiláticas, e 24 horas ames. quando em doses terapêuticas. As heparinas não fracionadas quando em doses terapêuticas e em infusão conrínua podem ser suspensas até seis horas antes do procedimento. Quando a via de administração for subcutânea. deve-se respeitar os mesmos intervalos das HBPM. As heparinas podem ser antagonizadas pelo sulfato de protamina, que forma um sal estável após sua liga-
361
ção com as heparinas. A dose utilizada é de 1 mg de sulfaro de proramina para cada 100 UI de heparina. O cálculo da dose deve levar em coma a meia-vida das diferences heparinas. A heparina não fracionada tem meia-vida de aproximadameme 60 minuros. Logo, a cada hora que passa do mamemo da sua adminisuação, a dose de protamina deve ser diminuída pela metade. Quando a HBPM for utilizada, a dose é de 1
mg para cada 100 UI de amifaror Xa nas primeira oiro horas após a adminisuação. A partir de emão, a dose de proramina deve ser diminuída. Como a ligação da protamina com a heparina depende do tamanho da molécula, a inativação das HBPM não ocorre por completo, apenas 60% da sua acividade amifator Xa é amagonizada. Em algumas raras siruações o plasma fresco congelado pode ser utilizado.
Tabela 31 .8- Normograma para ajuste de dose de heparina não fracionada, para adultos TIPa (paciente/controle)
Repetição bólus
Parar infusão
Alterar a infusão
Próximo TIPa*
< 1,20
5000 ui
não
t 200ui/h (-2ml/hl
em 6 horas
1,21 o 1,49
2500 ui
não
t 150ui/h (-1 ,5rnl/hl
em 6 horas
1,50 o 2,50
não
não
Não
manhã seguinte
2,5 1 o 3,00
não
não
~ 100ui/h (-1ml/hl
em 6 horas
3,01 o 3,70
não
30 min
~ 150ui/h- (1,5ml/h)
em 6 horas
> 3.70
não
60 min
~ 200ui/h (-2ml/hl
em 6 horas
• Primerras 24 horas TTPa de 616 h independenterneme do resultado amerior.
Tabela 31.9- Normograma para ajuste de dose de heparina não fracionada em pediat ria TTPa (paciente/controle)
Repetição bólus
Parar infusão
A lterar a infusão
Próximo TTPa•
< 1,20
100 UI I kg
não
t 4 UI/kg/hora
em 6 horas
1,21 o 1,49
50 UI I kg
não
t 2 UI/kg/hora
em 6 horas
1,50 o 2,50
não
não
Não
manhã seguinte
2,5 1 a 3,00
não
não
~ 2 UI/kg/ hora
em 6 horas
3,01 o 3,70
não
30 min
~ 3 UI/kg/hora
em 6 horas
> 3,70
não
60min
l 4 UI/kg/hora
em 6 horas
' Prrmeiras 24 horas TTPa de 616 h independemememe do resultado amerior .
362 [ Medicina laboratorial para o clínico )1-- - - -- -- -- - -- - - - -- -- - -- - -- -- - --
Kamph01sen PW. Lensen R. Howmg·DUistermaar Jl. Eikenboon J(J, Harvey M. Hemab1hry of elevated facror VIII anngen leveis 1n factor V Le1den fam1hes w1th trom· boph1ha. Br J Haematol. 2000,109519-22 10. Kraa,Jenhagen RA. m't Anker PS. "-oopman MM, Re1rsma PH, Pnns M H, van den Ende A. H1gh concentranon of facwr Vlllc IS a maJOr nsk factor for venous thromboem-
9 Protocolo utilizado no Ambulatório de Hemostasia do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas UFMG Sulfato de protamina:
Adm1nisrrar por v1a endovenosadura me 20 mmuros. de· v1do ao nsco de hipotensão e anafilaxia; Mon1rorizar com TTPa ames, imediatamente depo1s e 2 horas após a adm1mstraçào da Proramma Heparina EV com ínua: Calcular a quantidade de heparina 1nfund1da nas úk i· mas 6 horas, levando em conta a meia-v1da de 60 minutos e deste valor calcular a quamidade de protamina a ser adm1n1strada Heparina EV em bólus ou subcutânea: Imediatamente depo1s ..... 100% da dose 60 m1n depo1s -+ 50% da dose 120 min depo1s -+ 25% da dose 180 mm depo1s ..... 12,5% da dose
REFERÊNCIAS 1.
Allaan CF. Poort SR. Rosendaal FR, Re1csma PH, Bernna RM. Bnet E. lncreased nsk of venous rhromboSIS 1n carners of hered1rary prote1n C def1oency defect. Lancet. 1993.34 1:134·8. 2. Beruna RM. Genetic approach w rhromboph1ha. Thromb Haemost. 200 1;86:92-103 3 De S:efano V, Ross1 E. Paoaron1 "-· Leone G. Screenmg for mhemed rhromboph1ha: md1cauons and therapeuuc mphcar1ons. Haemarolog1ca 2002:87:1095-108. '' Dolan G. Neal K. Cooper P. Brown P. Preswn FE Prorem C. anmhromb1n III and plasm1nogen. effect of age, Sex and blood group. Br l Haemawl. 1994;86:798·803. r:, ro l ~o m AR, Cushman M , Tsa1 MY, Aleks1c N, l-Icei.. ben SR. Boland LL. ct ai. A prospeetive srudy of venous th romboembohsm 111 relar1on ro factOr V Leiden and 1e lated factors. Blood. 2002;99:2720-5. 6 Hirsh ), Lee AY. How we d1agnose and trear deep ve1n thrombos1s. Blood 2002;99:3102-10 7 Huyen AM, G1nsberg $), G1nsberg T Anncoagulanr ther apy for maJor arrenal end venous rhromboembol1sm. ln. Colman RW, Marder V), Clowes A\V, George ) . Gold haber SZ. Hemosras1s and rhrombosis: bas1c pnnoples & chnical pracnce. Slh ed. Ph1ladelph1a: Lippincott W1lhams & WilklnS; 2006. p.1673·88. 8 Jochmans K. L1ssens W, Seneca S. Capei P. Charela1n B, Meeus P, er ai. The molecular bas1s of anmhromb1n def,. Ciency 1n Belg1an and Durch fam1hes. Thromb Haemost 1998;80376-81.
Investigação laborator ial do paciente com trombofi lia
bolism. Thromb Haemosr. 2000:83:5-9. 11. Kyrle PA. M 1nar E. Hirschl M, B1alonczyk C. Stain M, Sch· neider B, er ai. High plasma levei of factor VI II and eh e nsk o( recurrent venous rhrombocrnbohsm. N Engl J M ed. 2000;343:457-62. 12. Lane DA. Mannuw PM, Baue1K!\ Beruna RM. Bochkov NP, BoulyJenkov V. et ai. lnhemed rhrombophilia: pan I Thromb Haemost. 1996,76.651·2. 13. Lev1ne JS, Branch DW, Rauch ). The Annphosphohp1d Syndrome. N Engl JMed. 2002.346.752-63 14. Mamnel11I, MannucCI PM, De Stefano V, Ta1oh E, Ross1 V, Crostl F, er ai. Different nsks of thrombos1s 1n four coagu· lanon deffects assoc1ated w1th 1nhenred tromboph1ha: a srudy of 150 fam1hes. Blood. 1998;92:2353·8. 15 Marnnelh I. R1s ractors 1n venous thromboembohsm Thromb Haemost. 2001;86.395-403 16. M1ddeldorp S, Büller HR. Pnns Mil. H1rsh j. Approach w rhe rhrombophihc pauent. ln Colman RW, H~rsh) Marder VJ, Clowes AW. George JN. ed1wrs. Hemosras1s and Th rombos1s. 4lh ecl. Philadelph1a: L1pp1ncorr Williams & Wilkins; 2001. p. 1085-100. 17. OkaJima K. Koga 5. KaJI M , lnoue M, Nakagak1T. Funatsu A. er ai. Effect o f prote1n C and awvated prore1n C on coagulanon and flbnnolysis 1n normal human subJecrs. Thromb Haemost. 1990,63:48·52 18. Poort SR. Rosendaal FR. Re,tsma PH, Ber:.na RM. A com mon gener1c vananon 10 the 3 -unrranslated reg1on of the prorhromb1n gene 1s assooated w1th elevated pias ma prorhrombm leveis and an mcrease 1n venous throm bosis. Blood. 1996;88:3698-703. 19. Quiroz R. Goldhaber SZ. Anr1coagulation chmcs. ln: Colman RW, Marder VJ. Clowes AW, George JN, Goldhaber SZ. Hemostas1s and thrombos1s. bas1c pnnc1ples & chn1 cal pracnce. 5th ed. Ph1ladelph1a: L1pp1ncott W1l11ams & Wilkms: 2006. p 16R9-9R 20. Rees DC. Cox M, Clegg JB. World d1srnbuuon of facror V Leiden. Lancet. 1995;346:1133-4. 21. Rosendaal FR. Th rornbos1s 1n the young: ep1dem1ology and risk facwrs. a focus on venous thrombos1s. Thromb Haemost. 1997;78:1·6. 22. Sona JM, Almasy L. SoutO JC. T1rado I. Bo1ell M , Mareo ). er ai. L1nkage analys1s demonstrares thar rhc prmhromb1n G20210A murar on JOimly mfluences plasma prorhrombln leveis and nsk of rhrombos1s. Blood 2000,95:2780·5
363
Mitiko Murao Henrique Neves da Silva Bittencourt José Silvério Garcia
32
ASPECTOS LABORATORIAIS DA HEMOTERAPIA
O grande marco da era científica da hemorerapia foi a descoberra, em 1900, dos grupos sanguíneos ABO por Karl Landsreiner. Outros passos imporrantes foram o desenvolvimento das bolsas plásricas com mecanismo fechado, possibilitando o fracionamenco do sangue, as coleras selerivas (afereses) que proporcionam a separação de um componente específico, a cuidadosa triagem clínica e sorológica do doador, a maior sensibilidade dos testes de compatibilidade melhor conhecimento dos sistemas de grupos sanguíneos e normatizações legais rigorosas, tornando a prática hemorerápica cada vez mais segura e racional. Os antígenos erirrocirários de interesse clínico-transfusional podem ser divididos em dois grandes grupos, conforme a constituição estrutural bioquímica em antígenos carboidracos ligados a proteínas ou a lipídios e anrígenos protéicos. Os primeiros são moléculas presentes nos glicolipídios de membrana citoplamática de diversas células, além das hemácias, sobressaindo dois sistemas: ABO e Lewis. O segundo grupo reúne os demais SIStemas antigênicos que são extremamente complexos, sendo o Rh o mais significativo nas implicações tanto transfusiona1s como na etiologia da doença hemolítica do recém-nascido. O complexo principal de hiscocompatibilidade humano (CPHH), mais conhecido como HLA. é um conjunto de moléculas glicoprotéicas expressas na superfície de praticamente todas as células. São responsáveis pela apresentação de antígenos aos linfócicos T e conseqüen-
re desencadeamento da resposta imunológica celular. O complexo HLA controla a resposta do sistema 1mune por meio da diferenciação entre o que é próprio (se/f) e estranho (non-se/f) ao organismo. A hemorerapia é regulamentada, normatizada e fiscalizada pela ação da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). a partir de Resoluções da Diretoria Colegiada (RDC), sendo a última (RDC n° 153) datada de 14 de junho de 2004. A RDC no 153/200 4 regulamenta as ações no atendimento rransfusional de rotina, na extrema urgência, em transfusões maciças e nos casos de transfusões incompatíveis, orientando a necessidade do regiscro documental dos procedimentos, desde a origem até o destino final de cada hemocomponente.
GRUPOS SANGU ÍNEOS Os antígenos eriuocitários são estruturas polimórficas, herdados genericamente e definidos por carboidratos ligados a proreína~ ou lipídios, localizados na superfície da membrana eritrocitária, ou por seqüências de aminoácidos específicos (antígenos proréicos). Os antígenos carboidratos são produtos secundários de genes produtores de glicosiltransferases, que transportam carboidratos para estruturas precursoras da membrana do eritrócito (ex. sistema ABO) e os antígenos protéicos são produtos diretos dos genes que os codificaram
(ex. sistema Rh). Assim, os antígenos eritrocitários podem se localizar na superfície da hemácia ou atravessar a membrana eritrocitária parcialmente ou totalmente, desempenhando papéis importantes na morfologia, como proteínas estruturais e fisiologia da hemácia, como recepção e transporte de substâncias e atividade enzimática, entre outros. Além disso, já se conhecem características como susceptibilidade ou resistência a determinadas doenças, na presença e/ou ausência de certos antígenos de grupos sanguíneos, por exemplo, o sistema Duffy e resistência à malária.
TERMINOLOGIA Na tentativa de pad ronização da nomenclatura dos antígenos erirrocitários, a Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea (ISBT) criou, em 1980, um grupo de trabalho (Working Party on Terminoloy of Red Ce/Is Surface Antigens) que elaborou uma nomenclatura de forma numérica e simbólica, possibilitando o armazenamento em bancos de dados computadorizados. Assim, os antígenos fo ram classificados em sistemas, coleções e séries. Até 2001, os antígenos erirrocitários estavam agru pados em 26 sistemas, cinco coleções e duas séries (Quadro 32.1). Outros antígenos foram identificados, entretanto, não foram caracterizados em sistemas.
SISTEMA DE GRUPOS SANGUÍNEOS São os antígenos produzidos a partir de genes alelos de mesmo locus gênico ou por um complexo de dois ou mais genes homólogos intimamente ligados sem que ocorra recombinação entre eles. A nomenclatura dos sistemas compreende um número formado por três dígitos e um símbolo, geralmente a primeira letra do nome do antígeno (Quadro 32.1).
COLEÇÕES DE GRUPOS SANGUÍNEOS O termo coleção foi introduzido em 1988 pela ISBT para englobar os grupos de antígenos relacionados do ponto de vista genético, bioquímico ou imunohemato-
lógico, mas que não preenchem os critérios para serem defin idos como sistema. As coleções também são identificadas por números e símbolos (Quadro 32.2)
SÉRIES DE GRUPOS SANGUÍNEOS Os antígenos que não possuem critérios para serem classificados em sistema ou coleções são classificados em séries. Os antígenos de baixa freqüência formam a série 700 e os de alta freqüência a série 901. Antígeno de baixa freqüência é aquele que possui incidência menor que 1% na população (Quadro 32.3). Antígeno de alta freqüência é o que tem incidência maior que 90% na população, também conhecido como sistema público (Quadro 32.4).
BASES MOLECULARES A maioria dos genes que codificam os gru pos sanguíneos é bem determinada. A designação dos genes ou Joci gênicos são descritas em letras mai úsculas e itálicas ou sublinhadas. Ex. ABO ou ABO. Os antígenos devem ser escritos em fonte regular. Os números ou letras adicionais deverão ser geralmente sobrescritos para genes e subscritos para antígenos. Ex.: antígeno A1 produzido pelo gene A\ com exceção para Colton: genes Coa e Cob e antígenos coa e cob. Detalhes em relação aos alelos associados com antígenos de grupo sanguíneo e fenótipos podem ser obtidos no site: http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm.
ANTICORPOS CONTRA GRUPOS SANGUÍNEOS A aloimunização eritrocitária ocorre quando um indivíduo é exposto pela primeira vez a um antígeno eritrocitário desconhecido proveniente de outro indivíduo da mesma espécie, através da transfusão de sangue, gravidez ou transplante, o que ocasiona a produção de anticorpo (aloanticorpo) específico a esse antígeno. Embora a composição antigênica das hemácias transfundidas sempre difira daquela dos pacientes, somente uma minoria desenvolve aloanticorpos.
366 ( Medicina laboratorial para o clínico )~-----------------------------
Tabela 32.1 - Sistema de grupos sanguíneos Símbolo Sistema
Antígenos associados
Nome do gene
Localização cromosômica
ABO
A, B, AB, AI
ABO
9q34.1-q34.2
MNS
MNS
M , N, S, s, U, He, Mi0 , Me, Vw, Mur, M9, Vr, Me, Mf, Sf, GYPA, Ri0 , Cl0 , Nf', Hui. Hil, Mv, F01, sD. Mrt, Dantu, Hop, Nob. GYPB, GYPE Ena, ENKT, N l, Or, DANE, TSEN, MINY, MUT, SAT, ERIK. Osa, ENEP, ENEH, HAG, ENAV MARS
4q28·q31
p
Pl
Pl
22q 11 .2·qter
Rh
RH
D. C. E. c, e, f. Ce, CV', C' V Ew G Hr0 , Hr hr' VS, C9, RHD, RHCE CE. D". c-like cE, hr>-i, Rh29, Go0 , hrB, Rh32, Rh33, HrB, Rh35, Be0 , Evans, Rh39, Tar, Rh41, Rh42, Craw-ford, Nau, Riv Sec, Dav. jAL. STEM. FPTT. MAR, BARC
l p36.2·p3 4
lutheran
LU
lu0 , Lub, Lu3, Lu4, Lu5, Luó, Lu7, Lu8, Lu9, Lul l, Lul2, Lul3, LU lul4, Luló, Lul7, Aua, Aub, Lu20
19ql 3.2-ql3.3
Keil
KEL
K, k, Kp 0 • Kpb, Ku. Jsa, Jsb, Ula, Kll, Kl 2, K13, Kl4, Kló, Kl7 Kl8, Kl 9, Km, Kpc, K22, K23, K24, VLAN. TOU
KEL
7q33
Lewis
LE
Le0 , Leb, Le0 b, Lehh, ALeb, BLeb
FTU3
19pl3.3
Duffy
FY
Fya, fyb.
FY
lq22-q23
Kidd
JK
jk0 , jkb, jkJ
SLC14AI
18ql l-ql2
Diego
DI
Di I Di 0 , Wf', Wrb, wda, Rba. WARR. ELO, Wu. Bp0 Moa Hga, Vga, SwD. BOW. NFLD. jn°. KREP. Tf'. Fr 0 SWl
SLC4A1
17q2l -q22
Yt
YT
YfO. Ytb
ACHE
7q22.1
Xg
XG
Xgn CD99
XG, MIC2
Xp22 3, Ypll.3
Scianna
se
Se l , Sc2, Sc3
se
lp35-p32
Dombrock
DO
Doa. Dob, Gya, Hy, Jo 0
DO
12pl3.2-p12.1
Colton
co
Co0 , Cob, Co3
AQP/
7pl4
Landsteiner-Wiener
LW
LW0 , LW'b, LW b
LW
l9pl3.3
Chido/Rodgers
CH/RG
Ch l-6, Rgl, Rg2, WH
C4A, Cd8
6p21.3
Hh
H
H
FUT/
19ol3.3
Kx
XK
Kx
XK
Xp2l.l
Gerbich
GE
Ge2 Ge3. Ge4, wb Ls0 An°. Dh0
GYPC
2ql4-q21
Cromer
CROM
Cf', Tc0 , Tcb, Tcc, Df', Es0 , IFC, WESa, W ESb, UMC
DAF
lq32
Knops
KN
Kn°. Knb. McC0 , $1°, Yk0 , McCb. Vil
CRI
l q32
lndion
lN
lno, Jnb
CD44
l l pl 3
Ok
OK
oka
CD/47
19pl3.3-pl 3.2
Roph
RAPH
MER2
MER2
l lpl5.5
John Milton Hogen
JMH
jMH l
SEMA7A
15q23-24
Sistema
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
PI
F,fl FI' Fy'í'
Fy6
367
Quadro 32.2 - Coleções de amígenos
Quadro 32.4 - Série 901 - amígenos de alta freqüência
Sistema (ISBT)
Nome
Símbolo Sistema
Símbolo Antígeno
Sistema (ISBT)
205
Cosi
COST
Cs0 Csb
207
208
ER
Er
EtJ Erb
209
p
GLOB
pk
LKE
210
LKE
Lé
Nome
Símbolo Antígeno
901002
Langereis
Lan
901003
August
Ata
Vel
901001
901005
jra
901008
Emm
901009
Anton
AnWi
901012
Sid
Sda
90 1013
Duelos
(Duelos)
90101 4
PEL
901015
ABTI
901016
MAMm
Led
Quadro 32.3 - Série 700 - anrígenos de baixa freqüência
A produção de aloanticorpo depende principalmente da parcicularidade da resposta imune do receptor e da imu-
Sistema (ISBT)
Nome
Símbolo Antígeno
nogenicidade dos diferentes antígenos eritrocitários. Nem
700002
Batty
By
todo aloanticorpo tem importância clínica. Dessa forma,
700003
Christiansen
Chr<'
uma vez detectado o aloanticorpo, deve-se determinar a
700005
Biles
Bi
700006
Box
Bx0
700015
Radin
Rd
rios a 3rC e diminui a sobrevida das hemácias uansfundi-
700017
Torkildsen
To0
das, causando destruição em minutos, horas ou dias.
700018
Peters
Pt0
Os antígenos considerados mais imunogênicos são
700019
Reid
Re0
700021
jensen
jea
os do sistema ABO, seguido do Rhesus (Rh), Keil (K), Duffy (Fy), Kidd (Jk), MNS. Diante disso, na rotina hemote-
700028
Livesay
uo
700039
Milne
(Milne)
700040
Rasmussen
RASM
700043
Oldeide
01°
700044
JFV
700045
Katagiri
Kg
700047
jones
jONES
sua especi ficidade para avaliar a sua importância clínica. Geralmente, o aloanticorpo considerado clinicamente significativo é aquele que reage com os antígenos eritrocitá-
rápica, conforme Resolução Colegiada (RDC) n° 153 de
14 de junho de 2005, é obrigatória a compatibilização para os antígenos A. B, O e Rh (D) em toda transfusão de glóbulos vermelhos.
GRUPOS SANGUÍNEOS COM ANTÍG ENOS CARBOIDRATOS Os sistemas ABO. Hh e Lewis (LE) são considerados
700049
HJK
700050
HOFM
700052
SARA
700053
LOCR
células, além das hemácias, sendo considerados antíge-
700054
REIT
nos de histocompatibilidade. As células da mucosa salivar
associados uma vez que seus anrígenos têm a mesma origem bioquímica: são moléculas complexas presentes nos glicolipídios e glicoproteínas de membrana de diversas
também produzem antígenos A BO. H e Lewis solúveis.
368 ( Medicina laboratorial para o clínico ]1--- - - - -- - - - -- - - -- - - - - - -- - - -- - -
Sistema de grupo sanguíneo ABO O sistema ABO foi descoberw por Landsteiner, em 1900, que observou que as hemácias de alguns indivíduos aglutinavam devido à fixação de anticorpos aos antígenos específicos localizados na membrana. Identificou, assim, os grupos A, Be O. Posteriormente, desco briu-se o tipo AB, em 1902. Esses quatro grupos são os mais importantes do sistema ABO. O locus ABO encontra-se no braço longo do cromossoma 9 (9q34.1 - q34.2). A classificação dos fenótipos eritrocitários ABO correspondem à presença e/ou ausência dos antígenos A e/ou Bna membrana da hemácia. Os indivíduos formam naturalmente anticorpos contra os antígenos que não possuem. Esses anticorpos podem ser detectados no soro e/ou plasma. Estima-se que cada antígeno presente na hemácia possua um anticorpo correspondente no soro e/ou plasma, de especificidade contra o antígeno que o indivíduo não possui, conforme Quadro 32.5. Herança genética ABO
Foi descrita pela primeira vez por Eptein e Ottenberg, em 1910, e posteriormente por Bernstein, em 1924. Existem três genes alelos no sistema ABO (A, B e 0 ), transmitidos segundo as leis de Mendel, sendo A e B co-dominantes, o que significa que os dois genes herdados se expressam igualmente, enquanto o O é recessivo. Assim, indivíduo com fenótipo A pode ser homozigoto para o gene A (AA) ou heterozigoto (AO). O mesmo se aplica para o fenóti po B. Para o genótipo AB, o fenótipo é AB e para o grupo O é sempre 00. Dessa forma, existem quatro fenótipos para o grupo ABO (A, B, AB e O), com seis possibilidades genotípicas (AA, AO, BB, BO, AB, e 00) - (Quadro 32.5). A freqüência de fenótipos ABO é variável entre as diferentes etnias. Nas populações de raça branca, os fenótipos O e A são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 40% da população. O fenótipo Bé encontrado em 11% e o AB é menos freqüente (4%). Na população mundial, o gene B é o mais raro do sistema ABO, com alta freqüência na Ásia Central. Biossíntese dos antígenos
Os genes dos sistemas ABO, Hh e LE são correiatos, mas independentes. Não codificam direramente
Aspectos la boratoriais da hemoterapia
a produção dos amígenos, mas produzem enzimas (glicosilcransferases) que acuam sinergicamente adicionando açúcares específicos N-acetil galactosamina (antígeno A) ou galactose (antígeno B), para substâncias precursoras que carreiam o amígeno H (Figura 32.1).
Murações nos genes A e B provocam a subsriruição de aminoácidos na glicosilcransferase resultante, gerando os subgrupos de A e B. Subgrupos ABO
Os subgrupos mais comuns associados ao gene A são A1 e A2. O subgrupo A, ocorre em aproximadamente 80% dos indivíduos e o subgrupo A2 em 20%. O subgrupo A3 é pouco freqüente, com incidência de um em 1.000 indivíduos. O gene A1 difere do gene A2 por uma deleção de base na região Gterminal, além de uma mutação de ponw, ocasionando a substituição de um aminoácido (prolina por leucina) na glicosiluansferase. Como a enzima A1 tem mais eficácia no transporte do açúcar A para seu substrato, o número de sítios para A1 é maior do que para o A2 Além disso, a transferase A2 liga os carboidratos nas cadeias H lineares, enquanto que a A, nas cadeias H ramificadas determina as diferenças qualitativas entre os dois fenótipos. Por isso, para definição do subgrupo A, utiliza-se a lecitina antiA1 (Dolichos biflorus), que reage especificamente com hemácias A1. No subgrupo A3, as hemácias podem apresentar número variado de sírios antigênicos, levando à ocorrência de campo misto ou dupla população. A identificação desses fenótipos pode ser feita por meio da fenotipagem com lecitinas antiA1 e anti-H, reste de fixação-el uição e pesquisa de antígenos na saliva. Os subgrupos de Bsão muito raros e possuem mecanismos genéticos, moleculares e sorológicos semelhantes aos subgrupos de A A expressão dos genes ABO depende da ação do gene H (FUT1), localizado no cromossoma 19. A expressão dos genes ABO, H e Lewis é controlada por um outro par de genes alelos denominados secrecores (Se/se). O gene secretor (FUT2) é responsável pela formação de uma enzima 2-alfa-fucosiltransferase, que adicionará uma fucose à substância precursora, produzindo o antígeno H solúvel. Os indivíduos sese são chamados não secrerores e têm expressão normal dos antígenos ABO e H nos eritróciros.
369
Tabela 32.5 -Características fenotípicas do grupo ASO
Grupo ABO
Antígenos ABO no hemácio
Anticorpos {soro/ plasmo)
Genótipos
o
Nenhum
AntiA, Ant1B e ontiAB
AI
AI
B
Freqüêncio (%) Broncos
Outros
00
45
49
Ant B
A'AI AlA? AlO
.10
27
B
AntiA
BB. BO
11
20
A1B
A1B
Nenhum
AB
4
4
A2
A2
AnliB, eventualmente ontiA1
A2A2; A20
A2B
A2B
Nenhum: eventualmente ontiA
A2 B
Figura 32.1 - Representação esquemánca da b1ossínrese dos amígenos do Sistema ABO. Existem ev1dências da associação do grupo ABO a determinadas doenças. como prevalência maior do câncer gástrico em indivíduos do grupo A e úlcera péptica nos de grupo O. Observa-se também que o nível plasmático do fator de von Willebrand varia conforme o grupo 1\BO, indivíduos do grupo O apresencam o nível plasmático mais baixo, seguido pelo gr upo A. B e AB.
Anticorpos e significado clínico Anticorpos ABO estão presentes no soro e/ou plasma de md1víduos. contra os antígenos ABO ausentes nas
370 ( Medicina laboratorial para o clínico
hemáCias (Quadro 32.6). Esses anticorpos são formados naturalmente, não sendo necessária sens1bil1zação prév1a através de transfusão ou gravidez. Os estímulos são passivos, desde o nascimento, principalmente por bactérias da flora InteStinal. pois estas possuem açúcares em suas membranas celulares semelhames aos açúcares dos amígenos A e B. estimulando a fo rmação de anticorpos antiA e/ou antiB, que são classificados como natu rais e regulares. Os anticorpos antiA e anciB são detectados encre três e seis meses após o nascimento, mas sua produção máxima se dá entre cinco e 10 anos de idade, mancendose na fase adulta. Encretanco. o título desses ancicorpos dim1nu1 com o avançar da idade.
Os anticorpos antiA e antiB são predominantemente
ção dos antígenos A e B. O gene que codifica o antígeno
da classe lgM, embora pequena quantidade de lgG pos-
(FUTl) está localizado no cromossoma 19q13. O gene H
sa estar presente. Os anticorpos ABO de classe lgM e lgG
está presente em 99.99% da população. sob a forma ho-
são capazes de ativar o sistema de complemento, pro-
mozigoca HH ou heterozigoca Hh. A forma hh é rara e dá
vocando hemólise intravascular em caso de transfusões
origem ao fenóti po conhecido como Bombay. O fenó-
incompatíveis, podendo ser fatais. A doença hemolítica
tipo Bombay clássico é produzido pelos indivíduos hh/
do recém -nascido (DHRN), por Incompatibilidade ABO.
sese (não secretores).
ocorre entre mães do grupo O e filho A e/ou B, sendo
H nos eritrócicos e nas substâncias solúvets. Nesses indi-
os sintomas e a evolução menos acentuados do que na
víduos, o soro e/ou plasma podem apresentar, além do anticorpo anri-H, o anriA e o antiB, que são reativos a
incompatibilidade por Rh.
ão apresentam anrígenos ABO e
37"( e hemolíticas, portanto. importantes do ponto de vista transfusional. A quantidade de antígeno H nos eritrócitos varia de
Sistema de grupo sangu íneo Hh
acordo com o grupo ABO. O grupo O é composto soO sistema H possui dois genes, H e h, e um único
mente de antígeno H. A seguir, em ordem decrescente, a
antígeno H (Hl), que serve de precursor para a forma-
dtstriblllção do antígeno H: 0> A 2 > B >A 2 B > A1 > A,B.
Quadro 32.6 - CaracterísCicas dos pnncipais anticorpos Especificidade Anticorpo
Classe do anticorpo
Significado clínico
ABO
lgM;olguns lgG
Rh
lgG;olguns lgM
Keil
Reação transfusiona l
Doença hemolítica do recém-nascido
Sim
Imediato. l eve o grave
Comum. leve o moderado
Srm
lmedroto/tardio. leve o grave
Comum. l eve o grave
lgG;olguns lgM
Sim
lmedioto/tardio.leve o grave
Às vezes. Leve o grave
Kidd
lgG;Roro lgM
Srm
lmedio'o/tardio. Leve o grave
Raro. Leve
Duffy
lgG;Roro lgM
Sim
Imediato/tardio. Leve o grave
Raro Leve
M
lgG.Raro lgM
Raramente
Tordo :rcrol
Raro leve
N
lgM;raro lgG
Não
Não
Não
s
lgG:olguns lgM
Ocasionalmente
Tardio. leve
Roro. leve o grave
lgG;Raro lgM
Sim
Tardio. Leve
Raro. leve o grave
u
lgG·Roro lgM
Sim
lmediolo/ tordio.Leve o grave
Raro Grave
lutheron
lgG;olguns lgM
Sim
Tardio
Raro. Leve
Diego
lgG:o guns lgM
Srm
To1dio Nenhuma o leve
Raro. leve
Colton
lgG
Srm
Tardio. Leve
Raro. Leve
Dombroc
lgG
Srm
lmedio·o/to1dio Leve o g1ove
Não
Raramente
Raramente tardio
Não
Yto
lgG
LW
tgG alguns tgM
Srm
lo•dio Ne"'humo o leve
Raro Leve
Ch/Rg
lgG
Não
Não
Não
Pl
lgM;olguns lgG
Não
Não
Não
Le LeL
lgM;olguns lgG
Raramente
Imediato. Raro
Não
lgM:olguns lgG
Não
Não
Não
lgM;olguns lgG
Não
Não
Não
Knops
lgG·Raro lgM
Não
Não
Não
Xgo
lgG;Roro lgM
Não
Não
Não
0
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
371
Sistema de grupo sanguíneo Lewis
O sistema Lewis é diference dos outros sistemas de grupos sanguíneos, uma vez que os amígenos (Lea e Leb) são formados no plasma e posteriormente adsorvidos na membrana da hemácia. Possui dois alelos (Le e /e). O alelo Le é dominante e o /e recessivo. O /ocus Lewis está localizado no cromossoma 19, posição 19p13.3, ligado ao Jocus C3 (fração do complemento). Os genes Le e Se produzem duas enzimas que agem sobre a mesma substância de base produzindo, respectivamente, Lea e H, cuja interação produz a especificidade Leb Os indivíduos de fenótipo A, possuem menor quantidade de antígenos Lewis do que os A2 que, por sua vez, possuem menor quantidade que os indivíduos O. O fenótipo Le (a-b+) está presente em 70% da população da raça branca e em aproximadamente 5% da raça negra. O fenótipo Le (a-b-) é menos comum na população branca, mas encontrada em 30% da população negra. Semelhantemente ao grupo ABO, os anticorpos do sistema Lewis são da classe lgM, podendo ativar complemento, e reagem à baixa temperatura. Embora possam estar implicados em reações transfusionais, usualmente essas reações não são graves. O anticorpo antiLea é mais comum do que o antiLeb Os anticorpos antiLewis nunca estão implicados em DHRN, uma vez que são da classe lgM, não podendo atravessar a barreira placentária. Além disso, os antígenos Lewis não estão presentes nas hemácias fetais.
GRUPOS SANGUÍNEOS COM ANTÍGENOS
PROTÉICOS Sistema de grupo sanguíneo Rh
O sistema Rh, o mais complexo sistema de grupos sanguíneos, é o de maior importância clínica após o ABO. Descoberto por Landsteiner e Weiner em 1939, possui o mais alto polimorfismo entre os marcadores de membrana erirrocitária descritos até o momento. Já foram relatados 45 antígenos como pertencentes a esse sistema, cinco destes (D, E. e, C c) responsáveis por 99% dos problemas clínicos associados ao sistema Rh (Quadro 32.1). As lipoproteínas do sistema Rh são partes integrantes da membrana eritrocitária, atravessando-
a 12 vezes. A função do amígeno Rh é desconhecida. embora, baseado no fen ótipo Rhnu\1• se reconheça que tenha papel importante na estrutura do esqueleto da hemácia, no transporre de proteínas e amônia. No fenótipo Rhnu/1 as hemácias não ap resentam nenhum dos antígenos do sistema Rh. Terminologia
Três nomenclaturas foram anteriormente desenvolvidas: sistema Wiener, Fisher-Race e Rosenfield (numérico). A teoria de Wiener propunha que os antígenos Rh eram produtos de apenas um par de genes alelos no Jocus Rh. A nomenclatura de Fisher-Race baseava-se na produção dos antígenos controlada por três pares de genes alelos: Cc, Dd e Ee. Entretanto, as teorias propostas por Wiener e Fisher- Race não foram confirmadas por vários estudos posteriores, mas permanecem, ainda, largamente utilizadas por sua familiaridade (Quadro 32.7). Quadro 32.7 - Ancígenos do sistema Rh Rosenfield
Fisher-Roce
W iener
Rhl
D
Rho
Rh2
c
rh'
Rh3
E
rh"
Rh4
c
hr'
Rh5
e
hr"
Rh6
ce !fi
Hr
Rh7
Ce
rhi
Rh8
Cw
rhwl
Rh9
Cx
rhx
Rh lO
V ICes)
hrv
Rhll
Ew
rhw2
Rh 12
G
rhG
O locus Rh está localizado no braço curto do cromossoma 1, na banda 1p36.2-34, e contém dois genes altameme homólogos: RHD e RHCE. O gene RHD, que não possui alelos, codifica a produção da proteína Rh que carreia o antígeno D. O gene RHCE já possui vários alelos (RHCe, RHcE, RHce, RHCE) e codifica a produção da proteína RhCE (ce). Assim, indivíduo considerado Rh positivo (D positivo) possui os dois genes Rh (RHD e
372 ( Medicina laboratorial para o clínico ]1-- -- - - - - - - - - - - - - - -- - - -- - - - - - - -
RHCE). enquanto em indivíduos Rh negativo (O negativo). em quase sua wtalidade. o RHD está deletado. Os genes RHD e RHCE apresentam estrutura similar. A proteína C difere da proteína c somente em quatro aminoáodos. Já a proteína E difere da proteína e em apenas um aminoác1do, mas em posição Importante na proteína. A proteína D difere da proteína CcEe em 35 am1noác1dos. Devido a essa grande diferença é que o amígeno D é tão imunogênico para os indivíduos que não o possuem. O Quadro 32.8 apresenta os principais fenótipos do Sistema RH. Q uadro 32.8 - Principais fenótipos do SIStema Rh
Freqüência (%)
Haplótipos (antígenos presentes) Fisher-Race
Wiener
Brancos
Negros
Asiáticos
DCe
RI
42
17
70
DeE
R2
14
11
21
3
Dee
RO
4
44
DCE
Rz
<0,01
<0,01
37
26
3
r
2
2
2
<0.01
<0,01
ry
<0,01
<0,01
<0,01
ce Ce cE CE
As princi pais variantes dos antígenos Rh são: • antígeno D fraco: genericamente designado ou. apresenta-se como uma expressão enfraquecida de D. Normalmente, esse antígeno não é detectado por técnicas de aglutinação di reta, mas sim em teste de antiglobulina. As hemácias D fraco devem ser consideradas Rh positivo, podendo provocar aloimunizações transfusionais ou few-maternas. Não existe diferença qualitativa entre D e ou. apenas uma redução do número de sítios antigênicos expressos na membrana eriuocitária; • antígenos D parciais: o antígeno D apresenta-se como um mosaico de nove subunidades ou epíropos. Todos esses epíropos antigênicos (epDl a epD9) estão presentes na maioria das hemácias Rh positivo e ausentes nas Rh negativo. Os antígenos D paroais são caracterizados pela falta de uma ou outra dessas subunidades, podendo os indivíduos de fenótipos O parciais produzir anticorpos antiD contra subu nidades ausentes;
Aspec tos la bo ratoriais da he m o terapia
• antígenos O deprimidos por efeito de posição "trans": a fraca reatividade do antígeno D pode também ser devida ao efeiw da posição "uans" em certos haplótipos Rh. A presença do haplótipo dCe deprime a expressão do antígeno D produzido pelos haplótipos Oce ou Dce em posição "trans". Anticorpos Rh
Os anticorpos anti-Rh resultam de aloimunizaçào por transfusão sanguínea ou por gravidez, pertencendo, na maioria das vezes. à classe lgG (lgGl ou lgG3). Alguns anticorpos da classe lgM podem ocorrer transitoriamente no início da aloimunização. O anticorpo antiD é o mais comum, uma vez que o antígeno D é altameme imunogên ico. A maioria dos casos de DHRN é devida a esse antígeno. Raros anticorpos antiE e antiC" podem ser observados sem estímulo antigênico conhec1do. sendo considerados "naturais". Os antígenos do sistema Rh mais imunogênicos são. em ordem decrescente. D. c. C E, e, cw
Sistema de grupo sanguíneo MNS
Os antígenos M e N foram descoberws por Landsteiner em 1927. Em 1947, foi descrito o antígeno S e em 1951 seu antitético s. É o segundo sistema em diversidade antigênica, depois do Rh, apresemando 43 anrígenos associados (Quadro 32.1). O sistema possui muitos antígenos de baixa freqüência associados a glicoforinas (GP) híbndas anormais resultantes de glicosilações das GPA/B. Os amígenos Me N estão associados à glicoforina A, enquanto os antígenos Ses à glicoforina B. Os antígenos desse sistema são codificados por dois genes, GYPA e GYPB. localizados no cromossoma 4q28-q31 e um terceiro gene homólogo, o GYPE. Contêm aproximadamente 350 kb e formam cluster gêniCo (5'-GYPA-GYPB-GYPE-3'). Os amígenos do sistema MNS estão assoc1ados às Slaloglicoproteínas (SGP) da membrana eritrocitária, denominadas glicoforina A (GPA) e glicoforina B(GPB) transmembranas, presentes em grande quamidade no emrócito, comendo aproximadamente 50% de carboidraros. Os antígenos M e N estão localizados na GPA (131 aminoácidos) e diferem entre si em apenas dois aminoá-
373
cidos. Os amígenos S, se U estão localizados na GPB (72 aminoácidos), sendo que S e s diferem em uma simples substicuição de aminoácido na posição 29. A maioria dos antígenos do sistema MNS está bem desenvolvida ao nascimento e parece restringir-se à linhagem eritróide, podendo ocasionar DHRN. Anticorpos MNS
O anticorpo antiM é geralmente natural e irregular, reage melhor a 4•e, mas pode reagir fracamente a 37"C. São quase sempre lgM, porém, em grande parte, apresentam associação lgG + lgM. Normal mente, não fixam complemento. De modo geral, não são clinicamente significativos, tendo pouca importância uansfusional e raramente causam DHRN. Sua atividade in vitro pode ser potencializada pelo uso de albumina ou redução do pH. O antiN apresenta características sorológicas semelhantes às do antiM, embora seja mais raro. Geralmente, é de ocorrência natural, do tipo lgM e inativo em temperatura superior a 25"C. O antiN não é considerado clinicamente importante, não rendo sido associado à reação rransfusional ou DHRN. Já os amicorpos anri-S, anti-s e antiU são clinicamente significativos e secundários à aloimunização. O anti-S pode ser eventualmente de ocorrência natural (lgM). O anti-s é um anticorpo mais raro e imune (lgG). O antiU é extremamente raro, imune e capaz de causar hemólise pós-rransfusional grave.
Sistema de grupo sanguíneo Keil
O sistema Keil foi o primeiro grupo sanguíneo descoberto após o desenvolvimento do reste de antiglobulina, em 1946, e seu antitético k (Cellano) em 1949. É um dos maiores sistemas de antígenos eritrocitários, complexo, polimórfico e possui, até o momento, 23 antígenos associados (Quadro 32.1 ). Os antígenos são codificados por um lows complexo, conhecido como locus Keil, localizado no cromossoma 7 q33. Possui pelo menos quatro sub/oci do complexo, cada um com alelo para antígeno de alta freqüência (k, Kpb, Jsb e KEL11) e um ou mais ai elo para os antígenos de baixa freqüência (K, Kpa ou Kpc. Jsa e KEL17).
374 [ Medicina laboratOrial para o clínico
Os antígenos Keil estão presentes nos eritrócitos e estão bem desenvolvidos ao nascimento. Parecem estar presentes em alguns tecidos, como cérebro, órgãos linfóides, coração e músculos esqueléticos. O antígeno K1 é três vezes mais imunogênico que c e E; 20 vezes mais imunogênico que os demais amígenos, mas seis vezes menos imunogêncio que D. A probabilidade de sensibil ização após transfusão de uma unidade de sangue K positiva é de aproximadamente 10%. A grande maioria dos anticorpos do sistema Keil pertence à classe lgG, reacivos a 37"C. Considerados clinicamente significativos, podem ser responsáveis por reações transfusionais hemolíticas imediatas e tardias, além de DHRN (menos grave que o antiD). Cerca de 20% dos anticorpos antiK ativam complemento, emrecanto, a hemólise intravascular não é freqüenre. Indivíduos portadores da síndrome Mcleod apresentam diminuição da expressão dos antígenos Keil e ausência de produção da substância Kx, cursando com alterações morfológicas eritrocitárias (acantose), reticulocitose, aumento da fragilidade osmótica, diminuição de haptoglobina e esplenomegalia. É herdada como carácer recessivo ligada ao cromossoma X.
Sistema de grupo sanguíneo Kidd
O sistema Kidd é composto de crês antígenos: Jka, Jkb, Jk3. O lows do sistema Kidd encontra-se no cromossoma 18q11-q12. Os antígenos Jka e Jkb estão bem desenvolvidos ao nascimento (detectados em torno da sétima à 1P semana de gestação) e podem ser encontrados, além de ericróci cos, em células endoteliais de rim. Existem crês alelos, sendo do1s deles co-dom1nantes, responsáveis pela produção dos antígenos Jka, Jkb, e outro aparentemente silencioso (Jk), que leva à formação do fenócipo nulo Jk (ab-). Os principais fenótipos Kidd são Jk (a·b+) e Jk (a+b+). Apesar da moderada imunogenicidade dos antígenos, os anticorpos Kidd (antijka e ant1Jkb) estão envolvidos em graves reações hemolíticas imediatas e tardias, em policransfundidos. Podem ocasionar DHPN não graves. Anticorpos Kidd
Os anticorpos são geralmeme da classe lgG, mas eventualmente lgM, fixando complemento. Esses anri-
Anticorpos antiDuffy
corpos apresentam meia-vida curta e, assim, freqüemememe não são detectados nos testes pré-transfusionais. Anticorpos anti)ka e anti)kb estão implicados em reações pós-transfusionais graves e alguns casos de DHPN. O anti)ka é o mais perigoso dos anticorpos imunes, ocasionando muitas vezes reações febris. O anti)kb é mais raro que o anti)ka e cem sido usualmente encontrado em soro de pacientes que possuem outros anticorpos irregulares.
Os anticorpos são usualmente da classe lgG. O antiFf é o mais comum, considerado clinicamente significativo, pois se associa a DHRN e reações transfusionais agudas e tardias. O antiFl é três vezes menos freqüente que o anriK(Kl). O anriFyb é 20 vezes menos freqüenre que o antiFf e envolvido somente em reações transfusionais tardias. Os outros anticorpos são menos comuns.
Sistema de grupo sanguíneo Duffy
Sistema de grupo sanguíneo Diego
Os antígenos do sistema Duffy são de grande importância na hemoterapia. pelo desenvolvimento de aloimunização freqüente e também pelo envolvimento no mecanismo de entrada do Plasmodium vivax nas hemácias. O sistema é composto de seis antígenos: Fya, Fyb, Fy3, Fy4, Fy5 e Fy6, sendo que os dois principais (Ff e Fyb) ocorrem em freqüência semelhante na população caucasóide, mas estão ausentes em 60% dos negros africanos e em 90% dos asiáticos. Os antígenos são codificados por um par de genes alelos cc-dominantes herdados de acordo com o modelo mendeliana, o locus Duffy, que se encontra no cromossoma 1q22-23. Os antígenos Fya, Fyb estão bem desenvolvidos ao nascimento, podendo ser detectados nas hemácias de embriões entre a sexta e a sétima semanas de gestação. Os antígenos Ff e Fyb já foram detectados em outros tecidos ou órgãos além das hemácias (cérebro, rins, baço, coração, pulmão, pâncreas e placenta). entretanto, não foram encontrados em linfócitos, monócitos, granulócitos ou plaquetas. O gene Duffy codifica uma glicoproteína quimiorreceptora nas hemácias para diversas substâncias. como quimiocinas, Plasmodium vivax e Plasmodium knowlesi, sendo essencial para a invasão desses parasitos. Assim, indivíduos que não expressam Fya ou Fyb nas hemácias são resistentes a essas formas de malária. Em partes da África, onde a infecção pela malária é comum, muitos indivíduos são Fy (a-b-). provavelmente devido à seleção natural. Os antígenos Fya, Fyb são moderadamente imunogênicos. O antígeno Fya é 40 vezes menos imunogênico que K(K1). En zimas proteolíticas como a ficina, papaína e bromei ina destroem os ancígenos Fya. Fyb e Fy6 A tripsi na não destrói Fya e Fyb e ainda intensifica a reatividade de Fy6 .
O sistema compreende os antígenos Diego e Wright. Consiste de 21 antígenos, sendo os mais conhecidos Dia /Dib e Wr3 /Wrb Os antígenos desse sistema são codificados pelo gene SLC4A1, localizado no cromossoma 17q21-q22, com 15 éxons. O antígeno Di 3 é extremamente raro em caucasianos, mas muito comum na população asiática.
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
Anticorpos antiDiego Os anticorpos antiDia e antiDib são geralmente da classe lgG, subclasses lgG1 e lgG3. sendo bons fixadores de complemento. O antiDia pode ser de ocorrência narural. Pode estar envolvido em DHPN e raramente em reações uansfusionais.
ANTÍGENOS E ANTICORPOS GRANULOCÍTICOS Os antígenos granulocíticos foram inicialmente demonstrados na década de 1960 a partir da investigação de crianças com neutropenia neonatal por incompatibilidade materno-feta l. Estudos posteriores demonstraram a importância desses antígenos na neutropenia autoimune, nas reações transfusionais febril e pulmonar. Na membrana dos neutrófilos existe elevado número de aloamígenos, que são amígenos definidos por aloanticorpos. Os antígenos granulocíticos são denominados pela ISBT de HNA (Human Neutrophil Alloantigens) e, acé o momento, o sistema HNA compreende sere amígenos localizados em cinco glicoproteínas (Quadro 32.9). O primeiro amígeno granulocítico (HNA1) foi demonstrado em 1966 por Lalezari e Bernard. O amígeno HNA1 é antitético com o HNA2 e estão presemes na gli-
375
coproceína FcRI/Ib. O ancígeno HNA-1b é mais freqüence que o HNA-1a nos caucasianos e negros, diferentemente do que ocorre com os orientais (chineses e japoneses).
Quadro 32.9 - Ancígenos dos neucrófilos humanos (HNA) Sistema
Antígeno
(ISBT)
Terminologia antiga
Localização Glicopro teína
ANTÍGENOS E ANTICORPOS PLAQUETÁRIOS
O siscema de antígenos plaquetários humanos (HPA) é formado por 10 grupos antigênicos, de acordo com a ISBT (Quadro 32.10). Os amígenos plaquetários são consticuí-
dos por segmentos proréicos polimórficos situados no interior de glicoproteínas plaquetárias. Muitas dessas glicoproteínas funcionam como receptores, desempenhando importante papel na hemostasia (adesão e agregação).
FcyRIIIbCD16 HNA-la
NAl
HNA-lb
NA2
HNA-lc
SH
2
HNA-2a
NBl
CD117
3
HNA-3a
5b
GP 70-95
4
HNA-4o
Marto0
CR3/CDl l b
5
HNA-5o
Onda0
CDlla
FcyRIIIbCDló
Quadro 32.10- Amígeno plaquetário humano (HPA)
Sistema (ISBT)
Antígeno
Glicoproteína
HPA-la
~I lia
HPA-lb
2
HPA-2a
lba
HPA-2b
3
HPA-3a
alib
HPA-3b
4
A neutropenia auto-imune em adultos pode ser idiopática ou secundária a várias doenças, como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, infecções bacterianas. A neutropenia auto-imune da infância possui incidência maior entre seis meses e dois anos de idade. O auto-anticorpo é freqüentemente autolimitado e a evolução é benigna. Já o mecanismo da neutropenia neonatal aloimune se dá pela passagem de anticorpos maternos pela placenta para a circulação do feto e é mais freqüente em mulheres com fenótipos NA1/NA1 e NA2/NA2. Os anticorpos mais freqüentemente envolvidos são aqueles contra os antígenos HNA1, HNA2 e HNBl. Nas reações hemolíticas febris, os anticorpos granulocíticos estão envolvidos, embora na maioria das vezes estejam associados a anticorpos contra antígenos HLA (classe 1), que estão presentes nos granulócitos. Na lesão pulmonar aguda relacionada à transfusão (TRALI) ou edema pulmonar agudo não cardiogênico, diversos mecanismos estão envolvidos: transfusão de anticorpos contra o HLA ou ancígenos neutrofílicos que reagem com leucócicos e plaquetas do receptor, levando a uma seqüência de eventos que aumentam a permeabilidade da microcirculação pulmonar, permitindo a passagem de líquidos para os alvéolos.
HPA-4a
~I II a
HPA-4b
5
HPA-5a
la
HPA-5 b
15
HPA-6bw
~I II a
HPA-7bw
~III a
HPA-8bw
~II I a
HPA-9bw
ali la
HPA-10bw
~III a
HPA-l1bw
~II I a
HPA-12bw
l b~
HPA-13bw
la
HPA-14bw
~I lia
HPA-15°
CD109
HPA-15b HPA-16w
Complexo glicoproteína llb/ llla (allb~3)
Esse complexo funciona nas plaquetas ativadas como recepcor para o fibrinogênio e facor von Willebrand, desempenhando, assim, importante papel na agregação plaquetária. A deficiência de gpllb/llla resulta na trombaste-
376 [ Medicina laboratorial para o cl ínico ]f-- - -- -- - - - -- - - - - - - -- - - - - - - - - -
nia de Glanzmann. O gene para a GPIIIa é localizado no cromossoma 17. Os aloamígenos plaquetários localizados na GPilla são: PIA. Pen. Ca/Tu. Mo. Sr. La. Gro. Oe e Duv. Na GPIIb estão os aloantígenos HPA-3 e Maxa. O sistema HPA-1 (PIA) é o mais importante e está presente em 90% dos casos de púrpura pós-transfusional e púrpura neonatal alo1mune. A freqüênoa fenorípica em caucasianos é de 97,9% para o HPA-1a e 26.5% para o HPA-1b. A produção de anticorpos contra epíropos localizados nas glicoproteínas da membrana plaquetária origina duas síndromes hemorrágicas: púrpura neonatal aloimune e púrpura pós-transfusional. A púrpura pós-transfusional caracteriza-se pela ocorrência súbita de plaqueropenia grave (< 10.000/mm 3), cerca de cinco a 10 dias após transfusão em mulheres com história de gestações e/ou transfusões prévias. A maioria dos casos envolve pacientes que não possuem o antígeno HPA-1. A púrpura pós-rransfusional é aurolimitada, com recuperação total em aproximadamente 21 dias.
Anticorpos antiplaquetários
Os principais anticorpos envolvidos na destrUição plaquetária são os do grupo ABO. HLA e os antiCOrpos específicos dos antígenos plaquerários de plaquetas específico (Quadro 32.11}. Os antígenos do sistema ABO estão presentes na membrana plaquetária e a quantidade de antígeno varia entre os Indivíduos. Assim, anncorpos ABO podem reduzir a meia-vida das plaquetas ABO incompatíveis e ocasionalmente o paciente pode tornarse refratário à transfusão de plaquetas. Os anticorpos mais importantes são os direcionados para os antígenos HLA (classe I) presentes nas plaquetas e leucócitos. Eles são usualmente lgG e estão assoc1ados à refratariedade plaquetária. O anticorpo anti plaquetário pode levar à diminuição da meia-vida da plaqueta transfundida e ser uma das causas de refratariedade à transfusão de plaquetas. Também pode levar à trombociropenia neonatal aloimune, com mecanismo semelhante à DHRN. A aloimunização para os antígenos plaquetários pode ocorrer após exposição como grav1dez, transfusão e transplante. Diferentemente dos aloanticorpos eritrocitários, é incomum o desenvolvimenm de anticorpo de forma natural. Alguns anticorpos também podem estar associados à trombocimpenla imune induzida por medicamento.
Aspectos labo ratoriais da hemoterapia
Pela dificuldade em se mensurarem os amicorpos antiplaquetários por meio de prova de aglutinação. como utilizado para as hemácias, e em decorrência da complexidade dos métodos (imunofluorescência, cimmetria de fluxo. rad1oimunoensaio, etc.), rorna-se limitada sua dececção na rocina hemocerápica.
O LABORATÓRIO E O ESTUDO DOS GRUPOS SANGUÍNEOS
A importância clínica de um determinado sistema de antígeno de grupo sanguíneo depende da freqüência de seus anticorpos e suas características. isto é. da classe da imunoglobuli na e, se for lgG, qual a subclasse e a habilidade para ativar o complemento, portanto. não existe sistema menor. A importância do sistema ABO justifica-se pelo encontro regular de anticorpos naturais antiA e antiB, podendo causar hemólise intravascular se transfundidas hemácias incompatíveis. pela facilidade de ativar complemento - pois são da classe lgM . Os antígenos fazem parte da integridade das hemácias de tal maneira que não podem ser destruídos sem que se destruam as hemácias. Em condições regulares, o antígeno e o anticorpo correspondente não estão presentes na mesma pessoa. O SIStema Rh é compostO de vários antígenos. sendo C c, D. E. e, cWe sua importância clínica é expressiva, principalmente o antígeno D. que é altamente imunogêmco. Na prática transfusional regular, como em outros casos de interesse e finalidade. apenas o antígeno D é pesquisado. Portanto, ao se considerar o Rh do paciente/doador, fica subentendido que se trata do antígeno O, a menos que haja necessidade de pesquisa de outro antígeno ou da fenotipagem eritrocitária completa para o sistema.
MÉTODOS PARA TIPIFICAÇÃO ERITROCITÁRIA Determinações dos tipos ABO e Rh em lâmina
Grupo sanguíneo ABO
Trata-se da técnica mais antiga para a pesquisa de anrígenos ABO nas hemácias. Utilizam-se anticorpos (re-
377
agemes) AntiA, AmiB e AntiAB da classe lgM, específicos e preferencialmente monoclonais, por apresentarem melhor reatividade, principalmente, na detecção dos subgrupos A2, A3, A2B. A utilização do reagente AntiAB poderá ser opcional.
de dos resulcados, dá-se preferência às amostras obtidas recentemente, evitando-se a adição de conservantes. Procedimento técnico • preparar suspensão das hemácias-teste a 40% no
próprio plasma/soro ou solução salina fisiológica Princípio do teste • Os reagentes AntiA e AntiB causam aglutinações grosseiras das hemácias diretamenre, rortanro, macroscópicas. As hemácias portadoras do antígeno A serão aglutinadas quando entram em contaw com o reagente AntiA; igualmente, as hemácias portadoras do antígeno B serão aglutinadas na presença do reagente AntiB.
• •
Amostra de sangue
•
Não há necessidade de preparo especial do paciente ou doador. A amostra deve ser colhida conforme técnica usual de flebotomia, utilizando-se anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acérico), citrato, heparina ou CPDA-l (citrato, fosfato, deswse e adenina). Se as hemácias são obtidas de coágulo ou de sangue de cordão umbilical, devem ser lavadas três vezes em solução salina fisiológica antes do teste. Para mais segurança e qualida-
• • •
(pode-se empregar, também, sangue total); em uma lâmina de vidro devidamente limpa e seca, à tempe ratura ambiente, colocar: uma gota de AntiA na exuemidade à esquerda e uma gora de AntiB na extremidade à direita; adicionar uma gota de suspensão de hemácias. misturar bem, individualmente, o soro e a suspensão de hemácias com bastão de vidro ou lâmina em área de ± 2x2 cm; oscilar a lâmina em movimentos de báscula, suavemente; os testes que não apresentarem aglutinações não deverão ser observados além de do is minuws; as lâminas não poderão ser aquecidas ou interpretadas sobre o visor do aglutinoscópio; anotar os resultados.
Os materiais necessários para o procedimento técnico estão listados no Quadro 32.l2.
Quadro 32.11 - Aloamicorpo plaquerário- principais fenóripos de importância clínica Especificidade Anticorpo
Significado clínico
Trombocitopenia neonatal a loimune
Púrpura pós-transfusional
Refratariedade plaquetária pós-transfusional
HPA-lo HPAlb HPA-5° HPA5b HPA-15o HPA-15b Hf'A:.la HPA-3b HPA-2o HPA-2b HPA-4° HPA4b
Sim Raro Sim Sim Sim Sim Sim Raro Sim Sim Sim Sim
Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim
Sim Sim Sim Sim Não
Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim
2
?
Sim Sim Sim
?
Sim Sim Não Não Sim Não
?
Sim Não Não
378 ( Medicina laboratorial para o clínico)l-- - -- - - - - -- - -- - -- - - - -- - - - - - -- --
Quadro 32.12 - Tipagem ABO- récnica em lâmina Materiais/Equipamentos
Reagentes/Solução
Tubos de hemólise !10x75/12x75mm) Suporte paro tubos
Soros reagentes monoclonois
Micropipetas (l0-200~L)
AntiA e AntiB
Ponteiros Lâminas de vidro Centrífugo Aglutinoscópio
Solução salino fisiológico 0 ,9%
• pingar uma gora de lecrina A, em um rubo de hemólise; • acrescentar 50 pl da suspensão das hemácias reste; • misturar bem - deixar incubar a temperatura ambiente por 15 minutos; • ressuspender o "barão" de hemácias agirando delicadamente o [Ubo, observando-se a presença de aglutinações, macroscopicamente. Os mareriais necessários para o procedimento técnico estão listados no Quadro 32.14.
Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.13. Quadro 32.13 - Tipagem ABO em lâmina - interpretação de resultados Reação com: AntiA
Grupo Sanguíneo
AntiB
A
+ +
+
B
+
AB
Quadro 32.14 - Tipagem subgrupos de A- técnica em lâmina Materiais/Equipamentos Tubos de hemólise 10x75/1 2x75mm Suporte paro tubos Micropipetos 11 0-2001-'Ll Ponteiros Cronômetro/relógio Centrífugo Aglutinoscópio Pincel
Reagentes/ Solução
Lectino AntiAl Solução salino fisiológico 0,9%
o Subgrupos de A
Embora sejam formados pelo mesmo açúcar, há diferenças qualitativas e quanrirarivas entre A, e A2. A diferenciação é feira restando-se as hemácias com lecirina encontrada na "Dolichos biflorus" (Lecirina AntiA,). capaz de aglutinar especificamente as hemácias A1 e A1 B. Devido à diminuição expressiva de sírios em A3, percebe-se a ocorrência de aglutinações de "campo misro", isco é, hemácias que reagem, outras não, levando a uma interpretação de dupla população de hemácias. Com a diminuição crescente de sírios, é possível que a reação antígeno-amicorpo seja ainda mais fraca ou, até mesmo com a inrerpreração de reação negativa, configurando-se resultados discrepanres quando da reação da prova reversa - pesquisa do anticorpo. Procedimento técnico • lavar as hemácias em solução salina fisiológica três vezes; • Preparar suspensão de hemácias lavadas a 3-5% em solução sali na fisiológica (30 a 50 11L de hemácias em 1.000 IJLde salina);
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.15. Quadro 32.15 - Subgrupos de A - interpretação de resultados Reação com Lecitina AntiAl
Grupo Sanguíneo
+
A 1 ou A 1B
A2, A3 ou A2B
Sistema Rh
Pnncíp10 do teste
O reagente AntiD causa aglutinação direra das hemácias O-positivo, cuja intensidade da reação varia amplamente de indivíduo para indivíduo e quando a reação não ocorrer terá a necessidade de eferuar a exclusão para O-fraco. O reste deverá ser acompanhado, em paralelo, com o controle do Rh, utilizando-se, assim, o soro conrro-
379
le de Rh, de preferência do mesmo fabricame. Caso seja positivo, a ripagem Rho(D) será considerada inválida e será definida após a resolução do problema, se possível.
Quadro 32.17- Tipagem Rho (D) em lâmina - interpretação de resultados Reação com: AntiD
Amostra de sangue
Procedimemo técnico • preparar suspensão das hemácias a 40% no próprio plasma/soro ou solução salina fisiológica (pode-se empregar sangue rotai); • em uma lâmina devidamente limpa e seca, colocar: uma gota de AntiD na extremidade à esquerda e uma goca de soro Controle-Rh na extremidade à direita; • adicionar uma gota da suspensão de hemácias aos soros; • misturar bem, individualmente, os soros e a suspensão de hemácias com bastão de vidro ou lâmina em área de aproximadamente 2x2cm; • oscilar a lâmina sobre o visor do aglutinoscópio (temperatura acima da ambiente); • os testes que não apresentarem agl utinações não deverão ser observados além de dois minu ros; • anotar os resultados. Os materiais necessários para o procedimento téc nico estão listados no Quadro 32.16. Quadro 32.16 - Tipagem Rho (D) - técnica em lâmina Materiais/ Equipamentos
Tubos de hemólise 10X75/12X75mm Suporte paro tubos Micropipetas 110·200~ll Ponteiras Lâmina de vidro Centrífugo Aglutinoscópio Banho-mario 37°( Microscópio
Controle de Rh
+
As observações descritas para a obtenção de amosua na ripagem ABO também se aplicam à ripagem do Rho(D).
Reagentes/Solução
Soro reagente AntiD Soro controle do Rh Antiglobulino humano IAGH)
Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.17
380 [ Medicina laboratorial para o clínico
+
Interpretação do Rho(D)
+
Positivo Negativo Indeterminado
Variante de D (O-Fraco)
A variação quantitativa de sítio antigênico para o antígeno D poderá resultar em reação sem qualquer expressão visível. Daí a necessidade da pesquisa na fase antiglobulina, denominada, no passado, Du (STRATTON. 1946). Portanto, indivíduos que expressam antígeno O-fraco são fenocipicamente Rho(D) positivo, podendo sensibilizar receptores O-negativo. Procedimento • preparar uma suspensão a 5% das hemácias teste (50 1-'L das hemácias + 1.000 1-'L de solução salina fisiológica); • identificar dois tubos de hemólise: De Cti com o nome ou número do paciente/doador; • colocar: uma gota de AmiD no tubo D e uma goca do soro-controle Rh no tubo Ctl; • adicionar 50 1-'L da suspensão de hemácia 5% em ambos os tubos (D-Ctl); • homogeneizar; • incubar os dois tubos por 10 minutos a 37°(; • ressuspender o "botão" de hemácias formado e observar aglutinações; • ler e anotar os resultados; • se a reação no tubo D for positiva, não haverá necessidade de continuar o procedimento, será definido como sendo O-positivo; • se a reação foi negativa no tubo D, lavar três vezes em solução salina fisi ológica os dois tubos (D-Ctl); • centrifugar a 1.000 rpm por um minuto ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • adicionar uma gora de antiglobulina humana (mono ou pol iespecífico) nos dois tubos; • homogeneizar;
• centrifugar os dois cubos a 1.000 rpm por um minum ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • leitura macro e IT' icroscópica; • anotar os resultados. Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.18. Quadro 32.18 - Pesquisa de O-fraco - interpretação de resultados Reação com: AntiD
Interpretação do Rho(D)
Controle de Rh
+
Positivo Negativo
+
+
Indeterminado
Procedimento Tipagem Direta
• pesq uisa dos antígenos - Preparar suspensão de hemácias teste a 5% (50 j.ILde hemácias + 1.000 j.IL de salina). - Identificar dois cubos de hemólise, colocando no cubo A uma gota do soro AntiA e no cubo B uma goca do soro AntiB. - Adicionar em ambos os cubos 50 ~L da suspensão de hemácias-tesce. - Homogeneizar. - Centrifugar a 1.000 rpm por um minuro ou a 3.400 rpm por 15 segundos. - Suspender o "botão" de hemácias com movimentos leves e observar a presença/ausência de aglutinações. - Anotar resultado Tipagem reverso
Determinações dos tipos ABO e Rh em tubo Grupo sanguíneo ABO
A técnica em cubo, para a tipagem ABO, permite que sejam pesquisados, em paralelo, os antígenos A e B e os anticorpos AntiA e AntiB. É dividido em duas fases: • classificação di reta- pesquisa os antígenos; • classificação reversa - pesquisa os anticorpos. Os materiais necessários para o procedimento técnico estão listados no Quadro 32.19.
Quadro 32.19- Tipagem ABO- técnica em tubo Materiais/Equipamentos Tubos de hemólise ll0x75/ 12x75mml Centrífugo M icropipetos ll0-200fJL) Ponteiros Aglutinoscópio Pinça Suporte poro tubos lâminas Cronómetro/relógio Pincel
• pesquisa dos anticorpos - Identificar dois cubos de hemólise com as letras: "RA" (reversa de A) e "RB" (reversa de B). - Piperar 50 ~L de soro/plasma em cada um dos tubos. - Adicionar uma gota de hemácia A1 em RA e uma gota de hemácia Bem RB. - Homogeneizar. - Centrifugar a 1.000 rpm por um minuro ou a 3.400 rpm por 15 segundos. - Ressuspender o "botão" de hemácias com movimentos leves e observar a presença/ausência de aglutinação. - Anotar resultado Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.20.
Reagentes/Solução
Tipagem do Rho(D)
Soros reagentes AntiA e AntiB Reagentes de hemócias A 1 e B Solução salino fisiológico 0,9%
Aspecros laboraroriais da hemoterapia
Os materiais necessários para o procedimento técnico estão listados no Quadro 32.21. Procedimento
• identificar dois cubos de hemólise com as letras "D" (dispensar uma gota de AnciD) e "Cti/CD" (dispensar uma goca de soro-controle Rh);
381
Quadro 32.20 - Tipagem ABO em cubo - incerpretação de resultados Provo Direto
Provo Reverso
Reoção das Hemácios com:
Reoção do soro/plasmo com:
AntiD
Controle de Rh
Hemác ias B
Hemácio A 1
+
+
+
+
+(fraco)
A
B AB
+
+
Interpretação do ABO
+
+
o
+ (f·aco)
+
A 2 c/ AntiA1
Exclusão para O-fraco Quadro 32.21 - Tipagem Rho (D) em cubo Materiais/Equipamentos Tubos de hemólise (10x75/12x75mm) Micropipeta (10·200fJL) Ponteiras Pincel Centrífuga Aglutinoscópio Microscópio Cronômetro/ relógio
Procedimento
Reagentes/So lução
Soros Anti-Rho (D) Soro controle Rh Solução salino fisiológico 0,9%
• adicionar em ambos os cubos 50 !JL da suspensão de hemácias-teste já preparada a 5%; • centrifugar a 1.000 rpm por um minuto ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • ressuspender o "botão" de hemácias de ambos os tubos; • ler e anotar os resultados. Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.22. Quadro 32.22 - Tipagem Rho(D) em cubo - incerpretação de resultados Reoção com: AntiD
Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.23. Quadro 32.23 - Exclusão para O-fraco - interpretação de resultados
Rh(D) Reoção com:
Controle de Rh
+
+
• levar ambos os cubos (D e Ctl) a 37°C por 10 minutos; • centrifugar a 1.000 rpm por um minuco ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • ressuspender o "botão" de hemácias em ambos os tubos; • ler e anotar os resultados; • interpretação: como a anterior; • se não houver aglutinações, lavar os cubos três vezes em salina; • adicionar 1 gota de antiglobulina humana (mono ou poliespecífico) em ambos os tubos; • centrifugar a 1.000 rpm por um minuto ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • ressuspender o "botão" de hemácias de ambos os tubos; • leitura macro/microscópica; • anotar resultados.
+
Positivo
AntiD
Negativo
+
Controle de Rh Positivo Negativo
Indeterminado* +
' Com1nuar - Fazer exclusão para O-Fraco
382 [ Medicina laboratorial para o clínico
Rh(D)
+
Indeterminado
Resolução de problemas Resolução de problemas de ABO: • prova direca: auco-aglutinina reaciva a frio - Manrer o sangue a 37°( após a coleta. - Lavar as hemácias várias vezes com solução salina fisiológica aquecida a 37°( anres do teste. - Fazer reste de conrrole em paralelo para determinar a persistência ou não da auco-aglutinina (usar albumina bovina a 6% em salina) - Se o conrrole for negativo, a reação com os soros AnriA e AnriB é válida. - Se a auco-aglutinação ainda persistir, a interpretação poderá ser difícil, mas a observação atenra da imensidade da reação poderá ser informativa. - Como a auco-aglutinina a frio é sempre uma lgM, o uso de agenres capazes de provocar adesnaturação da lgM poderá justificar o seu emprego, como o 2-mercapcoetanol ou DTT. • prova Reversa - Quando o soro reage com a hemácia do grupo "0", o resultado pode não ser confiável. - Repetir o teste com o soro e as hemácias A, 8, O pré-aquecidos a 37°C. - O soro de alguns pacientes pode não reagir a 37°C. - Fazer auco-adsorção ou adsorção com hemácias homólogas. • facor Rh - Auco-aglucinação espontânea por auco-anricorpo a queme ou a frio pode causar discrepância na ripagem do Rh - Alguns procedimentos usados na ripagem do ABO também aq ui se aplicam.
Determinações dos tipos ABO e Rh em gel
Tipagem sanguínea ABO/Rho (D) - (técnica gel-cencrifugação, ucilizando soro monoclonal) A técnica em gel é um mécodo relativameme novo para: • microcipagem de grupos sanguíneos; • pesquisa/titulação e idemificação de anticorpos irregulares; • provas pré-transfusionais de compatibilidade.
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
O sistema dispõe de cartão (cartela) com seis microcubos para as reações, o que cem permitido executar a rotina hemmerápica com vistas, enrre outras, à padronização, sensibilidade, facilidade da leitura (estável por 48 horas), emprego de anriglobulina humana sem a necessidade de lavar as hemácias, mais segurança nos resultados e aucomatização da rotina. Princípios do teste • composição do gel - é utilizado o sephadex com três apresentações: - gel neutro: sem adição de qualquer oucro constituinte (anti-soro específico). - gel específico: adição ao gel de anticorpo específico. - gel anriglobulina: adição ao gel da antiglobulina humana. • forma e volume do microtubo: - O microtubo tem uma forma que lembra um funil - largo na sua extremidade superior, o que permite a incubação das reações acima do gel. empregando volume de hemácias quatro a cinco vezes menor que o teste em tubo. o que melhora a relação soro/hemácias. - A parte intermed1ána é longa. levando-se em conta o tamanho total. para assegurar o conraco íntimo das hemácias com o gel durante a centrifugação. - A parte inferior é cônica, onde as hemácias poderão formar um depósico ao atravessar o gel, após a centrifugação (Figura 32.2). • formação da aglutinação. - Quando as hemácias não sofrem ação de constituinte do gel. por serem mais densas, passarão através dele e sendimentar-se-ão no fundo do microtubo por força da cemrifugação. - No gel específico. as aglutinações formadas pela ação do constituime não passarão pelo gel, ficando retidas na sua parte superior, sendo classificadas conforme padrões de positividade de 1 + a 4 +. - Nos testes que envolvem o emprego da antiglobulina humana (testes pré-transfusionais de compatibilidade. pesquisa e identificação de anricorpo irregular), as hemácias serão sensibilizadas na fase de incubação a 37°(, como já foi dica. na parte superior do microtubo. Aglutinam-se por ação da anriglobulina humana e ficam retidas aci-
383
ma do gel, após centrifugação. Quando a sensibilização das hemácias não acontece (ausência de anticorpo irregular), elas passam através do gel e depositam-se no fundo do microcubo após a centrifugação. Portanto, a técnica dispensa o processo da lavagem.
B
o tvH
monoclonal
I ctl
II~A_,_,~~~-: Prova rev./Rev gr Grupo inverso
Figura 32.2 -Modelo de cartão (cartela) para tipagem ABO (di reta e reverso) e Rho(D). Ver prancha colorida
Os materiais necessários para o procedimento técnico estão listados no Quadro 32.24
Quadro 32.24 - Tipagem Rho (D) em gel Materiais/Equipamentos Centrífugas (especial e laboratorial) Dispensador M icropipetas Ponteiras Tubos de hemólise:(l Ox75/ l2/ 75mm) Estação de trabalho (suporte para tubo e cartão)
Reagentes/So lução
Cartões (cartelas):ABO (com prova reversa)/Rho D Reagente de hemócias A1 e B Diluente - LISS
Procedimento
• centrifugar a amostra; • identificar o cartão (canela) ABO/Rho - nome/ número; • pingar uma gota de hemácias A1 e Bnos respectivos microtubos (5° e 6°- prova reversa);
• piperar 50 (JL de soro/plasma nos microtubos A1(5°) e B(6°); • dispensar 0,5 ml de diluente (LISS) em um tubo de hemólise e piperar 25 (JL de concentrado de hemácias da amostra; • homogeneizar; • pipetar 10 f.!L de suspensão de hemácias nos microtubos: A-B-0-Ct!; • centrifugar por 10 minutos (centrífuga própria). • leitura; • anocar os resultados no próprio cartão. A vizualização das provas direta e reversa pode ser observada na Figura 32.3 e a interpretação no Quadro 32.25. OBS: O microtubo Ctl (controle) deve ser sempre negativo, caso contrário, significa provável presença de autoanticorpo e as provas direta e reversa serão discordantes. Padrões de leitura das reações
• reação negativa: - Todas as hemácias encontram-se sedimentadas no fundo do microtubo, formando um "botão" (Figura 32.4). • reações positivas: - Fraca: hemácias parcialmente sedimentadas, mas dispersas na parte inferior do gel (25%) ou acima do "botão" (Figura 32.5). - 1+: Hemácias dispersas na parte inferior do gel de 50 a 75% (Figura 32.6). - 2+: Hemácias dispersas até a parte superior do gel de 75 a 100% (Figura 32.7). - 3+: Hemácias dispersas na parte superior do gel (50%) ou na sua superfície, com forte penetração neste (Figura 32.8). - 4+: Hemácias formando uma linha compacta na superfície do gel ou com leve penetração neste (Figura 32.9). - Dupla população: reação de 3+ a 4+ e hemácias sedimentadas no fundo do microrubo (Figura 32.10). São condições para o aparecimento de dupla população: pós-transfusional (heterogrupo); pós-TMO; hemorragia feto-materna grave; pós-exsanguíneo-uansfusão; subgrupos de A; contaminação da amostra; resíduos de fibrina (amostra inadequada); e antígenos enfraquecidos (RN - idosos - leucemias).
384 [ Medicina laboratorial para o clínico )1------- - - -- - -- - - - - -- -- - - -- -- - - - -
Figura 32.3 - Exemplos de t1pijicaçào ABO (direta e reversa) e Rho(D). Ver prancha colot1da
Figura 32.4 - Exemplo de reaçào negativa em gel. Ver prancha
colonda
Determinações dos tipos ABO e Rh em microplaca
A microplaca é encontrada no mercado com várias configurações para 12 determinações de grupos sanguíneos, cuja escolha dependerá do objeto específico de cada serviço. Poderá vir ou não com anticorpos monoclonais adicionados e dessecados aos poços, facilitando sobremaneira o trabalho de ri pagem sanguínea ABO/ Rho(D). É constiruída de 12 filei ras de oito poços cada uma. Não é necessário preparo prévio do paciente/doador para a coleta da amostra, que será obtida conforme técnica convencional de fleboromia em citraro, EDTA, heparina ou CDPA-1.
Os materiais necessários para o procedimento técnico estão listados no Quadro 32.26. Procedimento
• centrifugar a amostra; • preparar suspensão de hemácias-teste a 0,8%, dispensar em cubo de hemólise 1 ml do dil uente e pi petar 12,5 jJ Lde concentrado de hemácia ou 25 j..!L de sangue total; • homogeneizar.
Quadro 32.25 - Tipagem ABO (direta e reversa) e Rho(D) - gel teste
ABO Di reta
Rho(D) Reverso
Microtubo A Microtubo B Microtubo
Resultado
Microtubo B
Resultado Microtubo D
Al +
+ +
+
A
AB
+
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
+
+
B
+
+
Microtubo Ctl
+
+
+
Indeterminado
o
385
Figura 32.5- Exemplo de reação positiva fraca em gel. Ver prancha
Figu ra 32.7 - Exemplo de reação positiva 2+ em gel. Ver prancha
colorida
colorida
Figura 32.6 - Exemplo de reação posit1va 1+ em gel. Ver prancha
Figura 32.8 - Exemplo de reação posit1va 3+ em gel. Ver prancha
colorida
colorida
Prova direta do ABO/Rh
Observação: a suspensão de hemácias-teste não deverá ser utilizada após lS minutos, pois a bromelina (diluente) em cantata prolongado com as hemácias poderá favorecer aglutinações inespecíficas pela diminuição do zeta potencial.
• adicionar 50 11L da suspensão de hemácias do doador/paciente nos respectivos poços do microplaca contendo os anticorpos: AntiA, AntiB, AntiAB, AntiD (lgM), AntiD(IgG), controle Rh (Ctl).
386 [ Medicina laboratorial para o clínico )~------------------------------
Quadro 32.26 - Tipagem ABO/Rho(D) em microplaca com amicorpos monoclona1s ad1cionados Materiais/ Equipamentos
Reagentes
Dispensador Micropipetos
Ponteiras Centrífugo poro microploco Centrífugo laboratorial Agitador específico Tubo de hemólise 11Ox75/12x75mm)
Reagentes de hemócios Al e B Diluente: bromelino
Leitura Após a centrifugação:
Figura 32.9 - Exemplo de reação pos1riva 4+ em gel. \ d v.íg1na 381
• agitar fortemen te a microplaca por do1s a três segundos (ressuspensão do sedimento dos poços); • agita r com velocidade média por um a dois minutos (ressuspensão completa dos poços negativos); • agitar em velocidade mínima por um minuto (agrupar as aglutinações no centro dos poços); • ler imediatamente as reações em até um m1nuto após a ag1tação. po1s em 50 segundos as hemáe~as começam a sedimentar dific ultando ou mesmo impedindo a correta imerpreração. Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.27. Observações
F1gura 32.10- Exemplo de dupla população, reação pos1t1va 3+ a 4+. 1e1 oa 110 ~" Prova reversa do ABO
• pipetar 50 f.JL do plasma/soro do doador/paciente nos respectivos poços da m1croplaca; • adic1onar uma gota de reagente de hemácias A1 e B; • agitar a microplaca por 30 segundos na velocidade média; • 1ncubar por 10 minutos à temperatura ambiente; • centrifugar por 90 segundos a 900rpm;
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
• d-fraco pode apresentar reação negativa. Recomenda-se confirmar por outros proced1menros, Já refendas; • reações fracas ou duvidosas devem ser repetidas por outras técnicas; • reações atíp1cas devem ser escudadas em particular; • aglurin1nas tnespecíficas podem causar hemólise; neste caso. incubar soro a 56°( por 10 minutos e repetir o teste; • alros títulos de AntiA e AnnB podem causar hemólise das hemácias A1 e B; • poderá acomecer discrepânCia entre as provas direta e reversa do ABO nos casos de recém-nasCIdos (ausência). idoso ou pacientes portadores de agamaglobulinemia (ausência ou atenuação).
387
Quadro 32.27- Tipagem ABO (direta e reversa) e Rho(D) - microplaca Rh
ABO Di reta AntiA
AntiB
+ +
Reverso AntiAB
Al
+ +
+
+
+
AntiD
A
+ -/+
B
+
AB
Limitações:
• contaminação bacteriana do material; • os equipamentos devem ser específicos e recomendados pelo fabricante, além de checagem periódica; • não modificar a técnica ou incluir outros diluentes.
A REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO ERITROCITÁRIO
Antígenos eritrocitários
Os antígenos são estruturas estranhas a um determinado organismo, solúveis ou fixados à superfície de uma célula ou tecido que, em contato com eles, geram resposta contrária a eles, mediado pelo sistema imunológico. Esse sistema tem três elementos que serão usados na ligação ou reconhecimento desses antígenos: anticorpos, receptores de células T e moléculas do MHC. Os antígenos eritrocitários de grupos sanguíneos começam a se expressar a partir da quinta semana de gestação, como é o caso dos antígenos ABH e Lewis, entretanto, outros são expressos fracamente nas hemácias de recém-nascidos (I, Lea, Leb e Sda). alguns mais fracamente na infância do que nas hemácias do adulto (A. B, Pl, Lua, Lub, Yta, Xg e Vel) e existem sistemas que podem estar completamente desenvolvidos ao nascimento (Rh, Keil, Duffy, Kidd, MNSs, Coa). Vários são demonstrados em células precursoras das hemácias, como é o caso do A1, B, H, I, Rh, MNSs, Keil, Lewis, Duffy e Kidd.
Ctl
Resultados
B
+
+
388 [ Medicina laboratorial para o clínico
Resultados
+
+ O-Fraco +
o Os antígenos eritrocitários situam-se ou mesmo fazem parte da integridade de estruturas importantes da membrana das hemácias ou estão associados à anormalidade estrutural, quer seja pela sua presença ou ausência. Ex: Rhnull é associado à anemia hemolítica; fenóti po McLeod à acantocirose; sistema Duffy à malária; P à susceptibilidade à infecção por Escherichia coli no trato urinário; etc. Na prática cransfusional, são encontradas cinco situações freqüentes e importantes em relação à resposta do sistema imune a esses antígenos: • antígenos que têm habilidade de provocar resposta rápida e eficiente, pois são altamente imunogênicos, ex: Rh, Keil, Duffy e Kidd; • antígenos que têm a capacidade de reagir forte e especificamente com o produto da resposta, por apresentarem alta antigenicidade, ex: ABO e Rh; • certos indivíduos que não reagem à estimulação, apesar de estímulos sucessivos durante anos seguidos, ex: pacientes crônicos que necessitam de transfusões freqüentes e não desenvolvem aloanticorpos, os questionamentos são: a) incompetência do sistema imune pela idade; b) doença de base; c) hemácias com grande expressão antigénica; • intolerância aos próprios antígenos, com produção de auto-anticorpos contra células ou tecidos, ex: anemia hemolítica auto-imune; • medicamentos que são adsorvidos à superfície do antígeno, formando um "complexo antigénica novo" (neo-antígeno), induzem resposta específica para antígeno de grupo sanguíneo. Se o antígeno presente estiver envolvido com o neo-antígeno, não raramente tem especificidade para o Rho(D), ex: alfa-metildopa.
Anticorpos de grupos sanguíneos
formado na primeira exposição ao antígeno-aloimunização primária com produção de baixos títulos.
Os ancicorpos são imunoglobulinas (lgs) que aruam sobre os ancígenos na superfície da hemácia, podendo lgG
ser nacurais (regulares - amicorpos previstos) ou por estímulos com hemácias escranhas (aloamicorpos, anticorpos irregu lares ou amicorpos imunes). Atuam em
Ea imunoglobulina m ais abundame no plasma, re-
combinação com o amígeno e medeiam vários efeitos
presentando 80% de todas as imunoglobulinas, com
biológicos. Os ancicorpos que apresencam interesse
concentração m édia de 12 g / L (de 8 a 16 g/L). Molé-
imunohematológico são das classes lgM e lgG.
cula monomérica, de 160.000 daltons, com dois sítios de ligação. É anticorpo "q uente", ativo a 37°(, mas não provoca aglutinação d ireta de hemácias. necessita de
lgM
meio artificial para a visualização da reação antígenoanticorpo. A lgG é a expressão da resposta do siste-
Os exemplos clássicos
e de
ma imune com ocorrência de ±1% por unidade de
importância capital são
os amicorpos nacurais do sistema ABO.
hemácias transfundida, mas pode ter ocorrência em pessoa sem história transfusional entre 0,3
A concemração plasmática é de 0,5 a 2,0 g/L, com
e 2%, com
e meia-
especificidade para amígenos de grupos sanguíneos, o
vida de cinco dias. Molécula pemamérica, de 900.000
que justifica sua pesquisa sistemática em doadores de
predominância de 74% no espaço imravascular dalcons
e
com múltiplos domínios funcionais, o que a
sangue. Pode ser subdividida em quatro subclasses lgG1, lgG2, lgG 3 e lgG 4 , que diferem entre si na estrutura, função e concentração no plasma: lgG 1 - 6,63 g / L;
corna uma porence ativadora do complemento, classificada como a imunoglobulina mais efetiva nessa função.
lgG 2, 3,22 g/ L; lgG 3, 0,58 g/L e lgG 4, 0,46 g/L, salienta ndo-se a grande habilidade de ativar o complemenco da
Provoca hemól ise incravascular grave em caso de transfusões incompadveis, com volume relativamente pequeno
e
lgG 3, seguida da lgG 1 _A lgG 2 é muito menos efetiva na
não atravessa a barreira placemária, por isso não
e a lgG 4 é incapaz de ativá-
provoca doença hemolítica do recém-nascido (DHRN).
ativação do complementO
É considerado anticorpo "frio" com amplitude térmica
la. A lgG1, lgG 3 e lgG 4 atravessam facilmente a barreira placemária, mas a lgG 2 não a atravessa.
de ação de 4° a 37°(, com expressão ótima de ação em corno de 18°C. Possui capacidade de promover agluti-
Características das imunoglobulinas M
nação direta de hemácias em meio salino. É o anticorpo
e G são mos-
tradas no Quadro 32.28.
Quadro 32.28- Características da lmunoglobulinas M (lgM) e G (igG) Características
lgM
lgG
1
4
195
7S
900
160
Sublcasses Constante de sedimentação Peso Molecular Kdo M obilidade eletroforérico Sítios de ligação do antígeno Fixação de complemento
Entre
f3 e y
y
10
2
Sempre
Algumas vezes
Passagem pela barreiro p la centária
Não
Sim
Aglutinação d ireta do hemócia
Sim
Usualmente não
Hemólise in vivo
Sim
Não
AntiA e AntiB
Anticorpos Anti-Rh
Exemplo
A spectos laboratoriais da hemoterapia
389
Combinação antígeno- anticorpo
Açào envolvendo a lgM As hemácias não se chocam umas comra as outras, mas guardam cerra distância entre si por força repulsiva, em conseqüência à elerronegatividade existence na superfíoe da membrana promovida pelo grupo carboxílico (COOH-). A magn1rude dessa carga atrai íons Na+ carregados positivamente e íons Cl- negativos. Os íons se alinham em determinada seqüência a partir da membrana da hemácia para formar, ao seu derredor, uma nuvem elecrónica que se rorna menos densa à medida que se afasta da hemácia, criando, assim. uma diferença de porencial chamada de "zeta pmencial". Portamo, a força de repulsão entre as hemácias depende desse zeta porenoal, que pode ser calculado pela fórmula desenvolvida por Pollack.
I z. o:,, I Z ~ zew porenoal; y = elerronegattvrdade da llemóoa. O con1ta111e drelémco do me•o; 11 =força rômca do mero
Para a interaçào antígeno-ant1corpo Há que se considerar três variáveis: a carga da superfície das hemácias. a constante dielérrica do meio e a afinidade emre amígeno-amicorpo. Para a coesão ser mais eficiente. há necessidade de um somatóno de reações, como: pomes de hidrogénio, forças elerrostát1cas e de Van Der Waals e ligações h1drofóbicas. Para a complememaridade esrrurural emre a inceração anrígeno-anricorpo, há duas fases: a primeira é realmente o envolvimento do anticorpo à superfície da hemácia; a segunda. a formação da aglutinação englobando várias hemácias e. neste caso. o anticorpo deverá ser capaz de vencer a distância enrre as hemácias.
Aglutinação di reta
Os anr1corpos Anc1A e Am1B do ABO são os melhores exemplos, pois vencem com relativa facilidade a distância entre as hemácias quando suspensos em meio salino e causam aglutinação di reta. Essa aglutinação pode ser observada macroscopicamenre, quando se misruram hemácias e anticorpos lgM. incubando a temperarura ambiente por alguns
390 ( Medicina laboratorial para o clínico
segundos e/ou pela cenrrifugaçào rápida. A imensidade da reaçào poderá ser expressa conforme padrões, variando de 1+ para aglutinações leves a li+ para imensidade máx1ma.
Hemólise
Os ancicorpos AnriA e AnriB do ABO causam lise das hemácias anrígeno - positivo in vivo, podendo também acontecer in vitro quando os testes são incubados a 37°C. A hemólise in vivo é o resultado da ação do "complexo de ataque à membrana", como o resultado fi nal da arivação do complemento. que causa inúmeras perfurações na membrana, por onde escapa a hemoglob1na.
Ativação do complemento
Complemento é o nome dado ao conjunto de aproximadamente 20 proreínas séricas Sintetizadas principalmente no fígado que. em resposta a estímulos, os componemes reagem em cascata seqüencial. na qua l o produto de uma reação catalisa a próxima. Os produros rêm potemes efeitos biológicos: promovem inflamações a partir da qui miotaxia, aumemando a permea bilidade vascular. e causam lise celular. diretameme com a formação do "complexo de ataque à membrana" (MAC) ou indiretamenre, pela formação do produto C3b, que estimula células efetoras na fagocitose. A ativação do sistema do complemento ocorre por meio de duas vias distintas: a clássica e a alternativa. que convergem para a seqüência terminal em via comum. O quadro 32.9 apresenta a rermologia utilizada para esse sistema
Quadro 32.29 - Term rnologra do Slsrema de complemento Estado do Componente
Nomenclatura
M oléculas precursoras
l elra maiúscula C seguida de um número no caso das vios clássico e comum ex: Cl, C2. C4.
Frogmenlos
Suf1xo em lelro minúsculo. ex: C2o. Bo
Componenles olivos
Borro sobre os símbolos, ex: C 4b2o
Componentes •na11vos
Prelixo com o lelro i, ex: iC3b
Via clássica
O primeiro componente do Complemento é o Cl, formado por seis moléculas chamadas Clq e duas de cada um de outros dois componentes Clr e Cls. As quatro moléculas de Clr e Cls ligam-se às seis moléculas de Clq, que se arranjam em forma de "feixe" numa interação cálcio-dependente, que na ausência de cálcio dissociase do sistema e perde sua ação ativadora da cascata do complemento. Esse fato parece ser observado no uso de anticoagulantes quelantes de cálcio (citrato-oxalato) que retiram a capacidade de ativação pela remoção não só de cálcio, como de outros íons necessários à seqüência. Quando o Clq se liga ao anticorpo. o C1r é clivado para dar uma molécula de Clr ativado que. por sua vez. cliva o C1s. O Cls ativado dará continuidade ao processo. clivando o próximo componente, que é o C4, em dois fragmentos: C4a e C4b ativado. O C4b ativado continuará o processo, sendo que o C4a permanece livre no meio com modesta atividade biológica. O C4b ativado na superfície da célula atrai moléculas de pró-enzimas e se liga a C2. Este é clivado pelo C1s ativado em dois fragmentos: C2a ativado e C2b, sendo que este último sem atividade biológica. Um único C1qrs ativado pode ativar numerosas moléculas de C4 e C2 (de 100 a 200 moléculas). O C4b2a é chamado C3 convertase. O (3 convertase, agora formado em grande número na membrana ou superfície. é uma potente protease, sendo que uma única molécula cliva mais de 200 moléculas de C3, que é o seu substrato. A clivagem de C3 resulta em uma das mais importantes ações biológicas do complemento e, a continuidade do processo. a geração de dois fragmentos: C3a e C3b ativado. Esse mesmo evento pode ocorrer em outra via - a via alternativa. Via alternativa
A via alternativa permite a atividade do complemento mesmo na ausência de imunidade adquirida. Esta via constitui a primeira defesa antimicrobiana dos vertebrados. caracterizada por fenômeno ativo de superfície, que pode ser disparado em diversas situações, como: membrana de microrganismo, endotoxinas, complexos protéicos. algumas células tumorais. agregados de imunoglobulina, etc. O C3b ativado associa-se ao fator B. formando o complexo
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
C3bB. O Mg++ é importante, pois acua como substrato do fator D, gerando o complexo C3bBb ativado. pela remoção de Ba. capaz de co ntribuir para formar mais moléculas de C3b ativado. O C3b ativado pode causar destruição de células estranhas (ex: bactérias), mas não de células próprias, e o processo de ampliFicação é lim itado pela degradação contínua de iC3b pela ação conjunta dos fatores H e I. Via comum À medida que grande número de C3b ativado é
gerado, combinará com C4b2a para clivar o CS em dois fragmentos, sendo o CSb uma molécula ativa (CSb ativado) e o CSa uma potente anafilocoxina. O CSb ativado na membrana líga-se ao C6 e C7, resultando em um complexo trimolecular C5b67 ativado. Esse complexo é inserido com eficiência de quase 100% em fosfolipídios da membrana das hemácias. O C8, quando se liga ao C5b67 ativado, é também inserido na membrana, provocando o aparecimento de poro. A presença de C5b678 ativado permite ligar e polimerizar o último componente - C9. Forma-se, assim, o "complexo de ataque à membrana". Várias moléculas de (9 (de 12 a 15) podem aglomerar-se em torno de um complexo de C5b678 ativado, provocando a formação de poro ou grande canal, que perfura a membrana e permite o extravasamento do conteúdo intracelular. A célula fica letalmente danificada, com evolução para lise. Regulação da ativação do complemento
Existe mecanismo que controla a am plificação do sistema para prevenir danos aos próprios tecidos e conservar os componentes do complemento. Ocorre em três estágios: • decaída espontânea da atividade enzimática de complexo pela pequena vida-média; • controle procéico, que modula a atividade de certos componentes, p.ex: o (1 inibidor bloqueia as atividades de C1r e C1s; a função do fator H destrói a atividade de C3 convenase na via alternativa; e o fator I na presença de certos cc-fatores pode inativar C3b ativado e C4b ativado;
391
• controle do "complexo de ataque à membrana", mediado pela proteína S que, por competição, liga-se ao complexo C5b67.
A~ão envolvendo a lgG
A interação antígeno-anticorpo, com envolvimento de lgG, não promove aglutinação direta ou hemólise. A distância existente entre as hemácias e o tamanho da molécula de lgG impede que tal aconteça. Portanto, não é possível evidenciar a presença de lgG na expectativa de tal observação naturalmente, havendo, pois, a necessidade de incluir meios artificiais e especiais, in vitro, para cal. Identificação in vitro do envolvimento de lgG
Numerosas variáveis são capazes de influenciar a reação amígeno-anticorpo com envolvimento de lgG. Na prática, tem-se buscado entender essas variáveis para estabelecer testes que possibilitem a pesquisa, indiretameme. A maioria delas baseia-se na formação final de aglutinação. Estágios da reação
• sensibilização - o anticorpo liga-se ao sítio antigênico na membrana da hemácia e essa fixação (sensibilização) ocorre quando estão presentes antígeno e anticorpo específicos simultaneamente. É um processo dinâmico em que se procura estabelecer equilíbrio entre complexos antígeno-anticorpo e anticorpos livres; há o grau de associação (Kl) igual ao grau de dissociação (K2). Assim, a reação torna-se estável ou relativamente estável. [
Ag+Ac
AgAc
a) Concentração antígeno-anticorpo - essa variável pode ser influenciada pela concentração do antígeno (excesso de antígeno - efeito de pós-zona) ou pela concentração do anticorpo (excesso de anticorpo - efeito de pró-zona) de tal maneira que as orientações técnicas devem ser respeita-
das rigorosamente, tanto as diluições de hemácias quanto o volume fornecido de anticorpo (quantidade), evitando-se o desequilíbrio na reação. b) pH - a reatividade da grande maioria de anticorpos de grupos sanguíneos é melhor em pH de 6,5 a 7,5. c) Força iônica - em solução salina, os íons Na+ e Cl. são neutralizadas parcialmente pela carga oposta de antígeno e anticorpo. A diminuição de força iônica do meio aumenta a atração eletrostática pela redução do efeito proceror dos íons Na+ e Cl. que, por sua vez, aumenta a formação de complexos antígenos-anticorpo. Na prática, tem sido usada com freqüência a solução de baixa força iônica (Low lonic Strenght Solution - LISS), inclusive com redução do tempo de incubação. - Albumina bovina - a albumi na bovina tem sido utilizada para modificar o meio, promovendo redução de cargas elétricas negativas na membrana ou afetando a tensão interfacial entre as hemácias, favorecendo a ação de anticorpos. É encontrada no comércio em concentrações de 22 a 30%. - Enzimas- as enzimas proceolíticas, tais como: bromelina, ficina, papaína e tripsina, têm sido empregadas por favorecer a reacividade de anticorpos contra os antígenos dos sistemas Rh, Kidd, Lewis e P, embora possam desestruturar alguns amígenos, cais como: M, N, S, Fl e Fyb Atuam por dois mecanismos: i. redução de carga elétrica de superfície favorecendo a aproximação das hemácias, por dim inuição do zeta potencial; e ii. remoção de estruturas que escericamente impedem o acesso das moléculas de anticorpo. Ex: protease como a papaína remove polipeptídeos estruturais e a neuram inidase é ma is específica para o ácido siálico (carga elétrica negativa). - Polietileno glicol (PEG) - é um polímero hidrossolúvel usado como aditivo para aumentar a efetividade do anticorpo. Sua ação consiste em remover a água e, deste modo, abrir mais espaço em torno da hemácia, promovendo uma concentração maior de anticorpo e efetividade. A antiglobulina humana (AntilgG) é o reagente de escolha com PEG. Não deve ser a escolha para o trabalho com
392 ( Medicina laboratorial para o clínico )~-----------------------------
lgM, nocadamenre nos sistemas ABO e Lewis, pela diminuição ou falha na reação. Se for usado em alta concentração, pode provocar prec1p1tação de proteínas no plasma, fibrinogênio ou níveis elevados de lgG, faco que pode ser Interpretado como aglutinações. O PEG pode ser usado conjumamenre com o LISS. Não é vantajoso trabalhar com paciente portador de anemia hemolítica auco-imune, por realçar significativamente anticorpos quentes. Após a incubação com o PEG, as hemácias-teste devem ser imediatamente lavadas para o reste com a anriglobulina humana (AGH). d) Temperatura - a lgG reage melhor em temperatura de 37°C. Aquela que reage in vitro somente a temperatura abaixo de 37°( não é considerada clinicamente importante. e) Tempo de incubação - Dependerá do me1o utilizado. Procura-se o tempo em que o equilíbno entre a associação e a dissociação passa a ser estabelecido. Ex: em meio salino incubar por 60 mmutos; em album1na bovina, por 30 minutos e, em LISS por 10 minutos. Influência do número de sítios anrigênicos- não obstante o conhecimento da incapacidade das lgGs em promover aglutinação de hemácias em meio salino diretameme, algumas exceções podem ser vistas, como: lgG AntiA, AntiB e AntiM, enquanto que lgG antiD não é capaz. Esse fato é explicado baseado no número de sítios de A, que é cerca de 100 vezes supenor ao número de sítios para D. f) Outros fatores também são destacados: - Grau de projeção do antígeno, além da membrana. Ex: antígenos A e B se projetam substancialmente da base lipíd1ca da membrana da hemácia, enquanto que o Rho(D) não o faz. - Proximidade de um sítio antigênico de outro. dependente do número de sítios por hemácia, da extensão dos sítios na membrana e da possibilidade de formar grupos. • Segundo estágio - como não há formação de aglutinações d1 retamente no envolvimento de anticorpos lgG, várias estratégias têm sido desenvolvidas com aplicação prática para que esse fenômeno Seja demonstrado ou pesquisado. A antiglobulina humana (AGH) do soro de Coombs comb1na seus
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
dois sírios Fab com porções Fc de dois anticorpos fixados em sítios adjacentes na superfície das hemácias, formando uma aglutinação visível. Ames da adição do AGH. as hemácias devem ser lavadas com solução salina fisiológica para desprezar as oueras globulinas próprias do plasma/soro e que não interessam na reação (sobras) e assim evitam o resultado falso-negativo pela neutralização da AGH.
TESTE DE COMPATIBI LI DADE SOROLÓG ICO (PRÉ-TRANSFUSIONAL) Os testes de compatibilidade sorológicos pré-transfusJonais constituem um conjunto de normas, exigências e procedimentos que visam ao maior benefício possível e segurança na transfusão de sangue rotai e hemocomponentes.
Exigências, normas e procedimentos
São prescritas pela agênc1a reguladora e fiscalizadora das atividades na hemorerap1a - Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Para o atendimento transfusional. são necessários: • revisão da história transfusional do paciente no serviço; • ripagem sanguínea ABO/Rho(D) do paCiente; • Retipagem sanguínea ABO/Rho(D) do doador (bolsa); • pesquisa de anticorpo irregular (PAI); • reste de autocontrole; • reste de compatibilidade maJor (prova cruzada) entre o soro/plasma do receptor comra as hemácias do doador (amosua de bolsa}; • revisão da história transfus1onal do paciente no serviço. Os serviços de hemocerapia são obrigados a ter um sistema de registro adequado (ANVISA RDC n°153 - 14 de junho de 2004) que permita a rastreabilidade da unidade de sangue torai ou do hemocomponeme, desde a sua obtenção até o seu destino final. Incluem-se todos os exames de laboratório referentes ao atendimento (doador/ paciente) por um período de 20 anos. São obrigados, ainda. a informar, quando solicitados. dados
393
de seus registras às "Auroridades Sanitárias", relativos ao atendimento de uma transfusão (dados do doador e paciente). São dados que independem propriamente do serviço, sobretudo com referência aos da solicitação médica da transfusão. Deve ser feiw em formulários específicos que contenham informações claras e suficientes para a correta identificação do recepto r, além dos seguintes dados: nome completo do paciente, sexo, idade, peso, número do prontuário ou registro na Instituição, número do leito (para paciente internado), diagnóstico, antecedentes rransfusionais, hemocomponentes solicitados (volume ou quantidade de unidades), tipo de transfusão, resultados laboratoriais, que justifiquem a indicação do hemocomponente, data e hora, assinatura e o CRM do médico solicitante, com letra legível e sem rasuras. A ANVISA faz, ainda, uma advertência formal: "Uma requisição incompleta, inadequada ou ilegível não deve ser aceita pelo serviço de hemoterapia". Para os desavisados, pode parecer enfadonho o preenchimento de todos os dados. mas pode-se afirmar que todos eles têm sua importância e razão de existi r; • ripagem sanguínea ABO/Rho (D) do paciente Tipificação do ABO - o grupo sanguíneo ABO deve ser determinado com a classificação direca e a prova reversa. Se houver discrepância emre as provas. ela deve ser resolvida ames da transfusão. Para a determinação do fator Rh(D), se a reação for negativa, deve ser efetuada técnica para exclusão de O-fraco. Quando a prova para D ou O-fraco resultar positiva, o sangue deve ser rotulado como "Rh-positivo". Quando ambas as reações resultarem negativas, o sangue deve ser rotulado como "Rh-negarivo". Receptores Rh(D) negativos devem receber sangue total ou hemácias Rh(D) negativo, exceto em circunstâncias justificadas e desde que não apresentem sensibilização prévia (ANVISA); • retipagem sanguínea ABO/Rho (D) do doador (bolsa) "Os serviços de hemorerapia devem reclassificar os doadores usando amostra obtida de um segmento de tubo-coletor da bolsa - grupo ABO em todos os componentes erirrocitários a serem empregados no paciente. A reclassificação do fa-
wr Rho(D) só precisa ser feita em bolsas rotuladas como 'Rh-negativo'. Não é necessário repetir a prova para pesquisar O-fraco" (ANVISA; • pesquisa de anticorpo irregular - PAI A ANVISA normatiza o método para a pesquisa de anticor po irregular inesperado, no soro/plasma de doador/paciente, clinicamente significativo, com inclusão de: - Duas hemácias do grupo "0", randomizadas, amigenicameme diferences, que possuam a maioria dos amígenos de grupos sanguíneo. - Incubação a 37°C. - Utilização de AGH . - Sistema de controle para evita r resultados falso-negativos. Os anticorpos clinicamente significativos são aqueles presentes em adição aos esperados, antiA e amiBdo ABO, e são capazes de provocar reações transfusionais, quer seja diminuindo a sobrevida de hemácias tra nsfundidas (com manifestações clínicas importantes), quer seja na doença hemolítica de recém-nascido. O grau do significado vai depender da especificidade - alguns promovem hemólise importante e rápida; outros diminuem a sobrevida de hemácias em alguns dias, outros causam pouco efeito. • teste de autocontrole Para a interpretação da PAI, é importante saber se o soro investigado reage às próprias hemácias. Essa ajuda determina se é só aloamicorpo ou se há coexistência de auto-anticorpo. Assim, as próprias hemácias são postas em comato com o próprio soro/plasma em meio LISS e com o uso final de AGH. Soro/plasma que reage somente com os reagentes de hemácias I e 11 comém somente aloanticorpo; quando reage tanto com reagentes de hemácias I e 11 como com as próprias hemácias sugere auto-anticorpo ou ambos. Pacientes portadores de aloamicorpos e com história de transfusão recente podem ter hemácias de doadores circulando com aloanticorpos ligados que produzem auwcontrole positivo. Um quadro de campo misto pode ser interpretado como o começo de um auto-anticorpo. O teste de Coombs direto positivo pode significar a presença de auto-anticorpo. Quando este é encontrado no soro/plasma, a sua
394 [ Medicina laborawrial para o clínico)f-.- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
idemificação inclui prácicas para adsorver e para demonscrar a presença ou não de aloamicorpo. Princípio do teste
São ucilizados reagemes de hemácias (kits comerciais) de dois doadores do grupo "0", fenotipicamente diferentes, isto é, são hemácias cuidadosamente selecionadas que expressam, no mínimo, os antígenos para os siscemas demonstrados na Figura 32.11. Os anticorpos irregulares detectados nos tesres prérransfusionais devem ser identificados para sua especificidade e facilica r a seleção de hemácias fenot ipadas (antígeno-negativo) para a cransfusão, além de ser de grande interesse no pré-natal, cujas dificuldades sobressaem em crês situações: • aloimunização para antígeno de alta freqüência na população; • aloimunização múltipla; • possibilidade de DHRN grave.
Técnica em tubo
• se a leitura for negativa (sem aglutinações), adicionar uma gota de controle de Coombs (hemácia sensibilizada com lgG) e centrifugar a 1.000 rpm por um minuto; • leitura: positivo - procedimento válido; negativ -: AGH não funcioname ou neutralizada (lavagens inadequadas). (Quadro 32.30) Os resultados são interpretados de acordo com o Quadro 32.31.
Quadro 32.30 - Pesquisa de amicorpo irregular (PAI) - técnica em tubo Materiais/ Equipamentos Centrífugo laboratorial Tubos de hemólise (l0x75/ l2x75mml Suporte poro tubos M icropipetos Ponteiros Bonho·morio o 3rC Cronômetro/ relógio Microscópio
Reagentes/Solução
Reagentes de hemócios I e 11 Solução salino fisiológico 0,9% AGH
LISS Controle de Coombs
Procedimento
• centrifugar a amosrra (sem anticoagulante); • identificar dois tubos: I e 11; • colocar uma gota de reagente de hemácias I e 11 nos respectivos cubos I e 11; • pipetar 50 ~L de soro da amostra; • incubar 10 minutos a 37°C; • lavar três vezes em salina; • adicionar uma gora de AGH; • centrifugar a 1000 rp m por um minuto; • leitura macroscópica/microscópica;
Q uad ro 32.31 - Pesquisa de anticorpo irregular (PA I)- imerpretação de resultados Hemácias
Resultado 11
+
+
PAI · Positivo PAI · Positivo
+ +
PAI · Positivo PAI · N egativo
PAI - positiva : presença de anticorpo irregular: PAI - negativa: ausência de onucorpo lfregular ou anticorpo não detectado pela ausênoa de ontígeno especifrco nas hemtiCias I - 11.
Rh·hr
CCO.H
ft,ft ,
ccD.Ee
R.r
Figura 32.11 - Dwgrama da PAI, mostrando os antígenos presentes. Figura extraída do Manual de Técnica DiaMed-/0 (1994).
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
395
Técnica em cartão (cartela)
Procedimento
• centrifugar a amosua (soro/plasma); • identificar o cartão (cartela) com nome/número; • identificar dois microtubos e colocar uma gora do reagente de hemácia I no 1° microtubo e uma gota de reagente de hemácia li no 2° microtubo. • adicionar 25 J..!L de soro/plasma; • incubar por 10 minutos a 37°(; • centrifugar - centrífuga própria (dependendo do fabricante); • leitura. Os materiais necessários para o procedimento técnico encontram-se no Quadro 32.32 Para interpretação da intensidade, ver Figuras de 32.4 a 32.10.
compatibilidade do ASO- compatibilidade entre as hemácias do paciente e o plasma contido nos hemocomponentes. Devido às dificuldades na disponibilidade de CP, tem-se admitido, para adulto, a transfusão heterogrupo (ABO incompatível), isto é, paciente de grupo "A" recebe CP do grupo "O" ou "B". Esta conduta, no entanto, não deve ser permitida no recém-nascido e criança, pelo risco de hemólise mediada por lgM AntiA e/ou AntiB. "Para receptores Rh-negativo, de sexo feminino e com menos de 45 anos de idade, se as plaquetas forem de doador Rh-posirivo, deve ser realizada uma pesquisa de anticorpo irregular (PAI) na receptora. Se esta não possui AntiD, deve ser recomendada a administração de imunoglobulina Anti-Rho(D) (200 a 300 ug) por via intravenosa ou subcutânea, até 72 horas após a transfusão. Nas transfusões subseqüentes, deve ser repetida a pesquisa de AntiD; se este não for detectado, deve ser repetida a dose de imunoglobulina anti-Rho(D)" - (ANVISA RDC 153). Princípio
Quadro 32.32 - Pesquisa de anticorpo irregular (PAI) - técnica em cartão
Materiais/Equipamentos Centrífugo especia l Centrífug o laboratoria l Micropipetos Po nteiros Estação de traba lho (suporte poro tubos e cartão) Incubadora o 37°C Selad o ra
Reagentes
Reagentes de hemócio s I e 11 Cartão LISS-COOM BS
A transfusão de extrema urgência:
Teste de compatibilidade maior (prova cruzada)
A partir do conhecimento do ABO/Rh do paciente, os dados contidos na solicitação médica serão analisados para a escolha do hemocomponente mais adequado e seguro para o paciente. Portanto, mais uma vez exalta-se e justifica-se a necessidade de tais informações. Após a análise, o hemocomponente será escolhido no estoque. Para as transfusões de concentrado de plaq uetas (CP). plasma fresco congelado (PFC) e crioprecipirado de faror VIII (Crio), não haverá a necessidade de prova cruzada maior. A tentativa será sempre a respeito da
396 [ M edicina laboratorial para o clínico
Antes de roda e qualquer transfusão de sangue total (ST) e/ou concentrado de hemácias (CHM). excero nos casos de emergência, deve ser realizado teste de compatibilidade maior (prova cruzada). empregando-se hemácias obtidas do tubo-coleror de bolsa a ser transfundida e o soro do receptor. As técnicas que empregam o plasma devem ser devidamente validadas.
"A liberação de sangue total ou concentrado de hemácias sem provas de compatibilidade poderá ser feita, desde que obedecidas as seguintes condições: • o quadro clínico do paciente justifique a extrema urgência, isto é, quando o retardo no início da transfusão possa levar o paciente ao óbito; • existência de procedimento escrito no serviço. estipulando o modo como essa liberação será realizada; • termo de responsabilidade assinado pelo médico responsável pelo paciente, no qual afirma expressamente concordar com o procedimento; • as provas pré-transfusionais devem ser realizadas até o final, mesmo que a transfusão já renha sido completada.
)1-- - - - - -- - - -- -- - -- - - -- - - - -- -- - --
O médico solicicame deve ser informado dos riscos e será responsável pelas conseqüências do aro transfusional, se a emergência tiver sido criada pelo seu esquecimento ou omissão" (ANVISA. RDC - 153).
Técnica em tubo
Ver Quadro 32.33 Quadro 32.33 - Teste de compattbrhdade pré-transfusronal (prova cruzada) - técnrca em tubo Materiais/ Equipamentos Centrífugo Tubos de hemólise (10x75/12x75 mm) Suporte poro Tubos Micropipetos Ponteiros Lâmina de vidro M 1croscópro Banho-mario 3JCC Cronómetro - Relógio Seladora
Rea gentes/ Soluções
Soruçõo salino fosiorógico O9% LISS
AGH Controle de Coombs
Procedimento
• obter amostras de sangue sem amicoagulante do pacreme; • amostra do doador - segmento do tu bo colewr da bolsa; • centrifugar as amostras; • pipetar 10 !JL de hemácra do doador em um tubo de hemólise e identificar; • lavar uma vez com solução de LISS; • desprezar o sobrenadante e adicionar 0.5 ml de LISS; • para um cubo de hemólise identificado com o número da bolsa, transferir 100 !-!Lda suspensão acima. ptpetar 50 !JL de soro do paciente; • incubar 10 minuws a 37°(; • lavar três vezes em salina; • adtcronar uma gota de AGH (pohespecíftco); • centrifugar a 1.00 0 rpm por um minuw ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • leitura microscópica; • anotar resultados;
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
• para as provas compatíveis - ausência de aglutinação; • fa zer o controle da reação com o reagente "controle de Coombs", que contém hemácias previamente sensibilizadas com lgG; • adicionar uma gota do "controle de Coombs"; • centrifugar a 1.000 rpm por um minuto ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • leitu ra macroscópica: - Presença de aglutinações: bom padrão de prova cruzada e a AGH for incluída e está funcronando de modo adequado. - Ausência de aglutinação: a prova deverá ser repetida. cabendo as seguintes interpretações: 1. Falha na lavagem das hemácias para remover rodo soro/plasma (proteínas). O tubo deve estar cheio até ~ de sua capacidade; 2. Contaminação de AGH por proteínas estranhas; 3. Contaminação bacteriana do AGH; 4. Excesso de calor pode dimtnutr a reatividade. Seguir recomendações do fabncante para a eswcagem.
Técnica em cartão
Ver Quadro 32.34 Quadro 32.34 -Teste de compatibilidade pré-trans(usronal (prova cruzada) - técn ica em cartão Materiais/Equipamentos Centrífugo especial Centrífugo loboroloriol Micropipetos Ponteiros Estação de trabalho !suporte poro tubos e cartão) Incubadora o 3rC Seladora
Rea ge ntes/ Diluente
Diluente - LISS Cartão US5-COOMBS
Procedrmento
• obter amostras de sangue; • paciente: com ou sem anticoagulante (plasma/soro); • doador - segmento do cubo-coletor da bolsa;
397
• • • • • • • • • •
cenu ifugar as amoscras; idemificar o carrão com nome/número; preparar suspensão de hemácias do doador (bolsa); 10 ~ L de hemácias; 1.000 ~ L de LJSS (dilueme); idemificar o microcubo com o nú mero do doador (bolsa); piperar no microtubo 50 ~L da suspensão de hemácias e 25 ~L de plasma/soro do recepror; incubar por 10 minuros a 37°(; centrifugar - cencrífuga específica - por 10 minuws; ler.
In terpretação de resultados Compacível: as hemácias formarão um "bocão" no fundo do microrubo. Incompatível: aglutinações de hemácias dispersas no gel. Os resulrados da prova cruzada são imerprerados de acordo com o Quadro 32.35.
Decisão de transfusões incompatíveis "Quando os resultados das provas pré-transfusionais demonstrarem que não há sa ngue compatível para o recepror, o serviço de hemocerapia deve comunicar esse fato ao médico solicitame e, em conjumo com este, realizar uma avaliação clínica do pacieme. Caso seja feita a opção de se transfun dir sangue incompatível. esta deci-
Quadro 32.35 - Interpretação dos testes pré-cransfusionars de compatibilidade PAI
Autocontrole
Prova Cruzada
Diagnóstico
Negativo
Compatível
Ausência de anticorpos irregulares lauto ou ola)
Tronsfundir- transfusão seguro
Negativo
Incompatível
Ausência de anticorpos irregulares (auto ou alo)
N ão transfundir - testar outros doadores: quando um saro reage somente com um doador, há de se considerar que as hemácias do doador são ABO incompatível ou têm um teste de Coomb s di,eto positivo ou são poliaglutináveis; quase sempre esse doador se mostra incompa tível com outros pacientes ABO compatíveis
N egativo
Incompatível
Presença de aloanticorp o
Não transfund1r - solicitar idenrificaçõo da espeokidode do aloonticarpo (painel de herrácias) e repetir a prova cruzada com concentrado de hemácios fenotipodo.
Negativo
Compatível
Presença de aloanticorpa contra anlígenos dos reagentes de hemáCIOS I e/ou 11
Tro nsfundir - solicitar identificação da especificidade do aloanticorpo (painel de hemácias) para condutas futuras e solrcitar concentrado de hemácios fenotipado
Posi·ivo
lncampativel
Presença de auto-anticorpo que pode estar associada ou não a aloanticarpa
Não lransfundir - solicitar painel de hemác1as paro confirmar coexistência ou não de aloanricorpa, avaliar a história clínico e tronsfusional Se conf1rmar somente auto -anticorpos. as provas cruzados serão incompatíveis com todos os doadores; se confirmar a coexistência de oloanticorpo, solrc11ar concentrado de hemácias fenotipado para excluir a ação do alaonticorpo. mos as provas continuarão incompotiveis, pelo ação do auto-anticorpo
Negativo
Posit1va
Conduta
398 [ Medicina laboratorial para o clínico )1-- - - - - -- - -- - - -- - - - -- - - -- - - - - - - - - - -
são deve ser justificada por escrim. em termo que deve ser assinado pelo hemoterapeuta, pelo médico-assistente do paciente e, quando possível. pelo própno paciente ou por seu responsável legal" (ANVISA- RDC 153).
IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPO Quando um anticorpo irregular é detectado, a próxima conduta a ser deliberada será a identificação de sua especifiCidade, de grande interesse na medicina transfusional e pré-natal. Para tal. urli1za-se um painel de hemácias selecionadas, comendo um número variável de hemácias (ex: 11 hemácias - bastante utilizado em nosso meio), do grupo "0", cuja composição antigêntca seja conhecida e voltada para os grupos sanguíneos de interesse e apl1cação na hernorerapia. Os painéis de hemáCJas são obtidos de fornecedores comerciais, sendo que as hemácias são proveniemes de pessoas diferentes. As hernácias-teste são apresentadas em suspensão que varia de 1 a 5% em meio tarnponado e com conservante, tendo validade de até 28 dias. Na ror1na usual, não há necessidade de lavar as hernáCJas do painel comercial. Algumas vezes é necessário o uso de porencializador, ex: tratamento com enzimas proteolíricas ou outro meio que favoreça a reattvidade do anticorpo. O painel de hernácias é acompanhado de um d1agrarna específico para cada lore, com os resultados expressos dos antígenos presentes. com proposição para os antígenos dos sistemas já referidos no diagrama da PAI (Rh - Keil - Kidd - Duffy - Lewis - MNS - P - Luthera m - Xg e/ou Diego).
Princípio
As hernácias do painel são restadas contra o soro do paciente/doador com amplas variedades de restes, orientados conforme a necessidade, incluSIVe com as récn1cas apresentadas para a PAI (LISS - Coombs em tubo e gel reste cemrifugação). Po1s, há de se conceber que em urna pesqUisa de anticorpo irregular positiva pode-se rer apenas um aloanricorpo ou a coexistência de múltiplos aloanricorpos e/ou, a1nda. aura-anticorpo. A presença de múltiplos aloamicorpos e/ou de auto-anticorpo traz sénas dificuldades para a imerpreração dos resultados obtidos em um
Aspectos laboratoriais da hemorerapia
ún1co painel de hernácias e, não raramente, ex1g1rá récn1cas complementares com ampla variedade de resres. Ede fundarnemal importância na imerpreração das reações informações referentes à história clínica, gravidez. antecedente transfusional. dtagnósrico provável e/ ou definitivo e medicamentos usados pelo paciente. Ass1m, pode-se afirmar: • a observação do padrão da reação de restes positivos e restes negativos pode não ser apenas de aloanricorpo; • rearividade em diferentes fases do teste; • na renrativa de confirmação da especifiCidade de um simples aloanricorpo suspe1rado. poderão aparecer reações inesperadas, que deverão ser valorizadas e interpretadas. Daí a rotina de se usar mais de um painel de hemácias simultaneamente; ex: painel de hemácias em USS - AGH e enzimas prmeolíricas, que favorecerão no diferenCial de inrerpreração, rendo em vista que a enzima. (ex: papaína) irá desestruturar os antígenos do SIStema Dujjy e MNS. Pode-se coma r com a ajuda de três testes preliminares: • fenoripagem emrocirária; • reste de Coombs direto; • reste de autocontrole.
Fenotipagem eritrocitária
A fenoripagem eritrocicária idenrifica os anrígenos das hemácias do paciente /doador, que ajudará na identificação do anticorpo, mas não pode ter hav1do transfusão de hemácias nos últimos quatro meses (possibilidade da existênCia de hemáCJas do doador na mculação do paciente). o que falseará os resultados. Dessa maneira. constitui-se em uma contraprova; não poderá estar presente um determinado aloanr1corpo com antígeno correspondente nas hemáCJas (ex: fot detectado um aloanticorpo com especificidade para Fya. as hemácias do paCJenre I doador deverão ser Ft - negat1vo).
Teste de Coombs direto
Esse tesre pesquisa as hemácias fixadas por anticorpos (sensibilizadas) e/ou frações do complemento. No
399
paciente/doador, esse fato poderá estar presente na anemia hemolítica auto-imune, na hemólise induzida por medicamentos, nas reações hemolíticas pós-rransfusionais e no transplante de medula óssea ABO incompatível. É um reste com grande aplicação no diagnóstico de doença hemolítica do recém-nascido.
Teste de autocontrole
Como já referido, o teste de autocontrole será aqui, também, de fundamental importância na detecção da presença de hemácias sensibilizadas nas anemias hemolíticas auto-imune. Implica-se, assim, a necessidade de estabelecer técnicas complementares de adsorção e eluição para mostrar a coexistência ou não de aloanticorpo.
Técnica LISS- AGH Em tubo
Ver Quadro 32.36. Q uadro 32.36 - Identificação de anticorpo irregular - técnica em rubo Materiais/Equipamentos Centrífuga laboratorial Tubo de hemólise: l Ox75 / l2x75 mm M icropipetas Ponteiros Suporte para tubo Cronômetro I relógio Banho-maria 37°( Aglutinoscópio
Reagente s/So luções Solução salino fisiológico 0,9% LISS Painel de hemócias (ll hemáciasl AGH - poliespecífico Controle de Coombs (hemácios sensibilizadas!
A grande maioria dos anticorpos clinicamente importantes não causa aglutinações direta das hemácias e eles só serão demonstrados na fase da AGH, motivo pelo qual muitos serviços fazem a opção de eliminar a incubação à temperatura ambiente. Os procedimentos técnicos deverão obedecer, rigorosamente, as orientações e recomendações dos fornecedores. As técnicas apresentadas neste trabalho não poderão atender genericamente a todos os fornecedores.
Técnica em tubo L/SS/AGH
Procedimento
• numerar os tubos de hemólise de um a 11 - nome ou número; • identificar um tubo de hemólise AC (autocontrole) • colocar nos tubos de um a 11 duas goras das hemácias do painel, observando-se a correspondência - a ordem de identificação das hemácias e os respectivos tubos; • preparar suspensão a 3% em salina das hemácias do paciente I doador - transferir duas gotas para o tubo AC; • adicionar duas goras do soro do paciente/doador. Homogeneizar; • centrifugar os tubos a 3.400 rpm por 15 segundos ou a 1.000 rpm por um minuto; • observar a presença de hemólise no sobrenadante; • ressuspender o "botão" de hemácias delicadamente, verificar a presença de aglutinação; • interpretar e anotar os resultados, atribuindo intensidade de aglutinação (1+ I 4+); • incubar os 12 tubos a 37°( por 10 minutos; • repetir os itens: 6, 7, 8, 9; • lavar os 12 tubos com salina por três vezes. Ressuspender o "botão" de hemácias a cada adição de salina; • adicionar aos 12 tubos duas goras de AGH - poliespecífico; • repetir os itens 6, 7 8, 9. Interpretação
• usar o diagrama que acompanha o lote para anotar e interpretar os resultados; • presença de anticorpo irregular corresponde à hemólise e/ou aglutinação em algumas ou todas as fases; • ausência de anticorpo irregular corresponde à ausência da hemólise e aglutinação em qualquer das fases. A Figura 32.12 apresenta um diagrama de painel de hemácias para interpretação de resultados.
400 [ M edicina laboratorial para o clínico ]1 - - - - - -- - - -- - -- - - - -- - - - -- - -- - - - -
Figura 32.1 2- D1agrama do Pamel de Hemácias, mostrando os antígenos presentes. F1gura extraída do Manual de Técmca D1aMed-ID (1994) Emprego do controle de Coombs
Procedimento
• adtctonar uma gota do concrole de Coombs (he· máoas sensibilizadas com lgG); • cencnfugar a 1.000 rpm por um mtnuro ou a 3.400 rpm por 15 segundos; • ler; • rodas as reações negativas deverão apresenrar resultados posttivos fracos após a adtção das hemácias conrrole (sensibilizadas). Técnica em gel centrifugação - LISS!COOMBS
Ver Quadro 32.37.
Quadro 32.37 - Identificação de ancicorpo irregular - técntca em gel Materiais/Equi pamentos Tubo de hemólise: 10x75 12x75mm Micropipetos - próprios Ponteiros Estação de trabalho poro tubos e cartões Centrífugos laboratorial e específico Incubador 37°C Dispensador
Reagentes/So luções
I Cartões LISS - Coombs Diluente - LISS Hemócios teste - Painel
Aspecros laboratoriais da hemoterapia
• os reativos deverão estar à temperatura am bienre anres do uso; • dois cartões: idenrificá-los de 1-6 e 7-11 e no último tubo (12) idenri ficá-lo com AC; • idenrificá- los com nome do pacience I doador; • preparar AC: 1 mL de LISS (diluenre); • 10 ~ L de hemácia pacience I doador; • homogeneizar; • rettrar o lacre de alum ínio proteror dos microtubos dos dois cartões; • homogenetzar as hemácias do patnel e colocar uma gota das hemácias nos microtubos identificados de um a 11, observando a correspondência; • pipetar 50 ~L da suspensão de hemácias do pa· cience I doador no mtcrotubo AC; • adicionar 25 ~L do soro teste em rodos os microtubos; • incubar a 37°C por 15 minutos; • centrifugar os cartões: centrífuga própna que Já está ca librada para a velocidade e tempo (10 minutos); • ler os cartões; • interpretar as reações conforme parâmetro já demonscrado para reações positivas (I+ I 4+) e negativas; • registrar o resultado.
401
Interpretação de resultados
• usar o diagrama que acompanha o loce; • hemácias na superfície do gel ou dispersas ao longo da coluna do gel = PRESENÇA DE ANTICORPO(S) IRREGULAR(ES); • hemácias depositadas no fundo do microcubo. formando um "bmão" = AUSÊNCIA DE ANTICORPO(S) IRREGULAR(ES).
Eluição
O anticorpo que tenha se ligado especificamente ao anrígeno de membrana da hemácia pode ser dissociado mediante o emprego de vários testes: utilização de calor, mudança de pH ou solvences orgânicos.
OUTROS MÉTODOS PARA DETECÇÃO DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Técnicas complementares Separação de múltiplos aloanticorpos Adsorção
Um amicorpo poderá ser removido de um soro pela adsorção e eluição utilizando-se hemácias contendo o ancígeno correspondeme. Após o amicorpo se ligar ao amígeno de membrana de hemácias, o soro será separado das hemácias por cencrifugação, podendo haver necessidade, em alguns casos, de repetir o procedimento mais de uma vez para adsorver codo o anticorpo em questão. Essa técnica é utilizada com os segu111ces objetlvos: • separação de múltiplos aloancicor pos em um soro; • confirmar a espeCificidade de anticorpo por adsorção com fenócipo específico de grupo sanguíneo. Portamo, a adsorção serve para diferences proposições e/ou necessidades e. na prática, não há um único método que possa satisfazer todos as situações. As variáveis serão utilizadas e concroladas conforme o objetivo. Variáveis
• temperatura de incubação: será aquela que melhor atender à necessidade de reação do anticorpo em evidência; • pré-tratamenco das hemácias com enzimas proteolíticas para favorecer a reatividade do ancicorpo; • escolha do fenócipo - de suma importância, pois permite a reação amígeno-ancicorpo a pesquisar; • se vários ancicorpos estão presences, a escolha da hemácia será aquela que remover somente um anticorpo de cada vez.
Os métodos. além do tradicional teste em cubo, o uso regular da AGH e, mais recemememe, os testes em gel não represencam alternativas de emprego na rotina hemmerápica. mas são extremamente importantes e necessários na Medicina Laboracorial para identificação ora de antígenos, ora de anticorpos específicos para várias doenças. Alguns não permitem a detecção de ambos os ancicorpos lgM e lgG. outros são de domín io de fornecedores comerciais, ramo os procedimentos como os reagentes e equipamentos.
lmunofluorescência
Os testes de imunofluorescência permitem a localização de antígenos incrínsecos e de superfície celular. Podem ser usados em dois procedimentos: direto e indireto • no teste direto, o ancicorpo com especificidade conhecida (fornecido pelo k1t comercial) é fixado à superfície de uma lâmina à qual será adicionado o amígeno (amostra). Ao complexo será adicionado um ancicorpo ligado ao fluorocromo (ex: fluoresceína). Expressão: Ac (fixado) + Ag (amostra) + Ac (ligado ao fluorocromo); • no teste indireco, o antígeno específico é fixado à superfície da lâmina (fornecido no kit) à qual será adicionado o anticorpo (amostra). Será acrescentada uma AGH ligada ao fluorocromo (ex: fluoresceína). Expressão: Ag (fixado) + Ac (amostra) + AGH (ligado ao fluorocromo).
402 ( Me dicin a laboratorial para o clínico ]1-- - - - - - - - - -- -- - - - - - -- - - - - - - - -- -
A leicura (testes direm e indirem) será feita em microscópio de fluorescência, que permitirá a visualização e identificação da reação positiva pelo aparecimento de cor brilhanre vivo verde - amarelo ou vermelho, dependendo do fluorocromo usado.
Enzimaimunoensaio (Elisa
I ElE):
Os restes Elisa I ElE podem ser, também, direro e indireco que, em linhas gerais. seguem a mesma regra básica de raciocínio para mensurar o amígeno ou anricorpo, diferindo, no emamo, na expressão final da reação. pois desenvolverá cor que será avaliada por aparelho especuoforômerro. • Elisa direw (cécn1ca de sanduíche) - o anticorpo específico e conhecido é fixado aos poços comidos em uma placa (fornecido pelo kit) à qual será adicionado o antígeno (amostra) e após procedimentos intermediários (incubação e lavagem) será adicionado o amicorpo ligado à enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) para, finalmente, ser adicionada uma substância que irá reagi r com a enzima, formando cor que será estabilizada pela adição de solução stop. normalmente um ácido diluído; Expressão: Ac (fixado ao poço) + Ag (amostra) + Ac (ligado à enzima) + substraw (reage com a enzima) + solução stop (ácido diluído). • Elisa indireto - o amígeno conhecido é fixado ao poço da placa, ao qual será adicionado o anticorpo (amostra), e após procedimento de lavagem será adicionada a AGH (ligada à enzima), desenvolvendo cor que será estabilizada pela solução stop (ácido diluído). Expressão: Ag (fixado ao poço) + Ac (amostra) + AGH (ligada à enzima) + substrato + solução stop. O kit usado traz os parâmetros de referência de reações positivas e negativas. conforme o valor de absorvância da cor desenvolvida.
Radioimunoensaio (RIE)
Nos procedimentos de RIE, é usado um radionucleotídeo como marcador de amígeno ou anticorpo e um
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
contador de radiações gama, em duas técnicas básicas: a competitiva e a de "sanduíche". • técnica de competição - o amígeno (amostra) é colocado em comam com o anticorpo específico em quantidade limitada, gerando a equação: Ag + Ac AgAc. Após procedimentos intermediários de incubação. é adicionado amígeno marcado com 1125 que irá competir com o amígeno da amostra, gerando a segunda equação: Ag 1125 + Ac Agi 125Ac. Essa reação é inversamente proporcional, pois no caso de grande quam1dade de amígeno na amostra, sobrarão poucos sírios de ligação para o amígeno marcado com 1125; conseqüemememe, expressará pequena contagem de radiação gama e vive-versa; • técnica de "sanduíche": Em uma fase sólida (ex: pérolas ou fundo de um tubo) é fixado um anticorpo específico ao qual será adicionado o antígeno (amostra) que, após procedimentos intermediá rios de incubação, será adicionado um anticorpo marcado com 1125. gerando a situação: Ac (fixado) + Ag + Acl 12 s Na reação em que o amígeno estiver ausente na amostra, a contagem de radiação gama será baixa, po1s o 1125 não estará presente, por ter sido desprezado no procedimento intermediário de lavagem, e vice-versa.
SISTEMA HLA O SISTEMA HLA Complexo principal de histocompatibilidade humano
O complexo principal de histocompatibilidade (CPHH) é também conhecido como HLA, codificado no braço cu rto do cromossoma 6. O HLA contém ma is de 200 genes. dos quais mais de 40 estão codificados em leucócitos. O HLA é dividido em três classes: classe I, 11 e III. As classes I e 11 são expressas na superfície das células e a classe III compreende diversos fatores solúveis (principalmente proteínas do sistema de complemento). Todos eles são partes fundamentais da resposta imune de um indivíduo.
403
Estrutura e função das proteínas HLA
O HLA de classe I está presente em todas as células
nucleadas do organismo e compreende uma cadeia polipeptídica alfa codificada no cromossoma 6 ligada de maneira não-covalence a outra proteína, chamada beta-2 microglobulina, codificada no cromossoma 15. O HLA de classe 11 está expresso somence em células apresentadoras de antígenos (macrófagos, monócitos, células dendríticas, linfóciros 8, linfóciros T ativados, células endoteliais e epiteliais). É formado pela Junção de duas cadeias, alfa (alfa l e 2) e beta (beta 1 e 2). O HLA é herdado de maneira mendeliana dominante. Em função da proximidade dos diferences elemenros que compõem o sistema HLA e a conseqüente baixa taxa de crossover; os genes são herdados em conjunco. Esse conjunco fixo de genes herdados de cada genicor é chamado de haplótipo. Assim, o HLA de um sujeito é formado a partir de dois haplótipos, cada um deles codificado em um dos cromossomas 6. Desta maneira, são quatro as possíveis combinações de haplótipos provenientes do pai (2) e da mãe (2) [Figura 32.13]. Do pomo de vista de transplante de órgão, as moléculas de HLA importantes na hisrocompatibilidade são as de classe I A, 8 e C e as de classe li DR, DQ e DP. M ãe
AJB
I
Pai
DO CID
I
I
I
A/C
AJO
lO lO
B/C
8 /D
Figura 32.13 -Combinações possíveis dos haplót1pos HLA.
A fu nção biológica do HLA de classe I e 11 é se ligar a anrígenos próprios e não próprios e transportá-los até a superfície da célula onde serão apresentados aos linfócitos T citotóxicos (CD8) e T helper (CD4), respectivamen te. Peprídeos componentes do antígeno a ser apresentado são montados nas fendas de ligação das moléculas do HLA e são reconhecidos pelos receptores da célula T
(T ce/1 receptor - TCR). Esse processo chama-se resposta imune adaptativa. O reconhecimento de um antígeno pelo linfócito T como estranho desencadeia uma resposta imune contra a célula. Este antígeno estranho ao organismo pode ser um componente de um microrganismo (vírus, bactéria), um componente celular novo (mutação que ocorreu em um tumo r, por exemplo) ou, ainda, um componente celular totalmente estranho, como é o caso de um transplante de órgão. O reconhecimento de antígenos próprios (selj) que desencadeariam uma reação de auto-imunidade é evitado por diversos mecanismos de eliminação e/ou supressão dos li nfócitos T. que têm alta afinidade com esses antígenos self (tolerância). Esse processo ocorre basicamente no timo.
Resposta alogênica
As próprias moléculas que compõem o sistema HLA são extremamente im unogênicas. A resposta dos linfócitos T a uma molécula do HLA. estranha ao organismo, leva à ativação de 1-10% do repertório de linfócitos T do organismo. Esse mecanismo de reconhecimento é a base da rejeição de um tecido/órgão proveniente de outro organismo e distinto do receptor. As moléculas do HLA são fortemente imunogênicas por dois motivos distintos. As de classe I e 11 são altamente polimórficas. Até janeiro de 2004, foram identificados mais de 303 diferentes alelos de HLA-A, 559 de HLA-8 e 440 de HLA-DR8. Graças a esse polimo rfismo genético é que diferentes indivíduos não aparentados possuem padrões distintos de expressão do HLA e a inserção de tecido de um indivíduo em outro pode ser identificada como estranha. O outro motivo da extrema imunogenicidade das moléculas do HLA diz respeito à sua capacidade em ativar os li nfócitos T por duas vias. Uma delas diretamente pelo reconhecimento de uma molécula HLA estranha na superfície de um tecido transplantado ou num leucócito proveniente de uma transfusão; a ouera pela eventual fagocitose de uma célula estranha ao organismo e que tenha um fragmento da molécula de HLA exibido por uma célula apresentadora de antígeno aos linfócitos T via HLA-classe 11. Hoje, para reduzir a ativação dos linfócitos T em caso de transplante de órgão, busca-se a compatibilidade entre a expressão HLA do tecido do doador e do receptor.
404 [ Medicina laboratorial para o cl ínico )t-- - - - - - - -- - - -- -- - - - -- - -- - - - - -- -
Antígenos secundários de histocompatibilidade
Alguns dos paciemes submetidos a transplame de medula óssea em que o doador é um familiar HLA-idêntico podem, mesmo com esta compatibilidade, apresentar reações imunológicas emre o tecido rransplamado e o recepcor. É a chamada reação do enxerro comra hospedeiro, já que num pacieme transplamado de medula óssea a célula imunologicameme ativa é a cransplamada. O eswdo dessa siwação específica culminou com a descoberta dos chamados amígenos secundários (ou menores) de hisrocompatibilidade. Eles são peptídeos derivados de genes polimórficos e apresemados ao sistema imune pelas moléculas de HLA de classes I e 11. Em um pacieme cransplamado, esses peptídeos proveniemes do recepcor são reconhecidos pelos linfóciros T do doador. Embora a freqüência dos linfócicos T específicos comra os amígenos secundários de hisrocompatibilidade seja menor que os linfócicos que reconhecem moléculas não próprias, sua expressão é sufici eme para desencadear, em vários casos, a reação do enxerro comra hospedeiro. Um grupo de amígenos secundários idemificado é derivado de proteínas codificadas por genes presemes no cromossoma Y. Num rransplame em que o receptor é do sexo masculino e a doadora do sexo feminino, peptídeos derivados do cromossoma Y podem ser reconhecidos como esrranhos pelos linfócicos da doadora. Isco explica o aumemo da freqüência da doença do enxerco contra hospedeiro com essa combinação de doador-recepcor. Um outro grupo de amígenos secundários é expresso especificameme em células hemacopoéticas. A presença desses amígenos em células residuais de leucemia, por exemplo. remanesceme após o transplante de medula óssea, pode desencadear uma resposta imunológica mediada pelos linfócicos T e produzir o chamado efeico enxerco comra leucemia, benéfico na erradicação da doença neoplásica.
MÉTODOS PARA TIPIFICAÇÃO HLA Método sorológico
Os métodos de ripagem (identifi cação) do HLA baseados em sorologia utilizam soros com especificidade para diferences ancígenos HLA para idencifi-
Aspectos laboratoriais da hemoterapia
car a expressão dessas moléculas num determinado indivíduo. Cada soro Ll[ilizado reage comra um anrígeno HLA específico expresso na superfície dos leucócitos Após um período de incubação do soro que permite que os amicorpos se liguem aos anrígenos dos leucóciros, complemento é adicionado para acelerar a lise das célu las. As di ferences reações e seus resultados são visualizados em um microscópio. O HLA é determinado a partir dos soros que apresentaram reações contra os leucÓCitos. Esse método é muito menos específico que o baseado em técnicas de biologia molecular. Ainda é uti lizado em alguns laboratórios para o rastreamenco de potenciais doadores.
Métodos moleculares
Os métodos moleculares de ripagem HLA usam técnicas de biologia molecular. Não existe a identificação do antígeno expresso na superfície da célula e sim do DNA. que codifica a seqüência do antígeno. O mécodo molecular não necessita ser feico apenas em leucócicos viáveis, podendo ser realizado em oucros tecidos. Sem dúvida alguma. os mécodos molecu lares são muico mais precisos que os sorológicos. Alguns podem inclusive forn ecer detalhes em nível de alelo que a sorologia é incapaz de fo rnecer. Esses ale/os é que codificam os antígenos presemes nas células. Os mécodos moleculares se dividem em níveis de resolução. Os chamados de baixa resolução fornecem resultado semelhante ao obtido com a sorologia, distinguindo grupos de a/elos; os de média resolução já conseguem determinar alguns alelos de HLA, mas não o alelo específico. Os métodos mais utilizados para a ripagem HLA em baixa ou média resolução são o SSP (sequence specific primer) e o SSOP (sequence specific oligotide probes). Os métodos de alta resolução distinguem todos os ale/os HLA. Muitas vezes são util izados mécodos de seqüenciamenco. Para muitas aplicações, basta o conhecimento do HLA em baixa resolução. Porém, para a realização de transplante de célulastronco hemato poéticas usando um doador não-aparentado, é muito importante a determi nação do HLA em nível alélico.
405
NOMENCLATURA
O SISTEMA HLA NAS TRANSFUSÕES E NOS TRANSPLANTES
Métodos sorológicos A nomenclacura oficial para a ripagem sorológica do HLA por meio de amígenos é definida pela OMS.
HLA e transfusão
As letras (A, B, DR, etc.) referem -se ao /ocus gené-
O s antígenos HLA de classe I estão expressos em
rico e o número que segue ao anrígeno cod1ficado naquele /ocus (ex. HLA-A2, HLA-835, HLA-DR4).
grande quantidade nos leucócitos e plaquetas. Cada transfu são na qual exista a presença de plaquetas
Quando os números estão entre parênteses, indicam um antígeno broad para o qual especificidades foram definidas posteriormente (chamados de split - ex. A26(10).
e/ou leucócitos carrega o ri sco de alo imunização para o pacienre. Os pacientes imunocompetentes
Método molecular A ripagem molecular é feita utilizando-se um número de quatro algarismos, que identificarão o alelo. O locus H LA (A. B, C. DR, DR e D P) é separado pelo símbolo * dos dois primeiros dígitos, que indicam o equivalente sorológico do amígeno. Os dois dígitos seguintes designam o alelo específico (HLA-A*2402). Ocasionalmente, um número adicional pode ser acrescentado ao final, indicando a existência de um subtipo de alelo produz id o por uma substituição de um nucleotídeo que não altera a seqüência de aminoácidos nem a expressão do antígeno. Ass1m, por exemplo. o alelo HLA-A*240201 pertence ao locus A, codifica o antígeno A24 e 02
é o seu subtipo alélico do A24 . Este alelo tem uma substituição de um nucleotídeo que o distingue do alelo HLA -A*24 02 02.
que recebam transfusões de plaquetas, hemácias ou de sangue total podem vir a desenvolver amicorpos conrra os antígenos HLA a que eles tenham sido expostos. Esse ri sco pode ser minimizado pela lavagem ou fi ltragem de concentrado de hemácias, plaquetas ou de sangue total com filtros de leucodepleção. em que é redu zida de maneira imporrame a quantidade de leucócitos presentes. d iminuindo-se o risco da alo imunização. Já nos pacientes politransfundidos, como nos portadores de leucemia. por exemplo, os anticorpos anti-HLA podem ocasio nar do 1s problemas: • esses pacienres podem se tornar refratários a transfusões de plaq uetas. pois as mesmas são rapidamente destruídas pelos anticorpos. • reações rransfus1onais não-hemolíticas podem ocorrer em resposta à presença dos antígenos HLA Ambos os problemas podem ser contornados. embora com alguma dificuldade. Doadores familiares. especialmente aqueles irmãos HLA idênricos, podem doar plaquetas que não serão destruídas. É possível realizar provas de compatibilidade chamadas cross-
Resumindo: HLA - A região HLA (H LA-DR).
e o prefixo de um gene HLA
HLA-DRB1 - Uma região particular do locus (ex. DQBl). HLA-DRBr•n - Grupo de alelos que codifica o antígeno HLA-DR13. HLA-DRB1.1301 - Alelo específico dentro do gene que cod1fica o anrígeno HLA-DR13.
406 [ Medicina laboratoria l para o clínico
match para confirmar se ele é HLA compatível com o mesmo ou se o indivíduo não possui o antígeno HLA presente no receptor. Outra alternativa é a unlização de um banco de potenciais doadores de plaquetas que renham t ido o seu HLA identificado. Para esse banco funcionar a contento, é necessário elevado número de voluntários para ter-se uma cha nce razoável de localizar um doador adequado.
]1 -- - -- - - -- - - - - - -- -- - - - - - - -- - --
HLA e os transplantes Transplante renal A ripagem HLA foi aplicada no cransplante renal quase imed iatameme depois que os primeiros amígenos HLA foram determinados. A importância de se reduzir o grau de incompatibilidade dos antígenos emre o pacieme e o rim doador ficou aparente com os primeiros resultados mosrrando melhora significativa na sobrevida de enxercos provenientes de irmãos HLA-idênticos. comparados aos obtidos quando existia apenas compatibilidade de um haplótipo ou quando o rim provinha de um doador não aparentado. Porém, mesmo quando ocorre compatibilidade HLA. outras condições devem ser atendidas: Existe a necessidade de compatibilidade ABO e também de uma reação de crossmatch negativa, ou seja, não pode ocorrer a existência de amicorpos ami-HLA no receptor, sob risco de ocorrer a chamada rejeição hiperaguda.
Transplante de fígado No transplame de fígado, o HLA não tem papel tão destacado como no transplame renal. sendo mais importame a compatibilidade ABO e o tamanho do órgão. No emamo, segue sendo importante a não existência de amicorpos anti-HLA (crossmatch negativo). Transplantes realizados em paciemes com crossmatch positivos têm taxa de sucesso significarivameme mais baixa.
Transplante de córnea Embora existam evidências de que uma córnea que seja HLA idêntica em classe I sobreviva um pouco melhor, no paciente de baixo risco não é fei co rotineiramente a ripagem HLA. Emretanto, quando já houve rejeição de um ou mais enxertos, a ripagem pode ter papel mais destacado.
Transplante de células-tronco hematopoéticas A compatibilidade do HLA entre doador e recepcor é essencial para a realização do transplante de célulastronco hematopoéticas. A realização de um uansplame compacível reduz de maneira importante o risco de rejeição da medula transplamada, mas também do apare-
Aspectos laboratoriais da he mo terapia
cimemo de uma complicação muico mais freq üeme, a doença do enxerco comra hospeaeiro, conhecida pelas abreviaturas DECH ou GVHD (graft versus host disease). Nesta última, a reação de linfócitos imunocompetemes presemes no enxerto transplamado "atacam" tecidos do recepcor reconhecidos como escranho. Uma parte dos transplames de cél ula-tronco hematopoética utiliza um doado r aparentado (geralmente um irmão ou irmã) HLA-idêmico. Nessa situação, muitas vezes é suficiente a utilização de ripagem HLA de classe I por sorologia ou por métodos de baixa resolução e a confirmação com ripagem de classe li de alta resolução. Na ausência de um doador fami liar que seja totalmente compatível. a utilização de um fam iliar que apresente apenas um antígeno HLA de diferença tam bém pode ser viável, dependendo da situação. Emretamo, aqui no Brasil. mais de 50% dos paciemes não irá apresemar na família um doador adequado. Existe hoje no mundo uma série de regisrros de doadores voluntá rios de medula óssea, o que tem viabilizado a realização de transplames para uma séne de pacientes sem doador familiar. Estima-se que haja em todo o mundo quase 10 milhões de volumá rios. No Brasil, foi estabelecido o Registro Brasileiro de Doadores de Medula ó ssea (REDOME), coordenado pelo Ministério da Saúde. Para os transplames ditos não-aparentados, a exigência mínima de compatibilidade é que sejam totalmente semelhantes para os HLA-A e -B (classe 1) em baixa resolução e sejam com patíveis em HLA-DR de alta resolução. Contudo, em muitos países europeus e na América do Norte, a exigência é que haja compatibilidade HLA-A. -B, C-, DR e DQ de alta resolução, a chamada compatibilidade l O/lO. Com essa com patibilidade, os resultados estão se aproximando dos obtidos com doadores aparentados. Infelizmente, quanto maior a exigência de compatibilidade, menor a chance de se local izar um doador. Mais recememente, vem ganhando terreno a utilização do sangue de cordão umbilical e placentário como fonte de célula-tronco hematopoética para transplantes. Nesse transplame, o grau de compatibilidade exigida é menor em virtude da relativa imaturidade do sistema imune do recém-nascido. Uma unidade de sangue de cordão pode ser utilizada para um transplante, mesmo quando existem até duas diferenças HLA (considerando-se para isso os dois antígenos HLA-A. os dois antígenos HLA-B - baixa resolução -e os dois alelos HLA-DR - alta resolução).
407
REFERÊNCIAS 1. ASEATTA- educanon [home page da Internet]. Disponível em: hctp://www.aseaua.org.au/HLArelv.htm. 2. Brecher M E. Techn1cal M anual. 151h ed. Maryland: American Association of Blood Banks; 2005. 3. Buckley RH. Transplamanon lmmunology: Organ and Bone Marrow. J Allergy Chn lmmunol. 2003;111:733-44. 4. Delves PJ, Ro1ct IM . lhe lmmune Sysrem - Second of rwo parts. N Engl J Med. 2000;343: 108-17. 5. Girello AL. Kühn TIBB. Fundamentos da imuno-hematologla emrocitána. São Paulo: Senac; 2002 6. Greer JP. Wincrobe's Clin1cal Hemarology. lfh ed. Philadelphla: Lipp1ncott W1lliams & Wdk1ns; 2004. 7. Mollison PL, Engelfnet CP. Concreras M. Blood TransfuSion m Clin1cal Med1c1ne. 91h ed. Oxford: Blackwell Sclentlflc Publicar1ons: 1993. 8. Olive1ra MCVC. Góes SMPM. Práncas em lmunog1a Erirrocitária. Rio de Janeiro: Medsi; 1999.
408 [ M edicina laborat orial para o clínico
9. Peakman M . Vergani D. Imunologia Básica e Clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 1999. 10. Resolução RDC 153 de 14 de JUnho de 2004. D1rerona Colegiada da Agência Naoonal de V1g1lânoa San1tána Determina o Regulamento Técnico para os procedimentOS hemoreráp1cos, inclUindo a colera, o processamenro, a resragem. o armazenamento. o transporte. o comrole de qualidade e o uso humano de sangue e seus componentes. obtidos do sangue venoso, do cordão umbilical. da placema. e da medula óssea. Disponível em: http://elegls.anvisa.gov.br/lelsref/publlc/showAct.php?id=11662. 11. Rudmann S. Textbook of Blood Bankmg and Transfus1on Medicine. Ph1ladelph1a: W. B. Saunders; 1995. 12. Simon TL. Dzik W H. Snyder EL. Srowell CP. Strauss RG. Ross1's pnnoples of transfus1on med1cine. 3'd ed. Ph1ladelph1a: L1pp1ncott Williams & Wilkms; 2002. 13. Will1ans TM. Human Leukocyte Anngen Gene Polymorph ism and The Hisrocompat 1bility Laborarory. J Molec Diag. 2001;3:98-1 04.
33
Pedro Guatimosim Vidigal Leonardo de Souza Vasconcellos Lucimar Gonçalves de Souza Assunção Elza Santiago Erichsen
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DISFUNÇÃO HEPÁTICA
INTRODUÇÃO
As diversas doenças que acometem o fígado podem lesá-lo e provocar disfunção, leve ou grave, reversível ou progressiva. Os testes laboratoriais utilizados para a investigação das doenças hepáticas estão alicerçados na avaliação do comprometimento de suas múltiplas funções. Por isso, existe a necessidade de se utilizar um conjunto de testes com a finalidade de detectar as funções comprometidas e avaliar a gravidade, intensidade, localização, extensão e evolução do agravo - se agudo ou crônico. Em mUitoS casos, a propedêutica laboratorial disponível permite atingir esses objetivos. Em ouuas situações, necessita-se recorrer também à abordagem por imagem e à biópsia hepática para o diagnóstico definitivo.
FUNÇÕES DO FÍGADO
O fígado realiza múlti plas funções metabólicas, produz a secreção biliar, promove a detoxificação e o armazenamento de várias substâncias.
FUNÇÃO DE SÍNTESE A síntese e metabolismo de vários nutrientes como carboidratos, lípides, proteínas e enzimas são realizados pelo hepatócito.
• carboidraros - Em condições fisiológicas. o fígado partici pa da homeoscase glicêmica. Sob a ação da insulina, o excesso de glicose no sangue estimula o fígado a ar mazená-la sob a forma de glicogênio no hepatócito (glicogênese). Quando há baixa de glicose no sangue, o glicogênio é quebrado e liberado para as funções energéticas, sob forma de glicose (glicogenólise). Esse último mecanismo ocorre pela ação de glucagon ou da epinefrina. O fígado ta mbém promove a gliconeogênese, que é a formação de glicose a partir de aminoácidos. As alterações dessa função estão relacionadas aos distúrbios dos carboidratos discutidas no capítulo 36; • lípides - o fígado é o principal órgão responsável pela síntese e homeostase do colesterol e triglicérides endógeno. t o local da síntese de lipoproteínas e ácidos biliares. A avaliação das alterações desse processo não é utilizada como teste de função hepática, mas está relacionada às dislipidemias (ver capítulo 37); • proteínas - o fígado é o local de síntese de várias proteínas do organismo, tais como albumina e globulinas, lipoproteínas, rr2nsferrina, ceruloplasmina, proteína C reativa e fatores de coagulação. Dessas, a produção de albumina ocorre exclusivamente no fígado, sendo por isso um excelente marcador da fu nção de síntese hepática. A produção dos fatores de coagulação pelo fígado
também reflete a capacidade de síntese do he-
FORM AÇÃO E SECREÇÃO DA BI LE
patóciro. O fígado rem im portância central na hemostasia. Dos 13 farores da coagulação, 11 são
O fígado é o local da produção da bile. Liberada
sintetizados a partir de matrizes protéicas hepá-
do hepatócito, ela flui pelos canalículos biliares, duetos
à vesícula
ticas. O fibrinogên io (fator 1), a protrombina (fa-
biliares, dueto hepático comum. chegando
tor 11) e os facores V, VIl, IX, X, XII e XIII parecem ser sintetizados exclusivamente pelo hepatócito.
é armazenada. Através do ducco colédoco, desemboca no duodeno pela pap1la de Vater. Euma se-
Apenas o faror VIII não é sintetizado no fígado.
creção aquosa composta de pigmentos e sais biliares,
Os fatores 11, Vil, IX e X são glicoprmeínas cuja
fosfolipídios
biliar, onde
e colesterol e participa, no intestino delga-
síntese depende da v1tam1na K. A dosagem de
do, do processo de digestão dos lipíd1os da alimenta-
albumina e a determinação do tempo de pro-
ção. A bile é. também, a via de excreção da bilirrubina.
trombina são utilizadas na prática clínica para
produto final da degradação da hemoglobina ou. mais
avaliação da síntese hepática;
especificamente, do heme.
• enzimas - o hepatócito é o local de síntese e armazenamento de várias enzimas que participam nos múltiplos processos metabólicos do
Metabolismo da bilirrubina
organism o. Níveis séricos alterados ocorrem em distúrbios com lesão do hepatócito ou disfun-
A s hemácias senescenres, após sua vida de 80-120
ção de síntese hepática. A s enzimas hepát icas
dias, são destruídas principalmente no baço. por ação do
dosadas na prática clínica são: aminotransfera-
sistema mononuclear fagocitário, denominação arua I do
ses, fosfatase alcalina, desidrogenase lárica e ga-
sistema retículo endotelial (SRE). A globina. separada do
maglutamil transferase .
heme, por ser a parte proté1ca da molécula, é quebrada em aminoácidos que serão reutilizados no organ1smo para síntese protéica. O anel tetrapirrólico formador do
FUNÇÃO DE EXCREÇÃO E D ETO XIFICAÇÃO
heme é rompido, transformando-se em biliverdina e, posteriormente, em bilirrubina. Outras fontes de menos
Várias substâncias endógenas e exógenas são ca-
importânCia em cond1ções fisio lógicas são a destruição
tabolisadas e eliminadas pelo fígado. O colesterol e
de hemácias imaturas na medula e carabolismo de ou-
os pigmentos biliares são excretados na bile, onde
tras porfirinas como citocromo C e mioglobina.
também ocorrem o m etabolismo e a eliminação de
Após a produção nos tecidos periféricos, a bilirru -
à albumina,
muitas drogas. Já a amônia, derivada do metabolismo
bina é transportada para o fígado ligado
de aminoácidos ou de bactérias inresrina1s, é trans-
sendo denominada bilirrub1na não conjugada (BNC)
formada em uréia, substância não tóxica, e eliminad a
ou bilirrubina indirera (BI). Por ser insolúvel em água e
na urina. Outros metabólicos, como os hormônios
estar ligada à albumina, não é detectada na urina nos
esteróides, também po dem ser inativados no fígado
restes laboratoriais. Chegando ao hepatóciro, a BNC é
e excretados na urina.
captada e conjugada com ácido glicurônico nos micrassomos hepáticos, pela ação da enzima glicuronil cransferase. O produco dessa reação, consriruído por mono-
FUNÇÃO DE ARMAZENAMENTO
glicuronato (15%) e d iglicuronato (85%) de bilirrubina, é denominado bilirrubina conjugada (BC) ou bilirrubina
O fígado armazena várias substâncias. tais como fer-
direta (BD). A BC é transportada para os canalículos
ritina. glicogên1o. ácido fálico e vitaminas, principalmen-
biliares e excretada na bile. Sua estrutura mo lecular a
te as lipossolliveis (A, D. E e K)
torna solúvel em água. sendo livremente fi ltrada nos
e do complexo
B (B12).
Entretanto, a dosagem dessas vitaminas não é utilizada
rins e podendo ser detectada na urina nas situações em
como teste de função hepática e sim para o diagnóstico
que há elevação da BD no sangue. Prosseguindo o seu
de seus distúrbios metabólicos específicos.
metabolismo, no im estino a BD sofre a ação das bacré-
410 [ Medicina laboratoria l para o clínico
rias da microbiora e rransforma-se em urobilinogênio, que é espontaneamente oxidado para urobilina, estercobilina e mesobilina. Esses pigmentos são excretados nas fezes, dando sua coloração marrom característica. Uma fração de urobilinogênio é reabsorvida pela circulação encero-hepática, sendo captada pelo hepatóciro e novamente excretada para a bile. Havendo excesso da produção desse pigmento biliar (hemólise) ou incapacidade do hepatócito em captá-lo (lesão hepática), observa-se aumento do urobilinogénio reabsorvido no sangue com conseqüente aumento da eliminação deste na urina (ver capíwlo 35). As Figuras 33.1 e 33.2 apresentam as etapas do metabolismo das bilirrubinas. As hepatopatias evoluem, freqüenremente, com distúrbio em alguma dessas etapas, ocasionando a elevação desse pigmento no sangue e a icterícia.
EXAMES LABORATORIAIS NA ABORDAGEM DAS HEPATOPATIAS Embora o fígado seja um órgão de mú ltiplas funções, a propedêutica laboratorial na abordagem e manejo das hepatopatias apresenta limitações que devem ser lembradas e valorizadas na indicação e Interpretação dos resultados dos testes laboratoriais. A maioria dos testes apresenta especificidade diagnóstica relativamente baixa, já que os resultados são tnfluenciados não apenas pelas alterações que estão ocorrendo no fígado, mas também por alceSMF (SRE) (80- 85%)
rações acorrendo em outros órgãos ou no indivíduo como um todo. É necessário, portamo, associar vários restes para aumentar a sensibilidade e especificidade diagnóstica. Por outro lado, essa abordagem permite categorizar as doenças hepáticas de acordo com o tipo de comprometimento: hepacocelular ou colestático. Diante da multiplicidade de exames disponíveis para investigação das hepatopatias e visando a facilitar a indicação, a interpretação e a racionalização desses, os mesmos podem ser agrupados de acordo com a disfunção hepática por eles detectada: • lesão hepatocelular; • disfunção de síntese hepática; • disfunção de excreção e detoxificação do fígado.
TESTES PARA A AVALIAÇÃO OE LESÃO HEPATOCELULAR Os testes mais indicados com esse objetivo são as dosagens das enzimas hepáticas. Por sua localização no citoplasma e nas mitocôndrias, sua elevação no sangue ocorre quando há extravasamento celular devido à lesão ou necrose do hepatócito. As enzimas relacionadas nesse grupo são: • alanina aminouansferase (ALT); • aspartato aminotransferase (AST); • desidrogenase lática (LDH).
Destruição dos eritrócitos senescentes
-I
Hemoglobina
l
r-~ M edula Óssea
J
-l
Destruição dos eritróci tos em ma nutenção
Ferro
(15 - 20%)
Metabolismo de outros produtos contendo heme (hemoproteínas mioglob inas; citocromos; catalases, triptofano pirrolase, peroxidases)
+----i
l
H eme-oxigena se
[ Biliverdina l Biliverdina redutose ~
+
Fígado
Heme
Globina
f-
r
Bilirrubina - Bl
l
+ A lb umino
Figura 33.1 -Formação da bilirrubina não conjugada (ou indireta). SMF- Sistema Mononuclear Fagocitário; SRE - Sistema Retículo Endotelial; Bl · Bilirrubina lndireta.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
411
Captação
Excreção
( Conjugação
Hepatócito
Dueto biliar
Intestino
UDP Glicuron iltransferase ~
BI + óc glic
"
REL Bactérias
Urobilinogênio
Sinusóides !plasmai
uro bilina e eslercobil ina
Figura 33.2 - Metabolismo das bilirrubinas. Bl - Bilirrubina indireta, BD- bilirrubina di reta, Alb- Albumina, L- ligandina, REL - retí· culo endoplasmático liso, MGB e DGB - monoglicuronato e diglicuronato de bilirrubina, UDP - uridina difosfato.
Aminotransferases
Aspartato aminotransferase (AST)
Também con hecidas como tra nsaminases, são enzimas que catalisam a n ansferência de grupo alfa-amino de um aminoácido para alfa-cetoácido. A elevação sérica dessas enzimas é um indicador sensível de necrose ou lesão do hepatócito. Além do fígado, ta mbém estão presentes em outros tecidos. tais como miocárdio. musculatura estriada esquelética. rins. pâncreas. sistema nervoso central e hemácias. O Quadro 33.1 apresenta as situações clínicas que podem apresentar elevação sérica das aminorransferases.
Antenormeme denominada transaminase glutâmica oxalacética (TGO). esta enzima promove a segutnte reação de rransaminação:
Q uadro 33.1 - Doenças que podem cursar com elevação das aminmransferases séricas
Ácido G lutômico + Ácido Oxolocético
;:! Ácido a
+ Asportoto
Nos hepatócitos, cerca de 70% da AST são originados do citoplasma (microssomos) e 30% das mirocôndrias. A AST ap resenta meia-vida curta de 17 horas e está presente em outros tecidos, como músculos cardíacos e esqueléticos. ri ns, pâncreas e hemácias. Portamo. além dos quad ros de agressão hepática. ta mbém há elevação de AST na presença de lesões de outros órgãos. como, por exemplo. no infarto do miocárdio e nas miopatias.
Hepoto potios: hepoliles agudos e crônico , cirrose. doenças hepoto bilio res Miocard iopo tios Doenças do pôncreos Doenças muscula res
Alanina aminotransjerase (A LT)
Anteriormente denominada transaminase glutâmica pirúvtca (TGP). esta enztma promove a segwnte reação de transaminaçào:
Alcoolismo Ácid o Glutômico + Ácido Pirurvico
Outras doenças não hepóticos com repercussão no fígado: d iabetes, o besidade, hemocroma tose, d oença celío co , SIDA, hipertireo idismo, deficiência de alfa 1-o ntitripsina, etc.
412
M edicin a laboratorial para o clínico
;:!
Ácido a
Está presente em elevada quantidade no fígado, sendo por isso mais específica para diagnóstico de agressão
hepá[ica em relação ao AST e localiza-se exclusivamente no ciwplasma (microssomos). Seu tempo de meia-vida é mais longo, de 47 horas, permanecendo mais tempo alterada após o dano celular agudo em relação ao AST. Nas hepatites agudas, está muiro elevada, embora isso não indique mal prognós[ico. Sua atividade sérica encontra-se moderadamenre aumenrada na colestase e em processos hepáticos crónicos (hepatite crónica e cirrose). Embora seja mais específica para o fígado em relação ao AST, pode haver elevação de ALT em miopatias graves. Método: fotométrico - ultravioleta (cinética). Princípios: O piruvam,ou oxaloacetato formados pela ação das aminotransferases presenres na amostra são acoplados a uma segunda reação, na qual o piruvato (pela ação da ALT) ou oxaloacetato (pela ação da AST) são reduzidos pela NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) em reação catalisada pela lactam desidrogenase (para a ALT) ou malaw desidrogenase (para a AST). A transformação da NADH por oxidação à NAD+ é monitorada em 340 nm. Valores de referência: os valores séricos das amino, cransferases em indivíduos saudáveis variam com a idade e com sexo, sendo ligeirameme mais alros no sexo masculino (Tabela 33.1). Os valores de referência, especialmente de dosagens enzimáticas, variam em fun ção do mérodo e do reagente utilizado e da temperatura de reação, portanro, eles devem estar claramente citados nos laudos de resultados dos exames laboratoriais. Os valores mostrados são para as aminotransferases medidas pelo método proposto pela lnternational Federation oj Clinica/ chemistry (IFCC), com piridoxal-5'fosfato e temperatura de reação de 37°C. Principais causas de aumento: hemólise, exercício físico imenso previamente à coleta, etilismo, uso de fármacos hepacotóxicos: azitromicina, aminoglicosídeos, captopril, cefalosporinas, fluoroquinolonas, penicilina, piroxican, sulfas, interferon e ervas chinesas. Principais causas de diminuição: uso de vitamina C formaldeído, leucina, metronidazol. dopamina, metildopa, ciclosporina, alopurinol. progesterona, uremia, deficiência de vitamina B6. Razão AST/ALT
A atividade de AST dividida pela acividade da ALT, conhecida como razão de Ritis, expressa a diferença de alteração dessas enzimas nas hepatopatias agudas e crónicas e
Investigação labo ratorial do paciente com disfunção hepática
pode ser utilizada como mais um dado para a correlação clínico-laborawrial (Quadro 33.2). Habitualmente, em lesões agudas (hepatite virai, tóxica, medicamentosa), há aumento da permeabilidade dos hepatócitos ou necrose celular, com predomínio de ALT em relação ao AST. Por outro lado, em
lesões crônicas, (hepacice alcoólica, cirrose hepácica), nas qua1s, além da membrana celular, há lesão mitocondrial, ocorre predomínio de AST em relação à ALT. Nas hepatopatias alcoólicas esses índices são mais expressivos.
Oesidrogenase lática ou lactato desidrogenase (lO Hou lO}
No fígado, essa enzuna partici pa na gliconeogênese e na síntese de glicogênio a partir do lactato. A LDH tOtal dosada é resultame da combinação de cinco isoenzimas: LD I' LD2, LD3, LD4 e LD5. Praticamente todos os órgãos do corpo humano, incluindo o fígado. apresentam essa enzima, entretanto, a distribuição e a produção dessas isoenzimas variam para cada órgão individualmenre, como mostra a Quadro 33.3. O fígado é o órgão que apresenta o maior predomínio de LD5 e, portanto, nas lesões hepáticas, a LDH irá se elevar principalmente à custa dessa isoenzima. Método: focométrico - ultravioleta (cinética). Pri ncípio: A acividade da lactam desidrogenase presente na amostra pode ser avaliada pela medida da velocidade de transformação do piruvaco em lactam utilizando-se a co-enzima NAD+ e NADH em 340 nm. As reações podem proceder do lactato a piruvato ou, de modo inverso. do piruvato a lactato. Devido às suas vantagens, os ensaios que procedem do lactato a piruvaro são os mais utilizados pelos laboratórios clínicos atualmenre. Valores de referência: os valores de referência, especialmente de dosagens enzimáticas, variam em função do métOdo e do reagente utilizado e da temperatura de reação, porranta, estes valores devem estar clarameme citados nos laudos de resultados dos exames laboratOriais. Os valores mostrados na Tabela 33.2 são para LDH (tOtal) medida por transformação do lactato em piruvata, à temperatura de reação de 37°(. considerando-se a faixa etária. Principais causas de aumento: hemólise, exercício físico intenso previamente à coleca, !infamas, leucemias, hipóxia, doenças respiratórias, infarto agudo do miocárdio, anemia hemolítica, ecilismo, uso de amiodarona, esteróides, anabolizanres, gentamicina, nitrofuramoína, metotrexate, ácido valpróico.
413
Tabela 33.1 - Valores de referêncra de amrnocransferases - AST e ALT - utilizando o méwdo proposw pela IFCC. com pmdoxal-5'-fosfato, a 37 C por farxa etána e sexo Aminotronsferose AST
Sexo
O· 10dios
M&F
47· 150
0,80. 2,55
10 dros - 24 meses
M& F
9· 80
0, 15. 1,36
24 meses - 60 anos
M
15 ·40
0,26 ·0,68
F
13-35
022·0.60
M
19-48
0,32. 0,82
F
9· 36
0,15·0,61
M
11-38
o 19-0,65
F
18.30
0,31 0.5 1
O- 12 anos
M&F
13-45
0.22. 0.77
12 meses 60 anos
M
10 -40
0,17 0,68
1· 35
0.12 ·0.60
13 40
0.22-0.68
10 28
0.17-0,48
6-38
0.10 065
5o 24
0.09-0.41
60 · 90 anos
> 90 anos
AlT
60 - 90 anos
>
~onw Conversão
90 anos
M
M
ce unld~de corvcnc,onal (U/L) para umdade rmernac onal ( ~Kat/ L): U/L x 0.017
Principais causas de diminuição: uso de amrconvulsivames e oxalacos Quadro 33.2 - Correlação entre valores dos índrces AST/ ALr e hepawpatras AST'AL~
Unidade convencional U/L Unidade internacional ~Kot/L
Faixo etário
o
< 1
hepotopotras agudas (wal ou por drogas)
AST/ALT > 1,O · hepatopaha crômca (cirrose. hepahte vrra trpa Cl
~1-.at/L
Quadro 33.3 - Disrnburção percentual das isoemimas da desrdrogenase lática (LDH) em drversos órgãos Tecido
LD1
Sangue
25%
LD2 35%
LD3 20%
LD4
LD5
15%
5%
Coração
45%
40%
10%
5'7o
O~o
Hemócros
40%
35%
15%
10%
0%
Rm
35%
30~
2SOo
10',;,
Oo
Pulmão
10%
15%
40%
AST/ALT > 2.0 sugeshvo de hepotopoha olcoólrco
Músulo-esouelético
0%
oo
10°o
30% 300.
60%
AST/AlT > 3.0 ·altamente sugesrivo de hepatopatia alcoólico
Fígado
0%
5%
10%
15%
70%
5%
Tabela 33.2 - Valores de referência de desidrogenase lática (LDH) utilizando méwdo fowméuico-cinético (piruvato lacraro) a 37°(. segundo idade Unidade Convencional
Unidade lnternacional
U/ L 290-755
~Kat/L 4,9 - 13,2
545-2000
9,3 34,0
lO d ias- 24 meses
180-430
3,1 - 7,3
24 meses - 12 anos
110-295
19-5.0
12 -60 anos
100- 190
1,7 - 3,2
60-90 anos
11 0 210
1,9 - 3,6
> 90 anos
99 - 284
1,7-4, 8
Faixa etária
0-4 dias 4-
]Q OIOS
Conve1sóo de unidade convencional (U/LI paro unidade inlemocionol (!JKOI/LI U/L x 0,017 = IJKol/ l.
TESTES PARA AVALIAÇÃO DA DISFUNÇÃO DE SÍNTESE HEPÁTICA A avaliação da síntese hepática é realizada na prática clínica pela dosagem de: • proteínas séricas: proteína total. albumina e globulinas; • tempo de protrombina.
Dosagem das proteínas séricas
Tendo em vista que o hepatócito é a principal célula produtora de proteínas no organismo humano, em especial a albumtna, a quanttftcação laboratorial da proteína sérica total e suas frações, albumina e globulinas, são indicadas para avaliar disfunção da síntese hepática. Proteína total
Emende-se por proteína rotai do soro a soma da al bumina e globulinas. Pode ser dosada mais comumente por métodos colorimémcos, podendo ainda ser utilizados métodos imunométricos (nefelometria, rurbidimerria) ou eletroforéricos. Método: fotométrico-colorimétrico. Princípio: os métodos para a determinação da concentração de pro-
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
teínas totais são muito variados, no entanto, os mais utilizados são os espectrofotométricos. empregando-se o reagente de biurew. Este reagente, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio e um estabilizame, reage com proteínas, formando um complexo
cuja imensidade da cor pode ser medida em 540 nm. Valor de referência: a concentração plasmática de proteínas tocais é dependente da idade e da postura do indivíduo. Os valores de referência podem variar em função das características da população estudada. do método e do reagente utilizado, portanto, estes valores devem estar claramente eirados nos laudos de resultados dos exames laboratoriais. Os valores de referência para proteínas totais pelo método colorimétrico-fotométrico com o reagente de biureto, de acordo com a idade e postura, são apresentados na Tabela 33.3. Tabela 33.3 - Valores de referência de proteínas rorais utilizando método colorimérrico-forométrico com o reagente de b1ureto, de acordo com a 1dade e cond1ção postural
Faixa etária
Unidade Convencional g / dL
Unidade Internacional g /L
Cordão
4
8 - 8,0
1\8-80
RN pré-lermo
3.6-6.0
36-60
RN o lermo
4,6-7,0
46 -70
O -7 dias
4.4 - 7.6
44-76
7 meses - 1 ano
5,l - 7.3
5 1 -73
1 -2 anos
5,6- 7.5
56 75
> 2 anos
6,0 -8,0
60-80
Adulto- Ambulo•or'o
6 4-8 3
64-83
Adulto - Acomodo
6,0-7.8
60-78
> 60 anos - Ambuloloriol
6.2-7.8
62-78
> 60 anos - Acomodo
5,8-7.6
58-76
Conversão de umdode convenc,onol (g/dl) paro unidade 'nternocionol (g/ll g/dl x 10 = g/L.
Método: eletroforese de proteínas - esse método permite o fractonamemo da proteína total em albumina e nas frações de globulinas (ver capítulo 5). Na eletro-
415
forese convencional (pH
= 8,6), as proteínas cocais são
separadas em cinco faixas, como demonstra o Quadro 33A. Na eletroforese capilar. separa-se ainda a faixa beta em duas: beta 1 (transferrina e hemopexina) e beta 2
Tabela 33.4 - Valores de referência em elerroforese de proteínas em gel de acetato de celulose para indivíduos adultos Unidade Convencional
Unidade lnternacional
g/dl
g/L
Albumino
3.5-5.0
35-50
Alio l -globulina
0,1 -0,3
1- 3
Alfa 2-globulina
0,6 - 1,0
6 - 10
alfa 1-onrirripsina, glicoproteino ácido l1poproteíno alfa (HDL)
Betaglobu!ina
0,7 - 1.1
7- 11
Gomoglobulina
0,8 - 1,6
8 - 16
Faixa 3 ou Alfa 2-globulina
mocroglobulino, hoptoglobulino, lipoproteína beta (LDL). ceruloplosmino, imunoglobulinos
ProTeínas :orais
6.0 - 8.0
60-80
Faixa 4 ou Betaglobulina
tronsferrino, opolipoproteíno, complementos C3 e C4, imunoglobulinos
Faixa
(complemento C3). Quadro 33.4 - Elerroforese de proteínas do soro Faixa eletroforética Faixo 1 Faixo 2 ou Alfa l-globulina
Faixa 5 ou Gomoglobulina
Proteínas séricas pré-albumino e albumino
fibrinogênio, proteína C reotivo, imunoglobulinas
Conversão de unidade convencional (g/dll paro un1dade internacional (g/ LI g/ dl x 10 = g/L. Albumina Entre as diversas proteínas séricas. aquela q ue mais reflete a disfunção de síntese do hepatócito é a albu-
A elerroforese de proteínas nas hepatopatias apresenta alguns padrões característicos. mas não específicos. A diminuição da fração albumina ocorre em heparopatias crónicas. A elevação das gamaglobulinas. quando não associada a outras condições inflamatórias crónicas, pode ser um bom indicador de doença hepatocelular. Na cirrose hepática, observa-se a elevação policlonal das gamaglobulinas; na hepatite crónica. a elevação ocorre por elevação da lgG; na cirrose biliar, o aumento é decorrente da lgM e na cirrose alcoólica da elevação de lgA As frações alfa e betaglobulinas apresentam poucas alterações significativas nas doenças hepáticas. mas observa-se elevação da fração beta na colestase. Um padrão de eletroforese útil no diagnóstico é a ausência do pico de alfa l -globulina (faixa 2). que sugere deficiência de alfa 1-antitripsina e deve ser investigado pela dosagem específica dessa proteína. Valor de referência: os valores de referência podem variar em função das características da população estudada do método e do reagente utilizado, portanto, esses valores devem estar claramente citados nos laudos de resultados dos exames laboratoriais. A Tabela 33.4 apresenta os valores de referência para eletroforese de proteínas em gel de acetaco de celulose para indivíduos adulros.
mina. Em condiçõ es fisio lógicas, cerca de 10 gramas são sintetizados diariamente. É a proteín a sanguínea mais abundante, perfazendo aproximadamente 2/3 das proteínas totais. Suas principais funções são transporte e manutenção da pressão oncótica e do volume plasmáti co. Apresenta meia-vida de 15 a 19 dias e por isso é pouco sensível pa ra doenças agudas. mas a hi poalbuminemia é achado freqüente nas doenças crónicas do fígado. Embora seja sintetizada exclusivamente pelo hepatócito, sua concentração sérica pode encontrar-se red uzida em diversas situações cl ínicas. sem que haja. necessariamente, comprom etimento hepático, como ocorre em processos inflamatórios agudos. Assim, a albumina pode ser considerada uma proteína de fase aguda negativa (ver capítulo 56). O Quadro 33.5 ilustra as principais causas de hipoalbuminemia sérica. Métodos: a albumina pode ser dosada por diversas técnicas, mas as fotométricas colorimétricas, utilizandose o reagente verde de bromocresol. são as mais difundidas e de primeira escolha. Outras técnicas mais elaboradas. como a eletroforese de proteínas e imunoensaios. são utilizadas para dosagem das frações de globulina e imunoglobulinas.
416 [ Medicina laboratorial para o clínico )1-- - - -- - - - - - -- - - - - - - - - - - -- - - -- - -
Quadro 33.5 - Pnncipats causas de hipoalbuminemia Diminuição de síntese
Aumento da perda Aumento da volemia Aumento do catabolismo Variação genética
Doença hepático
Nefropotios-síndrome nefrótico
Desnutrição prolé1co· calórico
Enleropolios
Mó-absorção inleslinal
Queimaduras
Neoplosios
Hiper-hidrolação
Traumatismos
Anolbuminemia
Pós-ooeralório
diarréias
Doenças dermoloexsudotivos
Reoções inflamatórios
Valores de referência: a concentração plasmáttca de albumtna é dependente da idade e da postura do indivíduo (pacientes com hospttalização prolongada ou cronicamente acamados apresentam diminuição da albumina plasmánca). Os valores de referência podem vanar em função das características da população escudada do mérodo e do reagente utiltzado, portamo. estes valores devem estar claramente citados nos laudos de resultados dos exames laboraroriais. A Tabela 33.5 apresenta os valores de referêncta para dosagem de albumina de acordo com sexo e fatxa etária, pelos métodos colorimétrico-forométrico, tmunorurbidimérrico ou imunonefelomérrico.
Tabela 33.5 - Valores de referência para albumma medida pelos mérodos colonmémco-fmométrico, lmunoturbtdlmémco ou tmunonefelométrtco, segundo fa1xa erána e sexo Unidade Convencional g/dl
Unidade Internacional g/L
0 - 4 dias
2.8-4,4
28-44
4 lOdios
3,8 -5.4
38 - 54
Adulto
3,5-5,2
35 - 52
60-90 anos
3.2 -4.6
32 46
> 90 anos
2,9-4,5
29 - 45
Faixa etária
Conversão oe un,dode convenCiono! lg/dl} poro unidade internoclonol lg/l}: g/dl x 1O = g/l.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
Principais causas de aumento: desidratação, iatrogenia (reposição endovenosa exagerada de albumina). Principais causas de diminuição: hemólise, uremia, lipemia, gravidez, uso de esrrógenos e anriconcepetonats oral, aumento da volemia (hiperidratação venosa). aumento da perda (síndrome nefrórica, doenças gasuintesrinais); diminuição da produção ( heparopatias crónicas. etdismo e uso de fármacos hepawróxicos: ibuprofeno, ramoxifeno, ácido valpróico, isoniazida). Globulinas e relação albumina/globulina
Correspondem à soma das proteínas séricas: gamaglobulinas, globulinas alfa e beta. As gamaglobulinas (imunoglobulinas) são sintetizadas pelo linfóciro B e as globulinas alfa e bera pelo hepatóciro. Apresentam-se aumentadas em várias heparopatias em resposta ao processo reacional inflamatório ou à disfunção de produção hepática. Por meio de mérodos de fracionamento (eleuoforese e imunoeletroforese) é possível detectar as alterações mais características. Métodos: o valor das globulinas é calculado pela diferença entre as dosagens das proteínas totais e da albumina (G = PT -A). medidas pelos mérodos colorimétrico ou eletroforético. A dosagem de albumina pela eleuoforese é preferível em relação ao método colorimétricofotométrico com o reagente verde de bromocresol. uma vez que este último pode superestimar o valor da albumina. A razão entre a al bumina e globulina (A/G) deve ser maior que 1 e geralmente se situa entre 1.4 e 2.6.
417
Principais causas de aumento: desidratação, reações de fase aguda, neoplasias, hipergamaglobu linemia mono ou policlonal (ver principais causa de aumento da dosagem de albumina). Principais causas de diminuição: (ver principais causa de diminuição da dosagem de albumina).
Fatores de coagulação - tempo de protrombina (TP)
O fígado tem função central na síntese dos fawres de coagulação (capículo 30). Assim a determmação do TP. que depende dos fawres I, 11, V, VIl e X sintetizados no fígado, é utilizada nas hepacopatias para avaliação da disfunção de síntese do hepatócico. Por terem vida média rápida, avaliam a disfunção hepática tanto nos processos agudos como nos crónicos. Entretanto, nem coda elevação do TP 1ndica, necessariameme, disfunção hepática. Para a adequada símese desses facores apresentados, excem o I (fibrinogênio). além da v1abilidade do hepatócico. também deve haver adequada disponibilidade da vitamina K, sendo, por isso, chamados de "facores dependentes da vitamina K". A carência dessa vitamina lipossollivel, que normalmente é absorvida pela ação da bile, também pode alargar o TP. Para diferenciar se o alargamento do TP é de causa biliar (deficiência de vitamina K) ou por lesão hepamcelular, excluindo-se as coagulopatias primárias, adminisua-se a vitamina K (injetável - lOmg/dia) e repete-se o TP após 24 e 48 horas. A persistência do TP aumentado mesmo após a oferta de vitamina K corrobora a suspeita de disfunção do hepatócico. Além disso, alteração persistente do tempo de prouombina ·10 segundos acima do concrole em um paoeme ictérico, que não se corrige com a vitamina K, correlaciona-se com prognóstico ruim.
TESTES PARA AVALIAÇÃO DA DISFUNÇÃO DA EXCREÇÃO HEPÁTICA O conJumo de restes utilizados para avaliar a excreção e decoxificação hepática é a dosagem de: • bilirrubinas: cotai (BT), conjugada (BC) ou direta (BD), não conjugada (BNC) ou indireta (BI); • pigmentos biliares; • enzimas ind1cadoras de colestase.
418
M edicina laboratorial para o clínico
Dosagem das bilirrubinas séricas
A elevação das bilirrubinas séncas é ocorrênoa freqüente nas hepawpatias, ora pela disfunção no metabolismo, ora por disfunção na excreção. A interrupção do fluxo da bile nas vias biliares, incra ou exrra-hepárica, ocasiona elevação da BC no sangue. Por outro lado, a lesão do hepatóciw dificulta ou impede a captação e a conjugação da BNC. As duas sicuações ocasionam elevação das bilirrubinas no sangue e podem levar ao aparecimenco da iccerícia, devido à impregnação da pele e mucosas por esses pigmemos. Os distúrbios do metabolismo das bilirrubinas serão d1scucidos ad iame. Método: diazo reação (fmométrico-colonmécrico). A dosagem das bil irrubinas baseia-se na clássica reação diazo, descrita por Van den Bergh e Muller, mostrada a seguir: Bilirrubina (soro) + Sol Diozotodo {reogenle) - Crom6foros de Azobilirrubino
A quamificação do produw final formado poderá ser feita por vários mémdos foco métricos e cromawgráficos (HPLC). Os focoméuicos são os mais amplameme utilizados na rotina do laboratório clínico. ABC por ser um composco polar. reage rapidameme com o sal diazotado, em meio aquoso, produz1ndo a azobilirrubina. Portamo, a BC é diretameme dosada (razão do termo bilirrubina direta - BD). Por outro lado, a BNC por ser um composco apoiar, reage mais lemameme e someme após adição de catalisadores (cafeína, etanol, metanol. benzoam de sódio, etc.) produz a azobilirrublna. Porca mo, no laboratório, habicualmeme dosam-se as bilirrubinas direta e coral. sendo os valores da Bl determinados de forma indireta, pelo cálculo: BT = BD + Bl e Bl = BT - BD (razão do termo bilirrubina indireta). Valor de referência: a bilirrubinem1a varia com a idade, apresencando níve1s mais elevados em recém-nasCIdos (RN). conforme apresentado nas Tabelas 33.6 e 33.7. Principais causas de aumento: jejum prolongado, tempo prolongado de garroceamemo (elevação de BT), hemólise, exercício físico intenso prévio à coleca, anemias hemolíticas, transfusões sanguíneas, hemawmas. cirurgias prévias (hemólise), uso de medicamentos tais como alopurinol. esteróides anabolizantes, viram1nas A e C colinérg1cos, codeína, morfina, diurét1cos. epinefrina, mecrotexate, mecildopa. rifampicina e salicilams.
Tabela 33.6- Valores de referência de bilirrubina cotai medida pelo método fotométnco, com reageme dtazo. para RN prematuro e a termo Faixo etária
Prematuro
A termo
Unidade Convencional Unidade Internacional Unidade Convencional mg/ dl 11moi/L mg/ dl
Unidade Internacional jlmoi/L
49,6
<2,5
42.7
Cordão < 24 h
1,0· 8,0
17.1 . 136,8
2.0. 6.0
34.2. 102,6
< 48 h
6,0·12,0
102,6. 205,2
6,0. 7.0
102,6. 119,7
3 o 5 dias
100 14.0
171.0. 2394
4,0. 6,0
68,4 . 102,6
7 dias
14,0·15.0
239,4 . 256,5
6,0. 10,0
102,6. 171,0
0.2 · I 2
3,42. 20.52
0,2. 1,2
3,42. 20,52
> 1 mês
< 0, 1 (normoll
< 1.71 lnormoll
O, 1 · 0,27 (eritroblostose fetoll
1,71 · 4,6(entroblostose fetal)
Líquido ommótico
Conversão de unidade convenc1onol (mg/dll poro un1dode lnternoclonoi(J.Jmoi/LI· mg/dl x 17 1 = J.J moi/L
Tabela 33.7 - Valores de referência das bihrrubinas total (BT), dtrera (BD) e tndtreta (BI) para indtvíduos adultas, medidas pelo método fotométrico. com reagente diazo
Urobilinogênio urinário Em condições fisiológicas. peouena porção de urobilinogénio é excretada na urina (~ 1 mg/dl). Nas disfun-
Unidade Convencional mg/ dl
Unidade Internacional pmoi/L
Direto
< 0,4
< 6.8
lndireto
< 0,8
< 13,6
Total
< 1,2
< 20,5
Bilirrubina
ções ou lesões hepáticas (hepatites, cirrose e insuficiência cardíaca congestiva) pela Incapacidade do hepatócito em capeá-lo, pode haver aumento da excreção, tornando sua pesquisa na urina pos1civa (Figura 33.2).
Enzimas indicadoras de co lestase Conversão de unidade convencionol(mg/dll poro unidade inter· nocionoi(J.Jmoi/L): mg/dl x 17 1 = J.Jmoi/L
Algumas enzima s encontram-se muito elevadas nos processos obscrucivos do fígado por aumento de produ-
Principais causas de diminuição: armazenamento
ção hepática ou por dificuldade de excreção através da
inadequado por exposição à luz solar ou artificial (foto-
btle e são utilizadas como ind1cadoras de colescase. Emre
oxtdação da b1lirrub1na).
essas, destacam-se a fosfatase alcalina (FA) e gamaglucamil
Bilirrubina urinária (bilirrubinúria)
cransferase (GGT). Outras. como a leuc1no-am1nopepcidase (LAP) e a 5'-nucleoccidase. são menos utilizadas na prática clínica. As enzimas relacionadas nesse grupo são:
detectada nos cesces rocineiros. Portanto, toda bilirrubi-
• fosfata se alcalina (FA)- uso rotineiro; • gamaglucamil cransferase (GGT)- uso rotineiro;
núria é indício de processo patogénico e merece Investi-
• leucino-aminopepc1dase (LAP)-ucilização restrita;
gação (ver capítulo 35).
• 5' -Nucleotidase- utilização restrita.
Em condições fisiológicas. a bilirrubina urinária não é
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepáti ca
419
Fosfatase alcalina (FA) A FA é uma metaloproceína zinco-dependente que hidrolisa o fosfaw terminal de éster orgânico. em pH alcalino. Apresenta origem hepática (50%), óssea (40%) e intestinal (10%). Em gestantes. há ainda pequena produção placentána (endométrio). Sua excreção se faz na bile. Na colestase, sua elevação ocorre prinCipalmente por ma1or estímulo à sua produção pelas células canaliculares devido ao aumento da pressão intracanalicular, bem como por regurgitamento para o sangue. Lesões expansivas no fígado elevam a FA Enconua-se muiw elevada nos tumores hepáticos. nas metástases hepáticas, granulomas. nódulos e c1sms hepáticos e pode ser a única alteração laborawrial observada. Além do diagnóstico das hepawpatias, a FA é também utilizada nas suspeitas de doenças ósseas. tais como raquitismo, osteomaláCia, osteossarcomas e fraturas. O quadro clínico do paciente e suspeita diagnóstica permitem, na maioria das vezes, orientar se a elevação de FA é de origem óssea ou hepática. A interpretação conjunta com ouuas enzimas indicadoras de colestase, como a GGT e outros testes. também colabora na interpretação. Método: focomérnco- colorimétrico (cinética). PrincípiO: a FA presente na amostra catalisa a transferência do grupo fosfaco do 4-nitrofenilfosfaro (4-N PP) para um acepwr de fosfaws (dietanolamina - DEA, 2-amion-2metil-1-propanol - AMP, tris-hidroximetil-aminometano - Tris, p.ex.), liberando 4-nitrofenol. A atividade catalítica é determinada a part1 r da velocidade de formação do 4-niuofenol med1da em 405 nm, a 25°, 30° ou 37°C. Valores de referência: em condições fisiológicas, a atividade sérica da FA em crianças é duas a três vezes maior do que em adulcos, sendo também elevada na puberdade se comparada com a idade adulta. Durante fases de cresCimento ráp1do. valores tão alcos quanto 1.000 U/L podem ser observados em indivíduos sadios. Os valores aumentados na 1nfância e puberdade resultam da grande contribuição da fração óssea. Após a puberdade, a FA sérica é, na sua maioria. de origem hepática. No terceiro mmestre da gestação pode ser detectado aumenco de até duas a três vezes o limite superior do intervalo de referência, sendo observado recorno aos níveis basais três a seis semanas pós-parto. Os valores de referência, especialmente de dosagens enzimáticas, variam em função do mécodo e do reagente utilizado e da temperatura de reação, portanto, estes valores devem estar claramente mados nos laudos de
420
Medicina laboratorial para o clínico
resultados dos exames laboramriais. A Tabela 33.8 apresenta os valores de referência da FA (cotai) para indivíduos adulcos. obtidos com mécodo fommétrico-cinético, utilizando-se 4-N PP como subsrraco. AMP como tampão e temperatura de reação de 37°( (mécodo de referência proposto pela IFCC e Arnerican Association of C/mcal Chem1stry - AACC). Tabela 33.8 - Valores de referência de fosfatase alcalina (FA) u[ilizando méwdo de referênc1a (IFCC/AACC). a 37°C. segundo idade e sexo
Faixo etário
Sexo
Unidade Convencional U/ l
Unidade Internacional !JKot/ L
4 · 15 anos
Me F
54. 369
0,92-6,27
M
53. 128
0,90 · 2, 18
F
42-98
0,71-1,67
M
56· 119
095.202
F
53- 141
0.90-2,40
M
56 - 155
0,95- 2,63
43- 160
0.73-2,72
20 - 50 anos
~
60 aros
60 · 90 anos
Conversão de unidade convencional (J/L) poro un1dode lnlernocionol 11-!Koi/ LI: U/L x O O17 = IJKoi/L
Principais causas de aumento: amostra estocada inadequadamente sob temperatura ambiente, drogas hepawtóx1cas. esmão do crescimento, doenças ósseas, terceiro trimestre da gravidez. Principais causas de diminuição: amostra colhida em tubo contendo EDTA, citraco ou fluoreco, hiporireoidismo, escorbuco, deficiência de vitamina B12 (anemia pernic1osa), deficiênCia nutricional (Kwashiorkor); uso de estrógeno, anticoncepcional oral. Gamaglutamil transferase (GGT ou y-GT)
Também conhecida como gamaglutamil transpeptidase, é uma enzima de excreção bi liar com meia-vida de 7-10 dias. Além do fígado, também pode se originar em demais órgãos do rraco gasrrintestinal. nos rins e no tecido prostático. Localiza-se no retículo endoplasmático das cél ulas epiteliais dos
ducros bilia res. Cerca de 90% das doenças hepatobiliares apresentam alteração da GGT, mas as mais expressivas são nas colestases. Assim como a FA, a GGT é utilizada como um indicador de colestase, com a vantagem de não se alterar em doenças ósseas e na gravidez. Valor elevado de FA associado à GGT dentro dos valores de referência indica causa extrahepática do aum ento da FA. Nas colestases int ra ou exrra-hepática, a GGT sérica aumenta cinco a 30 vezes o maior valor de referência. Na hepatite alcoólica, devido à ingestão crónica de álcool, observam-se tam bém níveis elevados de GGT. O álcool induz à maior síntese da GGT no fígado, por isso ela é utilizada no monitoramento de pacientes com abuso de tngestão de álcool. Elevações moderadas (em to rno de rrês vezes o maior valor de referência) são enconrradas em outras hepatopatias que não cursam com colestase, como hepatites agudas e cró nicas, esteatose hepática, uso contínuo de alguns medicamentos e utilização de drogas hepatotóxicas. Método: fotométrico - colorimétrico (cinética). A GGT presente na amostra promove a transferência do resíduo g-glutamil do substrato g-glutamil-pnitroanilida para a glicilglicina. liberando a p-nitroanilina, um produto cromogênico que pode ser medido em 405-420 nm. Valores de referência: os valores séricos da GGT, em indivíduos saudáveis, variam com a idade e sexo, sendo ligeiramente mais alcos no sexo masculino (Tabela 33.9). Os valores de referência, especialmente de dosagens enzimáticas, variam em função do método e do reageme utilizado e da temperatura de reação, portanto, estes valo res devem estar clarameme citados nos laudos de resultados dos exames laboratoriais. Os valores apresentados são para GGT. utilizando-se o mécodo foto métrico-cinético (Szaz) com g-glutamilp-nitroanilida como substrato e temperat ura de reação de 37°C. Principais causas de aumento: jejum prolongado, desidratação, tabagismo. etilismo. neoplasias (fígado, pâncreas e próstata), uso de azatioprina, mecotrexate, acetaminofeno, barbitúricos, cefalosporinas. cimetidina. estrógeno. amiconcepcional oral e anticonvulsivantes. Principais causas de diminuição: hemólise e dosagem em amostra colhida imediatamente após a dieta, hi potireoidismo, uso de vitamina C estrógenos conjugados.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
Tabela 33.9- Valores de referência de gamaglutamíl transferase (GGT) utilizando mécodo focométrico-cinéttco, com substra to g-glutamil-p-nitroanilida. a 37°(, de acordo com sexo e faixa etária
Sexo
Unidade Convencional
Unidade Internacional
U/ L
~-tKat/L
Cordão
M &F
11 - 194
0,19-3,30
0 - l mês
M& F
o- 151
0,00 -2.57
1 - 2 meses
M& F
0- 11 4
0,00- 1,94
2 - L1 meses
M&F
0- 81
0,00. 1,38
4 · 7 meses
M& F
o- 34
0,00. 0,58
7 · 12 meses
M& F
0 - 24
0,00. 0,39
l - 2 anos
M& F
l . 20
0,00 - 0,41
2 · 5 anos
M &F
3 - 22
0,02-0,34
5- lO anos
M&F
3-22
0,00. 0,37
M
3. 25
0.05- 0 .43
3 - 20
0,05 -0, 34
2-30
0,03 . 0,5 1
l- 24
0,02-0,041
Faixa etária
lO· 15 anos
Adulto
M
Conversão de unidade convencional lU/ L) paro unidade internacional (~Ko t/l) : U/l x 0,017 = ~Kat/l. 5'-Nuc/eotidase
Esta enzima é também um indicador de colestase. assim como a FA e GGT. É mais específica para doenças hepáticas do que a FA. pois não se eleva em doenças ósseas e com o crescimento - situações em que pode ser indicada para o diagnóstico diferencial, se disponível. Praticamente não é utilizada na rorina clínica, tendo sido substituída pela GGT. Métodos: focomérrico-colorimérrico (cinética) Valor de Referência: os valores de referência, especialmente de dosagens enzimáticas. variam em função do método e do reagente utilizado e da tem peratura de reação, portanto, estes valores devem estar claramente citados nos laudos de resultados dos exames laboratoriais. Os valores séricos de 5'-nucleotidase para indivíduos sadios, utilizando-se método fotométrico-cinético a 37°(, variam entre 2 e 17 U/L (0,03 - 0,29 IJKat/L - unidade
421
internacional). Resultado da relação GGT/5'-nucleotidase inferior a 1,9 é sugestivo de colestase intra-hepática. Principais causas de aumento: hemólise, gravidez (terceirO rnmesrre). pré-eclampsia, artrite inflamatória, hepacocaronoma. cirrose biliar primária, uso de anticonvulsivames, ácido acetilsaiiCÍhco, aceraminofeno e outras drogas causadoras de colestase. Principais causas de diminuição: amostras colhidas em EDTA ou armazenadas em temperatura ambiente por tempo prolongado. Leucina aminopeptidase (LAP)
Também conhecida como leucina arilamidase. a dosagem desta enzima praticamente não é utilizada na rotina devido a dificuldades técnicas. Eleva-se na colestase e está normal nas doenças ósseas. correlacionando-se com os achados da GGT. Atualmeme, apresenta utilidade reconhecida como indicador sensível para coledocolitíase e metástases hepáticas em pacientes ani([éricos. A GGT. LAP e 5'-nucleo[ldase são úteis para esclarecer a origem de aumento 1solada da FA, não sendo úteis no paciente icrérico em que a causa do aumento da FA está esclarecido. Método: fotométrico-colorimétrico (cinética) Valor de Referência: os valores de referência, especialmente de dosagens enzimáticas, variam em fu nção do método e do reagente utilizado e da temperatura de reação. portamo, estes valores devem esta r claramente eirados nos laudos de resultados dos exames laboratona1s. Os valores séricos de LAP são ligeiramente mais elevados em indivíduos do sexo masculino. Os valores apresentados na Tabela 33.10 são para LAP, utilizando-se o método fotométrico-cinético (Goldbarg-Rutemburg), a 37°C. Tabela 33.10 - Valores de referênoa de leuc1na aminopepridase (LAP) utilizando método fotomérnco-cinérico, a 37°(. de acordo com sexo Unidade Convencional U/ ml
Unidade Internacional U/L
Feminino
75- 185
18,0 - 44,0
Masculino
80 -200
19,2 - 48,0
Sexo
Conversão de unidade convenc1onol (U/ml}poro unidade mlernocíonol lU. li UimLx O24 = U/L
422 [
Medicina laboratorial para o clínico
Principais causas de aumento: linfomas. leucemias, rubéola e mononucleose infecciosa. Principais causas de diminuição: coleta da amostra de sangue em EDTA. hipertensão gravídica, enlrsmo.
ESTRATÉGIA DA PROPEDÊUTICA PARA AVALIAÇÃO DAS HEPATOPATIAS
Diante da suspeita de hepatoparia, a abordagem inicial seguida na prática clínica é a utilização de conjunto de restes laboratoriais, discutidos neste capitulo. Esses são impropnamente conhecidos como "restes de fun ção hepática". O objerivo desses testes é proporcionar ao clínico respostas às seguintes questões: • existe doença hepática? Hepatopatias com comprometimento discreto e/ou localizado (cisto, nódulo) podem cursar sem alterações detectáveis nos testes laboratoriais disponíveis atualmente. Habitualmente. quando todos os testes estiverem dentro do intervalo de referência, a possibilidade de doença hepática é pequena, porém a alteração persistente de apenas um dos testes pode ser indicativa de hepatopatia. Esta análise deve levar em coma os valores segundo o sexo, idade e até mesmo as características raciais, que podem alterar os valores referenciais para estes testes. Estes valores devem estar claramente citados nos laudos de resultados dos exames laboratoriais; • qual a extensão do dano hepático? Testes como as aminotransferases, muito alterados na fase aguda da hepatite v1rótica, não s1gn1ficam prognóstiCO ruim. Por outro lado, hepatopatias crónicas cursam por períodos de anos com alterações clínicas e laboratoriais discretas até a falência do órgão, como é visto na cirrose. Alguns testes. como as dosagens de amlllotransferases, apresentam elevada sensibilidade, alterando-se precocemente nas lesões de hepatÓCItOS, mas não permitem correlac1onar com preosão o grau de extensão do da no hepático. A diminuição da síntese de albumina e determinação do TP estão mais relacionadas com a extensão do comprometimento hepático, em processos agudos e crónicos; • qual a localização e etiologia da hepatopatia? Independentemente da etiologia. o dano hepático pode-se traduzir em: lesão hepatocelular, colesrase
ou ambas. Os restes laboraroriais disponíveis para avaliação hepática permitem ao clínico diagnosticar qual dos processos em curso. Para esclarecimento do diagnóstico etiológico, entreta nto, é necessário recorrer-se ao estudo por imagem, aos restes imunológicos, à biópsia hepática, e restes imuno-hisroquímicos; • como a doença está evoluindo? As manifestações clínicas e os dados laboratoriais observadas no curso da doença permitem monirorar a progressão ou regressão da heparopatia. A normalização dos testes indica regressão e cura. A persistência de alterações, mesmo com valores próximos do maior valor de referência, indica cronificação do processo, como é visto nas hepatites crônicas e cirrose. Esse monitoramento deve ser realizado em períodos de semanas ou meses e muitas vezes acompanhado de restes por imagem e/ou biópsia hepática. No perfil bioquímico indicado para a abordagem inicial das hepatopatias. estão: as dosagens de enzimas indicadoras de colestase (FA. GGT); as de enzimas indicadoras de lesão heparocelular (AST. ALT. GGT), a dosagem das bilirrubinas e os restes de avaliação da síntese hepática (albumina e TP), mostrados no Quadro 33.6. De modo geral, os resultados desses restes permitem a identificação do padrão predominante da lesão hepática: colesrase ou hepatocelular. Prossegue-se, então, a propedêutica para esclarecer o diagnóstico etiológico e monitorar o comprometimento hepático.
ALT será maior que um, indicando predomínio da AST e o comprometimento mitoco ndrial. Quanto às bilirru-
binas, encontram-se elevadas pela disfu nção de conjugação nas necroses extensas e pela colestase intra-hepática concomitante. Nas hepatites agudas, am bas estão elevadas, mas com predomínio da BC. Já as enzimas que indicam colesrase, FA e GGT. apresentam-se pouco alteradas se comparadas com as aminotransferases. O Quadro 33.7 exemplifica as possíveis alterações dos resultados de exames laboratoriais nas diversas hepatopatias que cursam com padrão hepatocelular. Quadro 33.6 - Perfil bioquímico indicado na abordagem inicial de suspeita de hepatopatia Bilirrubinos TotoliBTI Direta IBD) lndireta IBII Aminotronsferoses Asportoto ominotronsferase IAST) Alanina ominotronsferose IALT) Fosfatase alcalina IFA) G omo glutomil ·ransferase IGGT) Tempo de protrombina ITP) Proteína total Albumino
ALTERAÇÕES LABORATORIAIS DAS HEPATOPATIAS QU E EVOLUEM COM PADRÃO HEPATOCELULAR Nesse gru po de hepatopatias com padrão hepatocelular, a lesão ou necrose dos hepatócitos é o comprometimento preponderante. Esse pad rão é observado nas hepatites virais, hepatite alcoólica, hepatite autoimune, hepatites tóxicas, hepatite crô nica e cirrose. As enzimas AST e ALT são os restes mais sensíveis desse grupo, apresentando elevações significativas nas agressões hepáticas agudas. Esse aumento pode atingir 20 a 100 vezes o maior valor de referência. Na fase aguda há predomínio da ALT. mais específica e em maior quantidade no fígado, e a relação AST/ALT será menor que um . Nas agressões hepáticas crônicas, a relação AST/
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
Globulinas
ALTERAÇÕES LABO RATORIAIS DAS HEPATOPATIAS COM PADRÃO COLESTÁTICO
Nesse grupo estão as hepatoparias que evoluem com predomínio de colestase. As enzimas marcadoras de colesrase (FA e GGT) terão elevação mais expressivas nesse grupo em relação a AST e ALT. que apresentam aumento moderado de duas a quat ro vezes o maior valor de referência. A bilirru bina total encontra-se aumentada, com predomínio da BD, mostrando a dificuldade de excreção
423
e testes é necessário afastar-se o
nas vias biliares. O TP, se prolongado, corrige-se com a ad-
cos para hepatites virais orientam o diagnóstico
ministração de vitamina K. Para esclarecer se a colestase é extra ou inrra-hepática, é necessário recorrer a exames por imagem (ultra-sonografia, tomografia computado-
subseqüentes. Em alguns casos
diagnóstico de colestase extra-hepática, com utilização de exames por imagem.
rizada, ressonância nuclear magnética, por exemplo.). O Quadro 33.8 exemphftca as possíveis alterações observadas nos resultados dos exames laboraronats nas dtversas
ALTERAÇÕES DO METABOLISMO DAS
heparopatias que cursam com padrão colestático.
BILIRRUBINAS NAS HEPATOPATIAS
ALTERAÇÕES LABORATORIAIS DAS HEPATOPATIAS COM PADRÃO M ISTO
tas de heparopatia (Quad ro 33.6). A elevação dos níveis séricos das bilirrubinas pode ser a primeira ou mesmo
A dosagem das bili rrubinas é obrigatória nas suspei-
a única manifestação de uma doença hepática. Ela é Nesse grupo, ocorre ramo a lesão hepatocelular como colestase. As aminotransferases, as enzimas marcadoras de colestase e as bilirrubinas (BT, BD e Bl) estão muiro aumentadas. Isso é observado em algumas hepames virais que evoluem com padrão colestático e nas hepatites por drogas. Nesses casos, a históna clínica, o uso de drogas heparotóxicas e os marcadores sorológi-
secundária ao distúrbio do seu metabolismo, seja na captação, conjugação ou excreção. Apenas quando os valores da hiperbilirrubinemia ultrapassem 2,0 mg/dL a 3,0 mg/dl, levam ao aparecimento da icterícia. Dependendo da fase em que ocorre o distúrbio do metabolismo das bilirrubinas, ela é classificada em pré-hepática, hepática e pós-hepática.
Quadro 33.7 - AILerações dos exames laboraLOriais nas hepatopatias com padrão hepatocelular
Agravo
Etiologia
Aminotransferases
Bilirrubinas
Hepatite aguda
Vírus IA,B,C, D,I1
Aumento acentuado
Aumento de BD e Bl com predomínio do BD
Drogas
120 a 1OOX o MVRI
Hepototoxinos
AST/ ALT < 1,O
Vírus IB e Cl 1
Aumento moderado
Doenças auto· rmunes
!mais de 3X o MVR)
Doenças metabóli· cos e nutnetonais
AST/ALT > 1.0
Ingestão de etanol
Aumento moderado
Hepatites crónicos
Hepatite alcoólico lcirrosel
1-3X oMVRI
Tempo de protrombina
Albumina
lnalterado2
Inalterada
Fosfatase alcalina Inalterado ou aumento discreto i-3X o MVR) 3
Aumento de BD e Bl
Prolongado !sem correçõo com viramino Kl
Diminuído
lnal:erado ou cumerto discreto I-3X oMVR)
Aumento de BD e Bl
Geralmente prolongado isem correçõo com vitamina Kl
Diminuída
Inalterado ou aumento discreto
11 a 2X oMVRI
AST/ALT > 2,0
MVR: maior valor de referência I realizar sorologra 2 aumentado nos hepatites lulmmonles 1 muito elevado em alguns pacientes com hepatite virai que evoluem com componente colestótico mais acentuado.
424 [ Medicina laboratorial para o clínico
]1------------- - - -- - - -- - -- - - - -- --
Quadro 33.8 - Alteração dos exames laboramriais nas heparoparias com padrão colesrárico
Agravo
Causa
Icterícia obstrul,vo
Extra ou intrahepótico1
Aminotransferases Inalterados ou aumento discreto ioté
Bilirrubinas
Protrombina
Albumina
FA
GGT
Aumento com predomínio do
Inalterado ou prolongado (corrige com v1tomino K)
Inalterado
Elevação modero· do [mais de4X o
Elevoda2
BD
4 XoMVR)
MVR)
MVR: maior valor oe referênc10. o d1ognóstico dife1enciol é feito com os lestes de imagem [US: TC RNM) 2 no hepatite alcoólico também ocorre elevação do GGT
Jugação hepática da BNC devido à atividade reduzida da
ICT ERÍCIA PRÉ-H EPÁTICA
UDP-glicuronil uansferase, em to rno de 30% do normal. Ocorre pnnopalmenre quando há maior desuui-
A bilirrubinemia geralmente não ultrapassa 5,0 mg/d l
e
ção das hemácias, ou seja, nas doenças hemolíticas.
as demais funções hepáticas encontram-se normais. As
Esse maior aporre de bilirrubina ao fígado supera a ca-
síndrom es de Crigler-Najjar ri po I
pacidade hepática de eliminá-la na bile. A dosagem da
ditárias e aurossômicas,
b1hrrub1na mosuará elevação da Bl, correspondendo a
11 dominante. Também apresentam deficiência na ecapa
mais de 80% da BT. Elevação sérica da Bl ocorre tam-
de conjugação hepática, por redução ou ausência da en-
bém na hiperbilirrubinem ia primária, doença familiar
zima UDP-glicuronil uansferase. A bilirrubinemia geral -
rara, caracterizada por desuuição medular prematura
mente está bem elevada, com valores de BT entre 15
de precursores dos eritróciros - erirropoiese ineficaz -
40 m g/dl no ripo l,e entre 6
com quebra da molécula de hemoglobina
e 11 são doenças heresendo a ripo I recessiva e a ripo
e
e 20 mg/dl no tipo 11.
e produção
aumentada de bilirrubina. ICTERÍCIA COLESTÁTICA ICTERÍCIA H EPÁT ICA
Por definição, colescase é a obstrução do fluxo da bile aré a ampola de Varer e duodeno. Essa obstrução pode
Nesse grupo escão as hepacoparias que apresentam
ocorrer em qualquer ponto desse trajew, no fígado ou
d1srúrbio de conj ugação da bilirrubina pelo hepatócico,
na árvore biliar extra-hepática, dando origem à colesrase
com conseqüente aumento da Bl no sangue. Ocorre na
intra-hepática ou extra-hepácica, respectivamente. Nes-
iccerícia neonacal, em doenças congênitas (síndromes
se grupo predomina a elevação da BC ou BD.
de Gilbert e Crigler-Najjar). nas hepatites virats e medicamentosas. Devem ser diferenciadas da icterícia préhepática, pois ambas apresenram elevação da Bl.
Colestase intra-hepática
A icterícia neonatal. detect ada clinicamente quando o nível sérico de bilirrubina é igual ou maior que 5 mg/dl,
É secundária a d istúrbio do fluxo da bile sem obs-
pode ocorrer de forma fisiológica ou parológ1ca. Na ic-
trução mecânica demonstrável nos duetos biliares. A
terícia fis1ológica do recém-nascido a cermo, os níveis sé-
icterícia resultante apresenta predomínio da BD no
ncos de BT geralmente não ultrapassam 12 mg/dl, com
sangue e identifica a incapacidade de excreção pelas
predominância de Bl. Já na forma parológica os níveis
vias biliares e a preservação da conjugação hepática.
esrão acima de 12,0 mg/dl e. por ser lipossolúvel, grande
Ocorre em dist úrbi os familiares de excreção da bilir-
quantidade de Bl pode uluapassar a barreira hematoencefálica e desencadear o
Kernicterus.
A síndrome de Gilberr, doença hereditária aurossômtca dominante, é caracterizada pela deficiência de con-
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
ru bina, representados pelas síndromes de Dubin-Jo hn son e de Roror (hiperbilirrubinemia conjugada fami liar) ou em distúrbios adquiridos causados p or drogas ou infecções virais.
425
A síndrome de Dubin-johnson, doença benigna auwssômica recessiva, é cara([erizada por distúrbio de excreção das bilirrubinas por ausência de uma proteína canalicular. A elevação da BD é discreta. não ultrapassando 5 mg/dL e as demais fu nções hepáticas estão preservadas. Síndrome de Rotor é uma doença hereditária autossômica recessiva, decorrente de múltiplos defeitos na captação e excreção dos pigmentos de bili rrubina. A hiperbilirrubinemia também não ultrapassa 4 ou 5 mg/dl. Adicionalmente, grau acentuado de colestase pode ser observado em alguns pacientes com hepatites viróticas (hepatite colestática) e na hepatite alcoólica aguda. Várias drogas provocam colestase por lesão ao nível dos canalículos e ducros biliares intra-hepáticos. entre elas destacam-se: esteróides. clorpromazina, sulfonamidas, anovulatórios. hormônios sexuais (meriltestosrerona e noretandrolona), amoxicilina com ácido clavulônico. fluoxacilina e eritromicina. Colestase pode ainda ser encontrada em outras situações. como na doença de Hodgkin, na cirrose biliar primária. na colangite esclerosante primána e na arresia biliar intra-hepática.
Colestase extra-hepática
Ocasionada por obstrução física ao fluxo da bile no dueto biliar extra-hepático causada freqüentemente por cálculos biliares. Outras causas incluem compressão do duodeno por rumor da cabeça de pâncreas e tumor da papila de Vater impedindo o fluxo da bile. O nível sérico da BD dependerá do período de tempo da obstrução e se ela é parc1al ou coral. Uma taxa diária de aumento na bilirrubina de até 2 mg/dL é compatível com obstrução extra-hepática, mas taxa mais alta de aumento sugere hemólise. hepatite ou necrose hepática. Dosagem de BT acima de 30 mg/dL indica componente de dano hepatocelular e não apenas a obsuução biliar.
predomín io da fração conjugada (BD) ou da fração não conjugada (BI). Para que haja predomínio da BD. seus valores séricos devem ser superiores a 50% da BT. Por outro lado, considera-se predomínio da fração não conjugada quando esra é responsável por mais de 80% da BT (Quadros 33.9 e 33.10).
OUTROS EXAMES LABORATORIAIS ALFA-FETOPROTEÍNA (AFP) ta principal proteína sérica do feto, sintetizada pelo saco gesracional (vesícula virelínica), trato gastrintestinal e principalmente pelo fígado fetal. cuja determinação no líquido amniótico e no soro materno é útil para o d1agnost1co pré-natal de defeitos do cubo neural. Em indivíduos adultos com lesão hepática e regeneração celular, doença hepática alcoólica, hepatite crônica ou cirrose. a concentração sérica dessa proteína encontrase moderadamente elevada (100-200 ng/mL). A identificação de indivíduos com carcinoma hepático é a principal utilidade diagnóstica da dosagem de alfa-fetoproteína. uma vez que 95% desses pacientes apresentam níveis séricos superiores a 400 ng/mL. Além disso. níveis elevados são também observados em 50% dos pacientes com tumores de células germinativas e em praticamente todas as crranças com hepatoblastoma. Como a maioria dos marcadores tumorais, a dosagem de AFP apresenta valor mais alto no monitoramento e detecção de recorrência da doença em casos já diagnosticados de tumor. Aumento discreto da AFP no soro pode ser observado em casos de carcinoma do pâncreas, intestino e pulmão e em outras doenças, tais como tirosinemia e ataxia-telangiectasia. A dosagem de AFP pode ser realizada por restes imunomérricos (imunoensaio enzimático ou de polarização de fluorescênCia, p. ex.) e a concentração sérica em indivíduos adulcos sad1os é inferior a 15 ng/ml (15 j.Jg/L - unidade internacional).
CAUSAS DE ELEVAÇÃO DAS BILI RRUBINA$ Outra abordagem das causas dos distúrbios do merabolismo das bilirrubinas é a que focaliza o achado laboramrial da hiperbilirrubimemia e não a sua fisiopatologia, como descrim anteriormente. São classificadas pelo
426 [
Medicina laboratorial para o clínico
ALFA 1-ANTITRI PSINA (AAT) Trata-se de uma glicoproreína sintetizada pelo fígado. que é reagente de fase aguda e ini bidora de proreases
como a quimiotri psina e elastase. Por ser proteína rea-
ocorre a liberação de elasrase. Na ausência de AAT. a
geme de fase aguda, sua concemração sérica encomra-
elasrase não é inibida, atacando, assim, a elast ina da pa-
se elevada durante condições relacionadas a processo
rede alveolar, proteína crítica para o funcionamento dos
inflamatório agudo (infecção, cirurgia, infa rto agudo do
alvéolos durante o processo de respiração. A perda de
miocárdio, p. ex.). A AAT consti tui o principal compo-
elasticidade resu lta em enfisema pulmonar e susceptibi-
neme (90%) da faixa 2 (alfa l -globulina) observada na
lidade a infecções respirarórias. Indivíduos com fenóripo
eletroforese de prmeínas séncas (Quadro 33.4).
ZZ apresentam acúm ulo de AAT nos hepatócitos com
A deficiência de A AT está associada
à doença
hepá-
desenvolvimento de doença colestática e cirrose. Nas
tica e pulmonar tanto em crianças quanto em adultos.
primeiras semanas de vida, 10 a 20% dos neonatos com
Três principais alótipos (M, Z e S) da AAT foram defi-
fenótipo ZZ desenvolvem hepatite, que pode evoluir
nidos por meio de técnicas especiais de eletroforese. A
para cirrose juvenil.
maioria da população apresenta o fenótipo MM com
A dosagem de AAT pode ser reali zada por testes
100% de atividade da AAT. Indivíduos com fenótipos
imunomérricos (nefelometria e turbidimetria) e concen-
ZZ e SS apresentam AAT com atividades de aproxima-
tração sérica inferior a 50 mg/dl, na ausência de processo
damente 15 e 60%, respectivamente. Durante a fagoci-
inflamatório agudo é evidência de deficiência. Os valores
tose pelos leucócitos polimorfonucleares de partículas
de referência para AAT no soro, pelo método nefelomé-
e bacrérias inaladas presentes nos alvéolos pulmonares.
trico, encontram-se no Tabela 33.11.
Quadro 33.9 - Princ1pa1s cond ições clín1cas relacionadas com elevação da fração não conjugada ou bilirrLibina indireta (BI)
Co usas
Alteração do m e tabolismo d o s b ilirrubinos
lesões congêmlas Deficiência de G6PD 1 Esferocitose
Produção excessivo lhemólise)
Hemoglobi~opa'ra s
Síndrome de Gilbert Síndrome de Crigler N ajjor tipo I e 11
Diminuição do conjugação
Doença de Wilson Porfir1o Entropoiélico
Erilropoiese Ineficaz
I esões odquiriaos
Transfusão sanguíneo incompatível Produção excessivo ihemólise) Reabsorção de hematomas Anem1os IFerropriva e pern1ciosol Envenenamento por chumbo
Eritropoiese ineficaz
Contrastes com agentes iodados
Drogas Redução do coptoção hepático
Medicamentos Entorpecentes Hepatite crônrca persrstente
Diminuição do conjugação hepático
1 G6PD - glicose 6 fosfato desrdrogenose.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
427
Quadro 33.10 - Principais condições clínicas relacionadas com elevação da fração conjugada ou bilirrubina d1rera (BD) Alteração do metabolismo das bilirrubinos
Cousas Lesões congênrtos Síndrome de Dubin:)ohnson
Excreção biliar prejudicado
Síndrome de Rotor lesões intro·hepáticos Agressão/lesão hepo:ocelulor: hepatite viro!, heporte alcoólico, heoorite por drogas. ~eoot te auto·• munes. doenças me·abólicos. doenças gronu omotosas, omiloidose e oocleremias
Comprometrmento do etapa de excreção. Coso o lesão ~e per petue, os fases de conjugação e captação também poderão ser ore1udrcodos
lesões extro·hepálicos Coleslose obstrutivo intra ou extro·ductois: coledocolitíose, litíose biliar, mó-formação biliar, colangue esclerosonte primário. estenose pós·operotórro. doenças malignos infiltrotivos (hepotocorcinomo, tumor de cabeço de pâncreas, linfomos). quadros inflamatórios agudos e crónicos
Tabela 33.11 - Valores de referênCia de alfa 1-anmnps1na (AAT) pelo mérodo nefeloméuico, de acordo com a fa1xa erána
Redução do excreção de oilirrubino por obs•rução do lroto biliar
A pri ncipal aplicação clínica da dosagem de ceruloplasmina é no d iagnóstico da doença de W ilson, que é um raro defeiro aucossômico recessivo na regulação do
Unidade Con· vencional mg/ dL
Unidade lnter· nacional g/ L
concem ração sérica e aumemo da concemração uriná-
Neonolo
145. 270
1,45. 2.70
ria de ceruloplasmina e pelo acúmulo de cobre em vários
Adulto
78.200
078.200
> 60 anos
11 5 .200
1,15·2,00
Faixa etária
metabolismo do cobre. caracrerizado por decréscimo da
tecidos. como fígado, córnea, rins e cérebro. O acúmulo de cobre no parênquima hepático pode levar à cirrose. A concentração sérica de ceruloplasm1na varia com a idade. A Tabela 33.12 apresenta os valores de referência.
Conversão de unidade convencionol (mg/dl) poro unidade inter· nocional (g/l): mg/dl x O, 1 = g/l.
de acordo com a faixa etária, pelo mérodo nefelométrico. que é um dos mais utilizados nos laboratórios clínicos.
CERULOPLASM INA
É outra glicoproreína reageme de fase aguda, simetizada pelo fígado. A ceruloplasmina compreende apenas pequena porção da faixa 3 (alfa 2-globulina) observada na elerroforese de proteínas séricas (Quadro 33.4). Suas prrncipais funções parecem ser de enzima oxidase e arua r
Tabela 33.12 - Valores de referência de ceruloplasmina pelo mérodo imunomérrico. de acordo com a faixa etária
Faixa etário
Unidade Con· vencional mg/ dL
Unidade lnternacional !Jmoi/L
1 dia - 3 meses
5 - 18
50 · 180
como doador de cobre. Na superfície celular. a ceruloplasmina catalisa rapidameme a oxidação de Fe2+ a Fe3+ ames
6 meses - 1 ono
33 . 43
330. 430
que ele se ligue à transferrina. Apesar de comer seis a oiro
1 - 7 anos
24 - 56
240 -560
> 7 anos
18- 45
180. 450
ácomos de cobre em sua molécula. a ceruloplasmina não atua como transportadora desse íon; parece que sua ação mais importame é de am ioxidame no plasma e tecidos, o que explicaria seu papel nas reações de fase aguda.
428 [M"edicina laboratorial para o clínico
Conversão de unidade convencional (mg/dl) poro unidade n· ternociono (~moi /l) mg/dl x IO = f.lmol /L
CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS Carrazza FR. Andr1olo A DiagnóstiCO Laborawnal em Pediatria. 2a ed. São Pau lo: Sarvier; 2000. 2. Chirturi S. George ). Hepawwximy of commonly used drugs. Sem1n Liver Dis. 2002;22:169-84. 3. Corrêa CR. Burini RC. Prmeínas plasmáticas reat ivas posi1.
Nenhum teste de avaliação da função hepática é suficienre de modo isolado e, em geral, são indicadores pouco específicos de doença do fígado. Isto advém do faro de que muitas enzimas são também produzidas em ouuos órgãos, além do fígado. Para se imerpretar adequadamente um exame, são necessários história e exame físico minucioso.As dosagens das bilirrubinas, fosfatase alcalina, gamaglutamil transferase, aminotransferases, tempo de protrombina e proteínas, constituem a propedêutica laboratorial para esclarecer o processo fisiopatOlógico subjacente e a definição da etiologia e/ ou prognóstico. Vale ressaltar que. em muitos casos, exames laboracoriais como as dosagens de a -fetoproteina. a1 - amicripsina, ceruloplasmi na. exames de avaliação do metabolismo do ferro, pesquisa de auto-anticorpos ou marcadores soro lógicos para as hepatites virais, emre outros, podem ser necessários para atingir esses objetivos. Em oucras situações, o diagnóstico definitivo somente será realizado com o auxílio de exames por imagem ou o estudo histoparológico de biópsia hepática.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática
tivas à fase aguda. J Br Paml. 2000:36:26-34. 4. Franch1-Te1xeira AR. Antoniali F, Boin IFSF. Leonard! LS. lcrerícia obstrutiva. Med1c1na - R1be1rão Prew. 1997:30:159-63. S. Goldman L. Aus1ello D. Cecd Tratado de Med1ona Interna. 22• ed. R10 de janeiro: Elsev1er; 2005. 6. Henry )B. Cl mlcal diagnos1s and managemenr by laboratory merhods. 21th ed. Phdadelph1a: WB Saunders Company. 2007. 7. )acobs DS. DeMon WR. Oxley DK. Laborawry tese handbook. 5 th ed. Hudson Lexi-Comp: 2001. 8. Nanonal Academy of Clinical Biochem1stry. Standards of Laboratory Practice: Laboratory Guidelines for Screen1ng. D1agnosis and Monitoring of Heparic lnjury. 2000. 1 -58. Disponível em: http://www.aacc.org/NACB/members/nacb/Archive/LMPG/Hepaticlnjury/ 9. Rizzo CC Silva )r OC. Sankarankutty AK, Menegazzo LAG. Granato RG. Repercussões sistêmicas da icrerícia obstrutiva. Medicina - Ribeirão Preto. 1997;30:173-82. 10. Robbíns SL. Cotran RS. Patolog1a - Bases patológicas das doenças. 7a ed. R1o de Jane1ro: Elsev1er: 2005. 11. Sherlock S. Dooley ). Doenças do fígado e do sistema biliar. 11' ed. R1o de jane1ro: Guanabara Koogan; 2004. 12. Wu AHB. Tíetz. Clínícal gu1de w laboratory tests. 4th ed. St Lou1s: Saunders; 2006.
429
34
Raimundo Fontenelle Mascarenhas
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM PANCREATITE AGUDA
A pancreatite aguda (PA) é definida como "processo inAamatório agudo do pâncreas que pode envolver tecidos peripancreáticos e órgãos à distância (Aclanra,l992)" e cujas alterações emuturais e funcionais podem ser reversíveis.
O PÂNCREAS: ANATOMIA E FISIOLOGIA
O pâncreas é um órgão abdom~nal de localização recropericoneal. de tamanho e formara semelhantes aos da mão; sua cauda é voltada para o baço e sua cabeça é envolvida pelo arco duodenal. É macio ao roque e facilmeme trauma[fzável. Tem amplo supnmento sanguíneo diretamente de um tronco da aorta. A drenagem venosa de suas ilhotas dá-se pela veia porra hepática. Desempenha funções endócrinas e exócrinas. Aproximadamente 1% (1 a 1.5 g) do pâncreas consiste de aglomerados celulares isolados, as ilhotas de Langherans. Elas são responsáveis pelas secreções dos hormônios: glucagon pelas células alfa, insulina pelas células beta, somarosta[lna pelas células delta e o polipeptídeo pancreático pelas células-F. As funções exócrinas pancreáticas são desempenhadas pelas células acinares, centroacinares e ductais, que correspondem a mais de 98% dos 60 a 140 g de massa pancreática. Suas secreções são drenadas através dos dúcwlos pancreátrcos para o ducro pancreático e ampola de Vater formada de sua junção com o dueto biliar. O pâncreas exócrino produz pelo menos 22 enzimas di-
gestivas, 15 das quars são proteases. Sob a ação do suco pancreático. as proteínas são digeridas pelas enzimas tripsina, quimiotripsina e elastase. Os li pídeos são digerrdos pelas enzimas lipase, fosfoli pase A2 e carboxil esterase. Os carboidraros complexos são digendos pela alfa-amrlase. A amilase humana atua na quebra das ligações alfa-1.4glicolíticas do amido e outros polissacarídeos complexos. Entretanto. não é capaz de digerir a celulose, carboidraco complexo que requer beta-amilase para ser hrdrolisado. No pâncreas exócrino, os aglomerados de ácinos armazenam enzimas digestivas na forma de grân ulos zimogênios inativos ou em forma de pró-enzimas. Os grânulos são liberados das células acr nares por exocicose dentro dos ducros colecores. Outras enzimas. como a amilase. lipase e co-lipase, além da ribonuclease, desoxiribonuclease e carboxilescerase. são armazenadas sob a forma ativa. Enzimas proteolíticas, como a tripsina, quimiotripsina, carboxipeptidase A e B e elasrase constituem mars de 75% da massa das enzimas digestivas secretadas pelo pâncreas. Suas pró-enzimas contêm uma pequena cadeia de aminoácidos que bloqueia seu sítio proteolítico, prevenindo a ativação inrrapancreática. lnr bidores de proteases também são secretados para neutraliza r qualquer ativação enzimática prematura intrapancreática . No duodeno, a enteroquinase (enteropeptidase) quebra as pequenas cadeias de aminoácidos inibidoras das pró-enzimas, que liberam as proteases ativas e convertem pró-tripsina em tripsina ativa. Esta, a partir de mecanismo em cascata, promove a ativação de outras pró-enzrmas.
Adultos normais secretam cerca de dois a três litros por dia de suco pancreático. incolor e transparente. rico em enzimas e comendo de 120 a 300 mmol de bicarbonato. Amilase e lipase estão presentes em concentrações extraordinárias de cerca de 500.000 a 1 milhão de U/ L As células ductais e cemroacinares secretam água e eletrólitos no suco pancreático. O bicarbonato secretado neutraliza o ácido clorídrico vindo do estômago. Vários hormônios controlam a secreção do suco pancreático: a colecisroquinina ou CCK. a secretina e a gastrina. A distensão do duodeno por al1mento ou por álcool leva à liberação de todos os três hormônios. Gorduras e álcool são particularmente ativos estimulantes da secreção de secretina . Existe também um mecanismo de retroalimentação negativa na alça duodenal; a cripsina liberada como conseqüência da liberação de CCK tem. posteriormente. uma ação inibitória na secreção de CCK. O pepcídeo vaso-ativo intestinal. em inglês VasoactiVe lntestmal Peptide (VIP). é estruturalmente semelhante à secretina e glucagon. o que provavelmente explica a sua ação sobre o pâncreas. A somaroscat1na cem efeito inibitório sobre todas as secreções pancreáticas exócrinas e oucras fu nções gastrinrestinais.
FISIOPATOLOGIA DA PANCREATITE AGUDA
Na pancreatice aguda, ocorre a ativação das enzimas pancreáticas que levam à autodigestão tissular e inflamação local. Esses mecanismos podem 1ndum a síndrome da resposta inflamatóna sistêmica (SIRS). O processo inicia-se pela acivação de enzimas proteolítlcas (hidrolases lisossomais) no interior das células pancreáticas levando à degradação de zimogênios com quebra de tripsinogênio em tripsina. A tripsina tem a capacidade de ativar outras enzimas. como a pré-calicreína, a pró-fosfolipase A2 e a pró-elastase. O sistema das cin1nas. as cascatas do complemento e da coagulação são acivados pela calicreína, conduzmdo à resposta inflamatória celular local e efeitos sistêmicos. como vasodilatação. aumento da permeabilidade capilar e coagulação intravascular d1sseminada. A fosfolipase A2 promove desintegração das células adiposas e a elascase danifica as fibras elásticas dos vasos sanguíneos. Esse mecanismo pode ser desencadeado por diversos facores. como a obstrução aguda do ducro pancreático. dano primário à célula acinar. exposição a toxinas
432 [ Medicina laboratorial para o clínico
ou venenos. isquemia ou transporte intracelular defeituoso de pró-enzimas no interior da célula acinar. O álcool interfere na secreção pancreática. pois induz a obstrução duccal por deposição excessiva da proteína GP-2.
ETIOLOGIA E ETIOPATOGENIA
A PA é classificada em forma leve. a intersticial; ou grave, a necrosante. As formas leves correspondem a 85-90% dos casos e têm mortalidade aproximada de 2%. Em 10% dos casos ocorrem necrose e evolução grave. com mortalidade alta de 20 até 70%. A forma grave é complicada com necrose. coleção líquida. pseudocisro, abscesso ou fístula envolvendo os tecidos peripancreáticos. As repercussões siscêmicas desse quadro são: insuficiência respiratória. insuficiência renal ou choque. As causas mais freqüentes de PA estão relacionadas com litíase biliar até 45% e uso de álcool em corno de 35%. A microlitíase biliar diagnosticada por tomografias ou ulcra-sons abdominais correspondem. hoje. à grande parte das que eram diagnosticadas como id1opát1ca. Apesar disso. somente 1 a 8% dos pacientes com litíase biliar desenvolvem PA. As causas iatrogênicas por procedimenros cirúrgicos ou diagnósticos como colangiopancrearografia-retrógada (CPR) podem constituir até 3-5% das PAs. Nos demais casos devem-se descartar as possibilidades de causas medicamentosas com uso de azatioprina. didanosina, penramidina; traumas d1retos e em transplantes de órgãos e cirurgias abdominais; doenças metabólicas como hipercalcemia e hlperuigliceridemia. infecções virais como cicomegalovíirus (CMV) e caxumba; ascaridíase e alterações anacômicas como pâncreas div1sum e coledococele.
FATORES DE RISCO
São fatores de risco: a ingestão de álcool. a má-nutrição e a obesidade. Quanto a idade e sexo. a idade média de ocorrência varia de 30 a 70 anos, sendo de 30 a 40 anos na etiologia alcoólica e de 40 a 60 anos nas de etiologia por lidase. A origem biliar predomina em mulheres. enquanto a etiologia alcoólica é mais freqüenre no sexo masculino. A incidência é maior entre afro-americanos. sendo até três vezes mais comum do que na população branca.
A história de etilismo em homens com ingestão de mais de 150 g por dia por mais de três anos sugere a hipótese de PA alcoólica. A associação com litíase biliar deve ser suspeitada em mulheres com idade superior a 50 anos, não etilistas e com queixa de dor abdominal após refeições copiosas.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Geralmente, os pacientes apresentam dor abdominal súbita, imensa. localizada no andar superior e méd1o, podendo ser estritamente epigástrica, mal definida. contínua, com piora na posição supina e com irradiação para o dorso em cerca 50% dos casos. A associação com náuseas e vômitos é freqüence. Pode haver, mais raramente. a típica dor em faixa no abdome. Os achados ao exame clínico que favorecem o diagnóstico são: distensão abdominal com ou sem massa epigástrica palpável. febre. taquicardia, sinais evidentes de desidratação, equimose periumbilical ou sinal de Cullen e /ou equimose nos flancos ou sinal de Grey-Turner. ambos relacionados à doença grave. A presença de ascite sugere fístula pancreática.
ABORDAGEM LABORATORIAL DA PANCREATITE AGUDA
A avaliação laboratorial da PA utiliza como marcador a dosagem das enzimas pancreáticas que extravasam para o sangue em conseqüência do processo de autodigestão e tnflamação do pâncreas.A entrada de pequena quantidade de suco pancreático na corrente sanguínea, ocasiona considerável aumento das enzimas pancreáticas no sangue, devido ao gradiente de 10.000:1 entre suco pancreático normal e o sangue normal As que são dosadas na prár1ca clínica. por sua praticidade. são a amilase e lipase.
AMI LASE A atividade total da amilase sérica é resultante de duas isoenzimas denominadas P e S. de origem pancreática e salivar, respectivamente. A hiperamilasemia resulta do extravasamento excessivo da enzima para a circulação sanguínea e da redução no seu clareamemo renal.
Investigação la bo ratorial do paciente co m pancreatite aguda
Amostra
Soro ou plasma heparinizado são preferíveis. apesar dos relatos de valores significativamente mais elevados de amilase em amosuas heparinizadas submetidas aos métodos de dosagem por química seca. Alfa-amilases são metaloenzimas que necessitam de íons cálcio e cloretos como co-farores; por causa disso. anticoagulantes que quelam o cálCIO, como citrato, oxalato e EDTA. não devem ser empregados. Quando a dosagem da amilase é realizada em amostras de urina, deve-se também determinar a creatinina na mesma amostra. O resultado será reportado como relação amilase/creatinina (U/g), com o objetivo de compensar as variações de atividade enzimática encontradas em amostras de diferentes micções. Outro reste utilizado é a relação entre a depuração renal da amilase e a depuração de creatinina calculada pela seguinte fórmu la: Reloçõo % • omilose no urino (U/ l) x creolinino soro (mg/ dl)x 100 omilose soro (U/ll x creolinino no urino (mg/ dl)
Essa relação é mais sensível e específica que a dosagem isolada dos níveis de enzima e pode ser utilizada no diagnóstiCO diferencial das hiperamilasemias. As amostras de urina devem ser armazenadas entre 2 e 8°( e colhidas sem preservativos, assim como os outros líqUidos corporais destinados à análise. Em amostras séricas livres de contaminação bacceriana, a amilase é estável por uma semana quando conservada à temperatura ambiente e por até dois meses se refrigerada entre 2 e 8° C. A estabilidade em amostras urinárias refrigeradas é semelhante
Metodolog ia
Existem relatos de mais de 200 técnicas diferentes empregadas na determinação da atividade da alfa-amilase e, independentemente dos substratos utilizados, devem fornecer pH ótimo entre 6,9 e 7,0, além de íons cálcio e cloretos. Os mérodos sacarogênicos e cromolíticos são mais comumente utilizados devido à sua facilidade de automação, mas as técnicas rurbidiméuicas e nefelométricas. de importância histórica, e os que utilizam fluorescência polarizada, por exigirem Instrumentação especializada, são raramente utilizadas.
433
Nos mérodos sacarogênicos utilizam-se substratos polissacarídeos que. sob a ação da alfa-amilase. liberam glicose em quantidade dtretamente proporcional à sua atividade sérica. Nos cromolíticos. um corante ligado ao subsuaro é liberado sob a ação da enzima. No Brasil, a técnica mais utilizada é a iodométrica, que monitora o desaparecimento do amido a partir da sua reação com o iodo após certo tempo de hidrólise. A absorbância medida após o período de reação é inversamente proporcional à atividade da ami lase na amostra utilizando comprimento de onda de 660 nm. As principais vantagens desse mérodo são o baixo cusro, a facilidade de obtenção de substraros, a simplicidade e rapidez da técntca, além da sua boa sensibilidade. A dificuldade de estabilização do reagente de amido é a principal desvantagem. Nos laboratórios que utilizam automações de médio e grande porre. há preferência pelos métodos cromolíticos, como o nirrofenol (CNPG). Nesta metodologia, a amilase da amostra hidrolisa o substrato a.-(2-cloro-4-nitrofenil)- 131.4-galactoptranosilmalroside (Gai-G2-a.-CNP), liberando 2-cloro-4-nttrofenol (CNP) e 1.4-galaccopiranosilmaltostde (Gai-G2). A veloctdade de formação de 2-cloro-4-nitrofenol pode ser medida forometricamente e proporciona a medida tndireta da arividade de a -amilase na amosua.
Gal - G2 -a- CNP +
Hp
Quadro 34.1 -Valores de referência para amilase sérica segundo o méwdo utilizado Método (substrato), 37° C
Intervalo de referência
IFCC lmoltoheptose, PNP)
24 · 65 U/L
Bedmon omylose DS
2 · 131U/L
Phodebos lpolimeroomido azul insolúvel)
70 · 300 U/l
Abbott TDX (omilopectino· fluoresceíno)
33 · 122 U/L
Vitros Ektocrem lomilopectino)
30 110 U/L
BMD· olfo·omiloseEPS, Sigma l4·nilrofentlmoltoheplose)
< =220 U/L
MercK olfo-amilose 12-do· ro4NPMHOS·2·doro·PNP)
< =225 U/L
Du Ponl oco imoilopenlose) Dode·Behring (PNP·molopenlose e mailohexose) Beckmon·Coulter 15ET·G7-PNP)
23 · 85 U/L Adulto:20 · 104 U/ L > 90 anos 25 · 147 U/L
O 46 U/L
CIBA Corning IG7-PNP)
16 · 108 U/L
Bayer ADVIA IG7·PNP elllideno)
20 · 104 U/L
Cinélico Infinito 15 E·G7·PNP). Hilochi
3r C 35 · 140 U/L 30° C : 27 · 108 U/ l
Corowoy liodomélrico, cinélico colorimétrico)
3r c. 60. 160 U/dL
Cinético Infinito 15 E·G7-PN P): Olympus
3r c : 25 - 114 U/L
o.Amilase .!=:==::::;
Gai-G2 + CNP
Intervalos de referência
Os tntervalos de referência variam de acordo com dtferentes substratos e metodologias empregadas. Nas técnicas sacarogênicas e iodomérricas. os valores normais são inferiores a 160 U/L para indivíduos adultos, sem diferenças significativas entre os sexos. Nos métodos cinéticas, aucomatizados ou de química seca, os níveis são inferiores a 220 U/L. Em recém-nascidos, a atividade sérica normal da amilase é aprox imadamenre 18% da observada em adultos, já que pouca ou nenhuma am ilase de origem pancreática na circulação é detectada. Após essa idade e progressivamente até os quatro anos, os níveis encontrados nos adultos são atingidos (Quadros 34.1 e 34.2).
434 [ Medicina laboratorial para o clínico
LI PASE Lipases são definidas como enzimas que hidrolisam ésreres de glicerol e ácidos graxas de cadeia longa. A hidrólise completa de triglicérides gera uma molécula de glicerol e crês de ácidos graxas. Somente os ésteres ligados aos carbonos 1 e 3 (posições a.- e a.1 -) são hidrolisados e os produros da reação são dois moles de ácidos graxas e um moi de 2-acilglicerol (13-monoglicerídeo) por moi de substraro. O 13-monoglicerídeo é resistente à hidrólise devido à sua configuração espacial, mas sua isomerização esponcânea para a a -forma (3-aetlglicerol) permite a liberação do terceiro ácido graxa numa taxa mais lenta. Os sais biliares e a co-li pase pancreática são fundamentais para a formação dos micélios, que apresentam o substraro para ação da lipase com alta afinidade. Apesar de grande parte da lipase sérica ser de origem pancreática, alguma porcentagem provém das secreções das mucosas lingual. gástrica, intesti nal e pulmonar.
Quadro 34.2- Valores de referência para a amilase unnána segundo método laboracorial milizado Beckman DS· BMD Phadebos (polimeroamido azul insolúvel)
1-17 U/ h 170-2000 U/L
5-27 U/ h
Abboll TDX [amilopectina·fluoresceína) Vitros Ektocrem (Drmorene vermelho Z2B, omilopeclinol
32-641 U/L
BMD· alfo·omilosecPS Sigma (4-nitrofenilmo toheptoosel
Avulso 0· 1000 U/L. 24h=0·900 U/dro
MercK olfo-amilase (2-cloro4NPMHOS·2·cloro·PNPI
s:l 200 U/L
Du Pont oco (mo topentosel
4-37 U/ 2h
Beckmon·Coulter (5EFG7·PNPI
s:320 U/L
CIBA Corning (G7-PNP)
0 -14 U/ h
Boyer ADVIA (G7-PNP etilidenol
s:650 U/L
Cinético Infinito 15 E-G7-PNPI· Hitochi Cinético Infinito (5 E-G7·PNP): Olympus Re oção omilo~e urinóllo/creotrmno urrnório Relação depuração do omrlose/ depu· ração do creotrnrno
dos subsrratos, uso de co-enzimas, sais biliares. tampões e métodos de monitoração contínua de pH e temperatura. Ainda hoje são os méwdos de referência para calibração desses ensaios. Ouuos restes utilizando equipamentos mais simples e baratos empregam diversas
mecodologias, como curbidimecria, colorimecria. especcroforometria, fluorimetria e imunoensaios.
Intervalos de referência
O intervalo de referência varia dependendo do método utilizado (Quadro 34.3). Quadro 34.3 - Valores de referência para ilpase sérica segundo o mérodo utilizado
1 -17 U/ 2h JrC : 4 ·50 U/ h até 400 U/g 1,0 · 4,0 %
Ajustar a amostra para pH alcalino ames de rerrrgerar Fonte: Adaptado de Wu AHB. T1et1 Ciln1cal Cu1de to laboratory le
Amostra
Podem ser utilizadas amostras de soro ou plasma colhido em hepan na líttca ou sódica e líqutdos btológtcas. Anticoagulantes como EDTA, oxalato e citrato devem ser evitados por redumem a attvidade da lipase. Hemólise e icterícia intensa podem interferir na reação. A lipase no soro é estável por uma semana se conservada à temperatura ambiente; por até Lrês meses sob refrigeração; e por vários meses se congelada a -20° C. A contaminação bacteriana pode resultar em aumento na ativtdade de lipase. Líquidos de derrames cavitários. pleural ou peritoneal podem também ser utilizados.Na urina não é indicada pois, a atividade da ltpase não é detectada devido à sua provável inativação. embora sua excreção seja renal. Metodologia
Técnicas tituloméuicas. como a pioneira de Cherryl e Crandall (1932). foram aperfetçoadas com a ottmização
Investigação laboratorial do paciente com pancreatite aguda
Método (substrato),
Jr
C
Intervalo de referência
Cherryüondoll lluloção 37-' C. pH slot
0·1,5 U/ml 14·280 mUI/ml < 200 I com triole:nal < 160 I com oze1te oe ol vai
Fluorimétrico Progen Conflu· lip (glicerídeo fluorescente)
O· 120 mU/ L
BMD (1-oleorl·2.3·d ocetilglicerol)
23 · 300 U/ l
Colorimétrico (1, 2·o-diolurilroc-glicero·3·glutoroto · 6-metil-resorfurinal
13- 60 U/ L
Turbiormétrico (Tr1o1eho· co· lipose optmizodo)
< 190 U/L
Vitros Ektochem 11-oleoil-2,3 diocetilglicerol)
40-375 U/ L
Point Screntrfic (1.2-dioceroll
< 60 U/L
Alpho Diognostic lnternotio· nol (ELISA: lipose ABI
26 - 150 U/L
rome Adaptado de Wu AHB. T e:1 Chn cal Cu1de ro labomor~ l c<.:s (2006)
INTERPRETAÇÃO DOS ACHADOS LABORATORIAIS
O moniroramenro da pancreacice aguda é realizado não apenas com a dosagem das enzimas pancreáticas mas, rambém, oucros tesces laboratoriais para a valiar a repercusão sistémica do processo inflamatóno agudo, a gravidade, a evolução e o prognóstico.
435
ENZIMAS PANCREÁTICAS
Elevações séricas das enzimas pancreáticas, amilase e lipase três vezes acima do maior valor de referência (MVR) sugerem PA. A lipase é mais específica e permanece elevada por períodos mais prolongados em oposição à amilase, que pode ter seus níveis reduzidos ou normalizados após 24-48 horas. A determinação simultânea dos valores séricos de amilase e lipase oferece boa precisão diagnóstica para PA. com sensibilidade e especificidade de 90-95%. Em geral, grandes elevações nos níveis de enzimas não se correlacionam com a gravidade da doença. No início do processo inflamatório, já nas primeiras horas, a amilase e a lipase séricas elevam-se e os níveis de amilase no soro atingem o pico em no máximo 48 horas após a constatação do quadro clínico. Após a fase aguda, a amilase sérica reduz-se mais rapidamente que a lipase. Elevações dos níveis de amilase que persistem por mais de sete dias constituem indício de complicação e evolução para abscesso ou pseudocisto (Figura 34.1). Aproximadamente 20% dos pacientes com PA podem apresentar níveis normais ou pouco elevados de amilasf> sérica. principalmente os portadores de hiperlipidemia ou aqueles em que a pancreatite é letal, com grande destruição glandular. Como a excreção urinária da enzima permanece elevada por vários dias após a rem issão do quadro clínico, a determinação da amilasúria possibilita identificar um episódio de PA amerior. O melhor teste a ser utilizado é a relação da depuração da am ilase urinária/ depuração da creatinina urinária e valores superiores a 10% sugerem fortemente pancreatite aguda. A lipase, porém, é o melhor indicador de pancreatite nos pacientes examinados dias após o início da crise. A amilase pode ser dosada paralelameme nos líquidos ascítico e pleural, com a finalidade de idemificar perfurações intestinais ou esofágicas. Nessas situações, os níveis da enzima são crês a lO vezes mais altos nos derrames quando comparadas com o soro. A lipase também pode ser determinada em líquidos de derrames cavitários, mas tem valor diagnóstico apenas quando seus níveis são crês vezes superiores aos séricos. A relação lipase/amilase pode ser útil em diferenciar as pancreatites de etiologia alcoólica ou biliar. Essa razão deve ser calculada transformando-se as atividades
enzimáticas em múkiplos dos valores superiores de referência para cada uma das enzimas. Assim, por exemplo, valores de relação lipase/am ilase superiores a duas vezes sugerem causa alcoólica. Já a origem biliar é suspeitada quando se observam grandes elevações dos níveis da amilase associados a elevações de ALT, superiores a três vezes seu lim ite superior de referência. Nessa situação, os testes bioquímicos podem refletir o caráter inrermiteme ou persistente da obstrução biliar e orientar a terapêutica. A presença de cálculo na via biliar comum é acompanhada de elevação nas dosagens de bilirrubina, fosfatase alcalina e dos marcadores de lesão hepacocítica (AST e ALT), além dos níveis de amilase que atingem de 2.000 a 4.000 UI/L. Concentrações persistentemente altas de enzimas canaliculares e hepatocelulares indicam a permanência do cálculo na via biliar, enquanto a flutuação desses valores sugere obstrução intermitente. Na avaliação da amilasemia, devem ser consideradas outras condições clínicas nas quais se observa elevação dessa enzima, como: ruptura de vísceras ocas, insuficiência renal e inflamação das glândulas salivares, macroamilasemia, obstrução intestinal, colecistite aguda, neoplasia ou infarw pancreático, drogas como a morfina, entre outras. Porém, nessas condições. a amilasemia raramente estará elevada além de três vezes o maior valor de referência (MVR) e a lipasemia estará dentro da normalidade. A macroamilasemia é uma condição benigna e sem expressão clín1ca que acomete l a 2% da população e é decorrente da formação de complexos entre a amilase e as imunoglobulinas das classes lgG e lgA. Devido ao grande tamanho. esses imunocomplexos não são fi ltrados pelos glomérulos renais e as enzimas permanecem em circulação por um tempo acima do habitual, resultando em hiperamilasemia.
PROTEÍNA C REATIVA (PCR) A proteína C reativa é um indicador laboracorial de gravidade nas PA, tendo valor prognóstico independente. Valores superiores a 210 mg/L nos primei ros quatro dias do quadro ou superiores a 120 mg/L no final da primeira semana são valores preditivos positivos. equivalemes aos dos escores prognósticos mais utilizados, com precisão em torno de 80%. O valor preditivo negativo é de até 94%. se os níveis de PCR forem inferiores a 150 mg/dl nas primeiras 48 horas do processo agudo.
436 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1-- - - -- -- -- - - - - - -- - -- - - - - - - - -- - -
6
AMILAS E
o ·;:;
5
LIPASE
c
'!!!
.J1
!!!
4
"'~
\
o
o>
~
\ \
3
\
ô
\
E
";::j
c
Q) Q)
\ \
2
'
"U
o
"U
:~ ~
___,__~
0 +---;---;---;---;---~--~--~--~---r---+---+---+---+--_,
o
4h
Sh
12h
lóh
20h
24h
36h
48h
72h
7 dias
14 dias
Tempo
Figura 34.1 - Modelo gráfico da anvidade enzimátiCa da amilase e lipase na pancrearite aguda de evolução ben1gna.
Exisrem relaros do emprego de ourros marcadores
ções de glucagon, carecolam inas e glicocorricóides são
mflamarórios para avaliação da gravidade e prognós-
maiores. Enrreranro. a hiperglicemia de jejum persisreme.
rico das PA. mas nenhum referendado pela prárica.
superior a 200 mg/dl. pode refiem a insralação de um
Um resre urinário rápido para pesquisa do peprídeo
processo necrosante.
arivado pelo rripsmogênio pode ser uma alrernariva viável no fururo. CÁLCIO SÉRICO H EMOGRAMA
A hipocalcemia pode ser norada por volra do segundo ou rerceiro dia de insralação da doença e raramente
Comumenre. com o seqüesrro de líquidos do comparrimemo imravascular. observa-se elevação do
é grave. Níveis de cálcio inferiores a 7.0 mg/dl indicam pior prognósrico.
hemarócriro na admissão, que rende à normalização com a correra reposição hídrica. A queda persisreme do hemarócriro implica a busca por focos hemorrági-
GASOMETRIA
cos. A leucocirose é freqüeme nas pancrearires graves e pode ocorrer reação leucemóide. mesmo na ausência de infecção.
Uma queda progressiva na p02 arrerial. que ocorre durante vários dias após o iníoo dos sintomas. sugere complicação sisrêmica e evolução para edema pulmonar e síndrome da angúsria respirarória do adulro. Ourro
GLICEMIA
achado é o déficir de base. A presença de azoremia pré-renal e hipóxia e a persis-
A hiperglicemia leve e rransirória pode ser aparente, sobrerudo durante o 1nício do araque. em que as libera-
Investigação laboratorial do paciente co m pancreatite aguda
rência de hipocalcemia e hiperglicem1a acentuadas esrão relacionadas a quadros mais graves da doença.
437
5.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diener JRC. Rosa CM, LlnS S. Ava nços no manuseio da
Pancreatite Aguda. RBTI. 2004;16:261-S. 6.
Na investigação laboracorial dos quadros clínicos de dor abdominal com diagnóstico provável de pancreatite aguda. são indispensáveis as determinações dos níveis séricos de amilase e lipase. A monicoração desses dados complementada pelas avaliações hemodi nâmicas, gasométricas, do equilíbrio hidroelecrolítico. distúrbios metabólicos. do minucioso exame clínico e do emprego criterioso do diagnóstico por imagem são responsáveis pelos recentes avanços e progressivos sucessos da abordagem do paciente com pancreatite aguda.
7.
8. 9.
10.
REFERÊNCIAS 1.
A ndriolo A, Borges DR. Enzimolog1a. ln: Medicina Laborawrial - Gu1as de Med1c1na Ambulawnal e Hospitalar UNIFESP I Escola Paulista de Med1c1na. São Paulo: M anole; 2005. p. 23-31. 2. Berk JE. Fndhandler L. Hyperam ilasem1a: interpretation and newer approaches w elevat1on. Ann lntern Med. 1980;26:235-64. 3. Borges DR. Silva MRL. Enz1mas. ln: Carraza FR. Andnolo A, ediwres. Diagnóstico Laboratonal em Pediauia . São Paulo: Sarv1er; 2000. p. 109-12. 4. Chelb1 JM F. Ferrari AP, Silva MRR. Borges DR. Microcristais bd1ares na Pancreatite Aguda Idiopática: indício para et1olog1a biliar subJaCente. Arq Gastroenrerol. 2000;37(2):93-101
438 [ Medicina laboratorial para o clínico
11.
12.
13. 14.
Freitas GAP. Pancreame Aguda. ln: Gastroenterologia. Doenças do Pâncreas e das V1as Bdmes. Soares H. ed. Rio de janeiro: UFRJ; 2006. Série Rotinas do Serviço de Gasuoenrerolog1a do Hospital Universitário Clemenrino Fraga Filho.
Lott J A.The pancreas: funwon and chemical pathology. ln: Kaplan LA. Pesce AJ. ed1tors. Cil n1cal Chem1stry. Theory, Analys1s, Correlation. Sr. Louis: Mosby; 1996. p. 555-70. M eneghelli UG. Pancreat ite Aguda elementos para o diagnóstico. Medicina (Ribe1râo Preto). 2003;36:266-82. Moss DW. Henderson AR. Cl inical Enzimology. ln: Buns CA, Ashwood ER. Tietz textbook of clinical chem1suy. 3'd ed. Phdadelphia W B. Saunders; 1999. p. 617-721. Pincus MR. Zirn merman H). Henry JB. Clínica\ enzu11ology. ln: Henry JB, ediwr. Cl inical Diagnosis and Management by Laborawry Met hods. 19Lh ed. Philadelph1a: W B Saunders; 1996. p. 268-95. Rosa I, Pa1s MJ. Fánma C. Que1roz A Pancreame Aguda: ac tualização e proposta de prowcolos de abordagem. Acta Med Por. 2004;17:317-24. Santos JS. Elias )r J. Sacarpehni S, Sankarankretty AK. Pancreame Aguda: atualização de Conceiws e Condutas. Med1c1na (R1beirão Prew). 2003;36:266-82. Scelza A Pancreanns Aguda. D1sponível em: http://www. rnednet.org.uy/cq3/emc/monografias/pa-062003.pdf York JL. Enzymes: Class1 flcano1, K1netics, and Contrai. ln: Devlin TM. ediwr. Textbook of biochemistry w1th clin ica l correlations. New York: Wlley-Liss; 1997. p. 127-78.
]1-- - - -- - - -- - -- - - - - - -- - - - - - -- - - -- -
Pedro Guatimosim Vidigal
35
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DISFUNÇÃO RENAL
Os rins, órgãos pares localizados no espaço recro-
FORM AÇÃO DA UR INA
peritoneal enue a 12• vértebra rorácica até a terceira vértebra lombar, apresentam intrincada estrutura que
O sangue entra nos rins pela artéria renal. seguindo
reflete a com plexidade de suas propriedades funcio-
por diversas ramificações desta até as arteríolas efe-
nais. Cada rim contém cerca de 8 a 12 x 105 nefrons,
rentes, onde alcança os glomérulos. Nestes, inicia-se a
a unidade funcional do rim. O nefron é constituído
formação da urina com a filtração do plasma sangu í-
de um glomérulo, o u corpúsculo renal, que inclui um
neo acravés da cápsula de Bowman. O filtrado, deno-
enovelado de alças capilares envolvidos pela cápsula
minado ulcrafiltrado ou filtrado glomerular, apresenta
de Bowman e um sistema tubular, composco pelos tú-
a mesma composição do plasma, exceco pela ausência
bulos contorcidos proximais, alça de Henle e túbulos
de moléculas de peso molecular superior a cerca de
contorcidos distais, que leva aos tubos colerores na
70.000 dalcons. Como contém a maioria dos solutos
pelve renal.
presentes no plasma, o ultrafiltrado apresenta a mesma osmolaridade do plasma (gravidade específica ""' 1,010). Diariamente, são produzidos cerca de 200 L de
A FUNÇÃO RENAL
uluafiltrado, porém apenas 1 a 2 L de urina são elimi-
Os rins desempenham crês funções fundamentais: excrecora e reguladora - relacionadas à formação da
do filtrado glomerular é reabsorvida durante sua passagem pelo sistema tubular renal, fazendo com que a
urina - e a endócrina. Na urina são eliminados os ca-
urina apresente uma composição bastante diferente
tabóliros, como: creatinina, uréia, ácido úrico e outros
daquela do filtrado in icial (Tabela 35.1).
nados por um indivíduo sadio. Portanto, a maior parte
ácidos inorgânicos, drogas e coxinas exógenas. A fun-
No túbulo contorcido proximal ocorre reabsorção
e eletrólitos do fi ltrado glo-
ção reguladora desempenha importante papel na homeosrase, controlando a absorção e excreção de água,
de 60 a 80% de líquido
sódio, potássio, clorero, cálcio, magnésio, hidrogênio,
vamente, junto com o sódio que é reabsorvido por mecanismo ativo. O clorero, bicarbonaro, potássio
bicarbonaco, fosfacos, sulfacos, uratos. O rim pode ser
merular. A maior pa rte da água é reabsorvida passi-
considerado um órgão endócrina tanto primário, pois
e 40 a 50% da uréia são reabsorvidos passivamente
produz a ericropoetina, renina e prosraglandina, quanto secundário, pois é alvo da ação de hormônios como
JUnto com a água. Outros analitos são reabsorvidos arivamente nessa região, incluindo: glicose, proteínas,
paratormônio, aldosrerona e hormônio anridiurético.
aminoácidos, ácido úrico, cálcio, potássio, magnésio
Tabela 35.1 - Compostção da urina de indivíduos sadios Constituinte
Quantidade
Ácido úrico
300 - 800 mg/24 h
Albumtno
<15- 30 mg/L
Bilirrubina
Não detectável
CálCIO
100 - 240 mg/24 h
Cetonas
<50 mg/L
Creotmino
1,2- 1,8 g/24 h
Glicose
<30 mg/dl
Dens'dode
1005- 1030
Fósforo
0.9 - 1,3g/ 24 h
Os maioridade
>600 mOsm/L
pH
4,7-7.8
Potássio
30 - 100 mEq/24 r
Proteína total
30-150 mg/24 h
Sódto
85 - 250 ,Eq/ L
Uréio
7- 16g/24 h
Urobilinogênio
<1mg/L
A reabsorção de sódio é comrolada pelo hormônio aldosterona. A aldosterona estimula a reabsorção ativa de íons sódio em uoca de potássio, que é excretado pela bomba de sódio/potássio presente nas células tubulares. Na presença de fatores, tais como, hipOtensão, concentração plasmática baixa de sódio ou elevada de potássio, as células do aparelho JUStaglomerular, localizado na parede da arteríola aferente do glomérulo, secretam o hormônio renina na circulação. A renina leva à formação de angiotensina 11 a pa rtir do angiotensinogênio produzido pelo fígado e encontrado habitualmente na circulação. A angiorensina 11 é um potente vasoconstritor e, também, o principal estimulador da produção de aldosterona pelas glândulas adrenais. As células do túbulo contoretdo distal partietpam da manutenção do equilíbrio áetdo-básico a partir da secreção de amônta para o lúmen tubular, seguida da troca de íons sódio por íons amônio. A amónia, formada da deaminação da glutamina nas células tubulares, difunde para o lúmen e combtna com íons htdrogênto secretados pelas células tubulares, formando íons amónio. Estes combtnam com íons cloreto e sulfato para formar sais neutros. Esse mecantsmo permite a excreção de grande quantidade de íons hidrogênto e amónio em troca de íons sódio influenciando significativamente o pH da urina (ver capitulo 42). O túbulo coleror corresponde ao local final de con-
e fosfaro. O túbulo proximal apresenta capacidade de reabsorção limitada, denominada limiar de reabsorção renal, que varia para cada analim. Quando a concentração de um dado analiro é maior que seu limiar de reabsorção, este permanecerá no lúmen cubular e será eliminado na urina. Outros produros são excretados no túbulo contorcido proximal. incluindo íons hidrogênio, fosfaros, ácidos orgânicos e algumas substâncias exógenas (pen icilina, salicilato, man irol e contraste radiográfico). A alça de Henle promove a reabsorção de água por meio do mecantsmo de contracorrente, que cria um gradiente de hiperrontcidade no interstícto da medula renal, influenciando a concentração da unna. O túbu lo contorcido distal está relaetonado a duas importantes funções renais: manutenção do balanço hidroeletrolítico e do equilíbrio ácido-básico, a partir da reabsorção final de sódio e da excreção do excesso de ácido, respectivamente.
440 ( Medicina laboratorial para o clínico
centração ou diluição da urina. O filtrado que sai do túbulo contoretdo e entra no túbulo coleror é ainda isosmolar em relação ao plasma. Sob a influência do hormónio antidiurético (ADH), produzido pela glândula pituitária
em resposta ao aumento da osmolaridade do plasma, o túbulo coleror se torna bastante permeável à água, reduzindo a sua excreção (efeito antidiurético). Na ausência de ADH, a água não é absorvida e ocorre a produção de urina diluída. O líquido que deixa os cubos colerores é considerado urina. A partir destes, através dos ureteres, a urina alcança a bexiga, onde é temporariamente armazenada antes de ser eliminada pela uretra.
EXAMES LABORATORIAIS NA AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL O processo de diagnóstico do paciente com di srunção renal é bastante dependente dos exames laboratoriais, uma vez que a maioria das doenças renais é assin-
comática ou oligossimomática até que se renha lesão significativa do tecido renal. Investigação laborarorial a partir do exame de urina de rorina, das dosagens séricas ou plasmáticas de creatinina e uréia e da pesquisa de microalbuminúria permitem, com freqüência, o reconhecimenco inicial de disfunção renal associada a uma das síndromes renais. Outros ensaios, como a avaliação da taxa de filtração glomerular e a determinação da proteinúria de 24 horas, auxiliam na confirmação dessa primeira impressão. Adicionalmente, esses exames são úteis no acompanhamento da progressão da doença renal. Propedêutica complementar (laboracorial, por imagem e urológica) pode ser necessária para o diagnóstico definitivo e específico da doença renal.
EXAME DE URINA DE ROTINA É realizado numa amostra de urina humana para determinar suas características físicas e químicas e para verificar a presença de estruturas celulares e de outra origem. O exame de urina é conhecido com outras denominações, tais como, urina rotina, sumário de un na, urina do tipo 1, EAS (elementos anormais e sedimento), EQU (exame químico de urina), ECU (exame comum de urina), urina parcial e PEAS (pesquisa dos elementos anorma1s e sedimento). O termo "exame de urina de rorina" é o que será adotado nesse capítulo, por ser o mais apropriado. A análise da urina para o diagnóstico de doenças cem sido usada por muiros séculos, sendo um dos procedimentos laboratoriais mais antigos utilizados na prática médica. A amostra de urina pode ser considerada uma "biópsia" do trato urinário, obtida sem a necessidade de procedimento invasivo. Seu exame fornece informações 1mporrames, de forma rápida e econômica, seja para o diagnóstico e monitoramento de doenças renais e do trato urinário, seja para a detecção de doenças siscêmicas e metabólicas não diretameme relacionadas com o rim. Como qualquer outro procedimento laboratOrial, o exame de urina de rotina necessita ser cuidadosamente realizado e apropriadamente controlado, utilizando procedimentos padronizados de coleca, armazenamento e análise. O Quadro 35.1 inclui aspectos que necessitam ser conhecidos e compreendidos para assegurar a interpretação adequada do exame de urina de rotina
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
Quadro 35.1 - Considerações para a realização e interpretação do exame de urina de rotina 1. Princípio básico dos lestes 2. limiloções dos lesles Especificidade para a subslõncia pesquisada Sensibilidade ou limile de delecçào 3. Influências pré·analílicas e falares inlerferentes capazes de causar resuhados falso-negolivo ou folso·positivo 4. Etapas críticas e considerações do procedimenlo anolílico 5. Significado clínico dos resuhados e suo correlação com oulros achados do exame de urina
A fase pré -analítica
A qualidade da amostra é fundamental para a exacidão do exame de urina, portamo, codos os cuidados devem ser comados para que seja colhida, armazenada e transportada adequadamente. Métodos de cole ta de amostras de urina
A amostra de escolha para realização do exame de urina é a primeira urina da manhã, colh ida pela técnica de jaco médio, após período não inferior a quatro horas de permanência da urina na bexiga para promover sua concentração. É recomendado que a coleta não seja realizada após exercício físico vigoroso e/ou ingestão excessiva de líquido. Recomenda-se também, a coleta em jejum para reduzi r a diu rese e obter-se a amostra mais concentrada. Na impossibilidade de se colher a primeira urina da manhã, pode-se obter, alternativamente, amostra de urina dita aleatória. Neste caso, a coleta pode ser feira em qualquer momento do dia. A amosua obtida de colheita aleatória pode ser usada para a análise, porém está mais freq üentemente associada a resultados falsonegativo ou falso-positivo. Visando minimizar esses resultados, recomenda-se que a amostra de urina seja colhida após período igual ou superior a quatro horas da última micção. Outros mécodos de coleta de urina incluem: cateterismo vesical, punção suprapúbica e o uso de sacos colecores pediátricos. Para codos esses, a coleta requer, obrigatoriamente, a assistência de profissional treinado adequadamente.
441
Recipiente de coleta
A amostra de urina deve ser colhida em recipiente descartável. limpo e à prova de vazamento. Deve ser de material inerte. livre de partículas e substâncias interferentes. como desinfetanres e detergentes. Muicos laboratórios preferem utilizar frasco estéril para codas as coletas de unna. O reCipiente de coleta deve apresentar boca larga, com diâmetro de 4 a 5 cm, para facilitar a obtenção de urina por pacientes de ambos os sexos e sua base deve ser ampla o suficiente para evitar que o mesmo encorne facilmente. Tampa de rosca é preferível. pois apresenta menos propensão a vazamento do conteúdo durante o transporte, além de ser facilmente colocada e removida. O recipiente de coleta deve ser corretamente identificado com as informações do paciente e do material. Orientação ao paciente
A maioria das amostras de urina pode ser obtida pelos próprios pacientes, de forma adequada. após o fornecimento de inscruções simples pelo profissional do laboratório responsável pelo atendimento. Essas instruções podem ser dadas verbalmente, sendo rambém recomendado o fornecimento das mesmas na forma escrita comendo ilustrações do procedimento de coleta. Caso o paciente não seja capaz de realizar o procedimento recomendado, o laboratório deve oferecer assistência de profissional do laboratório capacitado. O Quadro 35.2 apresenta instruções para o procedimento de coleta de urina de jaco médio para pacientes do sexo masculino e feminino. Esse procedimento é adequado também para coleta de amostras para exames microbiológicos. Ao orientar verbalmente o paoenre, é importante enfatizar a necessidade de se lavarem as mãos e os cuidados gerais de higiene, bem como tampar adequadamente o recipiente após a coleta para se evitar vazamento do material. Secreção vaginal ou sangue menstrual podem contaminar a urina obtida de mulheres. Isto pode ser minimizado com o uso de rampào vaginal durante a coleta, quando não for possível adiá-la. Recomenda-se aguardar três dias após o término do fluxo menstrual para realizá-la. O volume de unna mín1mo necessário para realização do exame de urina de rot1na é 12 ml. Em sicuações especiais, como em casos de recém-nascidos, crianças e idosos. volumes menores poderão ser obtidos.
442 ( Medicina laborawrial para o clínico
Quadro 35.2 - Orientações para coleta de unna de Jato médio Sexo Feminino
Sexo Masculino
1. lavor os mãos com águo e
1. lavor os mãos com águo e sabão
sabão
2. Lavor o região vaginal com 2. Expor o glande e la vor águo e sabão e enxaguar com águo em obundãncio 3. Enxugar, fazendo movimen· tos de frente poro trás, com toalha de pano limpo ou de papel descortável 4. Assenlor no va so sanitário, a fastar os grandes lábios e mantê-los afastados 5. Desprezar o primeiro porção de urino no vaso sanitário 6. Sem tnlerromper o micção, colocar o frasco de colete no frente do jota ur
l Desprezar o reslonle de unno no vosa sanilárro 8 Fechar o frasco adequo· domenle e encom,nhá·lo rmediotomente poro o loborolório
com águo e sabão. En· xoguor com águo em obundãncio 3. Enxuga r com loolho d e pano limpo ou de papel d escorlóvel 4. Expor o glande e monler o prep úcio relroído 5. Desprezar o primeiro porção de urino no vaso son ilário 6. Sem interromper o micção, colocar o frasco de coleto no lrenle do jo ta urinário e colher entre 20 e 50 ml de urino. Evrlor locar no porte interno do frasco
l Desprezar o restonle de urino no vaso sanitário 8. Fechar o frasco adequo· domenle e encaminhá-lo rmedioromenle ooro o lobororório
Informações pré-ana/íttcas
O uso de med1camentos e vitaminas pelo paciente deve ser investigado, uma vez que isto pode representar
importante influência pré-analítica ou interferência do exame de urina (ver itens influências pré-analíticas e fatores interferentes). O ripo de amostra abrido e intercorrências eventualmente ocorridas durante o procedimento de colera devem ser anotados, pois podem auxiliar na interpretação do resultado. Armazenamento
O rempo compreendido entre a coleta e a análise da amostra de urina é o maior obstáculo para a exatidão dos resultados do exame de urina rotina na maioria dos laboratórios. Ideal mente, o exame de urina deve ser realizado até duas horas após a coleta. Caso isco não seja possível. o material deve ser armazenado sob refrigeração (entre 2 a 8 •C) imediatamente após a colera.
A refrigeração preserva a maioria dos elementos pesquisados com a tira reagente por seis a oiro horas. Para aqueles forossensíveis (bilirrubina e urobilinogênio). é necessário proteger a amostra contra a ação da luz. Caso a amosrra contenha bacrénas, a refrigeração reduzirá o crescimento bacteriano. minimizando a obtenção de resultados incorreLos de vános parâmetros na pesquisa com a ma reagente. Entretanto, pode haver a preci pitação de solutos. como uratos e fosfatos, que podem interferir no exame microscópico. Além disso. leucócitOs e hemácias podem sofrer lise e os cilindros podem se dissolver, com redução significativa de seu número após duas a quatro horas, mesmo sob refrigeração. Quanto mais tempo, maior a decomposição dos elementos, especialmente quando a urina está alcalina (pH >7.0) e a densidade é batxa (s 1.010). Urinas refrigeradas devem estar à temperatura ambiente ames de serem restadas, uma vez que algumas das reações químicas da tira reagente são dependentes da temperatura. Amostras mantidas à temperatura ambiente por mais de duas horas não devem ser aceitas para teste, devendo ser desprezadas. Vários elementos químtcos, células e cilindros podem ser perdidos. levando a resultados incorretos (Quadro 35.3). Quadro 35.3 - Alterações observadas em amostra de unna mantidas a temperatura am biente após duas horas Constituinte pH Glicose Nitrito
Alteração Mecanismo aumemo Produção de omõnio, o partir de uréio, por bactérias contammantes diminUIÇãO Glicólise por oção de bactérias presente Produção por boctétias contaminantes ausente
Degradação o nitrogênio, seguido de evaporação Cetonas diminuição Conversão do óctdo ocetoocét,co o acetona evaporação do acetona Bilinubino diminuição Oxidação à biliverdino po1 exposição à luz Urobdinogênto diminuição Oxidação à urobilino por exposição à luz Hemócios/leucócitos diminuição Lise Cil.ndros
oimnuiçõo
Dissotução
Investigação laboratorial do pacieme com disfunção renal
Fatores pré-analíticos
Além dos fatores relacionados à coleta e ao armazenamento da amostra, diversas condições, como jejum, ingestão hídrica, dieta, esforço físico, gravidez, são capazes de alterar a concentração dos componentes urinários, interferindo no resulrado. apesar do processo analítico estar correto. Considerando-se que a maioria absoluta dos medicamentos e seus metabólitos são eliminados pelo rim, o uso de qualquer medicamento deve ser considerado fator pmencialmente capaz de interfenr nos resultados do exame de urina. Dieta: nca em proteína de origem animal pode levar à acidez da urina. Alguns medicamentos comendo cloreto de amônio ou fosfatos ácidos são utilizados para acidificar a urina no tratamenco de litíase renal. Por outro lado, dieta rica em vegetais e fr utas, especialmente cítricas, pode induzir a formação de urina alcalina. O mesmo ocorre com o uso de bicarbonato de sódio e outras drogas alcalinizanres para o tratamento de certos tipos de cálculos renais. O jejum prolongado, em geral associado a condições como desidratação. febre. vômito e diarréia. e o uso de dteta pobre em carboidratos visando à redução de peso corporal podem ser causas de cetonúria. Ingestão de grandes quantidades de lípides pode. também, resultar em cetonúria. Praticamente todo o nitrato presence na unna é proveniente da ingestão de vegetais, portanto. indivíduos que ingerem pequena quancidade desses alimencos, aqueles em uso de dieta parenteral ou, ainda, indivíduos desnutridos podem apresentar quantidades insuficientes de nitrato na urina para conversão em nitrito, levando a resultados falsamente negativos da pesquisa de nitrito. Diurese: vários constituintes da urina têm sua concentração alterada com mudanças do volume urinário (diurese) do paCiente devido à variação da ingestão hídrica. redução da capacidade de concenuação renal ou ingestão de agences diuréticos. O jejum ames da coleta da primeira urina da manhã é recomendado para reduzir a di urese e obter amostra mais concentrada. Esforço físico: parece aumentar a ftltração glomerular como resultado da elevação da pressão arterial, levando ao aparecirnenco ou aumento de proreinúria (albuminúria) e hernatúria. A coleta da primeira urina da manhã. evitando-se a realização de esforços fístcos vtgorosos, minimiza essa influência. Além disso, pode-se observar a presença de número elevado de leucóCitoS na amostra
443
de urina de pacienres que realizaram exercícios físicos vigorosos previamente à coleta. Postura corporal: proreinúria orwsrácica ou poswral ocorre em 3 a 5% de indivíduos adulws jovens aparemememe saudáveis. Nesses indivíduos, a prmeinúria é observada durame o dia, com realização de suas arividades habiwais, e desaparece quando o indivíduo permanece em decúbiw. A primeira urina da manhã, invariavelmente, apresema comeúdo de prmeínas normal nesses pacientes. Gravidez: está associada à glicosúria devido ao aumemo da taxa de filcração glomerular (TFG) com diminuição da capacidade de reabsorção da glicose pelas células wbulares renais. As alcerações da hemodinâmica renal observadas na gravidez podem levar, também, à proteinúria transitória, porém qualquer prmeinúria durame a gestação deve ser considerada significativa e investigada. Leucocitúria fisiológica é outro achado que pode ser observado durame a gravidez. Mulheres grávidas podem apresemar valor baixo de glicose sangüínea em jejum associado à cetonúria moderada. Tempo de permanência da urina na bexiga: a permanência da urina na bexiga por tempo entre quatro e oiw horas permite o crescimento logarítmico de bactérias e a redução do nitram por estas. Assim, a primeira urina da manhã é mais sensível para detectar a presença de bactérias na urina, ramo por meio da reação do nitriw quanto por exames microbiológicos. O Quadro 35.4 apresenta os principais fatores préanalíticos relacionadas ao exame de urina de rotina
A fase analíti ca
O exame de urina de rmina inclui a realização de procedimentos para avaliar as propriedades físicas e químicas da urina e o exame microscópico do sedimemo urinário. Como será visto mais à freme, para a interpretação adeq uada do resultado do exame de urina é importante correlacionar os achados obtidos nas três avaliações. Propriedades físicas
Cor: a cor amarela da urina se deve principalmente à presença do pigmento urocromo e também à pequena quantidade dos pigmemos uroeritrina e urobilina. A in-
444 [
tensidade da cor amarela é proporcional à concentração de solutos na urina, indicando. mais freqüenremenre. o estado de hidratação do indivíduo. Medicamentos representam a causa mais comum de alteração da cor da urina, enrretanro. algumas doenças podem também induzir a alteração da cor (Quadro 35.5). Quadro 35.4 - Influências pré-analíticas Constituinte
Dim inuição/A usênc ia
A umento/Presença
Bilirrubina
Exposição à luz solar ou a rtificial
Cetonas
Evaporação d os cetona s
Jejum prolongado, gravidez, esforço físico
Densidade
Ingestão a centuad o de líq uidos, uso d e d iuréticos
Baixo ingestão de líquidos
Glicose
Bocter:úrio
Pó vaginal, intoxicoção com chumbo, grov•dez
Leucócitos
Use (à sedimentoscopio)
Contaminação com secreção vag ina l, gravidez, presença de Trichomonos sp
Nitrito
Baixo ingestã o de vegeteis, incubação insuficiente no bex1go, bactérias não produtoros de nitrato redutose, conversão de minto o nitrogêmo
Crescimento bocteriono em urinas o rmozenodos à temperatura a mbiente por mais de duas horas
pH
Dieta rico em proteína animal
Dieta rico em vegeta is e frutos Produção de omônio po r bactérias produtoras de ureose
Proteína
Esforço físico, postura o rtostático, g ravid ez
Sangue
Esforço físico vigaraso, contaminação com menstruação
Urobilinogê· nio
Exposição à luz solar ou ortikio , omônio . anestesio peridurol
Acetona, b ilirrubina maior excreção à ra rde
Hemócio s
lise (à sedimentoscopio)
Esforço físico vigo· roso, contaminação com menstruação
Cilindros
Dissolução
Esforço físico viga· roso
Transparência: a urina é normalmente límpida. Indivíduos sadios podem apresentar urina turva devido à pre-
Medicina laboratorial para o clínico]1---- - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
cipitação de soluws, fosfaws na urina alcalina e uraws na
pela m edida da gravidade específica quanto da osmo-
urina ácida. Enrre as condições que levam à rurvação da
lalidade. Em indivíduos com furção renal normal, a
urina, dest acam-se a presença de leucócitos, hemácias,
gravidade específica reflete o conteúdo de sódio, po-
m icrorganismos, células epiteliais, lípides, linfa, muco, se-
t ássio
creção prostática e contraste radiográfico.
terminação da gravi dade específica é m ais conveniente,
Quadro 35.5 - Principais causas de alteração da cor da urina
e cloreto e
corresponde
à osmolalidade. A de-
emretanto, a medida da osmolalidade reflete melhor a habilidade de concentração renal. Para determinação da gravidade específica, pode-se utilizar o refratômet ro
Cor
Causa
Vermelho
Hemócios Hemoglobina Mio globino M etemoglobino Porfirino Beterraba Fucsino, Anilino Fenozopiridino Fenolftoleíno
ou a tira reagente, que são métodos de fácil execução e apresentam boa correlação até va lores iguais a 1.025. A gravidade específica urinária sofre grande influência do estado de hidratação, podendo variar de 1.001 a 1,035. Em indivíduos com ingestão hídrica normal, a variação é de 1,01 5 a 1.022. Valores iguais ou acima de 1,020 em amostra aleatória de urina co rrespondem
à capacida-
Amarelo amorronzod o ou verae omorronzo do
Pigmentos b1liores
Alaranjado
Fenozopiridino
Amarelo brilhante
Riboflo vio e metabólitos
ainda, deficiência do ADH.
Marrom
Melonino Ácido homogentisico
radiográfico na urina pode causar falso aumento da
Azul esverdea do
lndicon Clorofila Infecção por
Q uando a medição é rea lizada com a t ira reagente, a
de de con centração normal. Valores persistentemente próximos de 1,010 sugerem perda da capacidade de concentração do rim, sinal precoce de doença renal ou, A presença de uréia (>1 g/dl), glicose e contraste gravidade específica quando se utiliza o refratômerro.
Pseudomonos sp
concentração moderada de proteínas (~ 100 mg/dL) e a presença de corpos cetônicos na urina podem causar fa lso aumento, enquanto que pH uri nário igual ou maior
Odor: a urina apresenta odor característico de origem não determinada. O Quadro 35.6 apresenta as prin-
a 6,5 pode levar a resultados falsamente diminuídos.
pH: apesar do rim ser essencial para a manutenção do
e dos
cipais condições que podem levar à formação de urina
pH sangüíneo
com odor distinto.
do pH não constirui, isoladamente, índice da capacidade
Quad ro 35.6 - Ca usas de alreração do odo r da urina
líquidos corporais, a determinação
renal de excreção de ácidos, apresentando valor lim itado na investigação de disfunções renais e distúrbios ácido-
Odor Adocicado
Comentário Presença de cetonúrio (cetoocidose diabético, jejum prolongado)
básicos. Entretanto, a m edida do pH urinário pode t razer informações úteis. Normalmente, a urina é discretamente ácida (pH 5.0 ou 6,0), sendo que o intervalo de referência varia de 4,5 a 8,0. Urina alcal ina freqüentemente
Amon:o col
Presença de omônio (p roduzido por bactérias a partir do uréio)
indica que a amostra foi mantida à tem peratura ambien-
Fétido
Presença de bactérias, decomposição de cistino
te por mais de d uas horas. podendo ocasionar result a-
Fecal
Cantaminoçco 1ecol ou presença de bactérto iEscherichio coh1
Outros
Vários alimentos e medicamentos podem conferir odor distinto à urina
dos incorrecos ao exame. Por outro lado, quando a urina foi colhida e armazenada adequadamente, pode indicar infecção urinária. O conheci mento do pH urinário auxilia na determinação de cristais que podem ser observados no exame microscópico de sedimento urinário. Além disso, em amostras de urina alcalina e diluída (gravidade
Gravidade específica ou densidade: a concentração de solutos na urina pode ser quantificada tan to
lnvesrigação laborato rial do pacie nte co m d isfunção renal
específica < 1,010), o processo de dissolução de cilindros e lise de cél ulas ocorre de forma mais rápida.
445
Emre as causas de redução do pH urinário, destacam-se jejum prolongado, diarréia grave, diabetes meliro, dieta rica em carne, acidose metabólica ou respiratória e utilização de medicamentos para acidificar a urina no tratamento de litíase renal. As principais causas de urina alcalina incluem dieta rica em vegecais e fruras cítricas, alcalose metabólica ou respiratória, drogas alcalinizantes para o tratamento de certos tipos de cálculos renais e acidose tubular renal. Características químicas Atualmente, os testes químicos que fazem parte do exame de urina e também as determinações da gravidade específica e do pH. vistas anteriormente, são realizados utilizando-se a tira reagente. A tira reagente é constituída por um suporte plástico contendo áreas impregnadas com reativos químicos específicos para cada parâmetro (Figura 35.1). Uma reação de cor se desenvolve quando as áreas de química seca entram em contato com a urina. A alteração de cor e sua intensidade são avaliadas visualmente, após período de tempo padronizado. comparando-se com padrão de cores fornecido pelo fabricante da tira reagente.
Bilirrubina Urobilinogênio Cetonas Glicose Proteínas Sangue Nitrito
pH •
Densidade Leucócitos
Figura 35.1 -Tira reageme para pesqu1sa de elemenws químicos. pH e gravidade específica no exame de urina de rmina.
446 ( Medicina laboratorial para o clínico
A pesquisa de elementos químicos com a rira reagente apresenta inúmeros benefícios, rais como, rapidez, baixa complexidade, reduzido volume de amosua, estabilidade e reprodutibilidade. Para assegurar esses benefícios, alguns cuidados no manuseio da tira são imporrances para manrer a integridade das áreas de reação: a) as tiras devem ser mantidas no seu recipiente original; b) deve-se evitar sua exposição à luz solar direta, vapores químicos e umidade ambiental; c) não se deve tocar nas áreas de reação; d) as leituras devem ser realizadas nos tempos corretos. Vários fatores são capazes de interferir nos métodos analíticos empregados na tira reagente e o conhecimento desses fatores é fundamental para a correta interpretação dos resultados. Entre eles, destacam-se: agentes de limpeza e desinfetantes, medicamentos e ácido ascórbico em concentrações elevadas na urina. Qualquer medicamento novo deve ser considerado, a princípio, uma fonte potencial de interferência. O Quadro 35.7 apresenta os fatores que, sabidamente, são capazes de interferir nas reações que compõem a tira reagente. Proteína: em condições fisiológicas, uma pequena quantidade de proteínas é observada na urina, correspondendo a cerca de 150 mg/24 horas (ou 10 mg/dL), que incluem albumina (até 30 mg/24 horas), proteínas de baixo peso molecular (cransferrina, haptoglobina, beta 2microglobulina, ceruloplasmina, etc.), imunoglobulinas e glicoproteína de Tamm Horsfall (até 50 mg/24 horas). A detecção de proteínas é provavelmente o achado mais sugestivo de doença renal. especialmente se associado a outros achados do exame de urina (cilindrúria, lipidúria e hematúria). O Quadro 35.8 apresenta os mecan ismos de proteínúria e suas principa is causas. O teste da tira reagente é particularmente sensível à albumina e menos sensível às outras proteínas. A sensibilidade das tiras reagentes varia entre 6 e 30 mg/dl de proteína, dependendo do fabricante. Proteínas tubulares (proteínas de baixo peso molecular), bem como imunoglobulinas de cadeia leve (proteína de Bence-)ones) observadas no mieloma múltiplo e outras gamopatias, podem não ser detectadas por este método. Glicose: a glicose é livremente filtrada pelos glomérulos e ativamente reabsorvida pelos túbulos renais. Em condições fisiológicas, apenas quantidade ínfima de glicose está presente na urina. Quando a concentração de glicose no sangue alcança valores entre 160 e 200 mg/dL.
o limiar de reabsorção tubular é ultrapassado e a glicose aparecerá na urina. Este é o mecanismo de glicosúria observada no diabetes melim. Glicosúria na ausência de hiperglicemia (glicosúria renal) é decorrenre de distúrbio na reabsorção cu bular renal da glicose e pode ocorrer em diversas condições: desordens rubulares renais, síndrome de Cushing, uso de corticoesteróides. infecção grave, hiperrireoidismo, feocromocimma, doenças hepáticas e do sistema nervoso cenrral e gravidez. Glicosúria pode ocorrer, ainda, devido à ingestão de dieta com elevada porcenragem de carboidrams. esrresse emocional agudo e após exercícios físicos vigorosos. A reação da tira reagente é específica para a glicose. não detectando a presença de outros açucares como galacmse, lacmse. fruwse, penrose e sucrose. o que ram-
bém podem ter significado clíntco. A detecção desses açúcares (com exceção da sucrose) pode ser realizada pela pesquisa de agentes redumres na urina. Cetonas: cem nas ou corpos cetõnicos correspondem a um grupo de três substâncias: ácido ~-hidroxibutírico. ácido acemacé[ico e acemna. Es[es são produms do metabolismo de lípides e sua presença na urina está relacionada a condições metabólicas nas quais lípides. em vez de carboidratos, são usados como fome de energia. As duas principais condições associadas à cetonúria são diabetes melim e jejum. No diabetes melim, devtdo à falra de insulina, ocorre o catabolismo de lípides. pela gliconeogênese. levando ao acúmulo de cemnas no sangue e urina. No jejum, devido à depleçào de carboidraco, o organismo passa a utilizar lípides como fome de energia.
Quadro 35.7 - Farores Interferentes da [ira reagente Diminuição ou Ausência
Aumento ou Presença
Comentários
Densidade
pH
Escalo de cores padronizado em pH 6
pH
Contaminação bocleriono
Reoção não afetodo por ororeínos Corantes no urina (lenozopiridino, beterraba) podem mascarar a reaçõo
Proteína
Detergentes não iónicos e oniônicos
pH>9, densidade oumen~odo, qutnmo ou quinona, omônio quaternário ou clorohexidino
Sangue
Densidade aumentado proteína elevo· do, nitrito >10 mg/dl ácido ascórbico ~25 mg/dl ácido úrico, glutoliono, ácido genlísico, coptopril
Peroxidose m•crobono lrfecçõo u1nÓI•OI. h1poclorilo, formo!, peróxidos, mioglobinúr io
N itrito
Ácido ascórbico ~ 25 mg/dl, pH < 6
Corantes no unno (fenozopíridino, beterraba)
leucócilos
Glicose >3g/dl, dens1dode elevado. albumino >500 mg/dl ácido ascórbico ;:>: 25 mg/dl, cefolex.no, cefolo!ino. lelrocrclino. genlomicino
Agentes oxidantes (hipoclorito). formo!
Glicose
pH < 5, densidade elevado, urino com lemperoturo < lSOC, ácido ascórbico ~ 25 mg/ dl, formal, ácido gentísico. ácido úrico
Agenles oxidantes (hipoclori o}
Reação não afetodo por cetonas e ácido ascórbico < 25 mg/ dl
DePstdode elevado ftoleíno. on;roqu•nono, levodopo, óctdo fenilpirúv•co, oce!oldeído, cisleíno, metildopo, coplopril
Escala ce cores calibrado poro o ácido acetoocético Reaçõo não ofetodo pelo pH do urino
Cetonas
Bilirrubina
Ácido ascórbico ~ 25mg/dt. nitrito
Urobtlinogênio elevado, fenozopirid no, fenollozino, clorpromozino
Urobiltnogênio
Nitrito, ácido ascórbico. formal
Nittduronloíno. 1iboflovino. lenozopiridtna, corantes diozótcos. óc,do p-ominobenzóico, beterrobc Interferentes do reoção de Eh rlich: porfobilinogênio. sulfonomido, procoíno, ácido o·ominosolicílico (PAS} e ácido htdroxtndolocélrco
lnves[igação laborawrial do paciente com disfunção renal
447
Quadro 35.8 - Pnncrpars causas de proreinúria Mecanismo
Principais causas
Aumento do
Glomerulonefrites
permeabilidade glo merular
Nefrite lúpico Amiloidose O bstrução do veio renal Nefroesclerose Pré-eclompsio N efropolio diabético
Desordens lubuto•es
Pielorefr'le Necrcse tuou ar agudo Rim ao ·c'sl co ntoxic:Jçõo por melots pesados e vtlomtno D Hrpopotossemio Doença de Wilson Síndrome de Fonconi G oloctosemia
Mecanismos o;versos
Proteirúrio postural (3 a 5% d e adultos jovens sodiosl Estado febril Exercício físico vtgoroso
Este é o mecamsmo de ceronúria observado em casos de desidratação, vômiros, diarréra, febre e alcoolismo. Cetonas podem ser observadas na urina de indivíduos submetidos a dietas pobres em carboidratos ou, ainda, após a ingestão de grande quantidade de alimentos contendo líprdes. Em condtções fisiológrcas, a presença de corpos cetônrcos não é detectada na urrna. Na ceronúria, 78% dos corpos cecônicos são ácido B-hidroxibucírico, 10% são ácrdo acecoacético e 2% correspondem à acerona. A ttra reagente é mars sensível ao ácido aceroacérico (5 a 10 mg/dL) que à acetona (20 a 50 mg/dL). Sangue: a presença de sangue na urina pode ser confirmada pela detecção, na urina, de hemácias íntegras - hemarúria (5 hemácias/IJL de urina) ou de hemoglobina livre - hemoglobinú ria (0,01 5 mg/dL de urina). A hemarúria resulta de sangramento em qualquer ponto do rraro urináno, desde o glomérulo até a uretra, podendo ser devido a doenças renais, infecção, rumor, trauma, cálculo, distúrbios hemorrágicos ou uso de anticoagulantes. A hemoglobinúria pode resultar de hemólise intravascular. no rraro urinário ou na amostra de urina após a colheita. A diferenciação entre hematúria e hemoglobinúria é clinicamente importante. porém, ambas resultam em reste positivo à eira reagente.
448 ( Medicina laboratorial para o clínico
Geralmente. a hemarúria é acompanhada de presença de hemácias ao exame microscópico do sedimento. Entretanto, como as hemácias na urina podem ser rapidamente lisadas. especialmente em urinas alcalinas e com densidade baixa (< 1,010), a ausêncra de hemácias à microscopia não afasta hemarúria ou confirma a hemoglobinúria. Outros achados ao exame de unna (proreinúria e cilindros hemáticos) e a pesquisa de hemácias dismórficas positiva são úteis no esclarecimento da causa da hematúria. A presença de mioglobina na urina pode resultar em pesquisa de sangue positiva sem hemácias ao exame mrcroscópico. Apesar de rara, a mioglobinúria é um achado importante, estando associada à destruição de fibras musculares (poltomiosite, dermacomiosire. traumatrsmo e isquemia muscular. CIrurgias. exercício físico vtgoroso). Leucócitos: o teste da tira reagente detecta a presença de leucócitos na uri na por meio da pesqursa da escerase leucocirária. Esta enzima está presente nos grânulos primários ou azurófilos dos neutrófilos. monócitos, eosinófilos e basófilos. Linfócicos e células epireltais não contêm esterase leucocitária. Em condtções ftsiológicas. podem ser encontrados até cinco leucócitos por campo de maior aumento (400x) ao exame microscópico do sedimentO uri nário. O limite de detecção da tira reagente encontra-se entre cinco e 20 leucócitos por campo de maior aumento. porra mo. espera-se que a pesqutsa de leucócitos, a partir da ma reagente, na urina de pacientes sadios. seja negativa. Leucóciros são rapidamente lisados, especialmente em uri na alcalina e diluída (< 1,010), podendo. portamo. não ser detectados à microscopia. Entretanto, a pesqursa de leucócitos com a rira reagente é positiva na presença ramo de células íntegras quanto lisadas. A presença de leucócitos (leucocicúria ou piúria) na urrna em número significativo está relacionada. mais comumente. à infecção urinária (pielonefrite e cistite), sendo, portanto. acompanhada. freqüentemenre. de bacrerrúrra (ver capítulo 16). Outros processos inflamatórios do trato geniru rinário, como glomerulonefrites. nefrites intersticiais. neoplas1as e, também. tnfecções por Chlamydia trachomat1s e Tnchomonas vagmallts, podem levar ao aumento de leucóciws. porém sem a presença de bacteriúria. A leucocicúria observada na liríase renal pode ser devida à resposta inflamatória local ou a infecções secundárias à esrase urinária.
Nitrito: a pesquisa de nitrito representa teste bas-
ao microscópio óptico, utilizando-se as objetivas de lOX
tante útil na detecção de bacteriúria. Os principais
(menor aumento) e 40X (maior aumento). O sedimento
agentes bacterianos cau sadores de infecção uri nária
urinário contém todo o material insolúvel acumulado
são bactérias gram negativo constituintes da micro-
na urina, desde o filtrado glomerular. passando pelos
biota indígena do intestino. tais como Escherichia coli. Proteus. Klebsielfa. Citrobacter e Samonella. A maioria
túbulos renais e pelo trato urinário baixo. Esse material pode
dessas bactérias apresenta a en zima nitrato redu tase,
mados nos túbulos renais, células derivadas do sangue
que promove a formação de nitrito a partir de nitra-
(h emácias e leucócitos). células epiteliais (renais, de tran-
to presente na urina, oriundo da ingestão de vegetais
sição ou escamosas). espermatozóides. microrganismos
incluir vários elememos. tais como: cilindros for-
na dieta. A pesquisa de nitrito indica 100.000 ou mais
(bactérias. fungos. parasitos), lípides. cristais. precipitados
bactérias capazes de converter nitrato em nitrito, su-
amorfos de substâncias químicas. lípides (corpos graxas
gerindo o d iagnóstico da infecção uri nária. especial-
ovalados. gotículas de lípides) e muco. Valores de refe-
mente quando associado à leucocitúria. Apesar de ser
rência do exame microscópico do sedimento urinário
um reste rápido e de baixo custo, a pesquisa de nitrito
encontram-se no Quadro 35.9.
não substitui a rea lização de exames microbiológicos para confirmação de infecção urinária. Além das ente-
Pseudomonas e raras de Staphy/ococcus e Enterococcus podem apresentar robateriáceas. algumas cepas de
Quadro 35.9- Valores de referência do exame microscópico do sed1menro urinário Constituinte
Concentração
Bilirrubina: sua presença na urina é observada quan-
Hemócios
O - 2/compo de maior aumento
do há aumento da concentração de bilirrubina conjuga-
Leucócitos
O - 5/compo de maior aumento
Cilindros hiolinos
O - 2/compo de menor aumento
C élulas epiteliois renais
Raros/campo de mo1or aumento
Células epiteliois de transição
Raros/campo de maior aumento
Células epiteliois povimentosos
Raros/campo de mo1or aumento
na porção de urobilinogênio é excretada na urina (<::;1 mg/dl ). Nas condições em que há produção elevada
Bactérias
Ausentes
Cristais anormais
Ausentes
nitrato redutase.
da no sangue (>1 a 2 mg/dL). geralmente secundária
à
obstrução das vias biliares ou lesão de hepatócicos. Desta forma. a detecção de bilirrubina na urina é importante na suspeita de doenças hepáticas e na investigação das causas de icterícia. Urobilinogénio: em condições fisiológicas, peque-
de bilirrubina, como nas anemias hemolíticas e desordens associadas
à eritropoiese ineficaz. observa-se
aumento do urobilinogênio reabsorvido pela circulação encero-hepát ica, com conseqüente aumento da eliminação desce na urina. Nas disfunções ou lesões
Cilindros: são estruturas resultantes de processo de
hepáticas (hepatites. cirrose e insuficiência cardíaca
solidificação de proteínas no lúmen dos túbulos ren ais
congestiva). o fígado torna-se incapaz de remover o
(primariamente nos cúbulos contorcidos discais e cubos
urobilinogênio reabsorvido. tornando sua pesquisa
colecores). representando um molde desses. de forma
na urina positiva. Outras condições nas quais há au-
cilíndrica e com consistência de gel. Em condições fisio-
mento do urobilinogénio urinário incluem: estados de
lógicas. apenas raros cilindros (do tipo hialino) são vistos
desidrat ação e febril.
no sedimento urinário (Figura 35. 2). Número aumentado de cilindros (hialinos) pode ser visto em indivíduos
Exame microscópico do sedimento urinário
sadios após exercício físico vigoroso associado à proteinúria. Na presença de doença renal. os cilindros podem
Para a realização desta etapa. uma alíquota da amos-
aparecer em grande número e de vários t ipos. A presen-
t ra de urina é submetida à centrifugação em condições
ça de grande número de cilindros indica maior gravidade
padronizadas e o sedimento obtido é. então, avaliado
e acometimento de grande número de nefrons.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
449
Figura 35.2 -Cilindro htalino ao exame mtcroscóptco do sedtmen· to unnáno. (Unnáltse Arlas Dtgttal. Btosoftware ). Ver prancha colonda
Das proteínas presentes na urina em condições fisiológicas. cerca de um terço corresponde à glicoproreína de Tamm Horsfall, secretada na parte ascendente da alça de Henle e túbulo distal. Esta constitui a matriz de todos os cilindros. A formação de cilindros está relacionada com proteinúria. pH e concentração 1Ôn1ca da urina, estase e obsuução do nefron por células ou fragmentos celulares. Durante o processo de formação dos cilindros, outras proteínas. células, lípides. bactérias, entre outros elementos presentes no lúmen tubular, podem ser incluídos na matriz do cilindro, podendo ser tdenttftcados na sedimentoscopta (Ftguras 35.3 e 35.4).
que se rorna mais evidente quamo maior o tempo de permanência do cilindro no rim. A degeneração das células incluídas no cilindro é vista ao microscópio pelo aumento da granulosidade do ciroplasma e desaparecimento da membrana celular - cilindros granulosos (Figura 35.6). Com a evolução do processo, as células não são mais visíveis, sendo identificáveis apenas estruturas granulares que se tornam cada vez menores até se dissolverem completamente. O resultado final são cilindros que, à sedimenroscopia, apresentam maior refnngênCia e opacidade com aspecto semelhante à cera, denom1nados cilindros céreos. Estes estão associados, mais freqüenremente, à insuficiência renal crônica, podendo ser v1stos também na reje1ção aguda ou crôn1ca de enxerto renal.
(.
.
..
Figura 35.4 - Ctl1ndro graxo ao exame mtcroscóptco do sedimenro unnáno (Unnálise Atlas Dtgttal. BtosofLware ). \er pranc/10 coloflda
I
o Figura 35.3 - C1l1ndro epttelial ao exame mtcroscópico do sedimento unnáno (Unnáltse ALias Dtgttal. Btosoftware ). Ver prancha co/onda
Após a sua formação. os cilindros podem sofrer modificações até que sejam liberados na urina (Figura 35.5). Células e outras inclusões podem sofrer degeneração,
450 ( Medicina laboratorial para o clínico
A largura ou diâmetro do cilindro também apresenta importânCia clínica. A ma1ona dos c111ndros apresenta diâmetro relaoonado ao do túbulo onde fo1 formado. Cilindros largos são indicativos de acometimento renal mais grave. O diâmeuo destes pode ser várias vezes maior que os cilindros ha bitualmente vistos e são provavelmente formados nos túbulos rena1s dilatados ou nos cúbulos coletores na presença de escase unnária. Doença renal crônica ou obstrução urinária são as principais condições que resultam em dilatação e destruição dos túbulos renais com formação de cilindros largos. Cilindros largos, geralmente céreos ou finamente granulosos, são característiCOS da tnsuficiência renal crônica, podendo algumas vezes consmuir achado fortuito ao exame de
urina de rotina de pacientes nas fases menos avançadas dessa síndrome (Figura 35.7).
1 C na "l) Ol' UI ar 'onn3'!lo IQI 10: ~ ~lbuló
•et'Jj}J
2 lnk:IO do prooo~ de degcneraç:lo o os 141me~ \ll.,fft
)
T111r.s"~rm~
e-m
~ lnd ro il'd"'IIIO$o
" Tr~m*lrmar.ta em '-~•nclro
céroo
Figura 35.5 - Representação esquemática da transformação de crlrndros epirelrais em crlrndros granulosos e céreos no inrerior dos túbulos renars.
Os cilindros podem ser classificados baseando-se na composição de sua matriz e na presença de células. pigmentos ou outras inclusões, conforme apresentado no Quadro 35.10. Hemácias: resul tam de sangramento em qualquer ponto do mto urinário e de causas exua-renais (Figura 35.8). t importante esclarecer a origem da hematúria para definição do diagnóstico e abordagem terapêutica adequada. De acordo com a origem. as hemáturias são classificadas em glomerulares e não glomerulares (Quadro 35.11). A hemorragia glomerular é classicamente caracterizada pela hematúria associada à proreinúria, presença de cilindro eritrocitário (Figura 35.9) e de hemácias dismórficas.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
Figura 35.6 A e B - Cilindros granulosos ao exame mrcroscóprco do sedrmento unnário. (Urinálise Atlas Digital. Brosoflware ). Ver ptancha colando
Figura 35.7- Cilindro largo céreo ao exame microscóprco do sedimento urinário. (Urinálise Adas Digital. Biosofrware ). Ver prancha wlorrda
451
Quadro 35.10 - Tipos e significado clínico dos cilindros renais Tipo de Cilindro Hialino
Significado Clínico Exercício físico vigoroso, desidratação, febre, lesão renal não específica, indivíduos sadios (até 2/campo de menor aumento)
Eritrocitário
Glomerulopatia, sangramento túbulointersticial
Hemoglobínico
Glomerulopatia, sangra mento túbulointersticial, hemólise intravascular g rave
Leucocitário
Epitelial
Processo inflamatório túbulo-intersticial,
Figura 35.9- Cilindro eri trocitário ao exame m icroscópico do sedi-
nefrite, pielonefrite, rejeição aguda d e
memo urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware
enxerto renal
tware.com.br>). Ver
prancha colonda
Insuficiência renal aguda, necrose lubular aguda, doença túbulo-intersticial,
Granuloso
rejeição aguda de enxerto renal, infec-
Quadro 35.11 - Principais causas de hematúria glomerular
ções virais lcitomega lovirose, hepatite)
e não glomerular
Degeneração celular, doença túbulointersticia l, lesão glomerular
Hematúrias Glomerulares
Hematúrias não Glomerulares
Bacteriano
Pielonefrite
Céreo
Doença túbulo-intersticial, insuficiência
Glomerulonefrite Proliferotiva Crescência Lúpico Membrono-proloferotivo Nefropotio lgA (doença de Berger( Proliferotivo mesongiol Púrpura de He nochSchoenlein
Cousas hemotológicos/ d istúrbio ploquetário Corpo estranho/cateteres Fístula a rtéria-venoso/trombose veio renal Hemongiomos vesicol/renol Hemotúrio de exercício Hipertrofio prostá tica Infecções/tuberculose Malformações renais (cistos) Metabólicos hipercolciúrio e hiperuricosúria Medicamentosa: anticoagu· !antes Nefrolitíose Obstrução do trato urinário Queimaduras Tabagismo Trauma obd ominol/cirurgios Tumores
renal crónica, rejeição de enxerto rena l Graxa
lipidúria, síndrome nefrótica
La rgo
Insuficiência renal crónica
Mioglobinico
Lesão muscular aguda
Bilirrubina
Bilirrubinúrio, lesão de hepatócitos e obstrução das vias biliares
G lomerulo nefrite não p roliferativa Alterações vasculares Nefrite hereditária progressiva Nefropotio membranoso Nefroesclerose G lomerulonefrite membrana basal Síndrome de A lport
;.;)
..
Figura 35.8 - Hematúria ao exame microscópico do sedimemo urinário_ (Urinálise Aclas Digital. Biosoftware ).
Ver prancha colonda
A presença de hematúria à sedimentoscopia deve ser correlacionada a achados da avaliação das propriedades físicas químicas da urina, tais como: cor avermelhada, presença de turvação da amostra e pesquisa positiva de sangue ao exame da tira reagente, ressaltando as possibilidades de lise das hemácias e resultados fa lsos da pesquisa com a tira reagente, citadas anteriormente.
452 [ Medicina labo r ator ial para o clínico J l - - - - - - - - - - - - - -- - -- - - -- - - - - - - - -- - - - -
Figura 35.11 - Aglomerado de leucÓCitOS ao exame m1croscóp1co do sed1mento unnáno. (Unnáhse Atlas D1g1ral. B1osofrware ). \ u ortJIIU'O o/•11 100
Figura 35.12 - C1hndro leucománo ao exame microscópiCO do sed1mento urináno. (Unnáhse Arlas D1giral. B1osofrware ). Ver orancha colonaa
Leucócitos: número aumentado de leucócicos na unna está associado à presença de processo inflamatório em qualquer pomo do trato urinário (Figura 35.10). A presença de leucócitos aglomerados indica processo
lnvesrigação laborarorial do paciente com disfunção renal
inflamacório agudo (Figura 35.11). Cilindros leucocicários podem ocorrer em condições inflamatórias de origem infecciosa ou não infecciosa, indicando sempre a locali zação renal do processo (Figura 35.12). Febre e exercíoos vigorosos podem ser causa do aumemo de leucócitos na uri na. Leucocirúria com pesquisa negariva à rira reagente pode ser devida à presença, na amostra de urina, de linfócitos que não comêm leucócito esterase ou, ainda, de áodo ascórb1co ou antibiótico (cefalexina. cefalotina, tetraciclina, gentamicina), que podem inibir a reação química da rira regente. Células epiteliais: em condições fisiológicas, as células epiteliais observadas na sedimentoscopia 1ncluem as células epiteliais tubulares renais, células epiteliais de transição e células epiteliais escamosas. O achado de raras células epiteliais a microscopia é normal e se deve ao processo esfoliativo de renovação do epitélio celular. A identificação do ripo de célula epitelial apresenta importância clínica. Excetuando-se as células epireha1s escamosas, a 1dent1ficação dos demais tipos celulares só pode ser realizada com segurança quando se utilizam métodos de coloração com corantes supravitais ou por meio de exame C1tológ1co. No nosso me1o. a realização do exame do sedimento urinário com uso de corantes é pouco comum. As células epiteliais escamosas são as mais comumente encomradas no exame do sedimento urinário (Figura 35.13). Essas célu las revestem a porção distal da uretra masculina, toda a uretra feminina e também a vagina. Número aumentado de células epitelia1s escamosas indica contaminação da amostra de unna com matenal proveniente da vagina, períneo ou do meato ureual. As células escamosas apresentam morfologia característica que perm1te sua pronta 1dent1ficação à microscopia óptica, sem o uso de métodos de coloração. As células epitehais de cransição revestem todo o trato urinário, desde a pelve renal até o rrígono da bexiga nas mulheres e, nos homens, até a porção proximal da uretra, incluindo ducco prostática e vesícula seminal (Figura 35.14). A identificação das células epiteliais de transição é bastante difícil já que aquelas das camadas mais profundas que revestem a pelve renal apresentam morfologia semelhante à das células epiteliais renais, enquanto que as células das camadas mais superficiais do revestimento da bex1ga lembram as células ep1teliais escamosas. O aumento das células ep1telia1s de transição
453
está associado mais comumenre a processos infecciosos
e neoplásicas da bexiga e após uso de cateter vesical.
As células epiteliais tubulares renais recobrem desde os túbulos contorcidos proximais até os distais e também os túbulos coletores (Figura 35.15). Em número aumentado, essas células têm grande importância clínica. pois podem resultar de uma variedade de alterações renais, que incluem: necrose tubular aguda associada a drogas nefrotóxicas (aminoglicosídeos. salicilatos). imunosupressores e envenenamento por metais pesados, nefrites e rejeição de transplante renal. Nestas condições. podem ser observados também cilindros epiteliais. indicando a origem renal do processo. Outras condições podem levar ao aumento da esfoliação renal. como febre. processos inflamatórios e neoplasias. Corpos graxas ovalados representam células tu-
Figura 35.13 - Célula epitelial escamosa ao exame microscópiCO do sedimenco urinário. (Urinálise Arlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colonda
bulares degeneradas que absorveram lipoproteínas contendo colesterol ou criglicérides (Figura 35.16). Os corpos graxas ovalados constituem uma das manifestações de lipidúria que incluem, ainda, gorículas de lípides, cilindros graxas (Figura 35.4) e cristais de colesterol. A presença de li pidúria acompanhada de proteinúria é característico da síndrome nefrótica. A hipoalbuminemia secundária à proteinúria maciça observada nessa síndrome aumenta a produção de albumina pelo fígado que. por sua vez. aumenta também a síntese de lipoproteínas. resultando em hiperlipemia. Macrófagos e histiócitos podem tam bém fagocitar lípides. sendo impossível. ao microscópio óptico. distinguí-los dos corpos graxas ovalados, entretanto,
Figura 35.14 -Célula epitelial de trans1ção ao exame microscópico do sedimemo unnáno. (Unnáhse Adas Digital. Biosoftware ). Vo prancha colonda
o significado clínico desses é o mesmo. Cri stais e materiais amorfos: cristais na urina, denominado cristalúria, apresenta significado clínico limitado (Figuras 35.1 7 a 35.21). A pesar desse achado poder estar relacionada com a composição química de cálculos urinários nos casos de litíase renal, a formação de cálculo ocorre sem a presença de cristalúria e esta pode ocorrer sem a formação de cálculos. Raramente são observados na urina cristais relacionados a processos anormais, entretanto, quando presentes. estes devem ser identificados (Figuras 35.22 a 35.25). A identificação de cristais e materiais amorfos é, geralmente, baseada
o Figura 35.15- Célula epitelial renal ao exame microscópico do sedimento urinário. (Urináhse Atlas Digital. Biosofcware ).Ver prancha colonda
na morfologia ao microscópio e no pH uri nário. Já que alguns cristais se formam na unna alcal1na (pH 2: 7,0) e outros estão associados à uri na com pH s; 6.5. No Quadro 35.12 estão relacionados os princ1pais cristais e substâncias amorfas observadas ao exame do sedimento urinário e seu significado clín ico.
454 ( Medicina laboratorial para o clínico )f - - -- - - -- - - - - - -- -- - - -- -- - - -- - - - -
o
Figura 35.16 - Corpo graxa ovalado ao exame microscópico do sedimemo urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colorida
A
• (11
,;:,
u
cf.
' 11)
t
, ,_
o
B Figura 35.19 A e B- Cristais de ácido úrico ao exame microscópico do sedimento urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colonda Figura 35.17 - Cristais de uraro amorfo ao exame microscópico do sedimento urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha coloflda
o
o
o Figura 35.18- Cristais de oxalato de cálcio ao exame microscópico do sedimento urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colorida
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
.....,
·.
~~~
Figura 35.20 - Cristais de fosfato mplo e fosfato amorfo ao exame microscópico do sedimento urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colonda
455
v
\ Figura 35.21 -Cristais de fosfaco de cálcio ao exame microscÓpiCO do sedimemo urináno. (Urinálise Adas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colando
,/
• ..
.#
~
~
.
~
Figura 35.24 - Cristais de bilirrubina ao exame microscÓpiCO do sedimento unnáno. {Urrnáhse Atlas Digital. Brosoftware ). Ver prancha colonoa
•
oA .
"
"
~:..,
..
Figura 35.22 - CnstaiS de CIS[Ina ao exame microscÓpiCO do sedrmemo unnáno. (Unnáhse Adas Drgrtal. Brosofrware ). '· ~~ prlln l.a calor do
o
c o
•
B Figura 35.23- Cristais de tirosina ao exame mrcroscóprco do sedr· menro urrnário. (Urinálrse Atlas Digital. Biosoftware ). Vet prancilll colando
456 ( Medicina laboratorial para o clínico
Figura 35.25 A e B - Cnstais de medrcamenros ao exame microscópico do sedimento unnáno. (Unnáhse Atlas Drgital. Biosofrware ). Ver prandw olouda
Quadro 35.12 - Principais cristais e materiaiS amorfos encontrados na urina Cristais ou materiais amorfos em urina ácida sem significado clínico Urato amorfo Ácido úrico
Fungos: células leveduriformes e pseudo-hifas escão comumente associadas à infecção urinária causada por
Cand1da sp, podendo. porém. ser secundária à comam inação da amostra por secreção vaginal (Figura 35.27).
Urato de sódio, de potássio, de omônio Oxololo de cálcio
Cristais ou materiais amorfos em urina alcalina sem significado clínico Fosfato amorfo Fosforo triplo Biuroto de omônio
Fosfato de cálcio Carbonato de cálcio
Cristais anormais de origem metabólica Cistina Leucina
Tirosina Colesterol
Bilirrubina Hemossiderina
Cristais anormais de origem iotrogênica Sulfonamidas Ampicilina
Contraste radiográfico Aciclovir
Outros elementos
Figura 35.27 - Células leveduriformes ao exame microscóptco do sedimemo urinário. (Urinálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colonda Parasitos: parasicos ou suas formas (ovos, ciscos. etc.)
Bactérias: na urina podem ou não ter significado clín1co, dependendo das condições de coleca e armazenamento da amostra. Em indivíduos sadios, não se ob· serva, à sedimentoscopia, microrganismos em amostra de urina colhida em condições adequadas e examinada até duas horas após a coleca. Nessas mesmas condições. a presença de bactérias na urina pode estar relacionada à infecção urinária (Figura 35.26), que deve ser confirmada pela coloração pelo gram de gora de urina não centrifugada e uroculrura.
estão relacionados à contaminação da urina por mate· rial fecal ou vaginal. devendo-se repetir o exame de uri· na rotina em nova amostra colhida com mais rigor. A presença de Trichomonas sp resulta da contaminação da amostra de urina com secreção vaginal. Muco: freq üentemente são observados filamencos de muco ao exame do sedimento urinário. Parte do muco parece ser proveniente dos túbulos renais, correspondendo à proteína de Tamm Horsfall. Além disso, é oriundo de glândulas do craco genirurinário e, particularmente. do epitelio vaginal. A presença de filamentos de muco apresenta significado clínico bastante limitado, podendo ser observado seu aumento em processos inflamatórios do craco genirurinário. Espermatozóide: ocasionalmente observam-se es· permawzóides ao exame do sedimento de amostras de unna de homens e, também, de mulheres. sugerindo, neste último caso, a contaminação da amostra com material vaginal (Figura 35.28).
PESQUISA DE HEMÁCIAS DISMÓRFICAS Figura 35.26 - Flora aumentada e olindro granuloso ao exame mt· crascópico do sedimento urinário. (Urinálise Atlas Dtgttal. Btosof· tware ). Ver pron' hn colando
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
A distinção entre hematúrias glomerulares e não glomerulares pode ser realizada a partir da análise morfoló-
457
gica de hemácias presentes no sedimento urinário. Na hemarúria não glomerular (pós-glomerular ou exrraglomerular). as hemácias provenientes dos rúbulos, duetos ou de todo o rraro urinário restante apresentam-se na forma isomórfica, semelhantemente às encontradas na circulação sangüínea. Por outro lado, na hemarúria glomerular, as hemácias apresentam-se dismórficas, com alterações de forma, cor, volume e conteúdo de hemoglobina, podendo-se encontrar diversas projeções de suas membranas celulares, bem como heterogeneidade citoplasmática e forma bicôncava ou esférica (Figura 35.29).
balhos rêm sido realizados visando dererminar esse valor de referência: alguns auwres adoram a presença de, no mínimo, 20% de hemácias dismórficas, tanto para crianças quanto para adulws. Ourros encontraram bons resultados utilizando um limite de 10%. Entretanto, a Associação Americana de Urologia propõe o encontro de pelo menos 80% de hemácias dismórficas para o diagnóstico de hematúria glomerular.
I
Figura 35.28 - Espermawzóide e hemácias ao exame microscópico do sedimenco urinário. (Uri nálise Atlas Digital. Biosoftware ). Ver prancha colorida
O mecanismo pelo qual as hemácias se tornam dismórficas ainda não está cotalmente esclarecido. A explicação mais aceita até o momento parece ser traumatismo mecânico. Ao atravessarem a membrana basal glomerular pelos hiatos existentes entre seus capilares. os eritrócitos urinários sofrem compressão importante, com conseqüente deformação de sua membrana celular e redução de volume. Para realização da pesquisa de hemácias dismórficas, a amostra de urina deve ser coletada e armazenada como relatado anteriormente para o exame de urina de rotina. Em casos de períodos menstruais ou trauma do rraw urinário, sugere-se aguardar alguns dias para a realização do exame. A microscopia por contraste de fase parece ser o melhor método para o estudo do dismorfismo eritrocitário, dispensando o uso de colorações especiais. Não existe, ainda, um consenso na literatura sobre qual porcentagem de hemácias dismórficas deve ser adorada para definir hematúria glomerular. Vários tra-
458 [ Medicina laboratorial para o clínico
f igura 35.29 B - HemáCias d1smórficas (Corres1a do Dr. Leonardo de Souza Vasconcellos). o ,1 8
DOSAGEM DE CREATININA Importância clínica
A creatinina é um produto derivado da creatina e da fosfocrearina presentes no músculo esquelético. A creatina é sintetizada nos ri ns, fígado e pâncreas, sendo em seguida transportada pelo sangue para o urros órgãos, especialmente, músculos, onde é fosforilada a fosfocreatina. A interconversão entre a fosfocreatina e creatina é particularmente importante no forneci mento de energia para o processo de contração muscular. Por dia, entre 1 e 2% da creatina livre no músculo são transformados espontaneamente em
creatinina, a qual, uma vez no plasma, é excretada pelos nns. A produção coral de crearinina corresponde a cerca
de )affé. Essa reação apresenta cerca inespecificidade na
de 20 mg/Kg/dia e é relativamente constante dia a dia e.
tes evenrualmente presenres nas amostras, tais como:
por ser proporcional a massa muscular, varia com a idade
glicose, piruvaro, ácido úrico. frurose. a -cetoácidos, hi-
determinação da creatinina devido à ação de inrerferen-
e sexo. A excreção diária pode ser 10 a 30% maior devido à
danroína. ácido ascórbico, uréia, cefalosporinas, lipemia,
Ingestão de carne, que contém creatina e creatlnina. Entre indivíduos sadios, a vanação 1ntra-ind1v1dual da concentra-
hemólise e bilirrubina. Dependendo do mérodo, esses inrerferenres levam a aumento dos valores verdadeiros de creatinina da ordem de 0,2 a 0,4 mg/dl. O Quadro
ção sérica de creatinina é menor que 4.3%, enquanto que a variação entre indivíduos é menor que 12,9%. Em condições fisiológicas, a creatinina é excretada quase que exclusivamente pelo rim, sendo 85% por fil tração glomerular e o restante por secreção tubular. Não parece haver absorção de creatinina ao longo do nefron. Assim, a dosagem de creannma no soro ou plasma é utilizada com muita freqüência para avaliar a função renal, especialmente a função glomerular. A concentração de creatinina no soro ou no plasma é inversamente proporClonai à taxa de filtração glomerular.
t
importante destacar que a dosagem de creatinina representa marcador pouco sensível para estimar a filtração glomerular. Reduções moderadas da taxa de filtração glomerular podem não se refletir em aumenro da concenrração de creatinina no soro ou plasma. Em geral. esta somenre se enconrra elevada na insuficiência renal crônica, quando 50% ou mais dos nefrons estão comprometidos. A quantidade de creatinina que é secretada pelos túbulos renais aumenta com a redução da filtração glomerular. Adicionalmente, o resultado de apenas uma
35.13 apresenra as principais condições capazes de alterar a concenrração de crearinma no soro ou plasma. Quadro 35.13 - Causas de alteração da concentração de crearinina no soro ou plasma Aumento Redução do perfusão renal Insuficiência cardíaco congestivo Choque Desidratação
Diminuição Baixo estatura Redução do mosso muscular Doença hepático avançado Desnutrição
Doenças reno1s (com redução do taxo de filtração glomerular) O bstrução do troto urinó110 Ingestão de carne Anormalidades musculo1es Terapia prolongado com cort1costeró1des Hipertireoidismo Distrofio e paralisia muscular Dermotomios1te Poliomiosile M etildopo
dosagem de creatinma deve ser inrerpretado com cautela. não devendo ser utilizado como único parâmetro
Trimetoprim
para avaliação da função renal. Por exemplo, em um indi-
Soliciloto
Cimetidino
víduo adulco, híg1do. com massa muscular relativamenre pequena, que tlpicamenre apresenta concentração sérica de crearinina de 0,5 mg/dl (44 f.Jmoi/L). e que apresenra à primeira consulta clínica resultado da dosagem de creatinina de 1,0 mg/dl (88 f.Jmoi/L). a primeira impressão é de que esse resultado é compatível com função renal nor-
Valores de referência
Os valores de referência para creann1na no soro ou plasma enconrram-se na Tabela 35.2. Esses valores podem
mal. Entretanto, para esse indivíduo, concenrração sérica de 1,0 mg/dl (88 f.Jmoi/L) de creatinina pode correspon-
variar de acordo com o método utilizado. Devido à maior massa muscular, homens apresenram concenrração sérica
der à TFG cerca de 50% menor que o valor de referência.
de creatinina maior do que mulheres. Devido ao aumento da filcração glomerular na gestação. a concentração sérica de crearinina é, em geral. menor em mulheres grávidas. Em indivíduos idosos. é importante considerar que o processo de envelheCimento leva à perda de massa muscular com menos produção de crearinina e à perda de nefrons com redução da TFG.
limitações A dosagem de creatin1na é mais comumente realizada com métodos que utilizam o princípio da reação
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
459
Tabela 35.2 - Valores de referência para dosagem de creatinina
Ds {ml/min/superfície corporal média)
=
= Us (mg/dl) x V (ml/min) x 1,73 (m2)
Valores de referência" Idade mg/dl
!Jmoi/L (Unidades internacionais)
1 o 5 anos
0.3 o 0.5
27 o 44
5o lO anos
0,5 o 0,8
44 o 7 1
Adultos Homens Mulheres
Inferior o 1, 2 Inferior o 1,1
Inferior o 10 6 Inferior o 97
•Métodos baseados na reação de Jaffé
AVALIAÇÃO DA TAXA DE FILTRAÇÃO GLOMERULAR
A taxa de filtração glomerular fornece excelente avaliação da capacidade de filtração dos rins e não é possível medi-la diretamente. Entretanto, ela pode ser determinada pela medida da concentração de uma substância no sangue e na urina simultaneamente. A medição da concentração de substâncias, como a creatinina, na urina (Us), do volume de urina formado em determinado período de tempo (V) e da concentração desta substância no plasma ou soro (Ps) permitem determinar o volume de plasma que é depurado dessa substância por unidade de tempo (geralmente um minuto). Esse volume, em ml/min, é definido como depuração renal e é expresso através da equação: Ds (ml/min) = Us (mg/dl) x V (ml/m in) Ps (mg/dl)
Ds = volume de plasma depurado da substância; Us = concentração urinária da substância; V= fluxo urinário em mililitros por minuto; Ps = concentração plasmática da substância. A depuração é proporcional ao número e tamanho dos glomérulos. os quais são proporcionais à superfície corporal. O valor obtido da depuração deve ser, portanto, corrigido quando a superfície corporal do paciente difere da superfície corporal de um indivíduo de tamanho médio (1,73 m2). Assim, a depuração deve ser expressa a partir da seguinte equação:
460 [
Medicina laboratorial para o clínico
Ps (mg/dl)
A (m 2 )
1,73 =superfície corporal média A = superfície corporal do paciente A superfície corporal pode ser medida pelo monograma ou fórmulas que relacionam altura e peso à área de superfície corporal. A medida da depuração de substâncias exclusiva ou predominantemente filtradas pelos glomérulos, mas nem absorvidas nem secretadas por outras regiões do nefron, proporciona determinação da taxa de filtração glomerular, ou seja, a quantidade de ultrafiltrado que passa do sangue para o lúmen cubular, através dos glomérulos, em determinado período de tempo. O polissacarídeo inulina é a substância ideal para a medida da taxa de fi ltração glomerular, sendo a sua depuração considerada o método de referência. Entretanto, a depuração de inulina não é utilizada rotineiramente, pois sua realização é demorada e necessita de infusão intravenosa contínua, já que é uma substância exógena e de coleta de urina por determinado período de tempo. Por ser uma substância endógena, a depuração de creatinina para determinar a taxa de fi ltração glomerular é amplamente utilizada na prática clínica para a avaliação da função glomerular. Entretanto, a depuração da creatinina apresenta baixa sensibilidade e especificidade. Alternativamente, é possível estimar a taxa de fi ltração glomerular utilizando equações baseadas na dosagem de creatinina sérica ou plasmática e dados demográficos.
Depuração de creatinina Importância clínica
A depuração da creatinina, utilizando urina colhida por 24 horas, é o ensaio mais comumente utilizado para avaliar a taxa de filtração glomerular, devido à facilidade de execução e baixo custo. Para sua realização, é necessária a colheita de urina durante período determinado, preferencialmente 24 horas, e de amostra de sangue para a determinação de creatinina em ambas. A amostra de
sangue pode ser colh1da a qualquer momenco durance a coleta de urina, sendo mais conveniente ao final do período de colheita da urina. Deve-se orientar o paciente para que se mantenha hidratado durante o período de colheita da urina, devendo evitar a realização de esforço fís1co e, sempre que possível, suspender o uso de medicamentos.
Quadro 35.14 - Orientação para coleta de urina de 24 horas N o p rimeiro dia, desp rezar o p rimeiro urino do manhã Colher todos o s micções oré o manhã do segundo d:o, Colher o primeiro unno do manhã do segundo dia; Enviar o amostro poro o lobor01ório. Todo urino colhid o deverá ser armazenado em frascos limpos.
livres de resíduo de qualquer natureza e sob refrigeração !entre 2 e 8
oq
Limitações
Diversos fatores, especialmente aqueles capazes de interferir na dosagem de creatinina plasmática (Quadro 35.13) e na colheita de urina, contribuem para a inexatidão dos resultados da depuração de creatini na. Em Indivíduos adultos, a variação intra-individua l da depuração de crearinina pode ser superior a 25%. Outras variáveis capazes de impactar nos resultados da depuração incluem o uso de drogas que inibem a secreção tubular de crearinina (salicilaro, cimetidina e trimetoprim). Apesar de ser livremente filtrada, a fração de creatinina secretada pelos túbulos renais resulta em superestimação de 5 a 10% da taxa de filtração glomerular em indivíduos sadios. Na fase 1nicial da insuficiência renal, à medida que reduz a taxa de fil tração glomerular, aumenta a secreção tubular de creatinina, aumentando a inexatidão da estimativa da taxa de filtração glomerular por me1o da depuração da creatinina. A colheita de urina é também um faror limitante. Deve-se cuidar para que roda a urina formada no período de 24 horas seja colhida, pois a perda de urina pode acarretar falsa diminuição da depuração de creatinina. O paciente deve ser orientado sobre como proceder à coleta, conforme descrito no Quadro 35.14. Pode-secolher urina em intervalos menores, como 12 ou seis horas, porém a colheita de 24 horas fornece amostra mais confiável. A urina deve ser armazenada em frascos limpos, livres de resíduos de qualquer natureza e sob refrigeração (entre 4 e 8 •c) durante a coleta para evitar o crescimento de microrganismos que podem produzir crearininases ou elevar o pH da amostra, promovendo a conversão de creatinina em creatina, com conseqüente diminuição da concentração da creatinina urinária. Durante a colheita de urina. deve-se evitar dieta rica em carne, que pode aumentar a excreção urinária de creatinina, e exercício vigoroso, que pode alterar a filtração glomerular. A hidratação adequada do paciente é necessária para assegurar fluxo urinário de pelo menos 2 ml/minuto.
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
Valores de referência
Os valores de referência para depuração de creannina encontram-se na Tabela 35.3. Em todas as faixas etárias. a faixa de referência é am pla. Os valores para mulheres são em geral cerca de 8% menores do que para homens em codas as faixas etárias. Após os 20-30 anos de idade, em ambos os sexos, ocorre declínio da taxa de filtração glomerular de aproximadamente 1 ml/min/1.73 m2 por ano. Assim. na fa1xa etária de 70 anos, o valor de referência méd1o é de aproximadamente 70 ml/min/1,73m2 Outros facores além da 1dade podem alcerar a taxa de filcração glomerular. A gravidez apresenta importante efeico sobre a taxa de fi ltração glomerular, que pode alcançar valores até 140%matares do que os de referência no final do segundo mmestre. Tabela 35.3 - Valores de referênc1a para depuração de creatinina Idade (anos)
Homens Mulheres (ml/min/ 1,73m2) (ml/ min/ 1,73m 2)
20 - 30
88 - 146
81 - 134
30 40
82- 140
75
40-50
75 - 133
69- 122
50-60
68- 126
64 - 116
60- 70
61 - 120
58 - 110
70-80
55- 113
52- 105
128
Equações para estimar a taxa de filtração glomeru lar
Tem sido proposto que a taxa de filtração glomerular pode ser estimada por equações baseadas na dosagem de creatinina sérica ou plasmática e em variáveis como idade,
461
sexo, raça ou camanho corporal. Essas equações são úceis para o diagnóstico e classificação de doenças renais crênicas e parecem oferecer estimativa mais exata e precisa da caxa de filcração glomerular do que a depu ração de crearinina. Além disso, podem ser utilizadas em situações em que não é possível a colheita de urina de 24 horas de forma adequada, como no caso de pacientes pediácricos. As mais amplamente utilizadas encontram-se no Quadro 35.15. A National Kidney Foundation dos EUA tem recomendado que a estimativa da taxa de filtração glomerular por meio das equações seja utilizada preferencialmente em vez da dosagem sérica ou plasmácica de creacinina. Quadro 35.15 - Principais equações desenvolvidas para estimar a taxa de filtração glomerular baseada na creatinina sérica Crianças Fórmula Schworts ' . } 0,55 x altura (cm} DCr (mL1 mm =
Cr,
Equação Counahan-Barrat TFG (ml/min/ 1.73 m2) = 0,43 x altura (cm) Cr5
Adultos Equação Cockcroft-Gault DCr (mL/ minI = (1 40- idade) x peso x (O•85 se mu lherI 72 x Cr, Equação MDRD TFG (ml/min/1, 73 m2) = 186 x (Cri ·154 x (idade)"0,203 x (0,742 se mulher}
x (1 ,2 10 se afro-americano} DCr: depuração de creatina; CRs creatina no soro; TFG: taxa de filtração glomerular
in Renal Disease (MDRD) parece ser superior à estimativa com a equação Cockcrofr Gaulc e a determinação da depuração da crearinina para estimar a taxa de filtração glomerular. Essa equação foi validada em grande número de indivíduos adultos americanos caucasianos e afrodescendentes com disfunção renal e o resultado obtido é corrigido pela superfície corporal. Entretanto, torna-se necessário validar a utilização dessa equação em outras populações, incluindo indivíduos com função renal normal. diabéticos, entre outros. As equações Schwarrz e Counahan-Barrar oferecem estimativas clinicamente úteis da taxa de filtração glomerular em crianças. Limitações
Como as equações utilizam a dosagem sérica ou plasmática de creatinina, a exaridão e precisão dos resultados obtidos estão sujeiras aos fatores que interferem nessa dosagem. As equações não devem ser utilizadas em algumas situações, como: nos extremos da idade, indivíduos com massa muscular acentuadamente grande ou pequena, presença de doenças da musculatura esquelética. paraplegia ou quadriplegia. indivíduos com dietas pouco usuais com excesso ou escassez de creatinina (suplememação com creatina ou dieta vegetariana). casos de redução da massa muscular (amputações. desnutrição, atrofia muscular) e obesidade mórbida. Outras situações em que a determinação da taxa de filtração glomerular a partir da depuração renal se faz necessária incluem: pacientes que estão apresentando deterioração rá pida da função renal. avaliação da função renal ames da introdução de drogas potencialmente nefroróxicas e excretadas pelos rins e avaliação da necessidade de iniciar procedimento de diálise. Adicionalmente, como já relatado anteriormente, essas equações precisam ser validadas em outros grupos populacionais.
DOSAGEM DE URÉIA
A equação Cockcroft Gaul, proposta em 1976, é provavelmente a mais utilizada. Ela prediz a depuração da creatinina e não a taxa de fi ltração glomerular, não considerando a superfície corporal. Apesar de suas limitações em algumas situações clínicas, tem sido evidenciado que ela produz resultados mais exaros e precisos do que aqueles obtidos com a determinação da depuração da creatinina. A equação proposta no estudo Modification of Diet
462 (
Medicina laboratorial para o clínico
Importância clínica
O carabolismo das proteínas e ácidos nucléicos resulca na formação de compostos nirrogenados não proréicos. A uréia é o principal produto formado (75%) desse carabolismo oriundo da conversão da amônia por enzimas hepácicas. Mais de 90% da uréia produzida é excretada pelos
rins e o resrame é eliminado pelo uaw gasmmesrtnal e pele. A uréia é livremente filcrada pelos glomérulos e 40 a 70% desta é difundida passivamente para fora do cúbulo renal. rewrnando ao plasma. Assim como a creacinina. a uréia apresenta relação inversa com a taxa de filcração glomerular e várias doenças renais com lesões glomerulares, cu bulares e vasculares podem cursar com aumento da sua concentração no soro ou plasma. Entretanto, vários fawres de origem não renal podem causar variabilidade da concentração de uréia sérica ou plasmática, wrnando limicada sua ucilidade como marcador de função renal (Quadro 35.16). Emre indivíduos sadios, a variação incra-individual da concentração sérica de uréia é menor do que 12.3%. enquanto que a variação entre indivíduos é menor 18.3%, demonstrando a maior variabilidade biológica da concentração sérica ou plasmática da uréia quando comparada com a de creatinina. Por outro lado, a elevação da uréia no plasma ou soro decorrente de alterações renais é mais precoce do que a creatinina, especialmente na insuficiência renal de origem pré e pós-renal.
Causas de alterações da concentração sérica ou plasmática de uréia
As principais causas renais e extra-renais capazes de alterar a concentração de uréia no soro ou plasma são apresentadas no Quadro 35.16.
Valores de referência
Como apresentado na Tabela 35.4, as concentrações de uréia tendem a aumentar com a idade do indivíduo e são discretamente mais elevadas no sexo masculino do que no feminino. Alimentação com alw teor protéico causa aumentos significativos nas concentrações plasmáticas e na excreção urinária de uréia.
PROTEIN Ú RIA DE 24 HO RAS
Import ância clínica
A presença de proteínas na urina em quantidades superiores a 150 mg/24 horas é provavelmente o acha-
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
do tsolado mais sugestivo de doença renal. A proceinúria pode ser devida ao aumento da permeabilidade capilar (proceinúria glomerular), na qual a proceína urinária é, principalmente, albumina; discúrbio da reabsorção cubular (proreinúria tubular), na qual as proteínas predominantes na urina são prmeínas de plasmácicas de baixo peso molecular; extravasamento de proteína de baixo peso molecular anormal - hemoglobina, mioglobina. proceína de Bence jones - do plasma para urina (proreinúria de sobrecarga); e produção de proteínas pelas vias urinárias (proreinúria pós-renal). Quadro 35.16 - Causas de alceração da concemração de uréra no soro ou plasm a
A umento
Diminuição
Redução do perfusão renal Insuficiência cardíaco congestivo Choque Doenças renais Insuficiência renal agudo e crõnica Glomerulonefntes crõnícas Pielonefrites crõmcas Obstrução do troto urinário Ingestão de grande quantidade de proteína Desidratação Aumento do cotobolismo protéico Jejum prolongado Cetoacidose Corticosteráides Telrociclrno Diuréticos Hemorragia digestiva lreobsor· ção de proteínas plasmá ticos)
Desnutrição protéico Insuficiência hepática Síndrome da secreção 'napropriodo do hormõnio onlidiurético
Tabela 35.4 - Valores de referência para uréia
Valo res de referência Idade mg / dl
mmoi/L (Unidades internacionais)
N eonolo
8,5 - 26
1,4-4,3
Cr iança
11-39
18-64
Adultos
15 - 39
2,5-6,4
>60 anos
17- 45
2.9- 75
463
e gra-
sos. A relação entre albuminúria e risco maior de doença
ve de proceinúria. Geralmente, a proceinúria é detecta-
cardiovascular cem sido demonstrada também em in-
da no exame de urina de roci na (pesquisa de elementos
divíduos aparentemente sadios. Assim, a determinação
A prmeinúria glomerular é o ripo mais comum
anormais), em seguida, é realizado teste quantitativo das
de microalbum inúria tem sido proposta em pacientes
proteínas cocais na urina. Como a elim inação de proteí-
com diabetes melico, hipertensão, pré-eclampsia e lúpus
nas na urina varia consideravelmente, a análise da prmei-
eritemacoso sistêmico, já que a intervenção nessa fase
é
núria deve ser realizada utilizando-se urina colhida por
capaz de preservar a função de filrração glomeru lar e
24 horas (Quadro 35.14), sendo o teste conhecido como
melhorar o prognóstico dos paciemes. Alguns estudos
proteinúria de 24 horas. Outros métodos de exames po-
têm evidenciado que a utilização de drogas inibidora
dem ser necessários para avaliar a presença de proteínas
do sistema renina-angiotensina pode minimizar o risco
específicas na urina (proteinúrias tubulares. proteína de
de progressão da nefropacia em pacientes diabéticos e,
Bence-Jones, etc.).
conseqüentemente, reduzir a taxa de excreção urinária de albumina. Além disso, o controle intensivo da glicemia e da pressão arterial é fundamental para reduzir-se
limitações
a evolução da nefropatia. O mecan ismo responsável pela albuminúria ainda
Vários fatores podem interferir no teste de proteinú-
não está esclarecido, sendo sugerido que seja conseqü-
e inflamação
ria de 24 horas e incluem erros na coleta de urina de 24
ência de disfunção endotelial generalizada
horas e uso de medicamentos como a fenazopiridina. A
vascular crônica, que incluiria os glomérulos. Essa hipóte-
à
se explicaria a relação da microalbuminúria com os even-
presença de proteínas na uri na pode se dever também
proteinúria funcional ou benigna, provavelmente devida
tos cardiovasculares.
a alterações do fluxo sangüíneo nos glomérulos e asso-
A imponância clínica da determinação de micro-
ciada a exercício físico vigoroso, estado febril. exposição
albuminúria reflete-se nas recomendações de diversos
prolongada ao frio ou calor, estresse emocional, protei-
comitês e associações médicas internacionais. A Orga-
núria postural e insuficiência cardíaca congestiva.
nização Mundial de Saúde (OMS) e a
American Dia-
betes Association (ADA) preconizam que a determ inação da microalbum inúria seja realizada imediatamente
Valores de referê ncia
após o diagnóstico do diabetes melito t ipo 2 e após cinco anos do diagnóstico de diabetes melito tipo 1.
Em condições fisiológicas normais, indivíduos adul-
Posteriormente, deve ser determinada a cada seis me-
eliminam entre 30 e 150 mg de proteínas em 24 ho-
ses (OMS) ou um ano (ADA). A realização anual para
ras. Crianças menores que 10 anos eliminam até 100 mg
pacientes com d iabetes melito t1po 2 também é reco-
tOS
de proteínas em 24 horas.
mendada pelo Instituto Nacional de Excelência Clínica do Reino Unido. A Sociedade Européia de Cardiologia
e o Comitê Nacional de Prevenção, Detecção, Ava liaDET ERM INAÇÃO DE M ICROALBUMINÚ RIA
ção e Tratamento da Hipertensão Arterial dos EUA
Importância cl ínica
da avaliação de todos os pacien:es hipertensos. A So-
propõem a pesquisa da microalbuminúria como parte ciedade Brasileira de Diabetes propõe a determ inação O termo microalbuminúria não se refere a uma nova
da microalbuminúria na avaliação do risco cardiovas-
substância ou a uma variante molecular da albumina e
cular de pacientes que apresentam fatores cardiome-
sim
à excreção urinária de pequena quamidade de al-
tabólicos e d iabetes melito.
bumina, entre 30 e 300 mg724 horas ou entre 20 e 200
Não há consenso na literatura quanto ao tipo de
~g/min. A microalbuminúria representa sinal precoce de
amostra de urina que deve ser colhida para a deter-
nefropatia e fator de risco aumemado de doença car-
minação da microalbumi núria. Pode ser utilizada urina
diovascular e morte em pacientes diabéticos e hiperten-
colhida no período de 12 ou 24 horas. a primeira urina
464 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1-- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - --
da manhã ou amosua
de
urina aleatória colhida após
três horas da última micção. Quando não
se
utiliza
Tabela 35.5 -Valores de referência para excreção de album1na na unna
amostra de urina de 12 ou 24 horas. é recomendada
TIPO DE AMOSTRA
a realização concomitante de dosagem de creatinina na amosrra de urina. Como a excreção de creatinina
é
relativamente constante, variações do volume urinário
24 horas
Primeira urina da manhã ou amostra aleatória
mg/ 24 h
~~g/min
<30
<20
Parâmetro
capazes de afetar a concentração urinána de album1na podem ser minimizadas quand o se expressa a excreção de album ina a partir da relação entre a concentração de albumina e a de creatinina na urina. A primeira urina da manhã parece ser a alternativa preferível na prática clínica, já que os resultados obtidos pela relação albumina: creatinina com esse tipo de amostra apresentam menos variação intra-individual quando
Excreção fisiológico Microolburni· núrio Albuminúrio (ou prorei· núriol
mg/g• Homens
Mulheres
<17
<25
30- 300 20-200 17-250 25- 355 >300
>200
>250
>355
comparados com os resultados obtidos com amostras aleatórias colhidas ao longo do dia. Os ensaios habitualmente utilizados pelos laboratórios para medir proteína na urina. incluindo a pesquisa com a tira reagente e a proteinúria de 24 horas, não têm especificidade adequada para caractenzar a excreção de pequenas quanndades de albumina. Para a sua
·mg/g. miligramas de albumma por gramas de creaumna Fome \lational Kid· ney roundauon. K/DOQI Cltmcal Pracuce GUideltnes for Chronic Kidney Disea· se: Evailition, Classificanon, and Stralification. Am ). Kidney Dis. 2002. 39: (suppl) 1.51·5266 Disponível em .
PRINCIPAIS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS DO PACIENTE COM DISFUNÇÃO RENAL
determinação, são utilizados métodos imunométricos, como a nefelometria e a turbidimetria, que apresentam maior sensibilidade.
As manifestações assoc1adas às doenças renais, in· clu indo os achados laboratoriais, são. em geral. inespecíficas. Todavia. elas perm1tem diagnóstico sindrômico da
Valores de referência
disfunção renal. o qual representa passo inicial importante para o diagnóstico definitivo e específico. Adioonal-
Os valores de referência para excreção de albumina
mente, a classificação das doenças renais em síndromes
na urina encontram-se na Tabela 35.5. Deve-se susp eitar
fornece abordagem didática. facilita ndo e ordenando o
da presença de m icroalbuminúria quand o esses valores
raciocínio clínico-laboratorial. A seguir, são apresentadas
são encontrados em duas de três amostras de urina co-
as principais alterações laboratoriais encontradas em cin-
lhidas em intervalo de um a se1s meses. A confirmação
co das grandes síndromes renais.
pela coleta de várias amostras se deve à variação intraindividual da excreção urinária de albumina, que pode chegar a 36%.
NA INSU FICIÊNCIA RENAL CRÔ N ICA
limitações
acordo com dois critérios: a) lesão caracterizada por
A insuficiência renal crónica pode ser defin ida de anormalidades estruturais ou funcionais do rim e ma-
t
importante destacar que outras condições não
nifestada por três meses ou ma1s, a part ir de alterações
relacionadas à lesão renal podem aumentar a excreção
anormais ou dos exames laboratoriais ou de imagem.
urinária de albumina, tais como: exercício físico vigoro -
com ou sem diminuição da taxa de fi ltração glomerular;
so. gravidez. febre. infecção urinária, hematúria. picos de
b) taxa de fi ltração glomerular inferio r a 60 ml/min/ 1,73
hiperglicemia. insuficiência cardíaca, proreinúria postural
m 2 por três m eses ou mais. com ou sem lesão renal. O
benigna e estresse.
Q uadro 35.1 7 apresenta as pnncipais alterações labora-
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
465
roriais encontradas na tnsuficiência renal crôntca, de-
pode ser classificada em pré-renal. renal e pós-renal.
vendo ser ressaltado que essas alterações podem variar
A insuficiência pré-renal decorre da hipoperfusão dos
dependendo do estágto de disfunção renal em que o pa-
rins, mais comumeme por uma absoluta redução do
ciente se encontra. Várias doenças renats e extra-renais, incluindo glomerulonefrites, pielonefme, obstrução do
volume de sangue - hipovolemia. Entre as causa renais,
traro urinário, substâncias nefroróxicas, lesões renais is-
renal isquêmica, nefrotóxica, por substâncias químicas
destaca-se a necrose tubular aguda resultante de lesão
e lúpus
(antibióticos, contrastes radiográficos, metais, solven-
eritemawso sistémico, podem evoluir para tnsuficiência
tes, etc.), e lesão secundária à excreção excessiva de
renal crónica, devido à destruição de nefrons por mecanismos fisiopatológicos diversos.
hemoglobina, mioglobina e proteína de Bence-)ones. Já na insuficiência pós-renal, estão implicados os fatores
quêmtcas, diabetes meltw, htpertensão arterial
relacionados à obstrução das vias urinárias, tais como: Quadro 35.17- Alterações labora toriais da insuficiência renal crôn1ca
cálculos. trombos, tumores, fibrose reuoperitoneal e procedimencos iacrogênicos.
Exame de urina de rotina Densidade: :1 ,010 e fixo Cilindros céreos Cilindros largos Dosagem de creatinina (soro/plasma) Aumentado Dosagem de uréia (soro/plasma) Aumentado Taxa de Filtração Glomerular (Depuração de Creatinina/ Estimativa por equação) <60 ml/min/1 73m 2 (~3 meses) Outros Exames Dosagem de ácido úrico (soro): nioeruricemio Dosagem de cá1c1o (sorol: hipocolcemio Dosagem de fósforo (soro): hiperfosfotemio Dosagem de magnésio (soro) hipermognesemio Dosagem de potássio (sorol: hipo ou hiperpotossemio Dosagem de sódio (soro) h.po ou hipernmemio Hemogromo. anemio Gosometrio (sangue arterial) ocidose meiobólico Dosagem de porotormôn'o (soro). aumentado
NA INSUFICIÊNCIA RENAL AGUDA
A msuficiência renal aguda é caracterizada pelo declínio abrupto da função renal. com redução da taxa de
Quadro 35.18- AIH.'rações laborarona1s da msuficiência renal aguda Exame de urina de rotina Densidade :1 010 e f:xo Cilindros hdinos Cilindros epiteliois Cilindros granulosos Células epitelioís {renal) Dosagem de creatinina (soro/ plasma) Aumentado Dosagem de uréia (soro/plasma) Aumentado Taxa de Filtração Glomerular (Depuração de Creatinina/Estimotiva por equação) <60 ml/min/1,73m2 (<3 meses) Outros Exames Dosagem de cálcio !soro): h1pocolcem1o Dosagem de fósforo {soro). hiperfosfotemio Dosagem de magnésio (sorol: hipermognesemio Dosagem de potássio (soro): hiperpotossemio Dosagem de sódio (soro): hiponolremi:J Gosometrio (sangue arterial): ocidose rrelobólico
NA SÍNDROME NEFRÓTICA
filtração glomerular e conseqüente retenção progressiva de uréia e creatinina no sangue e redução do volume urinário (Quadro 35.18). De acordo com os mecanismos
A síndrome nefrótica está relaoonada a nefropattas
fisiopacológicos envolvidos, a insuficiência renal aguda
que cursam com lesões glomerulares que resultam em
466 ( Medicina laboratorial para o clínico
aumento excessivo da permeabilidade da membrana basal às proteínas plasmáticas. Assim, caracteriza-se pela presença de proteinúria igual ou maior que 3.5 g/24 horas. A proteinúria maciça ultrapassa a capacidade de síntese hepática resulrando em hipoalbuminem ia. A conseqüente redução da pressão oncótica do plasma leva ao edema, contração do compartimento vascular e aumento da secreção de aldosterona que, em conjunto, podem reduzir a taxa de filrração glomerular. esse caso pode haver retenção de creatinina e uréia no sangue. A alteração da permeabilidade dos capilares glomerulares manifesta-se também para as lipoprmeínas, resultando em lipidúria. As principais alterações laboracoriais encontradas na síndrome nefrótica são apresentadas no Quadro 35.19. É Importante lembrar que. dependendo da nefropatia de base, a síndrome nefrótica pode ter caráter transitório ou ter, ainda, suas características clínicas e laboratoriais modificadas pela concomitância de uma das outras grandes síndromes renais. Quadro 35.19 - Alterações laborator1a1s da síndrome nefrócica Exame de urina de rotina Aspecto turvo Pesquiso de proteínas: positivo Ci 'noras h!Oiinos Cilindros granulosos Cil;ndros graxas Corpos groxos ovalados Gotículas de lípides
Proteinúria de 24 horas
NA SÍNDROME NEFRÍTICA
A síndrome nefrítica é secundária a acometimento glomerular (glomerulonefrite) difuso e manifesta-se pelo aparecimento súbito de oligúria, hematúria micro ou macroscópica, proteinúria e redução da caxa de filcração glomerular. resultando em hipertensão, edema e retenção de uréia e creatinina no sangue. A presença dessas alterações e sua Intensidade dependem da extensão da lesão glomerular. As alterações laborarona1s características da síndrome nefrítica encontram-se no Quadro 35.20. Diferentes doenças, com etiologias diversas manifestam-se como síndrome nefrítica e podem, portamo. apresentar prognóstico e tratamento distintos. Assim, é importante, posteriormente ao diagnóstico sindrôm1co. estabelecer ou definir a doença. especificamente a doença de base, util izando outros exames complementares. Quadro 35.20 - Alrerações laboracona1s da síndrome nefrír1ca Exame de urina de rotina Cor amarela escuro ou avermelhada Aspecto turvo Densidade: elevado Pesquisa de sangue: positivo Pesquiso de proteína: positiva Hemôcios [>2/compo de maior aumento) Cilindros erilrocilônos Corpos graxas ovalados (raros)
Pesquisa de dismorfismo eritrocitário Positiva
Proteinúria de 24 horas
~3. 5 g/24 h (ou ~50 mg/kg/24 h)
<3.5 g/24 h (ou <50 mg/kg/24 h)
Dosagem de creotinina (soro/plasma)
Dosagem de creatinina (soro/plasma)
Dentro do faixo de referência ou aumentado
Aumentado
Dosagem de uréia (soro/ plasma} Dosagem de uréia (soro/plasma) Dentro da faixo de referência ou aumentado
Taxa de Filtração Glomerular (Depuração de Creatinina/ Estimativa por equação) Dentro do fa xa de referência ou diminuído
Outros Exames Dosagem de albumino (soro): hipoolbuminemio Dosagem de triglicérides (sarai: hipertrigliceridemio Dosagem de colesterol total (sora):hipercaleslerolemio
Aumentado
Taxa de filtração glomerular (Depuração de Creatinina/ Estimativa por equação) Diminuído
Outros Exames Dosagem de Complemento C3 (soro(· diminuído~ Atividode hemolilico total do complemento- CH50 (soro(. diminuída· Anticorpos contra ontígenos esheptocócicos - ontiestreptolisino O, onti-hioluronidose, ontidesoxirribonucleose-B (soro(: titulas aumentados* · Em pac e'1tes com glome•ulone1r te aguda ~- ~,treptocÓ< ca
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal
467
CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS 1.
Nas doenças renais, os exames laboratoriais são importantes ferramentas, uma vez que a maioria delas é assintomática ou oligossintomática até que se tenha lesão significativa do tecido renal. O exame de urina de rocina. a dosagem sérica ou plasmática de creatinina e a pesquisa de microalbuminúria permitem o diagnóstico precoce de nefropatias bastante prevalentes, como a diabética e a hipertensiva. A avaliação da taxa de filtração glomerular. seja através da depuração de creatinina ou do uso de fórm ulas, são fundamentais para demonstrar a perda da função excretora renal. A proceinúria de 24 horas permite quantificar a concentração de proteínas na urina, que quando aumentada é provavelmente o achado isolado mais sugestivo de doença renal. Além disso, os exames laboratoriais são úteis no acompanhamento da progressão da doença renal. Este capítulo apresenta os principais exames laboratoriais utilizados para a avaliação laboratorial das principais síndromes renais, abordando seu significado clínico, variabilidade, limitações e valores de referência.
468 [ Medicina laborator ial para o clín ico
2.
European Confederation of Laborarory Medicine - European Urinalysis Group. European Urinalysis Gu1delines. Scand J Chn Lab lnvesr. 2000;60:1-96. Fuller CE. Threatte GA. Henry JB. Basic Examination of Urine. ln: Henry JB ediror. Clin ical and Diagnosis Manage-
menr by Laboratory Methods. 20th ed. Philadelphia: W. 3.
B. Saunders; 2001 . p. 367-402. Karalliedde J, Viberti G. Microalbuminuria and cardiovas-
cular risk. Am J Hypertens. 2004;17:986-93. Lamb E. Newman DJ. Kidney Function Tests. ln: Burtis CA, Ashwood ER. Bruns DE edirors. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostic. 4[h ed. Sr. Louis: Elsevier Saunders; 2006. p. 797-835. S. Marre M . Microalbuminuria an d prevemion o f renal insufficiency and cardiovascular diseases. Am J Hypertens. 1998;1 1:884 -6. 6. Mogensen CE, Keane W F, Bennett PH, jeruns G, Parving HH, Passa P, et ai. Prevemion of diabetic renal disease with special reference to microalbum inuria. Lancer. 1995;346:1080-4. 7. Mogensen CE. Microalbum inuria and hypertension with focus on type 1 and type 2 d iabetes. J lmern Med. 2003;254:45-66. 8. National Com mitee for Clinical Laborarory Standards. Urinalys1s and Collection, Transportat ion, and Preservation of Urine Specimens. Approved Gu ideline. Disponível em: http://www.clsi.org/source/orders/free /gp16-a2.pdf. 9. National Kidney Foundation. K/DOQI Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease: Evaluation, Classification. and Stratification. Am J Kidney Dis. 2002;39:51266. D isponível em: http://www.kidney.org/professionals/ kdoq i/guidelines_ckd/ p1_exec.htm. 10. Ringsrud KM, Linné JJ. Urinalysis and body fluids: a colortext and atlas. Sr. Louis: Mosby; 1995. 11. Vasconcellos LS, Penido MGMG, V1digal PG. Importância do dismor fismo eritrocitário na investigação da origem da hematúria: revisão da literatu ra. J Bras Paro I Med Lab. 2005;41(2):119-30. 4.
36
Eduardo Pimentel Dias Márcio Weissheim er Lauria Maria Marta Sarquis Soares Pedro Guatimosim Vidigal
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO DIABETES MELITO E OUTRAS CATEGORIAS DE DISTÚRBIOS NA HOMEOSTASE GLICÊMICA
Os disrúrb1os do merabol1smo glicêm1co caracterrzados bioquimicamente por h1perghcem1a, se considerados em conjunto: diabetes mehto (DM); intolerância à glicose, 1mpaired glucose tolerance (IGT); intolerância à glicose em jejum, rmpaired fastmg glucose (IFG) e resistência à insulina (RI), representam um dos distúrbios metabólicos mars prevalenres em codos os países do mundo ocidental c são considerados um problema de saúde pública. O seu diagnóstico adequado e precoce permite intervenções terapêuticas que previnem as complicações crônicas que são a maior causa de morbimortalidade dos pacientes por eles afetados.
FISIOLOGIA DO CONTROLE GLICÊMICO
O sistema nervoso central (SNC) depende de fluxo contínuo e adeq uado de glrcose para seu funcionamentO. Assim sendo. um complexo sistema de controle neural, hormonal e celular age de maneira sinérgica. com a finalidade de manter os níveis glicêmicos em uma faixa estreita durante toda a vida. O grau de complexidade desse sistema pode ser deduzido a partir da análise de alguns dados fisrológicos: • existe um pool (reserva) de glicose no compartimento extracelular relativamente pequeno (aproximadamente 15 a 20 g no adulto); • o turn over (produção e consumo) de glicose no período de jejum é de aproximadamente 150mg/ minuto (1,6 -2,6 mg/Kg/minuto);
• após uma refeição padrão ocorre ac réscimo ao pool de aproximadamente 10 vezes o seu volume (150 a 200 g). Torna-se. portanto, claro que a manutenção dos níve1s gl rcêm1cos dentro de uma faixa fisrológica ex1ge a Integridade c inreração de codos os componentes do sistema.
REGULAÇÃO DA GLICEMIA PÓS-ALI MENTAR No período pós-alimentar imediato, a manutenção da glicemia em níveis fisiológicos depende da velocidade de absorção da glicose e da integridade dos mecan ismos de transferência para o espaço intracelular (disponibilização Intracelular) da mesma. Em relação à velocrdade de absorção. são im portantes o tipo de carbordrato rngerrdo, a velocidade de trânsito estômago-duodeno e a presença de alimentos que retardem a sua absorção, como, por exemplo. as f1bras. Quanto à eficiência na disponrbihzação da carga de glicose, são fundamentais a presença de tecidos aptos a recebê-la (fígado. músculo e tecido adiposo) e o perfeito funcionamento dos mecanismos endócrr nos. A hiperglicemia resultante da absorção intestinal de glicose estimula a secreção de insulina, que age para restaurar a normoglicemia por três vias: • diminuindo a produção hepática de glicose. a partir da redução da glicogenólise e gliconeogênese;
• aumentando a captação de glicose pelo músculo e tecido adiposo, translocando os transportadores de glicose do moplasma para a membrana celular; • por sua ação amdipolítica e annproreolítica, diminuindo a oferta de subsuaco gliconeogenético para o fígado. Adicionalmente, a insulina inibe a síntese de glucagon pela célula a pancreática. A sincronia entre absorção e disponibilização intracelular deve garamir que a glicose plasmáCica não exceda a concentração de 150mg/dl em torno dos 30 a 90 minutos e que retome progressivamente ao normal (70-110 mg/dl) entre 120 e 180 minucos (acualmente a American Diabetes Association - ADA - recomenda a adoção dos valores 70-99mg/dl como normais). Fenômeno fisiológico freqüente no período pósalimentar é a queda transitória, assimomática, da glicose plasmática a níveis inferiores aos de jejum (às vezes, até 45-50 mg/dl). Essa queda fisiológica da glicemia é indispensável para que a insulinemia recorne ao nível basal (10 a 20 ~UI/ml), o que permite a ação glicogenolítica do glucagon e o início da produção endógena de glicose. O desconhecimento desse fenômeno, denominado por Hofeteld de cransitional low glucose, é a maior CilU~il cio diagnóstico erróneo de h1poglicemia. Esses níveis glicêmicos não se acompanham de secreção de hormônios h1perglicem1antes (glucagon e catecolaminas), nem de sintomas próprios à h1pogilcemia, o que afasta o seu diagnóstiCO.
MANUTENÇÃO DA GLICEMIA NO JEJUM A resposta normal ao jejum pode ser dividida em três fases que se sucedem de maneira ordenada e comínua: l a fase pós-absortiva (6-12 horas após a última ingestão de alimenco); 2. jejum curm (12-72 horas); 3. jejum prolongado (após 72 horas). Fase pós-absortiva: Nessa fase a glicemia é mantida basicameme pela mobilização das reservas hepáticas de glicogênio (glicogenólise), que é desencadeada pela redução dos níveis plasmáticos de insulina à faixa de 10-20 ~UI/ml, o que permite a ação glicogenolítica do glucagon. Após um período de jejum noturno, aproximadameme 50 a 70% da produção da glicose é derivada da
470
Medicina laboratorial para o clínico
glicogenólise. Como as reservas hepáticas de glicogên io, nesse mamemo, sicuam-se em mrno de 80g e o consumo de glicose é de aproximadamente 150 mg/min (125 mg para o sistema nervoso central e 25mg para outros tecidos dependentes de glicose), o prolongamento do jejum resulta em depleção progressiva desses esmques e dentro das primeiras 24 horas novos mecanismos adaptativos são necessários para a manutenção da glicemia. Fase de jejum curto: nessa fase, a glicemia é mamida primariamente pela gliconeogênese, sendo que após 48 horas esta é responsável por praticamente 100% da produção endógena de glicose. Durame esse período, está aumentada a proteólise, com mobilização de alanina muscular, submam básico da gliconeogênese. A lipólise encomra-se também ativada, o que fornece substrato metabólico para a gliconeogênese (glicerol) e energético (ác1dos graxas livres) para o trabalho muscular. Para que isso ocorra, a redução adiCional dos níveis de 1nsulina plasmática (mfenor a 10 J.1UI/ml) faz-se necessária, já que a 111Suilna tem ações antílipolít1cas e antiproteolíticas. A redução na concemração de insulina limita também a captação de glicose pelos tecidos insulino-dependemes e permite a sua utilização, principalmente pelos tecidos insulino-1ndependemes (SNC. células sanguíneas). Fase de jejum prolongado: Nessa fase deve haver compatibilização entre a manutenção da glicemia e a preservação dos esmques de proteína corporal. Para que essa compatibilização ocorra, há necessidade de redução na gliconeogênese, o que só é possível com redução paralela na utilização de glicose pelo SNC. Esse objetivo é alcançado com a utilização, pelo SNC de corpos cetônicos como fonte energética. O sinal determinante para essa utilização parece ser a própria elevação na concentração arterial dos corpos cetônicos.
DIABETES MEUTO (DM) EOUTROS DISTÚRBIOS DA HOMEOSTASE GUCÊMICA O termo diabetes melito (DM) aplica-se a um grupo de distúrbios metabólicos, de etiologia múltipla, que se caracterizam bioquimicameme por h1pergl1cemia crônica e clinicamente pelo desenvolvimento de complicações microvasculares (microang1opat1a diabética), complicações estas relacionadas ao grau e duração da hiperglicemia. Além da microangiopat1a, o
DM agrava e acelera o processo ateroesclerótico (macroangiopatia diabética).
CLASSIFICAÇÃO A denomi nação DM tipo 1 aplica-se à doença caracterizada por destruição das células ~das ilhotas pancreáticas, com deficiência grave na secreção de insulina, sendo em 95% das vezes causada por auto-imunidade c 5% por causas não idemificadas (idiopáticas). Os pacientes geralmente são propensos à cetoacidose e requerem tratamento com insulina. O DM tipo 2. forma mais prevalente de diabetes. é uma doença heterogénea. relacionando-se ma1s freqüentemente a defeitos na ação da insulina, à qual se segue a disfunção da célula ~· Alguns outros raros tipos de DM. geralmente causados por defeitos monogênicos. ramo na ação da 1nsul1na como na função da célula Bou por doenças primánas do pâncreas exócrino ou. ainda. Induzidos por drogas ou outras endocnnopatias, foram classificados como "outros t1pos específicos". Manteve-se o grupo DM gesracional (Quadro 36.1).
Quadro 36.1 - Class1f1cação etiológica do diabetes rnelito Tipo 1
Essa classificação, a mais utilizada arualmeme. ainda apresema algumas dificuldades. como o diabético tipo 2. que requer o uso de insulina para controle metabólico sarisfatóno. Existem também pacientes que não se enquadram bem nessa diferenciação entre tipo 1 e 2. Há algum tempo já vem sido sugerida a inclusão de outros tipos de diabetes (por exemplo, diabetes tipo 3. diabetes tipo 1 e Y2. etc.). visando à melhor classificação destes pacientes. Todavia, até o presente momento não há consenso que permita adorá-los.
EVOLUÇÃO NO DIAGNÓSTICO DO DM Dois faros rornam complexa a tarefa de se selecionar um nível de hiperglicemia que defi na o DM: a) a distribuição dos valores glicêmicos é unimodal na maioria das popu lações. e b) o longo intervalo de tempo entre a instalação da hiperglicemia e o aparecimento da microangiopatia. que caracteriza do ponto de vista anatomopatológico o DM. Refletindo essas drfrculdades, até 1979. pelo menos cinco cnrérios distimos eram utilizados para se estabelecer o diagnóstico de DM. Em 1979. o National Diabetes Data Group (NDDG). patrocinado pelo National lnsutute of Hea/th (NIH). estabeleceu critérios para serem adorados nos Estados Unidos. Um ano depois a Organização Mund1al de Saúde (OMS). recomendou a adoçào desses cnrérios com modificações que os tornavam mais simples (Quadro 36.2).
Tipo 2
Outros tipos específicos: Defeitos genéticos no função do célula Defettos genéticos no oçõo do insulina Doença do põncreos exócrino Endocrinopolios Induzido por drogas ou agentes químicos Infecções Formos incomuns de DM imunomediodo Ou•ros síndromes genéticos associados ao DM diabetes melito gestacional
Quadro 36.2 - D1agnós(lco de diabetes meliro (Natlonal Dwbetes Data Group. 1979/ Organização Mundial de Saúde. 1980) Glicemio jejum < 110 mg/dl1 e Glicem1o após sobrega1ga padronizado de glicose on1dro ' 2 < 140 mg/dl Diabéticos Glicem1a jejum> 140 mg/dl ou Glicemro após sobregargo padronizado de glicose anidro > 200 mg/dl Glicemia após sooregorga padronizado de g 1cose on,dro'lll > 140 < 200 mg/ dl Normais
'Para transformar mg/dl ~m mmol/l d1v1dtrpor 18 '120 mtnucos após 75g de glicose antdra(82.5 gde Dexuosol®) via oral solução 25% \molerâncta à glicose
Os cricérios consranres no Quadro 36.2 basearam-se no desenvolvimento de retinopacia em indivíduos pre-
Investigação laboratorial do diabetes meliro e ourras categorias de distúrbios na horneostase glicêrnica
471
viameme subme[idos ao [eS[e oral de wlerância à glicose (TOTG), seguidos por um prazo que variou entre três e oiro anos. À época, propôs-se a classificação de impaired tolerance test (ITT) - teste de rolerância prejudicado ou impaired glucose tolerance (IGT), literalmente traduzido por intolerância à glicose, para aq ueles pacientes que apresentam glicemia em jejum inferior a 140 mg/dl e duas horas após sobrecarga com glicose (usualmente, dextrosol®) superior a 140 mg/dl e inferior a 200 mg/ dL. Escudos prospectivas mostraram que esses grupos de pacientes encontravam-se em risco mais alto de desenvolvimento de DM e doença coronariana. Em relação a esse critério, que prevaleceu entre 1979 e 1997, vários estudos vieram mostrar que apenas um percentual variando entre 25 e 50% daqueles que preenchiam o critério diagnóstico de glicemia duas horas após sobrecarga de glicose superior a 200 mg/dl satisfazia o critério diagnóstico se lhes fosse solicitada a gl icemia em jejum (maior ou igual a 140 mg/dl ); ou seja, esses valores em jejum e duas horas após glicose identificariam duas populações distintas. Em 1997, o Comitê de Experts no Diagnóstico e Classificação do DM, criado pela American Diabetes Association (ADA) com a fi nalidade de rever o diagnóstico e classificação do DM, publicou um relatório em que propunha novos critérios para o diagnóstico e classificação da doença. Esses novos critérios procuravam corrigir essa discrepância e visavam a obter aproximadamente a mesma prevalência de DM. independentemente de se utilizar a glicemia em jejum ou a curva de rolerância à glicose. de tal maneira que ambos os critérios passassem a prever prognósticos idênticos. O valor de corte para o diagnóstico de DM para glicemia em jejum foi reduzido para 126 mg/dL. o que corresponde a exaros 7 mmoi/L se utilizar-se a unidade internacional. Foi mantido o valor de corte de 200 mg/dl para glicemia determinada duas horas após sobrecarga de glicose (Quadro 36.3). Como respaldo aos novos critérios. foram citados três estudos que procuraram correlacionar a glicemia em jejum com a prevalência de retinopatia diabética, desenvolvidos em etnias distintas. como os índios Pi ma. Egípcios e em população participante do projero Nacional Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III). A Associação Latino-Americana de Diabetes (ALAD) recomendou a adoção desses mesmos critérios em toda a América Latina.
Quadro 36.3 - Diagnóstico do diabetes melito (American Dwbetes Associat10n- Comitê de Experts. 1997) Glicemia ao acaso > 200 mg/dL + sintomas clássicos Poliúrio - Polid ipsio - Polifogio - E'T"Iogrecimento ou Glicemio em jejum (8 horas) > 126 mg/dl? ou G licemio após Sobregorgo padronizado de glicose onidra®1 > 200 mg/dl2 120m1nuwsapós 75g de glicose anidra (82.5 gde Dexuosol®,v1a oral soluçãoà 25%) e'T"I moi/L div1d1r por 18.
2duasdecerminações. Para transformar mg/dl
Em 2003. o mesmo Comitê recomendou a adoção de 100 mg/dl como valor de corte entre indivíduos normais e aqueles com intolerância à glicose em jejum, mantendo, entretanro, inalterado o valor de 126 mg/dl (7 mmoi/L) para o diagnóstico de DM. Novamente, a justificativa foi a busca de um valor de glicem ia de jejum que mais se correlacionasse com a glicemia após sobregarga de glicose anidra e que permi tisse a adoção da glicemia de jejum como mérodo eficaz de rastreamento de indivíduos com alterações no metabolismo glicêmico. Obviamente. à medida que se dim1nui o valor de corte da glicemia de jejum, sua sensibilidade como teste de rastreamento aumenta, mas também eleva o número de falso-positivos. Importante ressalta r que o novo limite de normalidade recomendado pela ADA (70-99 mg/dl) ainda não está universalmente aceiro, incl usive pela Sociedade Brasileira de Diabetes.
RECOMENDAÇÕES ATUAIS PARA O DIAGNÓSTICO DO DM No relatório do Comitê de Experts estabeleceramse critérios para a solicitação de glicemia em jejum (Quadro 36.4), que passou a ser considerada o padrão ouro para o diagnóstico de DM. Na ausência de sintomatologia clínica, uma primeira dosagem deve ser confirmada posteriormente. Em relação ao TOTG, desencoraja-se o seu uso ronnelro, entretanto, recomenda-se que todos os pacientes que apresentem glicemia em jejum superior a 100 mg/dl e inferior a 126 mg/dL (atualmenre classificados na categoria de intolerância à glicose em jejum) sejam submetidos ao TOTG e ten ham o seu distúrbio do metabolismo glicídico classificado de acordo com o resultado desse teste.
472 ( M edicina laborarorial para o clínico 1 ) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - -- - -
Quadro 36.4 - Indicações de solicitação de glicemias em jejum (Amencan D~abetes Association - 1979. modtficado)
Quadro 36.6- Preparo do paciente para teste oral de tolerância à glicose (Organtzação Mundial de Saúde - modificado)
A cada três anos o partir dos 45 anos
Je1um de 8 · 14 horas !libero-se águo)
Anual e mo is precoce se houver os fatores de risco abaixo
Dieta com pelo menos 150g de corboidrotos · três dias antes
IMC > 27 Kg/m 2 ou obesidade obdomtnal
Atividode físico usual nos dias anteriores
Parentesco de 1° grau com diabéticos
Ausência de doenças agudos concomitantes
Antecedentes obstétricos compatíveis com DMG
Suspensão prév10 de drogas h1perglicem1ontes
Coronoriopotia antes de 50 anos
Repouso e abstenção de fumo durante o teste
rlipertensõo arterial Triglicérides > 145 mg/ dl associado oo cHDL< 35 mg/dl IGT ou IFG em exame prévio
É impo rtante ressaltar que. para determinados grupos de pacientes, cujo risco de diabetes é aumentado, recomenda-se a realização rotineira do teste de sobrecarga oral com glicose anidra padroni zada, mesm o com valores de glicemia de jejum inferiores a 100 mg/dl (Quadro 36.5). Ao solicitar o TOTG,
Quadro 36.7 - Padrontzação para reste oral de colerâneta à gltcose (TOTG) (Organtzação Mundial de Saúde) Realizar glicemia em jejum de 8 o 14 h Ingestão de solução aquoso o 25% de gl1cose omdro 1 Adulros 75g de gkose onidro 2 Crianças: l .75g de glicose anidro/Kg de peso !máximo de 75g) Glicemto 120 minutos após ingesrõo do glicose on1dro
é indispensável padronizar o
procedimento dtagnóst ico de acordo com as normas da OM S (Q uadros 36.6 e 36.7).
Quadro 36.5 - Indicações para o uso rorineiro do teste de sobrecarga oral com sobregarga padronizada de glicose antdra como rascreamenco para diabetes melito
1 Asolução deve ser 1ngenda em Intervalo de tempo 1gual a c1nco m1nutos. 27Sg de glicose antdra = 82.5 g de Dextrosol®
OUTRAS CATEGORIAS DE DISTÚRBIO NA HOMEOSTASE GUCÊMICA
Em 1979, o NDDG classificou os TOTG que apre-
Glicemio em jejum superior ou igual o l OOmg/dL e infelior o l?ómg/dl
sentassem a glicemia duas horas após sobrecarga de
Diagnóstico de síndrome metabólico
glicose superio r a 140 mg/d l
Portadores de síndrome de Cushing e ocromegol1a
como
e inferio r a 200 mg/dl imparred glucose tolerance (IGT). usualmente
traduzido como intolerância a à glicose. O seguimento
Diagnóstico de síndrome dos ovários policíst1cos
desses pacientes revelou maior prevalência de OM e de
Portadores do síndrome do opnéio do sono
doença coronariana. No relatório de 1997, o Comitê recomendou o uso
Usuários crónicos de corticóides, imunossupressores e onti· retrovirois Poctentes com históno familiar fortemente positivo pata DM
da sigla IFG -
impaired fasting glucose (usualmente à glicose em jejum) para
traduzido por intolerância
enquadrar os valo res de glicemia em jejum que se enPresença de o co nlosis nigricons
contrem no intervalo de 110 a 125 mg/d l . Os estudos
Históno pregresso de d obetes gestooonol ou dioberes indu· zido por corticódes
prospectivas realizados desde então. em relação ao significado da categoria da IFG. foram apresentados no 36° Encontro Anual da Associação Européia para
Investigação laboratorial do diabetes melito e ou tras categorias de distúrbios na homeostase glicêmica
473
o Estudo do Diabetes e foram resumidos pelo professor Sir George Alberti, Presidente da Federação Internacional de Diabetes: • embora a nova categoria intolerância à glicose em jejum (I FG) amplie e melhore a descrição da alteração no metabolismo glicídico, ela deve ser vista como complementar e não como substituta do grupo intolerância à glicose (IGT); • IGT, mas não IFG, está associada a risco aumentado de doença cardiovascular; • IFG pode resultar de disfunção da célula beta, enquanto IGT está associado à hiperinsulinem ia/ resistência à insulina, sugerindo etiologias diferences para esses estados de distúrbio no metabolismo glicêmico; • o que é desconhecido é se o tratamento da IGT ou IFG, especificamente, pode retardar ou prevenir o aparecimento de doença macrovascular. Entretanto, retardar o início de diabetes nessa população de risco irá beneficiá-la em termos de morbidade e mortalidade. Pode, então, ser prudente tratar esses indivíduos pelo menos com aconselhamento quanto ao estilo de vida ou com agentes hipoglicemiames com segurança comprovada, enquanto acumulam-se informações adicionais; • a partir de 2005, a ADA passou a adorar a denominação de pré-diabetes para as duas categorias de alceração da homeostase glicêmica: IGT e IFG.
Considerações pré-analíticas
A amostra de sangue deve ser colhida pela manhã, após jejum de pelo menos oito horas (não ultrapassando 14 horas). Escudos recentes demonstraram que há variação diurna significativa da glicemia de jejum. A glicemia de jejum média é maior pela manhã do que à tarde, indicando a possibilidade de não se fazer o diagnóstico de pacientes avaliados no período da tarde. A concentração de glicose no sangue total ex vivo reduz-se com o tempo devido à glicólise. Assim, o plasma deve ser separado das células sanguíneas dent ro de 60 minutos após a coleta ou, se isto não for possível, a amostra de sangue deve ser coletada utilizando-se um agente capaz de minimizar a glicólise, como o fluoreto de sódio. A taxa de glicólise média é de 5 a 7% por hora, podendo variar dependendo de fatores tais como: concentração de glicose e número de leucócitos presentes na amostra e temperatura. Na presença do fluoreto de sódio, a partir de uma hora, a concentração de glicose na amostra permanece estável por 72 horas à temperatura ambiente. A glicose pode ser medida no plasma, soro ou sangue total venoso, sendo o plasma o material mais recomendado para o diagnóstico. Devido à diferença na concentração de água entre o plasma e o sangue total, a concentração de glicose no plasma é cerca de 11% maior que no sangue total, se o hematócrito está dentro dos valores de referência. A glicemia capilar determinada em sangue colhido por punção digital com utilização de glicosímetros não deve ser utilizada para o diagnóstico, rendo o seu uso limitado para controle domiciliar do tratamento.
ASPECTOS LABORATORIAIS DO DIAGNÓSTICO DODM Considerações analít icas
DOSAGEM DE GLI COSE O diagnóstico do DM é estabelecido exclusivamente a parri r da constatação laboratorial da hiperglicemia, ou seja, aumento da concentração de glicose no plasma sangüíneo. Esse aumento pode ser observado tanto em amostra colhida com o paciente em jej um (glicemia de jejum), quanto em amostra colh ida após ele ser submetido a uma sobrecarga oral com quantidade padrão de glicose (TOTG). Portamo, a qualidade da dosagem de glicose é fundamental para o diagnóstico adequado do DM.
474 ( Medicina laboratorial para o clínico
A concentração de glicose plasmática é determinada quase que exclusivamente por ensaios colorimétricos enzimáticos, como os métodos da glicose oxidase e da hexoquinase. Esses métodos apresentam desempenho satisfatório, permitindo medição precisa e exata da glicemia. A avaliação de programas de proficiência para laboratórios clínicos e outros estudos têm mostrado que a variabilidade analítica dos métodos enzimáticos é substancialmente menor do que a variabilidade biológica da glicose plasmática: entre pessoas sadias, a variabilidade incra-individual é de aproximadamente 5,7% e a inter-individual é de 6,9%.
Considerando a variação biológica, os mécodos de dosagem de glicose deverão apresentar as seguintes especificações da qualidade analítica: coeficiente de variação (1mprecisão) ~ 2,9%, erro sistemático (bias) ~ 2,2% e erro coral ~ 6,9%. Substâncias presentes na amostra podem interferir na dosagem de glicose, levando a resultados incorrecos. Hemólise, hiperbilirrubinemia e lipemia podem levar a resultados de glicemia falsamente elevados quando medidos com os mécodos enzimáticos. Além disso, a determmação da glicemia pelo mérodo da glicose oxidase sofre inrerferência de ácido ascórbico (vitamina C) e de hiperuricemia.
TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA À GLICOSE A utilização rorineira do TOTG não é recomendada para o diagnóstico do DM tipo 1 ou 2. Alguns estudos têm indicado que a glicemia de jejum é capaz de idennflcar a mesma prevalência de alterações do metabolismo de glicose na população que o TOTG. Além d1sso, esse teste apresema procedimenro complexo, limitando ~e u uso na prática clínica No enranco, dados epidemiológicos recentes indicam maior correlação da hiperglicemia pós-sobrecarga com a morbidade cardiovascular, sendo possível que em futuro próximo a determinação da glicemia pós-sobrecarga se corne rorina em pacientes portadores de ouuos fatores de risco cardiovasculares (ver Síndrome Metabólica). A ADA e a OMS conrinuam a recomendar a utilização do TOTG como mérodo diagnóstico para o DM gestacional, já que esta parece ser mais sensível do que a glicemia de jejum em gestantes, nas qua1s o consumo fetal de glicose dura me o período de Jejum noturno reduz o nível plasmátiCO da glicemia em jejum. O diagnóstico e rratamemo do DM gestacional são essenciais para prevenir morbidade e mortalidade perinatal associadas.
Considerações analíticas
O TOTG deve ser realizado conforme as recomendações da OMS apresencada nos quadros 36.6 e 36.7. Atualmence, não se recomenda a extensão do reste com dosagens de glicose em amostras colh1das em imervalos
superiores a 120 minutos. Em relação à determinação da glicemia pós-prandial, esta só deve ser utilizada para acompanhamemo do uaramemo do paciente já diagnosticado, já que a sobrecarga de glicose é variada, ramo na quanndade quanto na veloodade de absorção, d1ferememence do TOTG, que usa sobrecarga padrão equivalente a 75 g de glicose anidra no adulco ou 1,75 g/kg de peso na criança. É importame ressaltar que alguns estudos têm demonstrado que a reprodutibilidade do TOTG em classificar os pacientes varia entre 50 e 66%. Farores que parecem estar implicados nessa ba1xa reprodutibilidade incluem variação biológica da concemração plasmática de glicose, efeiros d1versos da adm1nisrração de solução de glicose hiperosmolar no esvaziamento gástrico e temperatura do ambieme. O desempenho dos ensaios para dosagem de glicose não está implicado nesse comexro, desde que sejam consideradas as especificações da qualidade analítica desejadas.
PERSPECTIVAS FUTURAS NO DIAGNÓSTICO DEDM
Como já foi salientado, o diagnóstiCO de DM continua sendo um desafio. Os novos critérios (ADA 1997 e 2003) aumentam a prevalência da doença. Em artigo receme publicado no The EndocrinologJst, Mayer B. Davidson, membro do Comitê de Expem que elaborou esses critérios, man1fesrou sua preocupação com esse aumenro. "Determinar o nível diagnóstico órimo de glicemia depende de um balanço entre os custos médico, social e económico de se fazer um diagnóstico em quem não está verdadeiramente em risco substancial de sofrer efeiros adversos do DM e aquele de não fazer o diagnóstico em quem esteja em risco". No futuro, mais ênfase deverá ser dada aos denominados "produtos finais de glicosilação," que parecem estar mais direramente relaoonados à erioparogenia das lesões crónicas do DM. Talvez o ma1or avanço no diagnóstico de DM renha sido a iniciativa de se unificarem os critérios diagnósticos. Isso tornou possível a análise de rodos os dados obtidos nas inúmeras pesquisas mundiais em relação à doença. A perspectiva histórica de como e por que uma doença tão amiga tenha os seus critérios diagnósticos modificados é indispensável para que não se perca de vista a importância de se manter a coerência e a objerividade desses cmérios.
Investigação laboratorial do diabetes meliro e outras categorias de di st úrbios na ho meostase glicêmica
475
DOSAGEM DE AUTO~ANTICORPOS A pesquisa de auto-anticorpos dirigidos contra componentes da célula Bpancreática pode ser útil na identificação do tipo de diabetes que o paciente apresenta. Vale ressaltar que esses auto-anticorpos são marcadores do processo auto-Imune e não agentes pacogênicos conhecidos. Estão presentes em cerca de 70 a 80% dos pacientes diabéticos tipo 1 logo após o diagnóstico, mas tendem a desaparecer após dois a três anos de duração da doença. Podem ser úteis também na identificação de pacientes com diabetes de origem auto-imune de instalação insidiosa, denominado LADA (Latent Aut01mmune Diabetes m Adults). Os pacientes com LADA têm a idade média em torno dos 50 anos e, por esse motivo, são inioalmente classificados de forma errônea como tipo 2. Esses pacientes evoluem precocemente para a terapia com insulina. As determinações de autO-anticorpos usualmente disponíveis são: anticorpos antiilhota (antiiCA). antiinsulina (antiiAA), antidescarboxilase do ácido glutâm1co (antiGAD) e ti rosina fosfatase (antiiA2). Os ICAs são anticorpos policlonais do tipo lgG que reagem com codos os componentes das ilhotas e o antiGA O e o IA2 são subfrações do ICA. O anticorpo antiGAD parece ser o exame de escolha para confirmar o diagnóstico do diabetes tipo 1 auro-imune. Os anticorpos antiinsulina (IAA) são os únicos específicos da célula beta, mas devem ser medidos antes de se in1c1ar o tratamento com insulina. Na maioria dos pacientes, a dosagem dos auto-anticorpos não é necessária para que se possa class1ficar o tipo de d1abetes. Todavia, pode ser necessária naqueles pacientes que representem dúvidas na sua classificação, destacandose os jovens com sobrepeso, história familiar positiva para diabetes e/ou marcadores de resistência insulínica (por exemplo. a presença de acantose mgricans) e os pacientes acima de 40 anos. magros e que se apresentem ao início do diagnóstico com quadro de cetoacidose diabética ou que evoluam com fa lência precoce aos hipoglicemiantes orais.
DIAGNÓSTICO DA SÍNDROME METABÓLICA
(SM) Essa síndrome. classicamente descrita por Reaven em 1988 como "Síndrome X", denma associação freqüente de farores de risco conhec1dos para doença ateroscleróti-
476 [ Medicina laboratorial para o clínico
ca, em um grupo de indivíduos com fenótipo de obesidade central e resistência insulínica. Esse grupo de pacientes apresenta morbimortalidade cardiovascular aumentada em duas a três vezes em relação à população normal. Existe uma série de critérios para fazer-se o diagnóstiCO
dessa síndrome. Em virtude disso, vánas definições
utilizando critérios diferentes vêm sendo sugeridas por diferentes sociedades médicas, o que de certo modo dificulta a pesquisa e a prática clín ica. Em 2005 a Federação Internacional de Diabetes (IDF. www.idf.org, maio 2005), na tentativa de padronização internacional da definição e utilizando cmérios de Simples avaliação, sugeriu como critérios diagnósticos para a síndrome metabólica: • obesidade central cujos limites possam variar conforme a etnia (para sul-americanos. sugeriu-se medida da circunferênCia da cintura acima de 90 cm para homens e de 80 cm para mulheres). Edois ou mais dos seguintes criténos: • hipertrigliceridemia ~1 50 mg/dl ou estar em tratamento específico para essa condição; • colesterol HDL <40 mg/dl em homens e <50 mg/ d l em mul heres; • hipertensão arterial S1stem1ca (~1 30/85 mm Hg) ou em tratamento de hipertensão diagnosticada previamente; • glicemia em jejum ~100 mg/dl ou diabetes tipo 2 diagnosticado previamente. Recentemente, o valor do d1agnóst1co de SM como entidade clinica distinta vem sendo questionado por alguns autores. Argumenta-se que os cmérios utilizados são ambíguos. confusos e incomplecos. Além disso, o papel da resistência à insulina como entidade etiológica única para a síndrome é questionável. Por fim, o risco cardiovascular relacionado à SM é variável e dependente dos farores de risco presentes para cada individuo. Esse risco assooado à síndrome parece ser semelhante à somatória de cada um dos riscos analisados separadamente. No entanto. recomenda-se que a identificação. em um paciente, de um dos fatores componentes da SM deve alertar o méd1co sobre a pesquisa dos outros fatores de risco. Até o presente momento, o tratamento de cada um dos fatores de risco deve ser realizado ind1v1dualmente. não estando justificado um tratamento específico para a SM.
DIAGNÓSTICO DE DIABETES MELITO GESTACIONAL (DMG) Em 1964, O'Sullivan e Mahan propuseram um critério para o diagnóstico de DMG baseado no TOTG após sobrecarga com 100 g de glicose. Na ocasião, a glicemia era determinada em amomas de sangue cotai. O teste estaria indicado para gestantes com famres de risco de desenvolvimento de DMG. Posteriormente, em 1971. os aumres propuseram um teste de rascreamento com a finalidade de limicar as solicitações de TOTG. O rastreamento seria feim para a determinação da glicemia em sangue venoso cocai uma hora após sobrecarga com 50 g de glicose administrada via oral. O valor de corre selecionado foi de 130 mg/dl e o rastreamento estaria indicado em codas as gestações e deveria ser realizado a parei r da 20a semana, época em que se corna mais orevalente o DMG. Esses critérios se mantiveram até 1979, quando o NDDG, ao propor que as determinações de glicemia fossem realizadas em plasma venoso, arualizou esses valores, acrescentando-lhes 15%, que é o facor de correção dos valores de glicemia em sangue rotai para o plasma venoso (Tabela 36.1). Na década de 80, um dos primeiros Workshops em DMG reduziu o valor de corte para o teste de rastreamento para 140 mg/dl (Tabela 36.1), com a finalidade de aumentar sua sensibilidade, característica básica de qualquer procedimento de rasrreamento. O relatório do Comitê de Experts da ADA (1997) não alterou essas recomendações. Entretanto, em 1998. baseado em estudos de Cousran e Carpenter, a ADA recomendou modificação no critério diagnóstico (Tabela 36.1).
Com esses novos valores, ocorre o aumento na prevalência do DMG, mas, segundo esses aumres, isco se justifica pela melhora do prognóstico perinatal. No Brasil. o Grupo de Trabalho em Diabetes e Gravidez (GTDG). pacrocinado pela Sociedade Brasileira de Diabeces (SBD), publicou um Consenso em Diabetes Melim gesracional e pré-gesracional. estabelecendo novos critérios tanto para o rastreamenro como para o teste de colerância (Figura 36.1).
DMG
Figura 36.1 - Fluxograma para d1agnóstico DMG. Consenso Brasde1ro - SBD.
Tabela 36.1 - Comparação dos critérios diagnósticos para diabetes mel iro gestac ional (DMG)
Rastreamento
O ' Sullivan Mahan (1964) (mod-NDDG)l
Couslan Carpenter (ADA/ 1998)2
GTDG (Consenso - SBD) (1999)
50g
100g
100g
75g
~1 05
~5
~1 1 0
~190
~18 0
2 horas após
~ 1 65
~1 55
3 horas após
~145
~1 40
Cargo de glicose Glicemio em jejum 1horo após
~140
mg/ dl
~14 0
Dererm1nação em plasma venoso. Para transformar mg/dl por mmoi/L. d1v1d1r por 18 1Valores ongma11em sangue total Faror deconversão plasma: 1.15(NDDG, 1979) 2Recomenda·se acualmente a adoção desse cméno
Investigação laboratorial do diabetes melito e outras categorias de distúrbios na homeostase glicêmica
477
É importante salientar que esses critérios sugeridos pelo GTDG, independentemente do mérito em simplificar o procedimento diagnóstico, devem ter os valores propostos validados pelo escudo do prognóstico perinacal ou por estudos prospectivas que estabeleçam a prevalência futura de DM tipo 2 nas gestantes classificadas como portadoras de DMG, já que a sua adoção praticamente dobra a prevalência de DMG. Por se tratar de condição transitória e que freqüentemente desaparece após a gestação, torna-se indispensável comprovar a relação custo-beníficio antes de se adorar qualquer intervenção terapêutica. Até que isso seja estabelecido, seria sensato utilizar-se preferencialmente os critérios da ADA de 1998, que já passaram por esse processo de validação. Tal sugestão baseia-se no impacto económico advindo do maior número de diagnósticos ao se alterar significativamente o valor de cone da glicemia na segunda hora após-sobrecarga com glicose de 155 mg/dl para 140 mg/dl.
MONITORIZAÇÃO DO DM
Uma vez estabelecido o diagnóstico, o controle do tratamento do diabetes deve ser realizado periodicamente du rante toda a vida do paciente. Geralmente recomenda-se avaliação médica a cada três a seis meses, mesmo para o paciente aparentemente bem controlado e assintomático. Objetiva-se com esse controle a manutenção da euglicemia e a prevenção e/ou detecção precoce das complicações crónicas relacionadas ao diabetes. A estratégia adorada envolve avaliação clínica rigorosa (orientação alimentar, controle do peso e da pressão arterial, incentivo à interrupção do tabagismo, exame físico geral, exame dos pés e avaliação oftalmológica) e o uso de parâmetros laboratoriais periodicamente, entre os quais destacam-se os que se seguem.
HEMOGLOBINA GLICADA A dosagem da hemoglobina glicada (HbG), sobretudo a sua fração HbA1c, é o melhor parâmetro de controle glicêmico do paciente diabético nos dias atuais. Esse exame laboratorial é capaz de indicar a concentração
478 [ Medicina laboratorial para o clínico
média da glicose plasmática dos últimos dois a três meses. A dosagem de HbG é capaz de prognosticar o risco de desenvolvimento e progressão das complicações crónicas do DM tipo 1 e 2, devendo ser medida periodicamente em rodos os pacientes para avaliar o grau de
controleglicêmico. A hemoglobina humana do adulto é habitualmente constituída de hemoglobina (Hb) A (97%), HbA2 (2.5%) e HbF (0.5%). A análise cromatográfica da HbA evidenciou uma gama de hemoglobinas com diferentes velocidades de migração, incluindo HbA,a. HbA1 b e HbA1c. que foram inicialmente denominadas hemoglobinas rápidas. Posteriormente, observou-se que estas hemoglobinas, ditas rápidas. apresentam a adição de algumas moléculas de gl icose e outros carboidratos, sendo coletivamente chamadas hemoglobinas glicadas ou HbA1. O Q uadro 36.8 apresenta a nomenclatura uti lizada para denominar as hemoglobinas. A HbA1c é a pri ncipal fração, correspondendo a 80% da HbA,. A HbA1c é formada pela ligação não enzimática da glicose com a porção N-terminal da valina (glicação) em cada cadeia beta da HbA, formando uma base de Schift instável (pré-HbA1c ou HbA,c lábil ou instável) que, por sua vez, sofre um rearranjo irreversível (rearranjo de Amadori), formando uma cetoamina estável. A formação da HbG, glicação, é um processo contínuo e irreversível que depende basicamente da sobrevida das hemácias (cerca de 120 dias) e da concentração plasmática de glicose, já que a hemácia é livremente permeável à glicose. A HbG corresponde a cerca de 4 a 6% da HbA total em indivíduos não diabéticos, podendo chegar a 20% em indivíduos diabéticos mal conuolados. Conforme o Posicionamento Oficial - 2004 do Grupo Interdisciplinar de Padronização da Hemoglobina Clicada - Ale, a determ inação de HbA1c deve ser realizada pelo menos duas vezes ao ano para todos os pacientes diabéticos e quatro vezes por ano (a cada uês meses) para pacientes que se submeteram à alteração do esquema terapêutico ou que não estejam atingindo os objetivos recomendados com o tratamento vigente. Os níveis sangüíneos de HbA1c não retornam aos valores esperados imediatamente após a redução e estabilização da concentração plasmática de glicose. O tempo necessário é de aproximadamente oito a 10 semanas.
Quadro 36.8 - Nomenclawra das hemoglobinas Denominação
Descrição
HbA
Principal hemoglobina encontrado no indi· víduo adulto
HbAo
Componente mais importante do HbA, identificado por suas propriedades eletro· foréticos e cromatográficos. Podem ocorrer modrftcoções pós·translocionois nesta fro· çõo nclurndo glicoção. que não alteram signi1 cot,vomente os propriedades de cor· ga do proteína. Na prática. considera se como fração não g!icado da HbA Formas de HbA detectadas por eletroforese ou cromatografia através do maior cargo negotrvo devido à adição de glicose e ou· Iras corboidrotos (glicoção). São também denominados hemoglobina glicodo total
HbAial• HbA 1, 2.
Componentes cromatogroficamente distrn tos que compõem o HbA I
gótica devido à ausência da HbA. Nestas situações, sugere-se a dosagem de frucosamina para a avaliação do controle glicêmico. Quadro 36.9 - Vanávets pré-analítrcas na dosagem da hemoglobina gltcada (HbG) Falsa Elevação da HbG Falsa Queda da HbG Hemoglobina F > 5%
Anemias hemolíticas
Uremia
Perda de sangue (aguda ou crônico)
H ipertrigliceridemia
G ravidez ou porto recente Hemoglob,nopct os
Esplenectomia Uso de AAS
HbA1c
Pré·A ,
Composto estável formado por ligação ce· too mino irreversível do glicose ao nitrogénio terminal do volino no cadeia beta do hemo· g lobino. É o froção do HbA Formo lóbil do hemoglobrno glrcodo for· moda por ligação oldrmrna reversível da glicose ao nitrogénio terminal da valina na cadeia beta do hemoglobina
Considerações pré-analíticas
A variação biológica apresenta pouco impacm na determinação da HbA1c, uma vez que a variação incra-individual é inferior a 2,0% e ocorre pouca variabilidade relacionada à idade, gênero e raça. Por ouuo lado, hemoglobinopatias e doenças que alteram a sobrev1da das hemácias podem interferir significativamente nos resultados de HbG. Resultados falsamente dim1nuídos da determinação da HbG podem ser observados nas doença hemolíticas ou outras condições que reduzem a sobrevida das hemáCias (estados hemorrágicos, por exemplo). Já nas anemias por deficiência de ferro, vitamina B12 ou ácido fálico, em que há aumento da sobrevida das hemácias, pode-se observar resultados falsamente aumentados. O Quadro 36.9 apresenta os principais fatores pré-analíticos e Interferentes da dosagem de HbG. A determinação da HbG não tem valor nos pacientes que apresentam hemoglobinopatia homozi-
Uso de a ltas doses de v•tamrnas
CeE
HbA- 0
HbA
Transfusões de sangue
Hiperglicemio agudo (Pré GHbl
Dopsona
Intoxicação por chumbo
Considerações ana líticas
Existem mais de 30 méwdos diferentes para dosagem de HbG, baseados em diferenças físicas, químicas ou imunológicas emre a HbG e a Hb não glicada. Os mémdos disponíveis variam quanto à fração de componente glicado que está sendo med1do e por isso podem apresentar valores de referênc1a diferentes. Não há evidência de que um mémdo seja clinicamente superior ao outro, entretanto, sem uma padronização dos mémdos os resultados entre laboratórios não podem ser comparados. lsm resu lmu na criação de um programa (Na tional Glycohemoglobin Standardizatwn Program-NGSP) em 1996. Esse programa prevê avaliação rigorosa dos fabricantes de reagentes quanto à precisão e exatidão dos seus mémdos. A ADA passou então a recomendar que os laboratórios só utilizem reagentes certificados pelo NGSP, com coeficiente de variação menor que 5% e que participem de um programa de controle externo de qualidade. Recentemente, no Brasil. o Grupo Interdiscipli nar de Padronização da Hemoglobina Clicada -Ale endossou esta recomendação.
Investigação laboratorial do diabetes melito e outras ca tegorias de distúrbios na homeostase glicêmica
479
Valores de referência ou metas do tratamento
Para a dosagem de HbG, não se considera o valor de referência, mas sim um valor abaixo do qual os riscos de desenvolvimento de complicações da doença não são significantemente elevados. As metas a serem alcançadas na dosagem de HbAlc, utilizando mécodos certificados pelo NGSP, encontram-se na Tabela 36.2. É importante ressaltar a necessidade de individualizar a meta a ser atingida para cada paciente, levando-se em consideração o tipo de diabetes, a idade do paciente e a presença de complicações crónicas. A análise longitudinal em um mesmo paciente é recomendada e fornece informações mais precisas sobre a evolução do controle glicêmico daquele paciente. Tabela 36.2- Metas recomendadas da dosagem de HbAlc
Metas Recomendadas de HbAlc (%)1
Indivíduos Não diabéticos
4,0 o 6,0
D1obét1cos Criança (faixo pré-
< 8,0
puberol) Criança (faixo pubeiOI]
< 8,5
Adultos
< 7,0
Idosos
< 8,0
'O Grupo InterdiSCiplinar de Padron1zação da Hemoglob1na Clicada -A" estabelece que o valor da meta para a dosagem de HbA1, utilizando reagentes comerc1ais não cemficados pelo NGSP, deve ser o valor do hm1te supenor do Intervalo de refe· rênm espeCificado pelo fabncante. ma1s uma un1dade
FRUTOSAMINA Frutosamina é um nome genérico dado a codas as proteínas glicadas (excetuando-se a hemoglobina) das quais a maior parcela é referente à albumina, que se constitui na maior massa protéica plasmática depois da hemoglobina. Assim como a formação da HbG é decorrente de uma modificação não enzimática, dependente dos valores de glicemia, o mesmo ocorre com a glicação de outras proteínas plasmáticas. Diferentemente da hemoglobina, a vida média das proreínas varia entre uma e
480 [ Medicina laboratorial para o clínico
uês semanas. Portamo. é de se esperar que, enquanto o valor da HbG reflete o controle glicêmico nos dois ou uês meses anteriores ao teste, a frucosamina espelha as concentrações de glicose plasmática dos últimos 20 dias. Assim, a fru tosamina está elevada em codos os casos de diaberes fora de controle mecabólico. Quando ocorre perda do controle glicêmico, a resposta da frutosamina, com elevação dos valores séricos, ocorre praticamente concomitante ao aumento da glicose, retornando, entretanto, aos valores de referência três semanas após o restabelecimento do controle glicêmico. A dosagem de frucosamina pode ser útil quando se necessita avaliar alterações do controle glicêmico em intervalos menores, incluindo a verificação em curco prazo da eficácia de mudança terapêutica ou no acompanhamento a gestantes com diabetes. Nas hemoglobinopatias, especialmente naquelas homozigóticas com ausência de HbA, a dosagem da frucosamina deve ser considerada parâmetro de seguimento do controle glicêmico. A medida simultânea da frutosamina e da HbAlc pode fornecer informação clínica mais útil no acompanhamento aos pacientes, entretanto, ainda não há consenso sobre a utilização da frutosamina no monitoramento do DM. Os ensaios para sua dosagem não estão padronizados, sendo necessários, tam bém, estudos para determinar se a frutosamina é útil como predicor de risco do desenvolvimento e progressão das complicações crónicas do DM.
Considerações pré-analíticas
Em indivíduos sadios, a variação biológica intra-individual e interindividual dos níveis séricos de frutosamina é 3,4 e 5,9%, respectivamente. A dosagem de frucosamina não sofre interferência significativa de medicamentos, dieta e nível de glicemia, não havendo diferença entre homens e mulheres. Por outro lado, alterações da concentração de albumina podem levar a resultados incorretos; valores falsamente diminuídos podem ser observados em pacienres com perdas elevadas de albumina ou naqueles com doenças que aumentam o catabolismo protéico. Outros fatores potencialmente interferentes incluem: hemólise, ácido ascórbico, ácido úrico, hiperbili rrubinemia e hiperrrigliceridemia.
Considerações analíticas e valores desejáveis
Os ensaios para dosagem de fruwsamina baseiam-se na sua capacidade redutora em meio alcalino, distinguindo-se pelo sistema de calibração utilizado e, conseqüentemente, pela unidade de medida dos resulcados (Tabela 36.3). Estudos comparacivos entre os ensaios moscraram boa correlação entre os mesmos, porém. devido às diferenças de calibração, não é possível comparar individualmente os valores abridos e, portamo. não é possível a livre imerconversão de valores obtidos. Tabela 36.3- Valores desejáveis de frumsamina Método
Valor desejável
Calibração pelo DMFl
<3,9 milimoi/L
Calibração com albumino glicodo 3
<285 micromoi/L
1Ensamcahbrados com l·deox1-1-morfoilno-frurose (DMF) 2Ensam calibrados com albumina glicada m v•Lro
MEDIDA DA GLICEMIA CAPILAR É realizada por meio de aparelhos portáreis denominados glicosímerros, que medem a glicemia do paciente a partir de um méwdo enzimático que utiliza a glicose oxidase. Por dosarem a glicemia do sangue wtal. apresentam valores geralmente lO a 15% inferiores à glicemia plasmática. Podem ser de grande utilidade para os diabéticos, porque permitem o ajuste adequado da dose de insulina de acordo com o valor glicémico obtido de 1mediaw. além de ser útil no diagnóstico de hipoglicemias. Para os pacientes que não usam insulina e que estão em tratamento dietético ou com doses fixas de hipoglicemiantes orais, o seu uso é controverso, wdavia, há evidências de que promove melhor a adesão do diabético ao seu tratamento. Destacam-se como limitações ao seu uso o cusw e o faw de ser fonte de ansiedade, dependendo do paciente.
MON ITORIZAÇÃO CONTÍN UA DE GLICOSE Recentemente. vêm surgindo métodos que fornecem a medição da glicemia do paciente de modo contínuo durante alguns dias. A monitorização contínua da glicose
parece ser útil para os pacientes com diabetes lábil, para os que apresentam hi poglicem ias assintomáricas (muitas vezes acompanhadas de "efeiw-rebore") e para aqueles com medidas freqüenres de glicemias normais e GHb elevada (obviamente após a exclusão de fawres que a elevam falsameme). As limicações para o seu uso são o custo, a baixa disponibilidade em nosso meio e a ausência de estudos importantes que validem o seu uso. O Sistema CGMS (Contmous Glucose Monitonng System-Medtronic®) destina-se ao registro contínuo dos níveis intersticiais de glicose dentro de uma variação de 40400 mg/dl (2.2 - 22 mmoi/L) em pessoas com diabetes mel ito. A leitura dos valores de glicose é feita através de um sensor inserido no tecido subcutâneo, que funciona a partir de uma reação eletroquímica da enzima glicose oxidase presente no sensor com a glicose presente no fluido intersticial do paciente. A enzima glicose oxidase é usada para converter a glicose na superfície do sensor em sinais eletrônicos. O sensor envia continuamente esses sinais através de um cabo para o monitor. O monitor capta os sinais a cada 10 segundos e registra a média dos sinais a cada cinco m1nutos. fornecendo aproximadamente 288 leituras de glicose por dia (período de 24 horas) durante três dias. O Gluco-Watch é um pequeno mon itor no formato de um relógio que, por meio de um sensor e um gel colocados sobre a pele do braço. fornece a medida da glicose de 10 em lO minuws por 18 horas. Não é disponível no Brasil, podendo ser importado.
COLESTEROL E TRIGLI CÉRIDES O controle do colesterol sérico dos pacientes diabéticos é tão importante quanto o seu controle glicêmico. O National Cholesterol Education Program (NCEP), através de seu último Adult Treatment Pane/-ATPIII, recomenda a adoção de metas agressivas para manter o nível de colesterol LDL (C-LDL) inferior a 100 mg/dL. semelhante ao que é proposto a pacientes não diabéticos com passado de infarto do miocárdio. Isso se deve ao faro de que a mortalidade cardiovascular se equivale nesses dois grupos de pacientes. Mais recentemente. o NCEP vem sugerindo a adoção de metas ainda mais agressivas (< 70 mg/dl) para determ inados pacientes com risco cardiovascular muito elevado, entre eles os diabéticos com história prévia de coronariopatia.
Investigação laboratorial do diabetes meli to e outras categorias de distúrbios na homeostase glicêmica
481
Para indivíduos com hipemigliceridemia, deve-se inicialmente objetivar bom controle glicêmico, o que muitas vezes já é capaz de regularizar o nível do criglicérides.
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL
Deve-se avaliar anualmente a função renal dos pacientes diabéticos ripo 2 desde o seu momento de diagnóstico. Em relação aos portadores de DMl. recomenda-se iniciar a avaliação periódica após cerca de cinco anos de diagnóstico. A avaliação da filtração glomerular é feira com a dosagem da crearinina sérica e o cálculo do clearance de crearinina. O exame de urina rotina, com análise do sedimento urinário, é extremamente útil. Na presença de traços de proteínas, recomenda-se a dosagem da proreinúria de 24 horas para melhor definição da nefroparia diabética, que em geral já esrá estabelecida. A presença de hemarúria deve alertar o médico para outras causas de nefro ou uropatia, rendo em vista ser achado infreqüente na nefroparia diabética. Infecções do trato urinário, geralmente oligossintomáricas em diabéticos, todavia capazes de produzirdescontrole glicêmico, rambém podem ser diagnosticadas. Em pacientes com exame de urina rotina sem alterações, recomenda-se a pesq uisa de microalbumi núria como marcador do início de acometimento renal. O achado de microalbumi núria caracteriza disfunção endotelial. Além de ser marcador da nefropatia diabética, é também fator de risco estabelecido de doença aterosclerótica. Pode-se utilizar como método de rastreamento a relação da concentração de albumina (mg)/concentração de crearinina (g) em amostra única de urina, geralmente na primeira coleta do dia. Valores acima de 30 mg/g são considerados positivos, devendo então ser confirmados pela dosagem de microalbuminúria em urina de 24 horas, que em geral estará entre 30 a 300 mg/24 horas ou 20 a 2001Jg/min. Valores muico elevados de albumina na urina (geralmente derecrados em exame da urina rotina) podem produzir resultado falso-negativo em ensaios imunométricos para microalbuminúria. Por outro lado, existe uma série de condições capazes de produzir resultados falso-positivos: infecções do trato urinário, febre, enfermidades agudas, exercício vigoroso, descontrole glicêmico e/ou pressórico.
482 ( Medicina laboratorial pa ra o clínico
CONSIDERAÇÕES FINAIS As freqüemes mudanças nos critérios diagnósticos do DM são conseqüência dos escudos epidemiológicos que progressivamente revelam impaccos de níveis glicêmicos, anteriormente considerados normais, sobre a saúde da população. A seleção de novos níveis de corte para diagnóstico dos distúrbios na homeostase glicêmica deve levar em consideração os benefícios, em termos prognósticos, de uma intervenção mais precoce. Não se pode desconsiderar o impacco adverso do estigma do diagnóstico de DM, incluindo os econômicos (cusco do seguro saúde, acesso a emprego, erc.), além daqueles decorrentes dos efeicos colaterais das acirudes terapêuticas. Acualmente, parece adequada a recomendação de mudanças no esrilo de vida com correção dos hábicos alimentares, prática de exercício físico e manutenção de peso adequado para roda a população, independentemente dos níveis glicêmicos. REFERÊNCIAS 1.
2.
3.
4. S. 6. 7.
8.
9.
10.
36th Annual meeting of the European Associat ion for the Study of Diabetes. Jerusalem. Israel. 17-21 Seprember 2000. D1aberologia. 2000;43 Suppi1:A1-316 Alberti KG. Zimmer PZ. Definirion, diagnosis and classification of diabetes mellitus and 1ts com plicarions. Pare 1. Diagnosis and classificarion of Diabetes Mellirus provisional repore of a W HO consultation. Diabet Med. 1998;15:539- 53. American Diabetes A ssociation, Diagnosis and Classificarion of Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 2005;28 suppl 1:537-42. Coustan DR, Carpenter MW. The diagnosis o f Gesrarional Diabetes. Diabetes Care. 1998;21 Suppl 2:BS-8. Davidson MB. Diagnosi ng Diabetes: Cutroffs vs Tradeoffs. The Endocrinologist. 2000;10:90-6. Fajans SS. What is Diabetes7 Med Clin N Am. 1971;55:793-805 Gross JL. Silvei ro SP. (amargo JL. Reichelc Aj, Azevedo MJ. Diabetes Melico: Diagnóstico, Classificação e Avaliação do Controle Glicêm1co. Arq Bras Endocrinol Metab. 2002;46:16-26. Grupo InterdiSCiplinar de Padron1zação da Hemoglobina C licada- Al e. Posicionamento Oficial - 2004. D isponível em: http://www.sbpc.org.br. lsomaa B. Almgren P, Tuomi T, Forsén B. lahti K, N1ssén M, et ai. Cardiovascular Morbidity and Mortality Associared With the Metabolic Syndrome. Diabetes Care. 2001;24:683-9. Levey AS. Coresh J. Balk E. Kausz AT. Levin A. Steffes MW. et ai. Nacional Kidney Foundation p ractice guidelines for
ch ronic kidney disease: evaluarion, classificarion, and scranficanon. Ann lmern Med. 2003;139(2):137-47. 11. I\Jat1onal Data D1abetes Group. Classification and d1agnos1s of d1abetes mellitus and orher categories of glucose 1ntolerance D1abeces. 1979;28:1039-57. 12. Sacks DB, Bruns DE. Goldscein DE, Maclaren NK, McDonald JM. Parron M. Guidelines and Recommendanons for LaboraLOry Analys1s ín rhe Díagnos1s and Managemem of Diabetes Mellltus. Clin Chem. 2002;48(3):436-72. 13. Sch1m1dt M. ReiChelt A. Consenso sobre D1abeces GestaCional e Pré-Gestac1onal. Arq Bras Endocnnol Metab. 1999;43:14-20.
14. The Effect of lmens1ve Treacmem of D1aberes on the Developmem and Progression of Long-Term Comphcanons 1n lnsulm-Dependem D1abetes M ehro. ew Engl J Med. '1993;329:977-86. 15. The Expert Comm1ttee on the Diagnos1s and Class1f1cation o ( D1abetes Mellitus . Repore o ( rhe Expert Com11l1lLee 011 Lhe diagnosis and classifiCaliOI1 of dtabetes melhrus. Diabetes Ca re. 1997:20:1183-97 16. The Experr Committee on the Diagnosis and Classification o( Diabetes Mellitus. Follow up repore on the dtagnosts o( dtabetes mellitus. Diabetes Care. 2003;26:3160-7.
Investigação laboratorial do diabetes melito e out ras categorias de distúrbios na homeostase glicêmica
483
Letícia Maria Henriques Resende Márcio Nunes da Silva
37
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DOENÇA ATEROSCLERÓTICA E DISLIPIDEMIAS
A 1mporcância dos lípides é conhecida em vários aspeccos, principalmente como precursores de hormônios, na digestão, no armazenamento de energia, na constituição das células, na condução nervosa e na preservação da perda de calor. No início de 198 0, alguns escudos demonstraram que o aumento da concentração plasmática de colesterol escava associado ao aumento da doença arterial coronariana (DAC). Esta doença constitui uma das causas mais importantes de morbidade e mortalidade no mundo e atinge, principal mente, indivíduos em idade de alta produtividade, gerando perdas sociais e econômicas significativas. Desde então, vários programas fora m desenvolvidos para tentar identificar e controlar os fatores responsáveis pela aterosclerose. Nos Estados Unidos, foi estabelecido o Na tional Cho/esterol Education Program (NCEP) com estratégias para diagnóstico e tratamento da hipercolescerolemia em adultos e crianças e de melhorias das técnicas de dosagens dos lípides. No Brasil, a Sociedade Brasileira de Card iologia apresentou as Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, que abrange a avaliação dos riscos de desenvolvimento de acerosclerose, controle dos lípides e o tratamento com drogas, acividades físicas e redução do cabagismo.A IV Direcriz foi lançada em abril, 2007. O gru po de lípides plasmáticos é constituído por várias substâncias com estruturas moleculares diferences, que têm uma caracceríscica em comum: são insolúveis
em solventes polares como a água, que é o principal componente do plasma. O conteúdo total de lípides no plasma foi inicialmente determinado pela sua excração usando solventes orgânicos, cais como clorofórmio ou metanol. Acualmenre existem métodos disponíveis para medir isoladamente cada fração lipídica, sendo de melhor valor diagnóstico.
O METABOLISMO LIPÍDICO
AS CLASSES DE lÍPIDES As classes mais importantes de lípides são: o colesterol. os triglicérides, os ácidos graxas e os fosfol ípides. O colesterol pertence à classe de 3B-hidroxil esteróides e está presente em todos os tecidos corporais e na maioria das células, com exceção das hemácias, que não conseguem sintetizá-lo. Ele pode ser encontrado na forma de um álcool (colesterol livre), que representa de 15 a 25% do colesterol total, e o restante na forma esterificada por um ácido graxa de cadeia longa (colesterol esterificado) As duas importantes funções do colesterol são: a) é constituinte das membranas celulares, auxiliando no controle de entrada e saída de íons e moléculas solúveis em água (ex: glicose); b) é precursor de outros esteróides. O colesterol é o metabólico precursor dos hormônios sexuais (esuógenos e andrógenos). dos corcicóides
adrenais (aldosterona e corticosterona), dos ácidos biliares que servem como detergentes no rraro gastrinrestinal para digestão e absorção de gordu ras da dieta e para síntese de vitamina D. Os triglicérides constituem o maior componente de gilcéndes do sangue e dos tecidos e são formados por uma m1srura de três ácidos graxas de cadeia longa com uma molécula de glicerol. É a forma mais imporcanre de armazenamento de energia no organismo, constituindo os depósitos do tecido adiposo e muscular. Sua principal origem é a dieta. Os ácidos graxas são a forma mais simples dos lípides e tam bém a de menor quantidade que circula no plasma. A principal função dos áodos graxas é o fornecimento de energia para as cél ulas através do processo de oxidação. Eles são classificados por seu grau de saturação em: • saturados (os que não possuem ligações du plas entre os átomos de carbono da cadeia); e • insaturados (aqueles que possuem ligações duplas entre os átomos de carbono da cadeia). Os monoinsaturados contêm dupla ligação e os poliinsacurados possuem duas ou mais duplas ligações. Os ácidos graxas sawrados são de origem de tecido animal, enquanto os de origem de vegetais, peixes e bactérias são excelentes fontes de ácidos mono e poliinsarurados. Muitos dos ácidos graxos presentes no corpo humano são derivados da dieta que contém, em média, 40% de gordu ra, sendo 90% de triglicérides. Ass1m, o homem é capaz de sintetizar a maioria dos áodos graxas saturados, mono e até poli insaturados necessários. Entretanto, existem aqueles que não podem ser sintetizados e que são chamados de áodos graxos essenciais. Um exemplo é o ácido linoléico (encontrado apenas em plantas). que se converte em ácido araquidônico, um importance precursor das prostaglandinas e da mielinização do sistema nervoso central. Os fosfolípides. ass1m como os triglicérides, contêm glicerol e ácidos graxas e por isto também pertencem ao grupo de ésteres de glicerol. Entretanto, os fosfolípides possuem um grupamento fosfato ligado a uma a hidroxila. A estenficação dos álcoois colina (leminas) ou etanolamina (cefalinas) ou inositol produz os ácidos fosfatídicos, que possuem características hidrofílicas e hidrofóbicas. Assim, os fosfolípides servem para interfa-
486 [ Medicina laboratorial para o clínico
cear moléculas não polares e polares, principalmente na composição das membranas celulares.
AS LIPOPROTEÍNAS Os lípides, devido à sua insolubilidade no meio aquoso, são transportados no plasma em complexos de macromoléculas chamados lipoproteínas. Estas são esféricas, com a camada externa formada por proteínas e lípides polares (fosfolípides e colesterol livre) e a camada interna (core) de lípides apoiares (rrigl1cérides e éster de colesterol). As lipoproreínas apresentam características fís1cas e químicas diferentes devido à sua composição variada entre lípides e proteínas. Essas diferenças podem ser determinadas pelos métodos de ulrracentrifugação e eletroforese. que definem a nomenclatura e a classificação das lipoproteínas. A técnica de ultracenrrifugação separa as lipoproteínas com base em sua densidade e são designadas pelas iniciais em inglês dessa separação: VLDL (very low density lipoprotems) ou lipoproteínas de densidade muito baixa. IDL (mtermediate-dens1ty lipoprotems) ou lipoproteina de densidade intermediária, LDL (/ow dens1ty lipoprotems) ou lipoproteína de densidade baixa , HDL (high dens1ty lipoproteins) ou lipoprote1na de alta densidade. A densidade das lipoprorein2s está relacionada com seu conteúdo de proteínas e de lípides: colesterol. fosfolípides e triglicérides. O quilomícron e a VLDL apresentam elevado conteúdo de rnglicérides e ba1xo teor de proteínas. São de densidade muito baixa e partículas maiores. As lipoproteinas ricas em colesterol são a LDL, de densidade baixa, e a HDL de densidade alta. As subclasses de HDL (HDL2 e HDL3) possuem, além das características diferentes, funções metabólicas e clínicas distintas.(Tabela 37.1) A técnica de elerroforese (em acetato de celulose, agarose ou gel de poliacrilam1da) separa as lipoproteínas de acordo com a sua mobilidade eleuoforétlca em relação às proteínas plasmáticas. O HDL migra com as a -globulinas. LDL com as ~-gl obu linas e o VLDL com as pré- ~ globulinas. O IDL-C forma uma banda estreita entre 13 e pré- j3-globulinas. Os quilomícrons. devido ao seu reduzido conteúdo protéico, não têm migração eleuoforética, permanecendo no ponto de apl icação.( Tabela 37.2)
Tabela 37.1 - Classificação das lipoproteínas plasmáticas pela técnica de ulrracemrifugação e a composição em porcemagem (%) de proteína, colesterol, triglicérides e fosfolípides correspondente Lipoproteínas
Colesterol Esterificado
Colesterol Livre
Triglicérides
Fosfolípides
Proteínas
Ouilomícron
3
2
86
7
2
VLDL
12
7
55
18
8
IDL
29
9
23
19
19
LDL
42
8
6
22
22
HDL2
17
5
5
33
40
HDL3
13
4
3
25
55
VLDL.overy low denSity ltpoprotelns; IDL=mtermedtace·aens•ty l10opro!e'11S, LDL=iow densny /tpoprotems; HDL=htgh denstty ltpoprotetns
Tabela 37.2 - Características e classificação das lipoproreínas plasmáticas segundo sua densidade e migração elerroforética Lipoproteínas
Mobilidade Eletroforética
Densidade (g/ml)
Diâmetro {nm)
Ouilomícron
Origem
<0,95
>70
VLDL
Pré-beta
0,95·1 ,006
26-70
Triglicérides de origem endógeno
B-1 00, Cl,ll,lll; E
IDL
Entre pré-beta e beta
1,006·1,019
22·24
Triglicérides de origem endógeno e ésler de colesterol
B-100; E
LDL
Beta
1.019-1,063
19·23
Ésler de colesterol
B-100
HDL
Alfa
1,063-1,210
4·10
Fosfolípides
Lp(a)
Pré-belo
1,040·1,130
26·30
Éster de colesterol e fosfolípides
Principais lípídes
Apolipo-proteínas
Triglicérides de origem da dieta
A I; B-4 8; C l, ll,lll; E
Al ,ll, opoC · 1,11,111, IV e opoE (o); B-100
VLDL=very low densiry hpoproreins; IDL=tnrermedtate-denslty tpoprotetns; LDL=Iow dens1ry hpoprotetns; HDL=htgh dens1ty hpoprotetns, Lp(a)=llpoproreina (a)
APO LIPO PROTEÍNAS
As proceínas específicas que consticuem as lipoproteínas são conhecidas como apolipoproteínas (apo) e são divididas por função e estrutura em classes de A a H, sendo algumas em até subclasses (ex: AI ou Cll). As apolipoproteínas têm função importante no metabolismo lipídico, principalmente como: • co-fatares enzi máticos no metabolismo das lipoproceínas;
• responsáveis pela manutenção da integridade estrucural do complexo da lipoproteína; • no reco nhecimento dos receptares de superfície celular para entrada da lipo proteína no interior da célula. Cada classe de li poproteína tem uma variedade de apoproteínas em diferentes proporções, com exceção do LDL, que possui apenas apoB-100. No caso da HDL a principal consticuinte é a apoA-1e em menor quantidade as apoC-1. 11 e a apoE.
Investigação laboratonal do paCiente com doença aterosclerótica e dislip1demm
487
A lipoprmeína (a) ou lp (a) é semelhante ao LDL, mas contém uma glicoproreína adicional chamada de apolipoproceína (a) ligada a apoB-100 por pontes de dissulfew. A apo(a) é estruturalmente semelhante ao plasm inogênio e arua como inibidor competitivo do acivador reeidual do plasminogênio (t-PA). Isco impede a geração de plasmina e, conseqüentemente, de fibrinóilse. Tais características conferem à Lp(a) propriedades arerogênicas e sua presença nas raças branca e amarela representa fator de risco de arerosclerose independente (Tabela 37.3).
Apolipoproteínos
Lipoproteína associada
Função
ApoA-1
HDL e quilomícron
Co·fator de LCAT
ApoA·IV
HDI e quilomicron
Ativaçõo de LCAT
ApoB·IOO
VLDL, IDL. LDL
Reconhec imento do receptor do LDL nas células
ApoB-48
Ou1lomícron
Secreção de ·riglí· cérides do in·est no
ApoC-1
VLDL, HDL e quilomícron
Ativoçõo de LCAT
ApoC-11
VLDL. HDL e quilomícron
Co·fotor de lPl
ApoC-111
VLDL. HDL e quilomícron
Inibição do olivaçõo de opoC·II
são hidrolisados em ácidos graxas livres e monoglicerídeos que, juntamente com o colesterol, são rapidamente absorvidos pela mucosa intestinal. No interior das células intestinais, esses elementos sintetizam uigilcérides e fosfolípides e formam junto com apoB-48 e apoA um complexo de lipoproreína rico em uiglicérides (quilomícron nascente). Os qutlomícrons são uansporcados através do dueto wrác1co para o sangue, aparecendo após 30 a 90 mmuws no plasma. Na mculação, os quilomícrons adquirem as apoC e apoE provenientes do HDL. A apoC-11, agora presente no quilomícron, aciva a lipase lipoproreína ligada à superfície das células endoteliais do epitélio capilar. Esta lipase irá hidrolisar rap1dameme os triglicérides em ácidos graxas livres. que poderão ser utilizados como fome de energia para as células musculares ou ser armazenados no tecido adiposo. Após repetidas ações li políticas da lipase. os quilom ícrons ficam com seu conteúdo de triglicérides reduzido (quilomícrons remanescentes). Com a presença de apoE e apoB-48 em sua superfície, eles são reconhecidos pelos recepcores específicos do fígado e sofrem endocicose. Os componentes lipídicos e protéicos do qutlomícron remanescente são hidrolisados. O colesterol liberado vai pamcipar da formação de ácido biliar ou ser incorporado na síntese de outra lipoproteína ou, ainda, ser estocado como éster de colesterol. Desta maneira, o colesterol proveniente da dieta permanece pouco tempo no plasma e tem pouca interferência nos níveis dosados.
ApoE
VLDL. HDL e qudomícron
Focd 1to entrada do quilomicron remonescente e do IDL
Via endógena
Tabela 37.3- As classes de apollpoproteínas, sua constituição na estrutura das hpoproteínas e função
VLDL,very low dens~ty /Jpoprotems; IDL=mtermed1ate-dens11y /Jpoprotems. LDL-Iowdens1ty l1poprotems; I IDL=h1ghdens1ty lipoprotems; LPL, I1pase l!poproteína; LCAT=lewma colesterol aoluansje1ase
METABOLISMO DAS LIPOPROTEÍNAS
O metabolismo das lipoproteínas inclui uma via exógena (lípides provenientes da dieta) e outra endógena (lípides formados no fígado).
Via exógena
As gorduras da dieta, ao passarem pelo intestino delgado, vão ser reduzidas por enzimas digestivas (lipases pancreáticas) para facilitar o início da sua absorção. Os cnglicérides
O fígado pode simetizar mglicérides através de carboldraws e ácidos graxos. Pode também sintetizar seu própno colesterol, pnnopalmente a parm de acetaco, aumentando a atividade da enz1ma 3-hldroxl-3-metilglutaril co-enz1ma A redutase (HMG-CoA redutase). que regula essa símese nos hepatócitos. O colesterol e o uiglicérides formados são "empacotados" em vesículas secreroras do aparelho de Golgi e transportados por exocirose pelos capilares sinusóides para a circulação. formando o VLDL nascente. Esta lipoproteína comém 55% de seu conteúdo de triglicérides, além de apoB-100, apoE e apoC na sua superfície. Outras apoC são incorporadas ao VLDL (como apoC-11), proveniemes do HDL circulame, que ar1va a ltpase lipoproréica do endocélio capilar. Da mesma maneira que acontece com os quilomícrons, ocorre a htdróltse dos trtglicérides,
488 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1----------- - - -- - -- - -- - - - - - - -- -- -
à injúria do endotélio. Acomete principalmente
restando um VLDL remanescente que pode ser rncorpora-
resposta
do ao fígado ou formar uma lipoprmeína densa conhecida como IDL. O IDL é rapidamente processado para LDL ou
a camada íntima de artérias de médio e grande calibre. O processo está associado a alterações estrutu rais e fun-
removido pelos hepatóci w s. Esse processo de remoção é
oonais que ocorrem na parede arterial, com as seguintes
rápido, dificultando a detecção de IDL no plasma.
etapas mostradas na Figura 37.1.
O LDL formado é a principal fome de transporte de colesterol para os tecidos periféricos e o seu metabolismo ocorre lentamente durante dias. Receprores específicos na superfície celular reconhecem apoB100, fazendo com que a membrana celular sofra invaginação e interiorize a lipoprmeína, formando uma vesícula endocítica com enzimas hidrolíticas (endossamo). Seu conteúdo prméico é hidrolisado a amrnoácrdos e o colesterol esterificado em colesterol livre. A presença do colesterol intracelular regula três evenros metabólicos distintos: • inibe a atividade da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril co-enzima A redutase (HMG CoA redurase), drmrn uindo a síntese de colesterol endógeno; • estimula a ação da enzima colesterol aciltransfe-
Agressão ao endo télio vascular desencadeado por lo to res de risco (i LDL, i iDL, hi pertensão a rterial, tabagismo)
Aumento do permea bilidade do íntima às lipoproteínos plasmáticos
Retenção do LDL no espaço subendoteliol
Oxidação do partícula de LDL, tornando-o imunogênico
rase (ACAT), aumentando a taxa de formação de ésreres de colesterol; • rnrbe a formação de novos receptores de LDL. Esses farores evitam que as células fiquem sobrecarregadas de colesterol.
Aparecimento de moléculas de adesão leucocitório no superfície do endotélio
A troção de monócitos e linfócitos poro o parede arterial
O HDL é secrerado pelo fígado ou pelo intestino delgado numa forma inicialmente discóide, constituída apenasde fosfolípedese apo-A. Posteriormente, são adroonadas novas moléculas de colesterol, fosfolípedes e apoproreínas específicas, que modrficam o HDL nascente em forma esférica. O colesterol livre das células é também transferido para o HDL nascente, após ser esterificado, esnmulado pela enzima leonna colesterol (aciltransferase) (LCAT). Os ésreresde colesterol são então devolvrdos ao fígado. Esse processo consiste no transporte inverso do colesterol, removendo-o dos tecidos periféricos e devolvendo-o ao fígado para nova degradação e excreção na bile. Esse papel do HDL pode ser a base da proreção atribuída a essa lipoproteína como um forre e independente fawr de risco inverso para DAC. A disponibilidade de HDL evita o acúmulo de colesterol nas células.
ATEROGÊNESE A arerosclerose é uma doença sisrêmica da parede do vaso, decorrente de processo rnflamarório crônrco, em
lnve~ugaçào
Fo rmação dos células espumosos ("estria go rduroso ") · primeiro lesão macroscópico
'
Mig ração dos células musculares lisos do camada médio arterial poro o íntimo
Prod ução pelos células musculares d e citocinos, fatores de crescimento e motriz extracelular
Formação do copo fibroso do placa=]
Figura 37.1 - h apasdo desenvolvimento da placa arerosclerónca.
laboratonai do pacreme com doença aterosclerótica e drslip1dem1as
489
A placa aterosclerótica plenamente desenvolvida é composta de: • núcleo lipídico, que contém cristais e ésteres de colesterol e fosfolípedes; • capa fibrosa composta de células musculares lisas, matriz de tecido conectivo extracelular com colágene, proreoglicanos e fibronectina; • células inflamatórias como macrófagos, linfóciros T e farores pró-coagulantes. As placas "estáveis" são as de conteúdo maior de colágeno, com capa fibrosa espessa, raras células inflamatórias e núcleo lipídico menor. Essas placas rendem a ser esrenosames e são localizadas principalmente nas carótidas. As placas "instáveis" apresentam arividade inflamatória intensa, núcleo lipídico proeminente e capa fibrosa fina. A ruptura dessa placa expõe o núcleo lipídico, que é altamente trombogênico, levando aos fenômenos de adesão plaquerária, geração de trombina e fibrina e formação de um trombo sobrejacente. Esse processo aterotrombótico é o pomo inicial para o desenvolvimento dos episódios das síndromes coronarianas agudas.
EXAMES LABORATORIAIS NA AVALIAÇÃO DAS DISLIPIDEMIAS
O perfil lipídico é definido pelas dosagens bioquímicas do colesterol total. do colesterol HDL e dos rriglicérides, após jejum de 12 a 14 horas. O colesterol LDL pode ser calculado usando-se a equação de Friedewald: ColesterollDL=C total - Colesterol HDL- TG/5
Nesta equação, o TG/5 representa a fração de colesteroiVLDL quando o valor total de rriglicérides dosado é inferior a 400 mg/dl. Para valores de triglicérides acima de 400 mg/dl, o colesterol LDL deve ser dosado diretamenre. Outra maneira de quantificar as lipoproteínas aterogênicas em pacientes com hipercrigliceridemia é considerar a fração do não HDL, pois representaria, além do aumento do LDL. a elevação das frações de VLDL e de IDL. O uso do não HDL seria usado nos casos de triglice-
490 [ Medicina laboratorial para o clínico
ridemia acima de 400 mg/dL, quando a fórmula de Friedewald não pudesse ser aplicada. Para a maioria dos pacientes, a equação de Friedewald é simples e de baixo cusro e por isro ela rem sido aplicada mais rotineiramente. Várias técnicas têm sido usadas para dosar os lípides e suas frações. rais como os métodos enzimáticos. imunoquímicos e de precipitação, além dos métodos físicos, como ulrracentrifugação, eletroforese. cromarografia e outros. Os mérodos enzimáticos usados nas rotinas laboratOriais são precisos. com técnicas simples e facilmente adaptadas aos analisadores auromáticos. No enranro, apesar dos diferences mérodos produzirem separações similares das lipoproreínas, elas não são idênticas, gerando variações analíticas para o mesmo componente dosado. O estudo das lipoproreínas rem aumentado de importância desde que foi definido o seu envolvimento como faror de risco das doenças cardiovasculares e no diagnóstico e tratamento das dislipidemias. Para isro. é importante definir e conrrolar os diferentes métodos analíticos para medição dos lípides, lipoproceínas e apolipoproteínas. As variações podem ser analíticas. quando estão relacionadas a metOdologia e procedimentos usados pelos laboratórios; e pré-analíticas. quando relacionadas a fatores biológicos, intrínsecos ao indivíduo (estilo de vida. uso de medicações e doenças associadas).
VARIAÇÕES PRÉ-ANAlÍTICAS As variações pré-analíticas são as principais responsáveis pela variabilidade dos resultados laboraroriais de um indivíduo que fará acompanhamenro de seu perfillipídico. Acredita-se que as variações biológicas contribuam com 70 a 98% das variações dos resultados enconrrados em pessoas, medidas em ocasiões diferentes. (Tabela 37.4) Elas são determinadas por estudos de metanálise e quantificadas como "coeficiente de variação biológica" (CVb). ~ O CVb do colesterol total é de 6,1%, do HDL de 7,4%, do rriglicérides de 22,6% e do LDL de 9,5%. A idade separa os valores de referência entre a população pediátrica e adulta. Entre 15 e 55 anos, há aumento progressivo dos níveis de colesterol rotai e de LDL. sendo mais baixos nas mulheres na pré-menopausa, quando comparadas aos homens na mesma faixa etária.
]1 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -- - -
Tabela 37.4 - Fatores comribuimes de variação pré-analítica do perfil lipídico
Tabela 37.5 - Principais drogas e doenças que interferem nos resultados do perfillipídico
Variações biológica s
Variações laboratoriais
Drogas
Doenças
Idade
Preparo paro coleto
Anti-hipertensivos (tiazidas, clortolidono, espironolactona,
Hipotireo idismo
Sexo
Duração do jejum
betabloqueadoresl
Gravidez
Anticoagulantes
Hipopituitorismo
Estilo de vida( dieta, exercícios, uso de álcool e de cafeína)
Técnico de punção venosa
lmunossupressores (ciclosporino, predinisono)
diabetes melito
Obesidade
Armazenamento e transporte do amostra
Esteróides (estrógenos, progestógenos e anticoncepcionais orais) Anliconvulsivontes
Síndrome nefrótico
Uso de drogas
Ácido ocetilsolicílico (AAS)
Insuficiência renal crónico
Doenças
Amiodorono
Atresio biliar congênito
Alopurinol
Doenças de a rmazenamento
Ácido ascórbico
Lúpus eritemotoso sistêmico
Já na gravidez, principalmente no segundo e terceiro trimestres, ocorre elevação dos níveis séricos das apolipoproteínas, triglicérides e colesterol. principalmente do LDL. voltando ao normal após a 10• semana do parto. Dietas ricas em gordura saturada afetam de maneira moderada a dosagem de colesterol total. triglicérides e de LDL. As dietas de carboidratos complexos e de ácidos graxas poliinsatu rados tendem a reduzir os níveis de LDL. O uso de álcool, em pessoas que não são usuárias de álcool regularmente, aumenta os níveis de triglicérides da fração do VLDL. Em pessoas que consomem regularmente níveis moderados de álcool (<30g/dia), ocorre elevação do HDL e das apoAI a apoAII. Quando a quantidade de álcool excede 80g/dia, aumenta a síntese de VLDLe da atividade da lipase li poprotéica. Atividades físicas, tais com caminhadas e práticas de esportes. levam, em longo prazo. à redução dos níveis de LDL, apoBe elevação do HDL e apoAI. Entretanto. exercícios extenuantes podem afetar os resultados, em função da desidratação e aumento das proteínas (hemoconcentração). Na vigência de doenças e do uso de várias drogas, o perfil lipídico deve ser avaliado com cautela, pois alterações no quadro clínico ou nas doses das drogas podem alterar os resultados. (Tabela 37.5) Outras recomendações devem ser orientadas e avaliadas para reduzirem-se as variações pré-analíticas: • realizar o perfil lipídico em indivíduos com estado metabólico estável;
• manter a dieta e o peso pelo menos duas semanas antes da realização do teste; • executar o teste nas primeiras 24 horas após um evento isquêmico (IAM), pois os valores correspondem efetivamente ao perfil lipêmico do paciente; • aguardar pelo menos 8 semanas após cirurgia ou doença em geral ou 3 meses após o parto para real izar o teste em grávidas; • evitar atividades físicas vigorosas 24 horas antes do teste; • evitar ingestão de álcool 72 horas antes do teste. • manter o uso de drogas que não possam ser interrompidas. Nas variações laboratoriais. a duração do jejum de 12 a 14 horas favorece o desaparecimento da lipemia plasmática, que interfere na metodologia de quantificação do colesterol. A mudança de postura da posição deitada para sentada ou erecta pode levar à troca de água corpórea do meio intravascular para o extravascular, resultando em alteração na diluição do sangue. É recomendado que a coleta seja feita em pacientes sentados, 10 a 15 minutos antes da punção venosa. O uso de torniquete mantém efetiva pressão dentro dos capi lares, transferindo pequenas moléculas e fluidos do meio intravascular para o espaço extravascular (hemoconcentraçào). Isto leva, após um a três minutos de sua permanência, ao aumento de 10 a 15% do colesterol.
Investigação laboratorial do paCiente com doença aterosclerótica e dislipidemias
491
As amostras colhidas com anticoagulantes do ripo EDTA levam a valores mais baixos de colesterol wral e de rriglicérides séricos e devem rer seu valor corrigido. A heparina pode ser usada apenas para as medições de colesterol roral e de HDL, mas não é indicador para a dosagem de triglicérides, por ativar a lipase lipoproreína in vttro. O tempo e temperatura de acondicionamento da amostra são também variações pré-analíticas. O soro deve ser separado das células sanguíneas dentro de três horas após a coleta.
VARIAÇÕES ANAlÍTICAS As variações analíticas estão associadas à metodologia e aos procedtmentos utilizados pelos laboratórios. O NCEP, por meio do LSP (Laboratory Standardization Program), possui uma padronização que estabelece critérios e recomendações para orientar e adequar o desempenho dos laboratórios, para que as variações das dosagens dos lípides seja a menor possível. A variabilidade inrroduztda pela metodologia pode ser avaliada pelo "coeficience de vanação analítico (CVa) e bias (avaliação da inexatidão ou desvio do valor real). A somatória desses parâmetros {(CVaxl,96)+btas=erro total} caracteriza o erro rotai analítico. ou seja. o intervalo ao redor do valor encontrado pelo laboratório. no qual pode estar o valor real da dosagem do paciente, com 95% de probabilidade (intervalo de confian ça). As recomendações do NCEP para dosagens de lípides estão relacionadas na Tabela 37.6.
Para reduzir essas variações, é recomendado que na avaliação do perfil lipídico de um indivíduo seja considerada a média de duas dosagens de colesterol obtidas em intervalos de uma semana e máximo de dois meses após a coleta da primeira amostra; e de rriglicérides, colesterol HDL e colesterol LDL a méd1a de duas a três dosagens. Deve-se estar atento às condições pré-analíticas do paciente e a preferênCia pela mesma metodologia e laboratório. Entre essas duas dosagens, a variação incra-individual acetta é a recomendada na tabela. Caso a vanação entre as duas dosagens seja superior à máxima aceitável, deve-se dar atenção às condições do paciente e aos critérios de metodologia e certificação do laboratório. Com esses cuidados, uma terceira dosagem pode ser feita. As apoproteínas A-1 e B-100 são as mais relevantes proteínas presentes no HDL e na LDL, respeccivamente. As metodologias disponíveis para suas dosagens são baseadas em imunoensaios com anticorpos específicos, principalmente de imunotu rbidimerria e nefelomerria. O uso das dosagens dessas lipoproteínas pode se tornar útil na avaliação de pacie ntes com riscoc:; cie DAC e de hiperlipoproteinemia. no encanto, faltam definições dos pontos de corte (cut off) aplicáveis às diferentes populações. Também no caso da Lp(a), embora esteja envolvida na arerogênese, os numerosos polimorfismos da apo(a) e as limitações da metodologia da sua dosagem limitam o seu uso na rotina.
Tabela 37.6 - Recomendações do Nationa/ Cholesterol Education Program
(NCEP) I Laboratory Standardrzatton Program
(LSP) para os mémdos de dosagens de lípides Anal ito
Método Recomendado
Colesterol total
CVa(%)
CVb(%)
C oeficiente variação total
Enzimático
<3
<6,1
<9, 1
HDL
Enzimóllco lprecip1toçào ou homogêneol
<6
< 7. 4
< 13,4
LDL
Equação de Friedewold
<4
< 9,5
< 13,5
Triglicérrdes
Enzimóllco
<5
< 22,6
< 27.6
CVa=coefic1emede vanação analirica CVb=coeflc1eme de vanação biológica
492 ( Medicina laborarorial para o clínico
]1----------- - -- - -- - - - - - -- - - -- - - -
CLASSIFICAÇÃO DAS DISLIPIDEMIAS
Tabela 37.7 - Valores de referência para o diagnóstico das dislipidemias em adultos, crianças e adolescentes
As dtslipidemias podem ser de origem primária e secundária.
Adultos
Anal ito
As dislipidemias de origem primária são causadas por alterações genéricas que alreram a síntese e degradação das lipoproreínas, bem como a relação entre as llpoproteínas e
Crianças e adolescentes
Valores (mg/dl)
Categoria
Valores (mg/dl)
Categoria
< 100
Ótimo
< 110
Ótimo
100-129
Desejável
130-159
limítrofe
110-129
limítrofe
160-189
A.to
~ 130
Alto
~1 90
Muito alto
<200
Ótimo
<170
Ótimo
200239
limítrofe
170·199
limítrofe
~240
Alto
~200
Alto
<40
Baixo
<35
Boixo
>60
Alto
seus receptares. Algumas só se manifestarão em função da influência ambiental, da dieta inadequada e/ ou ao sedentarismo. Assim, o diagnósnco da dislipidemta primána só será fetro após a exclusão das causas secundárias. As dislipidemias de origem secundária são associadas principalmente ao uso de medicamentos, hábitos de vida inadequados e algumas doenças. O perfil lipídico permite identifcar quau o tipos bem definidos de dislipidemia: • hipercolesrerolemia isolada, elevação isolada do colesterol LD L~160 mg/dl; • hiperrrigliceridemta isolada TG~1 50mg/dl; • hiperhpidemia mista, colesterol LDL~160/mg/d l e TG ~150 mg/dl; • colesterol HDL baixo, homens HDL < 40mg/dl e mulheres HDL< SOmg/dl. No primeiro ano de vida, as causas mais comuns são
LDL
Colesterol total
HDL
arresia biliar congênita e a doença de armazenamento de glicogênio. Hipomeoidismo, síndrome nefrórica, diabetes melito são mats prevalentes na infância e na adoles-
A identificação de pacientes assintomáricos que es·
cência, bem com os erros alimentares. Os ácidos graxas
tão mais predisposros é importante para a prevenção e
trans são usados na fabricação de sorvetes, bolos e bis-
pode ser avaliada a partir da definição de fatores de risco
coiros. São sintettzados durante o processo de hidrogenação dos óleos vegetais para produção de margarinas. Possuem semelhança estrutural com os ácidos graxas sarurados e provocam hipercolesrerolemia, aumentando o LDL e reduzindo o HDL.
e de suas correlações. A eStratificação é fetra pelo risco que tem uma pessoa de desenvolver determinado even-
Em adultos, as causas mais comuns estão relactonadas à obesidade, alcoolismo, uso de contraceptivos orais,
to cl ínico num período de tempo. Esrudos populactonats baseados em análtses de regres-
são procuram cnar algoritmos que facilitem essa análise. Um deles é o escore de risco de Framingham, recomendado pela IV Direrriz Brastleira sobre Dislipidemias e Prevenção da
diaberes meliro , medicamentos (corticóides, beta-bloqueadores e anticonvulsivantes), insuficiência renal crônica e hepatopattas colestáticas crônicas. O diagnóstico precoce de disliptdemia contribut para a redução dos riscos de doença arterial coronariana (DAC). Os valores de referência para o diagnóstico das dislipidemias em adultos e crianças estão relacionados na Tabela 37.7 e foram adaptados do NCEP e da Academta
Aterosclerose. da Sooedade Brasiletra de Cardiologta. e tam bém pelo NCEP. Neste escore. é estimada a probabilidade de ocorrer infarro agudo do miocárdio ou morte por doença coronariana no período de 10 anos. Existem três gwpos de risco: alto (probabilidade acima de 20% de infarro ou morre por doença coronariana em 10 anos). baixo (probabtltdade inferior a 10% de infarro ou morte por doença coronanana em 10 anos) e intermediário (probabilidade entre 10 e 20%
Amencana de Pedtarna.
de infarro ou morre por doença coronariana em 10 anos).
lnvesrtgaçào laboraronal do pactente com doença ateroscleróuca e dtsltptdemias
493
O LDL é considerado faror causal e independeme de arerosclerose e sobre o qual se devem wmar medidas que procurem diminuir a morbimorralidade.
Fases para defini~ão da estratifica~ão do risco Fase 1
Identificar a presença de doença aterosclerótica prévia ou seus equivalentes A identificação de indivíduos já com manifestações clínicas da doença aterosclerótica ou seus equivalentes os coloca no grupo de alto risco (Tabela 37.8). Tabela 37.8 - Manifestações cl ínicas de doença aterosclerótica de alto risco Doença arterial coroná rio aluai ou prévio (angina, isquemia silencioso, síndrome coronoriono agudo, card iomiop olio isquêmico) Doença carolídeo
baixo e médio risco que apresentem cricérios agravantes podem ser classificados em categoria acima da estimada pelo escore inicial. Esses fatores seriam: • história familiar de doença coronariana em parente de primeiro grau masculino abaixo de 55 anos ou feminino acima de 65 anos; • presença de sínd rome metabólica (presença de obesidade abdominal, triglicérides >150 mg/dl, HDL<40 mg/dl nos homens e <50 mg/dl em mulheres, PA> 130/85 mmHg e glicemia>100 mg/dl ); • microalbuminúria 20 a 200J.lg/min; • hipertrofia ventricular esquerda; • insuficiência renal crónica; • proteína C reativa de alta sensibilidade >3 mg/L; • exame complementar com evidência de doença aterosclerótica subclín ica. As avaliações bioqu ímicas e os exames de imagem para detecção de aterosclerose subclínica não são preconizados de rotina, mas devem ser considerados em pacientes com história familiar de doença aterosclerótica precoce.
Doença arterial periférico Aneurisma de a orta Doença arterial cérebro-vascula r diabetes melito tipo 1 ou 2
Fase 2
Identificar o escore de risco de Fram ingham (ERF). A identificação em indivíduos sem doença aterosclerótica prévia define os que possam estar no grupo de pacientes de médio e baixo risco. Para definição do ERF, a pontuação para cada indivíduo é de acordo com o sexo, a idade, o valor de colesterol mtal e de HDL dosados, a definição se é rabagisra ou não e os níveis da pressão arterial. No entanto, alguns outros fatores agravantes (definidos na fase 3) podem modificar a definição nestes casos. Fase 3
Definir fatores considerados agravantes que possam melhorar a classificação de risco em pacientes de risco intermediário, nos jovens e mulheres. Os pacientes de
494 [ Medicina laboratorial para o clínico
Fase 4
Iniciar medidas de mudanças de hábims de vida (dieta, arividades físicas. suspensão do fumo) para todos os níveis de risco. O uso de medicamentos hipolipemiantes será in iciado em codos os pacientes de alto risco e nos que não atingiram as metas estabelecidas para redução do LDL. sendo de baixo risco (após seis meses) e de médio risco (após três meses). A mera de LDL preconizada arualmente para os pacientes de baixo risco é inferior a 160 mg/dl, para os de risco intermediário inferior a 130 mg/dl e os de alta risco (diabéticos e com doença aterosclerótica significativa) inferior a 70 mg/dl.
OUTROS FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR
Apesar da forre associação das dislipidem ias como famr de risco de DAC têm sido identificados pacientes com eventos coronarianos, sem alterações nas concentrações de colesterol total ou do colesterol LDL. Diante de evidências científicas de que cerca de 20% dos pacientes com DAC não apresentaram qualquer faror de
risco clássico (hiperlipem1a. hipertensão, diabetes ou tabagismo), outros marcadores que pudessem melhorar a Identificação desses casos começaram a ser investigados. No entanto, o uso clínico desses marcadores tem se moscrado limitado em função da: • falta de padronização e validação dos cesces (ex: Lp a); • inconsistência da relação do marcador com o risco de eventos coronarianos demonscrados em estudos prospectivas (ex: homocisteína); • falta de níveis plasmáticos estáveis na população ou ao longo dos anos desses marcadores; • falta de comprovação de valor adicional aos marcadores tradicionais como LDL (ex: ancígeno PA-1 e r- PA).
O valor da PCRas, para ser considerada fator agravante de risco, sena >3 mg/L.
HOMOCISTEÍNA A homocisteína é um aminoácido derivado da merionina e sua dosagem rem sido recomendada para o diagnóstico de homocistinúria, de pacientes com deficiência do metabolismo de cobalam1na ou ácido fálico e para avaliação de fator de risco de DAC. Neste caso. ela não deve ser usada como triagem da população geral e sua elevação deve ser considerada apenas de valor prognóstico em pacientes com alto risco de DAC.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
PROTEÍNA C REATIVA DE ALTA SENSIBILI DADE A proteína C reativa é um marcador do processo Inflamatório em indivíduos sadios e serve para momronzação de casos infecciosos e auro-imunes. O processo Inflamatório crônico é um im portante componente do desenvolvimemo e progressão da aterosclerose e estudos epidemiológicos mostraram associação da elevação da proteína C reariva ao risco cardiovascular. Também tem sido demonstrado o seu valor preditivo para futu ros eventos coronarianos em pacientes com angina estável, portadores de stents arteriais e síndrome coronariana aguda. A dosagem da proteína C reativa para este fim necessita de técnicas analíticas capazes de detectar valores abaixo de 0.3mg/L. Existem hoje técnicas imunoturbidimérricas e imunonefelomérricas, automatizadas, capazes de detectar níve1s abaixo de 0.3mg/L com boa reprodutibilidade e que são conhecidas como PCR de alta sensibilidade (PCRas). Está em andamenw um programa de padronização dessas técnicas para reduzir diferenças de resulcados entre os laboratórios. A Sociedade Brasileira de Cardiologia. a partir da IV D1rernzes Brasileiras para Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose 2007, recomenda a dosagem da PCRas de maneira individualizada em pacientes que tenham história familiar de doença aterosclerótica precoce ou que este1am no grupo de risco intermediário do ERF.
Nos últimos 30 anos. presenc1a-se a redução da mortalidade por causas cardiovasculares nos países desenvolvidos e o au mento significativo nos pa íses em desenvolvimento. entre eles o Brasil. A doença aterosclerót ica é multifatorial e sua prevenção passa pela identificação e controle das dislipidemias e dos fatores de risco. ra1s como tabagismo. hipertensão arterial. diabetes melito e obesidade. Os programas de controle das dislipidemias (IV Direrrizes Brasileiras para Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose e (NCEP) procuram orientar os profissionais de saúde na avaliação global dos pacientes e nas condutas terapêuticas. tais como eliminação do tabagismo, estímulo para atividades físicas e uso de fármacos adjuvantes. REFERÊNCIAS 1.
2.
Bu rus CA, Ashwoo d CR, Bru ns DE. Tierz Texrbook of ChlliCal Chcm1suy and Molecular Diagnosncs. 4th ed. St. Lollls: Elsev1er Saunders; 20 06. Execur1ve Summary of rh1rd Reporr of rhe Nanonal Cholesrerol Educanon Program (NCEP). Expert Panei on Derewon, Evaluanon, and Trearmem o f high blood cholesterol1n adults (Adult Trearmenr Panei III ). )AMA.
3.
2001;285:2486-97. Forn N, D 1ament ). Lipoproteinas de Alta Dens1dade: Aspectos Metabólicos. ClíniCos, Ep1dem1ológ1cos e de Intervenção Terapêutica. AruahLaçào para os Clín1cos. Arq Bras Card1ol. 2006;87: 672-9. D 1sponível em: hnp://www. arqulvosonli ne.com.br/2006/8705/pd f/87050 19.pdf.
lnvesugação laboracona do pac1ente com doença arerosclerÓ[Ica e dlsl1pidem1as
495
4. Grundy SM, Cleeman Jl. Merz CN, Brewer HB jr, Clark LT, Hunninghake DB, et ai. lmplications of recent cl inical Trials for the Nacional Cholescerol Education Program Adu le Treatment Panei III guidelines. Circu larion. 2004;11 0:227-39. 5. Henry JB. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st ed. Philadelphia: WB Saunders Com-
pany; 2007. J Arq Bras Cardiol. 2006;87:672-79. 6. Khot UN, Khor M B. Bajzer CT. Sapp SK. Ohman EM. Brener SJ. ar ai. Prevalence of convencional risk factors in patients with coronary heart disease. )AMA 2003;290(7):898-904.
Ridker PM, Srampfer MJ. Rifai N. Nove! risk factors for systemic atherosclerosis: a comparison of C-reactive protein, fibri nogen, homocysceine, lipoprotein(a). and stan dard cholescerol screening as prediccors of peripheral arterial disease. JAMA 2001;285:2481-5. 8. Rifai N. Li poproreins and apolipoproteins. Composirion. merabolism. and associarion wirh coronary hearr disea7.
se. Arch Parhol Lab Med. 1986;110:694-701 9. Ross R. Arherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med. 1999;3402844-50. 10. Sociedade Brasileira de Cardiologia/ Departamento de Arerosclerose. IV Diretrizes Brasileiras para Dislipidemias e Prevenção da Arerosclerose Arq Bras Cardiol. 2007;88 suppl 1:2-19.
496 [ Medicina laboratorial para o clínico ]f--- - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
38
Márcio Nun es da Silva Letícia Maria Henriques Resende
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL NAS SÍNDROMES CORONARIANAS AGUDAS
O termo "síndromes coronarianas agudas" (SCA) refere-se a uma constelação de sintomas clínicos causados por isquemia miocárdica aguda. Pacientes com SCA são subdivididos em duas categorias maiores, baseadas no eletrocardiograma: aqueles com nova elevação do segmento ST, que é diagnóStlca de infarto agudo do miocárdiO, com elevação do ST (IAMEST), e aqueles que se apresentam com depressão do segmento ST, alterações de onda T ou sem anormalidades eletrocardiográficas (SCA sem elevação do segmento ST). Este último termo compreende angina instável (AI) e IAM sem elevação do segmenco ST (IAMSEST). Estas estão intimamente relacionadas, assemelhando-se em patogênese e apresentação clínica, mas, divergindo em gravidade. Especificameme, o IAMSEST distingue-se da AI por apresentar isquem1a suficiencemente grave em intensidade e duração, causando lesão miocárdica irreversível (necrose do mióciro), reconhecida clinicamente pela detecção de b1omarcadores de dano miocárdico.
EPIDEMIOLOGIA
Segundo estatísticas americanas, nos Estados Unidos ocorrem, ao ano, mais de 5 milhões de atendimentos devido à dor rorácica. Cerca de 1 milhão de casos de IAM são diagnosticados ao ano e outro tanto rem como diagnóstico a ang1na instável. Apesar da mortalidade hospitalar ter se reduzido em 30% nos últimos 10 anos, ainda
é expressiva a mortalidade dessa população, principalmente no decorrer da primeira hora do evento, como complicação de arritmia ventricular. Estima-se que, no BrasiLanualmente, o IAM seja responsável por cerca de 300 a 400 mil casos e destes, em média 60 mil evoluem para o óbito. De roda a população que procura os serviços de emergência por dor torác1ca, mais da metade não possui doença coronariana 1squêm1ca aguda. No entanto, muitos pacientes recebem alca desses serviços de emergência sem diagnóstico de doença isquêmica aguda. Essa população é víCima de altos índices de mortalidade e chega a total1zar 12% das altas dos serviços de emergência em tra balhos amencanos, suspeitando-se que esse índice alcance valores de até 20% no Brasil.
FISIOPATOLOGIA
Muitas dessas síndromes ocorrem em resposta a um evento agudo envolvendo as artérias coronárias, quando a circulação para uma reg1ão por elas irrigada é obstruída. Se essa obstrução é acentuada e persiste, normalmente ocorre necrose. Desde que a necrose leva algum tempo para se desenvolver. torna-se óbvio que, quanto antes houver o retorno à circulação da região acometida, mais tecido miocárdico poderá ser salvo. A causa mais comum de SCA é a aterosclerose, com erosão ou ruprura da placa aterosclerótica, expondo o conteúdo altamente pró-coagulante do núcleo do
areroma às plaquetas circulantes e às proteínas da coagulação e culminando na formação do crombo incracoronário. A aterosclerose é vista acualmente como uma doença inflamatória crónica. A dinâmica no interior de uma placa aterosclerótica pode variar, mas há claramente um ambiente inflamatório. Na maioria dos paciemes com SCA. o trombo é parcialmente obstrutivo ou somente transitoriamente oclusivo, resultando em isquemia coronariana sem elevação persistente do segmento ST (AI ou IAMSEST). Nos demais 30% dos pacientes com SCA. o trombo intracoronário oclui completamente o lúmen vascular, resultando em IAMEST. Além dessa etiologia mais comum , cinco outras causas podem ser citadas: a) ruptu ra da placa com trombose aguda; b) obstrução mecânica progressiva; c) inflamação; d) angina instável secundária; e) obstrução dinâmica (vasoconstrição coronária). D1ante disso. mu1tos tratamentos são orientados no sentido de 1nibir a trombose, a fibrinólise, a agregação plaquetária e inibição da inflamação. A eficácia do tratamento é avaliado utilizando-se critérios semelhantes aos do diagnóstico da SCA.
mais elevado, em parte, devido às altas taxas de obesidade e diabetes melico. • tabagismo: o tabagismo aumenta o risco de doença coronariana em duas a quatro vezes. Representa, também, um importanre faror de risco independen-
te de morce súb1ca em coronariopacas, alcançando o •
•
•
•
FATORES DE RISCO
Vários estudos identificaram fatores que aumentam o risco de doença coronariana.A chance de se desenvolver uma SCA eleva-se proporcionalmente ao número e à intensidade de cada um desses fatores. Idade: Mais de 83% das pessoas que morrem em conseqüência de doença coronariana apresentam idade igual ou superior a 65 anos. Sexo: Indivíduos do sexo masculino têm risco mais aIro de desenvolverem doença coronariana, além de serem afetados em idade mais precoce, quando comparados às mulheres. Estas, mesmo após a menopausa, quando há aumento do risco de SCA, não alcançam os patamares apresenrados pelos homens. Hereditariedade: Indivíduos cujos pais apresentam doença coronariana estão mais propensos a desenvolvê-la. Alguns grupos raciais. como os afro-americanos, possuem níveis de pressão arterial mais elevados quando comparados aos caucasianos. Outras raças têm risco
498 [
•
dobro do risco em comparação aos não fumantes; hipercolesterolemia: quanto mais altos os níveis de colesterol, mais alro o risco de coronariopatia, principalmente quando outros farores de risco (tais como hipertensão arterial e tabagismo) estão presenres; hipertensão arterial: níveis pressóricos elevados aumentam o risco de doença coronariana, além de acidente vascular cerebral. 1nsuficiência renal e insuficiência cardíaca. Quando há associação com obesidade, tabagismo. hipercolesterolemia ou diabetes mel ito, esse risco aumenta significativamente; inatividade física: a inatividade física é um faror de risco de doença coronarial'a. Uma atividade regular ajuda a prevenir doença cardíaca, ass1m como auxilia no controle do colesterol. diabetes e obesidade, além de ajudar a reduzir os níveis de pressão arterial em alguns grupos de pacientes; obesidade e sobrepeso: pessoas com excesso de gordura corporal. principalmente se localizada no abdome, estão mais propensas a desenvolver doença cardíaca e acidente vascular cerebral. mesmo na ausência de outros farores de risco. O excesso de peso aumenra o trabalho cardíaco, além de favorecer a hipertensão arterial, níveis elevados de colesterol e triglicérides e da redução dos níveis de colesterol HDL; diabetes melito: esta doença aumenta significativamente o risco de doença cardiovascular, mesmo quando os níveis glicêmicos estão sob controle. Aproximadamente 75% das pessoas com diabetes morrem em conseqüência de alguma forma de doença cardíaca ou vascular.
FATORES PRECIPITANTES
Em muicos pacientes com IAM, nenhum facor precipitante pode ser identificado. Porém, alguns escudos têm relacionado as seguintes atividades realizadas pelos pacienres no momento do IAM: atividade física extenuante (13%).
Medicina laborarorial para o clínico )1---- -- - - - -- - - - - - - - - - - - -- - - - -- - -
arivrdade físrca leve a moderada (18%), procedimemo CIrú rgico (6%), repouso (51%) e sono (8%). A atividade física relacionada ao rnfarro é, algumas vezes. mais comumeme encomrada em paciemes sem história prévia de angina do que naqueles com simomas prévios.
res com história prévia de angina. a mudança no padrão da dor torácica pode ser um indicador de instabilização. O exame fís1co freqüentememe é pobre e tnespecífico. sendo que menos de 20% dos pacientes apresentam alterações significativas.
CRONOBIOLOGIA
AVALIAÇÃO ELETROCARDIOGRÁFICA
Existe uma periodicidade importame para o momenro de 1nício do IAM. Freqüenrememe. este ocorre nas primeiras horas da manhã, entre oiro e nove horas, período no qual a ativ1dade adrenérgica é aumentada, os níveis de fibrinogênio são elevados e a adesividade plaquetária está aumentada. Há também um segundo pico de ocorrêncra, que gira por volta das 17:00 horas. O ncmo circadiano afera muiros parâmecros fisiológicos e b1oquímicos: as primeiras horas da manhã estão associadas ao aumento das catecolammas plasmáticas e da agregação plaquetária, redução da atívtdade do ativador tecrdual do plasminogên10 e aumento da ativtdade do in1bidor da v1a de ativação tecrdual do plasm1nogênio. Assim, é possível que alguns aspectos cíclicos de fatores vasoespást1cos, protrombóticos e fibrinolíricos associados à aterosclerose preexistente favoreçam o IAM. O infarro conhecido como não rransmural não exibe esse mmo mcadiano.
O eletrocard1ograma (ECG) deve ser realizado no transcorrer dos primeiros 10 minutos desde a admissão do paciente na unidade de emergência e. como já descrito, representa o cenrro decisório inicial em pacientes com suspeita de IAM. Em pacientes com sintomas sugestivos. a elevação do segmento ST rem especificidade de 91% e sensibilidade de 46% para o diagnóstico de IAM, porém essa alteração, assim como o desenvolvtmento de onda Q. está presente em apenas 50% dos pacrentes.
DIAGNÓSTICO DA SCA
HISTÓRIA ClÍNICA Embora a apresentação clínica de pacientes com isquemia mtocárdica aguda possa ser muito diversa 75 a 85%deles apresentam como sintoma predominante dor rorácica. Esta coscuma ser prolongada. com duração superior a 20 mmutos, normalmente desencadeada por exercício físico ou estresse. porém também ocorrendo em repouso. Dor mrácrca que ocorre subitamente em repouso ou em paoemes jovens pode sugerir vasoespasmo coronariano agudo, como ocorre na angina de Prinzmetal ou com uso de cocaína ou anferaminas. Aproximadameme 2% dos pacientes com dor rorácica associada à cocaína têm SCA. A dor na síndrome coronariana aguda pode irradiar-se para membros superiores ou pescoço ou vir acompanhada de outros sintomas. como náusea, vôm1ws e/ou dispné1a. Em pacien-
Investigação laboratorial nas síndromes coronarianas agudas
AVALIAÇÃO LABORATORIAL Baseado na recomendação da Orgamzação Mundial de Saúde, até recemememe o diagnóstiCO de IAM era confirmado se fossem preenchidos dois dos seguintes critérios: • desconforw w rácico sugestivo de isquemia miocárdica; • alterações eleuocardiográficas; • elevação e queda de enzimas cardíacas. Com o surgimento de marcadores mais específicos para detecção de lesão miocárdica, em setembro de 2000 um Comitê composto pela Sociedade Européia de Cardiologia e pelo Colég1o Amencano de Card1ologta redefi niu o critério para o diagnóstico de IAM. baseado predominamemente na incorporação das troponinas cardioespecíficas como marcadores de necrose tecidual. Nesta redefin1ção, o dtagnóstico de IAM, recence ou em evolução, seria estabelecrdo caso houvesse aumento característico e queda gradual da troponina ou aumento e redução mais rápidos dos níveis de CK fração MB, acompanhado de um dos seguintes cnténos: sintomas isquêmicos, desenvolvimento de ondas Q no ECG ou outras alterações eletrocardiográficas indicativas de isquemia (elevação ou depressão do segmento ST). Com a utilização de marcadores mais específicos e cada vez ma1s sensíveis, espera-se 30 a 70% a mais de incidência
499
de IAM. Muims dos casos diagnosticados ameriormeme como angina instável ou liberados da emergência para o domicílio como não portadores de SCA apresemavam, na verdade, IAM. Os marcadores cardíacos devem ser avaliados em codos os pacientes com sintomas consistentes de SCA, porém. naqueles com sintomas típicos de isquemia miocárdica e alterações eletrocardiográficas indicativas de IAM (IAM com elevação do segmento ST). a terapêutica não deve ser adiada, aguardando-se a confirmação laboratorial. Para muitos pacientes, uma amostra deveria ser obtida à admissão no serviço de urgência e após seis a nove horas. Em pacientes com dosagens iniciais normais. porém, com alta suspeita clínica. deve-se repetir a dosagem entre 12 e 24 horas.
actina-miosina (molécula inibitória) e a rroponina T (TnT) se liga diretamente à cropom1osina. As rropon1nas I e T são codificadas por diferentes genes nos dois tipos musculares (esquelético e cardíaco). produzindo proteínas que são imunologicamente distintas e detectáveis atualmeme em ensaios baseados na util ização de amicorpos específicos a cada uma delas, o que confere alta especificidade ao ensaio. Q)
"'o
6 oc 5 o 4
E
"'o -~
Q.
~
2
.E ~
Marcadores cardíacos
A necrose miocárdica é acompanhada pela liberação de proteínas estruturaiS e outras macromoléculas intracelulares no interstÍCIO cardíaco e na corrente sangüínea, como conseqüência do comprometimenco da Integridade da membrana celular. Quanto maior o dano celular, maiores serão as moléculas liberadas. A velocidade de apareCimento dessas macromoléculas na circulação sangüínea depende de vános fatores. incluindo a localização Intracelular, o peso molecular, os fluxos linfáticos e sangüíneos locais e a taxa de liberação no sangue. Esses marcadores bioquímicos de necrose miocárdica incluem a troponi na, creatinofosfoquinase (CK e sua fração MB) e mioglobina. A lactato desidrogenase (LDH) e a aspartado ammotransferase (AST ), Citadas apenas do ponto de vista h1stórrco. perderam o status de marcadores cardíacos pela falta de especificidade e por apresentarem elevação tardia e não serão discutidas neste capítulo (Figura 38.1). Troponina
Desde a redefinição diagnóstica do IAM. ocorrida em setembro de 2000. a troponina tornou-se o marcador cardíaco de escolha. O complexo troponina regula a contração do músculo estriado e consiste de três subunidades: T. I, C. que estão estreitamente ligadas ao filamento da tropomiosina. A troponina C se liga ao cálcio. a rroponina I (Tnl) à act1na e inibe a interação
500 (
Medicina laboracorial para o clín1co
7
:2 o
/ -- -
3
2 1
o
' ' '' _ _ _ _
o
20
40
60
80
100
---LDH
Tro pon ina -------
120
140
160
Horas do início do infa rto
Figura 38.1 - Características da elevação dos marcadores cardíacos após o ep1sód1o do IAM.
A croponina C não apresenta diferenças entre os dois tipos musculares e. portanto, não tem utilidade na prática clínica. As formas cardíacas das croponinas I e T encomram-se predommamemente ligadas às fibras musculares e estas formas são liberadas lentamente durante um período de uma a duas semanas seguindo um IAM. Assim. embora as cTnl e cTnT (c- cardíacas) sejam moléculas pequenas. com pesos moleculares de 23kDa e 34kDa, respectivamente, e sejam clareadas da circulação rapidamente, seus níveis plasmáticos caem lentamente após o dano miocárdico. Uma pequena fração de uoponina na célula m1ocárdica encontra-se livre dentro do moplasma (cerca de 6% para TnT e entre 2 a 5% para Tnl) e é esta fração que será liberada mats precocemente na circulação. Tem sido demonstrado que. após o IAM, inicialmence há liberação da TnT livre. posteriormente da Tnllivre. seguido dos complexos terciários (TnT-Tni-TnC) e de alguns fragmentos da TnT. O complexo teroário logo se dtssooa em TnT livre e complexos binários (Tni-TnC). No caso da Tnl. a forma mais difundida é a do complexo binário (Tni-TnC). ainda que tam bém o possa ser na forma livre, oxidada ou reduzida. Essa multiplicidade de formas contribui para os diferentes resultados obtidos nas diferentes metodologtas.
Freme a um processo de necrose miocárdica, a uoponina cardíaca é detectada no plasma a partir de quatro a seis horas do início dos sinwmas, refletindo provavelmente a liberação precoce de seu componente ciwplasmático. Os valores de pico geralmente ocorrem em 18 a 24 horas e, então, começam a declinar de forma gradual, inicialmente mais rápido nas primeiras 36 a 48 horas e, depois, mais lentamente, sendo detectadas por um período de sete a 10 dias, podendo-se estender até 14 dias. A TnT apresenta sensibilidade próximo de 100% a partir da oitava hora após o IAM, enquanto a Tnl atinge essa sensibilidade próximo da 12a hora, isw devido ao seu menor pool ciwplasmático. ,\letodolog,as e mrerfercntes
Basicamente, wdos os ensaios disponíveis atualmente baseiam-se no princípio de uma reação amígeno-anticorpo (imunoensaios). As mewdologias mais utilizadas são ELISA (enzyme-lmked 1mmunosorbent assay), ELFA (enzyme-lmked fluorescent immunoassay), quimiluminescência e imunocromatografia. A amostra utilizada é o plasma ou soro. Resultados falso-positivos podem ocorrer devido a fatores interferentes, como: • coágulos de fibrina em amostras incompletamente coaguladas, como pode ocorrer em pacientes com coagulopatias ou em terapia anticoagulante; • anticorpos heterófilos, fawr reumatóide e auwanticorpos; • amostras ictéricas ou hemolisadas; • formação de imunocomplexos; • micropartículas na amostra; • alta concentração de fosfatase alcalina. Causas altutllll tvm de clcvoçuo ele tropontt 1m wrclíacns
A liberação de troponina do mióciw pode ser devida a um dano celular reversível ou irreversível. Em uma situação de isquemia prolongada, as células são irreversivelmente lesadas, com a degradação da membrana celular seguida de liberação gradual da uopon1na na ci rculação. Porém, a idéia de que a troponina esteja elevada somente após dano irreversível do miócito (necrose) tem sido questionada, pela observação de que alguns pacientes com angina instável (AI) têm elevações transitórias da
Investigação laboratorial nas síndromes coronarianas agudas
troponina, com os valores retornando aos níveis normais em algumas horas. Esse padrão de aumento pode não ser consistente com dano miocárdico permanente. Portanto, é concebível que a troponina possa também ser liberada em situações que favoreçam o aumento da permeabilidade da membrana celular, como pode ocorrer na presença de fatores depressores miocárdicos, liberados em situações de sepse e outros estados inflamatórios. Deve-se ter em mente que a troponina é específica de dano miocárdico e não do mecanismo que o ocasionou, pois há várias situações que podem se apresentar com níveis de uoponina elevados sem associação com doença cardíaca isquêmica (Quadro 38.1). Nestas situações, os níveis costumam se encontrar dentro de uma faixa de dúvida ou ligeiramente elevados; e em dosagens seriadas normalmente não se elevam, como ocorre no IAM.
Os resultados de diferentes tipos de ensaios de troponina geralmente não são comparáveis. Uma grande variação na concentração de tropon1na I cardíaca, em termos de valor absoluw, pode ser observada para dada amostra de um paciente, avaliada por diferentes métodos analíticos. Essa variabilidade analítica entre os ensaios de troponina existentes é devida ao faw de haver ampla variação na sensibilidade dos testes, diferenças nos limites superiores de referência, nos pontos de corte diagnósticos, imprecisão dos ensaios (coeficiente de variação - CV) e utilização de tipos de amostras diferentes (soro, plasma ou sangue wtal). As recentes determ inações da Sociedade Européia de Cardiologia e do Colégio Americano de Cardiologia para o diagnóstico do IAM definiram as condições em que se devem obter os limites de referência da tropo nina, a saber: qualquer valor obtido num contexw de síndrome isquêmica superior ao percentil 99 de uma população de referência definirá o IAM. ~emprP (jt!E' esse va lor tenha sido obtido com imprecisão analítica não superior a 10%, para evitarem-se resultados falso-positivos. Na Tabela 38.1, apresentam-se valores de corte de troponina de diferentes fabricantes. Normalmente, os resultados são li berados utilizando-se a unidade "ng/ml:' e muiros laboratórios adicionam ao laudo, nos valores de referência. as seguintes orientações:
501
"Nega[lvo", "Provável lesão m iocárdica" e "Lesão m tocárd tca". Quadro 38.1 - Condrções nas quats são evideno ados nívers elevados de troponrna sem doença cardíaca isquêmrca
encontra-se elevada no m úsculo esrrrado, cérebro e teCIdo cardíaco. A CK
é um dímero composto de duas subu-
ntdades, cad a qual com um peso molecular d e cerca de 40kDa. a saber: subunidade B -"bram" =cerebral e subunid ade M -"muscle" = muscular). Dev1do à forma at1va da
Trauma (contu~oo, obloçõo, morcoposso, cordioversõo, bróp~ro cntlonnoLórcko, cu urgro cardíaco)
enzima ser um dímero, somente t rês pares de subunida-
Insuficiência cardíaco congestivo, agudo ou crónico
CK3). A d1strtbUtçào d essas isoenztmas nos vános rectdos
Doença valvular aórtico e cordiomiopotio hiper:rófico obstru· livo com ~rgnrficotrvo h pertrofio ventricular esquerdo
é mostrad a na Tabela 38.2. Todas são encontradas no cito-
des podem extscrr: BB (ou CKl), MB (ou CK2) e MM (ou
sol da célula ou associadas a estruturas mto fib rilares.
Hipertensôo H po•ensào assoe oco o crr lrr·os Cirurgro nõo cord'oco sem compi'coçôes l~~ut
c ê'lC o renal
Asma grave Doenças cr t os especro men•e drobe!es. nsulic'êrrcio respiro •ór'o si'1drome nemolillco·urêmrco cordiotoxicidode (odriomicino, 5-fluorourocil,herceptino, veneno de cobro, colecolominosl
Tabela 38.1 - Valores de corte de krts de rroponrna ca rdíaca Kit, Fabricante ARCH STAT Troponin-
UT
Percentil 99
cv 10%
0,009
0,012
0.032
0.02
0,04
0,16
I. Abbott Drognoslrcs AxSYM Troponrn· ADV Abbott Diognosl rc~
Hipollreordismo
i-STAT, Abbott Loboratones•
0,02
008 (STl
0.1
Vosoesposmo coronoríono
Cerlaur Bayer Drogno5trc5
002
0.1
0.35
Access AccuTnl Troponrn 1, Beckmon Coulter
0,01
0,04
0,06
-rroge Cordrac Pene Bros te'
0,19
0 19
0.5
Sepse
Dimension Rxl , Dode Behring
0,04
0.07
0,1 4
Que'maduros. especio mente com ocomeumenlo de > 30% do svp<>r1'cie :o·poreo
Strotus CS. Dode Behr'ng '
0,03
007
0.06
Doenças infiltrolivos. rncluindo omrlordose, hemocromotose, sorcoidose e esclerodermio
lmmulite, Oiognostrc Products Corporotion
0,1
0,2
0 .6
Doenças neurológrcos agudos. nclurndo ocidente vosr Jlor cerebral e hemorragia suborocnóideo
Vitros. Orlho-Cirnrcol Drognostrcs
0.02
0,08
0.12
Robdomiólise com dono cardíaco
Response OrthoClinrcol Drognosucs •
0.03
0,03 (ST)
0,21
Drog·
< 0,01
0.01
0.03
Reoder, Rache Diognostics "
< 0,05
0,05 (STJ
ND
Tosoh AIA. Global Medicai Instrumentol·on lnc
< 0,06
0.06
006
Doenças n:lomo•or os (mrocord ·e. oer cc•di•e. níecçào ao• parvovírus Bl9 cloençn dP Kawn,nki ncorrFt.r1"Pn'n mror<íraco de endoca•orte boc•enono) lrue•venções coronorronos pe•cutôneos sem comp icoções
Voscul oo•ro reloc o~ oco o ·rorsp 0'1te Exouslõo !'s co
Creatmoqwnase e suas izoenzimas A creatinoquinase (CK), também incorretameme chamada de creacinofosfo quinase, catalisa a fo sfonlação reversível da creatina pelo ATP. Sua acividade enzimática
502 ( Medicrna laboratorial para o clínico }---
Elecsys, nostrcs
~acne
UT Lrmrte mfenor de aerecção CV coe! creme de var.ação. ST Sang~.oe to;a NO: Não determrnaao. 'Po1nt-of-care Te5te Fonte Apple et ai. (2003)"
Tabela 38.2 - Padrões de izoenzimas de CK nos tecidos humanos
Tecido Músculo Esquelélico Relo· abdominal Peilorol maior
Atividode deCK (U/g peso) 2500
Gaslrocnêmio
CKMM CKMB % %
98.9
1.1
98
2
100 100
o o
CKBB % 0,06
Cérebro
555
o
2.7
97.3
Coração
473
78,7
20,0
1,3
54 ± 6
41 ±7
52 ±4
46 ±5
190
4,3
o o
95,7
978
Venlrículo esquerdo Músculo popilor Estômago lnleslino delgado Cólon
112
1.2
138
2.1
Reto
267
1.2
Rim
32
2.8
Bexigo
145
6,6
Próslola
11 4
6
o o o o o
27 - 72
0- 4
18 - 69
o o o
100
Pu mão Fígado
-1
o
Úlero
115
23
Placenla
o
Tireóide
4 - 26
98.8
98,8 97.2 93.4 94
974
100
0 - 1 73 - 96
Fome I ang. H.: Creaune Krnase lsoenzymes: Pathophysrology and c:,nrcal Apphca· tron. Berlrn. SpnngerVcrlag. 1981. Existe uma quarta forma que difere das outras, ramo do pomo de vista imunológico quanto de sua mobilidade eletroforética. A isoenzima CK-Mt (mitocondrial) está localizada entre as membranas interna e externa da mitocôndria e representa, no coração, mais de 15% da arividade da CK total. A atividade da CK também pode ser encontrada em forma macromolecular, a chamada
Investigação laboratorial nas sínd rom es coronarianas agudas
macro-CK. Esta é encontrada. de maneira transitória, em mais de 6% dos paciences hospitalizados. mas somente uma pequena proporção destes tem atividade de CK anormal. A macro-CK existe em duas formas. tipos 1 e 2. O tipo 1 é o complexo composto pela ligação de uma molécula de CKl e uma imunoglobulina da classe lgG. porém. outros complexos têm sido descritos, como CK3 e lgA. A prevalência rem sido estimada entre 0,8 e 2.3%. porém isto é dependente da metodologia e da população estudada. O tipo 1 está associado a doenças gastrintesrinais. adenomas ou carcinomas, doenças miocárdicas e vasculares. Freqüentemente, ocorre em mulheres com idade superior a 50 anos. A importância clínica de se identificar essa forma de macro-CK é a ocorrência de resultados falso-positivos de CKMB. em metodologias baseadas em troca iônica e imunoinibição. O tipo 2 é uma forma de CK mitocondrial oligomérica. com prevalência entre 0,5 e 2,6%. Esta forma é enconcrada predominantemente em adultos com neoplasias malignas ou doenças hepáticas. gravemente doentes ou em crianças com doenças miocárdicas. Esse tipo de macro-CK também pode interfenr nas dosagens de CKMB. utiltzando-se de metodologtas de uoca iônica e imunoinibição. Ambos os tipos de macroCK são estáveis ao calor. o que não ocorre com a CKMB "verdadeira", que é termo-lábil e pode ser distingutda desta incubando-se as amostras (soro) em banho-maria a 45°C durante 20 minutos. Após esse procedimento. as amostras são rerescadas e, caso haja normalização dos valores de CKMB ou redução superior a cerca de 50% em comparação à dosagem inicial, praticamente pode-se afirmar que realmente se trata de uma CKMB elevada e não de uma Interferência de macro-CK. Como demonstrado na Tabela 38.2. essa enzima rem baixa especificidade para dano miocárdico. Seu nível sérico aumenta em três a oiro horas após a lesão miocárdica. atingtndo um pico entre 12 e 24 horas e recornando aos seus níveis basais dentro de três a quatro dias. Em situações em que a rroponina ou CKMB não esrejam disponíveis, pode-se utilizar a dosagem de CK total para auxiliar no diagnóstico, desde que ela esteja duas vezes acima do limite superior da normalidade. Usando-se uma única dosagem de CK total. rem -se sensibilidade de 35%. especificidade de 80% e valores predirivos positivo e negativo de 20 e 90%. respectivamente. Com amostras
503
seriadas, esses valores passam para 95, 68, 30 e 99%, respectivamente. A memdologta normalmente utilizada na dosagem de CK total é Clnéttca-UV especcrofmomécrica. O intervalo de referênc1a para CK total é mécodo-dependente, porém, ensaios realizados a 37"( apresentam valores na faixa de 50 a 200 U/L para homens. Mulheres têm níveis 20 a 25% Inferiores aos masculinos. Lactentes na faixa de um ano de idade podem apresentar valores duas vezes os do adulm lsoenzimas da CKMB
A CKMB é muito mais cardioespecífica do que a CK rotai isoladamente, apesar de corresponder a cerca de 1 a 3% da musculawra esquelética. Ainda é um dos testes laboracoriais mais utilizados para o diagnóstico de IAM devido à indisponibilidade de dosagens de troponina em muicos laboratórios de urgência. Seguindo dano miocárdico, os níveis de CKMB começam a aumentar a partir de três a quatro horas. atingindo o pico em aproximadamente 24 horas e rewrnando ao normal dentro de 48 a 72 horas (a meia-vida da CKMB é de 10 à 12 horas} Facores que podem interferir no padrão clássico de elevação incluem tamanho do infarto, compostção da CK2 no miocárdio, lesão de músculo esquelético concomitante e reperfusão. A CKMB pode ser avaliada a pamr de sua atividade enztmática ou de sua concentração (massa). Estudos clínicos comparando essas duas modalidades de dosagens mostraram que a alteração da CKMB massa fo1 mais precoce do que a atividade. Asstm, há ganho na sensibilidade analítica sem perda da especifiCidade. Outra maneira de se unlizar a dosagem de CK2 no dtagnóstico de IAM base1a-se no uso clínico do índice relattvo (IR%). ou seja. IR% : CK2 massa
I
alividade CK total x ( 100) ou I atividade CK total x ( 100)
% CKMB = CKMB ati v idade
Essas avaliações não deveriam ser utilizadas para interpretação quando a atividade da CK torai permanecer dentro da faixa de normalidade, devido ao risco de valores falsamente elevados. Segundo determinações da Sociedade Européia de Cardiologia e do Colégio Americano de Cardiologia para o diagnóstico do IAM. os níveis de CKMB deveriam exceder o percentil 99 de valores de
504 ( Medicina la boratorial para o clínico
uma população de referência em duas amostras sucessivas. As metodologias mais utilizadas são eletroforese, cromatografia de troca iônica e ensaios imunológicos. sendo a imunoinibição um dos métodos mais rápidos, simples e, conseqüentemente, um dos mais usados na prática laborawrial. A medida da concentração da CKMB massa a partir do uso de anticorpos monoclonais antiCKMB é um método muico sensível. utilizando-se de quimiluminescência. A faixa de referência para a CKMB (atividade). como acontece com a CK total. é método-dependente, apresentando-se com limites superiores tão discrepantes quanto 25,0 U/L ou 6,0 U/L. Para a CKMB massa, são considerados normais. geralmente, valores de até 3,6 ng/ml. 'w/J/ontl(l d CI\ i\· 8
A CKMB pode também ser caracterizada pelas subformas: CKMB2 e CKMBl A primeira é encontrada no tecido miocárdico e, a segunda. no plasma. Uma relação CKMB2/ CKMB1 ac1ma de 1.5 sugere lesão miocárdtca. Estudos envolvendo análise de subformas de CKMB em paCientes com dor corácica encontraram sensibilidade de 96% e especificidade de 94% quando esses marcadores foram medidos seis horas após o início dos sintomas. Os ensaios utilizados para a quantificação dessas subformas não estão normalmente disponíveiS para uso clíntco em nosso meto. As mecodologias normalmente envolvidas são: focalização isoelétrica, lmunoblottll1g, cromacografia líquida de alta performance (HPLC) e elecroforese. Mioglobina
Mioglobina é uma proteína carreadora de oxtgênio. encontrada nos músculos esquelético e cardíaco. com peso molecular de 18kDa. Esse baixo peso molecular associado à sua localização citoplasmática provavelmente é responsável pela sua elevação precoce, ou seJa. cerca de uma a três horas após lesão muscular. ADnge o ptco em cerca de seis horas e o excesso é rapidamente clareado da corrente sangüínea. tendo sua senstbiltdade clíntca reduzida substancialmente após 12 horas. Os mécodos utilizados na sua dosagem não são capazes de distinguir o tecido de origem. Possui alta sensibilidade (90 a 100%) e batxa especificidade (60 a 95%) para dano miocárdtco. apresentando, portanto, alro valor predinvo negativo para IAM.
Os intervalos de referência variam de acordo com a idade, raça e sexo. Normalmente, sua concentração sérica aumenta com a idade, homens possuem concentrações mais altas do que mulheres e indivíduos da raça negra também possuem valores mais elevados. Os métodos disponíveis para a avaliação da mioglobina são: aglutinação em látex, nefelometria, turbidimeu ia e quimioluminescência. A faixa de referência é método-dependente, mas podem ser encontrados limites superiores, variando entre 70 e 100 ng/ ml. Os níveis podem ser 25% superiores em homens.
MARCADORES CARDÍACOS E REPERFUSÃO MIOCÁRDICA Quando um IAM ocorre, o êmbolo pode ser lisado por agentes uombolíticos ou, alternativamente, por intervenção mecânica, como angioplastia. Para ser eficaz, a reperfusão deve ser iniciada logo após o início dos sintomas, limitando-se, assim, o dano miocárdico e reduzindo-se o risco de óbito e complicações futuras. O estudo TIMI (thrombolysis in myocardial infarction) definiu um sistema de graduação para reperfusão coronária: TIMI O indica completa oclusão coronária; TIMI 1 indica que houve alguma penetração da obstrução pelo contraste, sem per fusão do leito coronário distal; TIMI 2 indica perfusão completa da artéria coronária, com fluxo lento; finalmente, TIMI 3 denota completa perfusão coronariana e fluxo normal. Em associação aos sintomas e alterações eleuocardiográficas que podem ser utilizados na avaliação da reperfusão, pode-se lançar mão dos mesmos marcadores que são utilizados no diagnóstico do IAM. Lf A'B
A monitorização seriada das concentrações séricas de CKMB tem auxiliado a avaliação não-invasiva da reperfusão miocárdica seguindo a terapia trombolítica. Uma reperfusão precoce causa aumento da enzima acima do limite superior de referência e atinge o pico da atividade/concentração da CKMB com valores mais elevados e mais precocemente. Vários estudos têm demonstrado, após a trombólise, aumento superior a duas vezes o nível da CKMB nos primeiros 90 minutos de reperfusão e taxa de aumento nas primeiras quatro horas identificando os pacientes reperfundidos dos não reperfundidos. Outros
Investigação laboratorial nas síndromes coronarianas agudas
estudos descrevem que alterações nos valores de CKMB em associação com reperfusão foram mais bem descritas pela inclinação da curva da CK2 ou pela relação da CK2 basal aproximadamente 90 minutos após a terapia trombolítica. Outros trabalhos encontrara m aumento superior a cinco vezes nos níveis de CKM B. cambém aos 90 minutos, com sensibilidade de 82% e especificidade de 66% para TIMI 3.
Para alguns aurores. em pacientes com padrão de fluxo TIMI 3, o aumento relativo na sensibilidade cl ínica (82 a 86%) da Tnl para detectar reperfusão foi maior em 30. 60 e 90 minutos, comparado às sensibilidades clínicas da CKMB (59 a 77%) e mioglobina (63 a 70%). Portanto, a medida da Tnl foi o melhor preditor não-invasivo da reperfusão precoce da artéria coronária. Em contraste, ouera estudo envolvendo 63 pacientes nos quais foram obtidas as dosagens de TnT. mioglobina e CKMB mostrou que a mioglobina foi o melhor marcador para avaliação da reperfusão. Outras pesquisas relataram aumento nos níveis de TnT de 0.50 IJg/mL 60 minutos após o início da trombólise, identificando reperfusão com sensibilidade de 83% e especificidade de 100%. Também tem sido citado que o aumento de cinco vezes nos níveis de TnT 90 minutos após a trombólise apresentou sensibilidade de 82% e especificidade de 67% para TIMI 3. /\!lwglobllltl
Investigações utilizando medidas seriadas desse marcador em pacientes submetidos à trombólise revelaram que a mioglobina atinge picos significativamente mais precoces após a reperfusão (111 minutos) do que quando essa reperfusão não ocorre (360 minutos). Uma rápida elevação em seus níveis foi evidenciada a partir do aumento de 4,6 vezes nas primeiras duas horas após a reperfusão. A literatura mostra também que a relação de mioglobina para CK total superior a cinco é indicativa de reperfusão, com sensibilidade clínica de 75% e especificidade clínica de 96%. Finalmente, vários estudos têm sugerido que a mioglobina pode ser um marcador razoável do sucesso da reperfusão, com sensibilidade de 84 a 85%. especificidade de 73 a 100% e acurácia de 88 a 95%.
SOS
CONSIDERAÇÕES FINAIS Desde a redefin1ção dos cntenos diagnósticos para o IAM, ocorrida em 2000, as u oponinas cardíacas têm ocupado papel relevante na avaliação de pacientes com
suspeita de SCA admitidos em unidades de emergência, quando o eletrocardiograma é inconclusivo. Apesar de ser o marcador cardíaco de escolha. outros como CK total e sua fração M B e a mioglobina podem ser utilizados como coadJuvantes no diagnóstico ou em subsmuição às traponinas. quando estas não estão disponíveis, além de serem utilizados na avaliação da reperfusão. Na maioria dos casos. uma amostra deveria ser obtida à admissão no serviço de urgência e após seis a nove horas. Em pacientes com dosagens iniciais normais e com alta suspeita clínica de IAM deve-se repetir a dosagem entre 12 e 24 horas. Apesar da elevada especificidade das troponinas cardíacas. deve-se ter em mente que esses marcadores demonstram dano miocárdico, mas não sua origem, não sendo específicos do IAM. Portanto, deve-se manter um ativo intercâmbio com o laboratório, adorando o exame laboratonal como ma1s uma ferramenta para o auxílio diagnóstico, fundamentado em sólidos conhecimentos fisioparológicos e após anamnese bem feita, evitando-se, assim, equívocos na condução clín1ca com danos. às vezes irreparáveis, para os paCientes.
506 ( Medicina laboratorial para o clínico
REFERÊNCIAS 1. Achar SA. Kundu S, Norcross WA. Diagnos1s of Acure Coronary Syndrome. Am Fam Physician. 2005;72: 119-26. 2. Alpen JS, Thygesen K, Amman E, Bassand jP. Myocardial 1nfarwon redefined-a consensus document of The Jolnt European Society of Cardiology/America n College of Card iology Committee for the redefinition of myoca rdial infarction. JAm Coll Cardiol. 2000;36(3):959-69. 3. Apple FS, Quise HE, Doyle PJ, Otto AP. Murakam1 MM. Plasma 99th Percent1le Reference Limits for Card1ac Troponln and Creatine K1nase M B Mass for the use w1th European Sooety of Card1ology I Amencan College of Cardiology Consensus Recommendations. Clin Chem. 2003;49(8): 1331-6 4. Babuin L, Jaffe AS. Tropon1n: The B1omarker of Cho1ce for the Detewon of Card1ac lnJury. CMAJ. 2005;173(1 0):1191-202. 5. Bohner J. Ste1n W, Renn W, Stemhart R, Eggsce1n M. Srab11ity of Macrocreat1ne Kinases and (rearme Kinase lsoenzymes Compared: Heat lnacnvation Tese for Dererm1nat1on of Thermo srable Creanve Kmesis. JChnr Chem Cllm B1ochem. 1981:19:1021-6. 6. Burus CA. Ashwood ER, Bruns DE. T1etz Texrbook of CIII11Cal Chem1stry and Molecular D1agnosncs. 4th ed. St Lou1s: Elsev1er Saunders; 2006. 7. Goldman LE, E1senberg MJ ldentlficanon and Managemem of Pauems W1th Fa1led Thrombolys1s after Acure Myocard1al lnfarct1on. Ann lncern Med. 2000;132:556-65. 8 Jerem1as A. G1bson CM. Alternanve Causes for Elevared Card1ac Tropon1n Leveis When Acure Coronary Syndromes Are Excluded. Ann lmern Med. 2005;142:786-91. 9. NACB. The Academy of AACC. B1omarkers of AcULe Coronary Syndrome nad Heart Fadure. 2004 Draft Gu1· delines Vers1on 2. D1sponivel em: http://www.nacb.ol g/ 1mpg/card_b1omarkers_1mpg_drafr.hrm 10. Soc1edade Bras1le1ra de Card1olog1a. III D1rernz sobre Tratamento do lnfano Agudo do M 1ocárd1o. Arq. Bras. Cardiol. 2004; .83 (supl.4). D1sponível em: http://publicacoes. cardiol.br/consenso/2004I Dirl ll_Trata IAM.pd f.
39
Eduardo Pimentel Dias Luisane Maria Falei Vieira Maria Marta Sarquis Soares
METODOLOGIA DA PROPEDÊUTICA DO SISTEMA ENDÓCRINO: UMA VISÃO SISTÊMICA E AVALIAÇÃO CRÍTICA
A Endocrinologia é hoje uma importante especialidade da medicina, se considerar-se a sua área de aruação e o número de doenças abordadas. Isso decorre da variedade de órgãos (glândulas) envolvidos e da característica única da especialidade, que são os distúrbios de hiperfunção, quase inexistentes nos outros aparelhos. Apesar disso, é possível estabelecer uma mecodologia de abordagem diagnóstica bastante simples e intercambiável para qualquer glândula escudada.
ORGANIZAÇÃO DO SISTEMA ENDÓCRINO E SUA INFLUÊNCIA NA METODOLOGIA DE EXPLORAÇÃO DIAGNÓSTICA
A compreensão da organização do sistema endócrina (SE) é fundamenta l para o domínio da mecodologia a ser adorada na sua exploração propedêutica. O SE compõe, com os sistemas nervoso e imunológico, o grande complexo homeostático do organismo, cuja finalidade é gerar respostas adaptativas aos estímulos e agressões do meio ambiente. Esses sistemas se diferenciam pela maneira como veiculam suas mensagens e pela amplitude de tecidos orgânicos aptos a traduzi-las, gerando as respostas adaptativas necessárias. O sistema imunológico utiliza largamente, como mensageiros, células móveis. O sistema nervoso usa mensageiros químicos liberados na membrana si náptica (neurotransmissores) a partir de um sinal elétrico originado no
corpo celular neuronal e que se difu nde rapidamente pelo axônio, sendo então a maneira mais rápida de comunicação intercelular, porém gerando respostas adaptativas mais localizadas. O SE, por sua vez, veicula suas mensagens através de substâncias químicas (denominadas hormônios) capazes de modificar o comportamento celular, usualmente alterando a quantidade ou atividade enzimática intracelular. A difusão desses mensageiros ocorre por meio dos líquidos corporais. usualmente circulação sangüínea (ação endócrina). embora possa ocorrer difusão tecidual direta (ação parácrina). Como os hormônios se encontram disponíveis à maioria dos tecidos orgânicos. a resposta adaptativa é mais sistêmica, bastando a decodificação dos mesmos pelos receptores celulares que identificam e traduzem a mensagem. Como era de se esperar, um sistema homeostático com essa complexidade necessita de integração entre os seus componentes (SE/ S. nervoso/ S. imunológico). o que realmente ocorre. A interação SE/ nervoso explicitase anatômica e funcionalmente na unidade hipotálamohipofisária. na qual os neurônios hipotalâmicos secretam peptídeos reguladores da função hipofisária direcamente na circulação porta-hipofisária. de onde se difundem até a adeno-hipófise, estimulando ou inibindo a função das células dessa glândula. Embora embriologicamente pertencentes ao sistema nervoso, funcionalmente esses neurônios podem ser considerados células do SE. Isso permite estratificar o SE em dois serores principais:
. - - -- -- --
1. Setor regulador - responsável pela identificação
Receptor Sensor de Cálcio
das demandas adaptativas, avalia as necessidades orgânicas e secreta substâncias estimuladoras (hormônios tróficos) ou inibidoras (hormônios inibidores), que agirão sobre o seror efetor.
I
j. - - - - -8
2. Setor efetor - secreta hormônios que agem em âmbiro tissular (hormônio efetor ou periférico), modificando o comportamento celular, sempre procurando a resposta adaptativa. Esses dois serores se auro-regulam através de retroalimemação (feedback), usualmenre negativa, em que a oscilação nos níveis séricos do hormônio produzido pela glândula eferora gera alterações em senrido contrário no nível do hormônio trófico, secretado pela unidade reguladora (Figura 39.1).
Hipotálamo
~ u~ormônio ~ L1berodor
N íve l de Lesão
c=>
Célula Principal 1-----+ do Parotireáide
~
s
Figura 39.2 - Esquema da homeostase do cálcio pelas paratireóides e secreção do parawrmônio (PTH). A compreensão dessa organização permite entender a variedade de distúrbios que podem acometer o SE e a implicação que ela traz na interpretação dos dados clíni cos e laboratoriais.
Secundário
1-)
TIPOS DE DISTÚRBIOS DO SISTEMA ENDÓCRINO
+
Hipófise
~ ~
Clinicamente, ao se examinar um pacieme, o que se
UHormônio Tráfico
1- )
Terciário
+
ção) dos hormônios efetores. Desta maneira as queixas de desânimo, hipersensibilidade ao frio, ganho moderado
Tireáide Hormônio Efetor loção celular)
~
Primário
U
~Célula
o
Resposta Adaptativa
~ Insensibi lidade
L../
Açõo hormona l
Figura 39.1 - Esquema de organização do Sistema Endócrino (SE). Eixo Hipotálamo- Hipófise- Tireóide, como exemplo.
O SE apresema ainda um outro nível de organização, no qual as demandas funcionais são avaliadas diretamente pela glândula secretora do hormônio efetor ou periférico, não existindo, portanto, comrole direto pelo sistema nervoso. Essas glândulas são consideradas "glândulas livres" (Figura 39.2).
apresenta são sinais e sincomas decorrentes da exposição dos tecidos ao excesso (hiperfunção) ou fal ta (hipofun-
de peso, constipação intestinal e alteração de fâneros conduzirão facilmente à hipótese diagnóstica de hipotireoidismo (exposição dos tecidos a níveis inadequadamente baixos de triiodotironina). No entanto, esse hipotireoidismo pode etiologicamente ser resultado de uma lesão tireoidiana (hipotireoidismo primário), de uma lesão hipofisária, com conseqüente redução do hormônio trófico - TSH (hipotireoidismo secundário) ou, mais raramente, de uma lesão hipotalâmica (hipotireoidismo terciário). De maneira semelhante, ao examinarmos uma paciente com quadro clínico de hipercortisolismo (síndrome de Cushing), é indispensável estarmos cientes de que, etiologicameme, pode se tratar de uma lesão em uma das adrenais (adenoma adrenal), na hipófise (adenoma produtor de corticotropina - ACTH), com conseqüente hiperplasia de ambas as adrenais, ou, excepcionalmente, no hipotálamo. com hipersecreção do hormônio liberador
508 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1------ - - - - - - - - - - -- - - - -- - -- - - - - -
de corticotrofina - CRH - respectivamente, hiperfunção pnmária, secundária ou terciária. Além desses distúrbios de híper e hipofunção, o SE pode gerar quadros clínicos decorrentes do não reconhecimento (leirura) da mensagem adapcaciva (síndromes de insensibilidade à ação hormornal). Nessa siruação, um hormônio não é reconhecido pelos teodos, ma1s comumente por funCionamento 1nadequado do recepcor celular. Os pacientes porcadores de insensibilidade à ação hormonal apresentar-se-ào clinicamente como portadores de síndrome de hipofunção, mas os exames laboracoriais revelarão o diagnóstico de hiperfunção central (secundária ou terciária). O reconhecimento da complexidade do SE, com a possibilidade de quadros clínicos de híper e hipofunção escracificados em crês níveis principais (lesão primária, secundária e terciária), além da possibilidade ma1s rara de uma síndrome de insensibilidade à ação hormonal (Figura 39.1), tornam indispensáveis rigor e atenção na coleta e análise dos dados semióricos, resultando ainda em uma SIStemática para solicitação e interpretação dos dados propedêuricos que serão discutidos a segu1r.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL DO SISTEMA ENDÓCRINO
Embora a semiologia clín1ca desempenhe papel fundamental na formulação da h1pótese diagnóst1ca correra, em Endocrinologia, mais do que em qualquer outra especialidade, os exames laboratoriais são indispensáveis à confirmação diagnóstica. Isso decorre da superposição do quadro clínico que ocorre nas hipofunções/ hiperfunções primária, secundária e terciária, já que o quadro que se apresenta ao examinador reflete a exposição tecidual em níveis inadequados (deficientes ou excessivos) dos hormônios periféricos. A propedêutica laboracorial em Endocrinologia objetiva um diagnóstico inicialmente funcional e, a seguir, etiológico, baseando-se em um tripé constituído por: • dererm1nações hormona1s em siruação basal; • testes dinâmiCos; • imagem. Da correra utilização desses recursos deve resultar o diagnóstico de híper ou hipofunção e sua classificação em primána, secundária ou terciária.
DETERMINAÇÕES HORMONAIS EM SITUAÇÃO BASAL
São aquelas dosagens hormona is solicitadas sem que o SE esteja estimulado ou sujeico à supressão. Genericamente, são determinações de níveis hormonais em líquidos corporais, mais freqüemememe soro. plasma ou unna. Solicita-se habirualmente a dosagem de pares hormonais, na qual se medem, em uma mesma amostra. o hormônio efetor, produzido pela glândula periférica e responsável pela ação tissular, e seu hormônio trófico. A determinação dos pares hormonais fundamenta-se na organização do SE anteriormente discutida, na qual os componentes do par se relacionam por reuoahmentação, ou seja, a osc1lação do hormônio efetor desencadeia oscilação compensatória e em sentido oposto do hormônio trófico. Baseados nesses fu ndamentos, pode-se elaborar uma representação esquemática, que expressa essa relação e facilita a análise dos resultados (Figura 39.3). Hormônio Efetor
ü
Hiperfunção Secundária **
N
Hiperfunção Primária • •
Normo funçõo
D
Hipofunção Secundária •
Hipofunção Primária*
ü
N
D
Hormôn1o Trófico
· '1,oo·"nçõo • • ....p :ilunçõ·
Figura 39.3- Dtagrama para avaliação funoonal da SE utiltzando· se o par hormonal. Hormónto eferor no etxo das coordenadas e o hormônto trófico no e1xo das absctssas.
Usualmente, quadros clínicos francos, facilmente diagnosticados pelo exame do paciente são confirmados pela dosagem dos pares endócrinas. Uma vez alcançado o diagnóstico funcional. a propedêutica por imagem é utilizada para estabelecer a correlação função - lesão anatómica. Exemplificando, hipercortisolismo (Cushing) primário (ACTH independeme) = lesão adrenal. sendo indicados os exames por imagem (comografia ou ressonância magnética) para definir qual adrenal a ser abordada cirurgicamente.
M etodologia da propedêutica do sistema endócrina: um a vi são sistêmica e avaliação cr ítica
509
TESTES DINÂMICOS São solicitados usualmente após as dosagens basais. para esclarecimenro adicional. Fundamentam-se no princípio teórico de que o SE, para gerar as respostas adaptativas solicitadas pelo organismo, deve estar íntegro e ser capaz de alterar para mais ou para menos o nível de hormônio eferor disponível nos tecidos. Teste de estímulo: usualmente utilizado para o diagnóstico de hipofunção. Estimula-se (fisiológica ou farmacologicameme) a glândula a ser escudada e determina-se a sua capacidade de resposta (nível hormonal basal e após o estímulo). Teste de supressão: usado para o diagnóstico da hiperfunção. Procura-se suprim ir o funcionamento glandular, exacerbando-se a rerroalimenração. Os testes dinâmicos (estímulo e supressão) são estratégias complementares à determinação dos pares hormonais. Além da dificuldade de execução e do cusro mais elevado. já que pressupõem várias determinações hormonais e, às vezes, necessidade de hospitalização e padecem ainda da falta de padronização. Esses restes foram padronizados em indivíduos adulros. de peso normal e sem uso de qualquer medicamento. A sua utilização na infância e na terceira idade, em pacientes com excesso de peso significativo ou em uso de vários medicamentos, apresenta limitações de interp retação. Além disso, podem representar risco para o paciente (exemplo: reste de supressão de aldosterona, com infusão de soro fisiológico em paciente hipertenso, com suspeita de hiperaldosreronismo primário). Dessa maneira, devem ser solicitados por médico familiarizado com os mesmos, executados com supervisão adequada e interpretados com cautela.
IMAGEM Os vários recursos de imagem disponíveis devem ser solicitados após o diagnóstico funcional bioquímico, já que no arual estágio de conhecimento a correlação imagem/função é ainda exceção. Assim. devem ser solicitados como método complementar e usualmente após o diagnóstico funcional bioquímico. Algumas exceções já existem, como o emprego da ressonância magnética no diagnóstico de feocromocitoma. O uso
510 (
Medicina laboratorial para o clínico
indiscriminado dos métodos de imagem resulta na detecção dos incidentalomas. Essa denominação aplica-se ao achado de imagem desvinculado de qualquer repercussão clínica. O incidentaloma é considerado uma "doença" da alta tecnologia, demandando propedêutica extensa e de custo elevado.
ANÁLISE CRÍTICA DA ESTRATÉGIA PROPEDÊUTICA
Em relação à estratégia delineada, cabem considerações quanto às suas limitações. que decorrem da estratégia em si e aquelas dependentes dos métodos laboratoriais utilizados.
LIMITAÇÕES DEPENDENTES DA ESTRATÉGIA Dosagem dos pares hormonais
Na análise dos pares hormonais, é indispensável levar em consideração o denominado set point (ou ponto de ajuste) do feedback (ou retro-alimemação). Resumidamente, deve-se considerar como set point aquele ponto em que o nível de hormônio tecidual sinalizador da ação fisiológica em nível tissular é capaz de inibir a secreção do hormônio trófico, determinando uma concentração normal (dentro da faixa de referência) do mesmo. Usualmente. esse nível do hormônio tissular encontra-se em algum pomo dentro da faixa de referência laboratorial do mesmo. Exemplificando, na avaliação da função tireoidiana. set point é o nível de T4 livre que, dentro da sua faixa de referência (entre 0,8 e 1.7 ng/dL). acompanha-se de TSH na faixa de referência (0.3 a 4,0 mU/L). Dessa forma, um par hormonal com T4 livre dentro da faixa de referência, porém com TSH discretamente elevado, indicaria um hipotireoidismo primário subclínico (Figura 39.4, quadro A). De maneira inversa. uma dosagem de T4 livre na faixa de referência, com TSH suprimido (
é revelado pelo nível
terminado indivíduo, o que
inade-
quado do hormônio trófico.
e os seus dois componentes (hormônio tecidual e hormônio trófico),
• analisar o par como um rodo
Uma variante fisiológica desse conceito de set point é o ritmo circadiano do cortisol, que determina valo-
• correlação com o quadro clínico;
res de referência distintos para o cortisol plasmático
• identificar todos os fatores intervenientes.
pela manhã (5 a 26f1g%) e às 23 horas
individualmente;
(< Sflg%). Essa
variação circadiana se explica pela variação fisiológica no set point para feedback, que é mais elevado pela
LIM ITAÇÕES DEPENDENTES DOS MÉTODOS
manhã, exigindo, portamo, mais concentração de cor-
LABORATORIA IS
cisai para inibir a produção de ACTH. Esse set point reduz-se progressivamente durante o dia, alcançan-
Em circunstâncias normais, moléculas sinalizadoras,
do seu ponto mais baixo às 23 horas. Na doença de
como, por exemplo, hormônios, estão presentes em
Cushing (síndrome de Cushing por adenoma hipofi-
concentração muito baixa nos f luidos corporais (ng ou
é raro encontrar-se um
pg/ml). Além do mais, alguns hormônios apresentam
par hormonal com cortisol matinal normal ou discre-
semelhanças estruturais significativas. Desta maneira,
sária produtor de ACTH), não tamente elevado
e ACTH
normal (Figura 39.4, quadro
métodos de dosagem hormonal devem ter como carac-
e especificidade, o que torna
C). A interpretação correta para esse achado é que
terísticas alta sensibilidade
ocorreu um re-set do feedback (ou reposicionamento
os métodos imunológicos os mais adequados para de-
da retroalimentação), sendo necessário mais cortisol
terminação dos hormônios nos fluidos corporais. É in-
para manter o ACTH na faixa normal. A exposição dos
dispensável, portanto, na interpretação dos resultados,
tecidos a esse excesso de cortisol resulta no quadro
conhecimento básico sobre as lim itações ineremes aos
clínico de hipercortisolismo (síndrome de Cushing).
métodos util izados em Endocrinologia.
Hormônio Efetor
D N
D
Hiperfunção Secundário
c
Hiperfunção Primário*
A
Normofunção
B
Hipofunção Primária
Hipofunção Secundária
MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DO SE PRINCÍPIO DOS IMUNOENSAIOS As reações im unoquímicas formam a base de uma grande variedade de sistemas analíticos sensíveis
e
es-
pecíficos. Em um ensaio típico, anticorpos são usados
ü
N
D
Hormônio Trófico
Figura 39.4 - Diagrama represenrando: A: Hipofunção subclínica. B: Hiperfunção subclínica. C: reset de
feedback.
como reagentes para detectar a substância (antígeno) de interesse. Os anticorpos utilizados podem ser policlonais ou monoclonais. Os policlonais são obtidos de animais normais submetidos a esrímulo com imunógenos e são uma mistura heterogênea de anticorpos produzidos pela resposta imune. Os monoclonais são produzidos a partir de um único clone ou li nhagem plasmática e
Além dessas possibilidades, existem ainda interferên-
devem reagir com um único epitopo de um amígeno
cias externas ao SE, como as decorrentes de distúrbios
multivalente, significando que não devem apresentar
psiquiátricos e do uso de medicamentos.
reações cruzadas importantes nem formar macropre-
Em resumo, na análise de um par hormonal é indispensável:
cipitados. Uma vantagem prática do uso de anticorpos monoclonais é a possibilidade de uso de dois amicorpos
• perfeito conhecimento da fisiopatologia dos dis-
de especificidades diferentes em uma única incubação:
túrbios que afetam o eixo endócrina estudado;
um anticorpo ligado a uma fase sólida (aderido a uma
Metodologia da propedêutica do sistema endócrina: uma visão sistêmica e ava liação crítica
51 1
superfície). específico para o anrígeno-alvo (anahro). e outro anEicorpo marcado, específico para outro sítio antigênico do anal1ro.
não competitivos e enzimáticos. utilizando marcador quimiolumlnesceme. estejam emre os ensaios mais sensíveis disponíveis acualmente.
Tipos principais de imunoensaios
INTERFERÊNCIAS EM DOSAGENS HORMONAIS POR IMUNOENSAIOS
Os dois principais ti pos de reação usados em imunoensaios são: • compemivos - ensaios com limitação de reagenre; • não-competitivos - ensaios com excesso de reageme. tipo duplo sítio ou tipo sand uíche. O fundamenro analítico dessas técnicas foi abordado no capítulo 6.
SENSIBILI DADE ANAlÍTICA Um conceito laboratorial com o qual os endocnnologlstas devem estar familiarizados é o de "sens1bli1dade analítica". Os pnme1ros métodos para dosagem de TSH eram capazes de d1scriminar resultados na ordem de 1 mUI/L. Depois vieram os métodos capazes de discnm1nar resultados na ordem de 0,1 mU/L. Acualmence estão disponíveis e são recomendados os métodos chamados "terceira geração", capazes de discnminar resultados na ordem <0.02 mU/L e "quarra geração"com limites de 0,001 a 0,002mU/L. Mas, como compreender o que é "sensibilidade analítica"? A sensibilidade analítica de um método é definida por enr1dades como a lU PAC (lnternat10nal Union of Pure and Applied Chem1stry), mas pode ser encendida como uma relação entre o aumento de concentração do analito e o sinal gerado. Uma reação mais sensível consegue "perceber" pequenas alterações de concentração melhor que uma reação menos sensível. O termo é freqüememence confundido com o limite de detecção, que é a menor quantidade de um analito detectada de forma confiável (ou seja. a confiabilidade da distmçâo encre a ausência do analito e a presença de uma quantidade defin ida). O limite de detecção é geralmente informado como "resultado menor que X". Concudo. os termos são inter-relacionados. pois um método com alta sensibilidade analítica deverá ter baixo limite de detecção. Os marcadores enz1mát1cos introduzem um passo de amplificação do sinal. o que faz com que os imunoensaios
Há uma série de interferentes possíveis em imuneensaios. levando ramo a resultados falsamente elevados (bias positivo) quanto a resultados falsamenre reduzidos (bias negativo). Nesses casos, a pri meira suspeita freqüenremente virá do médico-assistenre. ao encomrar resulrados não compatíveis com os demais dados (clínicos e laboratoriais). pois cais ocorrências podem ser randômicas e em geral escapam ao controle da qualidade do laboratório. A esse laboratório cabe acolher os questionamentos e aval1ar as possibilidades de Interferentes de acordo com a merodologia utilizada. Este capítulo não pretende esgotar o complexo tema dos Interferentes analíticos e sim docar o médico de conheomenros básicos e ferramentas que possibilitem a melhor análise crítica dos resultados dos pacientes e a interação posit1va e ét1ca com o laboratóno clínico.
Variáveis pré-analíticas
Todos os fatores interferentes associados a constituintes das amostras são chamados de variáveis pré-analíticas. podendo ser subdivididas em facores associados ao paciente e em farores associados às amoscras. Farores associados aos pacientes. como o repouso. o fumo e o horário da coleta. podem afetar os resultados. mas não serão considerados aqui. O soro é o material (matriz) de escolha para a maioria dos imunoensaios (Quadro 39.1).
Efeitos analíticos
Os efeitos de matriz são defin1dos como "a soma dos efeitos de rodos os componentes de um SIStema de reação, com exceção do anahro a ser med1do" e,
naturalmente, incluem os reagentes e a amostra. Um dos problemas fundamentais relacionados à anál ise de materiais biológicos é a extremamente complexa e variada mistura de proteínas, carboidratos, lipídeos, pequenas moléculas e sais que constituem essas amostras. (Quadro 39.2 e 39.3).
Podem interferir com alguns ensaios para T4 Livre, bloqueando os sírios específicos e reduzindo falsamente os níveis do hormônio. Q uad ro 39.3 - Proteínas potencialm ente inrerferenres
Albuminas Quad ro 39.1 - Fatores inrerferenres associados às amostras
Colete de sangue - venoslose com aumento do concentração dos proteínas plosmólicos
Fotor reumatóide Complemento lisozimos
Tipo de amostro - Soro (com ou sem gel separador) ou plasmo (tipo de onticoogulonte)
Fibrinogênio
Hemólise e hiperbilirrubinemio Proteínas endógenas ligodoros de hormônio Lipemio Estabilidad e e armazenamento
N oto : Esses fatores são importantes poro o seleçõo do melado· logio e do fornecedor, pelo laboratório.
Q u ad ro 39.2 - Fatores inrerferenres associados aos rea-
Formos anormais de proteinos ligodoros de hormônios Auto·onticorpos contra hormônios tireoidionos Anticorpos heterófilos
Complt llk'rl!O
genres
Tampões - pH e forço iónico A nticorpos policlonois Anticorpos monoclonois Marcadores dos imunoensoios Separação dos froções ligados aos anticorpos dos froções livres
Noto: Esses fatores são importantes poro o seleçõo do metodologia e do fornecedor, pelo laboratório.
Efeitos das proteínas em geral Albumrno
A albumina pode interferir em decorrência de sua alra concentração e da sua capacidade de ligar e liberar grande quantidade de ligantes, como os hormônios. Fat01 reumntorde
Os facores reumatóides são auco-anticorpos, em geral de classe lgM, dirigidos contra a fração Fc das lgG e estão presentes em cerca de 5% da população normal.
O complemento compreende uma série complexa de proteínas que podem estar elevadas em diversas condições inflamatórias. Ligam-se ao fragmento Fc das imunoglobulinas, bloqueando os sítios de ligação a anticorpos, levando a resultados falsamente reduzidos. A investigação desse tipo de interferência cabe ao laboratório, que pode tentar reduzi-la, refazendo o reste em soro envelhecido em geladeira por alguns dias ou usando plasma coletado em EDTA. Lrsozrmo
A lisozima liga-se fortemente a proteínas de baixo ponto isoelétrico, como as imunoglobulinas, podendo formar pomes entre as lgG da fase sólida e os anticorpos marcados, levando a resultados falsamente elevados. Efeitos das proteínas endógenas ligadoras de hormônios
Estão presentes em concentrações variáveis no soro e no plasma e tanto os seus níveis quanto as suas caranerísricas de ligação sofrem influências genéticas e adquiridas. Particularmente relevantes são a albumina, a pré-albumina (transtiretina), as globulinas ligadoras de
Metodologia da propedêutica do sistem a endócrin a: uma visão sistêmica e avaliação crítica
513
hormônios sexuais (SHBG), tireoidianos (TBG) e corticosteróides (CBG). Para a dosagem de hormônios totais. é essencial que codas as moléculas ligadas a seus sítios endógenos sejam deslocadas e que se previna a posterior ligação dos complexos hormônio ligame-amicorpo marcado, formados duranre a reação, a esses sítios endógenos novameme. Cada sistema analítico emprega uma mewdologia para que esse objetivo seja alcançado. Contudo. alterações das proceínas ligadoras podem ter efeitos marcantes, como. por exemplo, a interferência de altos níveis de globulinas ligadoras dos hormônios sexuais (SHBG) nos radioimunoensaios direros para tescosterona e estradiol. Alterações na globuli na ligadora de tiroxina (TBG) são encontradas devido a variações genéticas, síntese aumentada, depuração metabólica diminuída ou por uma combinação desses fatores. Ocorrem alterações tam bém em uma grande variedade de condições clínicas e de uso de medicamentos. As variações de TBG afetam profundamente a interpretação das dosagens hormonais tireoidianas e podem contribuir para enganos diagnósticos. Duas estratégias foram desenvolvidas para contornar esse problema: primeiro. a estimativa de índices de hormônios tireoidianos corrigidos para a capacidade ligadora do soro (ITL-índice de tiroxina livre. atualmente em desuso) e, segundo, a medida direta de hormônios livres. Os índices são menos confiáveis. principalmente nos extremos de concentração das proteínas ligadoras (ex: gestação. deficiência ou excesso congênicos). Para a dosagem de hormônios livres, a única técnica disponível por muito tempo foi a diálise de equilíbrio, bastante laboriosa, de baixa produtividade e de alto custo. As técnicas diretas para as dosagens livres tornaram-se recentemente disponíveis e são cada vez mais popu lares. estando. contudo, ainda em evolução, devendo-se analisar seus resultados com bastante cuidado e em estreito contato com o laboratório. Efeitos das formas anormais de proteínas ligadoras endógenas
Proteínas ligadoras anormais podem estar presentes no plasma de alguns pacientes, sendo a condição hereditária mais freqüente a disalbuminemia hipertiroxinêmica
familial (FDH). Trata-se de uma condição autossômica dominante rara, na qual até 50% das moléculas de albumina ligam a tiroxina com uma afinidade cerca de 50% mais intensa que a normal. Os indivíduos com FDH têm concentrações de T4 Total e Livre até três vezes maiores que as normais e correm o risco de serem diagnosricados como tireotóxicos, não estando a concentração de TSH dos mesmos suprim ida. Efeitos dos auto-anticorpos para hormônios tireoidianos
Descriros inicialmente em 1956, anticorpos antiT4 e antiT3 são relatados em cerca de uma em cada 2.500 amostras. havendo vários relacos de interferência em ensaios para T4 Total e Livre. Nessas circunstâncias, os únicos métodos confiáveis são aqueles em que as proteínas são separadas dos hormônios antes da realização do imunoensaio. Os ensaios para tireoglobulina são particularmente suscetíveis a interferências por auto-anticorpos. existindo expressiva quantidade de literatura a respeito. Esses anticorpos são detectáveis em até 27% dos indivíduos sadios. em até 50% dos pacientes com doença de Graves. em até 95% dos pacientes com tireoidite de Hashimoco e em até 30% dos pacientes com carcinoma de tireóide. Os auto-anticorpos podem levar a uma estimativa falsa. tanto reduzida quanto aumentada, da tireoglobulina total. independentemente do método utilizado. Há métodos bastante sensíveis para a detecção de auto-anticorpos antitireoglobulina, devendo sua pesquisa ser solicitada juntamente com a dosagem de tireoglobulina. uma vez que os níveis dos respectivos auto-anticorpos flutuam no tempo. Efeitos dos anticorpos heterófilos
Anticorpos heterófilos têm sido relatados em 30 a 40% das amostras e podem ter especificidade pa ra várias espécies diferentes. inclusive algumas usadas habitualmente para a obtenção de anticorpos reagentes. como os camundongos. coelhos. ovelhas e cabras. Os anticorpos heterófilos podem interferir em reações do tipo competitivo. reduzindo o número de sítios disponíveis e levando a um bias negativo (aumenta do sinal e redução da concentração do analito). Em reações do tipo não-competitivo, tipo sanduíche com excesso de anticorpos, os anticorpos heterófilos podem levar a
514 ( Medicina laboratorial para o clínico ]~------------------------------
um bias positivo ou podem ser neutralizados pelo anticorpo em excesso. Alguns fabricantes adicionam aos seus métodos estratégias para a eliminação ou redução das interferências por anticorpos heterófilos. Essas estratégias podem ter sucesso apenas parcial e não há garantia coral da eliminação da Interferência dos anticorpos hererófilos. Com a implementação para uso in vivo de técnicas imunocintigráficas e quimioterápicas utilizando anticorpos monoclonais como veículo, a presença de anticorpos anticamundongo (HAMA. do inglês human anu-mouse antibody) vem se tornando um gra nde problema, principalmente para as dosagens de marcadores tumorais. Parece importante selecionar para uso m v1vo anticorpos que não sejam utilizados com final1dade diagnóst1ca. Interferentes mecânicos
Fibrinogênio presente em amostras incompletamente coaguladas interfere no processo de pipetagem auromátlca da maioria dos equipamentos e produz erros aleatónos. Paraprote1nem1a pode interferir por alteração da viscosidade, reduz1ndo o volume pipetado e os resultados. ou se ligando inespecificamenre a analicos e reagentes, levando a erros aleatórios. Interferentes inespecíficos
Interferentes inespecíficos podem surgir por concentração excessiva de outros constituintes do plasma. Ácidos graxos livres podem perturbar alguns ensaios para T4 Livre ao deslocarem o T4 das proceínas de ligação endógenas. A natu reza de alguns inrerferenres inespecíficos não é. ainda. bem conheoda. "Efeito gancho" (Hook Effect)
Um dos interferenres na dosagem de hormônios, pri ncipalmente quando se utilizam os mécodos de duplo am1corpo. é o efeito gancho (do inglês hook effect). também chamado de efeito de altas doses. Este ocorre quando existe, na amostra biológica, grande quantidade de analito a ser determinado. Nessa Situação. pode ocorrer ligação do analito em excesso ao anricorpo da fase sólida e ao anticorpo revelador (marcado) analiro. Como conseqüência. ao se proceder à lavagem, perde-se o anri-
corpo revelador que não se ligou ao analiro fixado à fase sólida, gerando si nal de imensidade bastante reduzida. O resultado dessa dosagem poderá ser baixo. normal ou mesmo pouco elevado em paciente com sinais evidentes de grande excesso hormonal. Na rocina laboratorial. a ocorrênCia de efeico gancho pode ser evitada de duas formas: • selecionando-se reações orimizadas para a minimização de efeico gancho. como. por exemplo. as que apresentam uma etapa de lavagem antes de acrescentar o anticorpo revelado r (ensaio em duas etapas). Atualmente. com a evolução dos ensaios. o efeito gancho torna-se cada vez mais raro e só ocorre com a presença de níve1s exrremamenre elevados do hormônio a ser dosado; • criando-se mdas as amostras a partir da realização de duas dosagens (diluída e sem diluir). Essa condu ta não é custo-efetiva e não se JUStifica na grande maioria dos sistemas analíticos atua1s. Quando o quadro clínico é característico de excesso de hormônio circulante e os níveis dosados não são compatíveis, o médico deverá suspeitar de efeito gancho e entrar em contato com o laboratório responsável pela dosagem para esclarecimenros. O laboratório investigará a possibilidade da presença de efe1to gancho e outras causas para o resultado discrepanre. A récn1ca para a confirmação de efe1ro gancho é realizar diluições sucessivas da amostra em questão (geralmente na ordem de 10: 1/10, 1/100, 1/1000 etc) até que se obtenham duas diluições sucessivas com níveis de hormônio equivalentes e mu1w elevados. Efeitos da inespecíficidade do ensaio
A espeoficidade é um dos requisitos mais importantes dos imunoensaios. A inrerferênoa ocorre em rodas as situações nas quais o anticorpo não é absolutamente específico para o hormônio. A baixa especificidade resulta em interferências causadas por compostos de estrutura molecular ou epiropos 1munorrearivos semelhanres. Ensaws com quanttdCicit lm11wdo dt ant,corpo 1eogentt (t.po compct:LM> ou UJ)O I)
Alguns dos maiores problemas quanro à especificidade são encontrados nas dosagens de esteróides e com-
Metodologia da propedêutica do sistema endócrina: uma visão sistêmica e avaliação crítica
515
postos estruwralmeme relacionados. Todos os ensaios mais usados para testosterona total, por exemplo, reagem de forma cruzada com a S'alfa-di-hidrorescosterona e wcualmente codos os ensaios para corcisol reagem de forma cruzada com a prednisolona. Oucros problemas ocorrem quando os ensaios são usados fora do conrexw para o qual foram desenvolvidos e restados. como, por exemplo, em neonacos. A interferência de drogas e seus metabólicos é um problema comum em imunoensaios. As drogas podem interferir por reatividade cruzada do compostO nativo ou de seus metabólitos, por deslocamento dos hormônios das proteínas de ligação e por suas ações fa rmacológicas. Há grande volume de referências a respeito e recomenda-se a consulta ao livro Young, Ejfects of Drugs on Clinical Laboratory Tests: Washington DC: 1995, sempre que se apresentar potencial interferência de drogas. Lt i iWO~ l(JIIl CXCC\SO
de (lllfiCOipO rcfl~CIItt
(',Pt) PtiO
OD't t !1t LU
ou tipo 11)
Os ensaios não-competitivos apresentam relações mais complexas entre o analico, os reagentes cruzados e os anticorpos reagentes que os ensaios competitivos. A falta de especificidade e até a hiperespecificidade dos ensa1os desse tipo podem levar a interpretações erróneas. Ensa1os não-específicos tipo único sítio para hormôniO da paratireóide (PTH) moscram níveis elevados de PTH 1munorrearivo, particularmente em pacientes com 1nsufioênc1a renal que não depuram adequadamente os fragmentos C-term1na1s. O uso de ensaios tipo du plosíno para PTH intacto (N-terminal), que não reagem de forma cruzada com o C-terminal, fornece um quadro ma1s verdade1ro do status do paciente. O que deve ser feico quando se suspeita de interferênoa7 A prime1ra conduta do médico deve ser entrar em contaw imediatamente com o responsável técnico do laboratório que realizou a dosagem. Juntos, devem trocar Informações clínicas e metodológicas que possam levar a hipóteses quanto à presença e tipo de interferência. A seguir, poder-se-á optar pela utilização de uma metodologia alternativa para a realização de nova dosagem na mesma amostra ou em outra, o que for mais indicado. O auxílio do profissional de laboratório é importante, pois a metodologia alternativa poderá estar disponívelapenas em determinado(s) laboratório(s). sen-
516 ( Medicina laboratorial para o clíntco
do de boa prática envolver o ourro responsável técniCO na investigação do problema de forma transparente. Ainda, em alguns casos, poderá ser necessário acionar a assessoria científica do fabricante do sistema analítico, no Brasil ou no país de origem.
t papel do profissional de laborarório, do médico e da indústria diagnóstica o reconhecimento das inúmeras possibilidades de interferências, devendo todos os envolvidos atuar na minimização dos problemas e nos esforços para o seu esclarecimento.
APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA O DIAGNÓSTICO ENDOCRINOLÓGICO
As técnicas de biologia molecular têm muito valor não só nas questões de investigações básicas como no entendimento de uma variedade de problemas que afetam a condição humana em geral. A prevenção de doenças, geração de novos produtos protéicos, manipulação de plantas e animais para a aqwsição de traços fenotíp1cos específicos são aplicações dos métodos utilizados por essa tecnologra. A util1zação de técnicas de biologia molecular tem, ainda, propiciado melhor compreensão dos mecanismos de ação hormonal, bem como das bases moleculares de vánas síndromes já conhecidas clínica e bioqu1m1camente. As características moleculares dos tumores prenunciam seu comportamento, o que permite delinear tratamentos mais efetivos. O conhecimento de que muitas doenças endócrinas têm como causa mutações em um único gene pode ser crucial nas decisões terapêuticas e nos rasrreamentos de indivíduos com o risco de apresentarem determinada doença. Desse modo, faz-se necessário um entendimento da nomenclatu ra utilizada em biologia molecular e genética. para a compreensão global da endocrinologia moderna. Ao se iniciar o estudo genético de uma endocrinopatia, o primeiro objetivo é determinar, dentre os milhares de genes. qual é o responsável por aquela determinada doença. Escolhem-se os genes candidatos a partir do conhecimento daqueles que concrolam os mecan1smos de açào hormonal ou que codificam proteínas que controlam o crescimento e desenvolvimento celulares ou que já estejam envolvidos em outras doenças relac1onadas já conhecidas. Por exemplo: o conhecimento prévio de
)1------- - - -- - - -- - - - - -- - -- - -- - - - - -
que o carcinoma medular de tireóide (CMT) é causado por mutações no proto-oncogene RET leva à procura da mesma mutação nos casos de neoplasia endócrina múltipla tipo 2A onde o CMT se faz presente. Uma vez determinado o local que se deseja estudar, é necessáno que se amplie a quam1dade de matenal genético d1sponível. Existem várias mane1ras de produZir cóp1as suficientes de um gene a ser escudado. A clonagem é uma delas, na qual o gene a ser cop1ado é inserido no DNA de uma bactéria. Cada vez que a bactéria se reproduz, seu DNA e o gene inserido serão copiados e, como as bactérias se multi plicam muito rapidamente, bilhões de cópias do gene original poderão ser produzidos num período curto de tempo. Um método m v1tro mais simples e mais rápido revoluc1onou a amplificação de seqüências delimitadas de DNA presentes em uma amostra - a reação de polimerização em cadeia (PCR). Com essa técnica, consegue-se a amplificação m v1tro. Após a obtenção do segmento desejado em quantidade suficiente, submete-se esse matenal a diversas técnicas existentes para o rastreamento de mutações, que são alterações na seqüênoa do DNA genômico que podem ser passadas de uma célula mãe à célula fil ha. Em várias doenças genéticas pode-se herdar um alelo com mutação, detectável por diferenças na mobilidade do DNA em um gel de poliacrilamida. O polimorfismo conformaoonal de fita única (SSCP, single stranded conjormat1onal polymorphísm) e a eletroforese em gel com gradiente desnacurante (DGGE, denatunng grad1ent gel electrophores15) rastreiam a presença de mutações baseadas em diferenças no pad rão de migração do DNA. Outros métodos podem ser utilizados para detectar-se a presença de mutações quando se comparam o matenal afetado e o não afetado (sangue e rumor, nas mutações somáticas). Como exemplos, têm-se as técnicas que utilizam microssatélites, que ajudam na compreensão dos mecanismos envolvidos na formação de rumores e as técnicas de cirogenética, como a hibridização genômica comparativa, em que se procuram ganhos ou perdas alélicas, analisando todos os cromossomas e comparando sangue com tumor ou teodo normal com afetado. Recentemente, a quantificação da expressão gên1ca a partir de técnicas sofisticadas como microarray ou PCR em tempo real tornou possível maior detalhamemo da participação dos genes nos mecanismo etiopatogênicos das doenças.
Após a obtenção de um rascreamenco positivo, o objetivo passa a ser a análise da seqüência alterada. O seqüenciamemo é o método mais sensível e específico para detecção de mutações. O método baseia-se na síntese de uma fita de DNA por uma DNA polimerase, a partir de um molde de fica simples. Comparada a seqüência estudada com um banco de dados de genes já existente pode-se verificar qual aminoácido é alterado e sua possível repercussão na estrutura da proteína. Na detecção de mutações já conhecidas, a hibridização alelo-específica, que utiliza oligonucleotídeos (sondas) contendo seqüênCias que levam à doença, é uma arma simples e rápida. É uma técntca adequada para estudo famdtar (ver capítulo 7). Atualmeme, a utiltzação da maioria dessas técntcas ainda fica restrita a laboratórios de pesquisa. Na Endocnnologia, teve-se como contribuição o conhecimento da estrutura gênica dos hormônios e de seus receptores, dos seus mecantsmos de ação através das vias imracelulares de Sinalização e das várias mutações que explicam o mecanismo ftstopatológtco das resistências hormona1s e de vánas doenças ames ttdas como td1opát1cas. Por exemplo. o gene do recepror do hormônio tireotrófico (TSHR) está implicado na gênese de rumores hiperfunoonantes da tireótde (adenomas tóxicos); mutações no gene do receptor de hormônio luteotrófico (LH-R) levam aos adenomas de células de Leydig; mutações nas vias imracelulares de sinalização da insulina explicam alguns tipos de diabetes; mutações em proteínas que controlam o ciclo celular, como a menin, levam ao hiperparatireoidismo ou à neoplasia endócrina múltipla tipo 1; e assim por diante. Além dessas. o rasueamemo de doenças geneticamente conhectdas, como o carcinoma medular de meótde e deftoênoa de 21 hidroxtlase, 1dent1ficando doentes ou carreadores heteroz1gotos. também demonstra a grande comributção dessas técnicas. po1s têm-se marcadores moleculares capazes de proporoonar detecção precoce numa fase pré-clínica da doença. podendo até mesmo evitar seu aparecimento. Os distúrbios do cresctmento, o hipoparatireoidismo e outras endocnnopattas ganharam novas classificações, que surgiram freme a esses novos conhemnentos que não param de ser ampliados e que lllfluenciam, cada vez mais. as condutas. as investigações laboratoriais e que. no futuro próximo, poderão resultar na possibilidade de terapia gênica que resultará em abordagem terapêutica mais eficaz.
Merodo logia da propedê utica do sistema endócrina: uma visão sistê mica e avaliação crítica
517
CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS 1.
As doenças do SE caracterizam-se por sintomas variados, freqüentemente provenientes de sistemas orgânicos
2.
distintos, o que torna a avaliação semiótica indispensável na elaboração da suspeita d iagnóstica. A confirmação
des-
sa suspeita fundamenta-se na propedêutica laboratorial. que se baseia quase uniformemente na estratégia descrita.
Barralana L. Robbins J. Thyro1d hormone transpor r proreins. Clin Lab Med. 1993;13:583-98. Baxrer JD. An overv1ew of rhe evolurion funwons. and organizatlon of rhe endocnne sysrem. ln: Felig P. ed1ror. Endocrinology and Merabol1 sm. New York: McGraw Hill;
1981 p. 15-28. 3.
Baxrer JD. lnrroducrion to endocrinology. ln: Greenspan FS, Srrewler GJ. edirors. Basic and Clinical Endocrinology. 5th ed. Sramford: Appleron e Lange; 1997. p. 1-38. 4. Burris CA, Ashwood ER. Tierz Texrbook of Clinical Chemisrry. 2nd ed. Philadelph1a: W. B. Saunders; 1994. 5. Kacsoh B. Laborarory evaluarion of rhe Endocnne Sysrem ln: Kacsoh B Endocrine Physiology. New York: McGraw Hill; 2000. p.99 - 119. 6. Larrônico AC. Os Grandes Avanços da Endocrinologia na Era Genômica. Arq Bras Endocnnol Merab. 2002;46{4):323-4. 7. Selby C.lnrerference in lmmunoassay. Ann Clin B1ochem. 1999;36:704-21. 8. Spencer CA. Takeuchi M. Kazarosyan M. Currenr srarus and performance goals for serum rhyroglobu lm assays. Clin Chem. 1996;42:164-73. 9. Wilson JD. Principies of Endocrinology. ln: Wilson JD. Fosrer DW. Williams Texrbook of endocri nology. 8d1 ed. Philadelph1a: W. B. Saunders; 1998. p.1-10. 10. Young DS. Effecrs of Drugs on Clu11cal Laborarory Tesrs. 4th ed. Washington DC: Amencan Association for Clinical Chemisrry; 1995.
Maria Marta Sarquis Soares Luisane Maria Falei Vieira Eduardo Pimentel Dias
40
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DOS DISTÚRBIOS DA FUNÇÃO TIREOIDIANA
Com sua importância descrita pela primeira vez no
um transportador específico existente na membrana
final do século XIX, a tireóide produz horrnônios com
basolateral das células tireoidianas, o co-t ransporra-
ação sistêmica atuando na maioria dos órgãos. É urna
dor sódio-iodeto (NIS, Na+; l- Symporter). O iodeto
glândula endócnna, ímpar e mediana, localizada na
é transportado através da membrana apical da célula
parte anrenor e infenor do pescoço, abaixo da laringe,
folicular por outra proteína importante nesse proces-
d1anre dos primeiros anéis da traquéia. Ela é constituída
so, a pendrina. Na interface apical da célula folicular
por dois lobos laterais reunidos na linha média por uma
com o colóide. o iodeto é oxidado e incorporado em
lâmina achatada de tecido tireoidiano, o istmo. Os hor-
regiões específicas (resíduos tirosil) das moléculas d e
môniOS tireoidianos são derivados iodados de aminoá-
rireoglobulina (TG), que é a principal proteína produ-
cidos e constituem no homem as princ1pais moléculas
zida pela tireóide, correspondendo a 70-80% do con-
1odadas do organismo.
teúdo protéico da glândula. Os resíduos t irosil podem ser monoiodinados, dando origem às monoiodotirosinas (MIT) ou bi-iodinados, originando uma diiodoti-
FI SI OLOGIA
rosina (D IT).
SÍNTESE HO RMONAL
nal é a peroxidase rireoidiana (TPO), responsável pela
A principal enzima relacionada à biossíntese hormoox1dação do 1odeto e sua incorporação aos rad icais rirosil Os hormônios tireoidianos são necessários para a
da molécula de t ireoglobulina. Existem dois sítios catalí-
diferenciação, crescimento e metabolismo de diversos
ticas na TPO. um para se ligar ao 10deto e outro para se
tecidos dos vertebrados. Entre as ações fisiológicas des-
ligar à t irosina. presente na ti reoglobulina.
ses hormônios incluem-se o desenvolvimento de tecidos
A s iodotirosinas assim formadas são acopladas
como, por exemplo, o do sistema nervoso, a regulação
por meio de um remanejamenro estérico oxidativo
de funções básicas como consumo de oxigênio. tempe-
da proteína, dando origem aos hormônios t ireoidia-
ratura corporal e freqüência cardíaca. além do controle
nos: tetraiodo tironina (T4), que é a principal forma, e o
do metabolismo de carboidratos, proteínas e gorduras. O iodeto é a matéria-prima essencial à biossíntese
t riiodotiron1na (T3), secretado em menor quantidade. O total plasmático de T4 é aproximadamente 45 vezes
versus 2nM) e a principal fon -
dos hormônios da tireóide. O iodem proveniente da
maior que o de T 3 (90nM
dieta é absorvido no trato gastrintestinal. sendo cap-
te de produção de T 3 ocorre a partir da conversão de T4 em T 3 por meio da S'desiodação de T.. nos tecidos
tado pela tireóide na corrente sangüínea. a partir de
periféricos promovida pelas desiodases. Apenas 18%,
(exponenciais) compensatórias e em sentido contrário
T3 circulante é proveniente de
do TSH, comando-o o parâmetro laboratorial mais sensí-
aproximadamente, do
vel para o diagnóstico precoce da disfunção tireoidiana.
secreção tireoidiana. Uma vez secretados. os hormônios tireoidianos circulam comumente ligados às proteínas plasmáticas e somente 0,03% de T4 e 0.3% de T estão livres. 3 A ligação desses hormónios às proceínas plasmáticas
DETERMINAÇÕES HORMONAIS
aumenta suas meias-vidas e assegura a distribuição re-
CARACTERÍSTICAS DOS MÉTODOS ANAlÍTICOS
gular do hormônio nos tecidos-alvo. No interior da cé-
DE DETERM INAÇÃO DE TSH NO PLASMA
lula. o T3 1iga-se a recepwres específicos localizados no núcleo, os recepwres do hormônio tireoidiano (TRs).
As dosagens de TSH eram, originalmente, baseadas
Os TRs medeiam a ação do hormônio ligando-se di-
em bioensaios. No momento. o imunoensaio é o pro-
retamente na região promowra dos genes-alvo, regu-
cedimento de escolha nos laboratórios. O imunoensaio
lando a transcrição em todos os tecidos de mamíferos.
wrnou-se um teste de rotina após a disponibilidade de
Existem evidências de que os hormônios tireoidianos
TSH purificado para imunização e iodinação.
podem exercer alguns de seus efeiws também via mecanismos não genômicos, ativando cinases, calmodulina. captação de glicose em vários tecidos e modulam
Radioimunoensaio (RIE)
o transporte de cálcio. O ensaio tradicional (RIE) era baseado na competição entre o TSH endógeno e o marcado com raCONTRO LE HOMEOSTÁTICO DA
dioisówpo por sít ios de ligação (anticorpos antiTSH)
SÍNTESE HORMONAL
disponíveis para uma quantidade limitada do hormônio. A quantidade de TSH marcado ligada era inversa-
O eixo hipocálamo (TRH - hormônio liberador
mente relacionada à concentração de TSH presente
de tireotrofina) - hipófise (TSH - hormônio tireotró-
na amostra. A determinação de TSH por RIE mostrou-
fico) - tireóide (T3 e T4) destina-se a fornecer aos te-
se muito útil na detecção dos níveis elevados de TSH
cidos quantidades adequadas de T4 e T3, de maneira
que ocorrem no hipotireoid ismo primário. Contudo,
a atender às necessidades fisiológicas do organismo.
como ela podia detectar apenas lmU de TSH por litro
A produção dos hormônios tireoidianos é estimulada
(ou 1~U/ml). muitos RIEs não conseguiam distinguir
pelo TSH, sintetizado e secretado pela hipófise. Nos
os valores normais dos valores subnormais associados
pacientes com o eixo hipotálamo-hipófise-tireóide
ao hipertireoidismo.
(HHT) intacw, um sistema de retroalimentação
(fe-
edback) negativo entre as concentrações de T4 e T3 livres (T4L e T3L) e o TSH controla a função tireoidiana. A hipófise funciona como um sensor biológico dos níveis de hormônios tireoidianos disponibilizados aos tecidos e regula a secreção do TSH. ohjetivando
de medir os níveis diminuídos de TSH enconrrados
e T3L. A
nos casos de hipertireoidismo primário. Essas novas
a manutenção de níveis adequados de T4L
Ensaios imunométricos Novas técnicas imunométricas são agora capazes
redução dos níveis de T4L e T3L est imula a produção
metodologias resultam da aplicação do princípio do
de TSH. enquanto o aumento desses níveis suprime a
"sanduíche", no qual uma molécula de TSH forma
secreção de TSH .
uma ponte entre dois ou mais anticorpos antiTSH dis-
Quando o eixo está preservado e em equilíbrio, exis-
tintos. O primeiro anticorpo (Ac). geralmente mono-
te uma relação log-linear inversa entre a concentração de
clonai. é dirigido contra um sítio específico da subu-
e T4L no plasma. ou seja, pequenas oscilações (line-
nidade beta e é ancorado a um suporte (fase sólida).
ares) no nível de T4L desencadeiam grandes oscilações
Esse anticorpo está presente em excesso e seletiva-
TSH
520 [ M edicina laboratorial para o clínico ]~-----------------------------
mente imunoexuai a maior parte do TSH presente na amostra. O hormônio ligado é então quantificado, utilizando-se um segundo Ac antiTSH (monoclonal ou policlonal). que é dirigido contra um sítio antigênico distinto (por exemplo, a subunidade alfa). Esse Ac de detecção é marcado com uma molécula sinalizadora, como um radioisócopo, uma enzima, um uoróforo ou uma molécula luminescente. Os resultados do ensaio são usualmente calibrados contra uma preparação de referência de TSH e são expressos em miliunidades internaCionais de atividade biológica por litro de soro mU/L (ou iJU/mL). Contrariamente à curva inversa de dose/resposta do RI E, os ensaios imunométricos apresentam uma curva positiva de dose/resposta, na qual os níveis mais altos de sinal correspondem às maiores concentrações do TSH. O efeico gancho (hook ejfect). presente quando há grande quantidade de antígenos, é raramente visco. Os ensaios imunométncos oferecem não só mais sensibilidade às med1das de TSH como também menos tempo de resposta (tum around time) e faixa de linearidade mais ampla. Por questões práticas. métodos não isotópicos dominam o mercado e substituíram os traçadores radioativos na maioria dos laboratórios.
Sensibilidade analítica dos métodos
Para distinguir os ensaios imunométricos de TSH dos RIEs menos sensíveis. termos descritivos como "sensível", "altamente sensível", "ultra-sensível" e "super-sensível" foram usados e houve grande confusão sobre o significado dos mesmos. Em 1991, o Comitê para Nomenclarura da American Thyrotd Associatton recomendou que o limite funcional de detecção de TSH fosse estimado com base nas características de precisão do ensaio nos limites inferiores de detecção. Atualmente, a sens1bil1dade funoonal é definida como "a menor concentração de TSH na qual o coefioente de vanação 1nterensa1o inferior a 20% ainda é obtido". Assim. à medida que a concentração de TSH em uma amostra se aproxima de zero. a precisão do ensa1o diminui, ou seja. há ma1s variação do resultado obt1do em corno do valor real de TSH da amostra. Amostras com concentrações cada vez menores de TSH são analisadas em ocasiões distintas (interensaio) e a dife-
Investigação laboratorial dos distúrbios da função tireoidiana
rença entre os valores obtidos é calculada em termos de porcentagem (variação). A menor concentração de TSH na qual a variação entre os resultados for inferior a 20% é considerada limite funcional de detecção do ensaio. Esse limite de detecção abrange tanto as variações analíticas (devidas ao sistema analítico do laboratório) quanto biológicas (atribuíveiS ao organ1smo) e, portanto, permite que níveis distintos de TSH reportados indiquem diferenças reais no paciente, nos níveis inferiores da linearidade. Ao mesmo tempo, o uso desse limite assegura que o nível de TSH encontrado seja realmente diferente de zero, não importando quão ínfima seja sua concentração.
Classificação de ensaios de TSH em "gerações"
Uma classificação de ensaios de TSH em "gerações". baseada na sensibilidade funcional. foi proposta para descrever as melhorias nos ensaios de TSH. Cada geração representa uma melhoria de um log no limite de detecção funciona l. Os ensaios de primeira geração (RIEs) apresentam tipicamente um limite funcional de detecção de 1 a 2 mU/Le são incapazes de detectar, de forma confiável. a supressão do TSH, caracrerística do h1perrireoidismo primário. Os ensaios imunométricos subseqüentes apresentam sensibilidade cerca de 10 vezes maior (0,1 a 0,2 mU/L) e são considerados ensaios de segunda geração. Estes são basrame confiáveis quanto à distinção entre valores normais e valores encontrados no hiperrireoidismo. tendo, contudo, aplicação limitada para distinguir valores moderadamente subnorma1s (0,01- 0,1 mU/L) de valores muico suprimidos (< 0,01 mU/L). Isto é. pacientes com diferentes valores in vtvo poderão apresentar valores laboracoriais semelhantes, quando se usa para determinação os mécodos de segunda geração. Os ensaios imunométricos de terceira geração foram desenvolvidos de modo a se obter precisão ainda maior nos níveis baixos de TSH. A maioria deles utiliza tecnologia quimioluminescente e rem limite funcional de detecção inferior a 0,02 mU/L. Há ainda ensa1os experimentais de quarta geração, com limites funcionais na faixa de 0,001 a 0.002 mU/L. Os ensaios de terceira e quarta gerações fornecem os limites inferiores de detecção necessários para distinguir valores de TSH subnormais limítrofes (como aqueles presentes
521
em pacientes eutireoidianos, hospitalizados, com doenças não tireoidianas) daqueles valores suprimidos encontrados no hipertireoidismo franco. E mais, esses ensaios parecem ser úteis na subclassificação de pacientes hipenireoidianos, de acordo com o grau de supressão do TSH; no acompanhamento a pacientes com câncer da tireóide, recebendo tiroxina, onde se procura a supressão da secreção de TSH; e na monitorização de terapia de reposição em pacientes com hipotireoidismo. Contudo, nem rodos os ensaios quimioluminescentes são capazes de apresentar desempenho quanto ao limite de detecção consistentemente de terceira geração. Na Tabela 40.1 estão demonstrados os valores de referência para os hormônios tireoidianos, ressaltando que são método dependente e da população analisada (ver capítulo 2).
DETERMINAÇÃO DO T4 LIVRE A tiroxina e a triiodoti ronina circulam no sangue como uma mistura, em equilíbrio, de hormônios livres e ligados às proteínas. Assim sendo, alterações da concentração ou afinidade da globulina ligadora de tiroxina (TBG) ou outras proteínas de transporte afetam a con centração total desses hormônios no soro. Alternativamente, o nível de equilíbrio (steady state) do hormôn io livre é independente das variações nas proteínas de ligação e se mantém quase constante. Numerosos métodos foram propostos para determinar a concentração de T4L no soro. Esses métodos incluem os diretos, que servem como referência, e os indiretos, mais amplamente disponíveis nos laboratórios clínicos.
Métodos Diretos de Referência
A determinação direta de T4L no soro representa um considerável desafio técnico. As concentrações de hormônio livre são extremamente baixas no soro normal (aproximadamente 0,03% do T4 total sérico). Conseqüentemente, o ensaio deve ser capaz de medir quantidades da grandeza de picomoles (10-'2 ). Teoricamente, os métodos mais confiáveis para dosar T4L são a diálise de equilíbrio e os métodos de ultrafiltração, que separam o hormônio livre do hormônio ligado por métodos físi-
522
Medicina laboratorial para o clínico
cos ames da dosagem direta da fração livre, com o uso de um ensaio imunomécrico sensível.
Métodos lndiretos Para Estimar T4 livre
A maior parte dos métodos para determinar as concentrações de T4L é estimativa. Essas abordagens são mais convenientes e mais baratas que os métodos de referência e muitas estão disponíveis comercialmente. Duas estratégias são usadas: o cálculo de um índice (ITL) ou um imunoensaio. O cálculo do índice baseiase na realização de dois testes separados: a dosagem de T4 total e a captação de T3. Esses dois resultados são combinados matematicamente para fornecer uma estimativa da concentração de hormônio livre. Imuneensaios em um ou dois passos determinam a concentração de hormônio livre usando técnicas de extração por anticorpos. Esses métodos realizam a determinação indireta de T4 Livre, pois os resultados dos testes são relacionados a calibradores de onde o soro é extraído e cujo nível de hormônio livre foi independentemente determinado utilizando-se um método de referência (ex.: diálise de equilíbrio direta/RIE).
DETERMINAÇÃO DE T3 TOTAL E T3 LIVRE Embora disponível, a determinação de T3L ainda não se tornou rotineira na prática clínica. Quando necessária a avaliação do nível de triiodotironina plasmática, utilizase mais freqüentemente a dosagem de T3 total (T3T). A principal indicação desse exame é o diagnóstico de hi pertireoidismo por T3, que ocorre em menos de 10% dos casos de hipertireoidismo. Como acontece com o T4 total (T4T), o ensaio de T3T sofre influência das variações das proteínas transportadoras.
A UTILI ZAÇÃO DO REFLEX TESTING Segundo a tendência moderna, a avaliação da função tireoidiana de modo racional e custo efetivo seria melhor realizada utilizando-se o reflex testing, abordagem em que o resultado do primeiro teste (geralmente a dosagem do TSH) determina a realização ou não de outros.
Tabela 40.1 -Valoresde referência dos hormônios meo1dianos Analito
Intervalo de Referência*
Método
Ant,corpo Anhperax1dase (Ant TPOJ
0 ,0 o 3,9 Ul/ml
lmunoensoio por quimiolum1nescênc1o
An•,corpo Anhhreog obulino
OO o 4 4 Ul/ml
lmunoensoio por ouim:alum,nescênclo
Hormônio Est•mulodor do T,reóide (TSH)
0 ,300 o 4 ,000 mU/ L (Adultos)
lmunoensoio por quimioluminescênc,o . Terceiro Geração
lreoglooul no
1.3 o 31 8 ng/ml (Adu.tos)
lmunoensa1o por qUimiOium,nescêncla
Tiroxina IT4 Total)
4 ,2 o 11,8 fJ9 / d l (15 o 20 anos) 5,1 o 14 lfJg/ dl (21 anos e ocimo)
lmunoensoio por quimioluminescêncio
Tr IO' l011ron no (T3 To·ol
102 o 200 ng JL (10 o 19 01 osl 80 o 200 ng 'd (20 on,.,s e oc mo:
lmunoensoio por cu .mdumlnescência
T4 livre
0,9 o 1,5 ng/dl (12 o 17 anos) 0,8 o I 7 ng/dl (18 anos e oc mo)
lmunoensoio por qu:m!Oiuminescêncio
T3 l vrc
3,6 o 7 5 pg;ml (14 o 17 O'lOSI 3.2 o 6.6 pg/ ml (18 anos e ocimo. exce1o gestortes) 3.0 o 5 7 pg ml (Gestontesl
o·é ise de Equ1 íono/ HPLC Esooctrornel'lo de M ossa
Captação de T3 (T3 Uptokel
28 o 41 %
lmunaensaia por qu imiolum~nescência
no e de Tiroxina livre (FTI)
1.4 o 4 ,2
lmunoensa o por qu1ml0ium.nescenc1a Cálculo
• Intervalos de referência são dependentes do sistema onolílico e do população. Valores odaplados de ARU P loborotories. apresento dos o penes o ·ruo oe exemp o TSH sensível
["·t I
l
Suspe~to ~
Hipot ireoi d is ~
Figura 40.1 - Rastreamento das disfunções ure01d1anas.
CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS DE HIPERTIREOIDISMO E HIPOTIREOIDISMO
A Amencan Thyratd Assooatton (ATA) recomenda que a redução dos níve1s de T4L. acompanhada de elevação dos níveis de TSH, seja cmério diagnóstico de
Investigação laboratorial dos distúrbios da função rireoidiana
hipocireoidismo primário e que a elevação do T4L com redução do TSH (determinado por mérodo sensível) a níveis rnferiores a O,lmU/L seja critério diagnóstico para o hiperttreoidismo. A ATA ressalta, em retamo. que o nível de TSH sénco é ma1s sensível que o T4L para o diagnóstiCO de ambas as Situações. Dev1do à alta freqüência de
523
disfunção tireoidiana na prática clínica, rorna-se necessária a adoção de estratégia que permita o diagnóstico dos casos sem elevação significativa dos custos. A Figura 40.1 apresenta uma proposta de rasrreamenro semelhante a várias outras já encontradas na literatura. Esse protocolo rem-se mostrado eficaz no diagnóstico da disfunção rireoidiana primária. Entretanto,é necessário ter em mente que, nos pacientes com disfunções hipofisárias ou hiporalâmicas (hiper e hiporireoidismo secundários ou terciários), a dosagem de TSH não é sensível, podendo, inclusive, encontrar-se elevada no hipotireoidismo secundário (hipofisária). Como a imensa maioria dos distúrbios do eixo HHT ocorre em nível primário (acometimento da tireóide), justifica-se a adoção desse protocolo. Os distúrbios secundários e terciários são acompanhados freqüentememe por sinais e sintomas de comprometimento das oucras funções hipofisárias. Sempre que houver suspeita clínica de acometimento hipofisária, portamo, é imperativa a determinação concomitante do T4L. Chama a atenção o faro de que, mesmo na ausência de quadro clínico, uma análise cuidadosa do par hormonal T4L/TSH poderá levantar a suspeita diagnóstica, já que a redução ou o aumento significativos do T4L não são acompanhados pela correspondente elevação ou redução exponencial do TSH. Torna-se claro que, ao se interpretar as determinações de T4L e TSH, os resultados devem ser analisados como componentes de um par hormonal. que é a maneira fisiológica de se comportarem, e não isoladamente.
T RIAGEM DOS DISTÚRBIOS DA TIREÓIDE
Há recomendações clínicas, baseadas em evidências, para o rascreamemo de disfunções tireoidianas em pessoas assintomáticas. Essas indicações são: a) recém-natos; b) história fami liar em parentes de primeiro grau; c) pacientes portadores de doença auto-imune; d) planejamemo pré-gestacional; e) idosos. Há também evidências se acumulando acerca do custo-efetividade positiva da busca da disfunção tireoidiana em outros grupos populacionais. notadamente mulheres acima de 50 anos. O hipotireoidismo subclínico é definido por níveis elevados de TSH e níveis normais de T4 e T3. É denominado subclínico porque pode ser detectado antes do aparecimento dos sintomas, sendo, portanto, um conceito baseado no resultado laboratorial. Freqüente-
meme evolui para doença franca, quando os sintomas típicos dessa doença se rornam presentes. Até mesmo discretos aumentos dos níveis de TSH podem se correlacionar a alterações dos níveis de colesterol, além de representar um risco independente de desenvolvimento de doenças coronarianas. Desta maneira. mrnou-se quase consensual que o hipotireoidismo subclínico seja tratado após confirmação diagnóstica por outra determinação de TSH ou pela presença de tírulos elevados de antiTPO. Além disso, o tratamento deve ser considerado em pacientes com história familiar de primeiro grau positiva para tireoidite de Hashimoto ou doença de Graves e também em gestantes, já que o hipotireoidismo subclínico correlaciona-se ao comprometimen ro do desenvolvimento neurológico do feto. A prevalência total de hipo e hipertireoidismo em adolescentes e adultos nos Estados Unidos é estimada entre 1 e 4%. A incidência anual em adultos é estimada em 0,05 a 0,1% para hipertireoidismo e 0,08 a 0,2% para hipotireoidismo, com as maiores incidências atribuídas às mulheres idosas. O Estudo de Framingham mostrou que 13,6% das mulheres acima de 60 anos tinham níveis de TSH acima de 5 mU/L. O recente Colorado Thyroid Prevalence Study (N = 25.862) detectou, entre os participantes de uma feira de saúde estadual que não estavam em uso de qualquer medicação, que 8,9% apresentavam níveis de TSH > 5,1 mU/L (hipotireoideos) e que 1% apresentava níveis de TSH < 0.3 mU/L (hipertireoideos). Entre os que estavam em uso de medicação tireoidiana, apenas 60% tinham valores de TSH na faixa normal. Esses investigadores concluíram também que a ausência de sintomas não deve ser usada para excluir a possibilidade de doença tireoidiana. Recentemente, vários autores vêm sugerindo uma revisão no valor de referência superior para determinação plasmática do TSH para um valor máximo de 3,8mU/L.
MONITORIZAÇÃO DO TRATAMENTO DO HIPOTIREOIDI SMO É consenso que a determinação do TSH plasmático é o método de referência para o acompanhamento da
reposição hormonal no hipotireoidismo primário, devendo ser mantido dentro da faixa de referência. Entretanto, é importante lembrar que o sistema de controle hipotálamo-hipofisária (TRH/TSH) tem um tempo de
524 [ Medicina la borato rial pa ra o clínico )1-- - - -- -- - - - - -- - - - - - - -- - - - -- - -
resposta relativamente lento, devendo-se. pois. aguardar
do médico responsável experiência com as dosagens
de 8 a 12 semanas para o ajuste na dose de reposição
de T4, T3 e TSH nesses pacientes. Aqui, a dosagem
hormonal. Nos hipomeo1dismos secundá no e terciáno, a
isolada do TSH não é suficiente, sendo ind ispensável a
determinação do T4L e T3L, aliada à clín ica, é o parâme-
determinação de T4L, T3L e, às vezes, o teste do TRH.
tro utilizado no controle.
Nesses pacientes, também é desejável o uso de ensaios de terceira geração.
M O N ITO RIZAÇÃO DO TRATAMENTO
ANTICORPOS ANTITIREÓIDE
DO HIPERT IREOID ISMO No tratamento do hipenireoidismo primário, a normalização dos níveis séricos de T4
e T3
Em 1956, Roitt et a/. vincu la ram, pela primeira vez, a
ocorre an-
presença de auto-anticorpos anti antígenos t ireoidianos
tes do retorno do TSH à faixa normal, o que também
a doenças da tireóide, assim chamadas "auto-imunes",
é explicado p ela resposta lema do sistema hipotálamo-
com destaque para a t ireoid1te de Hash1moto. Os antí-
hipofisária. O TSH pode ficar suprimido, independente-
genos meo1dianos clássicos compreend1am a nreoglo-
mente do eutireoidismo clínico e laboratorial. Uma vez
bulina e o "amígeno microssomal" tireoidiano, no início
normalizado, o TSH passa a ser o hormônio utilizado
mal defin1do e hoje caracterizado como uma enz1ma do
como parâmetro mais sensível para o ajuste da terapêu-
ripo peroxidase.
tica antitireoid1ana.
Hoje se sabe que ocorre dano celular quando os linfócitOs T-sensibilizados e/ou auro-ant1corpos se ligam à membrana celular causando lise, reações inflamatórias
TSH E T RATAMENTO SUPRESSIVO DO CÃNCER DE T IREÓIDE
e eventual destruição de tecido funcionante. Podem ocorrer também alterações da função da glându la rireóide, resultantes de ações de est ímulo ou de bloqueio
O uso de tiroxina visando à supressão da secreção
dos auto-anticorpos sobre os receptares das membranas
de TSH é prát ica comum no tratamento das neopla-
celulares. São três os principa1s antígenos envolvidos em
sias bem diferenciadas da rireóide. A seleção do nível
doenças auro-imunes da tireóide: meoperoxidase (TPO),
de TSH plasmátiCO a ser mantido depende da 1dade
tireoglobul ina (Tg) e receptor de TSH (TSH-R).
do paoente, da gravidade de sua doença e do tempo
Ainda não há disponibilidade de testes laboratonais
decorndo do rraramemo cirúrgico e com iodo radio-
para avaliar a imun1dade mediada por célu las nos pro-
atlvo. Nos pnmeiros anos após a terap êutica, o TSH
cessos auto-imunes da tireóide. Contudo, estão dispo-
deve ser m antido em níveis inferiores a 0,1 mU/L, não
níveis testes para a resposta humoral, ou seJa. autO-an-
haven do vantagem em se obter níveis inferiores a 0,05
ticorpos. Infelizmente. as dosagens de auto-a nticorpos
mU/L. Aqui, o uso de ensaios de terceira geração é de-
antitireoidianos apresentam lim itações técnicas, prin-
sejável. Após a con fi rmação da cura, o TSH pode ser
cipalmente em re lação
à sua especificidade e padroni-
mam1do em níveis inferio res a 0.3 mU/ L, mas superio-
zação. Independentemente do amígeno alvo. os auw-
res a 0,1 mU/L, visando, pnncipalmente em mulheres, à preservação da massa óssea.
anticorpos anritireóide são uma mistura complexa de imunoglobulinas potencialmente capazes de interag1r com Tg, TPO ou com receptores de TSH. As diretrizes da National Academy of Clinrcal Btochemtstry (NACB)
DOENÇA NÃO T IREO ID IANA (" EUTIREO IDIANO DOENTE")
em relação aos méwdos para determinação de anticorpos antitireó1de recomendam que se compreendam e considerem os resultados de testes para anticorpos an-
A interpretação das provas de função tireoidiana
t iti reóide com o mérodo-dependentes que variam no
em pacientes hospitalizados o u portadores de imercor-
reconhecimento de diferentes epiwpos em uma popu-
rênclas clínicas ou psiquiátricas é complexa, exigindo
lação heterogênea. A NACB recom enda t ambém que
Investigação laboratorial dos dist úrbios da fu nção tireoidiana
525
os ensaios de rorina para uso pelos laboratórios sejam padronizados contra padrões internacionais Medical Research Council - MRC. O uso da dosagem de auto-anticorpos para monitorização de tratamento não é útil já que o tratamento, em geral, é voltado para as conseqüências da disfunção e não para a sua causa (a auto-imunidade). Contudo, alterações da concentração dos auto-anticorpos podem refletir alterações na atividade da doença e devem ser avaliadas com a devida cautela.
ANTICORPO ANTIPEROXIDASE TIREO IOIANA (ANTITPO) O antigo antígeno microssomal da tireóide foi caracterizado. Trata-se, na verdade, da peroxidase cireoidiana (TPO), uma enzima glicosilada tipo hemoproteína, ligada à membrana celular, com peso molecular de aproximadamente 110.000 daltons. Ela exerce, como dito anteriormente, importante papel na biossíntese de hormônios tireoidianos ao catalisar tanto a iodinação de resíduos da tireoglobulina quanto a junção de resíduos iodotirosílicos para formar T4 e T3. A primeira técn ica a ser aplicada em larga escala para a determinação de antiTPO foi a hemaglutinação, na qual hemácias eram recobertas com
i
cireoglobulina e com "ancígeno microssomal". Essa metodologia apresentava limitações, devido à baixa sensibilidade e à imperfeita caracterização do antígeno antimicrossomal. A NACB recomenda atualmente o uso de imunoensaios sensíveis e específicos, empregando como amígeno preparações de TPO nativa altamente purificada ou recombinante humana. As antigas determinações semiquantitativas baseadas em aglutinação devem ser abandonadas. Os auto-anticorpos que reconhecem a TPO são potencialmente capazes de inibir a sua atividade enzimática. Eles atuam também como anticorpos fixadores de complemento, que podem induzir alterações citoróxicas nas células e são, portanto, uma causa potencial de disfunção tireoidiana. Os anticorpos antiTPO (ou TPOab, em inglês) estão envolvidos em processos destrutivas do tecido tireoidiano associados à tireoidite de Hashimoto, ao hipotireoidismo idiopática (80%), à doença de Graves (DG)(SO%) e, com menor freqüência, a outras doenças tireoidianas. Estudos longitudinais sugerem que o antiTPO é um fator de risco de disfunção tireoidiana no futu ro, incluindo-se a ti reoidite pós-parto e as complicações de alguns tratamentos medicamentosos (amiodarona, alfa-interferon, lítio). O significado clínico de níveis baixos de antiTPO encontrados em aproximadamente 12% dos indivíduos normais ainda requer mais elucidação (Figura 40.2).
do
Ativoçõo do Processo Auto-imune
i do TSH Hipotiroidismo Subclínico
Fotor (es) Ambiental
Predisposição Genético
idode
Figura 40.2 -Relação entre título de anticorpos AntiTPO e desenvolvimento de hiporiroidismo.
S26 [ Medicina laboratorial para o clínico
.[, do T4L Hipotiroidismo Manifesto
As recomendações acuais para a dosagem de amiTPO são: • diagnóstico de doença auto-imune da tireóide; • fatores de risco de doença auro-imune da tireóide: hipmireoidismo relacionado à terapia com alfa-inrerferon, imerleucina-2 ou lírio; disfunção da cireóide devido à amiodarona; hipotireoidismo em paciemes com síndrome de Down, disfunção da rireóide durante a gestação e no pós-parto; abortamentos e insucesso de fertilização mv1tro.
ANTICORPO ANTITI REOG LOBU LI NA (ANTITG) A tireoglobulina (Tg) é uma glicoproteína solúvel de alto peso molecular (660 kDa), formada por duas subunidades idênticas. Apresema alto grau de heterogeneidade devido a diferentes modificações pós-rranslacionais, como glicosilação, iodinação e sulfatação. Durante o processo de síntese e liberação de hormônios tireoidianos, a Tg é canto polimerizada quanto degradada. A prevalência de antiTg depende do ensaio usado. Os primeiros métodos desenvolvidos para sua pesquisa foram testes de 1munofluorescência indireta, utilizando cortes de tecido tireoidiano e mécodos de aglutinação passiva. No momento, estão disponíveis métodos mais sensíveis e específicos, imunoensaios competitivos e não-competitivos. Contudo, as mecodologias antigas e as recentes continuam em uso na rotina simultaneamente. Esse fato, somado à heterogeneidade do antiTg e às diversas caraCterísticas das preparações de Tg que dependem do tecido humano e do processo de purificação usados, contribui para explicar as diferenças entre ensaios observadas na prática e o motivo de serem tão difíceis de se padronizarem. A maior aplicação clínica para a determinação dos ant1Tg é seu uso associado à determinação da Tg plasmática no acompanhamento a pacientes portadores de carcinoma diferenciado de tireóide (CDT) submetidos à tireoidectomia e, subseqüentemente, à terapêutica ablativa com iodo radioativo. Nesses pacientes, considera-se que um TSH inferior a 0,3mU/L deve se acompanhar de dosagem de TG inferior a 1ng/ml. A determinação concomitante do antiTG é indispensável, já que sua presença pode interferir no ensaio de TG e torná-lo menos confiável como marcador tumoral. Portanto, o uso de ensaios
Investigação laboratorial dos distúrbi os da função tireoidiana
quantitativos sensíveis para dosagem de antiTG é crítico nesses pacientes.
ANTICORPOS ANTI-RECEPTORES DE TSH O primeiro relato de que haveria um agente estimulador da tireóide que diferia do TSH por apresentar meia-vida mais longa (Long Acting Thyro1d St1mulator ou LATS) foi publicado em 1956, utilizando um bioensaio in vivo. O LATS foi, posteriormente, identificado como uma imunoglobulina que se liga ao receptor de TSH, estimulando-o. Os receptores de TSH pertencem a uma família protéica cransmembrana chamada "receptores ligados a proteínas G" e apresentam dom ínio extracelular para ligação ao TSH e domínio intracelular que ativa a adenilatociclase e gera cAMP. Os auto-anticorpos anti-receptores de TSH (TRab em inglês) são heterogêneos, podendo simular a ação do TSH e causar hipertireoidismo (DG) ou, alternativamente, antagonizar a ação do TSH e causar hipmireoidismo, principalmente em neonatos. Não se encontra uma correlação entre os níveis séricos de TRab e a situação clínica do paciente, em grande parte devido à heterogeneidade do TRab circulante, a qual pode, inclusive, variar ao longo do tempo em um mesmo paciente. As principais situações cl ínicas nas quais estaria indicada a determinação de TRab são: • investigar a etiologia do hipertireoidismo quando o diagnóstico não for óbvio (doença de Graves(DG), inclusive oftalmopatia); • em gestantes com história pregressa ou acual de DG, para avaliação do risco de disfunção tireoidiana neonatal; • em neonacos, para avaliar a presença de amicorpos de origem materna, canto estimuladores como bloqueadores.
TIREOGLOBULINA NO ACOMPANHAMENTO DO CARCINOMA DIFERENCIADO DE TIREÓIDE (CDT)
A tireoglobulina (Tg) é sintetizada exclusivamente pelas células foliculares tireoidianas e, desta maneira, é excelente marcado ra da atividade dessas células. A in-
527
rrodução de ensaios sensíveis para sua dererminação no plasma wrnou sua dosagem úril na derecção de resms tireoidianos ou da recorrência do CDT após ablação cotai da ti reóide, usualmente conseguida com tireoideccomia wtal associada à dose terapêutica de 1131. Utilizando-se de ensaios sensíveis, considera-se que, no paciente em tratamento supressivo com Tiroxina, o nível de corte que aponta para a suspeita de recorrência do CDT é superior a 1ng/ml. Objetivando a maior sensibilidade do método, é indicada a determinação da Tg após estímulo da célula fol icular pelo TSH. Duas estratégias estão disponíveis: a suspensão do hormônio tireoidiano com conseqüente elevação do TSH endógeno ou, mais recentemente, o estímulo com TSH recombiname. Considera-se nível de corte para determinação de Tg estimulada por TSH o valor de 2ng/ml, acima do qual a pesquisa de recorrência deverá ser avaliada. Associada ao ultra-som da região cervical, a determinação de Tg estim ulada pelo TSH é o melhor método para detecção de recidiva do CDT.
CONSIDERAÇÕES FI NAIS
A utilização racional dos recursos laboracoriais permite uma abordagem diagnóstica bastante eficaz das doenças que acometem o eixo hipotálamo-h ipófise-tireóide.
528 [ Medicina lab oratorial para o cl ínico
REFERÊNCIAS 1. Adams DO, Purves H D. Abnormal responses in rhe assay o( thyrouopin. Proc Un1v Orago Med Sch.1956;34:11-2.
2.
A merican College 0( Physicians. Clinical guideline, parrl. Screen ing for rhyro1d disease. Ann lm ern Med. 1998;129(2):141-3.
3. Barra GB. Velasco LF. Pessanha RP. Campos AM. M ou ra FN. Dias SM. er ai. Molecular mechan1sm of rhyroid hormone acrion. Arq Bras Endocrinol Merab. 2004;48(1):25-39. Campbell PN. Doniach O, Hudson RV, Roitt IM. A uto-antibod ies in Hashimoto's disease (lymphadenoid goirre). Lancet. 1956;271 (6947):820-1. 5. Canaris GJ. Manowitz N R, Mayor G. Ridgway EC. The Colorado rhyroid disease prevalence srudy. Arch lnrern Med. 2000;160(4):526-34 6. Czarnocka B. Ruf J. Ferrand M. Carayon P, Lissirzky S. Punf1cat1on of rhe human rhyroid peroxidase and its idenrificanon as t he microsomal anrigen involved in autoimmune thyroid disease. FEBS Leu. 1985;190(1):1 47-52. 7. Hel fand M. American College Of Physicians. Redfern CC Clinical guideline. pare 2. Screeni ng for t hyroid disease: an update. Ann lnrern M ed . 1998;129(2):1 44 -58 8. Hol lowell JG. Sraehling NW, Flanders W D, Hannon W H. Gunrer EW. Spencer CA, et ai. Serum TSH. T(4), and thyroid anribodies in the Unired Stares popularion (1988 to 1994): arional Healrh and Nurrition Examl nation Survey (NHANES III). Clin Endocrinol Metab. 2002;87(2):489-99 9. INCA lodoterapia do Carcinoma Diferenciado da Tireóide. Rev Bras Câncer. 2002;48(2):187-9. Disponível em: http://w ww.inca.gov.br/rbc/n_ 48/v02/pdf/condutas2.pdf. 10. Nacional Academy of Clinical Biochemistry (NACB). NACB: laboratory supporr for the diagnosis and monitoring of rhyroid disease. Washington (DC): Nacional Academy of Clinical Biochemisrry (NACB); 2002.Dispon ivel em:http://www.nacb.org/lmpg/thyroid_lmpg_pub.stm em novembro de 2005. 11. Vaisman M , Rosenrhal D. Carvalho DP Enzymes involved in rhyroid iodide organification. Arq Bras Endocrinol M e· tabol. 2004;48(1):9-15 4.
Lucimar Gonçalves de Souza Assunção Elza Santiago Erichsen
41
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DOS
DISTÚRBIOS HIDROELETROLÍTICOS
A reposição de perdas anormais de água e eletróliros
homens. Está d istribuída em com partimentos que
do organismo para manutenção da homeostase é ocor-
d iferem em sua composição iônica. Dois terços estão
rência freqüeme na prát ica m édica. A avaliação clínica
d istribuídos no comparrimenro o u líquido intracelular
permite constatar sua ocorrência e possíveis causas.To-
(LIC)
davia, a dosagem dos eletróliros é indispensável para a
t racelular (LEC). O líquido extracelular é composro de
constatação dos distúrbios presenres e avaliação da gra-
rodos os líquidos externos à célula e está subdividido
vidade e para oriemar a sua correção.
em subcompartimentos:
um terço no compartimento ou líq uido ex-
Os distúrbios hidroeletrolíticos graves são gera l-
a) inrersticial ou li nfa;
e dinâmicas e necessi tam moniroramento clín ico e laborarorial contínuo. O
b) intravascular (plasma);
mente ocorrências agudas de
e
moniroramemo laborarorial
c) líquidos transcelulares.
é feiro pela dosagem dos
elerrólitos nos líq uidos corporais, principalmente plasma e urina. O utros líq uidos também são analisados
A Tabela 41.1 m ostra a dist ribuição média da água em relação ao peso corporal, segundo Morgan et a/. (1967)
se participarem dos farores causadores ou agravantes do d istúrbio: suco gástrico, líquido perironeal, perdas através de físrulas, líquidos de drenagens, ileosrom ia. N os estados emergenciais, essas dosagens são solicitadas periodicamenre pelo inrernista, de acordo com o
Tabela 41.1 - Distribuição da água tQ[al e valores médios da água dos comparrimemos orgânicos em relação ao peso corpo ral de um adulro de 70 kg
ritmo da reposição de água e eletróliros até a correção Compartimento Percentual do peso corporal Volume
do distúrbio.
Intracelular
40 %
28,0L
Intersticial
15%
10,5L
lntrovosculor \plasmo)
3 -5%
3,5L
Tronscelulor
2%
1 5L
Total
62%
43,5L
FISIOLOGIA - BREVE RESUMO A água e os eletróliros estão distri buídos no organismo em esp aços anatômicos definidos
e que se
e
funcionalmente
intercomunicam. Tendo como re-
ferência o peso corporal de um adulro, a água consrirui cerca de 50% do peso nas m ulheres
e 60%
nos
Fonte Mo1 gan et a/. (1967)
COMPOSIÇÃO ELETROLÍTICA D OS
outros cátions potássio (K+), cálcio (Ca++) e mag-
COMPARTIMENTOS INTRACELULAR E
nésio (Mg++) consriwem pequena concemração
EX TRACELULAR
nesse comparcimemo. Na composição de ânions, o cloro é o principal elemento do LEC. ligado
Os eletróltros presentes nos líqUtdos corporais
principalmeme ao Na+. Em menor c:oncemração
distribuem-se jumameme com a água corpo ral em di-
escão os fosfaros (HP04-), sulfaros (504--), ácidos
ferences concentrações no LIC e LEC. com o m ostra a
orgânicos e proteínas;
Tabela 41.2. Na sua composição iónica, rem os: sódio,
• líquido intersticial: caracteriza-se p ela ausência de
potássio, magnésio, fósforo. cloreros, cálcio, fosfaros.
proteínas e co nstitui um uluafiltrado do plasma.
sulfaros. bicarbonaro e proteína.
A concentração iónica é póxima da do plasma.
Tabela 41.2- Dtsrnbuiçào iô nica do plasm a. líqutdo imersrícíal e líquido intracelular
Cátions Sódio (No+)
líquido intracelular (UC)
Plasma
Líquido intersticial
Líquido intracelular
mEq/ L
mEq/ L
mEq/L
142
144
± 10
outros cárions presentes são o magnésio (Mg++), com concentração matar que no LEC. e o cálcio (Ca++). Os
O potássio (K+) constitui o principal cátion desse compart imemo. A concentração do sódio intracelular é reduzida em relação
à carga cariónica rotai do LI C. Os
Potássio (K+l
4,2
4,0
156,0
Cábo !Co++l
5.0
25
: 33
Magnésio !Mg++l
3,0
1,5
26,0
Tolo! cóllons
154
152.0
195.3
mEq/ L
mEq/ L
mEq/ L
Cloro !G)
103.0
114 0
=2.0
Bicarbonato (HC03 -I
27.0
30,0
±
Fosfato IHP04 -)
20
2.0
950
plasma, urina; b) a medida da osmolalidade plasm ática
Sulfato (S04 -)
1,0
1,0
20,0
e urinária. Para a dosagem na urina. u tiliza-se urina de 24
Ácidos orgânicos
5,0
5,0
Proteínas
16,0
0,0
55.0
Total ômons
154,0
152,0
180..0
prinopais ânions tntracelulares são os sulfaros (S04 --),
Ânions
8,0
fosfaros (HP04--,CH2P04-) e proteínas.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL DOS DISTÚRBIOS ELETROLÍTICOS Os tesres laborawriais utilizados para avaliar os distúrbios htdroelerrolíricos são: a) o ionograma, que
éa
dosagem dos eletróliros nos líquidos corporais: soro,
horas ou am ostra alearóna. O s m étodos para a dosagem elos elerrólicos são a focomerria de chama e o elerrodo de ío n seletivo (EIS) mais urilzado arualm em e.
FOTOMETRIA DE CHAMA
líquido extracelular (plasma e líquido intersticial)
É um método mats antigo, mas atnda utilizado em laboratórios de pequeno porre, e tem boa confiabtltdade. O princípio da fotometria de chama reside no fato de que o
• plasma: nesse compartimem o. o sódio (Na+) é o
sal de um metal alcalino dispersado em uma chama trá
IO-
cát ion em maior concemração, sendo responsá-
nizar-se, absorver energia da chama e então emirtr luz em
vel pela pressão osmótica eferiva e, portamo. pelo
um comprimento de onda característico. à medtda que os
comrole do volume desse compartimento. Os
átomos excitados decaem ao seu estado basal. Uma foro-
célula detecta a luz emitida e converte em voltagem que pode ser registrada. Como o sódio e o potássio emitem luz em comprimentos de onda diferentes, pode-se usar filtros apropriados. Os fotômetros dão respostas lineares para a concentração do íon em uma faixa estreita, portanto, são necessárias diluições da amostra.
plasmática é o miliosmol/kg (mOsm/Kg). Usou-se há algum tempo a osmolaridade, que é o mOsmol por litro (Osmoi/L ou mOsmoi/L), que expressa a pressão osmótica por litro de solução. Utiliza-se. por ser mais exara. a osmolalidade (Osmi/Kg/H2 0 ). Osmolalidade plasmática
Elet rodo íon seletivo (ISE)
t a metodologia ma1s utilizada atualmente. pois permite a dosagem dos diversos eletrólicos, como o cálc1o, pocáss1o. sód1o. cloreto, magnésio, no sangue, plasma ou soro, unna ou outro líquido b1ológico. e devido à sua prat1odade e sensibilidade. O eletrodo é uma membrana sensível de vidro que permite a passagem de íons. A d1ferença de potencial que se desenvolve através da membrana pela passagem de alguns íons é proporcional à concentração. o que pode ser medido pelo milivoltímetro. A vantagem do método é a possibilidade de resposta linear em uma faixa ampla de concentração e também por realizar as dosagem de vários eleuól1tos.
PRESSÃO OSMÓTICA DO PLASMA As perdas de água ou eleuóli ros levam a alterações da pressão osmótica do plasma. A osmolalidade depende da concentração de solutos ou partículas de um líquido e determina a sua tonicidade efetiva. No organismo. dev1do à osmose, a difusão da água através da membrana celular equilibra as diferenças de tonicidade dos compartimentos intra e extracelu lar.
Conceito de osmolalidade
A pressão osmótica de uma solução depende do número de partículas nela dissolvidas. Ela pode ser medida pela depressão do ponto de congelamento do solvente induzida pelas partículas do soluw. A pressão osmótica produzida por uma molécula grama (moi) de uma substância não dissociável ou um íon-grama em 1.000 gramas de solvente (água) terá a osmolalidade de 1 Osmol/ Kg/H20. Se utilizar-se a milésima parte do moi, rer-seá o miliosmol. A un1dade que expressa a osmolalidade
Invest igação laboratorial dos distúrbios hídroeletrolítícos
Em condições de equilíbrio. a osmolalidade plasmática está em corno de 289-300m0sm/kg/H20 e é devida principalmente à concentração de sódio plasmático e substâncias como a uréia e glicose. Ela contribui. em condições normais, com aproximadamente 2% da osmolalidade medida. Uma regra prática pode ser utilizada para cálculo da osmolal1dade, rendo-se os valores do sód io plasmático. uréia e glicose, como demonstrado na fórmula: Osmolalidade plasmática = (2 X Na) + (glicose .;. 18) + (uréio .;. 2 .8)
Osmolalidade plasmática cálculo-denvada
A uréia (PM=60 ou BUN-PM=28) e a glicose (PM =180) são d1vid1das pelos seus pesos moleculares (PM) para o cálculo da osmolalidade. 18 e 2.8 são resultados da mudança de un1dades que expressam a concentração da glicose e BUN (nirrogên1o uréico do sangue) em mg/dL para mOsm/L. Na fórmula. a uréia corresponde ao BUN. Na prática. utiliza-se a dosagem de uréia quando não disponível o BU . O sódio, estando ligado ao cloro (NaCI). tem a força dos dois íons, sendo. pois, multiplicado por dois. Osmo/alidade urinária
Mede a quantidade de partículas na urina eliminada com a água. Indica a capacidade de eliminação ou conservação de água pelos rims. Em condições fisiológicas. o rim elimina a urina com osmolalidade entre 500 e 1.200 mOsmoi/Kg, dependendo da ingesra de água, e valor médio de 750 mOsmoi/Kg
VALORES DE REFERÊNCIA As concentrações dos elerróliros são semelhantes no soro ou plasma. Os resultados são expressos em
531
mEq/L ou mg/dl . Nas Tabelas 41.3 e 41.4 estão os valores de referência dos elecrólitos utilizados na prática clínica, segundo a literatura.
•
Tabela 41.3 - Valores de referência dos eleuóliws no sangue
• Eletrólitos
Adultos
Crianças
Potássio
3,5 a 5,0mEq/L
3,5 a 5,0mEq/L
Cálcio total
8,6-10,6 mg/dl
8,5 o l i ,5 mg/dl (até 0 1 ano)
Cálcio ionizado
2,2 a 2,7mEq/L
•
4,5 o 5,5 mg/dl Magnésio
1.9 o 2,5 mg/d l
I ,9 a 2,5 mg/dl
1,5 o 2,5mEq/ L Fósforo inorgânico
3,0 o 4,5 mg/dl
2,5 a 4,0 mg/dl (meninos)
I ,O a 2.0 mEq/L
3.8 a 5,9 mg/dl (meninos)
Sódio
135 a 14 5 mEq/L
137 a 145 mEq/L
Cloretos
96 a I 07 mEq/L
96 o I 06 mEq/L
Tabela 41.4 - Valores de referência dos eletrólitos na urina de 24 horas Sódio
40 a 220 mEq/L/dia
Potássio
25 a 125 mEq/L/dio
Cloreto
150 a 240 mEq/L/dia
CUIDADOS NA COLETA DA AMOSTRA
Várias situações podem levar a erros analíticos e são evitadas pelas corretas condições de coleta e manuseio da amostra. Para dosagem de eletrólitos no sangue, pode-se utilizar plasma ou soro. A heparina de lítio é a ideal para obtenção do plasma. Os cuidados pré-analíticos a serem observados são: • deve-se providenciar o transporte imediaco da amostra ao laboratório e efecuar o transporte em
•
recipientes isotérmicas à temperatura ambiente, até que o material seja processado.; deve-se evitar o garroteamenco prolongado durante a coleta. Acima de três minucos, ele pode causar redução de até 6,2% no potássio sérico; deve-se evitar manobras com a mão e/ou antebraço durante o garroteamento para wrnar a veia mais visível, pois isso pode elevar o pocássio da amostra; deve-se rejeitar amoscras hemolisadas. A hemólise provoca aumenw artefactual de K+ pela liberação desse cátion das hemácias. Esse aumento pode chegar a 20 vezes a concentração; deve-se rejeitar amostras obtidas com anticoagulantes contendo oxalaw de pocássio, citrato de sódio e EDTA, pois são sais de Na+ e K+, que elevam os os níveis desses íons na amostra.
Fatores interferentes
Algumas situações interferem no resultado analítico: • pacientes hospitalizados, pela permanência prolongada no leito, podem apresentar hemodiluição, redução da proteína e albumina (0,5 a 0,3 g/ dL), aumenw do cálcio ionizado e redução do potássio sérico; • as amostras lipêmicas podem causar interferência nas dosagens por fotometria de chama. Os lípides ocupam espaço no volume de soro, levando à redução da água livre por litro de soro. Os mécodos de EIS superam esse interferente; • as trombocicoses e leucocicoses intensas podem causar elevação do K+ se utilizado soro, sendo praticamente abolido na utilização de plasma. A concentração sérica de K+ é normalmente 0,5 mEq/L maior que a plasmática devido à liberação de potássio das plaquetas e leucócitos durante o processo de coagulação; • o uso de medicamentos endovenosos contendo sais de K+ ou Na+ deve ser considerado, pois estes causam aumento artefactual desses íons no plasma; • a hiperglicem ia ou infusão endovenosa de manitol causa aumento da osmolalidade plasmática (hipertonicidade), mesmo com o sódio plasmárico baixo.
532 [ Medicina laboratorial para o clínico ) f - - - - - - - - - - - -- -- - - - -- - -- - - -- -- --
DISTÚRBIOS ELETROLÍTICOS O manejo de pacientes com distúrbio hidroelerrolícicos é ocorrênoa freqüente na prática clínica, em especial nos serv1ços de urgência e pacientes intenados. Diversas situações clínicas, doenças sistemicas, renais e endocrinológlcas podem levar a perdas ou retenção de água e de elerróilros do organismo. O distúrbio hidroelerrolírico conseqüente pode ser predominante de um dos íons, por ex. sódio, ou associado. por ex. cáloo, magnés1o, pmáss1o.
DISTÚRBIOS DO SÓDIO (Na+) O organismo regula continuamente o conteúdo de sódio, a partir de mecanismos reguladores no intestino e nns.Quando uma dieta é pobre em sódio, o intestino aumenta a sua capacidade absortiva e os rins reduzem a sua excreção na urina. A excreção urinária do sódio depende de vários fatores: filtração glomerular. ação do HAD. secreção de aldosterona pelo sistema renina-angiotensinaaldosterona, hormônio natriurético ou peprídeo natriurénco arriai (ANP). A aldosterona arua aumentando a reabsorção renal do sódio e o ANP a sua ellminação. As situações que causam depleção do sódio corporal levam à hiponatremia e o excesso à h1pernatem1a. Esses distúrbios podem vir acompanhados de alteração do LEC e da osmolalidade plasmática, pela ação direta do sódio na homeostase da água.
dosreronismo, por baixa produção do hormônio adrenocórticotrófico (ACTH) ou por hi pofunção adrenal, com diminuição da absorção renal de sódio; b) à secreção Inadequada do hormônio antidi urético (SIHAD). com retenção de água e diluição do plasma. O hormônio amidiurécico (ADH) é produzido no hipocálamo e l1 berado pela hipófise no sangue. Ao aruar no rim, o ADH reduz a excreção de água na urina. A deficiência de glicocorticóides aumenta a permeabilidade dos duetos coletores e os níveis de ADH circulames. A hiponatremia também pode resultar da retenção da água, por mecanismo anormal de excreção da água livre e por administração excessiva de infusão venosa de líquidos hipotôn1cos. Outras causas são as perdas gasmmestinais por: diarréia, vômitos, fístula, sudorese intensa e febre. Por sua relação com a osmolalidade plasmánca e distribuição de água nesse compartimento, os distúrbios do sódio devem ser avaliados com as repercussões que causam na osmolalidade plasmátiCa e no volume do LEC. como mostram a Figura 41.1 e o Quadro 41.1. Hipo notremio e osmololidode plasmático
~
~
Hiperosmolo r Hiperglicemio Solução venoso, mon itol Contraste radiológ ico
Hipoosmolor Conlroção do LEC Expansão LEC N ormovolêmico
Hiponatremia
A hiponatremia reflete a depleção corporal de sódio e é definida como uma concentração de sódio sérico menor que 135 mEq/L. Hiponotremio: sódio sérico < 135 mEq/L
lsoosmolo r Pseudo hiponotremio Uso de solução hipotônicos poro irrigação no s cirurgias
1
Figura 41.1 - Hiponarrem1a e aiLeração da osmolalidade plasmática Fome Adap[ado de Bras1l1a Med.2007
A hiponatremia é alteração eletrolítica comum e pode ocorrer devido a distúrbiOS nos mecanismos reguladores da homeostase do sódio e por perdas. Ent re as causas renais que levam à perda de sódio estão as nefropatias perdedoras de sal, o uso crônico de diuréticos de alça (riaz1d1cos) e as nefropatias dos idosos. Os distúrbios hormonais estão relacionados: a) ao hipoal-
Investigação laboratorial dos distú rbios hidroeletrolíticos
Manifestações clínicas
A hiponatemia freqüememente não é sintomática. Nos casos graves com sódio plasmático abaixo de 125/ mEqL, podem ocorrer confusão mental e náusea e até mesmo convulsões.
533
Quadro 41.1 - Hrponatremia e alteração do volume do LEC Hiponatremia e as alterações do líquido extracelular
(LEC) Cousas de hiponotremio com controçõo do volume do LEC: perdas gostrintestinois. perdas renais de sódio, diuréticos, quei· maduros. acúmulo de líquido no "terceiro espaço", oscile. Cousas de hiponotremia com volume normal do LEC: SIHAD. hipohreoidismo, deficiência de mineralocorticórdes Cousas de hiponotremia com expansão do LEC: insuficiência cardíaco congestivo, cirrose. síndrome nefrótico.
Hipernatremia
É definida como sódio sérico acima de l45 mEq/L e sempre representa um estado hiperosmolar. A osmolalidade plasmática encontra-se acima de 290m0sm/Kg e na urina acima de 800 mOsm/Kg. Hipernatrem io: sódio sérico > 145 mEq/ L
As situações clínicas que cursam com perda de água livre ou ganho de sal (Na+) ou combinação de ambos podem apresentar hipernatremia. As causas mais freqüemes estão
Fonre. Adaptado de .. Tratamemo hídrrco geral''. ln: Wash~r'lgtOn manual de tcrapCuuca clinrca, ed Ltpprncou-Raven Publrshers.Washington. 1998
relacionadas à perda de água de origem não-renal e renal, com alteração ou não do LEC ou volemia. (Quadro 412).
Avaliação laboratorial Na suspeita de hiponatremia est ão indicados os testes: sódio sérico, osmolalidade plasmática
e urinária,
Quadro 41.2 - Causas de hrpernacremia e alterações do LEC. mecanrsmos e causas
densidade urinária e sódio urinário. A osmolalidade plas-
Volume do LEC
Mecanismo
Causas
mática geralmente é calculada pela concentração de só-
Hipovolemio !déficit de águo r1oior que de sódioI
1. Perdas extra· renais de águo
1. Queimaduras, sudorese intenso
2. Perdas renais de águo
2. Doença renal intrínseco, diurese osmótica, Diabetes insipidus central ou nefrogênico
3. Mecanismo de sede alterado por dono ao hipotálamo ou comportamental
3. Privação de águo no idoso e paciente psiquiátrico
lotrogenio
Adminislroçào inlrovenoso inadequado de solução salino hiper· Iónico. bicorbonolo
Excesso de mme· rolocorlicóides
Síndrome de Cushrng
dio plasmático ou medida utilizando-se o osmômerro. O achado de elevação da osmolalidade plasmática e hiponarremia ocorre na hiperglicemia e no uso de manitol endovenoso. Na pseudo-hiponatremia a baixa de sódio sérico é artefacrual, secundária à elevação dos lípides (dislipidema)
e proceínas (mieloma) no soro. Elas levam
à redução do volume da fração líquida a ser analisada comendo o sódio e, assim, valor inferior ao real na amostra anlisada. As causas mais freqüemes de hiponatrema são acompanhadas de baixa da osmolalidade plasmática (Quadro 4ll ). Os achados laboratoriais da hiponatremia com con-
Sem alterações do LEC leuvolemio) !ganho de sódio maior que de águo)
uação do LEC são: aumento do hematócrito e proteínas plasmáticas, densidade urinária maior que 1025 e osmolalidade urinária maior que SOO mOsm/kg
e excreção
Manifestações clínicas
baixa de sódio urinário menor que 20 mEq/L. O aumento de excreção de sódio urinário acima de 20 mEq/L indica fa lha no mecanismo poupador de sal e ocorre nas
neurológico causado pela desidratação celular
nefropatias perdedoras de sal, uso crônico de diuréticos e no hipoaldosteronismo. Na hiponatremia com normovolemia causada pela
ção do volume cerebral. Evoluem com letargia. fraqueza, irritabilidade neuromuscular, coma e convulsão. Quanto mais rápido se instala, menor a capacidade de adaptação
SI HAD de qualquer etiologia, a osmolalidade urinária
celular e mais grave o quadro clínico. É uma si tuação crí-
encontra-se baixa, entre lOO
e 300
Os simomas de hipernatremia relacionam-se ao dano
e à redu-
mOsm/kg, o sódio
tica especialmente em crianças e idosos e pode evoluir
urinário acima de 40 mEq/L, a densidade urinária entre
para o coma. Os sintomas geralmente são aparentes, nos
1005 e 10l0 e o HAD no pasma elevado.
valores de sódio sérico acima de l 60-l 70 mEq/L.
534 [ Medicina laboratorial para o clínico ] 1 - - - - - - - - - - -- - -- - - -- - - - - - - - - - - - - - -
Abordagem laboratorial
Na suspe1ta de hipernatremia estão indicados os restes: sódio sérico e urinário, osmolalidade plasmática e urinária e a medida do volume urinário de 24 horas. A resposta renal reguladora às perdas de água é a diminuição do volume urinário (cerca de 500 ml/24 horas) e concenrração máx1ma da urina com osmolalidade U >de 800 mOsm/Kg (reabsorção de água pelos rins). A fa lha desse mecanismo é observada no diabetes insipidus central ou nefrogênico, no qual a hipernacemia está acompanhada de poliúria e urina com osmolalidade inferior a 250 mOs/ kg, dens1dade aba1xo de 1.010. Nas situações menos freqüentes de ganho primário de Na+, observa-se narriurese com (Na •1 urinário acima de 100 mEq/L.
Hipopotassemia
A hipopocassemia é definida quando o nível de potássio sérico está abaixo de 3.5 mEq/L. Hipopotossem io: potássio sérico< 3,5 mEq/ L
Várias são as causas que levam à hipopotassemia relacionada aos mecanismos reguladores do balanço do potássio como: baixa ingestão, aumento de perdas renais ou exuarenais, distúrbios endócrinas e metabólicos, sumarizados no Quadro 41.3. Manifestações clínicas
DISTÚRBIOS DO POTÁSSIO (K+) É o principal cácion do intracelular, 95% do pmásio total estão localizados nas células. A avaliação da concentração direta do potássio é difícil devido à sua localização. Assim, na prática, faz-se a correlação da concentração do potássio plasmático com o potássio tocai do organismo. Sua concentração plasmática é em rorno de 3.5 a 5,0 mEq/L. É ingerido por meio dos alimentos e absorvido pelo 1mest1no delgado. O mral de 1ngesra é cerca de 50 a 150 mEq/dia. Sua eliminação se faz pelas fezes, sudorese e urina. O local de maior excreção é o rim. com eliminação em torno de 75 mEq/dia, sendo esca a necessidade diána em condições basa1s. Vários hormôniOS parric1pam no mecanismo regulador do pocássio. A aldosrerona aumenta a secreção tubular de pocássio. A insulina promove a entrada de potássio nas células, principalmente músculos e fígado. A administração de glucagon (glicogenolítico) causa hiperglicemia e hiperpocassemia, pela liberação do pocássio hepático. Quanto às funções que exerce no orga nismo, estão: a) nos processos metabólicos de síntese proréica e do glicogênio; b) na manutenção da osmolalidade do imracelular e do pH; c) nas acividades neurocransmiSsoras, na comração da musculatura esquelética e cardíaca; d) nos distúrbios ácido-básicos participando da compensação renal. Os distúrbios do potássio são avaliados por sua concentração no sangue, podendo ocorrer a depleção, ou hipopocassemia e o excesso, a hiperporassemia.
Investigação laboratorial d os d istúrbios hid roeletrolít icos
Quando o déficit é moderado ([K+] =3 a 3.5 mEq/L), as manifestações clínicas são discretas e o diagnóstico é fe1to pelo achado laboratórial. As depleções mais graves, pocássio inferior a 2,0 mEq/L, são acompanhadas de distúrbio da excitabilidade neuromuscular, com repercussão no coração, levando a arriem ias cardíacas. O Quadro 41.4 mostra os sinais e sintomas encontrados na hipopocassemia. Abordagem laboratorial É realizada pelo ionograma, que mostrará a gravidade
do distúrbio do pocássio e de o urros elerróliros associados, caso presentes. Os outros restes orientam a possível causa. A gasomeuia avalia a ocorrência de alcalose, o potássio urinário elevado as perdas renais e os testes para avaliação da função renal, dosagens de crearinina e uré1a séricas.
Hiperpotassemia
É definida quando o potássio sérico é superior a 5,0
mEq/L. Hiperpotossemio = potássio sérico superior o 5,0 mEq/l
As situações clínicas ma1s freqüentes que causam elevação de pocássio são as que aferam a capacidade renal de excreção desse íon. Em condições normais, o rim é capaz de excretar o excesso de K+ da ingestão ou da liberação das células. A falência da função renal na
S3S
Quadro 41.3- Causas de hipoporassemia
Oferta inadequada
Perda extra-renal excessiva
Perda urinária excessiva
Desvio do potássio para o intracelular
Sudorese abundante
Alcalose
Aumento da excreção urináno de K + induzido por drogas: d iuréticos, acetozolamida, ácido aminosolicílico, onfotericino B, corbenicilino .
Perde gostrintestinol: vómitos d renagem biliar, pancreática e intestinal, fístulas e astomias.
Uso de insulina como solução polarizante (o insulina estimulo o ca ptação do potássio pelas células musculares)
Alcalose metabólico ou respiratório
Diarréia /infecção ou inflamação, síndrome de má-absorção, abuso crónico de enemas e laxante, adenoma viloso, tumor pancreático de células não-alfa e não-beta, tumor neural secretor de cotecolamino)
Envenenamento por bário
Ureterossigmoidostomia
Paralisia familiar periódico hipocolêmico
Ingestão Insuficiente Distúrbios do eixo hipófiseadrenol-hiperaldosteronismo
insuficiência renal aguda é acompanhada de hiperpocassemia de rá pida evolução. Já na insuficiência renal crônica é observada apenas nos estadios finais, devido aos mecanismos adaptativos que aumentam a excreção de potássio por nefron. Outras situações menos freq üentes podem ocorrer, como: necrose muscular, acidose metabólica, deficiência de insulina, hipoaldosteronismo, uso de medicação venosa com sais de potássio. Manifestações clínicas
Os sinais e sintomas são dependentes dos níveis e evolução da hiperpotassemia e podem levar à parada cardiorrespiratória. Quando ela surge abruptamente (acidose metabólica, infusão intravenosa excessiva de K+, insuficiência renal aguda), os sinais cardiotóxicos desenvolvem-se com as concentrações de 6 a 7 mEq/L e podem ser observados no eletrocardiograma (ECG): ondas T pontiagudas, prolongamento do intervalo PR, ampliação do QRS, desaparecimento da onda P. O agravamento do efeito cardiotóxico produz fibrilação ventricular e parada cardíaca. Quando o seu desenvolvimento é mais lemo (insuficiência ad renal, insuficiência renal crônica), as manifestações são menos intensas. As manifestações da hiperpotassemia no sistema neuromuscular são decorrentes da despolarização parcial da membrana celular. Os pacientes
apresentam inicialmente parestesia, fraqueza, arreflexia, evoluindo para paralisia flácida e hipoventi lação, se atingir músculos respiratórios.
Quadro 41.4- Man iresrações clínicas da hipoporassemia
Manifestação
Sistema Sistema nervoso central
Irritabilidade, confusão mentol, letargio, apatia, alucinações, delírio.
N euromuscular
Fraqueza, atro fia, robdomiólise, cãibra, parestesio, dor muscular, sinais de tetania lotente, paralisia flácido, parado respiratório.
Cardiovascular
Arritmias /risco aumentado abaixo de 2.5 mEq/LI: extra-sístole e alterações do ECG
Gastrintestinol
Náusea, vómito, ileoparalítico, dilatação gástrico.
Renal
Perda do habilidade de concentrar o urino com poliúrio e polidipsio, acidúrio paradoxal.
Abordagem laboratorial
Os exames indicados são o ionograma, em especial a dosagem do potássio sérico que se encontra acima de 5,5 mEq/L, e o urinário, reduzido nas causas renais de hi perpotassemia. A elevação sérica de uréia e creatinina acompanham a hiperpotassemia por falência renal.
536 ( Medicina laboratorial para o clínico )1--- - - - - - -- - - - - - -- - - - -- -- - -- - -- - - -
A gasometria avalia a ocorrência de acidose metabólica. outra causa de elevação do potássio (ver capítulo 42).
DISTÚRBIOS DO MAG NÉSIO (MgH) O magnésio (Mg' ') é o segundo cát1on predominante no compartimento intracelular. embora presente também no extracelular. em menor proporção. Um adulto de 70 kg rem em torno de 24 g de magnésio. Sua distribuição corporal é: tecido ósseo (60%), compartimento intracelular (39%) e compartimento extracelular (1%). O tecido ósseo constitui uma fonte para as compensações de deficiência do magnésio no organismo. A Figura 41.2 mostra a proporção sob forma ion1zada. ligado as proreínas fósforo e citrato. Esnma-se que a necessidade diária de magnésio seja de 220 mg/dia ou 4 mg/kg/dia, o que é obtido da ingesta alimentar. Éabsorvido principalmeme no intestino delgado (25 a 60%) e nos nns. Os nns parc1c1pam do balanço imerno do magnésio no organ1smo a parm da reabsorção nos túbulos proximais, distais e principalmeme na alça de Henle, em corno de 65%; e pela excreção, que ocorre no nível da alça de Henle. Alguns fawres aumemam a excreção renal de magnésio, como: a hipermagnesemia, a h1percalcemia e a ação de diuréricos. O magnésio é importante para as funções neuromusculares e cardíacas. Na célula. o magnésio tem as funções de ag1r como co-fator para fosforilação, estabilizar o DNA e RNA. participar nas estruturas ribossomiais, manter a integndade celular e participar nas reações enzimáticas que necessitam de ATP. Os distúrbiOS de magnésio podem ocorrer por depleção (hipomagnesemia) ou excesso (hipermagnesemia) desse cátion no organismo e avaliados pelos seus níveis sanguíneos e unnários. No plasma ou soro, os resultados ecomrados devem ser interpretados com cuidado, pois refletem apenas 1% do magnésio do organismo, portanto, têm valor relativo. Os valores de referência do Mg+ sérico são: 1,5 a 2,5 mEq/L ou 1,8 a 2,1 mg/dl e para a urina de 24 horas: 50 a 150 mg/24h .
Hipomagnesemia
É definida quando o magnésio sérico está abaixo dos valores mínimos de referência e considerada alteração grave a presença de valores inferiores a 1,0 mEq/L.
Investigação laboratorial dos distúrbios hidroelerrolíticos
=
Hipomognesemio magnésio sérico inferio r o 1,5 mEq/ L ou 1,8 mg/ dl
A hipomagnesem1a é achado freqüente no alcolismo e desnutrição. Outras causas estão citadas no Quadro 41.5.
Manifestações clínicas A hipomagnesemia não se manifesta como um distúrbio isolado, mas acompanhado de outras alterações. como a hipopotassemia, hipocalcemia e alcalose metabólica, por resultarem de causas comuns. O magnésio é cri tico para a manutenção da função celular e as manifestações mais comuns envolvem o sistema cardiovascular e nervoso, menos freqüentememe o esqueleto, trato gastrintestinal e geniturinário. As manifestações cardiovasculares são pincipalmente as arritmias arriais e ventriculares. As manifestações neuromusculares observadas são tremores. tetania quando associada à hipocalcemia e mioclonia, desorientação, confusão mental. inquietação. Esses são achados freqüentes no "delirium tremens" dos alcoolistas.
-
D
Ionizado Complexo - proteínas plasmáticas
6'Yo
Complexa do - fos fato Complexado - citrato
4%
30%
Figura 41.2- Disrnbu1ção do magnésio no organismo.
Abordagem laboratorial
O exame indicado é a dosagem de magnésio no soro e urina. A eliminação urinána encontra-se menor que 2 mEq/ 24h. nas causas disabsornvas e carenciais. Valores elevados na urina são encontrados no uso de diuréticos,
537
medicamenros e nefroparias. As dosagens de potássio e cálcio séricos fazem parte dos testes laboratoriais da investigação dos distúrbios do magnésio, pois estão sempre associados, assim como os distúrbios metabólicos, avaliados pela gasometria. Na acidose o magnésio sai da célula para o LEC, mas com aumento de sua excreção renal. Na alcalose o mecanismo é inverso.
Hipermognesemia - magnésio sérico acima de 2,5 mEq/ l
O excesso de magnésio é um distúrbio incomum porque o rim é capaz de eliminar o magnésio rapidamente, reduzindo a reabsorção tubular a valores mínimos. Entretanto, a falha desse controle renal é a causa mais freqüente de hipermagnesemia (Quadro 41.6). Q uadro 41.6- Causas d e hipermagnesemia
Q uadro 41.5 - Causas de h ipomagnesemia Insuficiência renal - a guda e crônica Desnutriçã o protéico-colórico Etilismo crônico Nutrição parenteral ou hidratação parenteral prolong ado sem magnésio Síndrome disabsortivo
Uso excessivo de laxantes à base de sulfa to de magnésio N o trotamento de eclompsio com sulfato d e magnésio Uso de enemo poro megccolon à base de sulfato de magnésio
Diarréia crônica
Hipo tireoídismo
Uso d e antineoplásicos
Doença de Ad dison
Ald osteronismo primá rio e secundário Hipertireoidismo Hipercolcemia Aspiraçã o prolongada por sond o nosogástrica Acidose tubular renal Fase poliúria da necrose tub ular agudo Hemod iálise Uremio Diuréticos tiazídios e furosemida Uso de anfotericino B Uso d e omino glicosídeos H ipopotossemio
Manifestações clínicas
Os sintomas da elevação de magnésio ocorrem quando os níveis séricos estiverem acima de 4 mEq/L. O magnésio elevado reduz a uansmissão neuromuscular (efeito curarizante) e age como depressor do sistema nervoso central. Os sinais e sintomas observados são: náusea, sedação, hipovemilação com acidose respiratória, diminuição dos reflexos tendinosos e fraqueza muscular. No sistema cardiovascular observam-se: hiporensão, bradicardia e vasodilatação difusa, que se manifestam com concentrações acima de 5,0 mEq/L. Achado laboratorial
Lactação excessiva Pielonefrite crônico
Hipermagnesemia
Define-se hipermagnesemia quando o valor de magnésio sérico está acima de 2,5 mEq/L.
538 ( Medicina laboratorial para o clínico
t realizada pela dosagem do magnésio sérico, que estará acima dos valores de referência. Entretanto, a investigação laboratorial deve estender-se à avaliação das possíveis causas e distúrbios associados da hipermagnesemia. Como as causas renais são as mais comuns, é imprescindível a avaliação da função renal pela dosagem de uréia, creatinina, exame de urina rorina. O distúrbios concomitantes de outros eletrólitos (K+,Na+,ca++,G) são investigados pelo ionograma. Indica-se também a gasometria.
DISTÚ RBIOS DO CLORO (cn
da investigação dos distúrbios h idroelecrolíticos
e ácido-
básicos, que estão sempre associados. A determinação O cloro do organismo distribui-se no LIC e LEC. Iigado ao sódio (NaCI). A alimentação é a fonte de cloreto de sódio no organismo
do cloreto urinário pode estar normal ou reduzida, menor que 110 mEq/24 horas.
e sua absorção se faz no intestino.
No estômago, é integrante da molécula de ácido clorídrico Nos rins participa do mecan ismo de secreção de H+
H i perclorem ia
e absorção de bicarbonato (cloreto shift) e, portanto, da regulação do equilíbrio ácido-básico. Aumento da excreção do cloro urinário ocorre: na sobrecarga de NaCI, diurese farmacológica, nefrite perdedora de sal, insuficiencia
Define-se como hipercloremia o val or de clo reto sérico acima de 107 mEq/L Hipercloremia = cloreto sérico > 107 mEq/l
adrenocortical. A diminuição do sódio urinário ocorre nas perdas extra-renal, baixa ingestão de NaCI, hiperfunção adrenocortical. Os valores de referência do cloro urinário
O distúrbio escá associado a causas metabólicas
e
endócrinas (hiperparatireoid ismo, hipernauemia, aci-
de 24 horas são: 170 a 254 mEq/ 24 horas. Sua concentra-
dose metabólica, acidose tubu lar renal), gasu imestina l
ção plasmática é 96 a 107 mEq/ L e alterações dessas con-
(desidratação, diarréia p ro longada, perda de secreção
centrações ocorrem na hipocloremia e hipercloremia.
pancreática, alça ileal, anastomose colo-ureteral ), medicamentos (especialmente a acetazolamida, que inibe a anidrase carbónica, além da infusão venosa excessiva de
Hipocloremia
solução salina) e uso de corticoesteróides. Preseme na síndrome de Barter, doença autossômica recessiva carac-
A depleção do cloro no organismo ou hipocloremia é definida com o valor de cloreco sérico menor que 96 mEq/L.
terizada por alteração da reabsorção do cloro no ramo ascendeme da alça de Henle.
Hipoclorem ia = cloreto sérico < 96 mEq/l
Manifestações clínicas As causas mais freqüentes de hipocloremia são: per-
As manifestações da hipercloremia são as dos distúr-
das de líquidos corporais por vômitos ou aspirado gás-
bios hidroeletrolícico e metabólicos associados (acidose
trico, diarréia, adenoma viloso do cólon, sudorese exces-
metabólica).
siva, febre alta, uso de diuréticos. No cúbulo discai, em situações de baixa de cloro, o sódio é absorvido com o bicarbonato (Na+ HC03-), por não cer o Cl (ânion) disponível, provocando alcalose metabólica hipoclorêmica (ver capítulo 42).
Abordagem laboratorial Na abordagem laboracorial são solicitadas as dosagens de cloreto sérico e u rinário, o ionograma completo e a gasomeuia. Determinações de cloreto sérico com
Manifestações clínicas
valores superiores a 107 mEq /L
e cloreto
urinário acima
de 254 mEq/ 24 horas caracterizam o estado de sobreO distúrbio é geralmente assintomácico. As manifes-
carga de cloro.
tações clínicas decorrem de distúrbios associados, ácidobásico (alcalose hipoclorêmica) e de outros eleuólitos.
DISTÚRBIOS DO CÁLCIO (Ca++)
Abordagem laboratorial Estima-se que um indivíduo de 70 Kg renha aproxi-
É realizada pela dosagem do cloreto sérico no plas-
madamente 1,2 Kg de cálcio, 99% localizados principal-
ma ou urina e sempre solicitada juntamente com outros
mente nos ossos. Uma pequena concentração de 5,3 g
íons (Na+, K+, HC03-) e a gasomeuia, pois fazem parte
escá no compartimento intracelular e 1,3 g no excracelu-
Investigação laboratorial dos distúrbios hidroeletrolíticos
539
lar. No plasma ou soro,
50% enconrram -se ionizados ou
livres e 50% ligados. formando complexos com compos-
Hipocalcemia = cálcio total < 8,6 mg/dl ou cálcio ion izado< 4,5 mg/ dl ou 2,2mEq /l
cos orgânicos. principalmente a album ina sérica. O cálcio
é importante para várias funções: formação óssea, trans-
Freqüenremente é causada por perda excessiva do
missão neuromuscular (participando juntamente com
cálcio na urina e/ou falha na mobil ização do cálcio dos
~.
Na+ Mg++,W), excitação nervosa. estabilização das
ossos para o sangue. Os diversos agravos que levam à
membranas cel ulares. participação na coagulação. Nos
hipocalcemia estão relacionados a falhas nos mecanis-
músculos, determina a despolarização da célula, inician-
mos reguladores hormonais (PTH), renais ou de síntese
do a conuação. A homeosrase do cálcio é realizada pelo
de vitamina D, sumarizados no Q uadro 41.7.
controle homonal do pararormônio e calcironina e pela ação da vitamina D. • controle hormonal - o paratormônio (PTH) é sintetizado nas glândulas pararireóides e regula as variações do nível sérico do cálcio por meio de mecanismo de feedback. A hipocalcemia estimula a secreção do PTH, que: a) nos ossos, mobiliza o
Quadro 41.7 - Causas de hipocalcemia Hipoporatireoidismo devido 6 remoção cirúrgico das poroti· reóides (câncer de tireóide e porolireóide), ogenesio de poro· tireóide ou no pseudo-hipoporotireoidismo. no qual não existe resposta adequado 6 oção do hormônio nos rins e nos ossos
diminuição da liberação do PTH. com mecanismo
Deficiência de vitamino D que ocone no: ol má·obsorçào (etilismo. esteoto néio, idosos). bi no doença hepático crónico por dekiêncro do 25·hidroxiloçõo do vil D ou por drm,nurçào do absorção rntestrnol, c) nos nefropotios devido 6 dmnu,ção do co tc 'triol(vrtomino D3) 4) no roqurtismo dependente de v tom no D
inverso nos orgãos alvo (ossos e rins) e estimulo
Hipoolbuminemio
cálcio; e b) nos rins, diminui a excreção desse íon, aumenta a excreção de fosfaro e estimula a formação de vitamina 03. Na hipercalcemia ocorre
para a liberação de calciconina pela tireóide, que tem ação hipocalcêmica por diminuir a reabsorção óssea e aumentar a excreção renal de cálcro; • vitamina 03: no fígado é produzida a 25-hidroxrcolicalcíferol e, nos rins, a partir de outra hidroxila-
Hipomognesemro Pancreolite aguda (remoção do cálcio plasmático) Alcolose metobáko
ção, transforma-se na 1.25 díihidroxicolecalciferol ou vir. 03 (calciuiol), biologicamente ativa. Sua ação é aumentar a absorção do cálcio intestinal e reabsorção do cálcio nos túbulos distais. Sua sínte-
Manifestações clínicas
se é estimulada pelo PTH. O cálcio sérico pode estar moderadamente baixo, Os rransrornos do metabolismo do cálcio são ava-
sem produzir sintomas. São sinais de hipocalcemia a
liados dosando-se a calcemia rota i, valor de referência
parestesia (formigamento dos lábios. língua e extremi-
8.6 a 10,3 mg/d l, e o cálcio ion izado. valor de referên-
dades), as dores m usculares. os espasmo dos músculos
cia 4,5 a 5.5 mg/dl ou 2.2 a 2.7 mEq/L. Podem ocorrer
da garganta - ocorrendo dificuldade respiratória, sinais
distúrbios que causam depleção (hipocalcemia) ou
neurológicos como letargia. confusão mental. espasmos
excesso (hipercalcemia).
musculares ou tetania e arritmia cardíaca. A tetania latente pode ser pesquisada pelo sinal de Chvostek (percussão do nervo facial), que é positivo quando produz
Hipocalcem ia
comração dos músculos da face, e pelo sinal de Trousseau (contração espasmódica dos músculos da mão e
Define-se como hipocalcemia os níveis séncos de
braço, quando se mantém o manguiro do aparelho de
cálcio coral inferiores a 8,6 mg/dl ou do cálcio ionizado
pressão insuflado acima da pressão arterial sistólica por
inferiores a 4,5 mg/dl ou 2.2mEq/ L. na presença de albu-
crês minuros).
mina sérica normal.
540 [ Medicina laboratorial pa ra o clínico
Abordagem laboratorial
Quadro 41.8- Causas de hipercalcemta
É realizada pela dosagem de cálcio sérico total e ionizado, devendo ser complementado com a dosa-
Hiperporotireoidismo
gem da albumina plasmática por suas repercussões
Carcinoma com ou sem metástases ósseas, como o carcinoma de células escamosas do pulmão, cabeça e pescoço e as metástases de câncer de mama, pulmão e ossos (PTH e prostaglandinas)
na calcem ia. O cálcio está parcialmente ligado à albumina no plasma
e o cálcio sérico
total baixo pode
refletir a hipoalbuminemia e não a depleção real do íon. Por isso, o mais indicado é o cálcio ionizado para definir o estado de hipocalcemia. Utilizando-se o cálcio total. deve-se fa zer a correção da hipoalbuminemia : a redução de 1g/dl na albumina reduz o cálcio total em aproximadamente 0,8 mg/dl. Quanto aos distúrbios ácido-básicos, a alcalose leva à hipocalcemia, por aumentar a ligação do cálcio com a albu-
M ieloma, leucemia e linfoma (substâncias com atividade osteaclóstica) Doenças granulomotosas (sardoidose, tuberculose, histoplos· mose, coccidioidomicose e beriliose) Hipervitaminose D crânica, intoxicação pela vitamina A e isotretinoína Imobilização prolongada em cr:anços e pacientes com turno· ver ósseo oiro (Paget, malignidade, histiocitose)
mina plasmática e diminuição do cálcio ionizado. Os
Síndrome leite-álcali luso prologado de carbonato de cálcio) - raro atuolmente
outros testes solicitados são para a avaliação de cau-
Idiopática na infância (rara)
sas agravantes ou a etiologia da hipocalcemia: avaliação da função renal com a dosagem de creatinina e
Endócrina: hipertireoidismo, doença de Addison, acromega· lia, feocromocitoma (causo rara de hipercalcemta)
uréia, dosagem sérica de fósforo, magnésio, potássio, PTH e a gasometria.
Hipercalcemia hipocalciúrica familiar (herança dominante) Osteomalácia renal induzida por alumínio Robdomiólise
Hipercalcemia
Várias drogas: sais de cálcio, lítio, vitamina D e A, estrogê· nias, clortalidona, tiaziada Define-se hipercalcemia como os níveis séricos de cálcio total superiores a 10,6 mg/dl ou do cálcio ionizado superior a 5.5 mg/dL. na presença da albumina sérica normal.
Abordagem laboratorial É realizada pela dosagem do cálcio, fósforo e cloreto, sérico e urinário, dosagem do PTH para diagnósti-
Hipercalcemia = cálcio sérico total > 10,6 mg/ dl e cálcio ionizado > 5,5 mg/dl
co de hiperparatireoidismo primário, o ionograma
ea
gasometria. A hipercalcemia inibe a absorção renal do As causas de hipercalcemia estão relacionadas às fa-
cloro, aumenta a excreção renal de bicarbonato, sódio,
lhas nos mecanismos reguladores. hormonais (PTH) e Vit.D3 As principais causas de hipercalcemia estão agru-
água, potássio e fósforo. Por isso, hipopotassemia, hipofosfatemia, acidose metabólica e desid ratação são
padas no Quadro 41.8.
achados freqüentes.
Manifestações clínicas
se acompanha de PTH elevado, cálcio sérico acima do
No hiperparatireoidismo primário a hipercalcemia valor máximo de referência (10,6 mg/dL), elevação de Os pacientes com hipercalcemia podem ter manifes-
vitamina D. hipofosfatemia, hipomagnesem ia. acidose
tações: a) gastrinestinais: náuseas. vómitos, constipação;
metabólica hipoclorêmica, maior excreção de fosfato
b) neurológicas: fraqueza muscular. fadiga, confusão tor-
e cloreto urinário. Geralmente, ocorre balanço inverso
por e coma; c) renais: nefrolitíase, poliúria, nefrocalcino-
entre o cálcio e o fósforo.
se; d) cardíacas: encurtamento do intervalo QT no ECG.
A hipercalcemia de processos malignos ocorre por reabsorção óssea devido a metástases e/ou liberação de
Porém, é freqüeme a falta de sintomas, que só ocorrem com níveis de cálcio sérico total acima de 12 mg/dl quando têm evolução rápida.
Investigação laboratorial dos distúrbios hidroeletrolíticos
e
substâncias osteolíticas pelos tumores, de ação semelhantes ao PTH. Nesses casos, têm-se vitamina D baixa,
541
absorção intestinal baixa de cálcio, cumor não-para tire-
Hipofosfotemio moderada: fósforo entre 2 . 1 e 2.5 mg/ dl
óide. Geralmente, a fosfatase alcalina está elevada acima de duas vezes o valor máximo de referência, o que é mais
Hipofosfatemio grave: fósforo< 1 mg/dl
sugestivo de neoplasias do que de hiperparatireoidismo. Na hipercalcemia familiar hipocalciúrica a hipercal-
Várias são as causas que levam à depleção de fós-
cemia não vem acompanhada de hipercalciúria, avaliada
foro. Entre elas, es(á a excreção aumentada do fósforo,
pela dosagem do cálcio na urina de 24 horas.
causada pelo hiperparatireoidismo primário ou secundário; nas desnutrições protéico-calóricas graves que ocorrem no alcoolismo crônico; insuficiência h epática
P04 - FÓ SFORO
e pancreática; na cecoacidose diabética, pelo deslocamento do fosfato intracelular para o plasma e perda
O fósforo representa 1% do peso corporal. No orga-
através da diurese osmótica; por aumento de perdas
nismo distribui-se: no tecido ósseo (85%), tecidos moles
renais na sindrome de Fanconi, nas tubulopatias por
(15%) e líquido extracelular (1%)
depósico de metais pesados, raquitismo resistente a
No sangue, 70% estão presentes na form a orgânica e
vi t ami na D; em neoplasias que comprometem a re-
30% inorgânica e representa apenas 1% do fósforo total.
absorção renal do fósforo, ocorrendo a osteomalácia.
O fósforo orgânico está distribuído principalmente nos
Outra causa
fosfolipídios; 15% do fósforo inorgânico estão ligados a
que formam complexos insolúveis com o fósforo, d i-
é o uso de antiácidos comendo alumínio,
proteínas e 75% em forma livre; o fósforo livre tem 50%
minuindo a absorção intestinal. Verifica-se na alcalo-
sob forma de sais de fosfaco monovalente e divaleme e
se respiratória pelo deslocamento do fósforo do LEC
40% em sais de sódio, magnésio e cálcio e pequena fra-
para o intracelular e nas deficiência de vitamina D, nu-
ção em P04.
tricional ou por má-absorção.
A fração medida na prática clínica é a do fósforo inorgânico, ou Pi, sendo os valores de referência de 3,0 a 4,5 mg/dl ou 1,0 a 2,0 mEq/ L. Embora presente sob a for-
Manifestações clínicas
ma de fosfato, é expresso em concentração de fósforo.
Os sintomas são inespecíficos e dependem da causa,
Absorvido no intestino delgado a partir da ingesta diária
duração e gravidade. Ocasionalmente, os pacientes po-
de 800 a 1.500 mg/dia, sua regulação está sob a influên-
dem se queixar de fraqueza. Nos pacientes cronicamente
cia do controle renal e hormonal e vitamina D. Vários
depletados de fosfaco, como os alcoólicos, desnutridos e
hormônios regula m o metabolismo do fósforo: o PTH
em fase de realimentação, os sintomas podem variar de
aumenta a excreção renal de fosfato, a insul ina aumenta
fraqueza e dor osteomuscular a alteração da consciência
a entrada de fósforo intracelular, os mineralocorticóides
e insuficiência cardíaca.
e a calciconina diminuem a reabsorção rena l de fosfaco. A vitamina D3 (calcitriol) aumenta a absorção de fósforo intestinal. Os distúrbios do fosfaco são os estados de depleção, hipofosfatemia; e o excesso, hiperfosfatemia.
Abordagem laboratorial
É real izada pela dosagem do fósforo sérico, cujos valores se encomram abaixo do valor mín imo de referência (3,0 mg/dL). Estando as!>OLiado a oucro~ distúrbios HE e AB, é im prescindível a avaliação do cálcio, magnésio, po-
H ipofosfatem ia
tássio, PTH, vitamina De gasometria. O fósforo urinário: a fração de excreção acima de 15% é elevada.
Define-se hipofosfatemia como os níveis séricos de fósforo (Pi) inferiores a 3,0 mg/dl.
Outras dosagens urinárias são úteis, como, por exemplo, na síndrome de Fanconi, que cursa com glicosúria, aminoacidúria, acidose tubular, hipouricemia e hiperuri-
Hipofosfotemio =fósforo sérico <3,0 mg/dl
542 [ Medicina labora toria l para o clínico
cosuria e hipofosfatemia por perda de fosfaco urinário.
Hiperfosfatemia
carbonaro de sódio) por período prolongado de tempo. A possibilidade de pseudo-hipoparatireoidismo geralmente
Define-se como hiperfosfatemia o nível sérico de fósforo superior a 4,5 mg/dl Hiperfosfatemia
=
é diagnosticada em bases clínicas, como as características físicas da osreodistrofia hereditária de Albrighr.
fósforo sérico> 4,5 mg/ dl
CONSIDERAÇÕES FINAIS As causas de hiperfosfotemia estão sumarizadas no Q uadro 41.9.
A água, os eletrólitos, os ácidos e as bases que compõem a estruw ra das células e tecidos do organismo,
Quadro 41.9- Causas de hiperfosfa[emia
em bora distribuídos em compart imencos (intracelular e extracelular), estão interligados e em equilíbrio para
Excreção reduzida : na insuficiência renal agudo e crónico, quando a depuração do creotinino está em torno de 20 o 25 ml/minutos, no hipoparatireoidismo e pseudo·hipoporatireoidismo, menopausa, hipertireoidismo, colcinose tumoral Carga exógena aumentada: uso de laxantes relais ou orais contendo fosfato, administração excessivo de fosfato parenteral ou oral, síndrome leite·álcali, transfusão de sangue estocado, excesso de vil D3 Cargo endógena aumentado: desvio do fósforo do introce· lulor para o espaço extracelular na rabdomiólise, lise tumoral, hemólise aguda, acidose respiratório ou metabólica aguda
a manutenção da homeostase. A avaliação laboratorial dispon ível na prática clínica permite detectar apenas os distúrbios dos eletrólitos no LEC (plasma/sangue/ líqu idos corporais), colaborando para o diagnóstico e sua correção. Na interpretação dos resultados, entretanco, deve-se ter em mente que essas alterações detectadas no LEC repercutem no meio incem o com o um todo.
REFERÊNCIAS 1.
Manifestações clínicas
2.
Os pacientes ocasionalmente podem apresencar sinro-
3.
mas como cãibras musculares, tetania e parestesia perioral e sinais de Trousseau ou Chvostek. Mais comumence, esses sintomas estão associados
4.
à hipocalcemia subjacente.
Outros sincomas são: dor óssea e articular, prurido ou eritema
e calcificação ectópica dos tecidos moles.
5. 6.
Achado laboratorial
7.
A hiperfosfatemia deve ser avaliada juntamente com outros íons, como o cálcio e o magnésio. Além destes, a
8.
determinação de uréia e creatinina é fundamencal para avaliar a função renal. A hipocalcemia associada à hiperfos-
9.
fatemia ocorre na insuficiência renal, hipoparatireoidismo e pseudo-hipoparatireoidismo. Uma abordagem laborarorial adicional pode incluir a determinação da vit amina De PTH intato. Na intoxicação por vi tamina D
10.
e síndrome leite-ál-
cali, os níveis de fósforo e cálcio estão altos. A síndrome leite-álcali é a ocorrência de alcalose metabólica causada pelo consumo de quancidades excessivas de leite (alta ingestão de cálcio)
e álcalis solúveis
(antiácidos, especialmente bi-
Investigação laboratorial dos distúrbios hidroeletrolíticos
11.
12.
Fauo AS. Harrison's Pnnoples of Internal Medicine. New York: McGraw-Hill; 2001. rried LF, Palevsky PM. Hyponatremia and hypernarremia Med Clin North Am. 1997 May;81(3):585·609. Haralampos J. Milionis GL. Elisaf M S. The hyponarremic patienr: a sysremanc approach ro laborarory diagnosis [review]. CMAJ. 2002;166(8):1056-62. Henry JB Clinical Diagnosis and Managemenr of Labo· rarory Merhods. 20th ed. Philadelphia: W. ll. Saunders Company; 2001. Kochhars S, Marshall W. lnvesrigarion: Essennal cli nical chemisrry. Srudenr BMJ. 2003;11:307-48. Kugler JP. Husread T. Hyponauemia and hypernauemia in rhe elderly. Am Fam Physician. 2000;61(12):3623-30. Morgan AP. Byden CM. Moore FD. Radioisorope dilution rechniques for mesuremenr of body composirion in he· alth an disease. Radiology Clin N Amer. 1967;5:193-204. Paolucci AA. Nefrologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 1977. 387 p. Ricos C Alvarez V. Cava F. García-Lario JV. Hernández A )iménez CV. et ai. Currenr databases on biological variation: pras. cons and progress. Scand J Clin Lab lnvest. 1999;59(7):491 -500. Riella CM. Princípios de Nefrologia e Distúrbios Hidroeletrolíricos. 3• ed. R1o de Janeiro: Guanabara Koogan; 1996.740 p. Wallach J. lnrerpreration of Diagnosnc Teses. 7th ed. Phlladelphia: Lippincott Williams & Wi lkins; 2000. Yeares KE. Stnger M, Morron AR. Sair and warer: a simple approach ro hyponarremia. CMA). 2004;170(3):365-9.
543
42
Elza Santiago Erichsen Lucimar Gonçalves de Souza Assunção
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DOS DISTÚRBIOS ÁCIDO,BÁSICOS
O metabolismo celular normal produz C02, água, uréia e ácidos orgânicos. Calcula-se que cerca de 20.000 mEq de C02 sejam produzidos diariamente nesse processo. Parce desse gás é hidratado e forma o ácido carbônico (C0 2+HP+H 2C03). No plasma essa equação é deslocada para a esquerda e o C02, sendo eliminado pelos pulmões, é chamado áCido volátil. Por outro lado, o metabolismo endógeno dos nutrientes produz diariamente 40 a 70 mEq de W ou ácidos fixos provenientes de aminoácidos contendo enxofre e fósforo presentes nas proteínas. Como produtos finais, produzem ácidos sulfúrico e fosfórico, que são eliminados como sulfatos, fosfatos e H+ pelos rins. A concentração hidrogênica iônica [H+] fisiológica no líquido extracelular (LEC) é de 40 nmoi/L e o pH do sangue arterial é mantido entre 7,35 e -7,45, para proporcionar a normalidade da função celular. As variações de pH compatíveis com a vida em limites extremos são 6,8 e 8,0 e mesmo assim o organismo pode suportá-las apenas por poucas horas.
MECANISMOS DE REGULAÇÃO DO pH PLASMÁTICO
Para manutenção da homeostase o organismo utiliza vários mecanismos, a fim de evitar variações da concenuação hidrogeniônica do meio interno: • camponamento químico com tampões presentes nos líquidos corporais: líquido extracelular (LEC) e líquido intracelular (LIC);
• controle respiratório do C0 2, o ácido volátil; • regulação renal do bicarbonato plasmático e eliminação de H+.
SISTEMA TAMPÕ ES Os líquidos corporais possuem em sua composição substâncias camponantes que impedem alterações bruscas do pH. Sabe-se que uma solução tampão impede variações de pH quando se adiciona a ela ácido ou base. Um sistema tam pão é o conjunto de um ácido fraco e de seu sal de base forte ou um ácido forte e seu sal de base fraca. No organismo várias substâncias presentes no LEC e LIC exercem esse efeito tampão e estão representadas no Quadro 42.1 Quando um ácido endógeno ou exógeno é adicionado ao organismo, ele é neutralizado no sangue, no Interstício e na célula. Aproximadamente 57% são tamponados nas células com troca de H+ por Na+ e K+ e o restante pelos tampões do LEC. Para as substâncias alcalinas, cerca de 70% são camponados no liquido extracelular e o restante no intracelular. Os tampões do sangue têm ação instantânea para lidar com o excesso de ácido ou base, sendo o bicarbonato o mais importante. O mecanismo pulmonar também cem ação rápida por meio da respiração. O tamponamento intracel ular e o mecanismo renal são mais lemos, mas com grande capacidade compensadora, como está esquematizado na Figura 42.1.
Eliminação de H• pelo organismo
Instantâneo
[
02 a 04 horas
]
[
Horas ou dias
]
[ 1O a 30 minutos ]
Figura 42.1 - Esquema representando a neurralização de excesso de ácido no organismo arravés dos vários mecanismos e os intervalos de rempo que cada processo leva para a sua ação neurralizadora. No extracelular os rampões mais imporrantes são o bicarbonaro e a hemoglobina. Quadro 42.1 - Sisremas rampões do organismo
dissociado, sendo esse o seu ponto de maior efeito tam ponanre. Essa equação para o tampão bicarbo naco, que
Base
é a base para a avaliação dos distúrbios ácido-básicos na
Sistema Tamp ão Ácido
prática clínica, está demonstrada nas fórmulas:
NaHC03
Bicarbonato
H2C03
Ácido carbônico
Na 2 HPO~
Fosfato bimetólico
NaH;P04
Fosfato monometólico
Pr(Na ou K+)
Proteinalo
Pr H+
Proteína ácido
Hb
Hemoglobinoto
HHb
Hemoglobina ácido
NH3
Amônio
N H4
Amônio
1)
base pH = pK + log - ácido
21
pK = 6,1
3)
27 pH = 6 , 1 + log 1,35
4)
pH
5J
pH = 6, 1 + 1,3 = 7,40
=6, 1 +
log 20
Tampão bicarbonato No organismo, o tampão bicarbonato se destaca,
No organismo, o dióxido de carbono (C0 2) pode: a)
pois ao tamponar o H + produz um ácido volátil C02,
formar ácido carbônico (H 2C03). que se dissocia em H+ e Hco; b) reagir com grupos aminos das proteínas; ou
que é controlado pelos pulmões, ou seja. pela respiração. Está presente em todos os tecidos Nas hemácias
e células
bicarbonato devido
e
no plasma.
c) estar livre no organismo. Quando em forma livre, ele
tubulares renais há síntese de
é diretamenre proporcional à pressão parcial do co2 ou pC02. O C0 2 livre = 0,03 X pC02 (0,03 é o fator de solu-
à grande concentração de anidrase
carbônica nesses locais.
bilidade do co2 no plasma ou constante oc).
Para simplificar a compreensão
e sua utilização prá-
o denomi-
nador da equação (2) H 2C03 pode ser substituído pela
tica. Henderson-Hasselbalch propuseram uma equação
pC02 vezes oc, pois o ácido carbônico
que representa a ação dos tampões. utilizando-se o pH,
pC02• expressa na fórmula:
é proporcional à
que é a medida da concentração de [H+J expressa em log.10 (pH = log 1/[H+J)
e introduzindo a const ante de
dissociação (pK) do tampão. Essa constante (pK) corresponde ao pH d o tampão quando ele
se encontra
50%
pH
s
NaHC03 pK + log - - pC02 x a
546 [ Medicina laboratorial para o clínico )1--- -- - - - -- - -- - - - - -- - - - - - - - - - - -- -
Em condições de trocas gasosas fisiológicas, a pC02 é de 40 mmHg e o C02 é em corno de 1,2 mEq/Lno sangue arterial e pode ser calculado pelo índice de solubilidade desse gás na água, que é 0,03. Assim, a concemração do gás carbónico: (C02]= paC02 X 0,03 ou 40 X0,03 = 1,2mEq/L. Interpretando a fórmula de Henderson-Hasselbalch, podese ver que aumento ou dtmtnutção de áodo ou base no organismo acarreta variações do pH do sangue. Em condições fisiológicas, a relação bicarbonato/ácido carbónico é de 20/1. Quando há diminuição de bicarbonaco, isso indica que houve acréscimo de W ou ácido fixo, consummdo o btcarbonaco e acarretando aodose metabólica. Por outro lado, o aumento da pC02 também acarreta dimmuição do pH ou acidose respiratória. As alterações que envolvem o bicarbonato são ditas metabólicas e dependem dos rins para sua compensação. Os diStúrbiOS que afetam o co2 são dicos resp1ratónos e dependem da função pulmonar. Para o rampão bicarbonaco do sangue, esse conceico pode ser simplificado, como mosrra a fórmula:
Tampão proteínas
As proteínas possuem efeico tamponante também porque possuem grupos ácidos e básicos em sua esrrurura molecular, semelhante ao que ocorre na hemoglobtna. A capactdade tamponame das proteínas está na capac1dade de os grupos ácidos cederem W formando ânions (-Coo-) e dos grupos básicos (-NH 2) captarem o H' formando cátions (- NH 3+). Por sua distribuição plasmática e intracelular e alta concentração no organismo corna-se também um Importante tampão.
Tampão fosfato
L o tampão mais importante nos rins e participa no mecanismo de regeneração do bicarbonaco. O H+ secretado pela célula tubular renal é trocado por uma molécula de sódio do tampão fosfato (Na 2 HP04), cuja reação é mostrada na fórmula:
componente metabólico
pHm - -- - - - COmpo nente respiratório
Tampão hemoglobina
A hemoglobina, além da função de uansporre de ox1gênio, é Importante tampão do LEC por possUir em sua estrutura grupos carboxílicos de áodos amtnados term1na1s (-COOH) e grupos bás1cos de am1nogrupos term1nais da lis1na ou guanid1na, valma e hisridina (-NH-CNH-NH2). A hidratação do C02 liberado nos Lecidos forma o b1carbonato, que se d1ssooa em Ht e HCOj . O H1 é captado pela Hb, tornando-a reduzida (HHb) e liberando o 0 2 para os teodos. Isso ocorre na passagem do sangue artenal para venoso. A forma ox1dada, oxihemoglob1na, rem menos afi· nidade pelo H+, pois o ox1gên1o ligado ao átomo de ferro diminui a capaodade ramponante do grupo 1m1dazol da hemoglob1na. Os íons b1carbonatos formados se dtfundem para o plasma e são equilibrados pela passagem de íons cloretos para dentro das hemáoas (rroca de o- por HCO~, mantendo assim o equilíbrio iônico dentro e fora das células. A eficiente produção de bicarbonato ocorre pela açâo da antdrase carbónica (AC) presente nas hemáoas (C02 + Hp ~ HF03 ~ HCOj + W), esquematizado na F1gura 42.2.
Investigação laboratoria l dos distúrbios ácido-basicos
CONTROLE RESPIRATÓRIO DO ÁCIDO VOLÁTIL C02 O controle respiratório é essencial para a manutenção da pC0 2 em níveis fisiológicos. Distúrbios respiratórios resultam em maior eliminação ou retenção de C02 no organ1smo e, portanto, perda ou ganho de ácido carbónico, que se dissocia em bicarbonato e htdrogên1o. O aumento da freqüêncta resp1ratóna ou taquipnéia leva à dim1nu1ção da pC0 2 e aumenco do pH arterial (alcalose respiratória primária ou compensadora). A diminuição da frequência respiratória ou bradipnéia eleva a pC02 e causa dim1nuição do pH arterial (acidose respiratória primária ou compensadora).
REGU LAÇÃO RENAL DO BICA RBONATO PLASMÁTICO E EXCREÇÃO DE H+ Os nns excretam cerca de 50 mEq/dia de W em condições fisiológicas. A eliminação desse ácido fixo e o controle do bicarbonato plasmátiCO são feitos pelo rim por
547
Tecidos C0 2 -
][
difusão -
)[
Plasma C02 -
difusão-
Eritrócitos
co2dissolvido
C0 2 +
Hp
~
+
Anidrase carbônica
+t H2C03
+t HCOj
02
HCOj + H• (tamponado pela Hb)
CI
CI
02
Hb + H•
H20
H20
Figura 42.2 -Representação esquemánca dos processos que ocorrem no ramponamenro do hidrogên1o pela hemoglobina. meio de vários mecanismos: a) reabsorção do bicarbonaro do ulcrafilcrado glomerular; b)regeneração do bicarbonaro consumido; c) excreção de H+; d) produção de amónia.
e sim resultado de várias reações químicas, mas equivalente ao que foi filtrado. Distúrbios eletrolícicos envolvendo o K+ e Cl- interferem na reabsorção de bicarbonaco. Na hiperpocasemia há aumento do ~ intracelular. O K+ que entra na célula é permutado com o H+, assim há queda de H+ e do pH
Reabsorção de bicarbonato Todo bicarbonaco filtrado é reabsorvido até o limiar
intracelular e, em conseqüência, menos absorção de bicarbonato, levando à acidose metabólica hipercalêmica. A hipopocassemia leva, por mecanismo inverso, à alcalose metabólica
(Tm) renal desse ânion, que é de 3,2 mEq/min e corresponde
hipocalêmica. Nos distúrbios com perda do cloreto ocorre
à concentração de bicarbonaco plasmático de ± 27 mEq/L.
aumento da reabsorção de bicarbonato renal. o que leva à alcalose metabólica hipoclorêmica.
Uma elevação na concentração plasmática de bicarbonaco ocasiona eliminação desse excesso pela urina. Cerca de 90% são reabsorvidos no cúbulo proximal e 10 a 15% nos túbulos contornados distais. Calcula-se que 27.000 mEq de HCO)são filtrados em 24 horas, o que levaria a uma grande espoliação de base se não houvesse esse mecanismo conservador. Emrecamo, o mecanismo de reabsorção do bicarbonaco é indireco. A Figura 42.3 esquematiza esse processo. Na luz tubular o bicarbonaco filtrado neutraliza o H+ secretado pelas células tubulares rena1s e o H2C0 3 formado decompõe-se em Hp+ C02, que se difunde para a célula tubular. Por ação da amdrase carbónica forma-se novamente W e HCOj O H+ é secretado e trocado pelo sód1o que, junco com o HCOj, difunde-se para o interstício e plasma, "reabsorvendo" assim o bicarbonato e sódio filtrado. Portanto, o bicarbonato que aparece no sangue não é o que fo1filtrado
548 [
Regeneração do bicarbonato Na neutralização do ácido fixo produzido ou introduzido no organismo, consome-se o tampão bicarbonaco. A restauração desse tampão é uma das funções do rim para manutenção do pH do sangue e cem a participação do tampão fosfato (HP04 --; Hl04 -).o mais importante e potente tampão tubular renal. Nos rins, a eliminação do H+ pela ação do tampão fosfato libera sódio e regenera o bicarbonaco por meio das reações esquematizadas na Figura 42.4. A quantidade de íons H+ eliminados pelo fosfato e por outros tampões orgânicos como creatinina e beta-hidroxibuciraro é chamada de acidez titulável.
Medicina laboratorial para o clínico ]1-- - - - - - - - -- - - - - - -- - - - - -- - - - - - - -
Filtrado Glomerular
l[
l(
Célula Tubular Renal
Na·
Na·
HCOj +Na·
~
Capilar Peritubulor
Na/K ATPase
HCO; +H·
HC0
H·+ HCOj
t+
+
H2 C03
,. Hp +
AC
co 2
~
3
NaHC03
t+
plasma
co2 + H20
urino
Figura 42.3- Esquema representando a "reabsorção" renal de bicarbonato que é realizada pela troca de H ~ por Na+ e a produção de HC03. pelas células tubulares sob ação da anidrase carbónica (AC).
~======F=i=ltr=o=do==G=Io=m=e=r=ul=o=r======~][>=======C=é=l u=la==fu=b=u=la=r=R=e=na=I=======<][~========C=a=p=ila=r=P=e=ri=tu=b=ul=a=r======~ Na·
NaHP04 + Na ·
Na·
Na/ K ATPase H· + HC0
3
HCO j
plasma urino Figura 42.4 - Esquema representando a regeneração de b1carbonaro. Nos túbulos distais uma molécula de Na+ do tampão fosfato presente no filtrado glomerular é trocado pelo H' e excretado na unna sob forma de fosfatO monossódico.Nessa troca houve eliminação de ác1do (H') e produção de nova molécula de bicarbonatO pelos rins.
Produção de amónia O urro mecanismo renal de conservação de base e ex-
nio (NH4 +), sendo excretado na urina ligado ao cloro.
creção de ácido muiro eficienre é a produção de amônia
Nesse processo, o Na+ é liberado e reabsorvido com o
(N H3) pelas células tubulares. A gluramina
é a principal
bicarbonatO esquematizado na Figura 42.5.
fonte de amônia que, ao reagir com o H+, produz amô-
Investigação laboratorial dos dist úrbios ácido-basicos
549
Filtrado Glomerular Cl + Na•
l[ li
JJ
Célula Tubular Renal Na•
l[
Capilar Peritubular Na·
Na/K
ATPose H•
H• + HCO;
HCO;
+
t+
NH 3
H2 C03
+
t +AC
Cl + NH.
j
H20 + C02 Glutamina (aminoácido)
NaHC03 plasma
urina
+ NH 3
Figura 42.5 - Esquema representando a excreção renal de H+ e regeneração do bicarbo nato. arravés da prod ução de amônla (NH) pelos aminoácidos das células r ubulares renais. A amônia rampona o H+ e é excrerado sob a forma de cloreto de amôn1o(CINH 4) eli m1nado na unna.
Excreção de H+ livre
Pequenas quamidades de H+ livre podem ser eliminadas na urina, mas são pouco significativas para a eliminação de ácido do organismo.
EXAMES LABORATORIAIS PARA A ABORDAGEM DOS DISTÚRBIOS ÁCIDO-BÁSICOS (DAB)
Na abordagem laborarorial dos distúrbios ácidobásicos são medidas. principalmenre, as alterações que ocorrem com a concemração do tampão bicarbonaro no sangue, por suas caracrerísticas já abordadas. Os testes laboraroriais utilizados na prática clínica para confirmação e diagnóstico são a gasometria e dosagem de elerróliros, pela inrer-relação desses distúrbios.
(base excess). A avaliação desses parâmetros determi-
nam o estado ácido-básico do pacieme. O (a) idemifica que foi realizada em sangue arterial. Os equipamemos utilizados compõem-se basicameme de eleu odos para a leitura direta de pH, pC0 2 e p0 2: • o pH mede a concemração de H- do sangue. É o log do inverso da [H+]. Valor de referência = 7.35 a 7,45; • a paC02 (pressão parcial de gás carbônico arrerial) mede a fração dissolvida não combinada de co2 rotai. Ela reflete o C0 2 em nível alveolar. Avalia as alterações respiratórias. Valor de referência = 35 a 45mmHg; • a pa02 (pressão parcial do oxigénio a nível alveolar) mede a concemração de oxigénio em nível alveolar, indicando a presença ou não de hipoxemia arterial. Va lor de referência = 80 a 100 mm Hg; • saturação de 0 2 mede o grau de saruração do oxigénio no sangue. Valor de referência = 95 a 100%.
GASOMETRIA
A gasomerria é o exame realizado no sangue venoso ou arterial, para a medida do pH, paC02, bicarbonaro plasmático, pa02, saturação do 0 2 e excesso de base
São calculados pelo nomograma de Sigaard-Andersen ou outro, disponíveis com o gasômetro utilizado: • bicarbonato padrão é a determinação do bicarbonato plasmático após o sangue ter sido equili-
550 ( Medicina laboratorial para o clínico )1---- - -- - - - - - -- - - - - - - - - - - -- - - - - -
brado com a pC02 de 40 mmHg, à temperarura de 37"C. Valor de referência 22 a 26 mEq/L;
O HA é utilizado na prática clínica na interpretação das acidoses metabólicas que são divididas em dois grupos:
• bicarbonato real é um dado cálculo-derivado do
1. acidose metabólica com HA elevado. Ocorre nas
bicarbonaro plasmático com os valores da pC0 2
elevações de ácido no organismo observadas na
do paciente. Avalia as alterações metabólicas. Valor de referência = 22 a 26 mEq/L;
ceroacidose diabética e acidose lática entre ou-
• excesso de base (BE): é calculado a partir dos valores de pH, de pC02 e da concentração da hemoglobina e expressa o excesso ou o déficit de bases do organismo. Representa o desequilíbrio
2. acidose metabólica com HA normal ou hiperclorêmica. Ocorre nos casos de perda de bicarbonaro pelo organismo. Nesse caso há aumento
dessas bases, valores negativos, indica perda de
tras causas;
de reabsorção renal de cloro para compensar o bicarbonaro perdido levando a hipercloremia.
base ou acidose metabólica. valores positivos. 1nd1ca excesso de base ou alcalose metabólica. Orienta a quantidade de base necessária para o retorno do pH ao normal. Valor de referência =
Hia t o a n iôn ico u rinário (HAU)
+2 a -2 mEq/L.
É uma medida indireca do amônio na urina a partir de amostras isoladas de urina. É outro dado utilizado na
Os aparelhos mais modernos incorporam elecrodos específicos para dosagem de elecrólicos (Na t . K+, e1· e ca+ ionizado) e determinam o amon gap, a hemoglobi-
avaliação da acidose metabólica A equação utilizada é: HAU = (No'J. +[K•J ; (Crj •
na, o hematócrico, a glicose e laceara Hiaw aniônico urinário (HAU) negativo significa aumenHIATO ANIÔN ICO (HA) OU
ANION GAP OU DIFERENÇA DE ÂN IONS (DA)
co de eliminação de amônio (NH~ e, portamo. resposta renal compensadora de eliminação de excesso de H+ (Figura 42.5). Quando se encontra o hiaw aniônico urinário (HAU) positivo. isw significa baixa eliminação de amónio ou sua elimina-
O h1ato aniôn1co expressa os ânions não dosados pelos mérodos rmineiros (fosfato. lactato. sulfatos. prmeí-
ção com outros ânions orgânicos (lactato. becahidroxibutiraco) ou não-orgânicos (hipuraw). Os HAU positivos indicam
nas. ceroáodos). É calculado pela diferença entre cátions
distúrbios renais na produção de NH3+ nos túbulos rena1s ou
e ân1ons séricos medidos, utilizando-se as fórmulas:
também distúrbio de secreção distal de H+. As Tabelas 42.1. 42.2. e 42.3 apresentam os valores
(No·]+(outros cótions] = (CI-] + (HCO; ] + (outros ônions]
Na prác1ca. o cálculo do hiato aniônico plasmático é feito utilizando-se a fórmula a seguir, que exclui o K+ (ba1xa concentração sénca conmbuindo pouco no cá lculo fina l). HA = (No•]- ((CIJ + (HCO; JI
A variação normal do HA é de 12± 2 mEq/L de plasma. Em pacientes rena1s, o potássio pode estar elevado e dar um efeito maior no cálculo. Uma fórmula alternativa é: HA = I(No·] + [K· ]) - I(CI]
+
(HCOJl l
Investigação laboratorial dos distúrbios ácido-basicos
de referência do pH, pa02. paC02. Sat.02. HC03, Hiaro aniônico. excesso de base (BE). em sangue arterial e venoso para adultos e crianças.
Variações biológicas
A vanação b1ológ1ca (Cv em %) do pH e pC02 está exemplificada na Tabela 42.4. Pela necessária manutenção desses parâmetros em limites estreitos, a variabilidade intra e imennd1víduos é reduzida e similar, bem como as especificações para a imprecisão e bias (resultados falsamente elevados ou reduzidos) dos métodos analíticos. O erro tota l corresponde à soma da imprecisão e inexatidão. considerando-se a variação biológica.
551
Tabela 42.1 -Valores de referência do pH, gases sanguíneos,
Tabela 42.4 - Parâmerros de Variação Biológica
bicarbonaw, excesso de base e hiaw aniônico em adulws Parâmetro
Valor de Referência
pH
7,35 - 7,45(*)
pa02
80- 100 mmHg
poC02
35 - 45 mmHg(*)
Sot0 2
95- 100 %
HC03
22-26 mEq/L
Hiato oniônico
12 ± 2 mEq/L
BE
-2 o +2 mEq/ L
Especificação Desejável
Variação biológica Cv intraindividual
Parâmetro
Cv interindividual
lmprecisão (%)
Bias Erro (%} total
(%) pC0 2
4,8
5,3
2,4
1,8
5,7
pH [H+]
3,5
2,0
1,8
1,0
3,9
Fome:R1cos C. Alvarez V, Cava F. GarCia-Lario JV. Hernandez A, )1menez CV. Mmchinela J. Perich C. Simon M. "Currem databaseson b1olog1C vanauon: pras, cons and progress.· Scand j Chn Lab lnvest 1999; 59:491-SOO
Cuidados na coleta Fome: Shapiro lN: Clin,cal Apphcauon of Blood Gases. Sth Edit10n. By Barry A. Shapiro. MD. W1lham T PeruZZI. MD and Rozanna Kozlowski·Temphn.1994. ' Os valores ass1nalados referem-se a d01s desv1os-padrão e no caso do paC02 tam· bém para pessoas em repouso
Na coleta da amostra
de sangue arterial ou venoso, a
heparina é o anticoagulante de escolha e deve estar elet roliticamente equilibrada com o sódio ou líti o em um pH abaixo de 7,0. Hoje estão d isp oníveis seringas prontas
Tabela 42.2 - Valores de referência do pH e gases sanguíneos para amosrras de sangue arrerial e venoso em adul w
com heparina de lítio em apresentação liofilizada para o btenção de vol umes definidos de amostra. A amostra deve ser mantida sem contato com o ar e transporta-
Parâ metro
Sangue arterial
Sangue venoso
da rapidamente ao local d o exam e. O sangue arterial é
pH
7,35 o 7,45
0.05 unidades menor
colhido de preferência na artéria femoral, radial o u cate-
poC0 2
35 o 45 mmHg
6 mmHg maior
pOz
70 o 100 mmHg
-50% (35 o 50 mmHg)
t er intra-arterial nos pacientes em cuidados intensivos. Amostras d e sangue capilar para micrométodos pod em ser o btidas de recém -nascidos
e crian ças menores,
tendo-se o cuid ado prévio de aquecim ento do local da punção para arterializar o sangue. Tabela 42.3 - Valores de referência do pH, paC02 e bicarbonaw sanguíneo em diferences faixas erárias Idade 1 mês (RTN)
pH
paC02
HCO;j
7,39 ± 0.02
31 ± 1,5
20 ± 0,7
3 - 24 meses
7,39 ± 0,03
34 ± 4,0
21 ± 2,0
1,5- 3,4 anos
7, 35 ± 0 ,05
37 ± 4,0
20 ± 2,5
3,5 - 5,4 anos
739 ± 0 ,04
38 ± 3,0
22 ± 1.5
5,5 - 12,4 anos
7,40 ± 0,0 3
38 ± 3,0
23 ± 1,0
Cuidados com a amostra e controle de fatores interferentes a) Pré-analíticos: relat ivos à adequada co let a e conservação da amostra durante o tra nsporte. •
rejeitar amostras coaguladas e hemolisadas;
• pad ro nizar o volume de heparina. O excesso de heparina (por ser ácida) na amostra pode dar resu ltado falso do pH. O volum e de 0,05 ml de heparina sódica
é suficiente para a amostra d e 1 m l
d e sangue; 12.5 - 17. 4 anos
7, 38 ± 0,03
41 ± 3.0
24 ± 1,0
• eliminar as bolhas d e ar na seringa após a coleta,
Adultos
7, 40 ± 0,02
41 ± 3,5
25 ± 1,0
pois levam a resultados elevados da p0 2 e baixos d e pC02;
Fonte: Carraza, FR& Andriolo. A. Diagnóstico laborawnal em ped1at na. São Paulo Sarv1er. 2000. p. 122
•
transportar a amostra acondicionad a em gelo. A falt a de refrigeração po de d iminuir o oxigênio da
552 ( Med icina laboraw rial para o clínico ] \ - - - -- - - - -- -- - -- - - - - -- - - -- - -- - - -
amostra e causar elevação do gás carbônico pela não interrupção do metabolismo celular; • realizar o exame no máximo de 10 minuws em amostra em temperawra ambiente ou até duas horas, se conservada no gelo. O atraso na execução altera as concentrações dos gases e pH. b) Analíticos relativos ao equipamento: providenciar a adequada e periódica manutenção do equipamento para prevenir o envelhecimenw e/ou contaminação das membranas com proteínas, fungos, bactérias.A cada turno de 8 horas recomenda-se a verificação da precisão com o uso de controles internos e acompanhamento nos gráficos de controle de qualidade (Levey-Jennings). Considera-se precisão adequada +/-0,02 para o pH, +/-2% para o p0 2 e pC0 2; c) Pós-analítico: considerar para a interpretação dos resultados o uso de infusões venosas de elerrólitos ou outros medicamentos, equipamentos para ventilação mecânica, no momento da coleta da amostra.
DISTÚRBIOS PRIMÁRIOS ÁCIDO-BÁSICOS
Os distúrbios primários ácido-básicos que podem ocorrer são: acidose metabólica, acidose respiratória, alcalose metabólica, alcalose respiratória e distúrbios mistos - associação de mais de um distúrbio. A abordagem laborarorial é feita com a solicitação da gasometria. Os outros testes como os eletrólitos séricos e urinários, HA. HAU. glicemia, creatinina são solicitados para avaliar a função renal e possíveis causas. A interpretação da gasometria deve começar com a verificação do pH. É o pH que orienta se existe o estado de acidose, pH do sangue abaixo de 7,35 ou alcalose pH acima de 7.45 ou equilíbrio pH normal. Em seguida, avaliam-se os outros dados como paC02, bicarbonaw. excesso de base, pa02, hiaro aniónico para caracterizar se o distúrbio primário é metabólico, respiratório ou mista e o grau de compensação. Os resultados devem ser sempre interpretados em conjunto com os dados clínicos do paciente (vómitos, diarréia, medicamentos em uso, agravos anteriores: DM. DPOC. PNM, IR, ventilação assistida).
Investigação laboracorial dos dist úrbios ácido-basicos
ACIDOSE METABÓLICA
Distúrbio resultante da perda de bicarbonato ou ganho de íons hidrogênio no líquido extracelular e conseqüente baixa do pH do sangue. Na gasomecria rem-se o pH abaixo de 7.35. bicarbonato diminuído no sangue. A compensação respiratória diminui o pC0 2. Na acidose metabólica o declínio da paC02 compensadora previsível pode ser calculada pela fórmula utilizada por alguns autores: pC0 2 = 1,5 x HC03 plasmático + 8, ou seja, para cada 1 mEq/L na diminuição do bicarbonato plasmático a paC02 diminui 1 a 1.3 mmHg. Por esse cálculo pode-se verificar a capacidade de compensação e/ou distúrbios respiratórios concomitantes. Se o resultado da paC02 estiver acima do valor previsível calculado para a compensação, está ocorrendo acidose respiratória associada; e nos valores abaixo, alcalose respiratória. Por exemplo: para o resultado de bicarbonato 10 mEq/L e paC0 2 de 40 mmHg teremos: • paC02 compensadora previsível = 1.5 x 10 mEq/L bicarbonaw+8 = 23 mmHg; • conclusão: acidose metabólica e associação de acidose respi ratória, pois os valores estão muito acima da compensação esperada, o que levaria à baixa da paC02. Na determinação da etiologia, devem ser realizados: glicemia, pesquisa de cetonas, pesquisa de substâncias tóxicas no sangue, eletrólitos séricos, lacta to sérico, exame da uri na e pH urinário. O cálculo do HA. HAU e BE é muito útil para esclarecimento do diagnóstico diferencial. O HA elevado sugere produção excessiva de ácidos orgânicos e ocorre na cetoacidose diabética e alcoólica, ácidose láctica e insuficiência renal. O hiato aniônico urinário negativo indica que a acidose metabólica é extra-renal (perda de bicarbonato ou ganho de ácido) e que o rim está eliminando o excesso de W por meio de maior produção de amónio (Figura 42.5). Se o hiato aniónico urinário for positivo, indica baixa excreção de amônio, significando que a acidose metabólica tem possível causa renal. As acidoses tubulares renais exemplificam essa probabilidade. O BE encontra-se negativo na acidose metabólica e expressa a perda de base. Por exemplo: pH = 7,20, paC02 = 24 mmHg, bicarbonato = 8 mEq/L, BE = - 16. (Conclusão: acidose metabólica parcialmente compensada: pH muito abaixo de
553
7,35, BE valor muiw negarivo indicam a grande perda de base e o componente metabólico; e paC0 2 baixa indica compensação respiratória parcial). O Quadro 42.2 esquematiza as alcerações esperadas para o pH, bicarbonaco e paC02 na acidose metabólica. Quadro 42.2 - Achados laboracona1s do pH, bicarbonato e pC02, excesso de base (BE) e hiaro aniônico na acidose metabólica pH
fa se Alteração primário
[HCü.J·] pC0 2 SBE
HA
<7.35
tt
N
<·2
Nau aumentado•
N
t
t
<·2
N ou a umentado
Resposta compensotórto
'depende da e[lologta
Ma nifestações clínicas
A acidose metabólica leve pode ser assintomácica. O bicarbonaco é consumido no processo de compensação, levando ao estím ulo respiratório com aumento da freqüência respiratória e redução da paC02 na fase compensatória. A compensação renal é feita promovendo maior eliminação de H+ e restauração do bicarbonaco, urina ácida, maior excreção de sais de amônio. Nos distúrbios graves, é comum a ocorrência de náusea, vômico, fadiga e respiração mais ampla e profunda (respiração de Kussmaul). O agravamento do quadro pode evoluir com fraq ueza, confusão memal, hipocensão, choque, coma e morre. A hipercalemia é uma complicação freqüence da acidose metabólica, pela troca do K+ intracelular pelo H+ como mecanismo de compensação.
• eliminação reduzida de ácido pelos rins na insuficiência renal (falência dos múltiplos mecanismos renais de eliminação de H+), acidose tubu lar renal (rransrorno tubular congênico ou adqui rido levando à secreção reduzida de H+ pelas células tubulares), desnucrição.
ALCALOSE METABÓLICA
Distúrbio resultante de ganho de base ou perda de ácido e conseqüente aumento do pH sanguíneo. A gasometria mostra: pH acima de 7,45 e bicarbonato elevado. O mecanismo compensador respiratório eleva a paC02 (retenção de H2C03). Na alcalose metabólica a previsão de compensação respiratória é o aumenco da pC02 de 0,7- 0,8 mmHg, para a elevação de 1 mEq/L de bicarbonato. A compensação renal, mais eficiente, diminui a produção de amônio, a reabsorção de bicarbonato renal produz maior eliminação de base e urina mais alcalina, excreção aumentada de sódio e potássio. Por exemplo: pH = 7, 55, paC0 2 = 35 mm Hg, bicarbonato = 30 mEq/L, BE = +6,0. Conclusão: alcalose metabólica pura: pH acima de 7,45. excesso de base positivo, componente respiratório normal. O Quad ro 42.3 mostra as alterações esperadas para o pH do sangue, bicarbonato plasmático, paC02 e BE na alcalose metabólica. Quadro 42.3 - Achados laboratoriais do pH, bicarbonato e pC02, excesso de base (BE) e hiaro aniônico (HA) na alcalose metabólica Fase Alteração primária
Etiologia
• perda de bicarbonaco por meio do aparelho digestiVO (diarréias, físculas pancreática) ou causas renais no rranscorno tubular proximal de reabsorção de bicarbonato (HA- normal); • acúm ulo de ácidos na cecoacidose diabética, acidose láctica (sepse por gram negativo), uso abusivo de aspirina, parada cardiorrespiracória. erro inaco do metabolismo (HA- elevado);
SBE
HA
>7.45
ii
N
> +2
N ou d iminuído•
N
i
i
> +2
N
pH
Respos·o compensotóno
(HCü.J'] pC02
'dependem da et1olog1a
Manifestações clínicas
A sintomatologia é inespecífica e se relaciona aos distúrbios no sistema nervoso e cardíaco muitas vezes secundário aos distúrbios hidroelecrolícicos associados
554 ( Medicina laboratorial para o clínico )1--- - - - - - -- - - - - - - - -- -- - -- - -- - - - -
Estes se correlacionam com alterações concomitantes no metabolismo do cálcio e pocássio, levando à hipocalcemia e hipopotassemia (o aumento de 0,1 no pH leva à dlm1nu1çào de 0.46 mg/dl do cálcio ionizado e 0,6 mEq/ L de potássio sérico). Na alcalose metabólica esse dado deve ser considerado na interpretação do potássio e cáloo séncos. Por exemplo: pH = 7,65 e K+ = 4,0 mEq/L Correçào da alcalose = (0,2 X 0,6 = 1,2) [K+) pocássio real = 4 -1,2 = 2,8 mEq/L, portamo, hipoporassemia
O Quad ro 42.4 esquematiza as alterações esperadas na acidose respirató ria para o pH plasmático, bicarbonaco, paC02 e BE. Quad ro 42.4 - Achados laboratoriais do pH, b1carbonaro e pC02 e excesso de base (BE) na acidose respira tória Fase Alteração primário Resposro compensolório
BE
N
pC02 ii
i
i
> ...2
pH
[HCO;j]
<7.35 N
N
Et iologia M anifestações clínicas
• depleção de clorew e d1stúrb1o do LEC por vóm iws, aspiração nasogásrnca. adenoma viloso, diarréia com perda de clorem, uso abusivo de diurécicos (tiazídicos, furosemida, ácido etacrín1co); • hipopotassemia devido à h1perativ1dade adrenal (síndrome de Cushing ou uso de corticosteróide). • administração excessiva de bicarbonam e síndrome leite-álcali.
o aumen w do co2ou hi percapnia pode causar estado de confusão e cefaléia relacio nados com a vasodilatação cerebral. Essa manifestação pode evoluir até o coma e cursar com aumento da pressão intracraniana. Manifestações cardiovasculares podem estar presentes.
Etiologia
ACIDOSE RESPI RATÓRIA Distúrbio resultante da retenção de C0 2 sanguíneo e conseqüente baixa do pH do sangue. A gasomecria mostra pH abaixo de 7.35, paC0 2 elevado, e o bicarbonato variando com a compensação. A retenção de co2eleva o HF03ou (H+ HCO~ - cada aumento de 10 mmHg na fase aguda eleva 1 mEq/L de b1carbonato e nos processos crónicos 3.5 mEq/L. A compensação da aodose respiratória é fe1ta por meio de dois mecan1smos: a) pelo tampão hemoglobina que capta o W e libera o blcarbonaco para o LEC; b) promovendo maior reabsorção renal de bicarbonaco e ma1or eliminação de H+ na urina. Por exemplo: pH = 7, 16, paC02 = 85 mmHg, pa02 = 30 mmHg, bicarbonaw = 24,0 mEq/L, BE= -3. Conclusão: acidose respiratória descompensada e hipoxemia pH ba1xo caracterizando a acidose, paC02 muiw elevada caracterizando a insuficiência respiratória, a acentuada baixa da pa02 mostrando a hi poxemia, o bicarbonaw e BE não alterados destacam a não compensação.
Investigação laboratorial dos distúrbios ácido-basicos
As causas de acidose respiratóna são todas as mcunstâncias que levam à hipoventilação e acúmulo de co2no sangue. Podem ser por um mecanismo Intrínseco de disfunção pulmonar e/ou músculos respiratórios ou depressão dos cenuos respiratórios no sistema nervoso cent ral. São causas de acidose respiratória: doença pulmonar obstrutiva crón1ca (DPOC). pneumonia, paralisia dos músculos respiratórios e lesões do SNC de diferences causas.
ALCALOSE RESPIRATÓRIA Distúrbio resultame da eliminação aumentada de C02 e conseqüente elevação do pH do sangue. A gasometria mostra: elevação do pH acima de 7,45, redução da paC02 e redução compensadora do bicarbonaco - para cada redução da pC02 de 10 mmHg ocorre diminuição de 2 mEq/L no bicarbonato plasmático na fase aguda e 4 mEq/L na crônica. A maior eliminação C02 significa perda de ácido volátil, ou seja, menor concentração de H+ no organismo. A
555
compensação se faz no sentido de eliminação aumentada de bicarbonaco pelos rins para normalizar o pH. Por exemplo: pacteme hipervenrilado apresentou na gasomerria: pH = 7,44, paC02 = 24 mmHg. bicarbonam =16 mEq/L. BE =-6. Conclusão: alcalose respiratória compensada (pH normal, baixa de C02 pela hiperventilação, bicarbonaro batxo compensando o distúrbto e o BE negattvo pela perda de base na compensação). O Quadro 42.5 esquematiza as alterações esperadas na alcalose respiratória para o pH. bicarbonato plasmático. paC02 e BE. Quadro 42.5 - Achacos laboratoriais do pH. btcarbonaro. pC0 2 e excesso de base (BE) na alcalose respiratóna Fase Alteração pnmóno Resposlo .ompensotório
BE
N
pC02 .!..!.
.!.
.!.
< ·2
pH
[HCO;j]
>7.45
N
N
Manifestações cín icas
A redução da pC02 tem duas conseqüências. sendo uma delas a vasoconstrição e a outra a hipocalcemia (redução do cálcio ionizado). Portanto, podem surgir manifestações relacionadas ao sistema nervoso central e muscular. tais como: parestesias, cãibras, tetamia. convulsões e alteração do estado de consciência.
Etiologia
Relaciona-se corr as diversas situações que cursam com a hiperventilação e o estímulo não-pulmonar do centro respiratório, como a dor aguda e intensa, sepses. ansiedade, altura e uso de drogas.
DISTÚRBIOS M ISTOS
São Situações clíntcas que ocorrem, dois distúrbios primários associados (respiratório e metabólico). Como visto até agora, os dtstúrbtos primários ocasionam uma compensação para a manutenção do pH do sangue e a homeostase, mantendo a
556 ( Medicina laboratorial para o clínico
proporção de bicarbonaro/ácido carbônico =20/1 na equação do tampão bicarbonato. Os distúrbios mtstos caracrenzam-se por ultrapassar esses limites previsíveis da compensação. avaliados na prática com a utiltzação do nomograma de StgaardAndersen. ou equivalente. de tnteração do pH. [HCO~. paC02• pa02•com índices de 95%de limtre de confiança. Para a conclusão são 1m prescindíveis o quadro clínico do paciente, os eletrólitos e os outros testes (HA, HAU, BE). Por exemplo: um paciente portador de cetoacidose diabética e insuficiência respiratória devtdo a quadro pneumónico terá na gasomerria JH e bicarbonaco baixos, BE negativo, indicando a acidose metabólica, mas paC0 2 elevada, o que caracreriza a acidose metabólica e respiratória associadas. O resultado da gasomerria foi: pH = 7.21, pC02 = 54mmHg, p02. = 48 mHg, Btcarbonam real = 19 mEq/L. BE = -6.5. Nesse caso o distúrbio misto foi no sentido oposto da compensação. o que faoltta o dtagnósttco e interpretação dos dados laboratoriais. Observar a hipoxemia presente. Há. portanto, possibilidade de associações que podem não levar à alteração do pH sanguíneo. se ocorrem no sentido da compensação. como alcalose respiratória e acidose metabóltca, observada no choque séptico. por exemplo. Essa situação leva a um estímulo respiratório central e alcalose respiratória primária e acidose metabólica conseqüente do quadro de choque. Nesse caso. pode ocorrer pouca vanação do pH do sangue, mas o bicarbonato e pC02 encontram-se baixos. Os outros testes laboratoriais indicarão a diminuição de base do organismo (HA, BE. HAU). auxiliando no diagnóstico final. São várias as associações de distúrbios mistos possíveis esquematizadas no Quadro 42.6. Quadro 42.6- Achados laboratonais do pH, bicarbonato e pC0 2 nos distúrbios mistos Distúrbios Alcolose metabólica e Alcolose respiratório Alcolose metabólico e Acidose resp1ra'óna Acidase metabólico e Alcolose respiratório Ae~dose metabólica e Acidose resp;ralório
[HCQ)J .!.
Parâmetros pC02 .!.
pH ii
ii
ii
N'
.!..!.
.!..!.
N*
.!..!.
ii
.L .L
·o contumo de outros dados: h1ato an1ônico. BE. h1ato amón,co unnáno. pH unná· no. po:áss o senco. aux1ham o d1agnóst1CO dm dlstúrb,os m1stos com pH normal
RESGATE DA IDÉIA CENTRAL DO CAPÍTULO A avaliação laboratorial dos distúrbios ácido-básicos medida pela gasomerria detecta as alterações ocorridas no tampão bicarbonaco. Encretamo, não devem ser in-
Mechanisms of disease. 5• ed. Philadelphia: W. B. Saunders Company; 1992. p. 233-45. 6. Hetz H, Prause G, Tesar H, List WF. Preclinical blood gas analysis.Technical descripnon, ínitial experiences indicarions. AnaesrhesisL 1996;45:750-4. 7. Hood VL. Tannen RL. Protection of acid-base balance by pH regu larion of acid production. N Engl J Med.
terpretados como dados isolados apenas desse tampão, mas com a compreensão de que eles refletem as altera-
1998;339:819-26. 8.
ções de um mecanismo complexo, dinâmico e incerativo regulador do pH
e eletrólicos sanguíneos. Participam
desse processo rodos os sistemas tampões do extracelu-
9.
lar e incracelular, os rins e os pulmões.
REFERÊNCIAS 1.
2.
3. 4. S.
Davenporr HW. ABC da química ácido-básica do sangue. s• ed. São Paulo: Arheneu; 1973. Dubose TO. Acidosis y alkalosis. ln: Harrison: Princípios de medicina interna. 14• ed. Madrid: McGraw-Hill-lnreramericana;1998. p.316-26. Edelman CM. Pediatric Kidney Disease. Boston: Lit tle. Brown and Company; 1992. Gluck SL. Acid-base. LanceL 1998;352: 474-9. Guyron A. Regulannon of acid-base balance; renal disease; micturition. ln: Guyton A. Human Physíology and
Investigação laboratorial dos distúrbios ácido-basicos
10.
11.
12. 13.
Rang LC Muray HE, Wells GA. MacGougan CK. Can peripheral venous blood gases replace arrerial blood gases in emergency departmenr patients? Can J Emerg Med. 2002;4{1):7-15. Ricos C Alvarez V, Cava F, Garcia-Lario JV. Hernandez A. )imenez CV, et ai. Currenr darabases on biologic variation: pras, cons and progress. Scand J Clin Lab lnvest. 1999; 59:491-500. Riella MC. Metabolismo ácido-básico. ln: Riella CM. Princípios de Nefrologia e Distúrbios Hidroelerroliricos. 3• ed. Rio de janeiro: Guanabara Koogan; 1996. p. 112-27. Schlichrig R, Grogono AW, Severinghaus )W. Human PaC02 and Standard Base Excess Compensation for AcidBase lmbalance. Criticai Care Medicine.1998;26:11 73-9. Shapiro BA. Peruzzi W T. Kozlowski-Templin R. Clinical Applicarion of Blood Gases. 5th ed. Chicago: Mosby; 1993. Srra nge G R. Ahrens WR. Lelyveld S. Schafermeyer RW. Pediarric Emergency Medic1ne. 2• ed. New York: Me Graw- Hill Professional; 2002. 410 p.
557
Fabiana Maria Kakehasi
43
Juliana Ribeiro Romeiro Maria Luiza Silva Silvana Maria Elói Santos
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM INFECÇÃO PELO HIV
A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)
é uma das doenças emergentes mais importantes
entre seus aminoácidos e os do HIV-1 e também leva
à
imunodeficiência, porém com evolução mais lema.
e devastadoras do mundo moderno e m uiro se tem es-
O envelope virai do HIV-1 é constituído por uma
tudado sobre sua epidemiologia, estrutura virai, meios
bicamada fosfolipídica proveniente da célula hospe-
diagnósticos e medidas profiláticas e terapêuticas.
deira da qual o vírus se originou e onde estão inseridas as glicoproteínas gp41 e gp120. A gp41 é uma proteína uansmembrana responsável pela fusão das membrana s
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
virai e celular, quando da infecção celular pelo vírus. A gp120, exposta à camada externa do envelope, liga-se ao
AGENTE ETIOLÓGICO
receptor CD4, uma glicoproreína existente na superfície de alguns linfócitos, macrófagos e outras células do sis-
Em 1983, o HIV-1 foi isolado de pacientes com
tema imunitário. como as células dendríticas. A ligação
(AIOS)
à molécula de CD4 induz mudança conformacional na
síndrome
da
imunodeficiência
adquirida
p elos pesquisadores Luc Momaigner, na França, e
gp120, possibilitando sua ligação com um segundo re-
Robert Gallo, nos EUA, recebendo os nomes de LAV
cepror na superfície celular (CCRS e/ou CXCR4), o que
(Lymphadenopathy Associated Virus ou vírus associado à linfadenopatia) e H TLV-111 (Human T-Lymphotrophic Virus
qüenciais fazem com que ocorram aproximação e fusão
ou vírus T-linfotrópico humano tipo III), respectivamente,
das membranas, permitindo que o material genérico vi-
nos dois países. É um reuovírus com genoma RNA de
rai seja introduzido na célula. Arualmente, está em uso
possibilita que a gp41 se una à célula. Esses eventos se-
fi ta dupla, da família Retroviridae (recrovírus) e subfamília
nova classe de droga anti-HIV, denominada inibidor de
Lentivirinae. Pertence ao grupo dos reuovírus ciropáticos
fusão, que consiste em peptídeos sintéticos (36 amino-
e não oncogênicos que necessitam, para multiplicar-
ácidos) que se ligam
se,
fusão das membranas.
da
enzima denominada
transcriptase
reversa,
à gp41, impedindo que ocorra a
responsável pela transcrição do RNA virai para uma
No interior do HIV. existe a matriz proréica, compos-
cópia DNA. que pode, então, integrar-se ao genoma
ta basicamente da proteína p17, e o capsídeo virai. com-
do hospedeiro. A infecção crônica ocasiona progressiva
posro da p24.
disfunção do sistema imune no hospedeiro. Existe ainda
A organização do genoma virai é complexa e está
o HIV-2, encontrado principalmente na costa lest e
didaticamente dividida em genes estrut urais (gag, pai e
africana, que apresenta cerca de 40 a 60% de homologia
env), genes regulatórios (tat e rev), genes acessórios (vif,
vpv, vpr
e nef), além das terminações repetitivas
longas
distintas o suficiente para caracterizarem diferences
Os genes estruturais da região gag codificam as pro-
e F2). No Brasil, o subtipo 8 é responsável pela ma ioria
(do inglês long terminal repeat - LTR) (Figura 43.1). teínas do cerne virai (p17
e p24); aqueles da
região env
codificam as glicoproreínas do envelope (gp41, gp120)
subtipos e são denom inadas subsubtipos (exemplo Fl das infecções pelo HIV-1, seguido pelo subtipo F e oueras formas recombinames.
e os da região pol codificam as enzimas nucleares res-
A infecção pelo HIV é caracrerizada pela alra repli-
ponsáveis pela replicação virai - uanscriptase reversa,
cação virai e pela incapacidade do sistema enzimático
protease e integrase. Os genes regulatórios porencia-
virai em corrigir completamente a seqüência de nu-
lizam a expressão dos genes virais, interagindo com o
cleotídeos durante a transcrição do DNA para RNA,
núcleo da célula infectada, facili tando o transporte do
de forma que o genoma virai uanscriro po de conter
RNA virai do núcleo para o ciroplasma e aumentando
diversos "erros" de t ra nscrição (subst itu ições de ba-
o nível de transcrição dos genes do HIV. Os genes aces-
ses, duplicações, inserções e recombinações). Admi-
sórios parecem atuar no poder de infecrividade virai
te-se que t ais erros possam ocorrer numa freqüência
(vif) e podem alterar o cicl o de replicação da célula
de 1/2.000 a 1/4.000 d urante a polimerização da fita
infectada (vpr). As LTRs desem penham importante
modelo de DNA que, in vivo, corresponderia a uma a
função na integração do genoma virai ao genoma da
10 mutações por genoma do HIV transcriro. Esse fato
célula hospedeira.
propicia que diferentes vírus com d iferences seqüên-
É sabido que isolados virais exibem grande diver-
cias de nucleotídeos infectem uma mesma célula,
sidade genética, que influenciam na sua transmi ssibi-
ocasionando. conseqüentemente, grande d iversidade
lidade, infectividade e im unogenicidade. O seqüen-
virai. A recomb inação genética pode gerar isolados
ciamento genético das principais proteína s virais,
virais com maior poder adaptativo, dependendo da
especialmente do envelope virai, permitiu classificar
mutação presente.
os subtipos virais e correlacioná-los em árvores filo-
O HIV é bastante lábil no meio externo, sendo ina-
genéticas. Assim, o HIV-1 é subdividido em linhagens
tivado por uma variedade de agentes físicos (calor) e químicos (hipocloriro de sódio, glutaraldeído). Em con -
M (main), principal subtipo na epidemia mundial, O
(outlier) e N (Non -M -Non-0). Linhagens distintas den-
dições experimemais controladas, as partículas virais in-
uo do grupo M foram identificadas de acordo com o
uacelulares parecem sobreviver no meio externo por até,
seqüenciamenro das regiões env e gag e designadas A
no máximo, um dia, enquanto que partículas virais livres
a D, F a H, J e K. Existem algumas linhagens virais que,
podem sobreviver por 15 dias, à temperawra ambiente,
apesar de diferentes entre si, não são geneticamente
ou até 11 dias. a 37°C.
LTR
Precursor gag
Precursor env
p53
'
Proteínas do cerne
gp160
gp 120
Enzimas virais
' 1
gp41 1
Proteínas do envelope
Figura 43.1 - Estrutura esquemática do genoma do HIV
560 ( Medicina laboratorial para o clínico
)1-- - - - -- - -- - - - -- - - -- - -- - - - - - - - -
EPIDEMIO LOGIA E FORMAS DE TRANSMISSÃO Apesar de ser mundialmenre distribuída, cerca de 90% das infecções pelo HIV acometem a popu lação de países em desenvolvimento, em particular a África subsaariana. Esta região abrigava 68% dos 33,2 milhões de indivíduos 1nfeccados pelo HIV de codo o mundo em 2007 e responde pela maioria dos óbicos atribuídos ao HIV desde o início da epidemia, com cenários de devastação de comunidades, diminuição da expectativa média de vida e da força econômica em muitas nações. Enrretanco, as taxas de prevalência variam entre os diferences países africanos, de 2% da população adulta em países do oeste africano chegando a aproximadamente 34% entre os da região sul. Na África subsaariana, o padrão de transmissão é predominantemente heterossexual, com alta proporção de mulheres infectadas e, conseqüentemenre, elevado número de menores de 13 anos infectados ou órfãos. Na América Latina, cerca de 1,6 milhão de indivíduos estavam infectados pelo HIV no final de 2007, de acordo com dados da UNAIDS. Em países do Caribe, onde o principal modo de tra nsmissão é o conraco heterossexual, grande parcela da popu lação se encontra em risco de infecção; essa região tem as mais altas taxas de incidência do vírus após a África subsaariana. A AIDS foi identificada pela primeira vez no Brasil em 1980 e até junho de 2007 aproximadamente 474.273 casos já haviam sido notificados. Os números de casos de AIDS em nosso país advêm das notificações recebidas pelo Sistema Nacional de Agravos Notificáveis (SINAN), que criou um banco de dados gerenciado pela Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS (CN-DST/AIDS) e pelo Centro Nacional de Epidemiologia (CENEPI) Na primeira metade da década de 80, a epidemia manteve-se restrita às regiões metropolitanas do país e associada a grupos com comportamentos de risco, homo/bissexuais masculinos e hemofílicos. A partir do final dos anos 80, observou-se expansão da epidemia entre a população brasileira. Apesar da distribuição heterogênea, concentrando-se em cidades da região Sul e Sudeste, nota-se a extensão da epidemia para as regiões Nordeste, Norte e Centro-Oeste do país. A subcategoria de exposição homo/bissexuais teve redução na participação na epidemia de infecção ao longo dos anos: de 71% dos casos notificados em 1984 a 16.5% em 2007. A transmissão em recepcores de hemoderivados. segmenro populacio-
Invest igação laboratorial do pacienre com infecção pelo HIV
nal intensamente atingido no início da epidemia, também apresentOu importante declínio, como conseqüência do conrrole de qualidade adorado pelos hemocentros a partir de 1985. Houve aumento expressivo da subcategoria de exposição heterossexual, contribuindo com 63,8% dos casos no ano de 2007. Com aumento de casos por via heterossexual, ocorreu progressiva redução na razão de sexo entre os casos notificados, 15 homens: 10 mulheres, em 2005, com relação de 1.5 homem para cada mulher. A maior participação das mulheres também é denotada pelo aumento percentual de notificações enviadas ao Boletim Epidemiológico; no período 1994-98 cresceu 71% contra 7,6% entre as enviadas de indivíduos do sexo masculino, um aumento de aproximadamente nove vezes. A conseqüência di reta da maior participação feminina é o progressivo aumenco da transmissão vertical. Quase a totalidade de casos da infecção em menores de 13 anos (81.1 %) se dá por via vertical; considerando que 8% dos casos têm categoria de transmissão ignorada, o número real de tra nsmissão via vertical deve ser ai nda mais alto. No mundo, as taxas de transmissão vertical diferem conforme a região geográfica considerada, variando de 15 a 25% na Europa e Estados Unidos e chegando a 25 a 40% na África subsaariana, na ausência de qualquer intervenção. Em 1994, estudo colaborativo (ACTG 076- AIDS Clinical Trial Group) demonstrou que a administração de zidovudina a gestantes infectadas e a seus filhos di minuía a taxa de transmissão em quase 67,5%. Tal estudo veio modificar as taxas de transmissão vertical em localidades onde é possível a administração profi lática de zidovudina. Entre os menores de 13 anos infectados via vertical, notou-se nítida diminuição da transmissão. Relatos das taxas de transmissão no Brasil ainda são escassos, enrretanro, estudo inicial de coorte de lactentes expostos em Belo Horizonre, conduzido entre 1994 e 1998, revelou taxa de transmissão de 18,1% (17/94, IC95%: 10,9-27,4). Pesquisa subseqüente evidenciou decréscimo paulatino nas taxas de transmissão ao longo dos anos: 20% em 1998, 14,1% em 1999, 8,6% em 2000, 9,4% em 2001, 5,9% em 2002, 3,2% em 2003, 2,1% em 2004 e 3,0% em 2005.
HISTÓRIA NATURAL DA DOENÇA Relata-se que história natural da infecção pelo HIV cursa, em média, entre oito e 12 anos desde o momen-
561
w da infecção até a evolução para o óbiro. Entretanto,
a duração do tempo de infecção tem sido prolongada com o uso da terapia anti-retroviral combinada . Inicialmente, após a transmissão virai, nota-se ampla disseminação virai, com acometimento predominante dos tecidos linfáticos. Os primeiros sinais e sintomas surgem em 50 a 70% dos indivíduos infecrados como uma síndmme virai inespecífica, cerca de duas a crês semanas após a infecção, caracterizada por febre, linfadenopatia. exantema. odinofagia, mialgia, diarréia, cefaléia, hepawesplenomegalia e. em alguns casos. sinais neurológicos. como meningite asséptica, neuropatia periférica, síndrome de Guillian-Barré. Devido à inespecificidade da síndrome retroviral aguda, a associação de tais sinais e sintomas não é habitualmente correlacionada à infecção pelo HIV Nesta fase notam-se alta viremia plasmática e queda abrupta na contagem de linfócitos T CD4+ Com o desenvolvimento da resposta imunológica específica ao HIV, há queda na viremia plasmática. aumento dos linfócitos T CD4+ e recuperação clínica em duas a quatro semanas. Inicia-se então um período assintomático que tem duração variável de indivíduo para indivíduo, mas a progressão para típica síndrome da imunodeficiência humana adquirida acontece, em média, em 10 anos. Apesar da latência clínica, a infecção pelo HIV nesse período caracteriza-se pela manutenção da replicação virai e declínio paulatino dos linfócitos T CD4+. Com a evolução da imunodepressão e com o aumento da viremia plasmática, o indivíduo infectado pode apresentar manifestações sistêmicas antes da apresentação da imunodeficiência com as infecções oportunistas. São descritas como manifestações sistêmicas: febre persistente; perda de peso progressivo; diarréia crónica; alterações dermatológicas. como modificação pigmentação ou infecções por fungos e bactérias. Notam-se. na história pregressa. relaros de episódios repetitivos de infecções bacterianas, virais ou parasitárias num curro período de tempo, assim como exacerbação de afecções dermatológicas prévias. como dermatite seborréica e psoríase, por exemplo. Com a persistência da infecção, os níveis de viremia plasmática aumentam progressivamence acompanhados de acometimento imunológico e do desenvolvimento de infecções oportunísticas, tumores, manifestações neurológicas ou síndrome da emaciação pelo HIV, a doença AIDS.
562 ( Medicina laboratorial para o clínico
TRANSM ISSÃO VERTICAL DO HIV O vírus pode ser transmitido por via vertical em três momentos: no período pré-parro (intra-útero) durante o decorrer da gestação; no período periparro durante o
trabalho de parm ou ao nascimento; ou no período pósparto através do aleitamento materno.
Transmissão intra-útero
A infecção incra-útero é definida quando o teste de PCR-DNA ou a cultura virai é positivo em amostra de sangue periférico colhido nas primeiras 48 horas após o nascimento. Cerca de 20 a 25% das infecções ocorrem durante o período intra-útero di retamente através da passagem uansplacentária do vírus para circulação feta l ou pela transmissão mediada por células mononucleares maternas infectadas pelo HIV Evidência da ocorrência da transmissão em período tão precoce quanto em rorno de oito semanas de gestação advém de estudos que detectaram antígenos virais p24 e genoma virai em tecidos fetais ou placencários. O acometimento fecal em fases embrionárias de desenvolvimento pode resultar em anormalidades congênitas ou aborro espontâneo. Outra evidência da transmissão intra-útero é a progressão clínica rápida da doença du rante o primeiro ano de vida, indicando que a infecção ocorreu precocemente, durante a gestação.
Transmissão periparto
Considera-se que a infecção tenha ocorrido no período periparto se o teste de PCR-DNA ou a cultura virai é negativo em amoscras de sangue obtidas durante a primeira semana de vida e tornam-se positivas entre o sétimo e o 90° dia de vida, na ausência de aleitamento materno. Estima-se que 60 a 75% das transmissões ocorram durante o trabalho de parto ou ao nascimento. Os mecanismos ainda não estão cotaimente esclarecidos. mas incluem ru pturas nas barreiras de proteção da pele da criança. com subseqüente exposição mucocutânea a sangue e secreções maternas contaminadas; ingestão de fluidos maternos contaminados; microcransfusões
transplacentárias durante o trabalho de parco e infecção ascendente. Durante a passagem pelo canal de parco. o recém-nasodo é exposco a sangue e secreções maternas contaminados, potencializando a uansmissão materno-fetal do HIV. Assim, a duração da exposição a fluidos maternos contaminados, quantificados pelo tempo de ruprura de membrana amniótica, parece ser importante facor de risco na transmissão vertical. Ouuas evidênoas da rransmissão periparco provêm de escudos que correlacionam mais ba1xas taxas de rransmissão emre mães submetidas a parco múrg1co elet1vo, auibuídas à menor probabilidade de m1crotransfusões de sangue contaminado dura me o uabalho de parco, ao faco de evitar contara do recém-nascido com secreções comam inadas na passagem pelo canal de parco.
Transmissão pós-parto
O aleitamento materno tem sido hiscoricamente recomendado pela capac1dade de transferência de imunidade passiva, pela redução da expos1ção a patógenos quando as condições de higiene são precárias, pelo fortalecimento da relação mãe-filho e, obviamente, pelo grande potencial nurritivo, espeoalmente em localidades em que as condições socioeconômicas são deficientes. A possibilidade da transmissão do HIV veio questionar a indicação irrestrita do aleitamento materno. Sabe-se que o vírus pode ser encontrado no leite materno associado ou não a células. O DNA pró-virai rem sido detectado em células do leite materno, numa prevalência de 44 a 58%. O Programa Global para AIOS da Organização Mundial de Saúde (UNAIDS) recomendava, entre 1987 e 1992, para reg1ões onde as doenças infecciosas e a desnutrição eram as principais causa de mortalidade infantil. que as mulheres devenam amamentar. independentemente dos status sorológico para o HIV-lA partir de 1996, a UNAIDS passou a recomendar a individualização da conduta a cada binómio mãe-filho após discussão dos riscos e benefícios com a mãe. A taxa de transmissão somente via aleitamento materno pode variar de 14 a 26%, dependendo da infecção materna: em vigência de infecção materna
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HIV
aguda, a nansmissão foi estimada em corno de 29%, caindo para 14% em mães com infecção estabelecida previamente à amamentação. Outros farores de risco não podem ser esquecidos, como o estado imunitário e clínico materno, a cepa virai, lesões periareolares e masrire; assim como farores relacionados ao concepco, como a premaruridade, baixo peso e lesões orais como candidíase oral.
EXAMES LABORATOR IAIS NA INFECÇÃO PELO HIV
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL GERAL Os exames laboracoriais de rotina recomendados são: • hemograma completo: para avaliação de anem1a, leucopenia, linfopenia e plaquecopenia; • testes bioquímicos: para melhor avaliação das condições clínicas gerais, em particular, funções hepática e renal, além de desidrogenase lática, amilase; • sorologia para sífi lis: em função do aumento da 1nodênc1a de co-1nfecção, visco que a 1nfecção pelo HIV pode acelerar a história narural da sífilis. Recomenda-se o VDRL e, se positivo, um teste treponêmico. Pacientes HIV+ com evidências sorológicas de sífilis não tratada devem ser submetidos à punção lombar e avaliação para eventual neurossífilis; • sorologia para hepatites virais: devido à alta incidência de co-infecção com hepatites Be C; • sorologia para toxoplasmose: para detecção de exposição prévia ao Toxoplasma gondii, que pode ser reativada se não for efetuada profilaxia, conforme o número de células T CD4+; • sorologia para citomegalovírus e herpes vírus: embora questionada, md1ca-se para detecção de infecção latente; • radiografia de tó rax: recomenda-se na avaliação inicial como parâmetro basal para possíveis alterações evolutivas no futuro ou em pacientes com história de doença pulmonar freq üente; • PPD (derivado protéico purificado): reste recomendado de rocina anual para avaliação da necessidade de quimioprofilaxia para tuberculose. Em paciente com infecção pelo HIV, cons1dera-se
563
enduração > 5 mm como reação forre e indicativa da necessidade de quimioprofilaxia; • papanicolaou: sua indicação é de fundamental importância, devido à alta incidência de displasia cervical e rápida progressão para o câncer cervical em jovens infectadas. É recomendado na avaliação g1necológ1ca imcial, seis meses após e, se resultados normais, uma vez a cada ano.
EXAMES LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV Diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV
Na grande maioria dos pacientes, o diagnóstico será feita sorologicamente pela confirmação da presença de anticorpos anti-HIV. Eventualmente, será utilizado o diagnóstico molecular, indicado principalmente em crianças menores de dois anos e na suspeita de doença retroviral aguda. As técnicas sorológicas apresentam excelentes resultados e são menos dispendiosas, sendo de escolha para o diagnóstico. Em adultos, anticorpos anti-HIV aparecem no sangue dos indivíduos infectados, em média, de crês a 12 semanas após a infecção e permanecem indefinidamente. Os ensaios de 4"- Geração - que detectam o antígeno p24 e anticorpos anti-HIV - podem reduzir em poucos dias o período de janela imunológica. No entanto, é importante observar que em caso de reatividade nesses testes, deve-se comprovar a presença de anticorpos, uma vez que o estabelecimento do diagnóstico da infecção pelo HIV baseia-se na soroconversão completa. Em filhos de mães infectadas, com até 24 meses de idade, o resultado dos testes sorológicos é de difícil interpretação, pois até essa idade é possível detectar anticorpos maternos. As recomendações vigentes do Ministério de Saúde classificam os testes sorológicos em testes de triagem e restes confirmatórios. Para triagem, são utilizados os testes imunoenzimáticos (ver capítulo 6), por serem sensíveis (sensibilidade > 99,5%), precisos e passíveis de aucomação. Os testes mais utilizados empregam antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos, com o intuito de minimizar ocorrência de reações cruzadas. Como testes confirmatórios, são empregadas a reação de imunofluorescência indireta, que utiliza como subsuaco células
564
Medicina laboratorial para o clín ico
K37-3 infectadas pelo HIV-1 e fixadas em lâminas, e a reação de western-blot (ou sua variação com antígenos recombinantes - imunob/ot - ver capítulo 6). Para o estabelecimento do diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV em indivíduos com idade acima
de dois anos, arualmeme, no Brasil, uriliza-se o algorirmo preconizado pelo Ministério de Saúde, conforme Portaria n° 59, de 28 de janeiro de 2003 (Figura 43.2). Resumidamente, é realizada triagem com um reste imunoenzimárico. Se negativo, a amostra é considerada "Amostra negativa para HIV". Se positivo, deverá ser realizada a etapa de confirmação. Pode-se optar em utilizar diretamente a reação de western-blor (WB). Se esta for positiva, a amostra é considerada "Amostra positiva para HIV" e deve-se colher segunda amostra para repetir o primeiro teste para descartar troca de amostras. Se o WB for negativo, deve-se considerar como "Amostra negativa para HIV". Se o WB for indeterminado, deve-se considerar como "Amostra indeterminada para HIV". Nos dois casos, deve-se pesquisar soroconversão incompleta (siwação mais freqüente), infecção pelo HIV-2 (em casos com evidência epidemiológica) ou reação falso-positiva. Nos casos com suspeita de soroconversão incompleta, recomenda-se coleta de uma segunda amostra após 30 dias. O resultado definitivo da infecção deve ser baseado na soroconversão completa. Para a interpretação do WB, diferentes critérios já foram recomendados, por diferences grupos. Atualmence, o Ministério de Saúde indica o critério recomendado pelo Center for Oisease Contrai and Prevention (CDC) Considera-se positivo, o teste que mostrar positividade para pelo menos duas das seguintes proteínas: gp120, gp41 e p24. É considerado negativo o teste que não apresenta nenhuma positividade. Os restes que não atendem aos critérios de positividade ou negatividade são considerados indeterm inados. A maioria dos casos de resultados indeterminados deve-se à presença de ancip24 isoladamente e, destes, a maioria resulta em resultados negativos ao seguimento. É descritO que 20% da populacao normal não infectada apresenta resultados indeterminados ao WB. Quando o WB não está disponível, pode-se alternativamente fazer a confirmação através da utilização de um segundo ensaio imunoenzimático (de outro fabricante) associado à reação de imunofluorescência di reta ou à reação de imunoblot. Quando as duas reações forem positivas, considera-se "Amostra positiva para HIV" e colhe-se segunda amostra para repetir o primeiro teste para descartar
troca de amoscras. Quando as duas reações forem negativas, considera-se "Amostra negativa para HIV". Quando as duas reações apresentarem resultados discordantes ou inconclusivos, deve-se encaminhar para realização de WB. Ressalta-se, nessa Portaria, que o diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV somente poderá ser confirmado após a análise de, no mínimo, duas amostras de sangue coletadas em momentos diferentes, preferencialmente em um intervalo de até 30 dias. As amosrras com resultado definido como positivo deverão ter o resultado da primeira amoscra liberado com a ressalva, por escrito, de que se trata de um resultado parcial e que somente será considerado como definitivo após a análise da segunda amoscra. Sempre que os resultados da segunda amostra forem diferences dos obtidos com a primeira amoscra, será preciso considerar a possibilidade de ter havido troca
[
N ão reagente
l J
[ TESTE IMUNOENZIMÁTICO 1
de amostras ou algum erro inerence aos proced imentos de realização dos testes. Reações sorológicas falso -positivas: já foram descritas mais de 70 causas de resultados falso-posi tivos para sorologia para HIV especialmente: infecções por ouuos vírus (incluindo a mononucleose infecciosa, hepatites, gripe), doenças auto-imunes, pacientes politransfundidos, multíparas, uso de drogas ilícitas, aquisição passiva de anticorpos anti-HIV (principalmente em crianças abaixo de 2 anos nascidas de mães infectadas), vacinações, encre oucros. Muitas vezes as reações falso-positivas não são esclarecidas. Em indivíduos com alto risco de exposição ao HIV, uma reação sorológica positiva apresenta valor preditivo positivo elevado, aproximando de 99%. Já em indivíduos com baixo risco de exposição, o valor preditivo positivo é bem inferior,
J
J Reagente ou inconclusivo L
J
[ TESTE IMUNOE NZIMÁTICO 2 e IFI ou IB Liberação do resultado definitivo como " Amostra negativa para anticorpos onti-HIV"
+ [ Testes não reagentes
J
l
j. [
" Amostra negativa poro anticorpos onti-HIV"
Testes d iscord antes ou inconclusivos
Resultado negativo para HIV-1
[
+ [ Testes reagentes
J
J
j.
" Amostro positivo poro anticorpos anti-HIV" COLETAR NOVA AMOSTRA E REPETIR ETAPA I
J
l
l
J
W ESTE RN-BLOT
Resultado indeterm inado para HIV-1
I
l Investigar soroconversão e ou pesquisar HIV-2. Repetir soro logio após 30 dias
J
l
l
+ Resultado positivo poro HIV-1
J
l
COLETAR NOVA AMOSTRA E REPETIR ETAPA I
Figura 43.2 - Fl uxograma proposro para diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV-1 em indivíduos com mais de 2 anos de idade - Portaria n59/GM/MS, de 28 de janeiro de 2003.
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HIV
565
Reações sorológicas falso-negativas: ocorrem na fase inicial da infecção quando a síntese de anticorpos ainda é baixa. Eventualmente podem ocorrer em fases muim tardias, quando a imunossupressão é imensa.
Testes rápidos para detecção de ant icorpos anti-HIV
São considerados testes rápidos, testes sorológicos cuja realização não necessita de estrutura laboratorial e que produzem resultados em, no máximo, 30 minums. Existem arualmence no mercado diversos testes rápidos disponíveis, produzidos por vários fabricantes e que utilizam diferences princípios técnicos. Geralmente, os testes rápidos apresentam metodologia simples, utilizando ancígenos virais fixados em suporte sólido (membranas de celulose ou nylon, látex, micropartículas ou carreias plásticas) e são acondicionados em embalagens individualizadas, permitindo a testagem individual das amostras. Apesar da simplicidade técnica, o teste rápido para detecção de anticorpos anci-HIV deve ser realizado somente por profissionais de saúde formalmente capacitados. Suas grandes indicações são o atendimento a parturientes com sorologia desconhecida e profissionais da área de saúde com exposição ocupacional ao HIV, que são si-
ruações de emergência nas quais se deve tomar decisão terapêutica imediata. Tendo em vista que não se trata de exame diagnóstico e que o resultado é considerado provisório, é imprescindível que a amostra reagente, ou o paciente, seja encaminhada o mais rápido possível, e em carácer prioritário, para realização de cesres confirmarórios. No caso de profissionais da área de saúde com exposição ocupacional ao HIV, o uso de restes rápidos no paciente fome do material biológico ao qual o profissional de saúde foi exposto se justifica pelo fato de se ter curto período de tem po para in iciar-se a terapêutica profilácica com anti-recroviral no acidentado. que reduz o risco de infecção em pelo menos 80%. Nesses casos, a terapia anci-retroviral deve ser iniciada preferencialmente entre uma e duas horas após a exposição de risco e mantida por um período de quatro semanas (Figura 43.3). Nos casos de parturientes com sorologia desconhecida, como se trata de uma situação de emergência com risco de morte para terceiros (no caso, o recém-nascido) e a eficácia da quimioprofilaxia é bastante elevada, recomenda-se a realização do teste rápido na gestante em trabalho de parto diante de seu consentimento verbal. As mulheres com resultado reagente ao reste rápido devem receber a quimioprofilaxia, ser aconselhadas a não amamentar e ser encaminhadas para confirmação sorológica.
[ Exposição ocupocional de risco para HIV
J
l Teste rápido aplicado no paciente-fonte mediante seu consentimento
I
l
+ Teste não reagente
+ 1. Não iniciar quimioprofilaxia ; 2 . Investigar as condições clínico-epidemio lógicas do paciente-fonte • encam inhand o-o para reavaliação da suo condição sorológica, se necessá rio.
+ Teste reagente
l
+ 1 . Iniciar quimioprofilaxia pa ra HIV no acidentado; 2 . Encami nhar o acidentado poro acompanha mento clínico-laboratoria l em serviço especializado; 3. Encaminhar a amostra de sangue ou o pac iente-fonte para defi nição do diagnóstico.
Figura 43.3 - Algoritmo das ações recomendadas para uso de teste rápido na exposição ocupacional de risco para proposto pelo Ministério de Saúde_
566 ( M edicina laboratorial para o clínico
HIV.
Recemememe, no Brasil. através da Portaria n° 34, de 28 de julho de 2005 da Secretaria de Vigilância em Saúde, foi recomendado o uso criterioso de restes rápidos em populações de difícil acesso às técnicas convencionais de ELISA e western blor, como estratégia de ampliação do acesso ao diagnóstico da infecção pelo HIV. Nesse caso, deverão ser realizados simultaneamente dois testes de fabricantes diferences, em amosrra de sangue rotai. soro ou plasma. Ambos os restes deverão apresentar elevada sens1b11idade. As amostras negativas nos dois restes rápidos terão seu resultado definido como "Amostra negativa para HIV". As amostras que apresentarem resu ltados positivos nos dois restes rápidos terão seu resultado definido como "Amostra positiva para HIV". Em caso de resultados discordantes nos dois primeiros ensaios, a amostra deverá ser submetida a um terceiro reste rápido. Quando o terceiro reste apresentar resultado positivo, a amostra será considerada "Amostra positiva para HIV". Quando o terceiro teste apresentar resultado negativo. a amostra será considerada "Amostra negativa para o HIV". Nesse caso. recomenda-se proceder à coleta de uma segunda amostra. 30 dias após a emissão do resul-
rado da primeira amoma e repetir rodo o conjunto de procedimentos seqüenciados (Figura 43.4). Princípios metodológicos dos testes ráptdos
Os restes rápidos mais empregados no Brasil, entre os quais se destaca o Teste Rápido HlV-1/2" - Bio-Manguinhos. de fabricação nacional. são imunocromamgráficos que empregam combinação de uma proteína conjugada com partículas de ouro coloidal e antígenos de HIV-1/2 ligados a uma membrana. A amostra é aplicada em local designado, seguida pela adição de um tampão de cornda, que propicia o fluxo dos componentes da amostra. Os anticorpos presentes no soro se ligam às proteínas específicas conjugadas a ouro coloidal. No caso da amostra ser positiva. o complexo "imunoconjugado" migra na membrana de nitrocelulose. sendo capturado pelos antígenos fixados na membrana. produzindo uma linha colorida. Na ausência de anticorpos para HIV-1/2. a linha colorida não é formada. Em mdos os casos. a amostra continua a migrar na membrana. produZindo uma linha colorida na área de controle. demonstrando o funcionamenco adequado do SIStema. (F1gura 43.5)
Col her novo omostro após 30 dias e repetir todo o algoritmo
Figura 43.4 - Procedimentos seqüenc1ados para d1agnósnco da infecção pelo HIV Utilizando-se restes ráp1dos em indivíduos com 1dade aCima de 18 (dezoito) meses. PORTARIA N°- 34 SVS/MS. DE 28 DE JULHO DE 2005.
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HIV
567
Suporte poro Fluxo Contínuo
Amostro Positivo
Amostro Negativo
Unho d!il f~e
C..rt·ole
linha de Controle
'·o
,,,
t t
Aus.&-cio de lima de leste
Linha de Controle
''"IJQrYi
!>
<> /lg HIV
>-
y.
Arno~rra d e K H.. • O!J"''O
\...011uq~KJc
t
)f l~'.
Figura 43.5- Apresentação esquemátiCa do resce de imunocromawgrafia "Tesce Rápido HIV-1/2 - B1o-Manguinhos".
Cuidados com a cole ta de amostra Em geral, os testes rápidos podem ser realizados com amosrras de soro, plasma ou sangue rotai. As amostras de sangue devem ser preferencialmeme utilizadas imediatameme após a coleca. Caso essas amoscras não sejam testadas imediacamence, estas devem ser refrigeradas logo após a coleta emre 2-8"(. podendo ser usadas em acé três dias. Não devem ser utilizadas amosrras de sangue com mais de crês dias de armazenagem. Para coleca de sangue total. devem-se usar tubos comendo EDTA. heparina ou mraro de sód1o. Para coleca de sangue da ponca do dedo, usar lanceta descarcável e desprezar a primeira gota. A segunda gota deve ser coletada com alça colerora descartável. Amoscras de soro ou plasma podem ser conservadas emre 2-8"C por crês d1as após a coleca. Caso a realização do teste não seja possível dencro desse período. as amosLras devem ser congeladas (-20°C).
Diagnóstico molecul ar da infecção pelo HI V
O d1agnósC1co molecular não é rocineiramence empregado, ficando suas indicações restritas a crianças menores
568 ( Medicina laboratorial para o clínico
de dois anos, na suspeita de doença retroviral aguda e em situações especiais de sorologia repetidamente inconclusiva. Na doença rerroviral aguda, corna-se positivo encre cinco e 60 dias após o concágio e. nas cnanças com menos de 24 meses, o exame deve ser fe1co após o pnmeiro mês de vida, a fi m de evitar resultados falso-positivos e resultados falso-negativos. Resultados falso-positivos podem ser devido à presença de células maternas infectadas na circulação fetal e resultados falso-negativos podem ocorrer nos casos de infecção perinacal. em que a viremia pode ainda estar abaixo do nível de detecção do reste. O cesce molecular diagnóscico, por excelência. é a pesquisa direta, qualitativa, de DNA pró-virai no genoma de células do sangue periférico do paciente, por meio de reação de polimerização em cadeta (PCR). a rede pública brasileira, encontram-se disponíveis apenas cesces de carga virai, em que são quancificadas as partículas virais circulances no plasma do paciente. O ensaio de carga virai não é recomendado para cnagem ou diagnóstico da infecção pelo HIV, exceto em crianças com idade de dois a 18 meses, nascidas de mães infectadas pelo HIV, conforme fluxograma para diagnóstico da infecção pelo HIV em crianças - Ministério da Saúde, que recomenda: "O Ministério da Saúde, através da Coordenação Naoonal em
DST e AIDS, preconiza o uso de restes de quantificação de RNA do HIV para estabelecer o diagnóstico da infecção em crianças com idade entre dois meses a dois anos de idade nascidas de mães infectadas pelo HIV. Define-se como infecrada aquela criança que possuir dois restes de carga virai detectáveis realizados em amostras coleradas em tempos diferentes, sendo a primeira amostra colecada após o segundo mês de vida e a segunda amosua com intervalo mínimo de dois meses. Caso a criança tenha stdo amamentada, novos restes devem ser realtzados após dois meses da suspensão do aleitamenw materno. Valores de carga virai abaixo de 10.000 cópias/mL devem ser cuidadosamente analisados devido ao risco de tratarse de resultado "falso-positivo". (Figura 43.6)
EXAMES LABORATORIAIS UTILIZADOS NO MONITORAMENTO DA INFECÇÃO PELO HIV
O curso da infecção causada pelo HIV varia consideravelmente. Muiws marcadores clínicos e laborawriais já foram empregados para estimar o prognóstico em pacientes infectados, como anergia cutânea, níveis sé ricos de ~2-m tcroglobul ina e neopteri na, antigenemia de p24 e a detecção de fenótipo virai indutor de sincício. Arualmente, a presença de sinais clínicos sugestivos de imunodeficiência, a contagem de células T CD4+ e a quantificação de carga virai são os principais parâmetros utilizados pela mataria dos especialistas para avaliação do prognóstico e planejamento de terapia anti-retroviral. (Figura 43.7)
AVALIAÇÃO DA COMPETÊNCIA IMUNOLÓG ICA ATRAVÉS DA CONTAGEM DE LI NFÓCITOS T CD4+ CI RCU LANTES NO SANGUE PERIFÉRICO
ser guiadas pela contagem de linfócitos T CD4+, juntamente com a carga virai e as condições clínicas do paciente.
Princípios metodológicos
Para determinar o número de células T CD4+, têm sido desenvolvidos métodos manuais e automatizados, utilizando-se ou não a citometria de fluxo. A citometria de fluxo (ver capítulos 4 e 6) é considerada o método padrão ouro para a contagem de células CD4+ devido à sua precisão e reprodutibilidade e é a metodologia utilizada na rede pública pela Rede Nacional de Laboratórios de Contagem de Linfócitos T CD4+ /CD8+ do Programa Nacional de DST/AIDS-MS no Brasil. Resumidamente, leucócitos do sangue periférico são incubados com anticorpos monoclonais anti CD4, CD8 e CD3 marcados com diferentes fluorocromos. Posteriormente, a suspensão celular é analisada em citômeuo de fluxo, que é capaz de identificar as diferentes populações linfocitárias de acordo com a fluorescéncia emitida pelos diferences fluorocromos após excitação com luz laser. (Figura 43.8)
Cuidados na obtenção das amost ras
O anticoagulante de escolha é o etilenodiamino tetracético (EDTA). As amostras deverão ser mantidas e transportadas à temperatura ambiente (15° a 25°C) e deverão ser idealmente processadas dentro de 24 horas. Temperaturas acima de 37°C podem causar destruição celular. Amostras refrigeradas, congeladas, hemolisadas ou apresentando coágulos devem ser rejeitadas.
Variações biológicas
Como a patogénese da infecção pelo HIV está diretamente associada à diminuição do número de células T CD4+, a depleção progressiva dessas células associa-se à maior gravtdade da doença e a prognóstiCO desfavorável. A quantificação de células T CD4+ circulantes no sangue periférico também tem sido usada para estabelecer pomos de decisões para iniciar profilaxia para infecções oportunistas, além de orientar a categorização das condições clínicas relacionadas ao HIV, especialmente a definição de AIDS. Deosões relattvas ao início ou troca de terapia anri-retroviral devem
Investigação laboratorial do pacienre com infecção pelo HIV
Fatores biológicos relativos à distribuição de leucócicos, tais como horário da coleta (contagens mais baixas no início da manhã), etnia e exercício físico, além de idade, uso de medicamentos e presença de infecção, são descritos como interferentes no número absoluto de linfócitos T CD4+. A contagem de células T CD4+, mesmo sendo considerada marcador clássico de progressão, apresenta grande variabilidade intra e interindividual, principalmente quando os valores estão acima de 200 células/mm 3, di fi-
569
culcando sua valorização em fases mais precoces da Infecção. Assim, recomenda-se que esse exame seja realizado, preferencialmente, pelo mesmo laboratório e no mesmo período do dia, para minimizar essa variabilidade.
Valores de referência
A liceracura científica descreve valores de linfócitos T CD4 + de 500-1.300 células/f.ll. em valores absol uros, e 38-65%, em valores percentuais, como valores esperados na população adulta. Os valores são considerados alterados quando as contagens seriadas estão abaixo de SOO células/1-JL (ou <24-28%). Pacientes com contagens abaixo de 200 células/1-JL (ou <14-16%) apresentam risco bastante aumentado para processos oportunistas, como a pneumocistose e a roxo plasrnose. Já pacientes com contagens abaixo de 50-100 células/1-J L(ou <5-10%) apresentam quadro de imunodeficiência mais grave e risco bastante elevado para infecções disseminadas, corno as doenças por momegalovírus e micobactérias atípicas.
Indicações para co ntagem de células T CD4+
A contagem de células CD4+ não deve ser usada para diagnóstico da infecção pelo HIV. Nos indivíduos infectados exame é recomendado a cada seis meses para paoentes assinromácicos e a cada crês meses após o aparecimenro dos smromas. Testes ma1s freqüentes são JUStificados quando o cracamento for modificado. Quando a contagem de CD4' é utilizada para mon1roramenro da resposta terapêutica, a resposta adequada é definida como aumenro na contagem de células, em média. de 100-150 células/ 1-JL por ano, com resposta mais rápida nos crês primeiros meses. em sua ma1ona, devido ao processo de redistribuição. Subseqüentemente. aumentos indicando bom controle wológ1co são, em média, de 100 células/f.ll /por ano, durante alguns anos, até alcançar patamar estável.
Significado clínico
De maneira didática, pode-se dividir a contagem de células T CDti+ em sangue periférico em adultas em quatro faixas:
570 [ Medicina laboracorial para o clínico
• maior que SOO células/f.JL: escágio da infecção pelo HIV, com baixo risco de doença. Há boa resposta às imunizações de rotina e boa confiabilidade nos restes cutâneos de hipersensibilidade cardia. corno o PPD. Casos de infecção aguda podem apresemar esses níveis de células T CD4+, embora, de modo geral, esses pacientes renham níveis mais baixos; • entre 200 e SOO células/f.ll: estágio caracterizado por surgimento de sinais e sintomas menores ou alterações constituoonais, com risco moderado de desenvolvimento de doenças oportunistas. Nesta fase, podem aparecer candidíase oral, herpes simples recorrente, herpes zoscer, tuberculose, leucoplasia pilosa. pneumonia bacteriana; • entre 50 e 200 células/1-JL: estágio com alta probabilidade de surgimento de doenças oportunistas, como pneumocisrose, roxoplasmose de SNC. neurocriprococose. h1stoplasrnose, momegalovirose localizada. Está associado à síndrome consurnptiva, leucoencefalopacia rnulcifocal progressiva, candidíase esofagiana, ecc; • menor que 50 células/f.ll: estágio com grave comprometimento de resposta imun itária. Alto risco de surgimento de doenças oportuniStas, como citomegalovirose disseminada, sarcoma de Kaposi, !infama não Hodgkin e infecção por mlcobactérias atípicas. Alto risco de baixa sobrev1da.
Pa rticularidades da população pediátr ica
Os parârnecros imunológicos nas crianças seguem curso diferente do indivíduo adulco. Nas infectadas. a queda nos valores de CD4+ está acentuada nos primeiros quatro meses de vida, com diminuição mais lenta posteriormente. Para infecção pediátrica pelo HIV, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) considera que a competência imune esteja relativamente preservada quando a contagem de linfócicos T CD4+ é maior que 1.500 célulaS/J..!l no primeiro ano de vida, maior que 7SOcélulas/f.ll para o segundo ano de vida e maior que SOO células/f.ll nos anos subseqüentes. Níveis menores que 750, SOO e 200 células/ 1-JL para os respectivos grupos de idade revelam depressão imune grave.
Criança com idade de 2 a 24 meses ( 1o este)
Repetir o teste imed iatamente com nova amostra (2• teste)
Repetir o teste imediatamente com nova amostra (3• teste)
Criança provavelmente não infectada
C riança provavelmente não infectada
Figura 43.6 - Fluxograma para utilização de testes de quamificaçào de RNA virai visando a detecção da in fecção pelo HIV em crian ças com idade enne 2 meses e 2 anos, nascidas de mães infectadas pelo HIV. Portaria no. 488/98/ SVS/MS de janeiro de 2000.
É descrito que a contagem absoluta de linfócitos T CD4+ varia muito nas diferences faixas etárias, o que não é observado com os valores percentuais. Portanto, variações na contagem percentual de linfócitos T CD4+ são parâmetros mais estáveis que variações na contagem absoluta para avaliar a progressão da doença em crianças.
o período assintomático. Os valores de set poínts dependem das velocidades de replicação e de clareamento virai e fornecem informação prognóstica, que é independente da contagem de linfócitos CD4+ (Figura 43.9).
Princípios metodológicos
AVALIAÇÃO DA CARGA VIRAL
A quantificação de partículas virais plasmáticas (carga virai) avalia a imensidade da infecção. É considerada o marcador laboratorial mais adequado para o monitoramento da resposta terapêutica aos ami-retrovirais, para a predição da progressão da doença e para predição do prognóstico de indivíduos infectados. A viremia apresenta-se elevada logo após a infecção pelo HIV Após algumas semanas, diminui e rende a alcançar níveis bastante estáveis (chamados set points) durante
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HIV
Vários métodos têm sido desenvolvidos para quantificar a viremia nos fluidos corporais. Atualmente, existem três métodos disponíveis comercialmente, que se baseiam na amplificação direta ou indireta dos ácidos nucléicos: • reação de polimerização em cadeia após transcrição reversa (RT-PCR), cuja técnica consiste basicamente na amplificação de cDNA transcrito pela transcriptase reversa a partir do RNA virai plasmático. É capaz de detectar RNA virai numa concentração de 50 a 750.000 cópias/ml;
571
Síndrome retrovirol agudo
AIDS Lotêncio clínico
..
"
o u
Anticorpos onti-HIV
"' P. u
()
.:2c
o
Q)
-o
a
E Q)
C])
P. c
o
u
~~~~-----------------A_n_o_s________________
se_ m _ o_ n_o_s__
L -____
_J
Figura 43.7 - Cinética da contagem de linfómos T CD4 +, do nível sérico de anticorpos anti-HIV e da carga wal no decorrer da infecção pelo HIV-1.
2 ô
(")
o u --.....
<"
o
N
_,J
u...
•
3
õ
g, -1 oo
•
10 1
102
4
103
104
FL l /CD4 Figura 43.8 - Desenho ilusrrarivo da apresentação dos gráficos derivados do citôm erro de fluxo. No e1xo da absmsa. está mostrada a fluorescênoa Fll que. no exemplo. está relacionada com o anticorpo monoc\onal antiCD4. No e1xo da ordenada. está mostrada a fluorescência FL2, no caso, relacionada ao anticorpo monoclonal antiCD3. A ssim, no quadrante 1, estão os linfócitos q ue expressam apenas CD3. No quadrante 2. estão os linfómos q ue expressam conJuntamente CD3 e CD4 (que são os linfócitos T auxiliadores). No quad rante 3, estão os linfócitos que não expressam CD3 nem CD4. No quadrante 4, os linfócitos que expressam apenas CD4.
572 ( Medicina laboratorial para o clín ico
]f------------------------------------------------------------------
Carga virai plasmática e progressão para AIOS
106
l
105
--------------------
,.._
,,\ '\--- -- ---------- ---------------- -- ----- ----------------- ----------
Q
>o
104
.\
~
o
u
' ---------------- -----
62% 49% (')
o
26%
\
103
3
)>
ã:. vo o
\
"''o-
\
vo
Ln
80lo•
o
2
o :::> ovo
5
Anos após Infecção
Figura 43.9 - Gráfico mosrrando diferenres curvas de decaimenro da carga virai após síndrome retroviral aguda. Quanw menor a carga v1ral. menor a mortalidade após 5 anos. Adaptado de Mellors et a/. Ann lnr Med 1994. • amplificação baseada na seqüência de ácidos nucléicos (Nucleic acid sequence based amplification -NASBA): baseia-se na at1v1dade simulcânea de uês enzimas, uanscnprase reversa, RNAse H e T7-RNA polimerase, e leva à amplificação da região do gene gag do HIV-1 no próprio RNA virai alvo. Écapaz de detectar a carga wal na faixa de 40 a 10.000.000 cópias; • branched DNA (bDNA): é um ensaio de hibridação em fase sólida tipo sanduíche, de ácidos nucléicos usando 11oléculas de DNA ramificadas (bDNA) marcadas com fosfatase alcalina. A detecção e quantificação do RNA virai são determinadas por quimioluminescência. A faixa de detecção é de 50 a 500.000 cópias/ml. Os três ensaios apresentam correlação superior a 90% e boa reprodutibilidade. Da mesma forma que na contagem de células T CD4 ', a avaliação da carga virai deve ser realizada em períodos de estabilidade clínica, não devendo ser realizada até passadas pelo menos quatro semanas da ocorrência de infecção oportunista ou vacinação.
Cuidados com a amostra
Em codos três ensaios, recomenda-se que o plasma (em EDTA) seja colhido após jejum de oiro horas e seja
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HIV
separado em até quatro horas após a colheita do material, devendo, nesse período. ser mantido à temperatura ambiente (18°( até 25°C). Enrretanro, existe alguma evidência de que o RNA HIV possa ser estável até 30 horas em materiais não separados.
Indicações e interpretação
No monitoramenro da resposta terapêutica aos antiretrovirais. o reste deve ser realizado ames e duas a oito semanas após início da terapia anri-retroviral. Essa segunda determ inação permite ao clínico avaliar a efetividade da terapia inicial, já que a maioria de pacientes apresenta diminuição da carga virai em duas a oito semanas, até atingir níveis inderectáveis em 16 a 24 semanas. Em pacientes em tratamento anci-retroviral estável. o reste deverá ser repetido a cada três a quatro meses. São consideradas alterações significativas: reduções. aumentos ou oscilações entre do1s resultados de exame de carga wal maiores do que 0.5 log (ou crês vezes em relação ao valor anterior), uma vez que variações de até 0,3 log têm sido observadas em cargas wais de paCientes estáveis. Para a predição da progressão da doença e para predição do prognóstico de indivíduos Infectados, de acordo com o CDC a determinação da carga virai deverá ser realizada no momenro do diagnóstico e a cada 3-4 me-
573
ses em pacientes não tratados. Esses intervalos entre os testes são somente recomendações, sendo flexíveis de acordo com as circurstâncias de cada paciente. Na predição de evolução, os resultados de carga virai devem ser Interpretados da seguinte maneira: • carga virai abaixo de 10.000 cópias de RNA por mililitro: baixo nsco de progressão ou de piora da doença; • carga virai entre 10.000 e 100.000 cópias de RNA por mililitro: risco moderado de progressão ou de piora da doença; • carga virai acima de 100.000 cópias de RNA por mililitro: alto risco de progressão ou de piora da doença.
Particularidad es na população pediátrica
A dinâmica da virem ia na infecção vertical pelo HIV é diferente da observada no adulto, haja vista que a criança apresenta viremia primária no início da vida, quando seu sistema imu ne está ainda relativamente imaturo. Desse modo, a carga virai está muito elevada, ou seja, maior de 106 cópias/ml, com taxas de declínio mais lemas que as apresentadas em adultos, sendo difícil definir limites precisos para a progressão da doença. Observa-se ainda que a carga virai pode declinar lentamente ao longo do tempo, mesmo sem terapêutica anti-retroviral. Esse declínio é mais rápido durante os primeiros 12 a 24 meses de vida, com redução média de 0,6 log por ano e ma1s lentamente até quatro a cinco anos de idade, em média 0,3 log por ano. Apesar de parecer lógico inferir que quanto maior a carga virai maior o risco de progressão, existe considerável superposição de valores entre as crianças que progridem rapidamente, lentamente e as não progressoras. A análise dos dados disponíveis até o momento revela que a definição de prognóstico não deve ser pautada somente na carga wal. mas principalmente na contagem de células T CD4+ e na evolução clínica de cada paciente, espeoalmente nas crianças menores de 30 meses de idade. Nas crianças com idade superior a 30 meses, os dados de literatura ind1cam que níveis de virem ia plasmática superior a 100.000 cópias/ml e contagem de CD4"'" inferior a 15% são preditores independentes de risco aumentado de progressão clínica ou morte.
574 [ Medicina laborat orial para o clínico
TESTE DE GENOTIPAGEM PARA ESClARECIMENTO DE RESISTÊNCIA AOS AGENTES ANTI ~ RETROVIRAIS
Mutações no genoma do HIVque conferem resistência aos agentes ami-retrovirais têm s1do relatadas e são consideradas causas 1m portantes de fal ha tera pêutica de origem virai. Infel izmente, a resistência do HIV às drogas anti-retrovirais está crescendo em rodo o mundo. Em 1998, a resistência primária nos Estados Un idos era de 3.5%; em 2000, 14%. No Brasil, subiu de 3.5% em 1997 para 7% em 2000. Testes laboratoriais podem ser utilizados para detectar e localizar ta1s mutações. Esses exames são feitos a partir da amplificação, por PCR, de regiões específicas do genoma virai e posterior seqüenciamento em equipamentos automatizados. A seqüência de nucleotídeos obtida é comparada com seqüências padrão de vírus selvagem para evidenciar eventuais mutações. Dependendo da localização da mutação (genes da transcriptase reversa, protease), torna-se possível uma reorientação do tratamento e seleção de terapia de resgate. Diversos estudos prospectivos, entre os quais se destaca o Viradapt, conduzidos em pacientes com resistência aos anti-retrovirais, evidenciaram que o emprego da genmipagem auxiliava Significativamente o resgate terapêutico. O teste de genmipagem não é indicado para def1n1ção do primeiro esquema de tratamento. Deve ser empregado apenas em pacientes já em uso correto de terapia anti-retroviral, que estejam apresentando falha virológica, devendo-se afastar outras causas de falha terapêutica, especialmente a baixa adesão ao tratamento. Por serem testes de metodologia e interpretação complexas, exigem capamação espeoalizada de todos os envolvidos: médico solicitante, técnico executor, médico interpretador. No Brasil. a partir de 2001, o Programa Nacional de DST e AIDS implantou uma rede nacional de laboratórios (Rede Nacional de Genmipagem - RENAGENO) para executar o exame de genotipagem na rede pública.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O surgimento e a disseminação da infecção pelo HIV trouxeram importantes mudanças em d1versos campos,
] 1 - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -
inclusive nas condutas adoradas na execução de procedi-
O acompanhamento continuado das recomenda-
mentos laboraroriais. Foi a partir de emão que a utilização de equipamentos de proreção individual e ourras medi-
ções vigentes é essencial para atuação profissional responsável e eficiente.
das relacionadas à biossegurança em laboratórios clínicos emergiram e se firmaram definitivamente. Ainda, diame
Finalmente, não se deve esquecer da declaração política da UNAIDS/OMS sobre o exame de HIV, que define
da responsabilidade em se firma r um novo diagnóstico,
que as condições sob as quais pessoas se submecem a
diversos prorocolos foram elaborados, por diferences
testes de HIV devem prezar por respeito aos princípios
agências, de forma a minimizar evemuais equívocos.
éticos. De acordo com esses princípios, a conduta dos testes de HIV nos indivíduos deve ser voluntária, confidencial, acompanhada por um conselheiro e conduzida com o consentimento informado.
O Brasil, a partir da criação do Programa Nacional de DST e AIOS, em 1985, tem atuado de maneira eficiente, com diferences projeros, nas diferences áreas. Em relação às ações de promoção de saúde, são de nosso especial interesse as medidas romadas no semido de padronizar, legislar e oriemar a abordagem laborarorial de paciemes portadores da infecção pelo HIV. No momemo. encontram-se em vigência alguns documentos que merecem destaque e que já foram citadas neste capítulo: • portaria no 59, de 28 de janeiro de 2003. Algoritmo do diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV e Programa de Controle da Qualidade Analítica do Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo HIV; • definição Nacional de Caso de Aids em Indivíduos Menores de 13 anos- Brasil. março de 2000- Anexo II I - Fluxograma para utilização de testes de quantificação de RNA visando a detecção da infecção pelo HIV em crianças com idade entre dois mesese dois anos, nascidas de mães infectadas pelo HIV; • portaria no 34, de 28 de julho de 2005. Regulamenta o uso de testes rápidos para diagnóstico da infecção pelo HIV em situações especiais; • nota Técnica N° 23/2006. Novas defin ições do Comitê Assessor de Genotipagem.
Investigação laborator ia l do paciente co m infecção pelo H IV
REFERÊNCIAS Brasil. M inistério da Saúde. Secrelaria de Vigilância em Saúde. Programa Nacional de DST e AIDS [home page da Internet]. Disponível em: hnp://www.aids.gov.br. 2. Cenrers for Di sease Control and Precemion. 1993 Revised Classi fication System for HIV lnfection and Expanded Surveillance Case Deflnirion for AIDS Among Adolescems and Adulrs. MMWR Recomm Rep. 1992;4l (RR17):1-19. 3. The lnternational Perinatal HIV Group. The mode of delivery and the risk of vertical transmission of human immunodeficiency wus type 1--a meta-analysis of 15 prospecrive cohort srudies. The lnternarional Perinaral HIV Group. N Engl l Med. 1999;340(13):977-87. 4. The Worki ng Group on Mmher-ro-Child Transmission of HIV. Rates of mother-ro-child rransm1ssion of HIV-1 in Africa. America. and Europe: results from 13 pen naral srudies. J Acquir lmmune Defic Syndr H um Retrovirol. 1995;8(5):506-10. 5. UNAIDS. jo1nt United Nations Programme on HIV/AIDS [home page da Internet]. Disponível em: http://www. unaids.org
1.
575
44
Marina L. Martins, Edel F. Barbosa Stancioli, Gustavo E. Brito Melo, jordana G. Alves Coelho dos Reis, O/indo A. Martins Filho, Grupo Interdisciplinar de Pesquisa em HTLV (GIPH)
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DA INFECÇÃO PELO HTLV
O HTLV- vírus linfocrópico T humano - é um
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
recrovírus que infecta cerca de 20 milhões de pessoas em wdo o mundo. Embora renha sido o pri-
AGENTE ETIOLÓGICO
meiro recrovírus humano descoberw, muiws aspe((OS sobre epidemiologia, manifestações clínicas
O HTLV é um retrovírus da família
Retrovmdae. gênero
e mecanismos de pawgênese são ainda desconhe-
Deltaretrovirus. com rropismo para linfóciros T e está divi-
cidos. dificultando. conseqüentemente. o desen-
dido em dois tipos: HTLV-1 e HTLV-2. O HTLV-1 foi descrito
volvimento de abordagens terapêuticas mais espe-
em 1980 como o primeiro rerrovírus humano, o qual foi
cíficas e eficazes. Além disso. o desconhecimento
isolado de um paciente com linfoma cutâneo de células T.
sobre o vírus encre muiws profissionais de saúde
OUEro ripo, conhecido como HTLV-2, foi descrito do1s anos
no país dificulta o correw diagnóstico do porra-
mais tarde. isolado de uma linhagem de células T estabe-
dor e o seu acompanhamento, se assintomárico e
lecida de um paciente com rricoleucemia. mostrando ser
especialmente se sintomático, bem como a d iv ul-
relacionado ao HTLV ripo 1, mas distinto dele. Em 2005, fo-
gação de medidas preventivas para a cransm issão
ram descriros dois outros tipos. HTLV-3 e 4, em uma zona
virai. A grande maioria dos portadores do HTLV
rural ao sul de Camarões. Os indivíduos infectados eram
(95%) permanece assintomácica. enquanto cerca
caçadores que foram expostos à mordida ou arranhões de
de 1-5% dos indivíduos infectados desenvo lve dife-
macacos. Evidenciou-se a preocupação arual do aumento
rences doenças. entre elas leucemia/linfoma de cé-
de rerrovírus cruzando a barreira entre espécies.
lulas T do adulw (ATLL) e m ieloparia associada ao
O HTLV possui estrutura morfológica similar
à de
HTLV/paraparesia espásrica t ro p ical (H AM/TSP).
outros rerrovírus, sendo uma partícula de 110 a 140nm
No Brasil. assim como na maioria dos demais pa-
de diâmetro e seu envelope lipoproréico apresenta as
íses, ainda não há política de saúde pública efetiva
proteínas tran smem brana (como a gp21) e de superfí-
para controle da disseminação do vírus HTLV-1 e 2.
cie (como a gp46). importantes no diagnóstico da infec-
com a dispon ibilização dos restes diagnósticos para
ção. O capsídeo constitui o cerne da partícula v1ral. que
possíveis portadores e seus fami liares, a 1ncrodução
abriga no seu intenor o genoma virai. representado por
d esses restes no pré-natal e a criação de centros de
duas cópias de RNA de fira simples. No inrerior desse
referência para aconselhamento e tratamento dos
capsíd1o encontram-se também proteínas virais como
indivíduos infectados.
a rranscriprase reversa. prorease e a integrase. essenciais
no processo de transcrição do RNA virai em ONA complementar e na integração do ONA provira! no genoma da célula hospedeira. O genoma do HTLV é caracterizado pelas regiões gag, pol e env, flanqueado por duas terminações longas repecidas (LTRs) localizadas nos finais 5' e 3' do genoma v1ral, que comêm promowres virais e ouuos elemenws regulatórios. assim como outros reuovírus. No emanw, possui uma oucra região, chamada pX, responsável pela codificação de prmeínas regulatórias virais, relacionadas à pawgenicidade, como Tax e Rex. O produro do gene tax é essencial para a replicação virai e pode regular também a expressão de vários genes celulares, estando envolvida na imortalização e transformação das células T infectadas. e portamo. na pawgênese da leucemia/hnfoma (ATLL). Por ser a prmeína virai mais 1munogênica, Tax também está envolvida na pawgênese da HAM/TSP. O HTLV-1 estabelece uma infecção lema. geralmente com grande período emre a infecção e o início dos pnmeiros s1nmmas das doenças associadas ao vírus. Apresema tropismo por células T do tipo C04 e C08, podendo infectar ouuos tipos celulares, como células do sistema nervoso, células apresentadoras de amígenos, macrófagos e células-tronco hemamlógicas. O HTLV apresenta ciclo de replicação típico dos reuovírus, caractenzado pelas segutntes fases: • ligação do vírus ao receptor de superfície na membrana celular, com penetração do capsídto virai no interior da célula; • uanscnção, denuo do capsídto, do genoma virai de RNA para DNA. pela enzima rranscriprase reversa; • entrada do ONA virai no núcleo da célula e sua integração no DNA da célula hospedeira, formando o provírus; • síntese do RNA virai pela maquinaria celular, tendo como molde o ONA provira!; • processamento dos transcrims para formação dos mRNAs e do genoma virai; • síntese das prmeínas virais. montagem e brotamento dos vínons; • processamento proteolítico das prmeínas do capsídio, obtendo-se finalmente a partícula wal madura. que está pronta para infectar novas células. Acredita-se que durante a 1nfecção primána o vírus renha um período de replicação ativa através da rranscnptase
578
Medici na laboratoria l para o clínico
reversa, mas que a proliferação subseqüenre ocorra principalmente via expansão clonai das células mfectadas. Conseqüentemente, o HTLV exibe baixos níveis de variação genética Intra-individual. diferentemente de outros retrovírus.
EPIDEMIOLOGIA E FORMAS DE TRANSMISSÃO A infecção pelo HTLV-1 apresenta distri buição mundial, com aproximadamente 10 a 20 milhões de pessoas tnfectadas em codo o mundo. A infecção caracteriza-se por agrupamentos em áreas geográficas situadas em várias regiões do mundo, vanação espacial de taxas de soroprevalência, elevação da prevalência com a 1dade e taxas mais altas de prevalênoa na mulher. Entre esses "grupamentos geográficos", podem-se citar regiões do Japão, América, Ásia e África. Áreas endémicas caracterizam-se por soroprevalênoa variando entre 0.5 e 20 % na população geral. dependendo da idade e sexo. Como regiões endémicas do HTLV-1 encontram-se ilhas do sudeste do Japão com algumas áreas com até 37% da população seropositivo; 1lhas do Caribe com 3,9% de prevalência em negros de Trinidad-Tobago; 4,25% em Barbados e 5 a 6% na Jamaica, regiões africanas (área do sub-Saara), Melanésia, região sudeste dos Estados Unidos e regiões da América Central e do Sul. Poucos são os estudos sobre a prevalência do HTLV no Brasil, mas estes moscram que o HTLV-1 e 2 estão presentes por w do o país. A maioria dos dados é proveniente de pesquisas desenvolvtdas junto aos doadores de sangue em Hemocentros. Portanto, acredtta-se que as taxas possam não representar a nossa realidade, estando subestimadas. O Brasil pode ser considerado um país endémico para o vírus HTLV e estimativas indicam que possui o maior número absoluro de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e 2 no mundo. Um estudo conduzido em bancos de sangue da rede pública de saúde em 26 capitais dos estados e no Distrito Federal, durante o período de Janeiro de 1995 a dezembro de 2000. constawu heterogeneidade geográfica entre as taxas de prevalências médias, apontando Florianópolis como o local de menor soroprevalência (0,04%) e São Luís com a maior (1%). segu1da de Salvador (0,9%). Belo Horizonte apresentou soroprevalência de 0,07% (Figura 44.1). É importante salientar que esses da-
dos represemam soropositividade no teste de ELISA, que é um reste de triagem altamente sensível, podendo estar superestimados. Sugerem-se três possibilidades para a variabilidade geográfica no Brasil da taxa de soroprevalência do HTLV emre doadores de sangue: a migração da população da Ásia até a América do Norte, alcançando o Norte e o Nordeste do Brasil, o tráfico de escravos africanos, principalmence ro Nordeste e Sudeste do Brasil, e a incensa imigração de japoneses, principalmeme no estado de São Paulo e no Sudeste.
O CJ
3.4/1000 a 6.6/1000
•
6.7/1000 a 10.0/1000
0.0/ 1000 a 3.3/1000
Figura 44.1 - Soroprevalência do HTLV-1 no Brasil. Fome: Caralan-Soares et ai. Cad. Saúde Publica v. 21n. 31.2005.
O Grupo Interdisciplinar de Pesquisa em HTLV (GI PH) avalia em Belo Horizonce desde 1997 uma coorte aberra de candidatOs à doação de sangue soropositivo para HTLV-1 e 2 da Fundação HEMOMINAS e paciences com HAM/TSP (HTLV-1 associated myelopathy I Tropical spastic paraparesis) da Rede Sarah de Hospitais do Aparelho Locomotor - Unidade Belo Horizome. Foram descritas características da infecção pelo HTLV-1 e 2, tais como: tendência à agregação familiar da infecção, aumemo da prevalência com a idade e maior soroprevalência no sexo feminino, como observado em outras populações do mundo.
Investigação laboratorial da infecção pelo HTLV
Em outros grupos populacionais, que não doadores de sangue, a prevalência para o HTLV-1 pode ser ainda maior, como observado em mulheres grávidas em Belo Horizonce, em que a prevalência foi de 1,1% (17/1.500) e em paciences acendidos no Ambulatório de DermatOlogia do Hospiral das Clínicas-UFMG, em que a prevalência foi 10 vezes maior (0,73%) que a relatada em doadores de sangue da Fundação HEMOMINAS (0,07%). O HTLV-2 exibe um padrão bem diferente de distribuição do HTLV-1, sendo mais prevaleme em populações indígenas das Américas. Também existe alta prevalência do HTLV-2 emre pigmeus da República de Camarões e Zaire, na África, e enrre usuários de drogas imravenosas nos Estados Unidos e países da Europa. O HTLV-2 é endêmico entre povos indígenas brasileiros. rendo sido relatada soroprevalência enrre 3,6 e 36% na região Norte e 0.4 e 0,9% no Nordeste. Esse vírus tem sido ainda relatado em usuários de drogas injetáveis na América do Sul e especialmence no Brasil. em áreas urbanas, mas é incomum entre doadores de sangue (menos de 3% do cotai de indivíduos infectados pelo HTLV em Belo Horizonte). A transmissão do HTLVse dá por via sexual, por transmissão vertical e pela via paremeral - agulhas e seringas contaminadas e transfusão de sangue contaminado. Por causa da sua transmissão pela transfusão sanguínea, o Ministério da Saúde no Brasil tornou obrigatória a imrodução de restes de triagem para o HTLV-1 e 2 em bancos de sangue a partir do ano de 1993 (Portaria nº 1376). A eficiência de transmissão virai pela via sexual é maior de homens para mulheres que vice-versa. Um risco aumentado de transmissão sexual está associado a relacionamentos mais longos e parceiros mais velhos, que apresentam altos títulos de anticorpos contra o vírus e maior carga provira!. A transmissão de mãe para filho acontece principalmeme na amamemação. O período de aleitamento é um fator de risco na transmissão vertical. assim como a carga provira! e títulos elevados de anticorpos torais para HTLV-1 na mãe. Em áreas endêmicas para o HTLV-1, aproximadamente 25% das crianças amamentadas, nascidas de mães soropositivo, adquirem a infecção. Vários relatos também rêm mostrado que a transmissão mãe/filho é mais freqüeme em bebês do sexo feminino. Apenas cerca de S%de crianças nascidas de mães infectadas, mas não amamentadas, adquirem a infecção. As mulheres têm-se mosrradas mais susceptíveis à infecção pelo HTLV, tanto sexual como vertical, bem como ao desenvolvimemo da HAM/TSP.
579
MANIFESTAÇÃO CLÍNICA Do pomo de vtsta clínico. a grande mataria (95%) dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 pode permanecer assinromáttco durante wda a vida, enquanto 1 a 5% poderão desenvolver manifestações clínicas do tipo hemawlógica ou inflamatória. As duas principats doenças associadas ao HTLV-1 são a ATLL - !infama e leucemia de células T do adulto - e a HAM/TSP - mielopatia associada ao HTLV I paraparesia espástica tropical. Outras doenças assooadas ao vírus são polimiosites. dermatites infecciosas. uveíte, alveolite pul monar, artropatias e síndrome de Sjógren. Em relação ao HTLV-2, não está bem estabelecida sua associação com doenças. Existem alguns relatos de casos associando o HTLV-2 a eventos mrlamatónos e propensão a infecções bactenanas.
Mielopatia associada ao HTLV I paraparesia espástica tropical
A HAM/TSP é uma doença neurodegenerativa inflamatória, de caráter progressivo. levando ao surgimento de alterações motoras e sensitivas. É caracterizada por atrofia na região torácica da medula espinhal, envolvendo desmteltnização perivascular e degeneração axonal, acompanhada de resposta inflamatória na região afetada e de tnfiltrado de células mononucleares. destruição de fibras nervosas no foco inflamatório com perda da capactdade motora-sensonal. Nos estadtos inioais, o paCiente pode apresentar manifestações leves, como sinais neurológicos motores e discreto compromett menro sensorial. Nos estadias intermediários. o comprometimento motor e sensitivo se intensifica, podendo surgir distúrbios nos tratos urinário e digestivo. Nos estadias finais. há acentuado grau de comprometimento motor e sensorial caracterizado por perda no potencial locomotor e sensorial. Alguns indivíduos com HAM/TSP podem apresentar paraplegia espástica decorrente da destruição axonal e mielínica de determinadas regiões da medula esptnhal. Desde que as manifestações clínicas mtoais da HAM/ TSP podem ser vanáveis, a consideração quanto à exposição aos fatores de risco e a prevalência do HTLV-1 na regtão onde nasceu ou vive o indivíduo deve ser feita quando da presença de um sintoma ou sinal isolado que possa
580
M edicina laboratorial para o cl íni co
indicar HAM/TSP Deve-se também ter o cuidado de se fazer um diagnóstico diferencial da mielopatia associada ao HTLV-1 com outras doenças que podem apresentar manifestações clínicas semelhantes. (Quadro 44.1 ). Quadro 44.1 - Doenças que devem ser consideradas no diagnóstiCO d 1ferenc1al da HAM/TSP
Mielopatias
Doenças
Inflamatórios Auto-imunes
Doenças do cológeno liúpus eritemotoso sistêmico, vosculite) Esclerose múltiplo, vosculites, idiopá ticas (50%)
Mielites transversos Tumoro1s
Tumores primó 11os e metastáticos
N utricionais
Deficiência de vitamino 812
Degenerativos
Comoressào medular (discopalios. fraturas e roumas)
Vasculares
Malformações artéria-venosos lsquem1o e inforto
Infecciosos
Espõnd1lo d 1scifes (tuberculose, bactérias, fungos s;filisl
Porositónos
Esquistossomose, cisticercose, toxoplosmose
Virais
HIV cilomegolovírus. herpes
Congênifos
M a l formação do junçcio crãnio-cerv1· cal (malformação de Arnold-C h1ori)
Outras
Atrofio espinal primário fa miliar espós1 co
paraplegia
Fonte: R1bas & "-\elo Rev Soe Bras Med Trop 2002 v 3S p 377· 384
A HAM/TSP acomete, na maior parte das vezes, indivíduos na faixa etária entre 35 e 50 anos, havendo predomínto do sexo femini no sobre o masculino (2:1). As principais manifestações neurológicas da HAM/ TSP são (W HO-Wo rld Health Orgamzation, 1989): paraparesia espástica crónica, que progride geralmente de forma lenta ou que às vezes permanece tnalterada após a progressão inicial; fraqueza dos membros inferiores, de predomínio proximal; distúrbio vesical, que acontece mais precocememe, e constipação imestinal observada mais tardiamente; impotênoa e dtmtnutção da libido; sintomas sensitivos, como formigamento. agulhadas e queimação; dor lombar batxa com trradtação para os membros inferiores; sensibilidade vibrarária comprometida; hiperreflexia dos membros tnferio-
res. freqüemememe com clónus e sinal de Babtnskl;
ver ATLL
é próx1mo de 5% nas pessoas infectadas ames
hiperreflexia dos membros superiores e sinais de Ho f f.
dos 20 anos. A média de idade no tempo do d1agnósC1co
mann e de Trómner; e reflexo mandibular exaltado em
é bastante variável, sendo, por exemplo, em corno dos
alguns pacientes.
60 anos no Japão. mas em torno dos 40 anos no Caribe e
Achados neurológicos menos freqüemes são: sina1s
Brasil. A IncidênCia da doença é um pouco mais alta nos
cerebelares, atrofia ótica, surdez, nist agmo, outros défi-
homens que nas mulheres, numa proporção aproximada
cits de nervos cranianos. tremores nas mãos. ausênc1a ou
de 3:2. A baixa 1ncidência e longo período de lat ência da
diminuição de contrações do tornozelo.
AT LL sugerem que, além da infecção virai, o acúmulo de
Outras manifestações neurológicas: atrofia de musculatura, fasciculação, polim iosite, neuropatia periférica. poliradiculopatia, neuropatia cranial. meningite e encefalopatia. Manifestações sistêmicas não neurológicas: alveo-
mu tações nas células infectadas deve ser necessário para a indução da doença. A doença
é classificada em quatro subtipos clínicos:
aguda, cró nica. latente e linfoma. Essa classificação é ba seada no número de células T anormais no sangue
lite pulmonar, uveíte, síndrome de Sjogren, artropatia,
periférico. nos níveis de desidrogenase lática (HDL), nas
vasculite, ictiose, crioglobulinemia, gamopatia mono-
lesões do tumor em diversos órgãos e no curso clínico
clonai, ATLL.
do paciente. A lguns indivíduos desenvolvem síndrom e
Os achados laboratoriais mais freqüentes na HAM/ TSP são:
pré-ATLL, que é ca racteri zada principalmente por lin focitose resultante da proliferação de uns poucos clones
• presença de anticorpos anti-HTLV ou antígenos vi-
de células T infect adas pelo HTLV-1 (expansão oligo-
rais no sangue e ou líquido céfalo-raquidiano (LCR);
clonal). Aproximadamente metade desses indivíduos
• pleocirose d1screta com predomínio de linfócicos no LCR;
apresentará regressão espontânea. Outras pessoas infectadas podem desenvolver a ATTL crónica ou smol-
• hiperproteinorraquia leve a moderada;
dering. Na form a crónica. os pacientes apresentam-se
• presença de linfócitos lobulados no sangue e ou
com linfocicose, além de ser comum adenomegalia e
líquor.
espleno megalia. já na AT LL smoldering. observa-se baixo nível de células circulantes infectadas pelo H TLV-1,
A pacogênese da HAM/TSP caracteriza-se por alte-
ocorrendo às vezes lesões de pele decorrentes da infil-
rações em parâm etros imunológicos, alta carga provira!,
tração de células leucêmicas. A progressão para um es-
hnfoproliferação espontânea aumentada, altos drulos
tadia agudo da ATLL ocorre eventualmente em alguns
de anticorpos anti-HTLV-1presentes no soro e no LCR
indivíduos. A ATLL aguda é uma forma bem agress1va
e aumentada produção de citocinas e quimiocinas pró-
de leucemia
Inflamatórias.
nal das célu las T infectadas pelo vírus, que podem re-
e caracteriza-se
pela expansão monoclo-
presentar até 99% do total da população das célu las brancas do sangue. Os pacientes exibem lesões de pele.
Leucemia/linfoma de células T do adulto
além de poliadenopat ia
e hepacoesplenom egalia. A hi-
percalcemia é freqüente. bem como altas concentraA leucem1a/ lmfoma de células T do adulco (ATLL)
ções no soro de HDL e da cadeia
a solúvel do receptar
ca racteriza-se pela expansão oligoclonal ou monoclonal
para interleucina 2. Finalmente, alguns ind1víduos po-
das células T infectada s com o HTLV-·1, ocorrendo ge·
dem evoluir para o t ipo linfoma. com a expansão clonai
ralmenre após muitas décadas de infecção virai. As ca-
das células T com o provírus integrado. Esses pacien-
racterísticas clínicas da ATLL são aquelas de um linfoma
tes apresentam -se com baixa percemagem de células
não-Hodgkin: indisposição. febre, linfoadenopatia. hepa-
leucêmicas circulantes e com poliadenopac1a. Os pa-
toesp lenomegalia. icterícia, sonolência, perda de peso e
cientes com ATLL aguda ou com a forma hnfoma têm
infecções oportunistas, além de serem comuns a sensa-
prognóstico ruim, com expectativa de v1da não supe-
ção de sede e o envolvimento da pele (nódulos, p lacas
rior a um ano ( por volta de seis a 10 meses). É típica nas
ou erupção papular generalizada). O risco de desenvol-
leucemias associadas ao HTLV-1 a presença no sangue
Investigação laboratorial da infecção pelo HTLV
581
de células T com núcleos lobulados, chamadas células em flor U!ower ce/Is), as quais mostram o fenóci po de células maduras e ativadas (CD2+, CD3+, CD4+. CD8-, CD2S+ e HLA-DR+). Um co-facor que vem sendo apontado na facilitação do desenvolvimento da ATLL é a infecção por Strongyloides stercoralis, encurtando significativamente o período de instalação da ATLL nos portadores coinfeccados. Nos porcado res do HTLV-1 com esuongiloidíase, foi observada elevada carga provira/, resultante da extensiva proliferação de um número resrriro de clones infectados com o vírus (expansão oligoclonal), que são considerados fatores de risco de desenvolvimento de ATLL. A transmissão do HTLV pela via vertical também é apontada como outro facor de risco de ATLL.
Imunologia da infecção pelo HTLV-1
A infecção pelo HTLV é marcada por forre resposta imune celular, com a participação de linfóciros T CD8+ específicos ao vírus. Acredita-se que em porrado res assintomáricos do HTLV-1, os linfócitos T citotóxicos são eficientes em manter a carga provira! num nível equilibrado. Quando essa resposta não é eficaz, a carga provira! aumenta, levando à exacerbação da resposta imune celular e ao desencadeamento da HAM/ TSP. Escudos têm demonstrado que pacientes com doença neurológica induzida pelo HTLV-1 apresentam aumento significativo de células T CD8+ eferoras e de memória específicas para a proteína Tax e diminuição de células T na1ve. As células T CD8+ ciroróxicas antiTax foram encontradas em maior quantidade no LCR do que no sangue periférico de pacientes HAM/ TSP. sugerindo que essas células T antígeno específicas atravessam a barreira hemaroencefálica e se acum ulam no sistema nervoso central. A alta freqüência de células T CD8+ anti-HTLV-1 em pacientes HAM/TSP correlaciona-se com a produção de várias cirocinas pró-inflamatórias, como IFN-y e TNF-a , indicando que essas cirocinas contribuem para o dano tecid ual na HAM/TSP. Ainda no âmbiro celular, ta mbém se destaca queda significativa no percentual de células CD3TD19+ (li nfóciros B) de pacientes portadores de HAM/TSP em relação a indivíduos infectados assi nromáticos para a doença, indicando graus de mar-
582 ( Medicina laboratorial para o clínico
bidade diferenciados. Assim, a avaliação da resposta imune encre porcadores assimomácicos e paciemes com HAM/TSP pode ser úcil para o entendimento da parogênese de HAM/TSP e para a identificação de marcadores imunológicos associados à progressão da infecção para doença.
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA INFECÇÃO PELO HTLV
Os ensaios sorológicos para o diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 e 2 são baseados na detecção de anticorpos contra proteínas virais da matriz, capsídeo e núcleocapsídeo (p19, p24, plS) e do envelope (gp46 e p21) e dividem-se em dois grandes grupos: as reações de triagem sorológica e as reações confirmatórias. Alguns anticorpos anti-HTLV-1 reconhecem ta mbém ancígenos do HTLV-2 e testes sorológicos de triagem não distinguem a infecção pelo vírus tipo 1 ou 2. Essa diferenciação é possível pelo reste de western blot e cem relevância clín1ca, uma vez que o tipo 1 está mais associado a doenças graves. Ainda não se conhece bem o período de Janela imunológica e a cinética dos títulos de anticorpos antiHTLV ao longo da infecção. O período para soroconversão deve variar de acordo com a via de transmissão da infecção e com a carga virai recebida no evento de transmissão. A transmissão via transfusão sanguínea é considerada a mais eficiente e o recepror geralmente se soroconverte em dois meses, enquanto que para as outras vias a soroconversão pode demorar seis meses ou mais. Não existem relatos de portado res que apresentaram clareamenro virai. As metodologias mais empregadas para a detecção de anticorpos anti-HTLV são: Testes de triagem: • testes im unoenzimáticos. Testes de ELISA de te rceira geração usam combinações de antígenos recombinantes: antígenos do envelope do HTLV-1, ancígenos do envelope do HTLV-2, antígenos do capsídeo do HTLV-1 e ancígenos do capsídeo do HTLV-2; • agl utinação de partículas de látex ou de gelatina: não utilizada no Brasil.
Testes confirmatórios:
Portanto. o reste de WB pode ser capaz ou não de
• western blot ou tmmunoblot. São tesres confirma-
distinguir entre o HTLV-1
eo
HTLV-2. Esta dist inção
é
tórios usados para restar amostras previamente
importance pela diferença no potencial patogênico dos
positivas em restes de criagem. Em geral. empre-
dois vírus.
gam como substrato ancigênico lisado virai do HTLV-1 acrescido de proteínas recombinances do COLETA DE AMOST RA PARA ELISA E WESTERN
envelope do HT LV-1 e do HTLV-2;
BLOT
• imunofluorescência indireta: pouco utilizada no Brasil.
Para os testes sorológicos de ELISA
e W B. poderão
ser utilizadas alíquoras de soro ou plasma a partir da colera de sangue total em tubo sem anticoagulante ou PROTOCOLO D E D IAGNÓSTICO SOROLÓGICO PARA IN FECÇÃO PELO HT LV
com anticoagulantes como EDTA ou heparina. A amosera deve ser centrifugada para separação do soro ou plasma o m ais breve possível
e o soro ou
plasma pode
Para o diagnóstico do HTLV. recomenda-se o uso de
ser armazenado à temperatura de 2•c a a·c durante
um reste sorológJCo de triagem (imunoensa1oenz1má-
um máximo de sete dias. Se for necessário o armaze-
rico), seguido de um reste confirmacóno
(western-blot)
caso a amostra seja pos1r1va. Nos hemocencros brasileiros. segundo instrução da ANVISA (Resolução da Direroria Colegiada
namento da amostra p or longo período. a amostra deve ser congelada a -1s•c o u m enos. Deve-se evitar o congelamento e descongelamento da amostra ames do seu t este.
- RDC n° 153, de 14 de j ulho de 2004 - A N VISA). emprega-se como reste de triagem soro lógica para HTLV-1 e 2 o reste de ELISA e como reste con f irm atóno o
western blot.
T ESTES COM RESULTADOS INDETERM INADOS PAR A HTLV
O reste de ELISA pode ser POSITIVO (reacivo). NEGATIVO (não-reativo) ou INDETERMINADO (valor de
Especialmente em áreas rrop1cais. resultados so-
absorbância próximo do valor de ponto de corre). Se for
rológicos indeterminados para HTLV são comuns,
rearivo. uma nova colera é feira e a nova amostra é resta-
trazendo dificuldades na interpretação do
da em duplicata. A rearividade em uma ou ambas dessas
infecção pelo H T LV e na conduta de aconsel hamento.
duplicaras implicará a realização de um confirmacóno,
O que provoca um reste WB indeterminado e qual a
o
western blot (WB). Na reação de WB. a amostra será
cons1derada: • negativa. se não houver qualquer reaciv1dade para os ancígenos v1rais presentes no reste;
importância médica desse
status de
status ainda não está mui-
ro claro. Um padrão WB indeterminado para HT LV pode ser devido à infecção com vírus defectivo; ao baixo número de cópias provirais do HTLV, incapaz
• indet erminada, se forem detectadas bandas es-
de suscitar resposta humoral detectável pelo reste; ou
pecíficas para o HTLV. mas que não preencham o
a reações cru zadas de anticorpos dirigidos contra ou-
cm éno de seropositividade;
tros rerrovírus. por exemplo. retrovírus endógeno, ou
• positiva, se apresentar rearividade para: • GAG (p19 e p24) e ENV (gp21) - soropositivo para HTLV (1 o u 2) ou
contra outros agentes infecciosos com alguma homologia com o HTLV. Testes m o leculares como a PCR (reação de po-
• GAG (p19 com ou sem p24) e duas ENV (gp21 e
limerização em cadeia), os quais não dependem de
gp46- l recombiname)- seropositivo para HTLV-
resp osta imunológica do hospedeiro. podem ser mui-
1 ou
ro ú teis em resolver a maioria desses casos. além de
• GAG (p24 com ou sem p19) e duas ENV (gp21 e gp 46-11 recombinante) - seropositivo para
p ermitirem a discriminação da infecção pelo HTLV tipo 1 ou tipo 2.
HTLV-2.
Investigação laborawr ial da infecção pelo HTLV
583
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO HTLV O teste de PCR qualitativo
As técnicas de biologia molecular para diagnóstico con firmatório e diferencia l da infecção pelos HTLV-1 e HTLV-2 fundamentam-se primariamente na detecção do ácido nucléico virai na forma de DNA provira!. A reação de polimerização em cadeia (PCR) é a técn ica molecular mais utilizada e baseia-se na amplifica ção de uma seqüência específica de DNA a partir da molécula-a lvo, possuindo alta sensibilidade. A sua especificidade é dada pela seqüência de iniciadores que devem se anelar à seqüência-alvo de amplificação. Diversos protocolos de PCR para detectar infecção pelo HTLV têm sido descritos pelos laboratórios baseados em tecnologia própria (in house), não existindo no mercado kit comercial para amplificação de seqüências genômicas do HTLV. Indicações da PCR: Para a infecção pelo HTLV, a PCR tem sido particularmente útil para: • averiguação da transmissão neonatal. já que os testes sorológicos em bebês podem detectar anticorpos maternos; • discriminação entre infecção pelo vírus tipo 1 ou tipo 2.; • definição de du pla infecção (HTLV-1 e HTLV-2); • definição de subtipos virais; • auxílio diagnóstico em indivíduos com suspeita de soroconversão; • resolução de casos WB indeterminado. Seqüências genômicas do HTLV-1 podem ser detectadas em linfócitos do sangue periférico dos indivíduos seropositivo para o HTLV-1 at ravés de PCR primária. Entretanto, estudos têm sugerido que alguns indivíduos seropositivo e a grande maioria dos indivíduos soroindererminado para o HTLV-1 são negativos nessa modalidade de PCR. Seqüências de tax do HTLV-1 têm sido periodicamente detectadas por PCR ani nhada ou nested (técnica que usa o produto da PCR primária como amostra para a segunda PCR). A ausência de detecção por PCR primária pode ser devido ao baixo número de cópias provirais, suficiente apenas para sua detecção na PCRaninhada. A habil idade para detectar apenas alguma
584 ( Medicina laboratorial para o clínico
região da seqüência virai. como tax, mas não o genoma compleco (pol. gag, env, LTR), rambém rem sido descrita e pode ser conseqüência de vírus defectivo. Portanto, para diagnóstico de amostras clínicas, recomenda-se o uso de PCR aninhada. Além disso, porque a sensibilidade da PCR pode variar em função da região de anelamento dos iniciadores, pode ser importante avaliar pelo menos mais de uma região do genoma virai. como, por exemplo. tax e pol ou tax e env.
PCR quantitativa - quantificação da carga provira! do HTLV
A carga provira\ para o HTLV-1 é o principal marcador de risco para o desenvolvimento de doenças associadas ao vírus. Diferentemente do HIV. em que a quantificação da carga da infecção é dada pelo número de partículas virais circulantes (quantificação de cópias de RNA vira\ por ml de plasma). a carga para o HTLV é a quantificação do número de cópias de DNA provira \ presentes numa população celular. ou seja. a medida do número de células infectadas, pois existem poucas partículas do HTLV-1 livres no plasma. A carga provira\ do HTLV-1 é caracteristicamente alta quando comparada à infecção por outros retrovírus e embora os números variem muito. a média da carga provira\ num portador saudável é significativamente mais baixa do que a observada em portadores sintomáticos, como pacientes com HAM/TSP ou com ATLL. Nos pacientes HAM/TSP, a alta carga provira\ está correlacionada com níveis elevados de anticorpos anti-HTLV-1 e de células T CD8+ ativadas no sangue periférico e no líquor. Além de ser um determinante importante para a patogênese da HAM/TSP, uma carga provira\ elevada também parece ter importância no desenvolvimento da uveíte. No contexm da ATLL. uma condição associada à carga provira\ aumentada também é considerada para ser um estadia inrermediário e é frcqüenremente complicada por infecção oportun íst1ca. como estrongiloidíase ou micose. A eficiência da transmissão do HTLV, seja ela horizontal ou vertical, está também associada à carga provira\, de modo que quanto mais elevada a carga, maior será o risco de tra nsmissão. Para a quantificação da carga provira\ do HTLV, têm sido usados diferentes métodos de PCR: PCR semiquan-
)1----- -- - - - -- -- - -- - - - - - - - - - -- - -
rirariva. PCR compeririva e PCR em rempo real. Todas essas merodologias devem usar controles em que se conheça o número de cópias do gene-alvo de amplificação para o HTLV e de um gene humano para normalização do número de células presentes na amostra, como. por exemplo, genes para actina ou albumina. Esses controles podem ser células infectadas com o vírus. desde que se conheça o número de cópias/célula do gene-alvo de amplificação ou plasmídios comendo as seqüências-alvo virai e humana. A partir da dil uição seriada dos controles. constroem-se então as curvas-padrão, que permitem a inferência do número de cópias provirais e do número de células. de modo que a carga provira! é dada pelo número de cóp1as provirais sobre o número de células. Atualmente, o método mais utilizado tem sido a PCRem tempo real, mas não existe padronização de protocolos emre os laboracónos.
Amostra utilizada na realização de PCR
Como o HTLV não apresenta viremia plasmática (presença de RNA virai circulante em grandes quantidades no plasma ou soro), o uso de plasma ou soro não é apropnado para o d1agnóstico molecular do HTLV. O HTLV possui tropismo para linfómos e a amosua de escolha para o diagnóstico de infecção é o sangue rmal. No entanto, poderão ser utilizadas diferentes amostras b1ológ1cas que contenham células possivelmente infectadas para identificação do vírus, em caso de estudos específicos para pesquisas. Dependendo do protocolo de PCR, será usada como amostra uma alíquota do sangue total ou então DNA extraído di retamente do sangue coral ou células mononuclea res. Existem diferentes métodos para a purificação de DNA a partir de sangue total ou de PBMC. mas melhor rendimento e pureza serão obtidos quando a amostra não está hemolisada. Durante a fase de processamento da amostra e realização da PCR, deve-se evitar a contaminação com agences inibidores de PCR e especialmente com DNA ou amplicom (produto de PCR) proveniente de outras amostras, a fim de se evitarem-se resulcados falso-negativos ou falso-positivos, respectivamente. O uso de controles positivos e negativos é importa nte na avaliação da especificidade da técnica.
Investigação laboratorial da infecção pelo HTLV
CONS ID ERAÇÕES FINAIS Caso haja suspeita de infecção pelo HTLV, o clínico deve solicitar a realização dos testes sorológicos do paciente para o diagnóstico de infecção pelo vírus. Recomenda-se a realização de ELISA específico para HTLV e caso o resultado seja positivo, deve ser confirmado pelo westem blot. A identificação do tipo de HTLV (1 ou 2) é importante. uma vez que o tipo 1 apresenta maior grau de morbidade em relação ao tipo 2. Assim, se o resultado do western blot não fornecer o tipo de HTLV do qual o paciente é portador. deve-se solicitar. então. PCR para identificação de HTLV-1 ou HTLV-2. Ao ser diagnosticada a infecção pelo HTLV. recomenda-se inicialmente o esclarecimento do portador quanto às diferenças entre esse vírus e o HIV, enfatizando o fato de que a maioria dos indivíduos infectados pelo HTLV não desenvolverá a doença, permanecendo assimomácicos pelo resto de suas vidas. No encanto, o portador deve ser alertado de que ele é um potencial transmissor da infecção e deve conhecer os meios para evitar essa transmissão: não doar sangue. órgãos, leite ou esperma; não fazer uso compartilhado de agulhas, seringas ou oucros objecos pérfurocortantes; discutir com seus parceiros sexuais a transmissão da infecção por essa via e a adoção de medidas preventivas. como uso de preservativos; preferir parco cesáreo e evitar o aleitamento pela mãe seropositivo, buscando garantir a nutrição do lactente em leite materno de bancos de leite ou aleitamento artificial. Os portadores do vírus devem ser submetidos a exame físico geral e avaliação neurológica. objecivando a identificação de manifestações precoces de doença, como adenomegalias. hepatoesplenomegalia. lesões cutâneas, alrerações de força muscular, dos reflexos. da sensibilidade e dos esfíncteres. Devem ser ainda realizados exames laboratoriais hematológicos e parasitológicos, tais como hemograma, para identificar a ocorrência de leucocirose. linfocitose com ou sem leucocitose. eosinofilia ou identificação de acipias linfocitárias; dosagem sérica de DHL e cálcio; raio X de tórax, para verificar a existência de massas mediastinais; e exame paras1tológico de fezes, incluindo pesquisa de Strongylo1des sp. Nos portadores de HTLV, recomenda-se igualmente a testagem sorológica de outros pacógenos que compartilham a mesma v1a de transmissão. cais como o vírus da
585
e HIV. Nos indivíduos se-
os com teste positivo e sintomatologia para HAM/
xualmente acivos, recomenda-se a testagem para HTLV
TSP, pode-se avaliar a possibilidade de encam inha-
dos parceiros. Todos os filhos de mulheres infectadas
mento do paciente para o Hospital Sarah Kubi t schek
pelo HTLV devem ser testados, devido à possibilidade de
em Belo Ho rizonte, que é referência no estado para
transmissão vertical. Por outro lado, mães e amas de leite
dist úrbios do aparelho locomotor, d istúrbios neuro -
de indivíduos com diagnóstico de infecção pelo HTLV
musculares para reabiliração de pacienres com lesão
também devem ser testadas para o vírus.
m edular o u cerebral.
hepatite B, vírus da hepatite C
Indivíduos com resultados sorológicos indeterminados devem ser informados de que seu resu ltado não está
REFERÊNCIAS
definido, sendo necessários testes complementares (testes moleculares) ou acompanhamento sorológico para
1.
definir possível soroconversão. Até que o status sorológico seja definido, eles devem ser orientados a seguir as mesmas instruções para evitar risco de transmissão do vírus, especialmente não doar sangue, visto que esta é a
2.
forma mais eficiente de t ransmissão do HTLV. Existem apenas três estados onde há centros de referência em HTLV no Brasil para encaminhamen-
3.
to de portadores do vírus ou suspeitas de infecção: Bahia, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. Os centros de referência são: o centro de atenção aos portadores de HTLV mantido pela Fundação Baiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC), com a Fundação Osvaldo Cruz (Fiocruz),
4.
em parceria em Salvado r
em Doenças Infecciosas do Sistema Nervoso/HTLV e Centro de Referência
- Bahia; o Centro de Referência
para HTLV-1 e 2e HIV do Instituto de Pesquisa Clíni-
5. 6.
ca Evandro Chagas - IPEC (Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, Mangu inhos) no Rio de
7.
janeiro; e o Centro de Referência em HTLV da Prefeitura Municipal de Porto Alegre, o Centro Municipal
8.
de DST/AIDS/HTLV, no Rio Grande do Sul. Existem ainda hospitais com profissionais capazes de orientar os portadores (doadores de sangue positivos), tais como: o Inst ituto Estadua l de Hematologia e o Hospital Universitário da UFRJ, no Rio de Janeiro. Em Minas Gerais, não existe centro de referência para HTLV. A fundação H EMOMINAS faz testes de triagem e confirmação sorológica e/ou molecular para doadores de sangue. Para indivídu-
586 ( Medicina laboratorial para o clínico
9.
Brasil. M 1nisrêno da Saúde. Secretana de ProjeL o~ bpeciais de Saúde. Manual de Controle das Doenças Sexualmente Transm 1ssíve1s. Brasília: Mimsréno da Saúde; 1999. D1sponível em: http://www.alds.gov.br/assistencia/ manualcomroledst.pdf Brasil. Min1sténo da Saúde. Secretana de V1gilânc1a em Saúde. Programa Nacional de DST e Aid s. Gu1a de Manejo Clínico do Paciente com HTLV. Série Manuais n.0 58. Brasília: Ministéno da Saúde; 2004. Brito-Melo GE, Souza JG. Barbosa-Stancioli EF. Carne1roPro1eui AB. Catalan-Soares B. Ribas JG, et ai. Estabhshmg phenoryp1c features associated w1 th morb1diry in human T-celllymphotropic vírus rype l 1nfecnon. Ciln Diagn Lab lmmunol. 2004;11(6):1105-10. Cann AJ. Chen ISY. Human T-cell leukemia vírus types I and li. ln: BN Fields. DM Kn1pe. PM Howley, edirors. F1elds V1rology. 3rd ed. Phdadelphia: Raven Publishers; 1996 p. 1849-79. Coffin J. Hughes SH. Varmus HE. Retroviruses. New York: Cold Spring Harbor Laborarory Press; 1997. Osame M. Usuku K. lzumo S, ljich1 N. Am1ran1 H. Igata A, et ai. HTLV-1 assooated myelopathy. a new ciln1cal enury. Lancet. 1986;1(8488) 1031-2. Pro1etti ABFC. HTLV-1. Cadernos Hemom1nas. D1sponível em: http://www.cehmob.org.br/downloads/htlv.htm. Santos FLN. Lima FWM. Ep1demiolog1a, fisiopatogen1a e diagnóstico laboratonal da 1nfecção pelo HTLV-1. J Bras Patol Med Lab. 2005;41(2):10S-16. World Health Organ1zarion. Repore of the Sc1em1fic Group on HTLV-1 and Associared Diseases. Kagoshlma, )apan. December 1988: Vírus d1seases. Human T Lymphorrop1c Vírus Type I, HTLV-1. Wkly Ep1dem Rec. 1989;49:382-3.
45
Eleonora Druve Ta vares Fagundes Alexandre Rodrigues Ferreira Mariza Leitão Valadares Roquete
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM HEPATITE PELO HAV E HEPATITE PELO HEV
HEPATITE A
Epidemiologia e formas de transmissão
A infecção pelo vírus da hepatite A (HAV) é usualmente caracterizada por ter curta duração, ser aucolimitada, conferir imunidade duradoura e não evoluir para heparopatia crônica. No entanto, a doença é uma importante causa de morbidade e de eventual mortalidade. Éde ocorrência freqüeme em nosso meio, sendo responsável pela maioria dos casos de hepatites agudas em crianças.
A hepatite A é uma doença comum, de distribuição universal, com altas prevalências em áreas de precárias condições sanitárias, sendo um problema sério de saúde pública. Com a melhoria das condições de vida da população, o percentual de contactantes tende a se reduzir três vezes ou mais. Paradoxalmente, a redução da incidência de hepatite A na faixa etária pediátrica pode elevar o número de casos com mais morbidade e gravidade, por aumentar o número de adolescentes e adulros suscetíveis que deixaram de apresentar a infecção leve e, muitas vezes, subclínica na infância. Em áreas de alta en demicidade, 90% das crianças são infecradas até 10 anos de idade. Nas áreas de endemicidade intermediária, as taxas de soroprevalência de 90% não são atingidas até o início da idade adulta. Costa-Ciemens et ai. (2000) estudaram a prevalência de HAV em quatro centros do Brasil (Manaus, Fortaleza, Rio de Janeiro e Porro Alegre), entre 1996 e 1997. A soroprevalência geral para o HAV no Brasil foi de 64.7%, mas o seu padrão foi muito heterogêneo entre as regiões, variando de 92,8% na região norte a 55% no sul e sudeste do país. Com isso, crianças e adolescentes de alto nível socioeconômico têm risco similar ao de viajantes para regiões de alta endemicidade, considerando que eles não estão protegidos, mas estão sob risco contínuo de infecção. Esse fato torna a vacina da hepatite A importante e de indicação precisa.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO Agente etiológico
O HAV é um pequeno vírus RNA da família dos picornavírus. Apenas um sorocipo foi identificado, embora pequenas diferenças genéticas tenham sido encontradas, que poderiam explicar as diferentes formas clínicas em relação à gravidade da doença. O vírus resiste a grandes variações de pH e aos sais biliares e enzimas proreolíticas intestinais, permitindo que o mesmo apareça intacro nas fezes, faci li tando a transmissão fecal-oral. Resiste a elevadas temperaturas (wo·c por cinco minuros e 25• por três meses), mas pode ser inativado quando exposro ao ácido hipoclorídrico, ao iodo e ao formaldeído. O dano hepático não é resultado direto do efeito ciropático do vírus sobre os hepatóciros, mas está mais associado à ação imunológica mediada pelas células T.
A hepatite A é extremamente contagiosa, de transmissão fecal-oral, direta ou indireta, através de água ou alimentos contaminados. O pico de rransmissão correlaciona-se com o período de maior excreção fecal do vírus. que ocorre duas semanas ames do início da icterícia e da elevação das aminotransferases. Em sua maioria, os casos deixam de ser infecciosos na segunda semana de iccerícia. A transmissão é mais comum quando há contam pessoal íntimo e prolongado do doente com um indivíduo suscetível à infecção. Conseqüentemente. os facores de risco são o convívio familiar e agrupamentos de pessoas (militares, prisões. creches e instituições que cuidam de crianças sem controle de esfíncter). além de homossexuais masculinos. usuários de drogas endovenosas e viajantes para regiões endêmicas de hepatite A. Nas crianças jovens, as infecções assimomáticas associadas ao prolongado período de excreção fecal do vírus e a limitada higiene pessoal dessa faixa etária fazem deste grupo uma importante fonte de infecção. A rransmissão parenteral é incomum. mas admissível, uma vez que durante o período de incubação há uma curta fase virêmica (sete a 10 dias).
Apresentação clínica
O espectro da doença causado pelo HAV varia amplamente, desde soroconversão assintomática até gastroenterite predominantemente anictérica em crianças jovens ou quadro iccérico febril com repercussões sobre o estado geral em adulcos. Como regra geral, quanto mais jovem o paciente, menos aparente é a infecção; crianças menores de dois anos são freqüentemente assintomáticas (aproximadamente 85% delas) e cursam sem icterícia numa proporção de 17:1, enquanto os adultos têm habitualmente quadro clínico evidente (cerca de 76 a 97% são sintomáticos, sendo que 2/3 cursam com icterícia). A existência de doença hepática crônica subjacente também está associada a quadros mais graves. Quando presente. a doença clínica dura, em média. dois meses. O período de incubação varia de 15 a 40 dias (média de 28 dias). Partículas virais podem ser deteccadas nas fezes no final do período de incubação e precocemente após o início dos sintomas da doença. Após o período de incubação, inicia-se a fase prodrômica, que dura de uma a duas semanas ames do início da icterícia. Nesta fase, são comuns febre, cefaléia, anorexia. náuseas e vômiros, em
588 (
Medicina laboratorial para o clínico
geral discretos, dor no hipocôndrio di reito, distúrbios do paladar e do olfato (aversão por carnes. friruras e odor de cigarro) e alterações do hábito intestinal. Achados como heparomegalia dolorosa. esplenomegalia. linfadenomegalia, mialgia e sintomas respiratórios, que se assemelham ao resfriado comum, são menos freqüemes. O aparecimento de colúria anuncia o início da fase ictérica, quando a doença é usualmente reconhecida. Com a icterícia, as fezes tendem à hipocolia; pode surgir prurido cutâneo e os sintomas prodrômicos melhoram rapidamente. A fase iccérica pode durar até quatro semanas. Aproximadamente S% dos pacientes com hepatite A cursam com colestase mais exuberante. Nessas situações. o quadro clínico habitual está presente, mas o prurido é mais marcante e a icterícia mais importante e prolongada - pelo menos 12 semanas de evolução, com aumento acentuado de fosfatase alcalina, bilirrubina di reta (> 10 mg/ dL) e gama-glutamiltransferase. Os pacientes com anemia falciforme apresentam esse quadro mais freqüememente, embora isso não implique evolução desfavorável. Entre 1,5 e 18.5% dos casos pode ocorrer aparente recuperação clínica e normalização das aminorransferases. denrro de poucas semanas até seis meses. Pode haver, então, reaparecimento dos sintomas, nova elevação de enzimas, com ou sem bilirrubinúria ou icterícia, ou a recaída ser assinromática, revelada apenas pelo aumento do nível de aminotransferases. O prurido pode ser especialmente problemático nas recaídas. que tendem a ser mais prolongadas que o episódio inicial, com recuperação completa, podendo levar até 40 semanas. A incidência de hepatite fulminante pelo HAV varia de 0,1 a 0,5%. O risco parece aumentar com o avanço da idade e com a presença de co-morbidades, como doença hepática crônica. Nos EUA. aproximadamente 100 casos de hepatite fulminante pelo HAV ocorrem a cada ano. Os casos que cursam com vômiros incoercíveis. alteração do sensório, tendência maior a sangramentos, icterícia acentuada e persistente. redução abrupta das aminotransferases e da heparomegalia, sem melhora clínica correspondente, merecem observação rigorosa e cuidados hospitala res. De modo geral, o prognóstico da hepatite A é favorável, sem risco de evolução para heparopatia crónica, mesmo nas formas colestáticas. recorrentes e com anci-HAV lgM duradouro. A melhora clín ica ocorre em poucas semanas e a normalização laboratorial e histoló-
gica em poucos meses. A taxa de caso/fatalidade enrre pessoas de codas as idades é de aproximadamente 0,1 a 0,3%, mas essas taxas aumentam para 1,8% entre adultos com mais de 50 anos. O diagnóstico diferencial inclui outras infecções bacterianas, parasitárias e virais, hepatite auto-imune e reação a drogas.
Tratamento e profilaxia
Baseia-se no repouso relativo, conforme a demanda do paciente, oferta de dieta habitual para a idade e uso de sintomáticos, quando necessário. A hospitalização fica reservada para quadros acentuados de vôm itos, coagulopatias graves, sinais de encefalopatia hepática e outras situações de risco. Os escolares, adolescentes e adultos podem recamar suas atividades assim que se sentirem bem. Quanto às crianças menores, deve-se aguardar duas semanas após o início dos sintomas ou uma semana após o surgimento da icterícia, quando já se superou a fase de excreção fecal do vírus, comando a transmissão da doença bastante improvável. Bons hábitos de higiene são o foco central na prevenção da hepatite A, especialmente em ambientes de possível exposição, como creches e aglomerados populacionais. Condições sanitárias adequadas e higiene na manipulação de alimentos também são importantes. A imunoglobulina é eficaz na prevenção e na atenuação do curso clínico da hepatite A, se administrada até duas semanas após a exposição, com eficácia variando de 85 a 87%. Está indicada no cantata íntimo (domiciliar e sexual) de um caso de hepatite A aguda, incluindo pessoas institucionalizadas, crianças e profissionais que freqüentam creches ou outros locais onde a doença foi identificada. Também oferece proreção de curta duração (um a três meses) no caso de viajantes para áreas tropicais e subdesenvolvidas. A dose é de 0,02 ml!kg, por via intramuscular, em dose única. A vacina de vírus A inativado tem se mostrado bastante segura, com eficácia em torno de 94 a 100%. São necessárias duas doses da vacina, com intervalo de seis meses, podendo ser administrada a partir de um ano de vida. Em crianças e adolescentes, mais de 97% desenvolvem anticorpos após a primeira dose e 100% após a segunda. A duração da proteção, na verdade, ainda não
foi determinada, mas acredita-se que a imunidade pode chegar a 20 anos. A incidência da infecção diminuiu significativamente em diversos países que incorporaram a vacinação entre crianças e adolescentes. Efeitos colaterais incluem reações locais e sintomas sistêmicos leves (<10%). Como a vacina é inativada, nenhuma precaução especial deve ser camada em indivíduos imunodeprimidos, mas pouco se sabe como esses pacientes respondem à vacina. O teste sorológico antes da administração da vacina em crianças não é necessário, mas pode ser útil em adolescentes e adultos de áreas de alta prevalência. Devido à alta taxa de soroconversão, não é necessário o teste pósvacinai. A vacinação universal seria a medida ideal para diminuir progressivamente a incidência da hepatite A, terminando por erradicá-la, e já faz parte do calendário de vacinação da Sociedade Brasileira de Pediatria. Está tam bém indicada para os pacientes com hepatopatia crônica. A vacina não está recomendada como profilaxia pós-exposição, embora haja relatos de sua eficácia.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL Alterações laboratoriais gerais
As aminotransferases aumentam durante a fase prodrômica, cerca de uma semana antes do início da icterícia; o pico dessas enzimas é geralmente verificado quando surge a bilirrubinúria. atingindo valores elevados (20 vezes ou mais os valores de referência). Aminotransferases normais ou pouco elevadas na fase inicial da doença virtualmente excluem o diagnóstico de hepatite A; no entanto, seus níveis tendem a cair rapidamente com o início da icterícia, em taxas de 60 a 70% por semana; logo, se diversos dias se passarem até a coleta do soro do paciente, aquelas enzimas já podem ter declinado a percentuais de pouco valor diagnóstico, normalizandose em uma a duas semanas. Pode haver redução dos níveis de albumina e elevação de globulinas inespecíficas. Alterações significativas do coagulograma acontecem nos quadros mais graves quando a síntese hepática está significativamente comprometida. Nessas condições, a resposta à admin istração de vitamina K parenteral é, em geral, incompleta e insatisfatória. O nível sérico de bilirrubina pode atingir valores entre 23 e 28 mg/dL, embora mais comumente oscile em torno de 5 a 10 mg/dl. A
Investigação laboratorial do paciente com hepatite pelo HAV e hepati te pelo HEV
589
fosfarase alcalina e a gamagluramil-transferase podem estar alceradas, especialmente nas forma s de hepatite que cursam com colestase significativa.
Diagnóstico sorológico
HEPATITE E A hepatite E já foi denominada hepatite não A não B de transmissão entérica. A história do vírus da hepatite E (HEV) teve início na Índia, após duas epidemias de
heparire icrérica devido à comaminaçào fecal de água
Os anticorpos específicos para o HAV começam a ser detectados no final do período de incubação, cinco a 10 dias ames do início dos sintomas (Figura 45.1). O anticorpo sérico lgM (ami-HAV lgM) é o marcador da fase aguda por excelência e aparece precocemente no curso da doença - quando a excreção fecal do vírus diminui; alcançando sua concentração máxima emre a qui ma e a oitava semanas após a exposição e persistindo por cerca de dois a seis meses. Sua identificação sorológica significa contam recente com HAV. Pode persistir em alguns casos além da fase aguda e da convalescença. por até 420 dias. A razão não é clara, mas pode refletir dtulos persistentemente baixos, detectados por técnicas muiw sensíveis. Falso-negativos, durante a Infecção recente, são extremamente raros. Falso-positivos podem ocorrer em pacientes com fator reumatóide positivo, justificando a exclusão desta condição se a positividade se prolongar por mais de um ano. A vacinação contra HAV pode induzir a formação de anticorpos lgM ami-HAV. principalmente se o teste for realizado dentro de um mês após a vacinação. O am1corpo lgG (ami-HAV lgG) aparece simultaneamente ao lgM, mas em geral sua concentração ascende de modo mais lento e dura, provavelmente, por toda a vida. Sua presença. com anti- HAV lgM negativo. indica exposição passada ao HAV e imunidade duradoura. A vacinação induz produção de lgGs, mas os títulos podem ser baixos, de forma que a ausência de lgG ami-HAV. após vacinação, não significa ausência de proteção. lgG
''
''
potável em 1955 e 1975. Até 1980, acreditava-se que o vírus da hepatite A seria o causador das duas epidemias. No encanto, amostras de soro estocadas foram negativas para os marcadores da hepatite A e B. Desta forma, f1cou estabelecido que se rrarava de hepatite não A não B de transmissão emérica. A primeira prova da existência de um novo vírus foi obtida em 1983, com sua visualização por microscopia eletrônica. No final da década de 1980 e início dos anos 90, os primeiros ensaios sorológicos mapearam o HEV, que ocorria predominantemente na África e na Ásia. O genoma do vírus foi desvendado em 1990. Desde então. já foram descritas epidemias em todos os continentes. especialmente nos países em desenvolvimento. O HEV é responsável por 53,3% dos casos de hepatite aguda em Nova Delhi (índia). No Brasil, os poucos estudos realizados verificaram prevalência de 3 a 6%. A infecção pelo HEV geralmente causa hepatite ictérica aguda e autolimitada. lembrando a hepatite pelo vírus A.
ASPECTOS RELEVANTES DA IN FECÇÃO Agente etiológico
O vírus da hepatite E é um vírus pequeno, esférico, sem envelope, com genoma RNA. Parece haver apenas um sorotipo do HEV. embora quatro variações genocípicas já tenham sido descritas com distribuições geográficas diferenciadas. O HEV pode ser identificado em animais domésticos e selvagens, o que confere à hepatite Ea denominação de zoonose.
'~, Epidemiologia e formas de transmissão
lgM ' ,
' o
2
4
6
8
10
12
Semanas após exposição
Figura 45.1 - Apresencação esquemátiCa dos marcadores laboratoriais da hepatire A.
590 ( Medicina laboratorial para o clínico
O vírus da hepatite E rem distribuição universal. A hepatite Eé uma 1nfecção determinada pela contaminação fecal de água potável. Ocorre sob forma de epidemia ou se apresenta como casos esporádicos nas áreas
endémicas. A incidência da hepatite E ainda não está bem definida. devido à baixa disponibilidade do reste sorológico, o que impede o diagnóstico das formas clínicas e subclínicas. A transmissão pessoa-pessoa é 1ncomum. Algumas evidências sugerem que os seres humanos com infecção subclínica e os animais possam servir de reservatórios do vírus E. A transmissão imrafamiliar é bem menos importante que a transmissão pela água contaminada. As epidemias são mais freqüemes durante a estação chuvosa, quando ocorrem enchentes e contaminação de água potável por dejetos humanos. Estão associadas. portamo, às condições inadequadas de higiene pessoal e sanitária. Nos países endêmicos para hepatite E, é possível a transmissão do HEV através de transfusão de hemoderivados. A hepatite E é mais freqüence na fa ixa etária de 15 a 40 anos. sendo também descrita como causa comum de hepatite aguda esporádica na população pediátrica de regiões endêmicas. O quadro é predominantemente subclínico ou an1ctérico emre as crianças. Na Índia, os anticorpos contra o vírus E foram detectados em mais de 60% de cnanças com idade inferior a cinco anos. A exposição é maior na população urbana em relação à rural. A taxa de mortalidade para a população geral em área endêmica varia de 0.5 a 4%. Emre as grávidas, sobretudo no segundo ou terceiro trimestre de gravidez. a mortalidade está em torno de 15 a 25%. A alta mortalidade entre mulheres gráv1das constitui uma particularidade da hepatite E. A suscetibilidade peculiar nesse grupo de pacientes permanece enigmática até o momento. Alterações na imun1dade e aumento do nível de hormônios esteróides durante a gravidez podem influenciar na replicação e expressão virai. determinando a maior gravidade da doença. O vírus da hepatite E pode ser transmitido pelas mães infectadas aos seus recém-nasc1dos por via vertical. ocas1onando morbidade perinatal e mortalidade significativas. A morre da mãe e do feto. aborto, parto premacuro ou morre do recém-nascido na sala de parto após o nascimento são complicações comuns da infe0ção pelo vírus Edurante a gestação. A maioria dos casos de hepatite E em países desenvolvidos é procedente de regiões subdesenvolvidas. Nos países desenvolvidos da Europa e América do Norte, 1 a 5% da população apresentam positividade para o anri- HEV. Entretanto, não está esclarecido se a sorologia positiva em áreas não endêmicas reflete infecção anicté-
rica e/ou subclínica. reação cruzada com ouu os agemes, restes sorológicos falso-positivos ou a comb1nação de rodos esses famres.
Apresenta~ão
cl ínica
O especuo clínico da hepatite E pode variar de um quadro de forma anicrérica e assimomárica até a hepatite icrérica, podendo culm1nar com a manifestação grave de insuficiência hepática fulminante. As manifestações clín1cas da hepatite E são semelhantes às da hepatite A. A infecção subclínica ocorre em adultos e crianças. porém com freqüência e significado desconhecidos. O período de incubação do HEV é maior que o do vírus A. variando de duas a 10 semanas (média de seis semanas). A fase icrérica dura em torno de 17 dias e coincide com o período em que ocorre o desenvolvimento de anticorpos. A hepatite aguda icrérica rem início insidioso. com pródromos de duração em torno de 14 dias, caracterizado por febre, dor abdominal. náusea. vômims, acolia fecal. colúria. artralgia, diarréia. astenia e rash cutâneo transitório. Essas manifestações são seguidas em poucos dias pelo aparecimento de icterícia. Com o início da icterícia. as manifestações prodrômicas diminuem e podem desaparecer. exceto os Sintomas gastrintestinais, que podem persistir por tempo prolongado. A doença é aurolimitada e tipicamente dura de uma a quatro semanas. A excreção do vírus inicia-se aproximadamente uma semana ames do início dos sinmmas e persiste por aproximadamente duas semanas; a wemia pode ser detecrada du rante a fase tardia do período de incubação. A hepatite Eé autolimitada e não evolui para a forma crónica. Existe relato de manifestação na fo rma de icterícia colestática, com du ração superior a seis meses. mas com resolução da doença.
DIAGNÓSTICO Alte rações laboratoriais gerais
As anormalidades laboramriais incluem elevação da atividade das aminotransferases e, quando há icterícia. hiperbilirrubinemia. A gama-glutamiltransfera se e a ativida-
Investigação laboratorial do paciente com hepat ite pelo HAV e hepat ite pelo HEV
591
de da fosfatase alcalina também podem estar alteradas. A elevação das aminotransferases pode preceder o início dos sintomas em até 10 dias e atinge o pico máximo no final da primeira semana da doença. A magnicude dos níveis de elevação da atividade das aminouansferases não se correlaciona com a gravidade de lesão hepática. O número ele leucóciws pode ser normal. existir leucopenia discreta ou linfociwse relativa. Os testes de função hepática rewrnam ao normal por volta de seis semanas. O diagnóstico inicial de hepatite aguda é baseado no quadro clínico e na elevação das aminorransferases, enquanto que o diagnóstico de hepatite Esó pode ser confi rmado pela sorologia específica. Nas áreas endêmicas, a epidemiologia pode ser útil; a evidência de transmissão fecal-oral. alta mortalidade entre mulheres grávidas e a maior incidência em adultos jovens são indicadores de surw de hepatite por HEV.
casos de hepatites de viajantes, mas os estudos epidemiológicos naciona1s destacam a presença do vírus na população brasileira. Em gestantes, seu diagnóstico deve ser priorizado. uma vez que a morbidade nesse grupo é muim alta. O tratamento da hepacice E é semelhante às ouuas formas de hepatite virai e nen huma medida específica é necessária. Os pacientes com hepatite fu lminante necessitam de cuidados de terapia intensiva e avaliação de transplante hepático. A vacina específica para HEV ainda não está dispon ível. Existem estudos em andamenm da vacina conjugada para o vírus E, acreditando-se que o vírus seja somente de um sorotipo. As medidas preventivas mais eficazes são o acesso à água de fonte segura, com medidas san itárias adequadas. REFERÊNCIAS
Diagnóstico sorológico
1.
O diagnóstico da hepatite pelo vírus Eé usualmente realizado a partir da detecção do anticorpo específico lgM, que desaparece em mrno de quatro a cinco meses; o anti-HEV lgG permanece por poucos anos. O anti-HEV lgM tem sido detectado em mais de 90% do soro obtido de pacientes após uma semana a dois meses de início da doença, especialmente nas primeiras quatro semanas. Entretanto, a sorologia pode ser negativa em alguns pacientes durante a primeira semana após o início da doença e os seus cículos decl inam rapidamente na convalescença. A identificação do vírus pelo mémdo de PCR é possível, embora pouco acessível na prática clínica. Embora o ami-HEV lgG seja mais duradouro que o antiHVE lgM, alguns pacientes já têm o anti-HEV lgG negativo após seis a 12 meses depois da infecção. A persistência variável do ami-HEV lgG dificulta a determinação da freqüência da exposição prévia do vírus e levanta a possibilidade de reinfecção após desaparecimento dos anticorpos.
2. 3.
American Academy o f Pediacncs Comm1rree on lnfecrious Diseases. Hepat iCIS A vacCine recomm endations. Pediarrics. 2007;120:189-99. Balistreri W, Schwarz KB. Virai Hepatitis. J Pediarr Gamoenrerol Nu r r. 2002;35(S1 ):S29-32. Ben1wal M, Kumar A, Kar P, Jilan i N, Sharma JB. Prevalence and severity of acure virai hepamis and fulm1nanr hepatitis du ring pregnancy: a p rospectlve swdy from
li.
norrh lndia. lndian J M ed Microbial. 2003;21:1 84-5. Brundage SC. F1tzparrick N . Hepatit is A Am Fam Physi-
5.
cians. 2006;7 3:2162-8. Clemens A SC. Fonseca JC. Azevedo
T.
Cavalcanti A, Sil-
veira TR, Cast ilho MC. et ai. Soroprevalência pa ra hepatite A e hepatite B em li centros no Brasil. Rev Soe Bras 6.
M ed Trop. 2000;33:1-10. Ferreira CT, Silveira TR, Pereira-Lima ). Hepatite A ln: Fer-
7.
rologia em pediat ria - diagnóstico e tratam ento. Rio d e janeiro: Medsi: 2003. p. 479-91 Fujiwara K, Yokosuka O, lmazek1 F, Mi k1 M, Su zuki K,
reira CT, Carvalho E. Silva LR. Gasrroenrerologia e hepa-
Oki ra K, et ai. A nalysis o f hepat itis A ví rus p rotein 2B in sera of hepamis A of vanous sevenCies. J Gastroenrerol. 8.
2007A2:560-6. Gendrel D, Launay O, Moulin F, Larnaudie S. Hau I, Laurenr C. et ai. Prophylaxis for com acrs of an index case of hepatitis A: immunoglobulins or vaccination7 Presse
Med. 2007;36:1072-7. Krawczynski K, A ggarwal R, Kamili S. Hepatitis E. lnfecr Dis Clin Norrh Am. 2000;14:669-87. 10. Krawczynsk 1K, Aggarwal R. Hepatit is E. ln: Schiff ER, Sorrell F, Maddrey WC. editors. Diseases o f the Liver. Phila-
9.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A hepatite E ai nda é desconhecida e a ausência de exames sorológicos na rede pública dificulta a detecção de casos. Seu diagnóstico ainda está localizado aos
592 ( Medicina laboratorial para o clínico
delphla: Lippinco tt-Raven; 1999. p. 849-60.
11. leach CT. Hepam1s A 1n the Untted Scaces. Ped1atr lnfecc D1s ). 2004;23:551-2. 12. Ouon1 CMC. Roquete MLV. Te1xe1ra ASS, Barreto AS. Ferre1ra AR. Hepames V1ra1s. ln: Penna FJ, Moca JAC. Roquete MLV. Onon1 CMC. Doenças do fígado e das vias biltares na tnfánCta - parce 2. Rto de )ane1ro: Medst: 1999. p. 79-82. 13. Parra 5, Kumar A, Tnved155, Pun M, Sann SK. Ann Maternal and fetal outcomes 1n pregnam women wtth acure hepatms E vtrus tnfecnon. lntern Med. 2007;47:28-33. 14. Roquete MLV, Ferre1ra AR, Onon1CMC. Hepames por outros vírus. ln: Ferre1ra CT. Carvalho E. S1lva LR. Gastroemerologia e hepatologia em pediacria - diagnóstiCO e tratamento. Rio de Janeiro: Meds1; 2003. p. 553-5.
15. Su CW, Wu JC. Huang YS, Huo TI, Huang YH, L1n CC. et ai. Companson of clintcal man1fesmions and ep1dem1ology between acure hepam1s A and acure hepatitis E 111 Taiwan. JGastr Hepatol. 2002;17:1187-91. 16. Tapia-Conyer R. Santos Jl. Cavalcami AM. Urdaneta E. R1vera L. Mamerola A. et ai. Hepatitis A 1n Lat1n Amenca: a chang1ng ep1demiologic patrern. Am J Trop Med Hyg.
1999; 61:825-9. 17. Teo CG. The two clinico-epidemiological forms of hepati(IS E. J Virai Hepat. 2007;14:295-7. 18. Yazigi NA. Balistreri W. Acu re and Chronic v1ral hepanns. ln: Suchy FJ. Sokol R). Balisrren WF. Liver disease in chtldren. Philadelphia: Lippincoct Williams & Wtlk1ns; 2001. p. 386-7.
Investigação laboratorial do paciente com hepatite pelo HAV e hepatite pelo HEV
593
46
Eliane Lustosa Cabral Gomez
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM HEPATITE PELO HBV E PELO HDV
HEPATITE PELO HBV
lipoprotéíco, cujo principal amígeno é o HBsAg (amígeno de superfície), que envolve uma partícula cenual composta
O vírus da hepatite B (HBV) foi o primeiro vírus causador de hepatite a ser identificado. Em meados dos anos 60, o antígeno Ausuália foi descoberro e subseqüentemente associado à hepatite. Em 1970, a panícula virai (partícula de Dane) foi visualizada e nos anos 80 o genoma do HBV foi seqüenciado, uma vacina segura e eficaz fo1 cnada e tratamentos foram instituídos. Ao mesmo tempo, testes diagnósticos foram desenvolvidos, permitindo compreender-se a história natural da doen-
do an tígeno denom1nado core (HBcAg). Este último encerra o DNA virai (HBV-DNA). a DNA polimerase e o amígeno "e" (HBeAg) que só é detectável quando ocorre replicação virai. Além dessa partícula completa, duas outras menores, com 22 nm, formaLo esférico e tubular, comendo apenas o HBsAg. podem ser encontradas. enrretamo. embora imunogênicas. não são 111fecrames. po1s não possuem
ça e sua associação com o heparocarcinoma primário.
o DNA do vírus B. Quando se pesquisa o HBsAg. todas essas três partículas são detectadas, o que explica por que o HBsAg não se correlaciona com infecrividade. Todos os
Desde então, novos avanços vêm sendo alcançados no
anrígenos descritos geram amicorpos que, em conjunto,
emend1memo do vírus e da infecção e no desenvolvimento de novos tratamentos e vacinas mais eficazes. A
são utilizados para o diagnóstico, permi tindo acompanhar
despeiro de rodo esse esforço, quase três décadas após a Introdução da vacina, anualmente cerca de meio milhão de pessoas morre em decorrência de doenças hepáticas crónicas associadas à infecção pelo vírus da hepatite B, incluindo cirrose e heparocarcinoma.
apresenta o esquema da partícula de Dane e o sistema de anrígenos e amicorpos utilizados. Até o momemo. oiro genóripos. A-H, que d1ferem em mais de 8% em sua seqüência foram Identificados. Os genótipos podem ter pacogenicidade e epidemiolo-
sorologicameme a evolução da doença. A Figura 46.1
gia diferences, o que tem sido escudado.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO EPIDEMIOLOGIA E FORMAS DE TRANSMISSÃO
AGENTE ETIOLÓGICO O HBV é um vírus DNA. membro da família hepadnavmdae. Possui forma de dupla concha, tem 42 nm de diâmetro e é composro de um invólucro externo
Cerca de dois bilhões de pessoas - um terço da população mundial - têm evidência sorológica de exposição ao HBV e aproximadamente 350 milhões delas apresentam a forma crónica de infecção pelo vírus.
HBV
HBsAg (Porlicuio compleoc)
HBcAg* (we - cemel
namia, amalgia, febre, náusea, vômiw, inapetência, dor epigáscrica seguida do escurecimento da urina, clareamemo das fezes e surgimento da icterícia. Nesta fase estão presentes as alterações bioquímicas e os marcadores sorológicos. Em alguns indivíduos a doença cursa sem icterícia, em outros, muito raramenre, predomina a icterícia, a chamada forma colestática, que pode se prolongar por oiro a 29 semanas, com completa recuperação.
HBeAg
DNA DNA
{orooe'r<> el • HBcAg não é deroc16vel no sangue
Figura 46.1 - Representação esquemática do HBV - antígenos e anticorpos ucthLados para o diagnóstico e acompanhamento.
O Ministério da Saúde estima que pelo menos 15% da população brasileira já tiveram comaco com o HBV e que os casos crônicos representem 1% da população. Como em codo o mundo, no Brasil há grande variação regional na prevalência da infecção com áreas de alta prevalência. como na Bacia Amazônica, e prevalência 1ntermed1ár1a e ba1xa, como no Sudeste. A maior1a das pessoas desconhece seu estado de portador. O período de incubação é de 15 a 180 dias e a transmissão se faz por diversas vias: parenteral (principalmente através do uso de drogas injetáveis), vertical e, a mais 1mportame delas atualmeme, sexual (hetero e homo). Em 37% dos casos. a fome de comág1o não é identificada. Devido às medidas de prevenção adoradas (sorologia em gestantes e vacinação), a incidência da infecção aguda vem declinando ao longo do tempo. O nsco de evolução para a forma crônica é maior quanto menor for a idade do paciente no momento em que ele adquire a infecção pelo HBV, variando de 5 a 10% nos adultos, 30% nas crianças de um a cinco anos, a 90 a 95% nos neonatos.
APRESENTAÇÃO CLÍNICA A mfecção pelo HBV. na maioria dos casos, é subclínica, passando despercebida. Geralmente o diagnóstico é feito na triagem de doadores de sangue ou quando já em fase avançada da doença crônica. Apenas 25 a 30%dos pacientes cursam com hepatite aguda clinicamente evidente. Na forma aguda típica, os stnais hepáticos são precedidos por manifestações prodrômicas inespecíf1cas: adi-
TRANSMISSÃO VERTICAL O perfil sorológico materno ao nascimento é um importante fator de risco para a transmissão vertical. A presença do HBeAg com níveis elevados de HBV-DNA está associada a risco aumentado de transmissão (70 a 90%aos seis meses de idade) e evolução para a infecção crônica (i 90%). Quando a mãe é HBeAg negativo, o risco de infecção pennatal vana de 10 a 40%. As cnanças nasc1das de mães HBsAg positivo que não adquirem a infecção pelo HBV ao nascimento permanecem em risco elevado de se infectar até os cinco anos de idade. A identificação das mães HBsAg positivo é fundamental para prevenirem-se as infecções perinatais e as que ocorrem até os cinco anos de idade, através do uso da imunoglobulina e vacina. A combinação da imunoglobulina e vacina aplicadas nas primeiras 12 horas após o nascimento previne a transmissão perinatal do HBVem aproximadamente 95% dos casos.
PROFILAXIA Em vários países onde programas de vacinação foram adorados, pôde-se verificar o declínio da infecção pelo HBV e suas conseqüências, como, Taiwan, Itália, Alasca e África do Sul. A vaCina é de alto poder imunogênico e destituída de efeitos colaterais importantes. Administram-se três doses em 1njeções intramusculares, no músculo dekólde (zero, 30 e 180 dias). No recém-nascido, administra-se a primeira dose nas primeiras 12 horas para evitar-se a transmissão vertical. A vacinação está indicada nos grupos de r~sco e quando há história de comato sexual e familiar e na criança no primeiro mês de vida, já fazendo parce do calendário oficial de vacinação brasileiro, da criança e adolescente até os 19 anos.
596 ( Medicina laboratorial para o clínico ]\-- - -- -- - - - - -- -- - -- - - - - -- -- - - - - -
A imunoglobulina humana anri-HBV é adm inistrada quando há risco imineme de contaminação, em indivíduos não vacinados, como no recém-nascido de mãe portadora do HBV e vítima de exposição acidental a sangue de portador do HBV.
EXAMES LABORATORIAIS NA INFECÇÃO PELO HBV
ALTERAÇÕES LABORATORIAIS GERAIS As alterações b1oquímicas são comuns a codos os tipos de hepatite wal. não permitindo distinguir um tipo do outro. Nas hepatites agudas por vírus ocorrem os maiores aumentos das aminouansferases, que alcançam níveis geralmente 20 vezes superiores ao maior valor de referência (MVR), podendo chegar a 100 vezes. Caracterisncameme, há o predomínio da alan ina aminouansferase (ALT) sobre a asparcaco aminocransferase (AST). A elevação das aminmransferases é a primeira alteração detectável e geralmente precede a hiperbilirrubinemia e pode, em alguns casos. se prolongar por mais de três meses. Quando presente, a hiperbilirrubinemia é predominantemente à custa da bilirrubina direta e raramente ultrapassa a quatro semanas. Nas formas colestáticas persistentes, a bilirrubina direta se liga à albumina, formando a chamada bilirrubina delta, que passa a rer a meia-vida da albumina, aproximadamente 21 dias, e não é mais excretada pelo rim. Isco vem explicar pacientes com hiperbilirrubinemia direta sem hiperbirrubinúria durante a fase de convalescença da sua doença e pacientes com recuperação clínica satisfatória com declín io mais demorado dos níveis de bilirrubina di reta do que o esperado. A fosfatase alcalina e a gama-glutamiltransferase não apresentam elevações importantes, salvo se ocorre colesrase significativa. Na forma crónica, a elevação das aminotransferases é geralmente menor que cinco vezes o maior valor de referência, podendo, inclusive, estar dentro do valor de referência. Há predomínio da AST sobre a ALT. As formas fulminantes são caracterizadas por quedas bruscas dos níveis das aminmransferases, acompanhadas por elevações das bilirrubinas.
DIAG NÓSTI CO SOROLÓG ICO Rocineiramenre, se1s marcadores sorológicos estão disponíveis, podendo ser utilizados para o diagnóstico de hepatite aguda e crónica, para o acompanhamento e avaliação de pacientes com a forma cônica, bem como para auxiliar na indicação e monirorização do tratamentO. São eles: o HBsAg e seu anticorpo, o ami-HBs; o HBeAg e seu anticorpo, o anti-HBe; o anci-HBc lgM e o antiHBc rotai (o amígeno HBcAg não é utilizado por não ser detectável no sangue, somente no fígado).
HBsAg (antígeno de superfície do vírus B)
O HBsAg é detectável tanto na infecção aguda quanna crónica. Sua presença indica infecção em curso. O HBsAg não é adequado para avaliar infecrividade ou replicação virai e seus níveis não podem ser correlacionados com a atividade da doença no tecido hepático. O HBsAg é o primeiro marcador sorológico a aparecer. podendo ser detectado uma a duas semanas após exposição ao vírus, estando geralmente presente quando os sintomas se manifestam. Na infecção aguda, autolimirada, desaparece na fase de convalescença, dois a quauo meses após seu surgimento. Na hepatite aguda fulminante. pode estar ausente, pois nessas circunstâncias ocorre seu rápido clareamento, inclusive com surgimentO do anti-HBs em alguns pacientes. A persistência do HBsAg por mais de seis meses é o critério utilizado para definir a infecção crónica. Em pacientes com a forma crónica da hepatite, pode ocorrer o clareamento espontâneo do HBsAg, com ou sem aparecimento do anri-HBs, em taxas que variam de 0,4 a 2,0% ao ano. Esses pacientes devem ser avaliados com cautela. tendo em vista a possibilidade de persistência do HBV-DNA com manutenção da replicação virai em baixos níveis em alguns deles. tO
HBeAg (antíge no "e" do vírus B)
O HBeAg é geralmente detectável uma semana depois do surgimentO do HBsAg. Na infecção aguda aurollm1tada, desaparece em rorno de duas a seis semanas após. A sua persistência, decorridas oiro a 10 semanas, sugere forre-
Investigação Laboratorial do paciente com hepatite pelo HBV e pelo HDV
597
meme a possibilidade de evolução para a forma crônica. A pesquisa do HBeAg só se justifica se o HBsAg for positivo. A existência do HBeAg indica replicação virai imensa, que se correlaciona com alta infectividade e doença ativa no fígado. A pesquisa do HBeAg tem s1do usada para separar, sorologicamente, os pacientes com infecção crónica (HBsAg positivo) em dois grupos: a) HBeAg positivo, que geralmente à biópsia apresentam hepatite crônica ativa e são denominados portadores de hepatite B crônica ativa; e b) HBeAg negativo. que geralmente não apresentam acividade inflamatória significativa no fígado nem elevação das aminotransferases e são assintomáticos. os chamados portadores "inativos". Alguns pacientes fogem a essa regra; embora HBeAg negativo (alguns inclusive anti-HBe positivo), têm HBV-DNA > 20.000 IU/m L. ALT elevada. persistente ou intermitentemente e apresentam doença hepática ativa. geralmente com evolução desfavorável e pior resposta ao tratamento. Verificou-se que isto era devido a uma mutação que impedia a produção do HBeAg. Esses pacientes passaram então a integrar um terceiro grupo de pacientes com a doença crônica. chamado de portadores de hepatite B crônica aciva HBeAg-negacivo. O quadro 46.1 apresenta esses crês grupos. Os pacientes HBeAg negativo, anti-HBe positivo ou não, devem periodicamente ser acompanhados com a ALT. Aqueles com quadro clínico e/ou laboracorial sugestivo de doença at1va podem ser portadores do vírus mutante. Nos paoentes com hepatite crôn1ca ativa, a taxa anual de soroconversão espontânea do HBeAg para anciHBe varia de 2.7 a 27%.
Anti-HBc lgM (anticorpo lgM contra o antígeno core do vírus B)
A existência do anci-HBc lgM 1ndica 1nfecção aguda. O ant1- HBc lgM é o primeiro anticorpo detectável que aparece junco ou pouco ames da elevação das aminocransferases e persiste por seis a 12 meses se ocorre cotai recuperação da doença. Na ocorrência da chamada "janela imunológica" (intervalo entre o desaparecimento do HBsAg e o aparecimento do anti-HBs) e nos pacientes com hepatite aguda fulminante, junco com o amiHBc total podem ser os únicos marcadores detectáveis.
598 ( Medicina laboratorial para o clínico
Nos pacientes que evoluem para infecção crônica, o anti-HBc lgM pode persistir positivo em baixos títulos que. no entanto, não são detectáveis pelos métodos rotineiramente utilizados. o que garante sua utilização como marcador de rnfecçào aguda.
Anti-HBc total (anticorpos totais contra o antígeno core do vírus B)
O ami-HBc mcal é o melhor marcador de exposição ao vírus B e o marcador de escolha para estudos epidemiológicos. pois está presente canto na infecção aguda quanto na crônica e nos pacientes que se recuperam completamente da doença. É freqüente o encontro do anti-HBc isolado, sem outros marcadores sorológicos para hepatite B. Esse achado pode ser acribuído a resulcados falso-positivos ou à Infecção pregressa em paoemes que não produzem resposta detectável de ami-HBs. mas também pode ser dev1do à infecção crónica em curso. Oucra situação em que o anti-HBc isolado ocorre é nos pacientes infectados com o vírus da hepatite C. A pesquisa do HBV-DNA ajuda a esta belecer ou excluir a infecção pelo HBV.
Anti-HBe (anticorpo contra o antíge no "e" do vírus B)
O anti- HBe geralmente é detectável logo após o desaparecimento do HBeAg. O surgimento do antiHBe é um evento favorável. tanto na mfecção aguda quanto na crônica. Na infecção aguda, indica que a doença entrou em fase de resol ução. Geralmente, seu aparecimento coincide com o declínio dos níveis de HBsAg nos pacientes que se recuperam completamente da infecção aguda. Persiste detectável por um a dois anos. Alguns indivíduos não desenvolvem níveis dececcáve1s de anr1- HBe. Nos pacientes com hepatite crónica, a presença do ami-HBe é geralmente associada ao chamado estado de portador "inacivo", em que o paciente apresenta discreta ou nenhuma atividade de doença no fígado, baixa infectividade e não há replicação virai. exceção feita aos pacientes portadores do vírus mutante não secretor de HBeAg e nas reacivações que geralmente ocorrem em paCientes 1munossuprim1dos.
Quadro 46.1 - Infecção crônica pelo vírus B Hepatite B crônica oliva
Estado de portador "inativo"
HBsAg
positivo > 6 meses
positivo >
HBeAg
positivo
negolivo
negativo
ALT
elevado*
no valor d e referência
elevad a*
HBV-DNA
> 20.000 IU/ ml
< 2.000 IU/ ml
> 20.000 IU/ ml
Fígodo
hepatite em o tividode
pouco ou nenhuma a tividade inflamatória
hepatite em alividode
6
meses
Hepatite B crônica ativa HBeAg-negativa (vírus mutante) po sitivo > 6 meses
'A ALT pode esw elevada. perSIStente ou 111cerm1tentemente
Anti-HBs (anticorpo contra o antígeno de superfície do vírus B)
O anti-HBs é um anticorpo protecor, neutralizante e, na maioria dos casos, indica recuperação da infecção e im unidade. Embora o anti-HBs seja produzido precocemente na infecção aguda, é o último anticorpo a ser detectável, em função da grande quantidade de HBsAg, que impede sua detecção, o que resulta na chamada "janela imunológica" (intervalo entre o desaparecimento do HBsAg e o aparecimento do anti-HBs). Com o desenvolvimento de reagentes cada vez mais sensíveis para a detecção do HBsAg e do anti-HBs, a tendência é de que seja cada vez mais raro observar-se a ocorrência da "janela imunológica". Após vacinação, com as atuais vacinas compostas apenas de HBsAg, é o único anticorpo presente. Aproximadamente 5 a 15% dos pacientes que se recuperaram clínica e laboratorialmente da doença não apresentam anti-HBs detectável, mesmo quando estimulados pela vacina. Alguns raros pacientes, tanto com infecção aguda quanro crónica, ap resentam concomitantemente o HBsAg e o anti-HBs. O anti-HBs é geralmente dirigido para um subdeterminante diferente do HBsAg. Esse fato se correlaciona com replicação virai e inflamação ativa.
DIAG NÓSTICO MOLECULAR As técnicas moleculares para a detecção e quantificação do HBV-DNA podem ser divididas em dois ti pos básicos: a) técnicas com amplificação prévia do DNA. com poder de detecção de quantidades tão pequenas quanco 10 cópias/ml, como a reação em cadeia da polimerase
(PCR). a mais utilizada, entre outras; b) técnicas sem amplificação prévia do DNA. também referidas como clássicas, com poder de detecção apenas de quantidades superiores a 105 cópias/ml, como o slot/dot blot, a hibridização líquida e a captura híbrida. Mais recentemente, foram desenvolvidas modificações que permitem amplificar o sistema de detecção utilizado nas técnicas sem amplificação, a fim de aumentar seu poder de detecção, que passou para quantidades superiores a 5 x 103 cópias/ml e que são referidas como técnicas com amplificação do sinal. como a ramificação do DNA (bDNA- branched DNA) da Bayer e a captura híbrida de segunda geração da Digene. As técnicas com amplificação do sinal são mais reproduzíveis e apresentam melhor padronização do que a PCR que, por sua vez, possui mais poder de detecção, embora ap resente tam bém o maior coeficiente de variação, estando sujeita a diversas interferências. Uma evolução da técnica de PCR, chamada PCR em tempo real (Real Time PCR), que detecta o DNA simultaneamente à sua amplificação, é mais sensível e amplia a faixa de detecção do HBV-DNA. A maioria dos esrudos sobre o HBV-DNA foi realizada utilizando-se as técnicas clássicas que possuem poder de detecção muito mais baixo do que os das novas técnicas. Conseqüentemente, grande parte do conhecimento acerca da cinética virai e sua relação com a clínica foi obtida com essas técnicas. Baseado nesse conhecimento, em uma conferência do National lnstitute for Health (N IH) de 2000 foi estabelecido ovalor de HBV-DNA superior a 20.000 IU/m l (1 05 cópias/ ml) como critério diagnóstico para hepatite crónica ativa, que está sendo utilizado até o momento. Entretanto, existem trabalhos demonstrando doença ativa e cirrose em níveis de HBV-DNA inferiores a 20.000 lU/
Investigação Laboratorial do paciente com hepatite pelo HBV e pelo H DV
599
ml e que nos pacientes com hepatite crônica ativa podem ocorrer variações significacivas nos níveis do HBVDNA. Hoje, o maior desafio na utilização das técnicas moleculares, na infecção pelo HBV, é definir qual nível de HBV-DNA se associa à doença hepática crônica ativa e com resposca ao uatamenw. Ourros achados obtidos a partir da ucilizaçào das técnicas moleculares de maior poder de detecção merecem atenção: • a ucilização da PCR, seja quamicaciva, seja qualitativa, tem levado à detecção do HBV-DNA em maior número de casos não deteccados pelos outros mécodos, em que há doença ativa e nos quais o paciente poderia talvez se beneficiar do tratamento. Por outro lado, a PCR tem também detectado o HBV-DNA em diversas circunstâncias não relacionadas à doença ativa, inclusive em pacientes considerados plenamente recuperados clínica, bioquímica e sorologicamenre (HBsAg negativo, anti-HBs positivo) da infecção aguda; • o HBV-DNA é positivo quando se utiliza a PCR qualitativa na maioria dos pacientes HBsAg positivo e também pode ser detectado em pacientes com hepacocarcinoma e que são soronegativo ou apresentam anti-HBs e/ou ami-HBc; • os resultados obtidos com técnicas diferentes não são comparáveis. Numa tentativa para equipará-las a Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu um padrão internacional para o HBV-DNA, expresso em unidades internacionais (lU), que todos os reagentes devem adorar para expressar a quantidade de HBVDNA por mililiuo (IU/ml). A detecção qualitativa do HBV-DNA por PCR tem sido utilizada para monicorização de reinfecção pelo vírus B após transplante hepático, para avaliação de pacientes com hepatite crônica soronegativo ou com padrões sorológicos não habituais.
UTiliZANDO OS MARCADORES INFECÇÃO AGUDA O diagnóstico de infecção aguda pelo vírus Bé feico pelo ami-HBc lgM, com ou sem HBsAg detectável (Figura 46.2).
600 [ Medicina laboratorial para o clíni co
De acordo com o Ministério de Saúde, o acompanhamemo clínico de pacientes com hepatite B aguda deve compreender consultas médicas quinzenais no primeiro mês e consultas mensais até a resolução do quadro. De modo geral, o quadro se resolve em um período inferior a três meses. Pacientes que persistem com evidências de replicação virai (HBeAg positivo) após o terceiro mês têm maior probalidade de desenvolverem formas crônicas e devem ser encaminhados a serviços de referência. A constatação da resolução da infecção é feita pela detecção do anti-HBs, indicador de recuperação e imunidade, associada à negativação do HBsAg, que ocorre cerca de seis meses após a contami nação.
INFECÇÃO CRÔNICA PELO HBV O critério para o diagnóstico de infecção crônica é a persistência do HBsAg por mais de seis meses. A pesquisa de HBeAg, a dosagem da ALT e a quantificação do HBV-DNA permitem separar esses pacientes em três grupos (Quadro 46.1). O HBeAg associado à elevação de ALT (> 2 X MVR) sugere hepatite crônica ativa, enquantO que o HBeAg negativo associado à ALT nos valores de referência é compatível com o estado de portador inativo, no qual há pouca ou nenhuma atividade inflamatória no fígado. Já a ALT elevada em pacientes HBeAg negativos leva à suspeita de doença ativa, que ocorre nos portadores do vírus mutante (Figura 46.3). Atualmente, a American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) recomenda que os pacientes HBeAg negativo com ALT alterada devam ser acompanhados com a dosagem da ALT e quantificação do HBVDNA a cada três a seis meses. Níveis de HBV-DNA > 20.000 IU/ml são compatíveis com infecção crônica ativa, o que sugere a existência do vírus mutante. Níveis de HBV-DNA entre 2.000 IU/ml e 20.000 IU/ml com ALT elevada (entre 1 c 2 x MVR) devem ser acompanhados a cada três meses e, se persistirem, deve-se considerar a possibilidade de biópsia para orientar conduta quanto ao tratamento. Níveis de HBV-DNA < 2.000 IU/ml com ALT abaixo de 1x MVR devem ser acompanhados a cada três meses no primeiro ano e, se não se alterarem nesse período, devem ser acompanhados a cada seis a 12 meses (Figura 46.3). Para mais aprofundamento nas
)1------ - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -
recomendações de 2007 da AASLD, sugere-se a leitura da referência bibliográfica número 1. O clareamento do HBeAg pode ser precedido por exacerbação do quadro de hepatite, manifestada pela elevação da ALT Os portadores inativos devem ser periodicamente acompanhados com a dosagem da ALT, tendo em vtsta a possibilidade de reativação.
TRATAMENTO - INDICAÇÃO E MON ITORIZAÇÃO DA RESPOSTA (AASLD) Arualmente, dtversas drogas e regimes (dose e duração) para o tratamento da infecção pelo HBV estão disponíveis. A escolha dependerá de fatores relacionados ao paciente e ao risco/benefício de cada terapêutica, sendo
Infecção em curso Replicação virai e alta infectividade Repetir após 8 semanas se HBsAg (+I
Infecção em curso* Ba ixos infectividode e replicação virai Acompa nhe com HBsAg após 8 semanas
algumas supressoras, o que implica uso prolongado, e outras que buscam erradicar a infecção. Os parâmetros laboratoriais para avaliação inicial do paciente e indicação do tratamento são o HBeAg, a ALT (> 2 x MVR) e a concentração do HBV-DNA (> 20.000 IU/ml). Os pacientes HBeAg positivo, antes de iniciar-se o tratamento, devem ser acompanhados por três a seis meses para verificar se ocorre soroconversão espontânea: HBeAg para anti-HBe. A resposta ao trat am ento, sob o ponto de vista laboratorial, está estabelecida para os pacientes HBeAg positivo e é definida como o clareamento do HBeAg (com ou sem aparecimento do anti-HBe), negativação do HBV-DNA por PCR e retorno da ALT aos valores de referência. Nos pacientes HBeAg negativo, sugere-se o uso da negativação do HBV-DNA por PCR.
Convalescença Janelo Imunológica Acompanhar**
Convalescença Considere recuperação e imunidade
Ausência de infecção em curso pelo HBV. Atenção para doto provável do contoto e período de incubação
Compatível com infecção crônica. (vide algortirno paro infecção crõnica fig 46-31
• Nem lodos os portentP• nesenvolvem níveis deteclóvetS de a nli·HBe. Quando presente, tndica que o infecção está em processo de resolução ' • 5o 15% dos paetentes nàc aoresentam an11·HBs detec1óvel
Figura 46.2 - Algommo para dtagnósrico e avaltação de infecção aguda.
Investigação Laboratorial do paciente com hepatite pelo HBV e pelo HDV
601
Hepatite crónica oliva Replicaçóo virai lnfectividade
Provável portador "inativo"( l). Acompanhar a cada 3 a 6 meses
Portador de hepatite crônica oliva HBeAg-negativa
Acompanhar níveis de ALT e HBV-DNA a cada 3 a 6 meses
VR = Valor de Referência (1) HBV-DNA < 2.000 IU/ ml. Se houver indícios de hepatite crónica oliva, quantificar HBV-DNA N os pacientes HBeAg negativos o anti-HBe pode ser positivo ou negativo
Figura 46.3 - Algoritmo para avaliação de infecção crônica.
Ouuo objerivo a ser atingido é a perda do HBsAg ou
ESTUDOS EPIDEMIOLÓGICOS E APÓS VACINAÇÃO
soroconversão para ami-HBs. que quando ocorre se diz que houve resposta completa. Embora a negarivação do HBsAg se associe à maior sobrevida e mais baixo risco
Pa ra avaliação epidemio lógica, uti lizar o am iHBc wral.
de desenvolyimenco do hepawcarcinoma nos pacientes
Recomenda-se verificar a resp osra à vacinação um
com cirrose, necessariamente não significa que a erradi-
a dois meses após o seu término, ut ilizando o ami-HBs
cação virai renha eferivamente ocorrido e que o paciente
quantitativo, sendo os níveis acim a de 10 m UI/mL consi-
esteja livre de complicações futuras decorrentes da in-
derados prmewres.
fecção pelo HBV.
CONSIDERAÇÕES GERAIS
INFECÇÃO PREGRESSA Embora o ami-H Bc lgM possa estabelecer o O diagnóstico de infecção pregressa é feiro pelo
d iagnóstico de infecção aguda, recomenda-se utili-
achado de ami-HBc coral e anti-HBs. na ausência do HB-
zar inicialmente o ami-HBc lgM e o HBsAg, ramo
sAg e do anti-H Bc lgM.
na susp eira de infecção aguda quanto de crónica. A verificação d e ami-H Bc lgM, com o u sem H BsAg, es-
602 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1--- - - - -- - - - -- -- - - -- -- - -- -- - -- - --
rabelece o diagnóstico de infecção aguda, enquamo
Mediterrâneo, América do Sul, Oriente Médio, Oes-
que a ausência do anti-HBc lgM diante de HBsAg
te da África e certas ilhas do Pacífico Sul. Na Grécia e
sugere infecção crónica.
Irá lia era endêm ica. acometendo principa lmente crian-
A pesquisa do HBeAg só rem indicação quando o HBsAg é positivo.
ças e adultos jovens. Com a melhoria das condições socioeconômicas, as medidas de prevenção adoradas
O HBeAg é um marcador de replicação virai, correlaCio-
comra a AIDS e a insriruição de campanhas de vacinação contra o HBV, a incidência da infecção pelo HDV
nando-se com arividade de doença hepática. já o HBsAg não é marcador de replicação virai. nem se correlaciona com atividade de doença hepática. sendo apenas um marcador de infecção em curso. que pode ser crônica ou aguda. O anti-HBc roral é um marcador de exposição ao HBV, estando presente na infecção aguda, crónica e após a recuperação.
HEPATITE D Em 1977, o vírus da hepatite D (HDV) foi 1dentif1cado por Rizzerro et ai. através da imunofluorescência, no tecido hepático de pacientes com hepame B crónica.
sofreu importante declínio. Estima-se que, no mundo, aré 5% dos portadores do HBV renham superinfecção pelo HOV. No Brasil. não é comum. exceto em alguns locais da Amazônia. resuitos aos vales dos rios Juruá. Purus, Madeira e Tapajós. As principais vias de transmissão são a parenteral e sexual. em que ocorre exposição percurânea e permucosa ao sangue e fluidos corporais contaminados. A transm issão inrrafamiliar era comum e provavelmente associada às condições pobres de higiene. Nas áreas endêmicas. é a principal causa de hepatite fulminante, principalmente na supennfecção do portador do HBV.
FORMAS DE INFECÇÃO E APRESENTAÇÃO CLÍNICA ASPECTOS RElEVANTES DA INFECÇÃO
AGENTE ETIOLÓG ICO
A infecção pelo vírus D pode ocorrer de duas formas: co-infecção - infecção simultânea pelo HBV e HDV; e superinfecção - portador crónico de HBsAg é infectado pelo HDV. Uma terceira forma de Infec-
O HDV é um pequeno vírus RNA defecrivo, único represemanre da família deltavmdae que, para sua expressão e para induzir hepatite, depende da existência do vírus da hepatite
ção foi descrita, ocorrendo após cransplante de fígado. quando o HDV infecta o fígado cransplantado antes da infecção pelo HBV e é chamada de infecção subclí-
B. ln v1vo, o HDV infecta apenas o hepatóoro, onde pode se
nica ou latente pelo HDV.
replicar na ausência do HBV. que é necessário na formação de seu invólucro. O HDV é consriruído por uma cobertura externa composta de amígeno de superfície do HBV (HBsAg) e lipídeos, que comêm o RNA e o anrígeno delta (HDAg). Três genóripos foram descriws: I, 11 e III, que diferem em sua distribuição geográfica e parogenicidade. O genótipo li se associa à doença com melhor curso, enquanro que o genóripo III rem s1do assoc1ado a uma forma de hepatite mais grave e freqüenrememe fulmmame. O genótipo mais comum é o I.
O período de incubação é o mesmo da hepacire B no caso de co-infecção, sendo menor na superinfecção. Em geral. a co-infecção resulta em hepatite aguda aumlimltada, com menos de 7% dos casos evoluindo para a forma crónica. enquanto a superinfecção resulta em exacerbação do quadro existente e evolução para a forma crónica da hepatite D em mais de 70% dos casos. Cerca de 70 a 80% das infecções crónicas evoluem para mrose. A co-infecção costuma apresentar curso bifásico, com
EPIDEMIOLOGIA E FORMAS DE TRANSMISSÃO
dois picos de necrose hepática, separados por algumas semanas. cada um deles associado a um dos vírus. No caso da superinfecção, a apresentação clínica dependerá se o portador do HBV rem doença ativa ou não. De qualquer forma, o risco de hepatite fulminante é elevado.
A 1nfecção pelo HDV rem sido enconrrada em codo o mundo, sendo mais prevalente em torno do mar
Investigação Laboratorial do paciente com hepatite pelo HBV e pelo HDV
603
EXAMES lABORATORIAIS NA INFECÇÃO PELO H DV As alterações bioquímicas são comuns a todos os vírus causadores de hepatite, entretanto, na co-infecção pelo HDV/HBV, podem ocorrer dois picos de elevação das aminotransferases associados à necrose hepática produzida pelos vírus, que ocorrem em momentos diferentes. O diagnóstico de infecção pelo vírus D é muitas vezes difícil e na prática depende da forma de infecção, baseando-se na detecção de anticorpos para o HDV e de marcadores sorológicos do HBV, e quando disponível. na pesquisa do HDV-RNA (Figura 46.4). A detecção do amígeno do vírus D (HDAg) é pouco utilizada na prática.
Figura 46.4 - Infecção aguda pelo HDV (padrões habituais).
CO-INFECÇÃO- HDV/HBV O diagnóstico é feito pela verificação de ami-HDV lgM e/ou HDV-RNA, na presença de ami-HBc lgM; o HBsAg pode estar presente ou não. Só se estabelece o diagnóstico de co-infecção quando se diagnostica infecção aguda pelo HBV em associação com infecção pelo HDV. O diagnóstico sorológico é difícil porque os anticorpos para o HDV se desenvolvem em baixos títulos e tardiamente. É necessária a repetição seriada da pesquisa de anticorpos durante algumas semanas, se há suspeita de hepatite D aguda e não se dispõe da pesquisa do HDV-RNA por PCR. O HDV-RNA é detectável ames do aparecimento dos anticorpos e está presente transitoriamente no caso de hepatite aguda autolimi tada. O anti-HDV lgM pode ser deteccável duas a três semanas após o aparecimento dos sintomas, raramente persistindo por mais de dois a três
meses nas infecções autolimitadas. A persistência do amiHDV lgM e do HDV-RNA alerta para possível evolução para a forma crônica. Em geral. os títulos de anti-HDV total são caracteristicamente baixos e não duradou ros.
SUPERI NFECÇÃO - HDV/HBV O diagnóstico é feito pelo achado de anti-HDV lgM e/ou HDV-RNA e HBsAg. O anti-HBc lgM é negativo. Essa forma de infecção é caracterizada pelo desenvolvimento precoce de anti-HDV lgM e lgG, em títulos sustentados. O HDV-RNA é detectável antes do surgimento dos anticorpos. Quando há resolução completa da doença, o que é pouco comum, o anti-HDV e o HDVRNA desaparecem. Usualmente, há evolução para infecção crônica, com persistência desses marcadores. O HDV-RNA correlaciona-se com replicação virai e doença hepática ativa. Nos pacientes que apresentam resposta sustentada ao tratamento, torna-se indeteccável. O anti-HDV total em altos tícu los pode ser devido à infecção crônica pelo vírus D (HDV-RNA é positivo) ou à infecção pregressa; neste caso, o anti-HDV lgM e o HDVRNA estão ausentes.
CONSIDERAÇÕES FINAIS Só se faz o diagnóstico de infecção pelo HDV em pacientes infectados pelo HBV. sendo: co-infecção quando o anti-HBc lgM é positivo; e superinfecção quando HBsAg é positivo e o anti-HBc lgM é negativo. O diagnóstico de co-infecção é mais difícil de se estabelecer do que o de superi nfecção, porque na coinfecção os anticorpos para o HDV apresentam baixos níveis, podem demorar a aparecer e são detectáveis por um curto período de tempo.
REFERÊNCIAS Alter MJ Epidemiology and prevention of hepatitis B. Sem Liver Dis. 2003;23(1):39-46. 2. Broderick AL, Jonas MM. Hepatitis B in Children. Sem Liv Dis. 2003;23(1):59-68. 3. Brasil. Ministério da Saúde. Hepatit es Virais: o Brasil está atento. Brasília: M 1n1stér1o da Saúde; 2005. 1.
604 ( Medicina la boratorial para o clínico )f-- - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - -
4. 5.
6.
Fartov1ch G. Natural H1srory and prognosis of hepatitis B. Sem Liv Dis. 2003;23(1):47-58. Feld JJ. Hearhcore J. Hepamis Be Anr1gen-Posirive Chron'c Hepat1ns B: Natural H1story and Trearmem. Semin Liv DIS. 2006:26(2):116-29. Fonseca JCF. Epidemiologia. ln: Foccacia R. Tratado de Hepames Vira1s. 2• ed. São Paulo: Atheneu; 2007. p. 325·7.
11. Pawlorsky )M. Molecular D1agnosis of virai hepariris. Gas-
troenrerology. 2002;1 22:1554-68. 12. Regev A. Schiff E. Clinical fearures of hepariris. ln: Howard CT. Lemon S. Zuckerman A). Virai Hepariris. 3rd ed. Massachussem : Blackwell; 2005. p. 33-49. 13. Rosina F. Rizzen o M. Epidemiology and natural hisrory hepariris D víru s. ln: Howard CT. Lemon S. Zuckerman A).
7. GermanidisG. Pawlocsky JM. De[ecção do DNA virai: Mé-
Virai Hepa[i[IS. 3rd ed. Massachussem: Blackwell; 2005. p
todos de Quantificação. ln: Foccacia R. Tratado de Hepa· rires Virais. 2nd ed. São Paulo: Arheneu; 2007. p. 205-9. 8. Hadziyannis SJ. Paparheodoridis GV. Hepariris B e Anti· gen-Negarive Chronic Hepariris B: natural Hisrory and Trearmenr. Semin Liver Dis. 2006;26(2):130-41. 9. Lok ASF, McMahon BJ. AASLD Praerice Guidelines: Chronic Hepariris B. Heparology. 2007:45(2):507-39 10. Margolis HS. Alter M). Hadler SC. Heparir1s B: evolving epidemiology and impl1 cat1ons for conrrol. Sem L1ver Dis. 1991;11(2)84-92.
583-9. 14. Servoss JC. Friedman LS. Diesrang )L. Diagnosric approach to virai hepatitis. ln: Howard CT. Lemon S, Zuckerman A]. Virai Heparitis. 3rd ed. Massachussem: Blackwell; 2005. p. 50-64. 15. Smedile A, Rizzetto M, Pagan1n S. Históna Natural. Transmissão. lmunodiagnósrico. ln: Foccacia R. Tratado de He· parires Virais. 2• ed. São Paulo: Arheneu; 2007. p. 313-24.
Invest igação Laboratorial do paciente com hepatite pelo HBV e pelo HDV
605
Eliane Lustosa Cabral Gomez
47
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM HEPATITE PELO HCV
Em 1989, Choo et a/., utilizando técnicas moleculares, identificaram o vírus da hepatite C (HCV), cujo genoma foi clonado e seqüenciado e testes diagnósticos foram posteriormente desenvolvidos. Hoje, sabe-se que a infecção pelo HCV é uma importante causa de doença crônica hepática, cirrose e hepatocarcinoma, sendo responsável por cerca de 50% dos transplantes hepáticos em adulcos nos países do Ocidente.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
AG ENTE ETIO LÓG ICO O agente causador da hepatite C é um vírus RNA da família jlaviviridae, do gênero hepacivirus. O vírus apresenta heterogenicidade genômica e até o momento pode ser classificado em seis genótipos, designados pelos números de um a seis, subdivididos em numerosos subtipos, denominados por letras do alfabeto.
EPIDEMIOLOGIA E FORMA DE TRANSM ISSÃO A hepatite C parece ser endêmica em várias regiões do mundo, entretanco, sua distribuição geográfica é muito variável. Segundo a mais recente estimativa da OMS, a infecção pelo HCV afeta mais de 100 milhões de pessoas, o que corresponde a aproximadamente
2,0% da população mundial. As prevalências mais altas fo ram relatadas em países da África e Ásia, sobretudo o Egito. As mais baixas estão na Alemanha (0,6%) e Canadá (0,8%). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima a prevalência no Brasil e grande parte da América Latina entre 1,0 e 1,9%. A pri ncipal via de transmissão do HCV é a parenteral. Até o advento dos testes de triagem sorológica em bancos de sangue, o HCV era importante causador de hepatite pós-cransfusional. Atualmente, a fonte de infecção pelo HCV mais importante é o uso de drogas injetáveis ilícitas. Entretanto, em alguns países em desenvolvimento, agulhas e seringas contaminadas e a transfusão ainda são a principal fonte de infecção. Nos Estados Unidos e Austrália, o uso de drogas endovenosas é relatado em 48 e 80% dos casos de infecção pelo HCV, respectivamente. A transmissão ocupacional, vertical, sexual e por convívio domiciliar é de ocorrência mais rara. Em uma parcela sign ificativa de casos (10 a 70%), não se consegue definir a forma de transmissão. No Brasil, a realização da triagem sorológica para o HCV é obrigatória em bancos de sangue desde 1993, contudo, segundo dados do Ministério da Saúde, entre os casos notificados entre 2001 e meados de 2006 (n=54804), as fomes de infecção mais relatadas são: a transfusão (13.9%), o uso de drogas endovenosas (12,6%) e a via sexual (8,8%). Em 53,4% dos casos o dado é relatado como ignorado ou não consta da nocificação.
APRESENTAÇÃO CLÍNICA A infecção pelo HCV, na maioria dos casos, é assinwmárica, sendo surpreendida em exames de rocina, na seleção de doadores em bancos de sangue ou em fase avançada, quando Já apresenca complicações decorrentes de doença crôn1ca. O período de 1ncubação varia de cinco a 26 semanas. Menos de 1% dos indivíduos infectados pelo HCV relata doença aguda associada à icterícia. Quando presemes, os s1ncomas são geralmente inespecíficos. como anorex1a, náusea e adinamia. Na infecção crônica, a queixa mais comum é a fadiga seguida por desconforw no quadra nte superior direiw. A infecção crônica pelo HCV pode ainda apresentar várias manifestações extra-hepáticas, principalmente algumas relacionadas à auto-1mun1dade. destacando-se a crioglobulinemia. que ocorre em 36 a 59% dos casos, além de glomeru lonefrite membranoproliferaciva, cireoidices, porfiria cutânea tardia. entre oucras. Dados recentes sugerem que os indivíduos que apresentam infecção aguda sintomática com icterícia cêm mais chance de cer infecção auwlimicada. A maioria (60-80%) dos indivíduos infectados pelo HCV apresenta infecção persisteme e desenvolve doença hepática crônica. sendo que 5 a 20% desenvolverão cirrose. Na maioria dos casos de doença crônica pelo HCV, o diagnóstico é fe1to 15 a 25 anos após a infecção cer sido adquirida. Estudos sobre a h1scória natural da doença têm demonstrado que a hepatite crônica leva 15 a 18 anos para se desenvolver. a cirrose 20 a 25 anos e o hepatocarcinoma 28 anos. O mecanismo envolvido na hepatocarcinogênese induzida pelo HCV não está esclarecido. Não foi ainda demonstrada imegração do genoma virai no genoma do hepatócito. Assim, acredita-se que o processo inflamatório crônico e a necrose persisteme de hepatócitos devam ter papel importante no surgimento de hepatocarcinoma.
predomínio da alanina aminou ansferase (ALT) sobre a aspartato aminorransferase (AST) é a alteração bioquímica característica que ocorre na hepatite aguda causada por vírus. As alterações bioquímicas são comuns a rodos os tipos de hepatite virai. não permitindo disringuir um ri po do ourro, emreramo, o aumenco intermitente das aminocransferases sugere infecção pelo HCV. Como raramente a infecção aguda cursa com sintomas, é incomum surpreender a elevação característica das aminotransferases. Nos pacientes com 1nfecção crôn1ca, cerca de 30% apresentam a alanina aminotransferase (ALT) no valor de referência. Nos restantes, observam-se aumentos d iscretos e intermitentes. Por não evo luir freqüememente com colestase. a fosfatase alcalina encontra-se normal ou pouco aumentada. Um achado freqüente nos pacientes portadores de hepatite crônica pelo HCV é a presença de vários auro-anticorpos. como fator reumatóide, anticorpos antin ucleares. antimúsculo liso, ecc. A plaquetopenia também pode ser freqüente na infecção crônica pelo HCV.
PRINCÍPIOS GERAIS DO DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO O diagnóstico de infecção pelo vírus C é feiro pela detecção de anticorpos rotais contra o vírus C (antiHCV) e pela detecção de seu RNA (HCV-RNA). O teste mais amplamente d 1fund1do e utilizado para a detecção de anticorpos para o vírus C em nosso meio. é o ensaio imunoenzimác1co. Mais recentemente, testes que dececcam e quantificam um anrígeno do core do vírus C e outro que detecta conjunramenre o antígeno core e o anri-HCV foram descriros. reduzindo-se o tempo entre a infecção e o diagnóstico. além de ser uma possível alternativa mais acessível e si mples do que os cesces moleculares, para estabelecer a presença de infecção ativa.
EXAMES LABORATORIAIS NA INFECÇÃO PELO HCV Pesquisa de anticorpos - Anti-HCV
ALTERAÇÕES LABORATORIAIS GERAIS A elevação das aminocransferases, geralmente acima de 20 vezes o maior valor de referência (MVR). com
608 [ Medicina laboratorial para o clínico
O ami-HCV está presente canto nos pacientes com infecção em curso, aguda ou crônica, quanto nos com infecção pregressa.
)1--- - - - - - -- - - -- - -- - -- - - -- - -- - - - -
Arualmenre, utilizam-se testes de terceira geração para a detecção do anti-HCV. A cada nova geração. esses testes incorporaram maior número de anrígenos, a fim de aumentar a sua sensibil idade, possibilitando a detecção mais precoce do anri-HCV (Figura 47.1). O ELISA de primeira geração apresema sensibilidade de 70 a 80%, o de segunda geração 95% e o de terceira geração 95 a 98%. Apesar do aumento da sensibilidade dos testes de segunda e terceira geração. a sua especificidade varia em função da população testada, sendo a ocorrência de resultados falso-positivos grande em populações de baixo risco, na qual o valor preditivo positivo de um teste de terceira geração é de apenas cerca de 25% e do teste de segunda geração de 50 a 60%, aproximadameme. Algumas reações de ELISA podem apresentar concentrações consideradas indeterminadas, ou seja. os níveis detectados tanto podem ocorrer em indivíduos com infecção quanto sem infecção. Nestes casos, o teste de imunoblot recombinante (RIBA) e HCV-RNA podem ou não auxi liar na defin ição do perfil sorológico (Quadro 47.1). A utilização do RIBA para a pesquisa do ami-HCV aumenta a especificidade da detecção do ami-HCV. O RIBA é um teste suplementar e está indicado para confirmar anti-HCV positivo na ausência do HCV- RNA. Quando positivo, sugere infecção pregressa e, quando negativo, que o resultado do ELISA era falso-positivo. Quando se utiliza RIBA, é possível saber para qual amígeno o anticorpo detectado é dirigido. O RIBA é considerado positivo quando há reatividade para pelo menos dois amígenos, o que aumenta sua especificidade em comparação ao ELISA Quando há reatividade para apenas um amígeno, o RIBA é considerado indeterminado. Core
Na infecção aguda, o anti-HCV pode ser detectado, em média, sete a oito semanas após a infecção ou segunda semana de doença, utilizando-se o ELISA de terceira geração, e 11 semanas após a infecção utilizando-se o ELISA de segunda geração. A detecção de anticorpos lgM não se momou útil para estabelecer o diagnóstico de infecção aguda, uma vez que o anti-HCV lgM persiste na evolução para a forma crônica. Caso não se disponha de provas de biologia molecular (que detecta a viremia ames do aparecimento do anticorpo), sugere-se a pesquisa do anti-HCV em soros pareados com intervalo mínimo de IS dias, no caso de suspeita de hepatite aguda C e com o primeiro exame negativo. O diagnóstico de certeza de infecção aguda só é possível pela documentação da soroconversão.
Pesquisa de antígenos - core HCV
A fim de buscar alternativas mais simples e acessíveis do que os testes baseados em técnicas moleculares, testes que detectam e quantificam o amígeno core do HCV têm sido desenvolvidos. Estudos comparando estes restes com a detecção qualitativa e quantitativa do HCV-RNA demonstraram que os níveis do core HCV se correlacionam com os de HCV-RNA, estando detectáveis um a dois dias após o aparecimento do HCV-RNA. A utilização destes testes que detectam o antígeno core poderia reduzir o tempo entre a infecção e seu diagnóstico em até quatro semanas. quando comparados com a pesquisa do anti-HCV. constituindo uma alternativa interessante para o diagnóstico da infecção pelo HCV. Entreta nto, estes testes ainda não estão sendo utilizados na rotina.
Envelope
I\
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 3' lJTR --l
Utilizando técnicas moleculares. três abordagens básicas podem ser feitas: detecção, quantificação e genotipagem do HCV-RNA
1• Geração 2° Geração •
Detecção do HCV-RNA - PCR qualitativa
J • Geração .
Figura 47.1 - Represemação esquemática do genoma do HCV e amígenos utilizados em cada geração do anti-HCV.
Investigação laborarorial do paciente com hepatite pelo HCV
A técnica mais amplamente utilizada para a detecção do HCV-RNA é a reaçào de polimerização em cadeia (Po-
609
limerase Chain React1on - PCR) e, mais raramente, a amplificação mediada pela cranscrição (Transcription-Mediated Amp/if,cauon - TMA). O poder de detecção dos testes qualitativos (10 a 50 IU/ml) é maior do que dos testes quantitativos e sua especificidade varia de 98 a 99%. O RNA do vírus C (HCV-RNA), acé o desenvolvimentO da pesqu1sa do antígeno core, era o único marcador disponível de infecção ativa capaz de discriminar infecção pregressa de infecção em curso. A sua presença correlaoona-se com infectividade. replicação virai e doença hepática. mas não diS[Ingue infecção aguda de crônica. O HCV-RNA pode ser detectado, por PCR qualitativa, uma a duas semanas após infecção pelo vírus C. precedendo a elevação da ALT em três semanas e o aparecimento dos sintomas em oito a 10 semanas. Na infecção aguda aucolimitada sua presença é transitória, em geral três a quacro meses. permanecendo positivo se há evolução para a forma crônica. IMPORTANTE: indivíduos com hepatite C crônica podem apresentar flucuações na concentração virai. Tendo isto em vista, uma única pesquisa do HCV-RNA negativo não é conclusiva e deve ser repetida. A detecção do HCV-RNA, por PCR qualitativa, é utilizada para estabelecer o diagnóstico, nos indivíduos anti-HCV posicivo, em pacientes imunodeprimidos, em pacientes soronegacivo com hepatite crônica, após exposição ocupacional e para verificar a resposta ao uatamenro. Nos recém-nascidos de mãe com infecção pelo HCV, uma vez que os anticorpos auavessam a barreira transplacencária, o diagnóstico é feita com a detecção do HCVRNA. Emretamo. o clareamenco espontâneo do HCV ocorre mais freqüememente em recém-nascidos. por isso. recomenda-se pesquisar o HCV-RNA apenas a partir dos seis meses de vida. A persistência do HCV-RNA após 12 meses de vida sugere evolução para forma crôn1ca.
Quantificação do HCV-RNA - PCR quantitativa e bONA
Duas metodologias estão disponíveis para a quantificação do HCV-RNA: amplificação do RNA, como no caso da PCR qualitativa (e mais raramente a TMA), ou hibridização com amplificação do sinal. como na ramificação do DNA (Branched DNA - bDNA). A fim de permitir uma comparação entre os diversos restes disponíveis, a
610 ( Medicina laboratorial para o clínico
Organização Mundial de Saúde (OMS) escabeleceu um padrão internacional para o HCV-RNA e a panir dele definiu uma unidade internacional (lU) que deve ser utilizada para expressar os resultados obt1dos na quantificação do RN A. De qualquer forma. a recomendação é de que se acompanhe um mesmo paciente com a mesma cécnica. Embora os cestes quantitacivos sejam menos sensíveis do que a PCR qualitativa, muitas vezes eles são usados no diagnóstico inicial do paciente anti-HCV positivo, uma vez que a maioria dos pacientes com infecção em curso pelo HCV apresenta níveis detectáveis pelos cesces quantitativos e o resultado pode ser utilizado para orientar no tratamento. Naqueles paciemes em que a quantificação do HCV-RNA seja negativa, deve-se realizar a detecção qualitativa do HCV-RNA. A especificidade dos testes HCV-RNA quantitativos varia de 98 a 99%
Genotipagem
A genotipagem pode ser feita por seqüenciamenco direco. por h1bndização reversa utilizando sondas específicas para cada genótipo ou por análise do pol imorfismo usando enzimas de restrição (RestnctJOn Fragment Lengh Polymorph1sm - RFLP). Utilizando estas técnicas é possível identificar todos os genótipos e mu1tos dos subtipos. Em menos de 3% dos casos não se consegue definir o genótipo e 1 a 4% apresentam infecções mistas (mais de um genótipo). Erros na identificação do genótipo são muito raros. mas erros na subtipagem podem ocorrer em 10 a 25% dos casos e, na sua maioria, está relacionada à região estudada e não à técnica. Uma vez que atualmente apenas o genóti po é ucilizado para decisões clínicas, os erros na subtipagem têm pouca conseq üência clínica. O genótipo do HCV tam bém pode ser determinado por sorocipagem, que é a detecção de anticorpos específicos para cada genótipo. A sorocipagem apresenta concordância de aproximadamente 95% com as técnicas moleculares. mas não é capaz de identificar os subtipos. Quando ocorre reatividade para mais de um genócipo, não é possível distinguir se há infecção mista verdadeira ou reação cruzada. A genotipagem deve ser realizada, em todo candidato ao tratamento, a fim de determinar o reg1me de tratamento (dose e duração) e a probabilidade de resposta ao mesmo.
] 1 - - - - - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - - - -
CONSIDERAÇÕES FINAIS INFEÇÃO EM CURSO: AGUDA OU CRÔ NICA PELO HCV Não existe nenhum marcador sorológico ou molecular que permita distinguir a infecção crónica da infecção aguda. Na prática, o que se consegue é estabelecer se há infecção em curso. Na suspeita de infecção pelo vírus C deve-se realizar a pesquisa do anti-HCV por ELISA. Os pacientes positivos devem ser submetidos à pesquisa do HCV-RNA por PCR qualitativa (Figura 47.2), que deve ser repetida caso seja negativa. antes de afastar infecção em curso. Nos pacientes HCV-RNA negativo, realizar a pesquisa do anti-HCV por RIBA para distinguir infecção pregressa de resultado falso-positivo. Pacientes com sorologia indeterminada devem ser acompanhados e os marcadores devem ser repetidos decorridos pelo menos 30 dias. O Quadro 47.1 apresenta os perfis sorológicos mais freqüentes.
TRATAMENTO Em relação ao tratamento, a American Association for The Study of Liver Diseases (AASLD), a Jnjectious Diseases Society of America e a American College of Gastroenterology referendam as seguintes recomendações:
• o objetivo do tratamento, sob o pomo de vista laboratorial, é tornar indetectável o HCV-RNA pesquisado por técnicas qualitativas altamente sensíveis (como a PCR). de maneira sustentada (por mais de seis meses após o término do tratamemo); • a genotipagem deve ser realizada em todos os pacientes candidatos ao tratamento, uma vez que o genótipo definirá a dose e a duração do tratamento, que são maiores no genótipo 1;
Genotipogem, poro orientar trotamento. No genótipo 1, quantificar o RN A HCV
• Se dúvida repetir PCR após 1 mês
Figura 47.2- Algoritmo para avaliação de pacieme ami-HCV positivo utillizando marcadores sorológicos e moleculares. (~) Se RIBA não d1sponível. um ant1-HCV que utilize amígenos d1feremes do prime1ro ELISA. fala a favor de 1nfecçào prév1a.
Quadro 47.1 - lmerpretação dos testes sorológicos e moleculares para HCV Anti-HCV
RNA HCV
+I IIl i H
+
+ +
I I (+)
RIBA +I !ll l H
+
Interpretação Infecção em curso A positividade isolada de RNA HCV é rara e esses casos, quando em pacienles imunocompetentes, devem ser acompanhados com cautela Infecção pregresso Se dúvida repetir o PCR decorridos pelo menos 30 dias Resultado falso-positivo Se o RIBA não for disponível e o onti·HCV for fortemente positivo, pode· se repetir o onti·HCV com outro ELISA que usa antígenos diferentes do pri· meiro, que se positivo fala a favor de resultado verdadeiramente positivo Resultado indeterminado Repetir decorridos pelo menos 30 dias Ausência de infecção Atenção poro o tempo decorrido entre o cantata e o realização dos exames, se necessário repetir
+ posit1vo; · negat1vo; (I) 1ndeterm1nado
Investigação laborato rial do paciente com hepatite pelo HCV
6 11
• a quantificação do HCV-RNA está formalmente indicada nos pacientes com genótipo 1 e deve ser feita no início e na 12• semana de tratamento. O desaparecimento ou a queda de 2-log10 ou mais nos níveis do HCV-RNA, na 12• semana de tratamento, é chamado de resposta virológica precoce (RVP) e se associa à maior chance de resposta sustentada ao tratamento. Quando os níveis de HCV-RNA não apresentam queda, a chance de resposta ao tratamento é muito pequena e recomenda-se avaliar sua suspensão, o que deve ser feito individualmente; • a detecção qualitativa do HCV-RNA é o parâmetro utilizado para estabelecer a resposta ao término do tratamento (24 semanas nos genóti pos 2 e 3 - 48 semanas no genótipo 1) e seis meses após, considerando-se resposta virológica sustentada (RVS) ao tratamento quando o HCV-RNA qualitativo é negativo nas duas ocasiões.
REFERÊNCIAS 1.
Bouvier-Aiias M, Parei K, Dahari H, Beaucourr S, Larderie P, Blatt L et ai. Clinical Utilit y of Total HCV Core Anrigen Quanti fication: A New lndirect Marker of HCV Replica-
2.
tion . Hepatology. 2002;36(1):211-8. Brasil. M inistério da Saúde. Secretaria de Vigilância em
Saúde. Guia de Vigilância Epidemiológica. s• ed. Brasília: M inistério da Saúde; 2002. 3.
Ferraz MLG, O liveira PM . Diagnóstico Laboratorial Específico. ln: Foccacia R. Tratado de Hepatites Virais. 2• ed. São Pau lo: Atheneu; 2007. p. 199-204.
4.
Granato CFH, A rrais T. Determinação Quanti tativa do RNA/HCV e Aplicações Clínicas. ln: Foccacia R. Tratado de Hepatites Virais. 2• ed. São Paulo: Atheneu; 2007. p.
S. 6.
205-9. Hoofnagle JH. Course and Outcome of Hepatitis C. Hepatology. 2002;36(S1):S21-9. Laperche S, Le Marrec N, Girault A, Bouchardeau F, Servant-Delmas A, Maniez-Montreu il M, et ai. Simultaneous Detection of Hepatitis C Virus (HCV) Core Antigen and Anti-HCV Antibodies Improves the Early Detection of H C V. lnfection J Clin M icrobial. 2005;43(8):3877-83.
7. 8. 9.
Pawlorsky JM. Molecular Diagnosis of virai hepatitiS. Gastroenrerology. 2002;122:1554-68. Pawlorsky JM . Use and lmerpretation o fVirological Tests for Hepatitis C. Heparology. 2002;36(S1):S65-73. Regev A, Schiff E. Clm 1cal fearures of hepatiris.ln: Howard CT. Lemon S. Zuckerman AJ. Virai Hepatitis. 3rd ed. Mas-
sachussem : Blackwell; 2005. p. 33-49 10. ServossJ(, Fnedman LS, DiestangJL. Diagnostic approach to virai hepatitis. ln: Howard CT. Lemon S, Zuckerman AJ. Virai Hepatitis. 3rd ed. Massachussem: Blackwell; 2005. p. 50-64. 1l Shepard CW, Finelli L, A lter MJ Global epidem iology of hepatitis C v1rus infection. Lancet lnfect Dis. 2005;5(9):558-67. 12. Strader DB, Wrigh t T. Thomas DL, Seeff LB. AASLD Practice Guideline: Diagnosis, Managemenr, and Treatmenr of Hepat iris C. Hepatology. 2004;39(4):1147-71. 13. Wasley A, A lter MJ Epidem iology of hepatitis C: Geographic Differences and Temp oral Tren ds. Sem Liv Dis. 2000;20(1):1-16.
612 [ M edi ci na laboratorial para o clínico
)1-- - - - -- - - --
48
Silvana Maria Eloi Santos Marcelo Luide Pereira Gonçalves Suzane Pretti Figueiredo Neves
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL NA INFECÇÃO PELO EPSTEIN,BARR VÍRUS
Em 1968, descreveu-se que o vírus Epstein-Barr (EBV). atualmente denominado herpesvírus humano 4, era o principal agente etiológico da mononucleose infecciosa (MI). Tal vírus havia sido descobertO em 1964, a partir de escudos com microscopia eletrônica de culcura de células obtidas de um linfoma de Burkitt, tumor comum na África subsahariana, descrico em 1958 por um des-
nômicas, principalmente más condições de higiene e grande concentração de pessoas em espaço pequeno, facilitam a transmissão. Assim, quanto mais desenvolvido o país, mais tarde as pessoas contraem a doença e mais sintomática é a 1nfecção aguda.
conhecido cirurgião que trabalhava em Uganda, Denis Burkitt. Trata-se de um vírus evolucionalmente bem
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
sucedido que, após a infecção primária, persiste no hos-
AGENTE ETIO LÓGICO
pedeiro, geralmente de forma inócua. Entretanto. pode induz1r transformação das células infectadas e. pelo seu potencial oncogênico, está assooado a carcinoma de nasofannge, linfoma de Burkitt e outros linfomas de células B. linfoma de Hodgkin e linfomas pós-transplantes.
EPIDEMIOLOGIA
Apesar de variações geográficas de prevalência e idade de soroconversão, sabe-se que o EBV é um vírus ubíquo, com distribuição universal e estima-se que cerca de 90% dos adulcos ocidentais já tenham sido infectados por ele. A prevalência pode ser muito elevada. como em países do norte da África (Aigéria e Tunís1a). ou baixa, como no norte da Europa (Dinamarca e Holanda). O Brasil é considerado um país de endemicidade intermediária. A maior incidência acontece na infância. com um segundo pico na adolescência. As condições socioeco-
Vírus Epstein-Barr, um gama-herpesvirus humano da família Herpesviridae. gênero Lymphocryptovirus, envelopado, com tamanho de 120-220 nm, simetria icosaédrica, com nucleocapsídeo envolvendo um genoma composco por DNA fita dupla de 186 kb que codifica proteínas estruturais e não estruturais (EBNA-1. EBNA-2, EBNA-3A3B-3C. EB A-LP, LMP1 e LMP2). Apresenta dois subtipos sorológicos, EBV-1 e EBV-2. e dois genótipos, A e B. O tipo A é mais eficiente em induzir imortalização de célula B em linfomas. Nos países ocidentais, incluindo o Brasil, predomina o genótipo A
PATOG ÊNES E Existem controvérsias sobre a primeira célula a ser infectada pelo EBV: células epiceliais da orofaringe ou linfócitos B. Atualmente, as evidências favorecem a
Manifestação clínica
célula B como sítio primário de infecção. De qualquer forma, a disseminação virai ocorre pela circulação de linfóciros Binfectados. A ligação do vírus ao linfócito se dá pela interação do complexo glicoprotéico gp350/220 da cápsula do EBV com CD21, recepcor para o componente C3b do complemento, presente na superfície de linfócitos B. Posteriormente, há ligação da gp42 com moléculas de HLA classe 11, iniciando a fusão vírus/célula, processo que requer, ainda, a participação de outras proteínas virais e permite a entrada do vírus no interior da célula. Como outros herpesvírus, apresenta ciclo lítico e, assim, uma vez no interior da célula, ocorre multiplicação virai e lise celular. Curiosamente, portadores de agamaglobulinemia ligada ao X, por não possuírem células B maduras, não são infectados pelo EBV. Estudos recentes indicam que replicação virai pode se dar no epitélio da orofaringe, o que explicaria os alros níveis virais presentes na orofaringe de pacientes com mononucleose infecciosa. Entretanto, os linfócicos Batuam como o principal reservatório que mantém o EBV no organismo após a infecção aguda. A infecção do linfóciro B induz ainda expressão de genes relacionados ao crescimento e transformação celular, que acarreta crescimento de linhagens linfoblastóides B infectadas pelo vírus. A proliferação e expansão de células B infectadas levam à hiperplasia linfóide inespecífica (linfadenomegalia, esplenomegalia) e ao surgimento de anticorpos séricos de reatividades variadas que induzem reações cruzadas em diversos ensaios sorológicos. Durante a fase aguda da MI, em torno de 1% dos linfócitos B está infectado. Na fase latente, os locais de persistência do EBV parecem ser os linfóciros B de memória e o número de células infeccadas, embora escasso, permanece inalterado por anos.
A infecção pode ser assintomática ou oligossintomática. Devido à sua fisiopatologia, o quadro clín ico clássico caracteriza-se essencialmente por quadro agudo febril acompanhado de faringite exsudativa, mialgia, linfadenomegalia, esplenomegalia e alterações sorológicas e hematológicas secundárias à infecção dos linfócitos B. Trata-se de um conjunto de sinais e sintomas frequentemen te encontrado em várias outras infecções agudas como infecção pelo citomegalovírus, pelo HIV. toxoplasmose etc, dificultando o diagnóstico puramente clínico. A febre está presente em praticamente todos os pacientes e permanece em média por uma semana, variando entre 37,5 e 39.5°C. Alguns dias após o início da febre, instala-se a linfadenomegal ia cervical, envolvendo vários gânglios, principalmente os cervicais anteriores e posteriores. Os linfonodos são móveis, de consistência firme e dolorosos. A odinofagia também é muito freqüe nte e há congestão difusa com exsudação de orofari nge, semelhante àquelas observadas na difteria. Petéquias no palato são observad as em cerca de 50% dos casos. A esplenomegal ia, com baço endurecido e doloroso, surge em aproximadamente metade dos casos. Em alguns pacientes, pode surgir exantema que pode ser morbiliforme, escarlatiniforme ou maculo papular. A adenopatia mesentérica pode levar a manifestações digestivas como náuseas, vómitos, dores abdominais. Os sintomas duram cerca de 2-4 semanas, com raros casos de curso mais pro longado, com persistência de febrícu las, astenia, fadiga, dores musculares, adenomegal ias etc. Há divergências sobre a possibi lidade de cron ificação da infecção.
APRESENTAÇÃO ClÍNICA
MONONUCLEOSE INFECCIOSA E GRAVIDEZ
Modo de transmissão: lnter-humano, pelo contato íntimo de secreções orais (perdigotas e saliva), fazendo com que a infecção seja conhecida como a "doença do beijo". É rara a transmissão através de transfusão sangüínea ou contato sexual. Período de incubação: 30 a 45 dias. Período de transmissibilidade: Um ano ou mais.
O vírus de Epstein-Barr não é citado como causa importante de anomalias fetais. A infecção primária durante a gravidez com aparente transmissão transplacentária é rara e poucos casos são relatados. Lesões fetais secundárias à infecção virai parecem ser discretas, mas a ocorrência de infecção placentária, levando à vilite e deciduíte, pode acarretar dano fetal.
614 ( Medicina laboratorial para o clínico ]f-- -- -- -- - -- - -- - -- -- - - -- -- -- - -- -
EXAMES LABORATORIAIS NA INFECÇÃO PELO VÍRUS EPSTEIN-BAAR DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
A mononucleose infecciosa caracteriza-se pela produção de inúmeros anticorpos de especificidades distintas. Essas especificidades são diretamente proporcionais à diversidade de clones de linfóciros B infectados pelo EBV. Assim, é extremameme comum encontrarmos resultados sorológicos positivos para auto-anticorpos (faror antinuclear, faror reumatóide), crioaglutininas e anticorpos para outros vírus, em indivíduos infectados agudamente pelo EBV. Tudo isco decorrente da ativação policlonal dos linfócicos. Entretanto, dois grupos de anticorpos são produzidos consistentemente na MI e sua detecção é de grande utilidade para o diagnóstico. São eles os anticorpos heterófilos e aqueles que reconhecem especificamente componentes do vírus EBV. O uso apropriado de cada um deles, ou ambos, no momento adequado, juntamente com o hemograma, constitui os pilares para o diagnóstico laboratorial da doença.
Anticorpos heterófi los São assim chamados por reagirem com vários antígenos celulares de outras espécies. Induzem aglutinação de hemácias de mamíferos e são da classe lgM. Foram inicialmente descritos por Paul e Bunnell nos anos 30, que nomearam o teste executado por décadas para auxílio diagnóstico da MI. A antiga reação de Paul Bunnell consistia em observar aglutinação de hemácias de carneiro quando em comaco com o soro do paciente comendo anticorpos heterófilos. Os resultados eram liberados em títulos, indicando a maior diluição do soro a produzir aglutinação. Modificado posteriormente por Davidsohn, o teste passou a diferenciar entre anticorpos heterófilos da MI e outros heterófilos produzidos em outras situações, recebendo o nome de reação de Paui-Bunneii-Davidso hn. Nesse caso, utiliza-se rim de cobaia para adsorção de outros anticorpos heterófilos que não aqueles produzidos na MI, trazendo mais especificidade ao teste. Hoje em dia, esses exames foram substituídos por testes de agiu-
Investigação laboratorial na in fecção pelo Epstein-Barr vírus
tinação em lâmina, rápidos e fáceis de realizar, cujos resultados são apenas qualitativos; e as hemácias de carneiro foram substituídas por hemácias de cavalo, mais eficientes. Existem dois tipos de testes comerciais que atendem comercialmente por nomes como monoteste, monospot, monoslide, monolátex etc. Alguns fazem apenas a detecção dos amicorpos heterófilos, sem caracterizá-los como MI específicos ou não. Testes capazes de realizar essa diferenciação são também chamados de testes diferenciais para anticorpos heterófilos e incluem a etapa Davidsohn em seu princípio. É de extrema importância que o laboratório infor me a natureza do teste utilizado no laudo do exame. Em nosso serviço, sempre trabalhamos com os testes diferenciais devido à sua maior especificidade. Quando solicitar o exame: a pesquisa dos anticorpos heterófilos deverá ser solicitada sempre que houver suspeita de MI. As concentrações aumentam a partir do terceiro dia de doença, alcançando seu máximo em duas semanas. Permanecem derecráveis por aproximadamente seis semanas, desaparecendo em três a seis meses. Estão presentes em 90% dos casos de MI, mas, em crianças, o percentual de falso-negativos é mais alro. Assim, em crianças ou diante de uma pesquisa de anticorpos heterófilos negativa, deverá ser solicitada a sorologia específica para o EBV. Quamo à especificidade, o clínico deverá estar atento se o exame realizado for do tipo teste diferencial, específico para MI, ou apenas a pesquisa comum de anticorpos hererófilos. Esta última pode ser positiva em pacientes infectados agudamente por outros vírus (CMV. herpes, hepatites), linfomas, toxoplasmose aguda ou mesmo em indivíduos sadios. O sangue pode ser colhido a qualquer momento, não exigindo jejum.
Anticorpos contra o vírus Epstein-Barr Durante a infecção aguda pelo EBV, são observados vários anticorpos dirigidos para componentes diversos do vírus. Os de maior relevância para o diagnóstico são: antiVCA (vira/ capsid antibody), amiEA (early antigen) e anti EBNA (EBV nuclear antigens). Na prática laboratorial. os testes mais utilizados são os imunoensaios enzimáticos (ELISA e outros) ou a imunofluorescência (util izando células infectadas pelo vírus como substraro) para detecção dos anticorpos antiVCA das classes lgM e lgG.
615
O amiVCA lgM rende a desaparecer em alguns meses, enquamo o amiVCA lgG permanece positivo durante a vida do indivíduo, sinalizando que ele é portador do EBV. Os demais anticorpos citados não são comumente utilizados em casos de MI, mas para rasrreamento de infecção passada ou reativação. Sua pesquisa é feita habitualmente, por laboratórios de referência. Quando solicitar o exame: os anticorpos VCA aparecem de quatro a sere dias após o início dos sintomas, sendo que, habitualmente, a resposta de lgM precede a de lgG. Como explicado. deve ser solicitado diante de pesquisa de anticorpos heterófilos negativa, em crianças e em casos reacionais mononucleose-líke. A sensibilidade dos testes é aproximadamente de 95%. A especificidade varia de 80 a 100%. É importante mencionar que anticorpos lgM produzidos durante a infecção pelo EBV podem reagir cruzadamente em imunoensaios destinados à detecção de anticorpos lgM antiCMV (citomegalovírus). Isto pode dificultar o diagnóstico da infecção por este vírus, principalmente porque a infecção aguda sintomática assemelha-se à mononucleose infecciosa. Não é necessário preparo do paciente ou jejum para a coleta do sangue. Atenção: nenhum desses anticorpos citados se presta para acompanhamento da doença ou "controle de cura", que deverão ser estabelecidos clinicamente. Perspectivas: a literatura mosua, ainda que escassamente, o uso dos testes de avidez de lgG para diferenciação entre infecção aguda e reativação e o uso da reação de polimerização em cadeia (PCR) quantitativa em tempo real para aumento da sensibilidade diagnóstica em crianças. Entretanto, mais estudos e experiência clínica ainda são necessários para o estabelecimento desses novos métodos. bem como melhor entendimento da história natural da infecção pelo EBV em indivíduos imunocomprometidos.
ALTERAÇÕES HEMATO LÓGICAS Alterações hematológicas são observadas praticamente em todos os pacientes com mononucleose infecciosa e persistem, geralmente, por 30 a 60 dias. Os achados mais característicos envolvem os linfócitos. A linfocitose pode ser detectada no fi nal da primeira semana e coincide com o aparecimento de sintomas clínicos. Além da linfocitose, geralmente superior a 5.0 X 103 células/mm 3, são observadas alterações morfológicas, representadas pelo aumento do tamanho celular. imaturidade nuclear com perda da condensação da cromatina, nucléolos evidentes. intensa basofilia citoplasmática e irregularidades do contorno celular. Tais alterações conferem aos linfócitos a denominação de LINFÓCITOS REACIONAIS (ou células de Downey I linfócitos atípicos). com percentual geralmente superior a 10% dos linfócitos ci rculantes. Convém salientar que essa denominação não está relacionada com qualquer indicação de malignidade e o encontro de linfócitos reacionais não é exclusivo da mononucleose infecciosa. O hemograma ainda mostra leucopenia na primeira semana, seguida de leucocitose (à custa da linfocitose), com a contagem global de leucócitos entre 10,0 e 20,0 X 103 células/mm 3 Aproximadê.mente 15% dos pacientes podem atingir valores superiores a 20,0 X 103 células/ mm 3. Os contadores automatizados podem emitir "alertas" referentes à presença de linfócitos reacionais, que são confirmados. posteriormente, a partir da revisão da lâmina pelo profissional do laboratório. Em relação a outros parâmetros hematológicos: a maioria dos pacientes apresenta dosagens normais dos níveis de hemoglobina, discreta trombocitopenia (entre 100.000 e 140.000 plaquetas/mm 3) e discreta neutropenia (absoluta e relativa) com raras granulações tóxicas. Pode ainda ocorrer discreta eosinopenia. (Quadro 48.1)
Quadro 48.1 - Achados laboratoriais da mononucleose infecciosa
Hematológicos • • •
leucocitose com linfocitose linfócitos reocionois (>l O% dos linfócitos) menos freqüentemente, discretos neutropenia, eosinopenio e trombocitopenio
Soro lógicos • anticorpos heterólilos • anticorpos ontiontígenos do EBV: - ontiVCA (viro/ copsid onfibodyl - onti EA leorly ontigenl - ontiEBNA (EBV nuclear ontigensl
616 [ Medicina laboratorial par a o clínico ]f-- - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - -
CONSIDERAÇÕES FINAIS A suspe1ção clín1ca de mononucleose 1nfewosa se
faz geralmente a parm do encontro de febre + hnfadenomegalia cervical + fanngire exsudariva + esplenomegalia. Por serem achados clín1cos inespecíficos, o laborarório apresenta papel relevante na confirmação d1agnósrica.
O quadro hematológico característico é um dado de alta sensibilidade (a ausência de achados hematológicos praricamente exclui o diagnóstico) e especif1odade moderada, uma vez que outras situações clín1cas apresenram linfócitos reacionais. Na mononucleose. sobressai o número elevado de linfócitos reacionais (> 10% dos linfómos totais). Similarmente ao encontro de linfómos reaCionais, remos o encontro de alguns anticorpos "reaoonals", os chamados "anticorpos hererófilos". Sua presença
REFERÊNCIAS 1. Barzila1 O, Ram M, Shoenfeld Y. Virai infewon can 1nduce che produwon of auroanribodies. Curr Op1n Rheumatol. 2007;19(6):636-43. 2 Brasil. M1n1sténo da Saúde. Secrerana de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. GUla de bolso. Doenças infecciosas e parasitánas. 4A ed. ampl. Séne B. Texros Básicos de Saúde. Brasília: M1msténo da Saúde; 2004. Disponível em: http://portal.saude.gov. br/porcal/arquivos/pdf/guia_bolso_4ed.pdf. 3. Hurt C. Tammaro D. Diagnostic evaluation of mononucleosis-like illnesses. Am) Med. 2007;120(10):911.e1-8. 4. Mande li GL. Douglas Junior RG. Bennett JE. Dolin R. PnnCiples and Practice of lnfectious Diseases. 6th ed. New York: Church1ll Uvmgsron; 2005. 5. Yamammo RM. Campos-Jr D. Manual PrátiCO de Atendlmenro em Consultóno e Am:>ulatóno de Ped1ama. SoCiedade Brasile1ra de Ped1ama; 2006. D1sponível em: http://www.sbp.com.br/pdfs/ManPratiCaAtend.pdf.
também não é específica de MI, mas nessa 1nfecção se encontram os maiores tírulos. Nos raros casos de ausência de anticorpos hererófilos está indicada a realização de pesqu1sa de anticorpos específicos. Lembre-se: a mononucleose infecciosa é uma in fecção virai de linfócitos B. capaz de induzir alterações hnfománas morfológicas (presença de linfócitos reaoona1s) e funcionais (presença de anticorpos heterófilos). Entretanto. essas alterações não são exclusivas da M I. podendo ocorrer em outras mfecções agudas vira1s. espeoalmente a momegalovirose.
Investigação laboraLOnal na mfecção pelo Epscein-Barr vírus
617
Suzane Pretti Figueiredo Neves Wan essa Trindade Clemente
49
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM INFECÇÃO PELO CITOMEGALOVÍRUS
A citomegalovirose é causada pelo citomegalovírus (CMV), um DNA vírus de dupla fita, do grupo Herpes. Embora cerca de 100 vírus desse grupo sejam conheCidos por infectarem diferences espécies animais. somente oito herpes-vírus são causadores de infecção humana: herpes simplex (HSV) tipos 1 e 2. varicelazoster (VZV). Epstem-Barr (EBV). herpes-vírus tipo 6 (exantema súbiw). herpes-vírus 7 (HHV 7 - examema súbiw similar) e herpes-vírus 8 (HHV 8 - Kaposi). além do CMV, que é também conheodo como HHV 5 (herpes-vírus humano tipo 5), considerando-se essa nomenclatura. Todos são estruturalmente semelhantes e têm propriedades comuns. particularmente no que se refere às características de latência e reativação. Assim. desde que a infecção renha ocorrido. os vírus ou seus genomas persistem por toda a vida. Durante o período de latência são silenciosos. mas podem estar sujeitos à reativação e desencadear quadros graves em indivíduos imunocomprometidos, a exemplo daqueles infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) e nos submetidos a transplante de órgãos. Ressalta-se que mesmo indivíduos imunocompetentes podem reativar o CMV no contexto de trauma. cirrose e naqueles criticamente doentes. Não se tem clareza dos mecanismos que permitem que o CMV embeleça 1nrecção latente após episódio primário. Porém. tem sido observado que leucóciws polimorfonucleares, linfócitos, tecido endorelial vascular. células epiteliais renais e glândulas salivares apresentam
formas virais do CMV pouco ou não replicativas, capazes de serem ativadas em circunstâncias especiais. Felizmente, têm sido desenvolvidas abordagens terapêuticas e preventivas eficazes que poss1b1iltam o controle das formas mais graves. Contudo, para o adequado manejo. é necessário utilizar instrumental propedêutico de elevado poder discriminatório e custo-efetivo.
PREVALÊNCIA Sendo o CMV um vírus ubíquo. sua prevalência é elevada. variando de 40% até mais que 90%. dependendo da região do mundo analisada. Para populações da América do Norte, as taxas são de 60 a 70%, alcançando aproximadamente 100% na África. No Brasil, estima-se que acima de 90%, ou seJa. a grande maioria dos indivíduos, ao chegar à idade adulta. Já é portadora do vírus em sua forma latente.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
VIAS DE TRANSMISSÃO A infecção pelo CMV pode ser adquirida intra-útero. durante o nascimento ao passar pelo canal do parto, pelo aleitamento e no período pós-natal pelo contágio entre humanos. através de secreções de vias respi-
ratórias, saliva ou urina. A transmissão pode acontecer, ainda, pela transfusão de hemoderivados, transplantes e acidentes laboraroriais. A transmissão entre indivíduos sadios requer contaco íntimo, repetido e prolongado. Nos indivíduos sexualmente ativos, o vírus é freqüemememe transmitido pelo comam sexual, sendo a soroprevalência, entre "profissionais do sexo", de aproximadamente 100%.
ASPECTOS ClÍNICOS Observa-se grande variabilidade de formas, dependendo da imunidade do hospedeiro e do momento em que ocorreu a infecção. Conceirualmente, a infecção primária é aquela que ocorre no soronegativo, não previamente infectado e a infecção secundária representa ativação de forma latente ou reinfecção no seropositivo Quanto à atividade, a infecção pelo CMV pode ser latente - seropositivo com infecção persistente, mas sem sinais de replicação virai; ou ativa - estado de replicação virai caracterizada pela presença de CMV no sangue, órgãos ou tecidos acompanhada do aumento de anticorpos específicos. Nesse caso, a infecção ativa pode ser asssintomática ou manifesta como CMV doença expressão de doença ativa com amplitude de sintomas, variando de mal-estar geral. febre, mialgia ou arcralgia até acometimento de órgão específico (hepatite, pneumonite, gastroenterite, colite, encefalite, etc.) e doença linfoproliferativa ou neoplasia associada, como linfoma de Hodgkin e leucemias.
Infecções pós-natais
Geralmente, a infecção pelo CMV ocorre na infância e na maioria das vezes é assintomática, porém pode acometer ad ulcos. Quando sintomática, manifesta-se por febre, mal-estar, cefaléia, mialgia, fadiga, linfoadenomegalia, acompanhados ou não de linfocicose periférica com linfóciws atípicos e leve elevação de enzimas hepáticas, constituindo a chamada síndrome mononucleose-like. Estima-se que 21% dos episódios diagnosticados como mononucleose infecciosa sejam causados pelo CMV. Observa-se que, ao contrário da "mononucleose" causada pelo Epsteinbarr, não há faringite, tonsilite ou esplenomegalia.
620 [ Medicina laboratorial para o clínico
O período de incubação varia de 20 a 60 dias e a infecção é usualmente assintomática naqueles imunocompetentes. A duração do processo é de duas a seis semanas, freq üentemente com resolução espontânea. As apresentações clínicas mais freqüentes são: infecção assintomática, síndrome tipo mononucleose infecciosa, síndrome congênira do neonaco (freqüentemente fatal ), além de am pla gama de manifestações no recepcor de transplante e em ourros indivíduos imunocomprometidos. Em recém-nascidos prematuros, pós-transfusão, pode haver quadro mais grave com organomegalias, ciropenia e choque.
Infecções intra-uterinas
A cicomegalia congênita ocorre em 0,2 a 3% dos nascimenros, sendo a infecção intra- uterina mais freqüente. É assintomática para a maioria dos casos. Quando ocorridas no início da gestação, resultam em encefalite, com destruição do sistema nervoso central (SNC), enquanto na forma pós-natal essa manifestação é rara. Apenas 5% dos acometidos são sintomáticos e apresentam as seguintes manifestações: crescimento restriro (33%), icterícia (62%), petéquias (58%), hepatoesplenomegalia (50%), prematu ridade (25%), microcefalia (21%), hidrocefalia, lesão cerebral. calcificação e coriorretinite. A mortalidade é superior a 5% e 5 a 17% dos RN assintomáticos apresentam déficits neurológicos durante a infância ou idade escolar. A infecção intra-uterina é menos freqüente que a doença perinatal, mas é mais grave. A infecção cicomegálica materna durante a gravidez é assunto ainda controverso e várias contribuições recentes modificaram os conceitos anteriores. Na grande maioria das vezes, a infecção é assintomática. Nos poucos casos onde se observam sintomas, estes são semelhantes àqueles observados em qualquer indivíduo imunocompetente. Reconhece-se como possível fonte de transmissão virai ao feto a presença do vírus nas secreções do cérvix uteri no. Outra questão é a reinfecção de mãe soropositivo por cepa distinta daquela que alberga, podendo determ inar transmissão intra-uterina e infecção sintomática congênita. Esse tópico é controverso, mas relevante, considerando-se o risco da transmissão através de contaco profissional. como é o caso de professoras e profissionais da equipe de saúde.
Infecções em indivíduos imunocomprometidos
Doença localizada
Nos casos de uansplames. observa-se que a inci-
Considerando-se o diagnóstico de doença localizada,
dência de ciromegalovirose varia com o ripo de órgão
deve-se ater para adoção de critérios rígidos que incluem,
transplantado, sendo descritas raxas de 8 a 35% para
além da manifestação clínica, exames endoscópicos ou
transplantes de rins, coração e fígado e freqüências ainda
de imagem e evidência da presença do vírus, pelas técni-
mais elevadas nos rransp lames de pâncreas e pâncreas-
cas já comentadas. Abaixo, descrevemos algumas delas:
rim (50%), bem como de pulmão e pulmão-coração (50 a 80%). O CMV é o patógeno mais comumente associado à infecção virai do t ransplantado, sendo a causa
a) Pneumonia
mais freqüente de infecção do 1° mês pós-rransplame.
Constatada pela presença de doença pulmonar + iso-
Além dos efeiros direws da lesão recidual. aqueles in-
lamento de CMV no lavado broncoalveolar ou em tecido
direros. como rejeição aguda e crónica, alterações vas-
pulmonar. O CMV é um freqüente agente de pneumonia
cu lares oclusivas do enxerro, doença linfoproliferariva e
intersticial para imunocomperentes mas, ao contrário des-
superinfecção bacreriana, fúngica e virai. elevam con-
ces, observa-se nos imunocompromeridos quadros graves
sideravelmente a morbidade no pós-uansplante. Parte
muitas vezes fatais. Entre os achados radiográficos descri-
dessas complicações se relaciona com a invasividade
ws, têm-se o infiltrado interst icial difuso e/ou peribrônqui-
vascular e capacidade im unorreguladora do vírus. Os determinantes de risco de infecção ciromegá-
co, hiperinsuflação e por vezes micronódulos. A detecção vi rai deve ser realizada por cultura, histopatologia, imuno-
lica no rransplantado dependem essencialmente do
histoquímica ou hibridizaçâo in situ. A detecção do CMV
status soro lógico do doador e receptor do órgão, bem
isoladamente em PCR não autoriza definição diagnósrica
como do grau de imuno ssupressão. Tanto a incidência
devido à elevada sensibilidade do método. A existência de
quanto o risco de adoecimento e manejo profilárico e
coparógenos. como o Aspergillus, juntamente com altera-
terapêutico relacionam-se com a estratificação do per-
ções de imagem sugestivas de aspergilose, direcionam o
fil sorológico do doador e recepror. Assim, alto r isco
diagnóstico para infecção fúngica e não virai.
ocorre quando o recepror do ó rgão é soronegarivo e o
é seropositivo; m édio risco ou risco intermed iário quando o recepwr é soroposirivo, independente
doador
da sorologia do doador, e baixo risco quando ambos são soronegativo.
b) Doença gastrintestinal Identificada pela combinação de sintomas do TGI baixo ou alto + lesões (endoscopia) + demonstração do
Portadores do vírus HIV com imunodeficiência
CMV (cul tura, hisroparológico, imunohisroquímica ou
apresentam aumento da prevalência de infecções
hibridizaçào in situ) em biópsia. A PCR realizada isolada-
oportunistas e, entre essas, o CMV. A cc-in fecção HIV-
mente não estabelece o diagnóstico.
CMV rem sido relatada em cerca de 90% dos homossexuais masculinos portadores da infecção pelo HIV. Uma elevada porcentagem destes apresenta elimina-
c) Hepatite
ção do vírus CMV na urina, m esm o na ausência de
Definida pela elevação de bilirrubinas e rransam inases
imunodeficiência. N aqueles com doença manifesta,
na ausência de o urra causa de hepatite + detecção do vírus
com CD4 <100 cels/mm3, há significativo aumento
em fragmento de biópsia (cultivo. HP, IHQ e hibridizaçào).
na freqüência de doença grave. A ciromegalovirose é também a doença virai oportunista mais freqüeme no portador de HIV, sendo que 21 a 44% dos pacientes
d) Doença do SNC
sem terapia anti-reuovira l altamente at iva (HAART)
Sintomas neurológicos associados à detecção do CMV
apresentam doença ariva pelo CMV. A ret inire, a do-
em líq uor através da PCR, cultivo ou biópsia cerebral. O
ença do SNC e do uaco gasuim est inal são as form as
acometimento neurológico é mais comum que a franca
clínicas mais freqüemes e graves.
meningoencefalire. A sintomarologia inclui cefaléia, farofa-
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo citomegalovírus
621
bia, rigidez de nuca, déficit de memória
e incapacidade de
se relativa com linfocirose atípica e rrombociropenia. A
concentração. Na imunodeficiência pelo HIV, o comprome-
leucomerria pode estar normal, diminuída ou elevada.
timento do SNC pelo CMV ocorre em cerca de 50% dos ca-
Pode ocorrer aumento discrero das transam inases. Mes-
sos, sendo o principal responsável pelo quadro demencial.
mo após a resolução da doença, pode haver excreção do vírus por anos. Para a identificação do agente ou de antígeno virai, utiliza-se metodologia direta através da
e) Retinite
coloração, ensaios, cu lturas e/ou tecnologia molecular. Costuma estar presente em 17 a 41% dos RNs com
Os mérodos moleculares contribuem em situações de
CMV congêniro, sendo muiro freqüente em indivídu-
baixa sensibilidade, lentidão na obtenção de resultados
à fundoscopia
pela via convencional e possibilitam, inclusive, aborda-
os imunocomprometidos. Lesões típicas
sempre requerem acom panhamento do oftalmologis-
gem
e tratamento precoces. Contudo, a opção por essa
é esbranquiçado, perivascular
ferramenta deve considerar o cusro-benefício, a dispo-
e hemorrágico. Inicialmente, o paciente é assintomático,
nibi lidade local e o poder discrim inatório entre infecção
havendo progressivo compromecimenco da visão até a
aciva e latente. A utilização de mérodos indiretos direcio-
cegueira.
nados à detecção de anticorpos depende não somente
j) Nefrite
resposta individual.
ta. O infiltrado na retina
da sensibilização prévia, com o também do padrão de A abordagem laboratorial da infecção pelo CMV deA PCR não define o diagnóstico. É necessária a de-
pende essencialm ente do t ipo de paciente sob suspeita:
tecção do vírus em biópsia renal, além da verificação da
se imunocompetente, imunocomprometido, gestante
disfunção renal.
ou recém-nascido. Os m érodos laboraroriais utilizados na infecção pelo CMV compreendem:
DIAGNÓSTICO lABORATORIAl DA INFECÇÃO PElO CMV
• demonstração do agente infeccioso ou seus efeitos nos tecidos; • pesquisa de antígenos virais e anticorpos em san-
Durante a última década, avançou -se muico no
gue circulante;
manejo da doença e infecção pelo CMV, resultado do
• pesquisa do genoma virai;
desenvolvimento de técnicas diagnósticas moleculares
• isolamento do agente infeccioso.
para detecção virai. A s conferências internacionais sobre o CMV em Paris em 1993 e Esrolcomo em 1995 modifi-
O diagnóstico de certeza depende da demonstra-
caram a abordagem e definição da infecção pelo CMV,
ção hisrológica ou do isolamento virai associados a qua-
rendo em vista os novos critérios moleculares. Posterior-
dro clínico compatível.
mente, com a evolução da profilaxia direcionada, observou-se redução importante da incidência e das complicações associadas à infecção do CMV, principalmente no
Citologia e histologia
recepcor de órgãos. A observação de inclusões intranucleares (t ipo
Cowdry), além da imunohiscoquímica e hibridização in PRINCÍPIOS DO DIAGNÓSTICO LABORATORIA L
situ, pode elevar a sensibilidade da pesquisa do CMV em
DA INFECÇÃO PELO CMV
fragmento cecidual (Figura 49.1). A pesquisa da inclusão ciromegálica identifica a pre-
Como nas demais doenças infecciosas, o diagnóstico
sença de inclusões virais nucleares ou ciroplasmáticas e
é basead o nas informações clínicas e epidemiológicas,
permite a determinação rápida da infecção pelo CMV
exame físico e propedêutica laborarorial. Em relação aos
em amostras de urina, secreção respiratória e genital,
achados laboracoriais inespecificos, o bserva-se linfociro-
líquor (LCR) e outros líquidos orgânicos. As amostras
622 ( Medicina laboratorial para o clínico
devem ser colhidas e fixadas em álcool e encaminhadas ao serviço de anatomia patológica em tempo inferior a uma hora. Apesar de a cicologia apresentar sensibilidade inferior ao cultivo, apresenta como vantagem a rapidez de execução. Contudo, ciwlogias negativas não excluem o diagnóstico. A caracterização de doença ativa persiste como um entrave para a interpretação dos resultados.
Figura 49.1 - Biópsia tecidual corada por HE, evidenciando inclusões virais. Ver prancha colorida Determinação da antigenemia (detecção de antígenos virais)
Trata-se de mécodo quantitativo, que permite estimar a carga virai. Nesse teste, amostra de sangue periférico é colhida em EDTA ou heparina, sem necessidade de jejum. Os eritrócitos são lisados e os neutrófilos são ciwcentrifugados em uma lâmina e posteriormente incubados com anticorpos monoclonais, marcados com substâncias fluorescentes, anriproteína pp-65 relacionada à replicação virai. que caracteriza infecção ativa. Os neutrófilos infectados pelo CMV são identificados pelos anticorpos monoclonais (Figura 49.2). O resultado é dado pelo número de células positivas em relação ao número total de leucócitos contados em microscópio de fluorescência. Assim como na pesquisa quantitativa do DNA virai. esse exame tem a vantagem de identificar a replicação do vírus ames da doença manifestar-se. fato que permite o tratamento preventivo. A sensibilidade do teste é de aproximadamente 90% e os resultados são emitidos no mesmo dia. Porém, o teste é artesanal e laborioso e poucas amostras podem ser avaliadas de cada vez. Outras limitações são a necessidade de processamento rápido da amostra (até 6h da
colheita) e a dificuldade de realizar o exame diante de leucopenia. Não há ainda definição quanto ao valor de corte do teste, havendo grande variabilidade na literatu ra. Tem sido sugerida, como marcador de replicação, a identificação de 10 células em aproximadamente 200.000 leucóciws contados. A definição desse valor de corte é necessária. pois é possível o encontro esporádico de poucas cél ulas positivas. sem que isto signifique atividade da doença. Em geral. a infecção ativa implica aumento do número de células infectadas com o passar dos dias. Assim, a interpretação dos resultados considera não somente o número de células infectadas em uma amostra única. como também os valores de análises seqüenciais (ex: aumento do número de células positivas em exames seqüenciais, com dois dias de intervalo). Nos transplantados, realiza-se anrigenemia seqüencial com freqüência semanal durante os primeiros três meses do cransplante e, posteriormente, sempre que houver suspeita clínica. Nesse caso, se a antigenemia for positiva, mas com valores inferiores a 10 células. repete-se o teste com intervalo de dois ou crês dias para acompanhamento. O tratamento preemptivo com antiviral é recomendado se o resultado da antigenemia apresentar padrão ascendente ou número considerável de células positivas (>10/200.000).
Figura 49.2 - Antigenemia para CMV demonstrando células positivas. Ver prancha colonda Detecção do DNA virai
A utilização de ensaios moleculares para detecção virai exige a extração do DNA. amplificação de seqüências com iniciadores (primers) específicos, seguido de revelação. Emre os métodos disponíveis, estão: a reação de polimerização
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo citomegalovírus
623
em cadeia (PCR) qualicaciva ou quamicaciva - cambém conhecida como carga virai; a hibridização e o NASBA e. mais recentemente, a pesquisa quantitativa pelo método da PCR em tempo real. Apresenta sensibilidade superior à cultura e antigenemia. Aqui também encontramos as dificuldades inerentes ao mécodo, pois ainda são poucos os laboratórios que dispõem de serviços de biologia molecular e o cusco do exame ainda é muico alco, principalmente para a rede pública. Portanto, é preferível consultar sempre o laboratório antes de solicitar a colheita do material. a fim de saber o método disponível ou mais viável. O DNA virai pode ser recuperado em fragmento de tecidos. plasma/soro, BAL. urina, LCR e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). As amostras devem ser colhidas em reci pientes adequados, podendo comer anticoagulantes. exceco heparina. A determinação qualitativa do DNA virai é muito útil no diagnóstico da infecção quando a pesquisa dos anticorpos não determina o diagnóstico ou quando esse não é possível por meio de técnicas convencionais. Esse exame também é considerado método ideal para avaliação do recém-nascido com suspeita de infecção transmitida pela mãe, uma vez que os anticorpos lgG maternos atravessam a placenta e nem sempre é possível detectar lgM antiCMV no bebê. Outra vantagem é o diagnóstico de encefalite ou polirradiculopatia pelo CMV no indivíduo infectado pelo HIV e a detecção virai no humor vítreo. Quando se utiliza técnica quantitativa (carga virai), pode-se inferir doença ativa, já que o número de cópias do vírus por mililitro de plasma relaciona-se com atividade replicativa virai. Desta forma, a determinação da carga virai é reservada aos indivíduos que apresentam suspeita de reativação da infecção prévia latente. como os transplantados. Essas técnicas reconhecem a atividade virai ames da doença manifestar-se clinicamente. Estudos recentes revelam sensibilidade superior à antigenemia, podendo identificar 96% dos casos de doença. com especificidade aproximada de 82%, valor preditivo negativo (VPN) de 99%, valor preditivo positivo (VPP) de 53%. Assim, a elevada sensibilidade, especificidade e precocidade do teste permitem a utilização de tratamento preventivo ou preemptivo para esse grupo com maior risco de adoecimento, lembrando que um teste negativo praticamente afasta a hipótese de doença. Recentemente, estudos mostraram correlação entre a carga virai (n° de cópias do vírus/ n° de polimorfonucleares circulantes) e o risco de seqüelas em recém-nascidos infectados por via congênita, trazendo novas perspectivas para o uso do exame.
624 ( Med icina laboratorial para o clínico
Isolamento virai
O cultivo do CMV em laboratório é possível. Entretanto. é um método laborioso, demorado (até seis semanas) e exige laboratório capacitado a realizar cultivos de células para que estas possam albergar o vírus, quando inoculadas. Não é método disponível na rotina laboratorial pública e raramente serviços de diagnóstico privado o adocam. O método de cultivo. conhecido como shell via/, consiste na demonstração rápida do vírus no meio de culcura, quando anticorpos monoclonais antiCMV marcados com fluorocromo reagem com o inóculo. Esse método de cultivo rápido permite a detecção do vírus em até 48 horas, mas também não é realizado pela maioria dos laboratórios. As amostras são espécimes orgânicos, tais como urina, secreção da faringe (criptas da tonsila), lavado-bronquioalveolar (BAL). fragmento de biópsia. fezes e sangue (utilizando heparina como anticoagulante). Caso a amostra seja colhida por swab, recomenda-se manutenção em ambiente úmido e frio, sem congelamento. O transporte ao laboratório e o processamento devem ser rá pidos para manter a viabilidade virai. Esses exames não são de escolha para análise de amostra liquórica devido à baixa sensibilidade.
Diagnóstico sorológico
A demonstração, no sangue circulame. de anticorpos que reagem com o CMV é o exame mais comumente disponibilizado pelos laboratórios. Reflete a presença indireta do vírus, uma vez que sinaliza seu reconhecimento antigênico pelo sistema imune. Diferentes isotipos estão presentes em fases distintas da infecção. Alguns não atravessam a barreira placentária e constituem ferramentas úteis, quando corretamente utilizados. Os primeiros anticorpos a serem detectados no sangue, após duas a quatro semanas da infecção, são da classe lgM. Segue-se. com o tem po, a produção de grandes quantidades de lgG, com as mesmas especificidades, fenômeno conhecido como mudança de classe (class-switch). Esses anticorpos lgG são produzidos com afinidade cada vez maior para os antígenos virais, permanecendo detectáveis por toda a vida do indivíduo. Ao contrário, a lgM tende a negativarse com a cronificação da infecção. Essa resposta de lgG, porém, não deve ser confundida com imunidade ao vírus.
pois esses anticorpos não eliminam o vírus, que permanece convivendo com o hospedeiro, na sua forma latente. Durante a fase aguda, é possível deteccar, em menores quantidades, anticorpos lgA e lgE contra o vírus. Na fase latente, podem também ser encontrados alguns picos isolados de lgM, sem que isco reflita reativação. Os mémdos mais comumente utilizados para detecção destes anticorpos são ELISA e suas variações (MEIA, ELFA, ELISA de captura etc). Também já podemos contar com a quimioluminescência e sua grande sensibilidade. Alguns testes fornecem resultados apenas qualitativos, enquanto outros permitem determinações semiquantitativas. Esses últimos possibilitam o acompanhamento de tículos quando o seguimento sorológtco do paciente for necessário.
entre reativação da doença e reaparecimenco de lgM, esta não deve ser solicitada. Da mesma forma, podem-se observar picos isolados de lgM, mesmo durante a fase de latência, sem importância clínica. Quadro 49.1 - Perrrs sorológicos na infecção pelo CMV lgG-/IgM -
indivíduo susceptível; sem contoto prévio com o vírus. Neste, o viragem de lgM ou lgG reflete soroconversão agudo
lgG+/IgM-
ndívíduo portador do vírus. Refere-se à moro rio do população adulto no Brasil
lgG-/IgM +
suspeito de soroconversão recente. Repele se o teste em 15 o 20 dias poro verificar viragem de lgG
lgG+/IgM+
infecção oguoo. IÓ com produção de lgG. lgM residual ou lgM folso·posit vo Real zor avidez de lgG
PERFIS SOROLÓGICOS DE DIFERENTES SITUAÇÕES CLÍNICAS
SOROLOG IA NO INDIVÍDUO IMUNOCOMPETENTE De modo geral. a detecção isolada de lgM antiCMV não acompanhada de lgG num indivíduo sintomático com suspeita de infecção aguda sugere fortemente o diagnóstico. Naqueles assintomáticos, como doadores de órgãos e/ou sangue, o perfil encontrado é, em sua maioria, lgG positiva/lgM negativa. Casos de lgM positiva com lgG negativa devem ser seguidos de novo exame, 15 a 20 dias após o primeiro, para verificação da viragem de lgG e, se possível. com a determinação da lgA antiviral. confirmando-se o diagnóstico de infecção aguda e soroconversão recente. Caso esta não ocorra, deve-se pensar em lgM falso-positiva. (Quadro 49.1)
SOROLOGIA NO IND IVÍDUO IMUNOCOMPROMETIDO A sorologia apenas informa se o indivíduo alberga ou não o vírus em seu organismo. lgG positivo indica indivíduo portador, mas o diagnóstico da reativação ou de doença por CMV reside em outros mécodos que não sorológicos, como já explicado. Como não há correlação
SOROLOG IA NA GESTANTE Uma mulher, ao engravidar, terá, na maioria das vezes, adquirido a infecção na infância. Portanco, será possuidora do perfil lgG pos/lgM neg. sem riscos para o bebê. Poucas serão susceptíveis, lgG neg/lgM neg, e menos ainda apresentarão o perfil de soroconversão recente, lgM ps/lgG neg. Estas últimas deverão ser conduzidas como já explicado: faz-se novo exame 15 a 20 dias após o primeiro para verificação da viragem de lgG, confirmando-se, então, o diagnóstico de infecção aguda e soroconversão recente. Se o método for semtquantitativo, é possível monicorar o aumento dos tícu los. É importante ressaltar que a gravidez em si é um forte estímulo à resposta humoral generalizada. Portanto. é comum reações falso-positivas em vános testes sorológicos, inclusive lgM fa lso-positiva. Também há casos em que gestantes susceptíveis apresentam viragem apenas para lgG na gravidez. Se o exame se confirma em outra amostra, considera-se soroconversão aguda. Atualmente, com o desenvolvimento de métodos cada vez mais sensíveis, tornou-se freqüente a detecção de lgM em baixos níveis acompanhada de lgG em níveis estáveis, chamada lgM residual. Esta pode permanecer por anos após o episódio agudo inicial. Logo. a presença de lgM pode não ser indicador seguro de fase aguda nesses casos. Então, diante de uma gestante
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo citomegalovírus
625
lgG+/IgM+, como raciocinar7 Estamos diame de três possibilidades: infecção aguda com produção de lgG ou lgM residual ou lgM falso-positiva . Provas adicionais são necessárias para elucidação do perfil. Estas consistem em: 1. Repetição do exame pelo mesmo mécodo e no mesmo laboratório. para avaliar níveis de anticorpos, sempre com pareamenco de amostras: amostra-resgate da primei ra amostra de sangue ensaiada. em paralelo com a segunda (uma vez que os laboratórios conservam as amostras em sororeca por até seis meses). Caso ocorra aumento de no mínimo quatro vezes, sugere-se produção ativa de an:icorpos. Títulos estáveis apancam o contrário; 2. Avaliação da amostra por método convencional para pesquisa de lgM (ex. ELISA mdireto). Esses métodos ainda obedecem ao amigo padrão no qual lgM perrranece de três a seis meses detectável após uma infecção aguda; 3. Pesquisa da avidez de anticorpos lgG: é o método preferencial. Baseia-se no conhecimento imunológico no qual. na fase aguda. os anticorpos têm menor afinidade funcional/avidez pelo amígeno. que vai aumentando com a cronificação da doença. Assim, numa gestante com perfil lgG+/ IgM+ com resultado de baixa avidez, confirma-se infecção aguda/recente; e aquele de alta avidez o afasta. Em nossa casuística, a maioria das gestantes submetidas ao teste são portadoras de lgM residual, refletindo. portamo, apenas a alta sensibilidade dos métodos acua1s para lgM. Ressalta-se, entretanto, que o ma1or poder de discriminação do exame é até a 20• semana de gestação; 4. Pesqu1sa de lgA ou lgE antivírus: essas imunoglobulinas podem estar presentes na fase aguda. O exame apreserca baixa sensibilidade, não sendo realizado na maioria dos serviços.
DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO CONGÊN ITA NO RECÉM-NASCIDO OU NO FETO Dev1do à passagem placentária da lgG materna, deve-se pesquisar lgM. A grande vantagem dos
mécodos atuais é garantir maior sensibilidade para dececção de lgM, na suspeita de infecção vertical. Mesmo assim, a resposta imune humoral dos bebês pode não ser suficiente para que o teste seja positivo. Portanto. uma pesquisa isolada de lgM, quando negativa, desde que haja suspeita epidemiológica (sorologia materna) e/ou clínica. não exclui infecção. Deve-se, então, repetir o exame após algum tempo, comparar os níveis de lgG materno com os da criança e pesquisar lgA o u lgE para aumentar a sensibilidade_ Após os seis meses. a permanência de anticorpos maternos já não é mais o bservada. Contudo, o teste ideal. por tratar-se de organismo não primado. é a detecção de DNA virai. Se disponível. é o teste de escolha não só para a infecção congênita por CMV. mas para as dema is doenças do grupo TORCHS. No feco. é desc rita a pesquisa de lgM em sangue de cordão um bilical após a 22" semana gestacional. O exame apresenta baixa sensibilidade e a pesquisa do DNA virai em líquido amniótico carece de ultra-sonografia para colheita. Impo rtante: toda sorologia no feto/bebê deve ser avaliada em conjunto com a sorologia materna (Figura 49.3).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A infecção pelo CMV pode ter resu ltados desastrosos para pacientes im unocomprometidos e grávidas_ A infecção pri mária da mãe durante a gravidez está associada a anormalidades feta is e doença neonatal. A doença pelo CMV no transplantado e portador de imunodeficiência é igualmente deletéria, considerando-se a perda do enxerco, a imunossupressão decorrente da infecção e até compl icações fatais. Apesar de d ispormos atualmente de instrumental refinado que pode nos auxiliar na detecção precoce da doença e possibilitar a intervenção oportuna. encontramos as dificuldades relativas ao reduzido número de laboratórios que possuem serviços de biologia molecular. em particular na rede pública. Há de citar-se ainda o alco custo do exame. Para o futuro. esperamos que a abordagem possa ser mais efi caz, com o controle dos efeicos destrutivas da infecção pelo CMV e o dese nvolvimenco de vacina eficaz e segura_
626 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1- - - -- - - - - -- - -- - - - - -- -- - - - - - - - - - -
Situação I
Situação 2
Situação 3
Situação 4
<20 semanas
Teste de
Considerar infecção agudo no gestação
Encaminhar poro propedêutico fetal poro propedêutico fetal
poro propedêutico fetal Sorologio trimestral
• Se disponível
F1gura 49.3 - Rouna pré-natal da momegalowose, conforme resultado da sorologia materna.
REFERÊNCIAS
2
3. 4
S.
6.
7.
Boeckh M, Bowden RA. Goodnch JM, Petunger M, Meyers JD Cytomegalowus anr1gen derectton 1n penphera t blood leucocyres after allogene1c marrow rransplanratton. Blood 1992.80(5):1358-64. Crumpacker C Wadhwa S Cyromegalowus. ln. Mandei! G. Bennet TJ. Dol1n R. Pnnoples and Practtce of lnfecrious D1seases. 6th ed. New York: Elsev1er; 2005. p. 1786-1800. Deayton J Is cytomegalowus wem1a a useful tool 1n rhe manag1ng CMV d1sease1 STD. 2000;76(5):342-4. Hernando S. Folgue1ra L. Lumbreras C San Juan R. Maldanado S. Pneto C er a . Companson of cyromegalowus wal load measure by real-nme PCR w1rh pp65 anr1genem1a for the d1agnos1s of cytomegalowus dtsease 1n solid organ rransplanr par1enrs. Transplanr Proc. 2005;37(9):4094-6. Hollíer L Gr,ssom H. Human herpes wuses 1n pregnancy: Cytomegalowus. Epsrem-barr v1rus and Var•cella zosrer. Clm Pennarol. 2005;32:617-96. )aber S. Chanques G. Borry ). Souche B. Verdter R. Perngault PF, er ai. Cyromegalowus lnfecnon 1n Cnttcally III Panenrs: Assoc1ated Factors and Consequences. Chesr. 2005;27:233-41. Lanan M, Lazzarotto T. Venrun V, Papa I, Gabnell1 L Guerra B Neonaral cyromegalowus blood load and nsk of sequelae m symptomattc and asympwmaric congemrally 1nfec red newborns Ped1atrtcs. 2006;1 17(1):76-83.
8. Lazarrotto T. SpeZ7acarena P. Vara m S. Gabnellt L. Pra dell1 P. Guerra B, er ai. Anrícyromegalowus (anr1CMV) 1mmunoglobultn G av1d1ty 1n idenr1f1canon of pregnant women ar nsk of rransm1tt1ng congen1tal CMV 1nfect1on. Cil n Diagn Lab lmmunol. 1999;6(1):127-9. 9. Lun a D. Ciromegalowosc. ln: Tavares W. Ma nnho L. Rot inas de diagnóstico e tratamento das doenças 1nfecetosas e paraSitánas. São Paulo: Atheneu; 2005. p. 181-87. 10. Newton ER. D1agnos1s of pennatal TORCI I 1nfewons Cltn Obstet Gynecol. 1999;42(1):59-70;174-5. 11. Pnya K. Mad havan HN D1agnosuc value of enzyme ltnked 1mmuno-sorbem assay fo r cyromegalow us d1se ase. J Postgrad Med. 2002;48:176-8. 12. Revel ia MG. Cerna G. D1agnosis and management of human cyromegalowu s tnfectton 1n mot he1, fe tus and newborn 1 n~anr. Cl1n Mtcrobtol Rev 2002;15(4)·680-7 15 13 Seehofer D. Me1sel H. Rayes N. Ste1n A, Langrehr JM, Set· tmacher U, et ai. P10spect1ve evaluar1on of the chntcal uultty of d1fferenr methods for the derecuon of human cytomegalovtrus d1sease after ltver transplanranon. Am J Transplam. 2004;4(8):1331 7 14 Spector S. Wong R. Hsta K. Ptlcher M. Stempten MJ Plasma cytomegalowus (CMV) DNA toad predtcrs CMV dtsease and surv1val tn AIDS pat·ents. J Chn lnvest. 1998:10 1497-502. 15. Van Der BIJ W, SpetCh R Management of Cyromegalovt· rus lnfewon and Dtsease after Soltd-Organ Transplamauon. CID 2001;33 Suppl l'S32-6.
Investigação labo rato rial do paciente com infecção pelo ciromegalovírus
627
Taciana de Figueiredo Soares
50
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM RUBÉOLA
A rubéola é uma doença exantemática virai aguda que acomete crianças e adultas. Embora seja considerada uma doença benigna, adquire relevância pelo faro de que mulheres grávidas susceptíveis, uma vez Infectadas, podem uansmiti-la por via rransplacentária. O recém-nascido poderá vir a apresentar seqüelas como surdez. catarata, defeitos cardíacos e reta rdo mental. Quanto mais recente a gestação à época da infecção, mais devastadoras as complicações. Por causa desse pocencial terarogênico, a doença é de nocificação compulsória em vários países, inclusive no Brasil. e os dados obtidos formam a base para a definição e implantação das políticas nacionais de controle da enfermidade. A confiabilidade dessas ações depende da correlação do conhecimento profundo dos aspectos clínicos e epidemiológicos da infecção com a precisa indicação e interpretação dos mérodos laboratOriais empregados no seu diagnóstico (correlação clínico-laboratorial). Nesse contexto, a participação do laboratório é de inegável importância na definição do diagnóstico da infecção aguda pré e pós-natal. da infecção congênita e na avaliação do estado imunológico da população. Descrita inicialmente como uma variante do sarampo e nomeada a "terceira moléstia", somente em 1814 a doença foi identificada como uma entidade infecciosa isolada e denominada "sarampo alemão". Em 1914, Hess postulou uma possível causa virai, fato confirmado em 1938 por Hiro e Tosaka. Em 1941, um ano após uma epi-
demia de rubéola na Austrá lia, Gregg relarou a ocorrência de cataratas congênitas entre 78 crianças nascidas de mães com diagnóstico de rubéola precocemente na gravidez. Dessas crianças, mais da metade apresentava defeitos cardíacos congênitos associados. Esta foi a primeira evidência da síndrome da rubéola congênita (SRC).
O VÍRUS
O Isolamento do vírus ocorreu em 1962 (Parkman e Weller). sendo classificado como um membro da família Togaviridae. gênero Rub1wus. A panícula wal é esférica, com diâmetro de aproximadamente 60nm; o envelope envolve o nucleocapsídeo, cujo d1âmetro é de aproximadamente 30nm, sendo composw de uma hélice de RNA (9762 nucleocídeos). São descntas estruturas pohpepcídicas associadas ao vírus, denominadas E1. E2 e C. As estru turas E1 e E2 são glicoproteínas rransmembranas; C é a proceína do capsídeo que envolve o RNA do vírion . Respostas imunológicas humoral e mediada por células são induzidas contra as proteínas estrutu rais El. E2 e C porém, El parece ser imunodomlnante. Embora o vírus da rubéola seja antigenicamente estável. estudos seqüenciais do open readingjrame da glicoproreína E1 reconheceram dois genótipos distintos. O genótipo I inclui 60 vírus e é predominante na Europa, América do Norte e Japão, embora circule por quase todo o mundo; o genótipo 11, que inclui três ví-
rus, é predominante na Índia e China, sendo restrito ao continente asiático. Como há reatividade cruzada entre os antígenos, a imunização com tais vírus pode desencadear imunidade contra wdos os vírus da rubéola. O vírus sofre inativação por solventes lipídeos, tripsina, formalina, luz ultravioleta e pH extremo; é termolábil, sendo inativado rapidamente a 3rC. à tem peratura ambiente e ao calor, mas pode ser estocado por curto espaço de tempo a -20°(. além de ser estável por meses a -60°(.
habitantes) e em Recife (período de 1999-2000 com 31 casos de SRC). Mesmo com a vacinação obrigatória e disponível para toda a população, dados do Ministério da Saúde demonstram que, até a semana epidemológica 52 do ano de 2007, foram confirmados surtos de rubéola em 20 estados do Brasil com um total de 8.683 casos de rubéola pós-natal (3.642 na reg1ão sudeste) e 17 casos de rubéola congênita (12 deles na região sudeste) - (Fome: http://portal.saude.gov.br/portal/arq uivos/pdf/nota_ rubeola140708.pdf).
EPIDEMIOLOGIA
PATOGENIA E APRESENTAÇÃO CLÍNICA
Trata-se de enfermidade disnibuída por todo o mundo, que não conta com vetares de transmissão e não tem reservatórios animais. A aquisição da infecção se dá por comato imerpessoal, por meio de secreções que albergam o vírus. Até o estabelecimento dos protocolos vacinais, epidemias por rubéola eram freqüemes, com intervalos de seis a nove anos, acometendo principalmente as crianças. Ainda hoje o vírus é endêmico em locais onde a vacinação não é rotineira. Naquelas áreas onde os esquemas vacinais adequados são utilizados, a maioria das infecções ocorre em indivíduos mais velhos. Pessoas vacinadas recentemente não transmitem a infecção, embora o vírus possa ser isolado da faringe por curto período de tempo após a vacinação. As vacinas de vírus vivo atenuado são utilizadas desde 1969 na prevenção da infecção em crianças e jovens e contribuíram para a redução da prevalência da infecção congênita. Nos Estados Unidos, em 2001. somente 23 casos de rubéola pós-natal e três casos confirmados da síndrome da rubéola congênita foram notificados ao Centro-de Controle de Doenças (CDC) contra 12 milhões de casos de rubéola pós-natal e 20 mil de rubéola congênita na mais recente epidemia naquele país no período de 1964 a 1965. No Brasil, a vacina de vírus vivo atenuado faz parte do calendário básico de vacinação (uma dose entre 14-18 meses de idade) desde 1992, época em que tal política de saúde foi instituída no estado de São Paulo, tendo sido progressivamente estendida para todo o país até o ano de 2000. Nesse período, foram notificadas epidemias de rubéola em São Paulo (período de 1999-2001, com taxa de incidência de SRC de 7,5/100.000
RUBÉO LA PÓS-NATAL - RU BÉOLA AGU DA
A transmissão pós-natal do vírus da rubéola ocorre a partir do cantata com secreções contaminadas com a aquisição do microrganismo por via inalatória; a replicação inicial do vírus dá-se provavelmente nas células do trato respiratório superior, com conseqüente disseminação por via hematogênica, envolvendo vários órgãos, inclusive a placenta. O período de incubação varia de 14 a 21 dias (média de 18 dias). seguido pelo su rgimento de um exantema morbiliforme que coincide com o início da resposta humoral e com o declínio da viremia, sugerindo um fator imunológico para o exantema (Figura 50.1). Após a infecção, uma proteção duradoura contra a doença se desenvolve, protegendo a maioria dos indivíduos de novos ataques. Entretanto, podem ocorrer reinfecções que são, na maioria das vezes, assintomáticas e detectadas por meio de testes sorológ1cos, traduzindose em significativo aumento dos títulos séricos de anticorpos; acometem tanto indivíduos naturalmente imunizados como aqueles que receberam cobertura vacinai, sendo mais comum neste grupo. As reinfecções são também mais freqüentes entre aqueles indivíduos cujos títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação (HAI) são iguais ou inferiores a 1/64; porém, mesmo entre indivíduos, vacinados ou não, que apresentam esses níveis de anticorpos, a taxa de incidência de reinfecção é significativamente mais alta entre vacinados. Viremia é rara nas reinfecções, embora o vírus possa ser recuperado da faringe. Uma questão controversa é se a ocorrência de episódios de reinfecções durante a gestação poderia resultar em transmissão do vírus para o feto.
630 [ Medicina laboratorial para o clínico )~------------------------------
Doença lg total (HAI)
64
Vírus no faringe
(%)
,/,'
·······•······...
32 16
Avidez de lgG
""'
\
,·...,.
50
I
t
8 4
o t±=+~~:J~~--~~~~~~~J o 3
2
5
4
linfoodenomegolio
I· Artrolgio I·
6
2
3
4
I Semanas
Meses
Figura 50.1 -Perfil de anticorpos na rubéola primária: desenvolvimento de lgG e lgM específicas e aumento da avidez de lgG.
A doença aguda se manifesta desde um quadro subclínico até sinais e sintomas leves ou moderados. como adenopatias, febre e exantema. Sinais prodrômicos da doença. como mal-estar, febre e anorexia, são encomrados em adolescemes e adultos infectados, sendo raros em crianças. A seguir, a doença se estabelece. As manifestações mais freqüentes são linfoadenomegalia renoauricular e cervical posterior, além de examema morbiliforme, não coalesceme, róseo, que surge inicialmeme na face e região cervical e que se desenvolve em semido crânio-caudal, esmaecendo e desaparecendo ao fim do terceiro dia. O examema pode ser acompanhado por coriza e conjuntivite. O diagnóstico diferencial deve ser confrontado com enfermidades como toxoplasmose, sarampo, parvovirose Bl9, doença de Kawasaki, escarlatina, enteroviroses, exantema súbito, mononucleose, varicela e reações medicamentosas. Embora a rubéola tenha aspecto benigno, complicações como artralgias, artrites (principalmente em mulheres), manifestações hemorrágicas (mais freqüente em crianças) e encefalite (um em 5.000 casos) são descritas. A detecção da resposta humoral é possível tão logo surja o exantema. A imunoglobulina lgM aparece juntamente com os primeiros sintomas e pode ser identificada por mais de um ano. lgG e lgA podem ser demonstradas por volta da segunda semana de infecção. As imunoglobulinas G detectadas nas fases mais precoces da doença são de baixa avidez, sofrendo maturação gradual com a cronificação do processo.
Investigação laboratorial do pacieme com rubéo la
A ocorrência de imunocomplexos antígeno viraianticorpo é descrita tanto em infecções naturais quanto após vacinação. A deposição desses imunocomplexos pode ser um dos mecanismos patogênicos das aruopatias e das manifestações tardias na SRC.
RU BÉOLA ADQUIRIDA CONGEN ITAMENTE SÍNDROME DA RUBÉOLA CONGÊN ITA A incidência da rubéola congênira depende da população, do número de indivíduos susceptíveis, da circulação do vírus na comunidade e do emprego dos esquemas vacinais preconizados. A síndrome é a conseqüência da passagem cransplacemária do vírus da rubéola durante o período de viremia experimentado por uma gestame susceptível. Após a infecção placentária, ocorre viremia fetal com disseminação para vários órgãos. As lesões decorrentes da infecção resultam da combinação de dano celular induzido pelo vírus e do efeito do próprio vírus nas células em divisão, comprometendo o ciclo celular e o desenvolvimento dos órgãos em formação. Autópsias de neonatos com rubéola congênita demonscram órgãos hipoplásicos com número reduzido de células. Os danos secundários à infecção observados no feto estão direramente relacionados à idade gestacional; quanto mais jovem o feto à época da infecção, mais graves serão as conseqüências. O feto rem 65 a 85% de chances de ser infectado se a gestante adquirir a doença nos dois
6 31
primeiros meses de gravidez. A instalação da infecção fetal precocemente na gestação favorece a cronificação e a persistência virai, além de induzir abortos espontâneos ou defeitos congênitos, que poderão ser transitórios ou permanentes, comprometendo o desenvolvimento da criança e do adolescente. O mais comum dos defeitos de desenvolvimento é o retardo mental de grau moderado a grave, que gera a necessidade de cuidados especiais para aquelas crianças mais comprometidas. Se a gravidez chega a termo, o neonaro pode apresentar sinais da infecção congênita, tais como: baixo peso, microcefalia, microftalmia, icterícia, glaucoma, retinopatia, catarata (50% dos casos é bilateral), anormalidades cardíacas, tal como persistência de dueto arterial, estenose da artéria pulmonar, estenose de válvula aórtica, defeitos septais, tétrade de Fallot, coarctação de aorta, hepatite, anemia hemolítica, plaquetopenia, micrognatia, osteopatia de ossos longos, entre outros. Por outro lado, os bebês podem nascer sem qualquer evidência da infecção congênita e apresentar na idade escolar ou adulta surdez uni ou bilateral, retardo mental, miopia grave, lesões oculares como o glaucoma, autismo, tireoidite e diabetes melito tipo 1. Por isso, a rubéola congênita não pode ser considerada uma doença estática. A resposta humoral na SRC difere daquela observada em crianças infectadas naturalmente ou mesmo imunizadas (Figura 50.2). Na SRC, os bebês não formam anticorpos contra a proteína C e têm baixa reatividade para a proteína E2, além de pouca produção
________
..._
2
3,
de anticorpos antiEl. Há compromerimef)to da resposta mediada por células, incluindo a citotoxicidade e a secreção de linfocinas in vitro, sugerindo a instalação de mecanismos de rolerância capazes de interferir no clareamento do vírus.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA RUBÉOLA Tend~
em vista que a rubéola aguda pode ter caráter subclínico e inespecífico, o diagnóstico definitivo da infecção deve basear-se na detecção/isolamento do vírus e/ou na demonstração de títulos de anticorpos lgG séricos em ascensão e/ou pela demonstração de lgM sérica positiva. As estratégias de diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus da rubéola serão discutidas a seguir.
ISOLAMENTO DO VÍRUS O vírus da rubéola está presente desde uma semana antes do surgimento do exantema na oro e nasafaringe, bem como no sangue periférico. Embora as partículas virais sejam clareadas do sangue tão logo surja o exantema, em alguns casos o vírus pode persistir na orofaringe por aproximadamente duas semanas. Outras fontes de vírus são a urina, o fluido sinovial, raspado de oro e nasofaríngeo, aspirado de cristalino e o líquido amniótico.
2
3
6
1
2
3
~-------~------~' ~ Trimestre
Nascimento
Id ade (meses)
Idade (anos)
Figura 50.2 - Perfil de anticorpos na infecção congénita pelo vírus da rubéola adquirida no primeiro trimestre de gestação.
632 [ M edicina laboratorial para o clínico ]1 -- - -- -- -- -- - -- - - - -- - - -- - -- -- -- -
Cultura virai O vírus pode ser isolado a partir de amostras corporais cultivadas em linhagens celulares contínuas. Em várias linhagens celulares derivadas de macacos e coe-
cataratas congênitas, nas quais a pesquisa do RNA virai é feita em amostras de aspirado de cristalino. Para o diagnóstico da infecção incra-útero, podem ser utilizadas amostras de líquido amniótico colhidas após a 153 semana de gestação e do vilo corial colhidas
lhos o efeico cicopácico do vírusé evidenciado. O cultivo
encre 10 e 12 semanas. Deve-se ter em mence o risco de
virai pode ajudar na definição de situações em que há dificuldade de confirmação da doença, como na artrite e na suspeita de rubéola congênita; entretanto, é prática cara e que demanda mais tempo para ser realizada bem como para a liberação do resultado (três a quatro semanas de cultivo, em média); além disso, poucos laboratórios são equipados para realizar tal procedimento. Outra estratégia de diagnóstico a partir da cultura virai é a utilização de ensaios de imunofluorescência direta para a investigação dos antígenos virais na cultura a partir de três a quacro dias de inoculação. Também é possível a pesquisa da presença de RNA virai por técnicas moleculares. Entretanto, resultados negativos num primeiro momerto não afastam a presença do vírus na cultura.
abortamento decorrente de tais procedimentos (0,5% e 2.3%, respectivamente). Resultados discordantes podem ocorrer, como a detecção do genoma virai na placenta sem evidência na pesquisa no feto, indicando que nem sempre este está comprometido. Também é possível a ocorrência de falso-negativos na pesquisa do genoma virai na placenta quando há distribuição irregular do vírus no órgão. Na pesquisa do RNA virai no líquido amniótico, resultados falso-negativos são relacionados à colheita precoce da amostra e coincidentes com a natural imaturidade renal fetal. o que compromete a excreção de partículas virais pelo feto. A detecção do genoma virai é realizada com a técnica RT-PCR, que é específica e sensível para a pesquisa do vírus em pequenas quantidades de material. A reação utiliza iniciadores para o gene El da rubéola, seguida de PCR nested (aninhada) com iniciadores internos para o mesmo gene. Em contraste com a cultura virai. o método é rápido, oferecendo resultado definitivo em 24 horas.
Métodos moleculares
A detecção do genoma do vírus da rubéola pode ser feita a partir de amostras como sangue, raspado de oro e nasofaringe, do líquido am niótico, vilo corial, do aspirado de cristalino e de produto de concepção em casos de análise post-mortem. V sando à otimização bem como a sensibilidade do procedimento molecular, as amostras corporais devem ser colhidas naqueles momentos em que é mais provável o encontro do RNA virai - em infecções pós-natais entre uma semana ames e aproximadamente duas semanas após o início do examema. Devem-se coletar os espécimes livres de contaminação que, tão logo seja feita a colheita, deve~ ser acondicionados em gelo seco ou nitrogênio líquido e encaminhados imediatamente ao laboratório. Se o procedimento de extração de RNA for programado para uma data posterior, o espécime deve ser congelado emre -20° e -80° C de preferência acondicionado em soluções comendo inibidores de RNAse. A principal indicação dos métodos moleculares é no diagnóstico de infecção intra-útero e na confirmação da SRC. bem como no diagnóstico diferencial das
Investigação la boratori al do paciente co m rubéola
DETECÇÃO DE ANTICORPOS A infecção pelo vírus da rubéola induz a produção de anticorpos neuualizames, fixadores de complemento e hemaglutinames. Os anticorpos são inicialmente detectados no terceiro dia de exantema, chegando ao nível máximo de titulação ao fi nal do primeiro mês de doença. Os anticorpos fixadores de complemento podem ter curta duração, não sendo detectados após um ano ou mais de infecção. Os anticorpos neutralizantes e hemaglutinantes persistem por toda a vida. A resposta humoral produzirá anticorpos das classes lgM, lgG e lgA específicas para o vírus da rubéola. Há várias técnicas baseadas em ensaios de neutralização, inibição da hemaglutinação, ensaios imunoenzimáticos, fixação de complemento, entre outras, disponibilizadas para a pesquisa dos anticorpos anti-rubéola. Aqui discutiremos algumas das mais utilizadas no diagnóstico da infecção.
633
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
É uma das memdologias mais utilizadas na detecção dos anticorpos lgG e lgM antivírus da rubéola. Trata-se de mécodo ágil. de fácil realização e relativamente ba-
são raros, mas podem ocorrer na presença de alros títulos de fator reumatóide lgM. na v1gência de 1nfecção por Parvovírus B19 e na presença de anticorpos heterófilos. A pesquisa de lgA pode ser realizada em amostras de soro ou de urina, porém, na prática, não é rotineira, care-
raro. Pode ser rotalmeme auromatizado, resultando em
cendo de mémdos padronizados para a sua detecção.
ma1s agilidade na obtenção do resultado e maximizando o trabalho no laboratório. Essa merodologia vem substituindo outros testes, como a hemaglutinação indireta, pela faolidade de execução. Ensaios associados à quimilummescênoa vêm sendo difundidos pela rapidez dos resultados, pela utilização de pequeno volume de amostra - Importante no diagnóstico da infecção em crianças, pelo armazenamento dos dados obtidos e principalmente pela confiabilidade dos resultados. Em estudos epidemiológicos, os ensaios imunoenzimáticos moscram-se adequados na definição do estado imunológico de uma população, na qual uma única dosagem positiva de lgG indica comam prévio com o vírus, seja em que época for. Acualmenre, é a mecodolog1a de escolha para a confirmação de suspeita da infecção aguda em crianças e adultos, que se baseia na detecção de lgM positivo ou no aumento da titulação de lgG em quatro vezes ou mais em d uas dosagens seriadas, com intervalo de aproximadamente duas semanas. No diagnóstico da infecção incra-útero, o teste é útil na investigação de lgM fetal em sangue colhido por cordocemese. Ensaios imunoenzimáticos utilizando raspado de orofaringe como material para a pesquisa de anticorpos específicos anti-rubéola já são disponíveis, sendo adeq uados ao diagnóstico da infecção congênita em lactentes. Anticorpos lgM anti-rubéola podem ser identificados tanto na infecção primária quanto na rei nfecção. Em indivíduos previamente vacinados, a elevação dos títulos de lgM pode 1nd1car reinfecção. Torna-se. pois, importante enfatizar que títulos baixos de anticorpos lgM podem ser detectados por tempo prolongado após a infecção aguda, como resultado, na maioria das vezes, da alta sensibilidade dos testes imunoenz1mát1COS empregados (lgM residual), sendo um fatar de confusão na definição de doença ativa ou não, principalmente em gestantes. Algumas situações podem favorecer resultados incorrecos, tais como: teste realizado em amostras de pacientes imunossuprimidos ou quando há contammação bacteriana do soro. Resultados positivo-falsos para lgM
634 [ Medicina laborarorial para o clín1co
Hemaglutinação indireta (HAI)
Até há bem pouco tempo, era considerada a técnica de escolha no diagnóstico da infecção. Embora seja ainda utilizada. a HAIvem sendo substituída em alguns serviços por técnicas mais simples, ágeis e reprodutíveis. como os ensaios 1munoenzi máticos. A HAIé um método sensível. que pode ser útil na detecção de anticorpos lgG e modificada para a detecção de lgM e que permite tanto a triagem quanto o diagnóstico da infecção se amostras de soro obtidas na fase aguda e na fase convalescente forem testadas em paralelo. O aumento de quatro vezes ou mais nos títulos de anticorpos lgG em amostras de soro pareadas 1nd1ca infecção recente. Valores perSIStentes e aba1xo de 1/8 indicam ausênoa de 1nfecção. A técnica detecta anticorpos funcionais. sendo que os títulos correlacionam-se com o real nível de imunidade. Porém, é uma técnica que demanda tempo para a sua realização. Testes em soros de paoentes imunossuprimidos podem ter resultados indeterminados; além disso, amostras obtidas de pacientes que tenham recebido terapia com imunoglobulinas podem fornecer resultados falso-positivos.
Test e de avidez de lgG
Diante da detecção de anticorpos da classe lgM, há indicação da pesquisa de avidez de lgG, com o objetivo de esclarecer se a infecção é aguda ou não, principalmente em gestantes. Como os ensaios para lgM atualmeme em uso apresentam alta sensibilidade. a detecção dessa imunoglobulina pode se dever à lgM residual, relacionada à infecção passada e que pode ser detectada por meses. Assim, através de ensaios imunoenzimáticos, é possível determinar o percentual de avidez de lgG, o que se correlaciona com o tempo de infecção. Percentagem de avidez inferior
a 30% sugere infecção aguda, ocorrida há menos de três meses. Um teste em que a avidez é maior que 60% indica infecção amiga, ocorrida há mais de crês meses, sem risco para o feco. Resultados emre 30% e 60% não permitem definir o tempo provável em que a infecção ocorreu.
Outros métodos já utilizados na pesquisa de imunoglobulinas anti-rubéola
lmunofluorescência indireta: Muito empregada nas décadas passadas, era útil no diagnóstico da infecção receme por evidenciar ascensão dos títulos de anticorpos da classe lgG em quatro vezes ou mais, em duas dosagens séricas consecutivas, uma aproximadameme sete dias após o início dos simomas e outra na fase convalescência, em corno do 16° dia. Apesar de ser um mécodo fácil e de simples realização, apresema limitações, como a falta de padronização dos critérios de leitura da fluorescência, a ausência de possibilidade de automação e variáveis relativas ao microscópio de fluorescência . Também sua sensibilidade pode estar comprometida na presença de alcos níveis de facor reumatóide do tipo lgM. Tais fatores têm comribuído para sua substituição em favor de mecodologias passíveis de automação e com maior precisão, como os enzimoensaios e a quimiluminescência. Fixação de complemento: acualmeme, essa metodologia encontra-se praticamente abandonada devido às dificuldades técnicas na sua execução e à pouca disponibilidade dos insumos biológicos necessários.
mais dos títulos iniciais de anticorpos lgG (soro agudo x convalescente) ou pela presença de amicorpos lgM específicos em um dos espécimes. Os anticorpos lgM podem persistir por oito a 12 semanas ou mais (Figura 50.1). Os métodos mais adequados e mais utilizados para a pesquisa de imunoglobulinas anti-rubéola são os ensaios imunoenzimáticos. Assim sendo, por ocasião da exposição ao vírus, a ausência de anticorpos detectáveis pelos métodos imunoenzimáticos indica susceptibilidade à infecção; a presença de anticorpos confirma uma infecção passada ou vacinação indicando proteção contra a infecção (Figura 50.3). No que se refere à infecção aguda em gestantes, é fundamental a colaboração entre as clínicas de assistência pré-natal e os laboratórios de diagnóstico, no sentido de promover investigação apropriada da infecção em gestames que tenham sido expostas ou que tenham adquirido o vírus. Nesse contexto, a presença de títulos ascendentes de lgM sérica favorece o diagnóstico de infecção aguda. Entretanto, níveis baixos de lgM sérica podem ser decorrentes de lgM residual secundária a uma infecção amiga. Para solucionar esse enigma, está indicada a pesquisa de avidez de lgG anti-rubéola pelo método imunoenzimático. Vale ressaltar que a avaliação do estado de imunidade da gestante à infecção pelo vírus da rubéola é parte do protocolo básico de exames do pré-natal, sendo de indicação formal a pesquisa de anticorpos lgG e lgM no primeiro trimestre de gestação, com revisão dos testes ao fina l do segundo trimestre (Figura 50.4).
DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO INTRA-ÚTERO
DEFINIÇÃO DO DIAGNÓSTICO INFECÇÃO PÓS-NATAL
Para o diagnóstico sorológico da infecção aguda pós-natal, a pesquisa dos níveis de anticorpos deve ser feita em amostra de soro na fase aguda colhida o mais cedo possível após o início do exantema e em amostra obtida entre duas e quatro semanas depois do início da fase convalescente. As amostras devem ser testadas em pareamemo. Rubéola aguda será diagnosticada pela evidente demonstração da ascensão em quatro vezes ou
Investigação laboratorial do paciente com rubéola
A investigação da infecção fetal pelo vírus da rubéola pode ser feita pela detecção de lgM por ensaios de quimiluninescência em sangue fetal colhido por cordocentese após 22 semanas, uma vez que o feto pode não produzir anticorpos ames desse período, ou pela pesquisa de RNA virai por nested-PCR do líquido amniótico (sensibilidade de 87 a 100%; especificidade de 100%) ou, ainda, por meio de amostras do vila cariai pela técnica de RT-PCR e hibridação in situ. Vale ressaltar que a presença de material genético virai na membrama vilo-corial deve ser interpretada com cautela, pois nem sempre reflete infecção fetal (Figura 50.4).
635
Suspeita de infecção pelo vírus da Rubéola em crianças e adultos
I lgM(-1 lgG(-1
Susceptível
lgM(-1 lgG(+I
[
Imune
~ lgM(+I lgG(+) ou aumento de 4X nos Títulos de lgG em nova amostra
J
J
lgM(+I lgG(-)
Repetir
~ Infecção agudo
r
~
Indicar vacinação
Evitor contoto com grávidos
lgM(-1 lgG(-)
Falso-positivo
Figura 50.3 - Fluxograma para o diagnóstico da infecção pós-natal pelo vírus da rubéola em adulros e crianças.
DIAGNÓSTICO DA RUBÉOLA CONGÊN ITA Deve-se suspeitar da presença da rubéola congênir::1 quando existe a possibilidade da aq uisição da doença ou de exposição ao vírus da rubéola du rante o primeiro trimestre de gestação, além da evidência de uma ou mais manifestações de rubéola congênita. A confirmação é dependente do isolamento do vírus ou de marcadores imunológicos específicos. O vírus da rubéola pode ser isolado de secreções respiratórias em 80-90% dos bebês com a síndrome no primeiro mês de vida, mas a excreção virai diminui progressivamente ao longo do primeiro ano, bem como outras secreções coroorais. Substituindo o cultivo virai, há métodos moleculares de detecção do RNA virai, como o RT-PCR. Fragmentos de tecido obtidos por biópsia tecidual e sangue podem ser utilizados para a demonstração de antígenos do vírus através de anticorpos monoclonais e para a detecção de RNA virai por hibridação e PCR. A pesquisa molecular em amostras de raspado de orofaringe tem sensibilidade de aproximadamente 94% e especificidade de 100%, além de correlacionar-se com a cultu ra virai em praticamente 100% dos casos. Em crianças com catarata como manifestação da síndrome da rubéola congênita, o vírus
pode ser detectado por RT-PCR em amostras de aspirado de cristalino no primeiro ano de vida. O padrão de persistência virai. bem como a resposta imunológica à infecção intra-uterina pelo vírus da rubéola, é ilustrado na Figura 50.2 e difere daquele observado na infecção pós-natal (Figura 50.1). Os bebês apresentam, ao nascimento, títulos de anticorpos séricos lgG e lgM. Como a lgG anti-rubéola é passada passivamente pela placenta refletindo uma infecção materna, o encontro de qualquer citulação de anticorpos lgM no soro do neonato (ou secreção de orofaringe) indica que houve a produção intra-útero dessa imunoglobulina pelo feto, denunciando a infecção congênita. Com os meses, ao mesmo tempo em que se percebe queda dos níveis séricos de lgG por clareamento das imunoglobulinas adquiridas passivamente, ocorre a ascensão dos títulos de lgM. Ao fim do primeiro ano, lgG anti-rubéola pode ser o anticorpo predominante no soro da criança. Assim, a presença e a persistência dos anticorpos anti-rubéola no soro do bebê com cinco a seis meses de idade ou mais e a identificação de anticorpos precocemente na primeira infância, como a lgM específica, são indicativos de rubéola congênita. Também a elevação dos títulos séricos de anticorpos em qualquer época da primeira infância em criança não vacinada fortalece o diagnóstico de rubéola congênita.
636 ( M edicina laboratorial para o clínico ]1-- - - - -- - - - - - -- - - - - - -- - - -- - - - -- -
Suspeita de infecção pelo vírus da Rubéola em gestantes
J
I lgMH lgG(-)
lgM(-) lgG(+)
(em 2 ocasiões diferentes)
(em 2 oca siões d iferentes)
Susceptível
[
lgM(+) lgG(-)
lgM(+) lgG(+) (ou aumento de 4X nos Títulos de lgG em nova amostra 2-3 semanas após)
[
Imune
[
l
baixa
Avidez lgG
1r
Infecção aguda
indefinido
?
1r
Repetir
lgM(-) lgG(-)
J
1[ [
alto
Infecção passada
)
J
Falso-positivo
J
J
l Biópsia de vilo cariai
Amn iocentese > 15 semanas de gestação
Cordocentese > 20 semanas
1O- 12 semanas de gestação
t ·Cultura virai · Pesquiso de RNA vira i
r
- Pesquiso de RNA virai
- Pesquiso de lgM
Figura 50.4 - Fluxograma para o diagnóstico da infecção pelo vírus da rubéola adquirida durame a gestação.
CONSIDERAÇÕES FIN AIS
Em resumo, para o diagnóstico da síndrome da ru béola congénita no período neonatal, os anticorpos específicos devem ser medidos tanto no soro materno quanto no do bebê - e deste em várias ocasiões - visando a surpreender a queda dos tít ulos, o que indicaria passagem passiva de anticorpos pela placenta ou elevação dos títulos sugestiva da infecção. Se lgM específica é detecrada no soro do neonaro, a hipótese diagnóstica de infecção uansplacentária encontra-se reforçada.
Investigação laboratorial do paciente com rubéola
A rubéola é uma doença com ampla distribuição geográfica e de evolução benigna; porém, pelo seu caráter dinâmico, causa efeitos desastrosos no ser humano em formação, comprometendo a qualidade de vida daqueles congenitamente infecrados. O laboratório pode contribuir muito para a definição dos casos suspeitos de infecção aguda, que podem ser fonte de infecção para as gestantes bem como auxiliar na prevenção da aquisição da doença por aqueles indivíduos susceptíveis. No contexto
637
do acompanhamento pré-natal, os exames laboratoriais são fundamentais na condução das gestantes em risco de se infectarem e daquelas que podem ter adquirido a doença. Variadas metodologias estão atualmente disponíveis e indicadas na avaliação da infecção intra-uteri na
5. 6. 7.
e dos bebêscongeniramenre acomeridos. A aruação dos laboratórios no diagnóstico da rubéola é parte das ações de vigilância epidemiológica que visam à universalização da atenção à saúde, à imunização da população, à queda da prevalência da infecção e, conseqüentemente, à redução dos casos de rubéola congênita. REFERÊNCIAS 1.
Andrade JQ, Bunduki V, Curti SP, Figueiredo CA, Oliveira MI, Zugaib M. Rubella in pregnancy: imrauterine transmission and perinatal ourcome during a Brazilian epidemie. J Clin Vi rol. 2006;35:285-91. 2. Banatvala )E, Brown DW. Rubella. Lancer. 2004;363:1127-37. 3. Brasil. Ministério da Saúde. Guia de Vigilância Epidemiológica. 6' ed. Brasília : Ministério de Saúde; 2002. Disponível em: htrp://porral.saude.gov.br/porral/arquivos/ pdf/Guia_Vig_Epid_novo2.pdf. 4. Casrillo-Solórzano C Carrasco P, Tambin1G, ReefS, Brana M, Quadros CA. New horizons in rhe conrrol of Rubella and prevemion of congeniral rubella syndrome 1n the A méricas. The J lnfecr Dis. 2003;1 87 Suppi 1:S146-52.
Cemers for Disease Comrol and Prevemion [home page da lm erner]. Disponível em : hnp://www.cdc.gov. De Samis M , Cavaliere AF. Srraface G. Caruso A. Rubella infection in pregnancy. Reprod Toxicol. 2006;21 (4):390-8. Gershon AA. Rubella vírus (German M easles). ln: Mandei! GL. Bennen )E. Principies and Pracrice of lnfecrions Diseases. 6rh ed. New York: Churchill Livingsrone; 2005.
p. 1921-4. 8.
Informações de Saúde. Minisrério da Saúde [home page da lmerner]. Disponível em: hnp://w3.darasus.gov.br/da-
tasus/datasus.php7area=359A1BOCODOEOF359G3H011Jd 1L2M ON &VInclude=../sire/rexro.ph p. Lanzieri TM. Parise MS. Siqueira MM, Forraleza BM, Segarro C Prevors R. lncidence, ciln1cal fearu res and es[lmared cosrs of congen1ral rubella syndrome after a large rubella ourbreak in Recife, [lrazil, 1999-2000. Pediatr lnfecr Dis ). 2004;12:11 16-22 . 10. MaceM, Co1me D, Six C Levy-Brulh D, Parem du Châreler I, lngrand D, er ai. D iagnosric value of Reverse Transcriprion-PCR of amnioric fluid for prenatal diagnosis of congeniral rubella 1nfect1on 1n pregnam women wirh conf1rmed primary rubella in fecrion. j Clin Microbial. 2004;42:4818-20. 11. Parrerson MJ. Rubella . ln: Rudolph CD. Rudolph AM. Hosrener MK. Lisrer G. Siegel NJ (eds). Rudolph's Pediat ncs. 21a ed. New York: Me Graw H1ll. P. 1075-9. 12. Surros de Rubéola no Brasil2007 - 2008 [home page da lmerner]. D1sponível em: hrrp://porral.saude.gov.br/ porral/arqulvos/pdf/nma_rubeola140708.pdf
9.
638 ( M edic ina laborator ial para o clínico ]1--- -- - - - - -- - -- - - - - - - - -- - - -- - - -- - - -
Júlio César de Faria Couto Suzane Pretti Figueiredo Neves
51
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM INFECÇÃO PELO Toxoplasma gondii
O primeiro relam da mxoplasmose em humanos foi feiw por janku, em 1923, ao identificar o parasim na retina de uma criança de onze meses portadora de hidrocefalia e microftalmia, com coloboma na região macular. Nessa época, o agente etiológico já havia sido isolado em 1908 simultaneamente por dois grupos de pesquisadores: Splendore (Brasil) e Nicole & Manceux (Tunis, África). No entanto, o procozoário só foi classificado como Toxoplasma gondii em 1942. O Toxop/asma gondii é parasim intracelular obrigatório de células nucleadas. Tem o gam e outros felinos como hospedeiros definitivos. os humanos e outros mamíferos como hospedeiros intermediários e os pássaros e outros animais domésticos como reservatórios. A transmissão da infecção geralmente ocorre por meio do comam do organismo vulnerável (soronegativo) com a forma infectante do parasito, o oocisto, que é formado no tubo digestivo do hospedeiro defin itivo. Além disso, a infecção também pode ser transmitida pela ingestão da forma cística do parasim, encontrada nos tecidos de animais infectados que servem de alimento ao homem. A infecção pelo Toxoplasma gondii é altamente prevaleme e normalmente assimomática. Entretanto, pode acometer gravemente tanto o feto (como resulcado de uma infecção materna durante a gestação) quanto um indivíduo imunodeprimido. Nessas situações podemos observar grande morbidade e mortalidade. A toxoplasmose congénita é um grave problema de saúde pública, por ser uma importante causa de deficiência mental, au-
ditiva e/ou neuromotora, fato que em nosso meio não é conhecido em sua magnitude, por não ser uma doença de notificação compulsória e também pela escassez de trabalhos que possam dimensionar o problema entre nós. Além do mais, o fato de uma criança nascer sem sintomas clínicos não impede o desenvolvimento de seqüelas que possam surgir ao longo do seu desenvolvimento. Seqüelas visuais, auditivas e intelectuais decorrentes do processo infeccioso podem aparecer no decorrer do desenvolvimento da criança. mesmo naquelas assimomáticas ao nascimento. Indivíduos imunodeprimidos possuem risco mais alm de desenvolverem toxoplasmose, incluindo aqueles portadores de doenças hemamlógicas (particularmente linfomas), transplantados, infectados pelo HIV positivo ou portadores de AIOS. A encefalite roxoplásm ica é a forma mais comum de apresentação da doença nesse grupo de pacientes e a mais freqüen te causa de lesões focais no sistema nervoso central de pacientes com AIOS. Outros órgãos comumeme envolvidos são pulmões, olhos e coração.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
AGENTE ETIOLÓGICO O Toxoplasma gondii é capaz de infectar animais herbívoros, onívoros e carnívoros, inclui ndo todas as ordens de mamíferos. Seu sucesso como patógeno é atribuído
à sua capacidade de invadir e se multiplicar dentro de quase rodos os ripas celulares de vertebrados. No imenor das células, o parasito forma vacúolos que o protegem contra os radicais livres, variações do pH, flutuações osmóticas e contam com anticorpos, evitando assim os mecanismos de defesado hospedeiro. O parasito possui organelas que permitem sua sobrevivência, crescimento e replicação somente no ambiente intracelular. Sua total dependência de purinas da célula hospedeira é o único mecan1smo bioquím1co conhecido que restringe sua existência ao meio intracelular. O coxoplasma pode ser encontrado na natureza em três formas distintas: Taquizoíto: é a forma invasiva do wxoplasma observada na fase aguda da infecção. Possui amígenos de superfície contra os quais são direcionados os anticorpos do hospedeiro. São pouco móveis, multiplicam-se rapidamente levando à demuição da célula hospedeira e podem ser encontrados nos líquidos orgânicos, excreções, secreções, células do sistema monocítico-fagocitáno, células nervosas e musculares. Bradizoíto: principal forma do coxoplasma encontrada na fase crônica da doença. Os bradizoítos se encontram no interior de cisros que são formados dentro das células hospedeiras. Os cistos podem variar de tamanho, dependendo da dimensão da célula parasitada e do número de bradizoítos no seu imenor, desde pequenos ciscos comendo poucos organismos até grandes cisros que podem comer até 3.000 bradizoítos no seu interior. Os fluidos digestivos são capazes de destruir a parede do cisco liberando os bradizoícos que podem sobreviver por vánas horas nesses fl uidos, tempo que permite a invasão de células locais. Os cistos permanecem nos teodos durante meses ou anos, freqüentemente du rante toda a vida do hospedeiro. Durante o período de infecção latente, os cistos podem ser encontrados no cérebro e nos músculos esqueléticos e geralmente não estimulam reação inflamatória do organismo. Podem ser destruídos pelo aquecimento a 66°(. por congelamento a - 20°( e também por dessecação. Oocistos: os gatos infectados liberam os oociscos durante uma a duas semanas, sendo que até 10 milhões de oocistos podem ser eliminados por dia. Após serem eliminados no ambiente, os oocistos não são infectantes até ocorrer a esporulação, que demora entre um e cinco dias, dependendo da aeração e temperatura, resultando
640 [ Medicina laboratorial para o clínico
na formação de oiro esporozoíros. A viabilidade dos aocistos está diretameme relacionada à umidade do solo, podendo permanecer viáve1s por aré 18 meses.
CICLO DE VIDA Os gatos e membros da família dos feli nos são os hospedeiros definitivos, pois permitem o ciclo sexuado no epitélio intestinal e o ciclo assexuado nos ourros tecidos. Os gatos suscetíveis podem adquirir a infecção pelo T gondii por meio da ingestão de oocistos encontrados na natureza ou de cistos em tecidos de outros animais. Após a ingestão de al imento contaminado, os flu1dos digestivos rompem a parede dos cistos e liberam organismos que são semelhantes aos taquizoítos que penetram no epitélio intestinal do gato, originando vários merozoícos que se transformam em gametas. O macrogameta permanece dentro de uma célula epitelial aguardando o microgameta sair de sua célula e fecundá-lo, formando o ovo ou zigoto. Este evolui dentro do epitélio, dando origem ao oocisto. Após alguns dias, a célula epitelial se rompe, liberando o oocisto tmaturo. No solo, esporulam dentro de um a 21 dias. Nesse processo o oocisto divide-se em esporoblastos. Cada esporoblasro desenvolve uma parede (esporocisro) dentro da qual ocorrem duas novas divisões, produz1ndo quatro esporozoíms dentro de cada esporocisco e oico ao cada dentro do oocisto. Este agora, inteiramente esporulado, é infectante quando ingerido, dando origem às formas extra-intestinais· A esporulação varia conforme as condições ambientais e climáticas: em climas quentes (24°C) os oocistos podem permanecer viáveis por até 18 meses e podem sobreviver vários meses na água e anos no solo. O toxoplasma é transmitido ao homem de vánas formas: • através da ingestão de ciscos presentes em carnes contaminadas e ingeridas mal-passadas: os bradizoíros podem ser encontrados em cerca de 8%da carne de origem bovina e 20%da carne de suínos utilizada para consumo. O coz1mento da carne à temperatura méd1a de 67"C ou o congelamento a temperaturas inferiores a 12"( é capaz de destruir o parasico; • oocistos infectantes podem ser ingeridos por contam feca l-oral liberando os esporozoícos que levam à infecção após invadirem a mucosa intestinal;
• o oocisto pode ser encontrado no solo ou na água, comaminando o ambieme no qual o homem está inserido. Logo, o inadequado saneamemo ambiemal associado à baixa instrução cria oportunidade para ingestão de oocisws existenres no solo, por meio da comaminação da água usada para ingestão ou higiene dos alimemos. A falta de educação sanitária comribui para o aumemo do risco em adquirir a infecção, o que pode ser modificado adorando-se medidas de prevenção primária durance a assistência pré-natal. Essa afirmação pôde ser confirmada em um estudo brasileiro sobre a incidência da wxoplasmose aguda em mulheres em idade reprodutiva, que mosrrou que a falta de saneamento básico não é um faror de risco para adquirir-se a roxoplasmose aguda quando medidas de prevenção primária são utilizadas; • a transmissão da infecção também depende da presença de veículos de transmissão de oocisws. Os inseros coprofágicos e os animais transportadores de oocisws (moscas, baratas e raws), por meio de suas paras. podem contaminar os alimentos não acondicionados de forma adequada. A ingestão de formas císticas do parasiw presentes na carne crua, leite não pasteurizado, ovos crus ou de oocisws encontrados em verduras não lavadas de forma adequada - relatados como fawres de risco de infecção aguda em nosso meio - mostrou-se importante apenas entre as gestantes, cujo risco variou conforme o alimento ingerido. A rransmissão oral da infecção pode ocorrer, ainda, por contaminação acidemal de reservatórios de água provocando surws epidêmicos e, neste caso, atingindo pessoas de qualquer classe social; • além da transmissão oral, existem ourras formas de contaminação: rransfusão sangüínea ou transplame de órgãos, acidental em laboratório e transplacentária. Essas formas de transmissão são importantes quando o sangue de uma pessoa infectada apresentando taquizoítos na circulação entra em conraro com um recepwr soronegativo; • após a contaminação, a parede externa do cisto ou do oocisto é degradada enzimaticamente e a forma infectame (taquizoíw) é liberada na luz intestinal, onde invade e se multiplica nas células vizinhas. As células infectadas se rompem e
liberam os taquizoítos que invadem as células contíguas e podem alcançar os vasos sangüíneos e linfáticos, disseminando-se por todo o organismo. A disseminação é generalizada e o T gondii pode invadir qualquer célula do organismo. Nesta fase sua divisão é rápida, passando de 100 a 100.000 taquizoítos em seis horas. Essa rápida multiplicação explica a eficácia do tratamenro utilizando inibidores da síntese de falam. A parasicemia normalmente é de curta duração. Entretanto, em cerca de 30% dos pacientes pode durar mais de quatro semanas. A parasitemia estimula a resposta imune do hospedeiro. inicialmente humoral; após alguns dias, com ativação dos linfócitos T, há produção de alto número de citocinas levando à diminuição gradual da parasitemia. Alguns parasitos que não são desuuídos durante esse processo podem migrar para determinados tecidos, particularmente cérebro, músculos, pu lmões, retina e, no caso da gestante, há possibilidade de migração para a placenta. Nesses locais, o raquizoíto se encista, adquirindo a forma de bradizoíw. o qual permanecerá em estado latente, com baixa taxa de replicação celular, durante toda a vida do hospedeiro.
EPIDEMIOLOG IA Avaliações epidem iológicas em codo o mundo têm demonstrado que a prevalência da coxoplasmose varia entre 50 e 90%, com diferenças enrre as diversas regiões. Alguns países apresencam-na baixa, com índices inferiores a 40%, como a Escandinávia, Tailândia, Malásia, Hong Kong. Irã e Austrália. No Brasil. varia de 40 a 60%. Aqui também se observa ampla variação, sendo registrada elevada prevalência em locais como Ceará (83.7%), Rio de Janeiro (77,1%), Manaus (71%), São Paulo (67%) e Goiãnia (65,8%). Belo Horizonre apresenca baixa prevalência (43%), com variações conforme a região e a população estudada.
APRESENTAÇÃO ClÍNICA No adulto, a roxoplasmose pode manifestar-se de diferentes formas:
Investigação la boratorial d o paciente com in fecção pelo Toxoplasma gondii
641
• toxoplasmose adquirida: as manifestações clínicas da roxoplasmose aguda são clinicamente 1naparemes em 90% dos casos. Os primeiros smromas como cefaléia, astenia e linfadenopac1a sem febre surgem após um período de incubação de nove a dez dias. A linfadenopatia eventualmente pode cursar com febre acompanhada de mal-estar geral, mialgia e odinofagia. Os sintomas normalmente persistem por poucos dias e são facilmen te confundidos com resfriado, gri pe ou mesmo mononucleose Infecciosa. Em alguns paciemes, a linfadenopatia pode persistir por até se1s meses. A retinocoroidite raramente ocorre na infecção aguda (l a 2%), sendo geralmente unilateral. Todos os indivíduos apresentando infecção aguda devem receber tratamento sintomático. No caso de gestantes, é importante que sejam encaminhadas para propedêutica especializada devido ao risco de acomec1memo fetal; • rearivação:a resposta imunológ1ca após a mfecção aguda leva ao controle da infecção com parada da replicação dos taquizoíros e formação de c1sros em alguns tecidos. Esses cisros enconrram-se em estado de "equilíbrio imunológico" com o hospedeiro, uma vez que induzem pouca ou nenhuma resposta inflamatória em indivíduos sadios. Emretamo, esses CIStos possuem caráter d1nâmico, pois o paras1ro em seu interior encomra-se em conrínua multiplicação de forma lema. o que evenrualmenre pode levar à ruptura do mesmo e liberação dos parasiros que imediacameme invadem as células vizinhas. Durante a gestação observa-se redirecionamemo da resposta imune em favor de uma resposta humoral em der rimemo da resposta imune celular. Por isso. podem-se observar episódios de reativação com mais freqüência nesse grupo populacional. este caso observa-se a reativação de um foco ocular, podendo levar a sintomas clínicos significativos em algumas pacientes. Tratase normalmente de um quadro aurolim itado e a gescame apresenta apenas alterações locais sem comprometimento sistêmico. Laborarorialmente observa-se aumento na concentração dos anticorpos lgG que pode ser precoce ou simultâneo aos sintomas clínicos. A reativação pode ocorrer tanto em gestantes saudáve1s como em imunodeprimi-
642
Medicina laboratorial para o c lín ico
das (mais comum). Em gestantes imunocompetenres trata-se de um fenômeno local. sem disseminação de taquizoícos na circulação, por isso não há risco para o fero. já em gestanres imunodeprimidas há o nsco de disseminação de taqUizoíros na ci rculação, com risco de infecção fecal. Dessa forma, para essas mulheres recomendam-se atualmenre as mesmas orienrações profiláticas que são dadas para as gestanres susceríveis, a fim de evitar quadros de reinfecção. A reativação da roxoplasmose é pouco freqüenre em pacientes com imunossupressão induzida por drogas. No enranro. é relativamente comum em pacientes com AIDS. Neste caso. a doença encontra-se normalmente restrita ao sistema nervoso central, sem comprometimento de outros órgãos. A reativação da roxoplasmose nesses pacientes pode ser confirmada por meio de exames de imagem que demonstrem a presença de abscesso cerebral que pode regredir após terapia específica. Como a reanvação é uma característiCa predominante da 1nfecção avançada pelo HIV, é multo raro seu apareomento sem oueras complicações associadas; • reinfecção: é geralmenre aceiro que a infecção primária pelo roxoplasma leva à formação de anticorpos proterores contra reinfecções. Entretanto, a possibilidade de reinfecção cem sido escudada e alguns casos têm sido descriros. particularmente em gestanres, mesmo imunocompecenres. Existem várias cepas de roxoplasma que não induzem 1mun1dade cruzada entre elas. Desta (arma, acredita-se que a reinfecção possa ocorrer devido ao conta to do hospedeiro com o roxoplasma de uma cepa diferente daquela que induz1u a produção de anticorpos lgG du rante a infecção aguda inicial. Pouco se sabe atualmenre a respeito da incidência desse quadro. particularmente na gestação. Mais limitados ainda são os conheomentos a respeiro das manifestações clínicas e da resposta sorológica. Há relates de pacientes assmromát1cos, como de indivíduos apresentando sintomas gripais e linfadenopacias. Em relação à resposta sorológica, parece que os quadros de re1nfecção. ao contráno da reativação da infecção latenre. podem cursar com a detecção dos anticorpos e lgA e também lgM. Contudo, muitas dúvidas ainda necessitam
ser esclarecidas. Não há dados na literatura sobre risco para o feto nessas situações. Existem alguns trabalhos que mencionam essa possibilidade, sem afirmar precisamente o risco; • na roxoplasmose congênita, o parasito pode atingir o feto em qualquer idade gestacional, sendo a infecção fetal mais comum quando a infecção materna ocorre no último trimestre da gestação. Apenas 20-30% das crianças com toxoplasmose congênita têm evidência de doença ao nascimento. Apesar do quadro clínico da roxoplasmose congênita ser extremamente variável, desde uma infecção grave fulminante até casos moderados e subclínicos, é importante ressaltar que as crianças que apresentam a doença clínica freqüentemente têm acometimento neurológico, quer na forma precoce, quer como seqüela tardia observada na infância e adolescência. Nesses casos, após o período neonatal. a doença geralmente está confinada ao sistema nervoso central e aos olhos. A identificação da infecção subclínica é difícil e o estudo minucioso da mãe poderá propiciar o diagnóstico desses casos, que merecem atenção especial, pois apresentam bom prognóstico quando tratados precocemente e por tempo prolongado. Na criança sintomática podemos observar várias manifestações clínicas, isoladas ou associadas: retinocoroidite, hidrocefalia ou microcefalia, retardo neuropsicomoror, calcificações intracranianas, convulsões, febre ou hipotermia, hepatoesplenomegalia, icterícia, exantema e anemia. A icterícia, encontrada principalmente nas crianças que apresentam forma predominantemente visceral da toxoplasmose congênita, tem freqüentemente início precoce, mas pode ocorrer tardiamente nos primeiros meses de vida. Pode ser observada acolia fecal nos casos com hiperbilirrubinemia e com fração direta muito aumentada. A anemia é sinal clínico freqüente, podendo ser causada por sangramento, hemólise e/ou diminuição de produção sangüínea. Quando a doença é clinicamente reconhecível ao nascimento, geralmente o quadro é grave, estando presentes sinais de lesão do sistema nervoso central (SNC); e mesmo quando tratados, esses recém-nascidos raramente se recuperam sem seqüelas.
TRANSMISSÃO VERTICAL
A transmissão do parasito é rara no início da gestação, por outro lado, o acometimento fetal é mais grave nesse período. O risco de transmissão fetal encontrase diretamente relacionado à idade gestacional na qual ocorreu a infecção materna, aumentando de 15% para 50% entre o primeiro e o terceiro trimestre. Se a infecção é adquirida nas últimas semanas de gestação, o risco de transmissão pode chegar a 90%. Por outro lado, o risco do feto desenvolver uma doença grave é inversamente proporcional à idade gestacional. Se a infecção materna é adquirida precocemente na gestação, a infecção fetal pode levar a abortamento, natimorto ou doença fetal grave. Entretanto, quando ocorre tardiamente, o resultado usual é o parto de um recém-nascido apresentando infecção subclínica (Figura 51.1)._
•
Risco de transmissão fetal
•
Gravidade da infecção congênita
Figura 51.1 - Prognóstico fetal conforme a idade gestacional da infecção materna.
A infecção fetal decorre da passagem do parasito por via hemarogênica transplacentária. Nesses casos, os taquizoíros colonizam a placenta, que permanece infectada durante toda a gravidez, podendo funcionar como reservatório de parasitos. Após a colonização da placenta, os taquizoíros podem ser transmitidos ao fero via cordão umbilical. disseminando-se no sangue e podendo alcançar todos os órgãos e tecidos fetais. Quanto mais desenvolvida e vascularizada a placenta, mais ela favorecerá a multiplicação do toxoplasma. A gravidade da infecção fetal está relacionada com a virulência da cepa, parasitem ia fetal. idade gestacional na qual ocorreu a infecção, grau de maturação do sistema imunológico do fero e com o tro-
Investigação laboratorial do pacie nte com infecção pelo Toxopla sma gondii
643
pismo tissular de cerras cepas. Como não foi confirmada até agora a produção de toxinas pelo parasito, acredita-se que os mecanismos envolvidos na patogênese da doença dependam da destruição celular e de fenômenos de hipersensibilidade. Os parasicos geralmente se multiplicam em cecidos com acividade imunológica modulada, como o sistema nervoso central, retina e músculos.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL NA INFECÇÃO PELO
Toxoplasma gondii
CINÉTICA DOS ANTI CORPOS NA INFECÇÃO Os anticorpos das classes lgG, lgM, lgA. lgE são produzidos em resposta à infecção pelo T gondii, levando à lise dos taquizoítos quando esses anticorpos são combinados com as proteínas do complemento. Tem sido demonstrado que altas concentrações de anticorpos lgM, lgA e lgE específicos podem ser deteccadas na fase aguda da infecção, com predomínio de lgM sobre as outras classes. Durante a fase crônica, lgG é a imunoglobulina predominante, sendo eventualmente encontrados anticorpos lgM. A produção, ascensão e a duração dos anticorpos na roxoplasmose são diferentes de outras doenças infecciosas. Os primeiros anticorpos (da classe lgM) são produzidos aproximadamente 48 a 72 horas após o contara com o parasito, estimulados por um antígeno de membrana, a proteína P30 Os anticorpos lgM podem ser detectados laboracorialmente entre sere e 15 dias após a infecção, atingindo seu pico um mês após a contaminação, quando sua concentração diminui progressivamente até a negacivação dos testes, em crês a seis meses. Na maioria dos pacientes esses anticorpos encontram-se ausentes na fase crônica /latente da doença. Entretanto, em 5% dos casos podem persistir por alguns meses ou mesmo anos, sendo denominados ANTICORPOS lgM RESIDUAIS. Nestes casos, sua concentração normalmente é baixa, sempre acompanhados dos anticorpos lgG em quantidades estáveis. Os anticorpos lgA são igualmente detectados ao fi nal da primeira semana. Na roxoplasmose aguda, lgM e lgA aumentam em paralelo. No entanto, esses anticorpos persistem em média por três a quauo meses após a infecção em cerca de 90% dos casos. Desta forma, a
presença de lgM associada a anticorpos lgA é forre indicativo de infecção aguda e cem sido utilizada no auxílio diagnóstico da wxoplasmose aguda em gestantes e no diagnóstico da fo rma congênica. Entretanto, diferenças individuais têm sido observadas, bem como a presença de lgA residual, acé oito meses após a infecção. A caxa de falso-negativos para esse exame é de 5%. Os anticorpos lgG são detectados duas semanas após a infecção. Os antígenos-alvo das lgG são numerosos, mas dois antígenos de membrana parecem mais importantes: as proteínas p30 e p35. Na ausência de tratamento específico, atingem sua concentração máxima após dois meses, quando seus valores se estabilizam em um platô por um período médio de três a quatro meses, decrescendo a seguir até atingir concentração variável segundo os indivíduos, mantendo-se positivos dura nte toda a vida, conferindo imunidade à doença, ainda que parcial, pois não impedem a reacivação em casos de imunodepressão. Quando o tratamento específico para coxoplasmose é administrado precocemente, a resposta humoral pode ser bastante modificada: o aumento na concentração dos anticorpos lgG torna-se mais lento e seus títulos permanecem relativamente baixos enquanto du rar o tratamento (Figura. 51.2).
"
/
-'
I
I
/
\
I
I
I
I
I I
I
\
-- ------
I
I I I
\
I
--024
2
Semanas - - - lgM
4
6
12
Meses
2
3 4 5 6 Anos
lgG
--lgA
Figura 51 .2 - Ciné[ica dos ancicorpos na infecção pelo toxoplasma.
Os anticorpos lgE são menos escudados. Parecem ser os primeiros anticorpos a serem produzidos após o contara com o parasito. Sua cinética é semelhante à da lgM. Altas concentrações desses anticorpos podem ser observadas no primeiro mês após a infecção e não são mais detectados após quatro meses. A detecção de anticorpos lgE tem sido observada em casos de reati-
644 [ Medicina laborawrial para o clínico ]f-- - - -- - - - - - - - -- - -- -- - - - - - - - - - - - -
vação em indivíduos imunodeprimidos, aumentando
concomitantemente com os anticorpos lgG e desaparecendo rapidamente. Sua utilização no diagnóstico da roxoplasmose congênita também cem s1do avaliada, porém tem demonstrado baixa sensibilidade (menor que a dos anticorpos lgM). Em pacientes apresentando retinocoroidite pode ser observada em 46% dos casos. Entretanto, sua uti lização prática no diagnóstico da infecção aguda ainda não foi estabelecida
PRI NCÍPIOS DO DIAGNÓSTICO LABO RATORIA L DA TOXOPLASMOSE Isolamento do agente: como em roda doença infecciosa, o teste laborawrial ideal é o isolamento do agente infeccioso. Entretanto, quando isto não é possível, podemos lançar mão de métodos sorológicos e, atualmente, métodos moleculares. No caso da coxoplasmose, é descrito o isolamento do parasito do sangue e líquidos corporais, em casos agudos e da placenta e tecidos fetais, na forma congênita. Todavia, o teste requer inoculação em animais ou culturas celulares, o que inviabiliza seu uso nos laboratórios de rotina. Histologia e Citologia: permite demonstrar o parasim (taquizoícos) ou múltiplos cistos próximos da lesão inflamatória necrótica em cortes de tecido ou esfregaços de líquidos corporais (LCR, BAL líquido amniótico) ou ainda linfadenite característica da doença. O uso de anticorpos monoclonais antiTgondii nessas amostras mostrou aumentar a especificidade e sensibilidade das pesquisas. Métodos moleculares: métodos de amplificação do ácido nucléico têm sido de grande valia no diagnóstico das TORCHS (infecções congên1tas mais prevalentes: roxoplasmose, rubéola, cicomegalovírus, herpes. sífilis), principalmente nas formas das doenças onde os demais métodos são limitados. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido utilizada com sucesso para o diagnóstico de coxoplasmose congênita, ocular e da coxoplasmose em indivíduos com AIDS. Pode ser realizada em diversos fluidos, incluindo líquido am niótico, placenta, tecido cerebral, sangue, líquor, urina, humor vítreo, humor aquoso, fluido broncoalveolar e derrames pleural e peritoneal. A utilização da biologia molecular revoluoonou o acompanhamento pré-natal da coxo-
plasmose. O diagnóstico pré-natal da roxoplasmose congênita pode ser realizado no líquido amniótico após a 18a semana de gestação, com sensibilidade variando de 62,5% a 97.4%. Possui impon ames implicações para o prognóstico fetal. assim como para a evolução neonacal. possibilitando o acompanhamento da gescame por uma equipe multidisciplinar com identificação precoce de alterações durante a gestação, parco e no período pós-natal imed iato. Permite, ainda, que os cuidados do recém-nascido sejam ocimizados a fim de melhorar o prognóstico dessas crianças. Para o clínico, entretanto, é importame ressaltar que nem todos os laboratórios disponibilizam o teste, ainda de custo bastante elevado e necessitando de equipe treinada e especializada. Por outro lado. técnicas caseiras devem ser absolutamente padronizadas antes de utilizadas no diagnóstico e, para tal, o cantata do médico-assistente com o patologista clínico é sempre desejável, pois, apesar da alta sensibilidade e especificidade, o nsco de falso-pos1t1vos e negativos. como em qualquer teste, não está eliminado. Na forma ocular, há estudos mostrando o uso da PCR no humor aquoso para o diagnóstico de uveíte, mas os autores sugerem que o coeficiente Goldmann-Witmer, relação entre anticorpos enconcrados no hu mor aquoso e no sangue. seja também utilizado para maior sensibilidade (ver métodos sorológicos). Em pacientes com AIDS e neurocoxoplasmose, a PCR vem sendo utilizada tanto no LCR quamo no sangue. Neste último. enconcraram-se sens1bil1dade e espeCificidades de 80% e 90%, respecrivamence, enquanto no líquor estas foram de 100% e 94,4%. Métodos sorológicos: os testes sorológicos são, ainda, os mais usados no diagnóstico laboratorial da coxoplasmose. Mostram. indiretamente, a infecção, pela detecção dos ancicorpos que reagem à presença do parasito. Testes sorológ1cos para detecção de antígenos circulantes não são utilizados na prática clínica. O pri meiro exame a ser desenvolvido. a reação de Sabin-Feldman. ou teste do corante, bem como a reação da fixação do complemento, não são hoje mais utilizados com fi ns diagnósticos. Foram substituídos por testes mais bem padronizados, de ótimo desempenho, sensibilidade e especificidade. São eles a hemagl utinação, a imunofluorescência. os ensaios imunoenzimáticos (ELISA e derivados) e a quimioluminescência. Descreveremos, a seguir. alguns aspectos relaoonados a eles:
Investigação laboratoria l do paciente com infecção pelo Toxoplasma gondii
645
Hemaglutinação: é de fácil execução, bararo e não exige uso de equipamentos, pois a leitura da reação é visual. Detecta anticorpos séricos que reagem com antígenos de toxoplasma presentes na superfície de hemácias de animais, mas não discrimina a classe do anticorpo, se lgG ou lgM. Sendo assim, informa apenas se o indivíduo apresenta-se infectado ou não, não sendo adequado para diferenciar infecção recente de infecção tardia. lmunofluorescência indireta (IFI): detecta anticorpos séricos que reagem com o parasito fixado em lâmina, sendo o imunocomplexo resultante revelado por antiimunoglobulina (ancilgG ou antilgM humanas) ligado a um fluorocromo. A reação é observada em microscópio de fluorescência. O valor de corte (cut-off) para ambos os testes, lgG e lgM antitoxoplasma, é uma diluição do soro do paciente de 1:16. Caso essa diluição inicial seja positiva, procede-se a diluições seriadas até que não seja observada mais fluorescência. É técnica barata, porém trabalhosa, e exige soros de referência para sua padronização, bem como microscopista experiente. Vem sendo substituída cada vez mais pelas técnicas imunoenzimáticas e quimioluminescentes. Por ser menos sensível, não detecta lgM residual. lmunoensaios enzimáticos (ELISA): de princípio semelhante à imunofluorescência, detecta várias classes de anticorpos: lgG. lgM, lgA e lgE anticoxoplasma. Permite que o soro de vários pacientes seja examinado de uma só vez, sendo mais prático que aquela. Atualmente, existem vários testes automatizados, com resultados bastante reprodutíveis. Esses ensaios podem fornecer resultados apenas qualitativos, ou seja, são positivas aquelas amostras cuja leitura está acima do valor de corte do teste e negativas aquelas abaixo desse valor. Alguns laboratórios referem como duvidosos ou indeterminados resul tados ± 10% o valor de corte. Hoje, a maioria dos kits fornece resultados semiquantitativos e é possível estimar quão distante ou próximo do valor de corte está o paciente. Não detecta lgM residual. São variações da técnica original de ELISA, o ELISA de captura, o MEIA - imunoensaio enzimático em micropartículas - e o ELFA - "ELISA fluorescente", ambos mais sensíveis, principalmente na detecção de lgM. Todos estes detectam lgM residual. Quimiolumi nescência: de extrema sensibilidade, detecta os anticorpos anticoxoplasma séricos através de imunoglobulinas anci lgG ou antilgM marcadas com
composro luminescente, usando como alvo micropérolas revestidas com antígenos do parasico. Também detecta lgM residual. Coeficiente de Witmer: trata-se de um cálculo matemático que permite estimar se está havendo produção local de anticorpos lgG -no vítreo e humor aquoso - na suspeita de coxoplasmose ocular. Só deve ser utilizado com os títulos obtidos por imunofluorescência indireta, pois os demais mécodos não são padronizados para outros líquidos biológicos que não sangue. Para tanto, faz-se a IFI no soro e no líquido ocular para detecção de lgG anricoxoplasma e dosa-se a lgG total em ambas as amostras por imunoturbidimetria ou nefelometria. Destacamos que seu uso vem sendo substituído pela reação da polimearse em cadeia. O coeficiente é dado pela fórmula: C = IFI líquido
I
IFI soro x lgG soro
I
lgG líquido
Resultados superiores a três indicam produção intraocular de anticorpos.
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO EM INDIVÍDUOS IMUNOCOMPETENTES
A mais forre evidência de uma infecção aguda em indivíduos imunocompetemes é a viragem sorológica verificada por meio de análise de duas amoseras consecutivas: a primeira soronegativo e a segunda soropositivo. Emretamo, a detecção de lgM, não acompanhada d e lgG, num indivíduo sintomático com suspeita de infecção aguda, sugere fortememe o diagnó stico. Em tais casos (lgM +/lgG-), novo exame deve ser realizado, 15 a 20 dias após o primeiro, para verificação da virage m de lgG, confirmando-se emão o diagnóstico de infecção aguda e soroconversão receme. Caso não ocorra a viragem, devemos pensar em lgM fa lso-positiva ou mesmo amicorpos lgM de nosso reperrório imune natural. Nos paciemes assintomáticos, portadores de infecções amigas, como freqüentememe encontrados entre os doadores de órgãos, gestames e indivíduos portadores do HIV, o perfi l encontrado é, em sua maioria, lgG positiva/lgM negativa.
646 [ Medicina laborarorial para o clínico )1---- - - - - - -- - - - -- - - -- - - - - -- - - - -
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO EM INDIVÍDU -
OS IMUNODEPRIMIDOS Em função da alta prevalência da roxoplasmose, a incidência de soroconversão em pacientes apresentando AIDS é relativamente baixa, situando-se em torno de 1.9%. Entretanto, os critérios sorológicos habitualmente observados em um quadro de infecção aguda estão presentes de forma inconstante: altas concentrações de anticorpos são observadas em apenas 30% dos casos; um aumento significativo dos títulos de anticorpos pode ser detectado em 38% dos pacientes e a presença de lgM pôde ser comprovada em apenas 4,8% dos casos. O diagnóstico sorológico ESTÁ dificultado, uma vez que há comprometimento na síntese de anticorpos. Por isso, o título dos anticorpos lgG pode aumentar, permanecer constante ou mesmo diminuir durante a infecção e não há correlação com lgM, pois esta não é detectada com freqüência. Mesmo utilizando diferentes técnicas para pesquisa dos anticorpos, não se observou aumento na sua taxa de detecção, traduzindo mais uma disfunção na sua produção que problemas metodológicos na detecção dos mesmos. Dessa forma, nos pacientes imu nodeprimidos, a toxoplasmose sintomática corresponde, na maioria dos casos, a quadros de reativação de infecção latente. Asorologia é de pouquíssimo auxílio na rearivação. Nesses pacientes, a rearivação é definida como o aumento dos anticorpos lgG com ou sem a presença de anticorpos lgM. O acom panhamento de pacientes HIV positivo rem demonstrado prevalência da toxoplasmose (75%), com incidência de rearivação em torno de 20%, o que corresponde à incidência anual de 12%, sendo que em 80% dos casos o aumento nos títulos dos anticorpos não é acompanhado nem imediatamente seguido de sinais clínicos de roxoplasmose evolutiva, o que provavelmente traduz quadros de reativação subclínica, cujo valor diagnóstico e prognóstico permanece ainda mal definido. Acredita-se que possa corresponder a um quadro evolutivo da parasitose, com liberação de bradizoítos existentes no interior dos cistos. Isso poderia ser responsável por uma resposta humoral secundária em pacientes com função imune relativamente preservada. Em indivíduos com imunodeficiência grave, tal resposta pode não ocorrer, o que explicaria a ausência do aumento na concentração de anticorpos nesses pacientes e o
pouco valor diagnóstico dos restes sorológicos. Nesses pacientes, um título alto de anticorpos poderia indicar reativação que tivesse ocorrido vários meses, ou mesmo anos, ames. A observação de uma rearivação sorológica pode ser considerada um fator de risco suplementar quanto à ocorrência de toxoplasmose clínica, uma vez que cerca de 17% dos pacientes acompanhados clinicamente apresentam infecção ariva no mês precedente ou posterior ao aumento dos anticorpos. A confrontação dos achados sorológicos com o status imunitário do indivíduo, avaliado pelo número de linfócitos T CD4, poderia melhorar o valor preditivo da sorologia. A rearivação da infecção ocorre normalmente, quando o número de linfócitos T CD4+ encontra-se abaixo de 200 cels/ml. A toxoplasmose cerebral é rara em pacientes apresentando contagem de linfócitos CD4+ normal, sendo mais freqüente quando se observa número abaixo de 200 cels/ml. Entretanto, apenas 30% dos indivíduos com baixa contagem dessas células apresentarão rearivação da toxoplasmose. Os portadores de AIDS com diagnóstico de toxoplasmose (cerebral, ocular ou pulmonar) apresentam sorologia positiva em 98% dos casos. Porém, em apenas 40% deles o aumento dos títulos dos anticorpos lgG precedeu o apa recimento dos sinais clínicos da doença. Do ponto de vista prático, é importante que a sorologia para toxoplasmose seja realizada em todos os pacientes HIV positivo dentro da propedêutica infecciosa inicial. Quando a sorologia é positiva, um acompanhamento semestral regular é aconselhável, a fim de evidenciar reativação sorológica eventual, ainda que seu valor prognóstico ainda necessite ser melhor definido.
DIAGNÓST ICO SOROLÓGICO NA GESTAÇÃO
Devido à alta prevalência da infecção em nosso meio, uma mulher ao engravidar terá, em cerca de 50% dos casos, adquirido a infecção no passado. Portanto, será possuidora do perfil lgG+/IgM- sem riscos para o bebê. As pacientes lgG-/IgM- são consideradas virgens de conta to com o parasito e deverão ser orientadas sobre medidas preventivas e monitoradas durante o pré-natal, visando à possível aquisição da infecção. O perfil de uma soroconversão recente, em paciente suscetível, traduz-se freqüentemente por perfil lgM+/IgG-. Deve-se fazer novo exame, 15 a 20 dias após o primeiro, para confirmação e verificação da viragem
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Toxopfasma gondii
647
de lgG, confirmando-se então o diagnóstico de infecção aguda. Bem mais raramente, a soroconversão aguda dá-se pelo aparecimento apenas de lgG. Deve-se sempre repetir o exame em 15 a 20 dias para confirmação e se o método for semiquantitativo é possível monicorar o aumento dos círulos. É importante ressaltar que a gravidez per se é um forte estímulo à resposta humoral generalizada, portanto, é comum reações falso-positivas em vários testes sorológicos, inclusive lgG e lgM falso-positivas. Na verdade, o ideal é que coda mulher em idade fértil seja avaliada para as infecções do grupo TORCHS ames de engravidar, evitando. assim, os tristes quadros de doenças congênitas. muico embora a toxoplasmose possa ser tratada durante a gestação, porém não sem efeitos colaterais. Hoje em dia, com a utilização rotineira de métodos cada vez mais sensíveis, tornou-se freqüeme, durante exames de pré-natal de rotina, a detecção de lgM em baixas concentrações, acompanhada de lgG em níveis estáveis, a chamada lgM residual. Esta pode permanecer por meses ou mesmo anos após o episódio agudo inicial. Logo, a presença de lgM pode não ser um indicador seguro de fase aguda nesses casos. Então, diante de uma gestante apresentando lgMI+IgG+, quais são as possibilidades diagnósticas? • infecção aguda já com produção de lgG; • lgM residual; • reação inespecífica para lgM - lgM falso -positiva. Por isso, provas adicionais são necessárias para elucidação do perfil. Estas consistem em: • repetição do exame pelo mesmo mérodo e no mesmo laboratório para avaliar níveis de anticorpos, sempre com pareamento de amostras: resgate da primeira amostra de sangue examinada em paralelo com a segunda (os laboratórios conservam as amostras em soroceca por até seis meses). Um aumento de no mínimo quatro vezes é sugestivo de produção ativa de anticorpos. Títulos estáveis apontam o contrário; • avaliação da amostra por método convencional para pesquisa de lgM (ex. ELISA ou IFI): esses métodos, por serem menos sensíveis, obedecem ao antigo padrão, no qual lgM permanece de três a seis meses detectável após uma infecção aguda. Pesquisa da avidez de anticorpos lgG: é o método de escolha atualmente. Trata-se de uma reação de ELISA
648 [ Medi cina laboratorial para o clínico
e baseia-se no conhecimento imunológico no qual, na fase aguda, os anticorpos apresentam menor afinidade funcional/avidez pelo amígeno e essa avidez aumenta com a cronificação da doença. Assim, numa gestante com perfil lgG+/IgM+, um resultado de baixa avidez (avidez< 30%) reforça a hipótese de que a infecção ocorreu nos últimos quatro meses e aquele de alta avidez (avidez > 60%) a afasta. Em nossa casuística, mais de 99% das gestantes assintomáticas que são submetidas ao teste são portadoras de lgM residual, portanto, refletindo apenas a alta sensibilidade dos mérodos atuais para lgM. Ressalta-se que para excluir a ocorrência de infecção aguda durante uma gestação em andamento, o teste de avidez deve ser realizado preferencialmente até a 163 ou 183 semana de gestação. Além desse tempo, fica impossível discriminar se a infecção aguda aconteceu antes ou durante a gestação. Pesquisa de lgA ou lgE antitoxoplasma podem estar presentes na fase aguda. De baixa sensibilidade, não são realizadas na maioria dos serviços (Figura. 51.3).
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA TOXOPLASMOSE CONGÊNITA
O diagnóstico definitivo da toxoplasmose congênita pode ser difícil em crianças nascidas de mães nas quais a infecção foi diagnosticada ou suspeitada na gestação. O diagnóstico sorológico é dificultado, uma vez que o recém-nascido produz anticorpos lgM em concentrações ainda bastante baixas, dificultando sua detecção, mesmo quando se utilizam testes mais sensíveis. Além disso. um grande faror de confusão no diagnóstico sorológico é a presença de lgG materna específica, que pode ser detectada no sangue da criança durante o primeiro ano de vida. Os anticorpos lgA podem ser observados durante meses ou mesmo anos após a infecção aguda. Por essa razão, eles possuem pouca utilidade no diagnóstico da toxoplasmose em adultos. Em contrapartido, tem sido utilizada com relativo sucesso no diagnóstico da toxoplasmose congénita. Em um número importante de recém-nascidos com doença congénita e ausência de anticorpos lgM. o diagnóstico sorológico tem sido estabelecido pela presença de anticorpos lgA. A grande vantagem dos métodos atuais (captura, MEIA, ELFA. quimioluminescéncia) é garantir mais
sensibilidade para de[ecção de lgM na suspei[a de infecção vertical. Mesmo assim, a resposta imune humoral dos bebês pode não ser suficiente para que o teste seja positivo. Portanto, uma pesquisa isolada de lgM negativa, desde que haja suspeita epidemiológica (sorologia materna) e/ou clínica, não exclui a infecção congênita. A pesquisa de anticorpos lgM e lgA deve ser realizada logo ao nascimento e repetida no 10Qdia de vida da criança, a fim de di minuir o risco de contaminação com o sangue materno. Embora ~ua sensibilidade necessite ser aperfeiçoada (70% para lgM e 65% para lgA). a presença desses anticorpos praticamente confirma o diagnóstico da doença congênita. No entanto, a ausência dos mesmos não permite descartar a infecção. Essas crianças devem então ser acompanhadas mensalmente com sorologia e exame clínico. No caso de crianças não infectadas. observa-se diminuição progressiva dos anticorpos lgG, com negativação dos mesmos entre o sexto e o oitavo mês de vida, na maioria dos casos. Nos casos de infecção congênita, a neossíntese de lgG pelo recém-nascido faz com que
Situação 1
Situação 2
Orientações
Abandonar rostreomento
haja uma permanência, ou mesmo aumento, nos títulos desses anticorpos, confirmando o diagnóstico de toxoplasmose congênita. A grande dificuldade nesses casos é que as técnicas sorológicas usuais são capazes de detectar essa neossíntese apenas no terceiro ou quarco mês de vida da criança, re[ardando o diagnóstico da infecção.
PERFIS SOROLÓGICOS NA INFECÇÃO
PELO TOXOPLASMA • lgG-/IgM-: indivíduo suscetível; • lgG+/IgM-: indivíduo portador; • lgG-/IgM+: suspeita de infecção aguda. Repete-se o teste em 15 a 20 dias para verificar soroconversão de lgG; • lgG+/IgM+: infecção aguda já com produção de lgG; infecção mais antiga com lgM residual; lgM falso-positiva. Realizar avidez de lgG, se gestante.
Situação 3
Situação 4
Sorologio trimestral
gestante Encaminhar poro propedêutico fetal
gestante Encaminhar poro propedêutico feta l
Trotar o gestante Encaminhar poro propedêutico fetal
Figura 51.3 - Rotina pré-natal da toxoplasmose conforme resultado da sorologia materna.
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Toxoplasma gondii
649
REFERÊNCIAS 1. Asburn D. Joss WL, Penningwn TH. Ho-Yen DO. Do lgA. lgE. and lgG avtCity teses have any value in the diagnosis of roxoplasma infenion in pregnancy7 J Clin Pathol. 1998;51:312-5. 2. Auberr D. Maine GT. Villena I. Hum JC. Howard L. Sheu M. er ai. Recombinanr anrigens ro derecr Toxoplasma gondii-Specific inmunoglobulin G and immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassay. JClin M icrobial. 2000;38(3):1144-50. 3. Avelino MM. Campos JR D. Parada JCB. Castro AM. Pregnancy as a r sk factor for acure roxoplasmosis seroconversion. European J Obstet Gynecol Reprod Biology. 2003;108:19-24. 4. Bobic B. Sibalic D. Djurkovic-Djakovic O. High leveis of lgM amibodies specific for Toxoplasma gondii in pregnancy 12 years after primary roxoplasma infection. Gynecol Obstet lnvest. 1991;31:182-4. S. (amargo ME. Silva SM. Leser PG. Granaro CH. Avidez de anticorpos lgG específicos como marcadores de infecção primária recente pelo Toxoplasma gondii. Rev lnst Med Trop. 1991;33(3):213-8. 6. Couto JCF. Leite JMB. Silva MVR. Diagnóstico laboratorial da toxoplasmose na gestação. Femina. 2002;30:731-7. 7. Dureau PDH. Hennequi C. Uteza Y, Bron A, Dufier JL. Congenital toxcplasma chorioretinitis transmitted by preconceptional y immune women. Br J Ophthalmol. 1998;82:1444-8. 8. Gavinet MF. Robert F. Firtion G. Delouvrier E. Hennequin C. Maurin JR. et ai. Congenital coxoplasmosis due maternal reinfection during pregnancy. J Clin Microbial. 1997;35:1276-7.
650 [ Medicina laboratorial para o clínico
9.
10.
11.
12.
13. 14.
15.
16.
17.
Gorgievski-Hrisoho M. Germann D. Maner L Diagnostic implications of kinetics of immunoglobulin MandA antibody responses to Toxoplasma gondii. JClin Microbial. 1996;34(6):1506-11. Gross U. Kempf MC. Seeber F. Luder CGK, Lugert R. Bohne W. Reacrivarion of chronic roxoplasmosis: Is rhere a link w srrain-specific differences in the parasite? Behring lnst Mitt. 1997;99:97-106. Hassan M, Hegab M, Abaza BE, Nasr ME. Mowafy NM. Specific antiToxoplasma amibodies in relation to infection and reinfection using different infective stages. Egypt Soe Parasitai. 1999;29:119-29 )acquier P. Zufferey J. Winderli W. Diagnostic biologique de la roxoplasmose au cours de la grossesse: méthods, interprétations et recommandations pratiques. Schweiz Med Wochenschr. 1995;125(65):39-51. Kravetz J. Federman DG. Toxoplasmosis in pregnancy. Am JMed. 2005;118:212-6. Naor Y. Guptill DR. Remington JS. Duration of lgM antibodies to Toxoplasma gondii after acure acquired roxoplasmosis. J lnfect Dis. 1982;145:770. Takahashi EEH. Rossi CL. lgM and lgA antibody responses in 12 cases of human acquired toxoplasmosis. Rev lnst Med Trop S Paulo. 1997;39(6):327-31. Takahashi EEH. Rossi CL. Use of three immunological techniques for t he detection ofToxoplasma sp lgA antibodies in acure toxoplasmosis. J Clin Pathol. 1994;47:1101-4. Wong SY, Hadju MP, Ramirez R. Thulliez P. Mcleod R. Remingcon )S. Role of specific immunoglobulin Ein diagnosis of acure Toxoplasma infection and Toxoplasmosis.
]r---------------------------------
Eliane Dias Gontijo Lúcia Maria da Cunha Gaivão Silvana Maria Elói Santos
52
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas é uma antropozoonose, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruz1, uansmitida ao homem e a vários outros mamíferos. principalmente através de vetores invertebrados, os triatomíneos, conhecidos como "barbeiros". Inicialmente era uma enzomia (forma silveme) que se espalhou entre as populações humanas rurais, devido aos movimentos migratórios e invasão. pelo homem, de ecótopos naturais dos n iacomíneos. Algumas espécies adaptaram-se às moradias humanas, especialmente àquelas mais precárias e a partir desse convívio com os vetares, a infecção humana emergiu.
ta, em 1907 por Carlos Chagas. acometia praticamente todas as faixas etárias, especialmente crianças. A partir da década de 80, com a concretização das grandes campanhas de erradicação do vecor uansm1ssor e do controle de doadores em bancos de sangue. o número de casos novos tem decaído significativamente. fazendo com que, awalmeme. a infecção seja pouco freqüeme em indivíduos com menos de 20 anos. A redução da transmissão vetorial resultou também na diminuição de gestantes e de doadores de sangue infectados, o que reduziu os riscos de transmissão transfusional e congênita. Quanto ao número total de pacientes infectados no Brasil. admite-se que seja em corno de três milhões, a maioria nascida ames de 1980.
EPI DEMIOLOGIA E FORMAS DE TRANSMISSÃO
Também conhecida como tripanossomíase americana, apresenta distribuição endêmica exclusivamente na América Latina e constitui importante problema de saúde, atingindo 13 milhões de pessoas. sendo 21.000 morres regisnadas a cada ano em toda a região acometida. Gera elevado custo socioeconômico. traduzido pelo sofrimento dos paCientes e familiares, absemeísmo laboral. necessidade de procedimentos médicos e utilização de tecnologias d1agnósticas e terapêuncas complexas. além de aposentadoria precoce por invalidez e anos de vida perdidos. especialmente nos países de maior prevalência. Sua epidemiologia, em nosso país. vem sendo modificada ao longo do tempo. Por ocasião de sua descaber-
TRANSMISSÃO VETORIAL Forma de transmissão responsável pela manutenção endêmica da mfecção. Ocorre basicamente no imenor do domicílio. pelo comaco da pele ou mucosa, fenda pelo triatomíneo durante repasto sangüíneo, com as fezes do insero que contém a forma infectante do Trypanosoma cruzi - tripomastigota metacíclica. Entre as mais de 120 espécies de triacomíneos conhecidas. apenas 31 estão relacionadas à transmissão da doença. No Brasil. as espécies que assumiram real importância em saúde pública. em função de sua capacidade de domiciliação, foram o Triatoma infestans, Panstrogylus megrstus
(Nordeste, Sudeste, Sul), Triatoma brasiliensis, Triatoma pseudomaculata (Nordeste) e Triatoma sordida (Bahia. Sudeste, Centro-Oeste). A partir da década de 80. quando os programas de controle do veror tornaram-se efetivos e com am pla cobertura, a transmissão verorial da doença vem perdendo a sua Importância. Em 2005. o Brasil recebeu o cenificado da OMS/OPAS de erradicação do Triatoma injestans. Entretanto. diante da presença. em diversas localidades, de T sordida e P megistus, e da possibilidade de repovoamento do T. infestans, a vigilância deve ser contínua. Disse Carlos Chagas: "Cumpre. antes de tudo, afastar toda a possibilidade de procriação do inseto nas casas cujas paredes devem ser rebocadas e livres de fendas e cujas coberturas devem obedecer a cuidados visando o mesmo objetivo. Nas zonas infestadas, as casas apenas barreadas ou cobertas de capim são absolutamente condenáveis, visto constituírem os grandes focos de barbeiros, que aí encontram condições as mais propícias de existência."
TRANSMISSÃO VERTICAL Arualmeme, a via vertical é considerada a principal forma de manutenção da transmissão urbana da infecção chagásica. A transmissão através do leite humano é possível, mas muiro improvável. A cransmissão vertical parece escar associada ao grau de parasirem1a, características da cepa, fatores placentários, obstétricos, imunes e nutricionais. A gestante pode transmitir a infecção ao feto em qualquer período da gestação, até mesmo no momento do parto, pelo contara das mucosas do fem com o sangue da mãe infectada. A taxa de transmissão da infecção chagásica da mãe infectada para o filho varia de 0.5 a 3% na maioria dos eswdos. No Brasil. a taxa de transmissão é variável e em Minas Gerais. atualmente, estima-se em menos de 1%. A razão para o declínio da transmissão vertical é a progressiva diminuição na prevalência da infecção nas gestantes. t importante ressalcar que não é raro observar amastigoras e alterações anatomoparológicas na placenta. na ausência de infecção fetal.
TRANSMISSÃO ORAL TRANSMISSÃO TRANSFUSIONAL Comprovada nos anos 50, a transmissão transfusional foi considerada problema grave de saúde pública, estimando-se que, ames da década de 80, cerca de 20 mil novos casos de doença de Chagas transfusional eram produzidos anualmente no Brasil. Freqüemememe despercebidos e oligossintomáticos, eram pouco notificados. A sorologia de doadores não era obrigatória e poucos serviços praticavam quimioprofilaxia com violeta de genciana, que havia se mostrado eficaz em Goiás e no Triângulo Mineiro. A criação do Sistema Nacional de Sangue e Hemoderivados instituiu a obrigaroriedade da seleção sorológica dos candidatos à doação, além de proibir a doação remunerada. Observou-se. ainda. progressiva queda da taxa de prevalência da infecção entre candidatos à doação, caindo de cerca de 7,0%, nos anos 70, para aproximadamente 0,5%, em 2004, devido ao controle da transmissão vetaria!. Hoje, os riscos de transmissão transfusional no Brasil são mínimos.
652 ( Medicina laboratorial para o clínico
Suspeita-se que a transmissão do T cruzi pela via oral seja freqüente entre animais. no ciclo silvestre. já que os mamíferos reservatórios do parasiro. em sua grande maioria. são onívoros. Na última década. microssurros de doença de Chagas aguda têm sido registrados, relacionados à ingestão de alimentos contaminados, principalmente suco de açaí e caldo de cana produzidos arresanalmente. A contaminação de caldo de cana se faz ao prensar a cana junto com algum triaromíneo infectado, com liberação das fezes contaminadas na bebida. Quanto ao suco de açaí, ao fazer seu ninho nas folhas ou cacho da palmeira. o inseto pode ser carregado e tritu rado com a fruta. Essa forma de transmissão é considerada acidental, mas tem importância epidemiológica na região amazónica.
OUTROS MECAN ISMOS São considerados excepcionais e incluem transplantes de órgãos ou de medula e acidentes de laboratório.
ETIOLOGIA
FASE AGUDA
O Trypanosoma cruzi, parasico flagelado da família Trypanosomatidae, caracceriza-se por possuir cinecoplasco e um único flagelo. Apresenta em seu ciclo crês formas evol utivas: uipo mastigota (forma infectante). epimastigotas (forma de multiplicação do parasito no vetar ou em culturas), amastigotas (forma de multiplicação no interior das células hospedeiras). Escudos de caracterização bioquímicomolecular do parasico permitiram o reconhecimento de três grupos distintos denom inados zi modemas (população com o mesmo perfil de isoenzimas): zimodemas I e III, constituído de amostras procedentes do ciclo silvestre, e zimodema 11, re presentado por amostras do ciclo domici liar. Assim, as populações de T cruzi podem ser divididas em duas linhagens filogenéticas maiores: T cruzi I (correspondente aos zimodemas I e III) e Tcruzi li (correspondente ao zimodema 11). Durante o repasto sanguíneo em hospedeiros infectados pelo parasito, os triaromíneos ingerem formas circulantes (tripomastigotas). Estas se transformam no seu cubo digestivo em epimastigotas. que se perpetuam por toda a existência do vetor (um a dois anos) e atingem o reta, onde se diferenciam em tripo mastigotas metacíclicos, que são eliminados com as fezes do insero. No hospedeiro venebrado. a forma cripomastigota pode penetrar em várias células: músculo liso e estriado, macrófagos, célu las epi teliais. fibroblastos. Na célula hospedeira, o tripomastigota se diferencia em amastigota e inicia sua divisão intracelular. Posteriormente, ocorre a transformação de amastigotas em cripomastigotas, que são liberados quando a célula se rompe, alcançando a corrente circulatória, de onde invade o utras células e tecidos, podendo eventualmente infectar insetos vetares e perpetuar o ciclo de transmissão.
Após período de incubação de aproximadamente sete a 10 dias na transmissão vetorial e de até 100 dias pela via uansfusional, inicia-se a fase aguda, que pode ser aparente ou inaparente. A fase aguda é definida basicamente pela alta parasitem ia detectável por exames parasitológicos diretos do sangue, tendo duração geralmente entre três e oito semanas, podendo ser letal em crianças de baixa idade e indivíduos imunocomprometidos ou evoluir para forma crônica de longa duração. Quando sintomática, pode apresentar sinais de infecção sistémica, como febre, mal-estar geral. cefaléia, astenia, hiporexia, linfadenomegalia, hepatoesplenomegalia, edema facial e de membros inferiores, de imensidades variáveis. Alguns sinais são característicos, apesar de infreqüemes, como aqueles de porta de entrada (sinal de Romana - edema ocular bipalpebral unilateral e chagoma de inoculação lesão cutânea eritematosa endurada). Os casos graves cursam com imensa miocardite e/ou meningoencefalite e parasitos intracelulares são encontrados em vários tipos celulares. incluindo macrófagos, células musculares lisas e estriadas, adipócitos e células da glia. Observa-se também necrose de miocardióciros não parasitados. Nos demais órgãos, a inflamação é focal ou multifocal, sempre em relação direta com células parasitadas. Os neurônios nos plexos mioentéricos podem exibir lesões regressivas de vários graus ou mesmo necrose e lise. Quando adequadamente tratada, a doença de Chagas aguda pode curar-se em proporções que chegam a 90% dos casos.
APRESENTAÇÃO CLÍNICA
Caracterizada por início agudo e desenvolvimento crônico, reconhece-se, na doença de Chagas, a presença de duas fases da doença: aguda e crônica.
Investigação laboratorial do paciente com doença de Chagas
FASE CRÔN ICA Caracteriza-se por baixíssima parasitemia e elevado nível de anticorpos da classe lgG. A partir da fase aguda, a infecção passa por longo período de latência clínica em que o paciente não apresenta manifestações clínicas. eletrocardiográficas e/ou radiológicas e o diagnóstico é feito somente pela positividade sorológica e/ou parasitológica, sendo esse período conhecido como FORMA CRÔN ICA INDETERMINADA da doença de Chagas. Em 1984, foram estabelecidos os seguintes critérios para a definição da forma indeterminada na I REUNIÃO DE PESQUISA APLICADA EM DOENÇA DE CHAGAS:
653
• posicividade sorológica e/ou parasicológica para doença de Chagas; • ausência de sintomas e ou sinais da doença; • eletrocardiograma convencional normal; • estudos radiológicos do coração, esôfago e cólon normais. No Consenso Brasileiro em Doença de Chagas (2005), a definição foi mantida e foi também reafirmado que não são necessários outros exames complementares para a classificação. Enquanm cerca de metade dos pacientes infectados permanece nessa forma, outros evoluem para formas crênicas determinadas da doença, após 10 a 30 anos, com evidências de comprometimento cardíaco e/ou digestivo. A forma digestiva está presente em 7 a 10% dos portadores da doença de Chagas, mas a prevalência depende da região geográfica. No Brasil, registra-se maior número de casos na reg1ão central do país, compreendendo parte dos estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Bahia e sul do Piauí. Sua ocorrência é excepcional nos países situados acima da linha equatorial, como a Venezuela e os países da América Central. Acomete rodo o trato gastrintestinal. mas, em geral. há predominância do esôfago e colo. A lesão esofagiana leva à formação de megaesôfago, conseqüente à incoordenação morara da musculatura do esôfago e acalasia do cárdia, provocadas pela redução quantitativa dos neurônios dos plexos inrramurais, secundária à intensa destruição dos neurônios do sistema nervoso periférico que ocorre fundamentalmente na fase aguda, levando à dilatação e alongamento do esôfago. Os sintomas mais freqüenres são disfagia mais acentuada para sólidos e frios (é clássica a queixa de engasgos com a ingestão de arroz frio), singulros e regurgitação com eliminação de alimentos ingeridos na ausência de vômiro ou náuseas. Epigasrralgia, azia e sialorréia são comuns e estão relacionadas à esofagite secundária à retenção alimentar. Em casos mais graves e crônicos. observam-se desnutrição e sintomas broncopulmonares de aspiração. No megacolon chagásico, a denervação intrínseca do colo e do rem também repercute em sua fisiologia mocora, ocasionando dificuldade na propulsão do bolo fecal e acalasia do esfíncter interno do reta. A principal manifestação clínica observada é a obstipação Intestinal, de caráter lemo, insidioso e progressivo. Seguem-se sinais e sintomas como meteorismo, disquesia e formação
654 ~dicina
laboratorial para o clínico
de fecalomas. Entretanto, aproximadamente 25% dos pacientes com dilatação evidente do colo apresentam ritmo intestinal normal. A cardiopatia chagásica crônica é a prinopal manifestação mórbida, com prevalência de 30 a 35%. Ocorre mais comumente em indivíduos entre 20 e 50 anos de idade, geralmente 10 a 30 anos após a 1nfecção pelo T. cruzi. Na maioria dos casos, os pacientes são assintomáticos, sem cardiomegalia e apresentam ao eleuocardiograma somente sinais de distúrbios na formação ou condução do estímulo elétrico. Entre as características mais peculiares da cardiopatia chagásica crônica, destacam-se especialmente o seu caráter fibrosante, considerado o mais expressivo entre as miocardites, a alta freqüência e alta complexidade de arritmias cardíacas e sua associação com distúrbios da condução do estímulo atrioventricular e intraventricular. t importante a grande incidência de morte súbita e fenômenos tromboembólicos. Os sintomas e sinais clínicos mais freqüentes são de insuficiência cardíaca, com predomínio da congestão sistémica, disritmias ventriculares e bloqueios atrioventriculares. Precord1alg1a pode estar presente e é geralmente atípica para isquem1a miocárdica. As principais alterações eletrocardiográficas são: bloqueio completo do ramo direito com ou sem bloqueio de ramo esquerdo, bloqueio atrioventriclar de primeiro, segundo e terceiro graus, extra-sistolia ventriculares, sobrecarga de cavidades cardíacas, alterações da repolarização ventricular, entre outras. Anormalidades contráteis segmentares podem estar presentes em ambos os ventrículos e a lesão mais característica é o aneurisma apical, que favorece formação de trombos intracavitários. A associação de formas cardíacas e digestivas pode ocorrer. Entretanto, o acometimento cardíaco é o grande responsável pela morbidade e mortalidade na doença de Chagas.
QUADRO CLÍN ICO DA CRIANÇA INFECTADA VERTICALMENTE A infecção da criança du rante sua gestação pode levar a alterações importantes no desenvolvimento fetal. que predispõem ao aborto, morre fetal. prematuridade e desnutrição fetal. Na maioria dos estudos, 50 a 90% dos recém-nascidos infectados nascem assintomáticos, não
havendo perfil clínico caracceríscico da doença de Chagas congênita. Parte das crianças infectadas pode apresentar quadro clínico comum a outras infecções congênitas, sendo mais comumente encontrados: hepatoesplenomegalia, anasarca, distúrbios respiracórios agudos, hepacice e sepse. A meningoencefalice e a miocardice cambém podem ocorrer. mas são observadas principalmente nos casos de cc-infecção com o HIV. São relatadas também febre, icterícia, anemia hemolítica, hemorragias cutâneas, cianose, coriorretinite, opacificação do corpo víueo. chagomas metastáticos. calcificações cerebrais e alterações digestivas incluindo destruição neural que pode levar a megaesôfago e megacolon. Felizmente, são altos os índices de cura das cnanças tratadas precocemente com drogas tripanomicidas. A simples presença de infecção materna pelo T. cruzi não afeta o crescimento inrra-ucerino e maturidade dos fetos não infectados.
formas clínicas que apresentam maior parasitem ia, como a forma aguda. a forma congênita e a rearivação de uma infecção crónica. Já o diagnóstico sorológico, mais amplamente utilizado, é o empregado para o diagnóstiCO da infecção crónica e na seleção de doadores de sangue. Quadro 52.1 - Exames ma1s 1nd1cados de acordo com a fase da infecção
Fase aguda
Fase crônica
Exames parositológicos (detecção d o parasito)
Exames sorológicos !detecção de anticorpos)
• Pesquiso d irelo o fresco • Mrcrohemolócnro • Goro espesso
• Ensoros imunoenzrmólicos • lmunofluorescêncio indueto • Hemog,u:rnoçõo morrera
DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO REATIVAÇÃO DA FORMA CRÓN ICA Pacientes chagásicos crônicos podem apresentar reativação da infecção diante de quadro de imunossupressão, como em neoplasias, AIOS, após transplantes e nos tratamentos com corticoesteróides e quimioterápicos. A pnncipal manifestação é o quadro de meningoencefalite com lesões cerebra1s focais, d1fusas. expansivas ou pseudotumorais. Curiosamente, em alguns casos de reativação da doença de Chagas, o parasiw pode não ser encontrado no sangue periférico e o diagnóstico da reativação é feito pelo achado de imenso parasitismo em exame hiswpawlógico, principalmente quando há envolvimento da pele, como observado em pacientes submetidos a transplante cardíaco. Nesses casos. ocorrem lesões cutâneas com características clínicas de eritema nodoso ou nódulos eritemawsos ulcerados e cujo processo inflamatório estendese ao tecido celular subcutâneo. Trata-se de quadro grave, mas com resposta terapêutica muitas vezes eficaz.
EXAMES lABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE CHAGAS
Para o diagnóstico da doença de Chagas, podem ser empregados méwdos parasiwlógicos ou sorológicos. Em geral, os méwdos parasimlógicos estão resuims às
Investigação laboratorial do pacience com doença de Chagas
Os méwdos parasitológicos empregados no diagnóstico da doença de Chagas são divididos em direws e indirews. Consrderam-se direws aqueles que pesquisam diretameme o uipanossoma na amosua. enquanto os indirews utilizam esuatégias variadas para faci litar a detecção do parasito, como hemocultura e reação de polimerização em cadeia (PCR).
Métodos diretos
Estão indicados naquelas siruações que cursam com maior parasitemia, como a fase aguda recente (durante as seis prime1ras semanas de infecção), quadros de reativação e infecção congênira recente. São exames que podem ser realizados em laboratórios clínicos convencionais. pois não requerem equipamentos especrais, mas é necessário que os profissionais tenham experiência no reconhecimenw do T cruzi. O mais simples desses procedrmentos é o EXAME A FRESCO. Para sua realização, cerca de 5 !JL de sangue anticoagulado ou colh1do por punção capilar são examinados entre lâmina e lamínula. no aumento de 400x, para visualização do tripanossoma vivo. Pelo menos 100 campos deverão ser avaliados para a liberação de pesquisa negativa. Variações desse método foram desenvolvidas com a finalidade de melhorar a sensibilidade. As variações ma1s utilizadas são a pesquisa
655
em GOTA ESPESSA corada por Giemsa, a PESQUISA EM CREME LEUCOCITÁRIO, o MÉTODO DE STROUT e o método QUANTITATIVE BUFFY COA T. Este último foi
descrito in icialmente para malária e consiste em microscopia de fluorescência, utilizando objetiva de 60X e grande profundidade de campo, para verificação de rripanossomas em sangue colhido com EDTA e colocado em tubo capilar comendo laranja de acridina. Já para a pesquisa no creme leucocitário, o sangue é colhido em 6-8 tubos capilares hcparinizados c centrifugados cm centrífuga de micro-hematócrito por 10 minutos. Os tubos capilares são dispostos sobre uma lâmina de vidro e fixados, em suas extremidades, com fita adesiva. A camada leucocitária é examinada por microscopia para visualização dos movimentos do parasito vivo. Não é recomendada a quebra dos tubos para exame direto do creme leucocitário, pelo risco de contaminação acidental. Para o método de Strout, 3 ml de sangue sem anticoagulante são incubados por 60 minucos, a 3PC. O soro é retirado com pipeta Pasteur e centrifugado a 160 g, por três minutos, para eliminação de eventuais hemácias. O sobrenadante é centrifugado novamente, a 400 g, por seis minutos, e o sedimento é examinado em microscopia convencional.
Métodos parasitológicos indiretos
A fase crónica da doença de Chagas é caracterizada por parasitemia subpatente no sangue periférico. Nessa fase não é possível identificar o parasito por métodos diretas, mas pode ser deteccado pelos métOdos indiretos clássicos, como xenodiagnóstico, hemocultura e PCR, que apresentam sensibilidade variável, entre 45 e 70%. Esses procedimentos são limitados aos laboratórios especializados, apresentam elevado custo operacional e necessitam de pessoal treinado para a sua execução. Indicações: esses métodos são indicados em situações distintas, como para confirmação do diagnóstico em casos de sorologia duvidosa, avaliação pré e pós-tratamento específico, diagnóstico de infecção congénita e quando se pretende isolar cepas do T cruzi. Xenodiagnóstico
O xenodiagnóstico, desde a sua descrição por Brumpt, em 1914, foi muito aplicado para a pesq uisa e
identificação do T cruz1. Erealizado usando-se triaromíneos criados em laboratório e alimentados com sangue de aves. Ninfas são distribuídas em 10 exemplares por caixa, aplicando-se quatro caixas no braço e antebraço do indivíduo para que os insetos realizem os seus repastas sanguíneos, durante 30 minutos. Após 30, 60 e 90 dias, as fezes e urina dos triaromíneos e/ou os intestinos, obtidos por compressão ou dessecação, são colocados em solução fisiológica e examinados ao microscópio em médio aumento para pesquisa de formas epimasrigocas e tripomastigotas metacíclicas do T. cruzi. No exame microscópico das fezes para a pesquisa de flagelados, é muito importante fazer a distinção entre o T cruzi e o T range/i. Este último pode ser detectado nas glândulas salivares e na hemolinfa dos triatomíneos e a diferenciação morfológica com o T cruzi também pode ser realizada em esfregaços das fezes positivas para tripanossomacídeos após a coloração. Esse método, por ser de procedimento biológico complexo, faz com que seu emprego na rotina seja bastante li mitado. As reações alérgicas advindas da aplicação do xenodiagnóstico no local da picada do inseto podem ser evitadas realizando-se o xenodiagnóstico artificial, em que os triatomíneos alimentam-se através de tênue membrana, em sangue venoso do indivíduo suspeito, coletado previamente com anticoagulante. Hemocu/tura
O T cruzi cresce e multiplica-se fac ilmente em vários meios acelulares contendo componentes como, sais, proteínas e derivados da hemina. Por algumas décadas, a hemocultura não foi usada para identificar o parasito na fase crónica da doença de Chagas devido à baixa sensibilidade. A partir da década de 60, a técnica de hemocul tura começou a ganhar credibilidade entre os pesquisadores da área. Em 1975, um trabalho relevante nesse campo fo i desenvolvido por Mourão e Mello, que introduziram o procedimento de retirar o plasma e lavar as células para a remoção de anticorpos e outros fatores que poderiam apa rentemente in ibir o crescimento do T cruzi. Posteriormente, outras modificações também contribuíram para aumentar a sensibilidade do método. Resumidamente, a técnica consiste na coleta de 30 ml de sangue venoso que deverão ser imediatamente centrifugados a 300 g por 10 minutos
656 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1-- -- - -- - - -- - -- -- - - - - - - - -- - - -- - - -
à temperatura ambiente ou a 4°C. Após remoção do plasma, o sedimento é lavado em meio LIT e distribuído em tubos contendo o mesmo meio. A cultura é realizada em estufa com temperatura entre 26 e 28°C e examinada ao microscópio com aumento 400x, mensalmente, até 120 dias. A positividade dessa técnica varia de 30-70% quando é realizada uma única hemocultura, variando, inclusive, de acordo com a região geográfica, o que provavelmente reflete a diferente constituição genética das cepas do T cruzi que circulam em cada região. Dados da literatura relatam que a realização de hemoculturas seriadas aumenta a positividade da técnica. A PARASITEMIA ESCASSA E INTERMITENTE nos indivíduos infectados na fase crónica da doença de Chagas explica a dificuldade na detecção do T cruzi em todas as amostras de sangue coletadas. Reação de polimerização em cadeia (PCR)
A PCR descrita em 1985 vem sendo expandida e abrindo novas perspectivas para o seu emprego no diagnóstico e caracterização de diferences agentes infecciosos e parasitários A sua aplicação no diagnóstico da doença de Chagas tem sido intensificada para amplificar seqüências do DNA nuclear e/ou seqüências do minicírculo do kDNA em sangue ou soro humano usando diferentes protocolos. Na fase crónica da doença de Chagas, o teste de PCR seguido de hibridização tem se mostrado uma alternativa para a comprovação da presença do parasito, devido à sua capacidade de detectar quantidades mínimas de DNA. Mesmo com o aprimoramento dos diferentes procedimentos da técnica, a sensibil idade da PCR varia entre 25 e 100%. Essas diferenças de positividade na PCR reforçam aquelas obtidas com os testes parasitológicos indiretos e podem ser explicadas pela PARASITEMIA ESCASSA E INTERMITENTE.
de formas crónicas, os procedimentos sorológicos são usados também na triagem de doadores de sangue e em inquéritos epidemiológicos. Baseiam-se na detecção de anticorpos, principalmente da classe lgG, contra determinantes antigênicos do T cruzi e os títulos desses anticorpos não apresentam relação com a gravidade e/ou apresentação da doença. Como todo teste sorológico. os valores preditivos positivo e negativo dependem da sensibilidade e especificidade do método e da prevalência da infecção. Métodos: as técnicas mais empregadas são imunofluorescência indireta, hemaglutinação indireta e imuneensaio enzimático, por apresentarem altos valores de sensibilidade e especificidade, superiores a 95%. Acualmeme, encontram-se disponíveis testes não convencionais que empregam preparações antigênicas mais purificadas, como antígenos recombinantes e peptídeos sintéticos, com a finalidade de incrementar a especificidade. Entre estes, ressalta-se o teste de aglutinação de partículas de gel, em cartão (PaGIN- DIAMED).
lmunoe nsaios e nzimát icos {ELISA)
Metodologia de simples execução, com possibilidade de automação, altas sensibilidade e especificidade, é considerada a mais sensível das técnicas convencionais, sendo amplamente utilizada na rotina dos serviços de hemoterapia e de diagnóstico. Consiste na reação de soros humanos com antígenos solúveis e purificados da forma epimastigotas do T cruzi, obtidos a partir de cu ltura in vitro, que são previamente adsorvidos nas cavidades de microplacas. Atualmente, alguns fabricantes têm empregado antígenos recombinantes como substrato antigênico como forma de minimizar a ocorrênCia de reações falso-positivas (Para maior detalhamento das técnicas ver capítulo 6).
Re ação de he maglutinação ind ireta
DIAGNÓSTICO SOROLÓG ICO Anticorpos antiT cruzi atingem concentrações séricas detectáveis pela maioria das técnicas convencionais de 20 a 30 dias após a infecção. A partir de então, os níveis séricos se mantêm estáveis. Além do diagnóstico
Investigação la boratorial do pac iente com doença de Chagas
Teste de fácil execução e bom desempenho, apresenta sensibilidade menor que os testes de imunofluorescência e de ELISA. Baseia-se na aglutinação de hemácias de carneiro o u ave revestidas com antígenos derivados da forma epimastigota do T cruzi. A leitu-
657
ra é feita a olho nu. com cerro grau de subjetividade de interpretação. A amosrra é considerada reagente quando as hemácias estão distribuídas de maneira homogênea, em forma de tapete ou manto, ocupando área maior que 50% do fundo da placa; não reagente quando as hemácias ficam acumuladas em forma de bocão no fundo do poço; e é considerada indeterminada quando apresenta qualquer padrão diferente dos anteriores. Pode ser qualitativa ou quantitativa, quando diluições seriadas são realizadas. Para tanto, a diluição inicial indicada pelo fabricante (aquela utd1zada no teste qualitativo) é postenormente diluída sucessivamente na razão 1:2. As diluições são testadas como a reação qualitativa e o título será a última diluição na qual a reação fo i positiva.
Reação de imunofluorescência indireta
Teste de elevada sensibilidade. embora apresente reações cruzadas, em particular com leishmanioses. Pode ser qual1tat1vo ou quant1tanvo (com titulação). Baseia-se na reação de soros ou plasmas humanos com parasitos da forma epimastigota fixados em lâminas de microscopia para fluorescência. A reação entre o antígeno fixado e o anticorpo presente nas amostras é visualizada após a adição de antiimunoglobulina humana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (ver capítulo 6). A leitura é realizada em microscópio de fluorescência: • amostra reagente: presença de fluorescência uniforme em todas as membranas do tripanossoma; • amostra não reagente: ausência total de fluorescência nos tripanossomas; • amostra indeterminada: qualquer padrão diferente dos descntos.
Outros métodos
Tem-se procurado melhorar qualidade dos testes até então utilizados, a partir do emprego de antígenos recombinantes e/ou peptídeos sintéticos, na tentativa de evitar reações cruzadas. observadas com os testes convencionais de diagnóstico. Dentre outros, o teste de westernblot mostra-se promissor como teste confirmatório.
658 [ Medicina laboratorial para o clínico
A reação de Guerreiro e Machado ou fixação de complemenro para doença de Chagas. já em desuso, deve ser abandonada. A sensibilidade do teste é baixa e a sua reprodut1b11idade não satisfaz os padrões de qualidade vigentes.
INTERPRETAÇÂO DOS TESTES SOROLÓGICOS
Apesar da grande expert1se já adquirida, existem muitas dificuldades na padronização dos testes sorológicos para doença de Chagas em uso. A ocorrência de reações cruzadas com soros de pacientes portadores de leishmaniose, infecção pelo HIV e doenças auto-imunes é descrita, assim como a verificação de resultados negativos em pacientes comprovadamente chagásicos. A Figura 52.1 mostra fluxograma baseado na recomendação do Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, em 2005. Realização de d ois testes sorológicos de pri ncípios diferentes (ELISA, IFI ou HAI)
Figura 52.1 - Fluxograma do diagnóstiCO na fase crónica.
DIAGNÓSTICO DE SITUAÇÕES ESPECIAIS Diagnóstico da infecção congênita
Em casos suspeitos de transmissão congêni ta, é importante confirmar o diagnóstico sorológico da mãe. Constatada a infecção materna. deve-se realizar o exame parasitológico no recém-nascido. Se positivo, a criança deve ser submetida ao tratamento etiológico imediatamente. Os filhos de mães chagásicas com exame parasi-
rológ1co negaCivo ou sem exame devem realizar sorologia após sete ou nove meses. Se a sorologia for negativa, descana-se a transmissão vertical. Os casos confirmados devem ser tratados, cons1derando-se a alta raxa de cura nessa fase. Em face do elevado número de falso-negativos e falso-posir1vos em rransm1ssão congênira, não se recomenda a pesquisa de anticorpos antiT cruz1 das classes lgM e lgA. A detecção de lgM específica, por lmunofluorescênoa. apresenta baixa sensibilidade e espeoficidade. Os testes utilizados para determinação do anttcorpo lgA ainda são pouco padronizados (Figura 52.2). A detecção do anticorpo lgG, através do sorologio convencional, no recém·noscido pode refletir apenas o lgG materno tra nsfer ido passivamente poro o feto. A persistência de anticorpos lgG após os 7.9 meses de idade indico fortemente o existência do infecção no criança . A comparação dos títulos so rológicos de lgG do RN com os de suo mãe, ao contrório de outros infecções congénitos, não se mostro úti l.
ciosas. esrá apoiado em evidências epidemiológicas. clínicas e laboratOriais. O laboratório mu1t0 contrtbw para confirmação ou exclusão da suspeita clímca na maioria das situações. Entretanto, compete ao médico-assistente a defimção do diagnóstico. Mãe com sorologio reagente confirmado
'
Pesquiso de T. Cruz i no RN . Duas amostras no primeiro mês de vida (se passivei)
Sorologia lgG 6 - 9 meses de vida
Diagnóstico da reativação de infecção crónica
A reativação da doença de Chagas, que ocorre em situações de imunodepressão, traduz-se essencialmente na visualização do parasico no sangue periférico, líquor ou ourros líqu1dos corporais (F1gura 52.3). Assim, o diagnóstico laboratarial base1a-se na positividade dos testes d1rews. A pesquisa direta em amosrras de sangue tem s1do relatada como o métado "padrão ouro" no diagnóstiCO precoce de reativação da doença de Chagas. Contudo, a PCR tem detectado mais precocemente a reatlvação da 1nfecção após transplante quando comparada ao exame d1rew do sangue ao m1croscóp10. Essa reação também Lem se mostrado uma ferramenta rápida e efiCiente na amplificação do T. cruzi no líquor. em pacientes portadores da infecção pelo HIV com menlngoencefalite chagás1ca. A negatividade dos testes parasitológicos não exclu1 a poss1bil1dade de reanvação da doença de Chagas. As reações sorológ1cas podem não apresentar reprodutibilidade nesses casos.
Figura 52.2 - Fluxograma do dtagnósttco da doença de Chagas congêntta
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como Já refendo por alguns autOres. o diagnóstiCO da doença de Chagas. como em outras enfermidades infec-
Investigação laborato ria l do paciente com d oença de Chagas
Figura 52.3 - Formas trtpomasttgoras em sangue pertfénco de pac1enre com q uadro de reauvação após transplante cardíaco. V< 1 prand1o (()/ondo
659
Cabe ainda ressalrar que não existe um procedimento laborawrial tido como "padrão ouro" e a ocorrência de resultados discordantes entre as técnicas não é rara, principalmente em candidaws a doadores de sangue. Também é freqüente o encontro de resultados contraditórios provenientes de diferences laboratórios. A razão para esses resultados discrepantes parece estar relacionada com a complexidade antigênica do T cruzi e por isso o tipo de antígeno empregado nos testes imunológicos (extraro bruto, semipurificado, purificado, antígenos recombinantes, peptídeos sintéticos) influencia o desempenho dos métodos. Falhas técnicas na execução das metodologias também acontecem. De forma a minimizá-las, o Ministério da Saúde, por meio do programa de Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST) e AIOS e da Coordenação de Sangue e Hemoderivados (COSAH), elaborou manual e vídeo da série Telelab, que se encontram disponíveis a todos que realizam os testes sorológicos. Muito útil também é o Portal de doença de Chagas da FIOCRUZ (http// www.fiocruz.br/chagas) que contém textos referentes a remas que vão desde a origem da doença humana, a vida de seu descobridor, o pesquisador Carlos Chagas, até questões de ecologia e Biologia Molecular. O Portal conta com a colaboração de grandes pesquisadores atuantes no campo doença de Chagas.
660 ( M edicina laboratorial para o clínico
REFERÊNCIAS 1.
Brasil. Ministério da Saúde. Doença de Chagas- Triagem
e diagnóstico sorológico em unidades hemoterápicas e
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
laboratórios de saúde pública. Brasília: Ministério da Saúde; 1998. Disponível em: http:/lbvsms.saude.gov.brlbvsl publicacoeslcd07_08.pdf Brasil. Ministério da Saúde. Doença de Chagas Aguda. Manual Prático de Subsídio à Notificação Obrigatória no SINAN. Brasília: M inistério da Saúde; Disponível em: hr r p:lI por ral.sa ude.gov.brI porra I/arq u ivosl pd fi man ual_chagas.pdf. Brasil. Ministério de Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Consenso Brasileiro em Doença de Chagas. Rev Soe Bras Med Trop. 2005; 38 Supl 3. Disponível em: http:/lportal.saude.gov.brlporral/arquivoslpdf/consenso_chagas.pdf Dias J(P, Coura JR. Clínica e terapêutica da doença de Chagas: uma abordagem prática para o clínico geral. Rio de janeiro: Fiocruz; 1997. Dias J(P. Doença de Chagas e transfusão de sangue no Brasil: vigilância e desafios Rev Bras Hemarol Hemorer. 2006;28(2):81-7 Luquetti AO. História dos mérodos de diagnóstico para a doença de Chagas. Disponível em: http:/lwww.fiocruz. brlchagas/cgilcgilua.exelsyslstarr.hrm. Organización Panamericana de la Salud I Organización Mundial de la Salud. Traramienro etiológico de la enfermidad de Chagas: conclusiones de reunion de especialistas. Rev Par Trop. 1999;28(2):247-79. Torrico F, Carl1er Y. Congeniral lnfecrion with Trypanosoma cruzi: from mechanisms of rransmission ro srraregies for diagnosis and conrrol. lnrernational Coloqium, Cochabamba, Bolívia, 2002.
Luciana de Gouvêa Viana Zélia Profeta da Luz Ana Lúcia Teles Rabello
53
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DAS LEISHMANIOSES
As leishmanioses encontram-se mundialmente distribuídas e estão presentes em 88 países em quatro continentes e compreendem uma das dez endemias mundiais prioricárias da Organização Mundial da Saúde (OMS). Estas são clinicamente divididas em leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT), a qual inclui as formas cutânea e mucosa. Mais de 90% dos casos de LT ocorrem no Irã, Afeganistão, Sina, Arábia Saudita, Brasil e Peru. Mais de 90% dos casos de LV ocorrem em Bangladesh, Brasil, índia e Sudão. Estima-se que aproximadamente 12 milhões de pessoas estejam atualmente infectadas e cerca de 350 milhões sob risco de adq uirir a doença. A incidência anual estimada para a LV e para a leishmaniose cutânea, apresentação clínica mais freqüente da LT, é alarmante: 500.000 casos e 1 a 1,5 milhão de casos, respectivamente. A leishmaniose visceral, particularmente, os~enta o status de uma das doenças mais negligenciadas db mundo. No Brasil, as leishmanioses são consideradas um grave problema de saúde pública, tendo em vista a sua magnitude e expansão geográfica.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO
AGENTES ETIOLÓGICOS E CICLO BIOLÓGICO As leishmanioses constituem um grupo de doenças causadas por várias espécies de protOzoários da ordem
Kineroplastida, família Trypanosomat1dae, gênero Lelshmama spp. O subgênero Le1shmama abriga as espéCies responsáveis pela LV: L. donovani, na Ásia e África, L. mfantum no Mediterrâneo, China e norte da África e L. chagasi, no Brasil e no restante da América Latina. Neste mesmo subgênero encontra-se a L. amazonens1s, uma das espécies responsáveis pela LT no Brasil, juntamente com a L. braziliensis e L guyanensis, pertencentes ao subgênero Viannia. Os parasitas do gênero Le1shmama apresentam-se sob duas formas evolutivas: amastigotas e promascigoras. A primeira é encontrada em hospedeiros vertebrados em condições naturais ou em moculações experimema1s. A segunda pode ser observada no aparelho d1gest1vo de seus vetares ou em cultura. A ordem Kineroplastida é morfologicameme caractenzada pela presença do cinecoplasco, organela rica em DNA e que está ligada à micocôndria da célula. As formas amastigotas são aflageladas, esféricas ou ovóides, de dimensões variando entre 2 a 5 ~m. Tais formas podem ser observadas livres ou no interior de células do sistema monocítico fagocitário, onde se multiplicam por divisão binária. As formas promastigotas são alongadas ou fusiformes, apresentando um flagelo livre na porção anterior da célula. Seu taman ho é bastante variável, podendo medir de 15 a 35 ~m . Os vetares das leishmanioses são insetos dípteros da família Psychodidae, subfamília Phleborominae, gênero Lutzomy1a. Somente as fêmeas são hematófagas e se alimemam de grande variedade de animais, sendo
as responsáveis pela transmissão do parasito. Em áreas rurais e urbanas, várias espécies de fleboromínios apresemam a capacidade de invadir os domicílios e abrigos de animais domésticos. estando cotalmeme adaptados às modificações ambientais promovidas pelo homem. Em condições naturais, estes insetos se mfectam durante o repasco sanguíneo no homem ou em outros an1ma1s. As formas amastigoras. ao atingirem o intestino médio, evoluem para promastigotas e se multiplicam ativamente. Ao término do tercei ro dia. as formas promastigotas invadem as porções anteriores do intestino do inseto, onde continuam a se reproduzir, obstruindo a luz deste órgão. Ao picar o animal ou o homem, o inseto inocula. por regurgitação, as formas promast1gotas infectantes (metacíclicas). Tais formas invadem ou são fagocitadas por células do SIStema monocítico fagocitário e iniciam sua fase de parasitismo no hospedeiro vertebrado. A disseminação da Le1shmania spp pode ocorrer por v1a hemarogên1ca e/ou linfática. As formas amastigotas se multiplicam rapidamente dentro dos macrófagos teciduais no sítio da picada do flebotomíneo. A partir daí, ocorre a migração dos amastigocas para as vísceras. principalmente órgãos linfóides. quando da infecção porespéoes Vlscerorróp1cas. Uma vez ocorrida e~La m1gração, as formas amasngotas são encontradas dentro de macrófagos ou. raramente. livres, nos espaços teciduais. Medula óssea, baço, fígado e linfonodos. órgãos ricos em células do sistema monocítico fagocitário, são mais densamente parasitados. Na infecção por espécies dermotrópicas. as formas amastigoras se multiplicam em macrófagos localizados na pele ou em mucosas. podendo-se encontrar grande quantidade de parasitos livres no teodo conjuntivo da derme e também células parasitadas na ep1derme. As raposas e os marsupiais. como o gambá, são reservatórios silvestres. No ambiente urbano, o cão é fonte primária de infecção, sendo considerado o principal reservatório doméstico da LV. Esta espécie animal caracteriza-se como fonte de transmissão eficaz por coabitar com as pessoas e, mUltas vezes, apresentar altas taxas de infecção sem ter quadro clínico aparente. Escudos têm demonstrado que a Infecção no cão precede o aparecimento de casos humanos. No âmbito doméstico. tem sido verificado que cães com sorologia reagente muitas vezes não apresentam sinais ou sintomas clínicos. aruando, no entanto, como bons reservatórios, com grande poder de infectar o vetor da doença.
662 ( Medicina laboratorial para o clínico
ASPECTOS SOCIOEPIDEMIOLÓG ICOS As leishmanioses são zoonoses consideradas, inicialmente, de transmissão essenoalmente silvestre em ambientes rurais. Verificam-se arualmente mudanças no padrão de cransmissão em decorrência das modificações soooamb1entais. como desmatamento e o processo migratório caracterizado pelo êxodo rural. Nesse contexto, a leishmaniose antroponótica, na qual o homem atua como reservatório e fonte de infecção para o vetor, vem adqu1rindo relevância e tem s1do relac1onada a epidemiaS, particularmente de LV. No Brasil, a LV é uma doença endêmica com regisuo de surtos freqüentes. Inicialmente, sua ocorrência era limitada a áreas rurais e a pequenas localidades urbanas. mas. arualmente, encontra-se em franca expansão para grandes centros. Assim. observou-se no início da década de 80 surro epidêmico em Teresina (PI) e, desde então, já se diagnosticaram casos autóctones em São Luís (MA), Fortaleza (CE). Natal (RN), Aracaju (SE). Belo Honzonte (MG), Santarém (PA). Corumbá (MS), Campo Grande (MS). Palmas (TO), Araçatuba (SP). Está dism buída em 19 estados da federação. atingindo quatro das cinco regiões brasileiras. Sua maior incidência encontra-se no Nordeste, com aproximadamente 70% do total de casos, seguido pela região Sudeste, região Norte, e. finalmente, região Centro-Oeste. Ao analisar a evolução da LT no Brasil, observa-se expansão geográfica. No início da década de 80. foram registrados casos em 20 unidades federadas (UF) e a partir de 2001 todas as UFs registraram casos autóctones da doença. No ano de 1994 houve registro de casos autóctones em 1.861 municípios, o que representa 36.9% dos municípios do país; em 2002 houve expansão da doença para 2.302 mun icípios (41,1%). As regiões Nordeste e Norte vêm contri buindo com o maior número de casos registrados no período (cerca de 36.9 e 36.2%. respectivamente) e a região Norte com os coefioentes mais elevados (99,8/100.000 habitantes), segu1da das regiões Centro-Oeste (41.8/100.000 habitantes) e Nordeste (26.5/100.000 habitantes). Nas Figuras 53.1 e 53.2 encontra-se o número de casos de LV e LT notificados no Brasil no período de 2001 a 2006, segundo informações do Banco de Dados do Sistema Único de Saúde (DATASUS). Nestas séries históricas destacam-se a ascensão da LV e a queda gradativa da
LT. A redução de casos de LT encontra-se relaoonada à intensificação das ações de controle coordenadas pela Secretana de Vigilância em Saúde (SVS). Esta. em parceria com o Departamento de Endemias Samuel Pessoa (ENSP/FIOCRUZ). desenvolveu um modelo de vigilância e moniroramento da LT para identificação de áreas prioritárias. Inicialmente, foi realizada uma análise da distribuição espaço-temporal da endemia, utilizando-se. além do número de casos e do coeficiente de detecção. a densidade de casos por área. Também foram analisados dados ambientais, sociais e demográficos das áreas de relevância epidemiológica para este agravo. A parr1r dessas análises. foram identificados os principais circuitos e pólos de produção de LT no país.
83 casos relatados no país, regisuados em 12 estados, revelou que 37.3% apresentavam LV e 62,7% apresentavam LT. sendo 21,8% com a forma cutânea e 40.9% com a forma mucosa. Vale destacar que a notificação das le1shman1oses é compulsória e todo caso confirmado deverá ser notificado pelos serviços públicos, pnvados e filanuóp1cos por meio da ficha de investigação epidemiológica padronizada no Sistema Nacional de Agravos de Notificação (SINAN).
APRESENTAÇÕES CLÍNICAS leishmaniose visceral
40000
Em regiões endêmicas. esnma-se que 20% dos indivíduos infectados por L. chagas1 desenvolverão a forma clássica da doença. Nos dema1s, a infecção rende a ser assmtomárica ou oligossimomática.
35000
"' •O Q)
uov 30000
--= -~ c
25000
Q)
-o
e
20000
5000
Q)
E •:::>
z
4500
15000
Q) "' •O 4000
u-
10000
o
~ 3500 õc
5000
3000 Q) -o o 2500
o 2001
2002
2003
2004
2005
2006
Ano Brasil M inas Gera is
F1gura S3.1 - Notificações de le1shman1ose VISCeral no Bras1l e em M1nas Gera1s no penado de 2001 a 2006. Fome: Banco de dados do Sistema Ún1co de SaC1de - OATASUS.
Q;
E 2000
•:::>
z
1500 1000
500
o 200 1
2002
2003
2004
2005
2006
Ano Brasil
Mais recentememe. a associação das infecções causadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e pelos prorozoános do gênero Le1shmama spp, caracrenzando a cc-infecção Le1shmanw/HIV, vem desempenhando papel importante na expansão das leishmanioses. Casos de co-mfecção Le1shmama/ HIV têm sido relatados em mais de 30 países pelo mundo. sendo verificada incidência expressiva na Europa. particularmente na Espanha. França. Itália e Portugal. Casos de co-1nfecção Le1shmama/ HIV têm sido descritos no Brasil desde 1987. A avaliação de
Investigação laboratorial das leishmanioses
M inas Gera1s
Figura S3.2 - Notificações de lmhmaniose tegumemar no Brasil
e em M1nas Gera1s no período de 2001 a 2006. Fonte· Banco de dados do S1srema Ún1co de Saúde - DATASUS.
O período de incubação da doença varia entre do1s e sere meses e, geralmente. apresenta evolução arrastada. O primeiro sintoma de visceralização é febre baixa recorrente, freqüemememe com do1s ou três picos diários, que perSISte com rem1ssões durante rodo o curso
663
da infecção. Esplenomegalia é o achado mais imporcanre
de inoculação das promasEigocas infeCEanres. acravés da
na LV. Na fase inicial da doença. a esplenomegalia não é pronunciada, mas torna-se uma característica invariável nos casos de doença estabelecida e crônica. O tamanho do baço varia, sendo caracteristicamente encontrado
picada do vetar, para qualquer das espécies de Leishmania causadoras da doença. A lesão primária é geral mente única, embora eventualmente múltiplas picadas do flebotomíneo ou a disseminação local possam gerar um
encre cinco e 15 cm da reborda coscal esquerdo e, em
número elevado de lesões. Surge após um período de
geral. quanto mais prolongada for a doença. maior o baço. Áreas de congestão e de infarro esplênico podem ocorrer, incl usive com ruptura do órgão. Em pacientes não tratados, a doença crônica é marcada pelo progressivo emagrecimento e enfraquecimento geral. com aumento da susceptibilidade a infecções secundárias. Leucopenia e trombociropenia estão associadas à tendência hemorrágica. Anorexia e anemia aumentam a incapacidade geral. levando à deficiência de vitaminas. Esta seqüência de eventos aumenta a debilidade do indivíduo e pode conduzi-lo à caquexia e ao óbito. A forma oligossinromática é facil mente confundida com outras doenças em virtude da baixa magnitude dos sinais e sintomas. Todas as manifestações que ocorrem na forma clássica podem estar presentes com menos intensidade ou menos freqüência, resultando em discreto comprometimento do estado geral. Nestes casos, o aumento do fígado é mais freqüeme do que o do baço. que usualmente não ultrapassa 5 cm da reborda costal. Diversos estudos têm revelado freqüência variável da infecção assimomática por L. chagasi. definida pela ocorrência de resultados positivos em testes imunológicos, sem smtomatologia clínica manifesta. A propedêutica laboratorial torna-se decisiva na definição do diagnóstico da LV quando o quadro clínico apresentado pelo paciente se confunde com outras doenças que cursam com heparoesplenomegalia febril, tais como malária, forma roxêmica da esquisrossomose, salmonelose septicêmica prolongada, febre tifóide, brucelose, histoplasmose. endocardite bacteriana aguda, linfomas e leucemias.
incubação variável de 10 dias a três meses, como uma pápula eritemarosa que progride lentamente para nódulo. Acompanha-se de adenopatia regional. com ou sem linfangite, em 12 a 30% dos casos. São freqüemes as ulcerações com bordas elevadas, enduradas e fundo com tecido de granulação. A leishmaniose mucosa é condição de difícil tratamento e prognóstico reservado quanto à possibilidade de cura. Está associada à L. braziliensis, na maioria dos casos ocorrendo em um intervalo de tempo variável após a instalação da lesão cutânea inicial. Os fatores que contribuem para que uma doença inicialmente cutânea evolua para essa forma tardia não são de rodo conhecidos. mas sabe-se que a demora na cicatrização da lesão primária e tratamento inicial inadequado podem estar associados. O acometimento mucoso pode surgir com a lesão cutânea ainda em atividade ou anos após sua cicatrização. Na quase tOtalidade dos casos a LM acomete a mucosa nasal, com importante comprometimento do septo, seguindo-se em ordem de freq üência o envolvimento da mucosa oral. Em am bos os casos o risco de deformidades permanentes é considerável. O acometimento de outras mucosas que não as das vias aéreas superiores é excepcional. Encontra-se na Figura 53.3 a classificação clínica para a LT proposta por Marzochi e Marzochi em 1994. As formas cutâneas devem ser diferenciadas das úlceras traumáticas. úlceras de esta se. úlcera tropical. úlceras de membros inferiores por anemia falciforme. piodermites, paracoccidioidomicose. neoplasias cutâneas, sífilis e tuberculose cutânea. A hanseníase virchowiana deverá ser excluída, principalmente no diagnóstico diferencial da leishmaniose cutânea difusa. Nas lesões mucosas, o diagnóstico diferencial deve ser feitO com a paracoccidioidomicose. hanseníase virchowiana. rinoscleroma. bouba, sífilis terciária, granuloma médio facial e neoplasias. Nas formas vegetames, distingue-se a variedade verrucosa. muito freq üente, que simula a esporotricose verrucosa. a cromomicose, a paracoccidioidomicose, a piodermite vegetante e a tuberculose verrucosa.
l eishmaniose tegumentar
A apresentação clínica da LT é determinada pela espécie do agente infeccioso e sua virulência, bem como pela resposta imunológica do hospedeiro. A leishmaniose cutânea é definida pela presença de lesões exclusivamente na pele, que se iniciam no pomo
664 [ Medicina laboratorial para o clínico ]~------------------------------
l [
leishmoniose Cutâneo
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
l
I
l
l
leishmoniose Mucoso
J
( 1) Formo Cutâneo único (2) Formo Cutâneo Múltiplo (3) Formo Cutâneo Disseminado (4) Formo Recidiva Cútis (5) Forma Cutânea Difusa
(6) Formo mucoso tardio (7) Formo mucoso concomitante (8) Formo mucoso contíguo (9) Formo mucoso primário (1O) Formo mucoso indeterminada
Leishmonio broziliensis I 1, 2, 3, 4} Leishmania amazonensis I 1, 2, 3, 4, 5} Leishmania guyanensis 11,2,3}
Leishmania braziliensis 16, 7, 8, 9, 1O} Leishmania amazonensis 18}
Figura 53.3 - Classificação clínica e respecr1vos agenres euológ1cos da le1shmaniose regumenrar no Brasil. Fome: Manual de V1gilânoa da Le1shman1ose Tegumenrar Amencana, FUNASA: MS.
EXAMES LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO DAS LEISHMANIOSES
O diagnóstico laboraconal das leishmanioses consiste, fundamentalmente, na utilização de crês princípios mecodológicos: os restes parasicológicos, os restes imunológicos e os restes moleculares. Exames complementares gerais geralmente acompanham a abordagem diagnóstica específica. Dentre estes. destacam-se os exames bioquímicos, hemacológicos e histopacológicos.
pático, até 85% para o aspirado de medula óssea e em torno de 50% para o aspirado de linfonodos. No Brasil, recomenda-se a punção aspirativa da medula óssea para a realização do exame direto e Isolamento em cultivo. Na LT. são utilizados procedimentos de escarificação. punção aspirativa ou biópsia das lesões cutâneas, de linfonodos ou de mucosas para a pesquisa direta de Leishmania spp. Tal abordagem apresenta sensibilidade em torno de 70% na forma cutânea e em corno de 40% na forma mucosa.
EXAM ES PARASITOLÓGICOS
Os exames parasirológicos são considerados os mécodos de referência no diagnóstico das leishmanioses e baseiam-se na demonstração direta do parasito e no seu isolamento em cultivo in vivo ou in vitro. As formas amastigoras de Le1shmania spp. podem ser visualizadas pelo exame direro após coloração (Giemsa ou Leishman). Geralmente são intracelulares, medem 4 a 10 1-l de diâmetro e apresentam forma ovalada. O núcleo é excênuico e cora-se em violeta (Figura 53.4). Na LV, o desempenho da pesquisa direra do parasico varia conforme o material biológico utilizado na inves(lgação. Verifica-se sensibilidade superior a 90% para o aspirado esplên1co. entre 70 e 90% para o aspirado he-
Investigação laboratorial das leishmanioses
Figura 53.4 - Formas amasrigoras de Leíshmama spp. Fome: Laboratório de Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ. Ver p1 ancha color1da
665
O mesmo macerial colecado para a realização do exa-
sas, a resposca ao cesce é mais incensa. podendo ocorrer
me direco pode ser utilizado em exames parasicológicos indirecos, como a inoculação em meios de cultura. O isolamemo da Leishmania em cultivo, porém, rarameme é necessário na prática clínica rotineira. Emretamo, tal
ulceração e necrose local. Na LV, o cesce é caracceriscicamence negativo na doença ativa. Após o cratamemo, este se torna positivo em mais de 80% dos paciemes após seis meses. A reação
mecodologia enconcra-se indicada na complemencação
de Moncenegro é considerada, porém, um imporcance
da abordagem diagnóscica, diante de falhas nas metodologias convencionais. O Novy-Nicolle-McNeal (NNN) é o meio mais utilizado, com uma fase líquida de solução salina estéril à qual se adiciona outro meio líquido, como LIT ou Schneider, aumemando e acelerando a positividade da cultura. As culturas devem ser mamidas entre 24 e 26°( e observadas em microscopia óptica comum ou invertida, semanalmente, até quatro semanas. Na LV, a positividade é bastante elevada (acima de 80%), sobretudo nos aspirados de medula óssea e baço. Na LT. esta gira em corno de 70%. O paras1to pode ser demonstrado a parc1r da inoculação do material biológico supostameme infectado em animais de experimentação, tais como hamsters. Tal mecodologia apresenta sensibilidade superior a 90%. Esta estratégia, porém, não é rotineiramente utilizada com final idades diagnósticas, pois vários meses podem ser necessários para a obtenção de resultado positivo. O animal pode ser infectado por diversas vias. sendo a intrapericonial a mais utilizada. Semanalmente, o animal deve ser examinado em busca de sinais e sincomas da doença e, em caso afirmativo, os parasitos podem ser recuperados por bióps1as esplênicas e hepáticas. Na ausência de sinais e sintomas da infecção, os animais devem ser sacrificados em quatro meses e amostras esplên icas e hepáticas submetidas à análise.
teste em estudos epidemiológicos da LV, uma vez que permite estimar a extensão do concaco com os parasitos e detectar formas assintomácicas e oligossincomáticas da infecção. O achado de teste positivo em indivíduos procedemes de área endêmica sem historia clínica de LV sugere infecção assintomática ou oligossimomácica prévia. Alguns aucores detectaram boa correlação de positividade entre esta e testes sorológicos. A reação é realizada a parti r da inoculação intradérmica de 0,1 mi do antígeno na face anterior do antebraço esquerdo, na pele sadia, dois a crês centímetros abaixo da dobra cubital. A leitura deve ser realizada 48 a 72 horas após a aplicação. sendo considerada positiva quando a induração resultante for igual ou maior que cinco milímetros (Figuras 53.5 e 53.6). É válido ressaltar relatos de casos de reatividade cruzada com tuberculose ganglionar e lepra lepromacosa. Por outro lado, a reaçào pode apresentar-se negativa nas seguintes situações: • nos primeiros 30 dias após o início das lesões, excepcionalmente por período mais prolongado; • nos casos de leishmaniose disseminada, positivando-se no decorrer do tratamento; • na leishmaniose cutânea difusa; • em pacientes imunocomprometidos.
EXAMES IM UNO LÓG ICOS
Teste intradérmico
Em 1926, Montenegro introduziu na prática médica a reação de hipersensibilidade retardada através da injeção int radérmica de suspensão de promastigotas de L. braziliensis com a finalidade de auxiliar no diagnóstico da LT. Esta torna-se positiva dois a três meses após o aparecimemo da lesão na leishmaniose cutânea e pode permanecer positiva por toda a vida. Nas formas muco-
666
Medicina laboratorial para o clínico
Figura 53.5 - Técnica de aplicação da Reação de Moncenegro. Fome: Laboratório de Pesquisas Clínicas do Cencro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ. Ver prancha colonda
para detecção de anticorpos específicos na leishmaniose. A sensibilidade é semelhante àquela verificada na RI FI, com significativo ganho em especificidade com a utilização de antígenos recombinantes na reação. Entre estes destaca-se a proteína rK39, extrema-
mente escudada no imunodiagnóscico da LV, para a
Figura 53.6 - Reação de Momenegro posi[lva (delimitação da enduração com caneta esferográfica). Fome: Laboratório de Pesquisas Clínicas do Cemro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ. Ver prancha colorida Testes sorológicos
Testes sorológicos baseados na pesquisa de anticorpos têm sido desenvolvidos como uma alternativa às metodologias parasitológicas. Estes apresentam como grande vantagem o caráter não-invasivo da abordagem. Entretanto, não permitem a distinção entre infecção ativa, subclínica ou passada e há a possibilidade de rearividade cruzada com ouuas doenças. Entre as técnicas mais utilizadas, destacam-se: • reação de imunofluorescência indireta - RI FI; • ensaios imunoenzimáticos- ELISA • reação de aglutinação direca - DAT; • teste imunocromatográfico rápido. A RIFI tem sido amplameme empregada no diagnóstico da leishmaniose, sendo o teste precon izado pelo Ministério da Saúde para este fim. O resultado da RI FI é usualmeme expresso em diluições. Aceita-se como positivas as diluições a partir de 1:80. Para títulos iguais a 1:40, recomenda-se solicitação de nova amostra em 30 dias. A sensibilidade do teste é considerada satisfatória na abordagem diagnóstica da LV: superior a 90%. Sua especificidade, porém, pode ser crítica (60 a 70%) devido à reatividade cruzada com outras infecções, tais como doença de Chagas e malária. Já em relação à LT. a RIFI apresenta sensibilidade em torno de 70% para a forma cutânea e pode chegar a 100% na forma mucosa. Desde sua incrodução, em 1971, os métodos imunoenzimáticos, como o ELISA, vêm sendo avaliados
Investigação laboratorial das leishmanioses
qual se verifica especificidade superior a 80%. Outra metodologia imunológica interessante é o teste de aglutinação di reta - Direct Agglutination Test (DAT). Este é processado à temperatura ambiente, apresenta baixo custo operacional e bom desempenho, com sensibilidade superior a 95% e especificidade de, no míni mo, 90%. Já o teste imunocromatográfico rápido destaca-se pela praticidade e adequação à abordagem imediata do paciente. Escudos recentes têm conferido ao reste sensi bilidade e especificidade superiores a 90%. A utilização de testes sorológicos para o diagnóstico da LV é uma preocupação naco-infecção Leishmania/HIV. A sensibilidade destes tem se revelado significativamente mais baixa em pacientes portadores da referida associação. Portanto, testes soro lógicos não devem ser utilizados como critério isolado para afastar o diagnóstico.
EXAMES GENÉTICOS
Nas leishmanioses, as análises do DNA genôm ico, DNA ribosomal e o DNA de cinetoplasto têm permitido o desenvolvimento de oligonucleotídeos sintéticos para o uso em reação de poli merização em cadeia (PCR). A maioria dos iniciadores utilizados nestes ensaios detecta regiões conservadas, presentes em todas as Leishmania spp., enquanto outras someme reconhecem seqüências de subgrupos mais relacionados. Considera-se que os iniciadores dirigidos comra as regiões mais conservadas são ma is sensíveis, enquanto os empregados para a ampli ficação de regiões variáveis, uti lizados para a identificação de espécies, são menos sensíveis. Os primeiros estudos que avaliaram a PCR para a detecção de LV isolaram o DNA do parasito de aspirado de medula óssea, baço e lin fonodos, os órgãos mais densamente parasitados, e observaram sensibilidade variando de 82 a 100% e especificidade encre 97 e 100%. Na LT. a sensibilidade do método supera as demais abordagens usualmente em pregadas
667
(exame direto e cultura), alcançando sensibilidade de 98% e especificidade de 95%; segundo alguns auwres. Mais recentemente, o isolamento e a amplificação de DNA do parasito em sangue periférico apresentaram-se como alternativa não-invasiva valiosa de diagnóstico da LV. A sensibilidade desses ensaios em pacientes imunocompetentes variou de 72-90%. com especificidade de 100%.
Diferentemente dos pacientes com forma clínica manifesta ou refratária da LV, os paCientes com forma subclínica têm pouca ou nenhuma alteração hematológica e bioquímica. Em geral, a anem1a é discreta, os leucócitos estão em número normal ou ligeiramente diminuído e
EXAMES GERAIS
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A abordagem laboratorial dos pacientes com suspeita de LV inclui geralmente exames bioquímicos e hematológicos, ao contrário da LT. cuja abordagem laboratorial mantém-se restrita ao diagnóstico da infecção na maioria dos casos. Na forma clássica da doença, as enzimas hepáticas estão comumeme alteradas. com uansaminases duas a três vezes o limite superior de referência. A dosagem sérica e a eletroforese de proteínas têm resultados típicos. com aumento acentuado da fração globulínica e queda da album1na. Vários exames hematológicos são úteis na complementação do diagnóstico da LV. Nas formas agudas, o hemograma é bastante expressivo. A maioria dos pacientes apresenta anemia com níveis de hemoglobina inferiores a 10 g/dL, contagem de leucócitos abaixo de 5.000/mm 3, plaquetas inferiores a 200.000/mm 3, chegando a menos de 100.000 células/mm3 com muita freqüência. O mielograma na LV é bastante característico, evidenciando alterações significativas na relação eritróciws/ granulócitos e pobreza nas séries granulocítica e plaquetária. Há intensa plasmom ose, com grande quantidade de células mononucleares. Muitas vezes, se o parasitismo é intenso, os macrófagos estão repletos de formas amastigotas de Leishmania spp. no interior do citoplasma (Carvalho et a/., 1985) Tanto no baço. quanto no fígado e linfonodos, pode-se verificar proliferação de células do sistema histiofagocitário.
Vários métodos podem ser aplicados para o diagnóstico das leishmanioses. sendo fundamental a associação das informações clínicas e epidemiológicas aos resultados de exames. Nesse contexto, pode-se afirmar: • na presença de dados clínicos e laboratoriais, um teste sorológico reagenre reforça o diagnóstico de leishmaniose visceral; • os testes sorológicos não devem ser utilizados como critério isolado para diagnóstico de leishmaniose tegumentar.
os exames bioquímicos estão demro dos limites de referência. O diagnóstico é fundamentalmente realizado por meio de metodologias imunológicas.
REFERÊNCIAS 1.
2. 3.
4. 5.
6.
7. 8.
Banco de dados do S1stema C:mco d~ Saude. 01sponíve em: hrrp:// www.datasus.gov.br Gonrijo B. Carvalho MLR. Le1shman1ose tegumemar americana. Rev Soe Bras Med Trop 2003; 36:71-80. M1n1stério da Saúde. Le1shmaniose v1scera l grave: normas e condutas. Brasília: M1n1sténo da Saúde. 2005. Min istério da Saúde. Manua l de vigilância e controle ela leishmaniose visceral. Brasília: Ministério da Saúde, 2003. Ministério as Saúde. Manual de recomendações para diagnóstiCO e acompanhamento da co-mfecção Lelshmama-HIV. Brasília: M1n1sténo da Saúde. 2004. Rabello A. Andrade MO. D1sch ). Letshmama/ HIV colnfecrion 1n Brazil: an appra1sal. Anna Trop Med Paras1rol. 2003; Oct;97 Suppll: 17-28. Sundar S. Ra1 M. Laborarory diagnos1s of VlscerallelshmanlaSIS. Chn 0 1agn Lab lmmunol. 2002; 9:951-8. World Heal th Organizatlon. Strategic D1 rccuon for Research - Le1shmaniasis. 2005. D1sponível em: http:// www. who.org.
Rômulo Carvalho Vaz de Mel/o Guilherme Bircha/ Cofiares
54
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM INFECÇÃO PELO Treponema pallidum
A sífilis ou lues é uma doença infecciosa, sexualmente transmissível, sistémica. crônica, sujeita a ciclos de reagudtzação em sua fase inicial e longo período de latência em sua fase tardia. Causada por uma espiroqueta. Treponema palhdum. é capaz de infenar praticamente rodos os órgãos e tecidos humanos e gerar grande variedade de manifestações clínicas em diferences sistemas, razão pela qual a doença já foi chamada de "a grande imitadora (the Great Pretender)" em tempos passados. Deste modo, a caracterização clínica da sífilis é. muitas vezes, complexa e os exames laboracoriais assumem importance papel no auxílio diagnóstico.
ASPECTOS RELEVANTES DA INFECÇÃO AGENTE ETIOLÓGICO
O agente etiológico da sífilis, na época conhecido por Spirochaeta pai/ida, foi isolado pela primeira vez de lesão primária. em 1905, por Schaudinn e Hoffman. O microrganismo, acualmente denominado Treponema palltdum, é uma espiroqueta de estrucura helicoidal de cerca de 0,151-1 de largura e 6 a SOIJ de comprimento, com seis a 14 espirais. sendo muiro delgado para ser visro pela coloração de Gram. Possui parede celular semelhante à de baccérias gram negativo. apresentando uma camada superficial de ácido hialurônico recobrindo a membrana externa.
O homem é o único hospedeiro natural conhecido. O microrganismo não é cultivável nos meios de cultura habitualmente utilizados no laboratório clínico. podendo ser isolado, porém, através da inoculação em testículo de coelho e mantido vivo por transferências seriadas. No encanto, esse méwdo de cultivo não rem utilidade na prática clínica.
EPIDEMIOLOGIA E FORMAS DE TRANSMISSÃO
O T. pallidum é transmitido. principalmente, por via sexual, através de lesões na pele ou mucosa dos órgãos genitais. Raramente o sírio de inoculação do agente é extrageniral, podendo levar ao aparecimento de lesões primárias em locais diversos. como boca e ânus. A taxa de transmissão após relação sexual desprotegida com parceiro com sífilis nos estágios iniciais da doença chega a 30 a 50%. A rransmtssão vertical, da gestante infectada para o concepto, por via transplacentária, é outra importante forma de disseminação do agente, podendo ocorrer em qualquer fase da gravidez e em qualquer fase da doença materna. O risco de transmissão vertical em gestantes não tratadas é de 70 a 100% quando a doença se encontra nas fases iniciais (primária ou secundária) e de aproximadamente 30% nos estágios tardios (latente ou terciária). A transmissão rransfusional não é comum, devido à triagem sisremá(lca e à grande susceptibtlidade da espiroquera ao processamento do sangue e seus derivados.
A incidência de sífilis primária e secundária em 2002 nos Estados Unidos foi de 2.4 novos casos para cada 100.000 habitantes. variando entre regiões e grupos étnicos. As taxas vinham caindo desde o início da década de 90, ocorrendo, porém, novo aumento no ano de 2001. A incidência de sífilis congénita é de aproximadamente 11,1 casos para cada 100.000 nascidos vivos naquele país. No Brasil, dados epidemiológicos a respeico da incidência de sífi lis são escassos. Apesar de a sífilis congénita ter sido incluída na lista de doenças de nmificação compulsória desde 1986. a subnotificação tem sido regra. sendo que apenas 24.448 casos foram nocificados enue 1998 e 2004. Apesar disco. estimativas de escudos de representatividade nacional são de que a prevalência de sífilis em gestantes tenha sido de 1,6% em nosso país no ano de 2004. Deste modo, são estimados aproximadamente 15 mil novos casos anuais de sífilis congénita. Estatísticas de mortalidade apontam para um conuole insuficiente da sífilis no Brasil. uma vez que ocorreram 2.7 óbicos em menores de um ano de idade por sífilis para cada 100.000 nascidos vivos em 2003.
APRESENTAÇÃO CLÍNICA A evolução clínica da sífilis. como apresentada nos livros didáticos. foi descrita após escudo desenvolvido no Alabama, Estados Unidos. no século passado. O escudo. denominado Tuskegee Study oj Untreated Syphllls. foi desenvolvido pelo Serviço de Saúde Pública Americano. entre 1932 e 1972, e consistiu na observação da evolução clín1ca da sífilis em 400 negros americanos. que permaneceram sem uatamento ao longo dos anos até a necropsia. Como grupo-controle. foram observados 200 negros americanos sem a doença. O escudo original continua sendo mmivo de discussão devido às sérias implicações éticas. como sua natureza racista, ausência de consentimento esclarecido dos participantes e o não tratamento dos pacientes, mesmo após a descoberta da penicilina, faros que levaram o presidente Clinton a pedir desculpas à Nação em 1997. A evolução da sífilis geralmente ocorre em quauo estágios sucessivos com diferentes manifestações clínicas: sífilis primária. sífilis secundária. sífilis latente e sífilis terciária. A sífilis pnmána é caracterizada pelo aparecimento de lesão ulcerativa. indolor, de base limpa com bordas
670 ( Medicina laborato rial para o clínico
endurecidas. no local da inoculação, associada à linfadenomegalia regional. em média uês a quauo semanas após a infecção. A lesão, denominada cancro duro. apresenta resolução espontânea e não deixa cicauiz. Cerca de duas semanas a dois meses após seu desaparecimento, surge novo quadro sindrômico. denominado sifilis secundária. Há o aparecimento de sintomas sistémicos como febre e linfadenopatia. além de lesões máculo-papulares não pruriginosas na pele e mucosas. por codo o corpo. inclusive nas palmas das mãos e plantas dos pés. Nesta fase pode ocorrer, ai nda, envolvimento do sistema nervoso central (meningite asséptica), fígado, rins e ossos. levando à paralisia de nervos cranianos. icterícia. síndrome nefrótica e/ou periostite em diferentes graus. A síjilts latente sucede à síf11is secundária e é caracterizada pela ausência de sinais ou sincomas clínicos. Deste modo, é detectada apenas pelas alterações laboracoriais. Pode ser subdividida em dois estágios: precoce e tardio. A sífilis latente precoce compreende o primeiro ano após o estabelecimento da latência clínica e a sífilis latente tardia corresponde ao período subseqüeme. podendo durar por coda a vida ou dar lugar à sífilis terciária. A sífilis terciária pode aparecer em qualquer intervalo de rempo após a fase secundária, mesmo depois de vários anos de latência. Ocorre em 8 a 40% dos pacientes não uatados e pode atingir quase codos os órgãos e sistemas humanos. As lesões infiluativas (gomas) podem simular tumores de pele, fígado, pulmão. estômago ou cérebro. Lesões no sistema cardiovascular correspondem a 10 a 15% das lesões terciárias da sífilis, podendo se apresentar como aortite, aneurisma ou regurgitação aórtica. O acometimento do sistema nervoso central ocorre em 15 a 20% dos pacientes com sífilis terciária e é denominado neurossífilis. Pode simular diversas ouuas doenças neurológicas, evoluindo progressivamente com deterioração das funções mocora e cognitiva. A neurossífilis apresenta-se de quatro formas clínicas distintas. A neurossífilis assintomática é caracterizada pela presença de alterações laboratoriais na ausência de sinais ou sintomas clínicos. A sífilis meningovascular acomete as meninges e esuucuras vasculares do cérebro. levando a sintomas de meningite crônica. como cefaléia, irritabilidade. paralisia de nervos cranianos e alteração de reflexos. A tabes dorsalis é caracterizada por uma degeneração crônica e progressiva do parênquima da medula espinhal, levando a alterações de propriocepção. hiporonia muscular e hi-
porreflexia. Pode ocorrer auofia ótica, alterações pupilares com hiporreatividade à luz (pupilas de Argyll Robertsan), crises dolorosas abdominais, na laringe, vagina ou reta, além de incontinência urinária (bexiga neurogênica). Finalmente, a paralisia geral progressiva leva à perda funcional progressiva do córtex cerebral, com perda da memória, disartria, uemor, irritabilidade e quadros mais graves, com mudança de personalidade, confusão mental e psicose. É importante ressaltar que essas formas clínicas podem não aparecer isoladamente, sendo comum a superposição de manifestações. A sífilis congênita pode ser dividida em duas fases, dependendo do tempo de evolução. A precoce ocorre até o segundo ano de vida e apresenta-se com quadro clínico variável, desde assintomática ao nascimento até quadros graves, com prematuridade, baixo peso ao nascimento e diversas alterações clínicas. como hepatoesplenomegalia. lesões cutâneas, ósseas. neurológicas e pulmonares. entre outras. A tardia aparece após o segundo ano de vida. Está associada a lesões ósseas, como tíbia em "lâmina de sabre". nariz "em sela", dentes incisivos medianos superiores deformados (dentes de Hutchinson), mandíbula curta. entre outros. Podem estar presentes, ainda. surdez neurológica e dificuldade de aprendizado.
EXAMES LABORATORIAIS NA INFECÇÃO
PELO Treponema pallidum
Como descrito anteriormente. a sífilis pode apresentar-se de formas clínicas bastante variáveis, acometendo diversos órgãos e sistemas do corpo humano. Deste modo, os exames laboratoriais assumem papel de grande importância no auxílio diagnóstico da doença. Os exames usados no diagnóstico e acompanhamento de pacientes com sífilis podem ser divididos em dois grandes grupos: testes bacteriológicos e testes sorológicos.
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓG ICO O T pallidum não é cultivável em meios de cultura habitualmente utilizados no Laboratório de Microbiologia. Deste modo, os teste bacteriológicos baseiam-se na detecção do microrganismo. por pesquisa direta, em amostras de tecidos acometidos pela doença. As-
sim, esses métodos podem ser usados somente nos casos de sífil is primária, secundária e congénita, nos quais o T pallidum pode ser encontrado nas lesões. A pesquisa de Treponema em microscópio de campo escuro é o método bacteriológico comumente utilizado. A positividade depende direcameme da qualidade da colheita, do tempo de transporte do material e da experiência do examinador. A colheita deve ser realizada removendo-se a camada de material que recobre a lesão, delicadamente. com uma g;'l?P, a fim de evitar sangramento. Logo após, uma gota do exsudato límpido que se forma na região deve ser colhido em lâmina de vidro para visualização sob lamínula em microscópio de campo escuro. O materia l deve ser examinado até 15 minutos após a colheita. pois a motilidade do microrganismo. que é característica. sofre interferência da exposição ao oxigénio. queda de temperatura e do ressecamento. Uma alternativa é manter o material vedado entre lâmina e lamínula através da aplicação de esmalte de unha ou vaseli na nas bordas da lamínula. evitando-se o ressecamento e o cantata com oxigénio. Nestes casos, o material pode ser observado até duas horas após a colheita. O diagnóstico é feito pela visualização do T pal/idum (em aumento de 400 ou 1.000 vezes), com sua estruwra helicoidal de seis a 14 espirais se movimentando ativamente para diante e para trás por rotação. O padrão de motilidade é importante não apenas para diferenciar o microrganismo de possíveis artefatos (como fibras de algodão, por exemplo). mas também na tentativa de diferenciar o T pallidum de outras espécies de Treponemas nãopacogênicos. O método não deve ser utilizado para amostras de lesão oral ou retal. já que a diferenciação do T pallidum de outras espiroquetas saprófitas da boca ou reta pode ser impossível. Outra forma de detecção direta do T pallidum é a coloração pela prata (Fomana) de material seco e fixado. Nestes casos, fica ainda mais difícil a diferenciação entre o agente da sífilis e outras espiroquetas, já que não há movimentação. Esta técnica não é comumente usada. Atualmeme, emprega-se a imu nofluorescência direta, em que o T pal/idum é detectado a partir da utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com fl uoresceína. Esses anticorpos apresentam ligação específica, não reagindo com outras espécies de Treponema.
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Treponema pallidum
671
O resultado positivo, por qualquer dos mécodos, confirma o diagnóstico de sífilis. Como a sensibilidade do reste é variável e dependente da colheita, transporte e experiência do observador, um resultado negativo não exclui a infecção Mais recemememe, técnicas de genética molecular para detecção do T pal/idum por reação em cadeia da polimerase (PCR), com utilização de pnmers específicos, têm sido desenvolvidas. Arualmente, essas técnicas são utilizadas apenas em laboratórios de pesquisa, mas podem representar grande avanço no diagnóstico da sífilis no futuro. Apresentam alta sensibilidade e especificidade e podem detectar o agente em praticamente todas as fases da doença, o que representa grande progresso, principalmente para diagnóstico de sífilis congênira, neurossífilis, sífilis terciária e na diferenciação entre sífilis pregressa tratada (com cicatriz sorológica) e reinfecção. Apesar disto, as técnicas ainda precisam ser mais bem avaliadas e padro nizadas para uso rotineiro.
nêmicos na sífilis. Embora anticorpos anticardiolipina possam ser encontrados em pequenas quantidades em pessoas hígidas, atingem alros níveis na infecção pelo T pallidum. Como era de se esperar, os testes apresentam alta sensibilidade, porém baixa especifici-
dade, podendo apresemar resultados falso-positivos em diversas situações clínicas, inclusive em pessoas saudáveis (Quadro 54.1). Desta forma, resultados reagentes devem sempre ser confirmados por testes mais específicos (testes treponêmicos). Quadro 54.1 - PossíveiS causas de resultados falso-positivos em testes não-rreponêmicos
Testes Não·lreponêmicos IVDRL, RPR)
e t reponêmicos
Doenças
Doenças
in fecciosas
não-i nfecciosas
Pneumonia pneu· mocócico
Gravidez
Escarlatina
Hepolopotio crônico
Honseníose
Cãncer avança do
Linfogronulomo venéreo
Uso de drogas injetáveis
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Endocardite bocteria no
Mielomo múltiplo
A infecção pelo T pallidum induz a produção de dois tipos de anticorpos que podem ser detectados por dois grupos de restes sorológicos: restes não-rreponêmicos e testes rreponêmicos. Tais restes podem ser utilizados para o diagnóstico e/ou acompanhamento da sífilis.
Malária
Lúpus eritemotoso sistêmico
Riquetsiose Psitocose Leptospirose Cancro mole Tuberculose Pneumonia por micoplosmo
Testes não-treponêmicos
tO
Outros doenças auto-imunes Múltiplos lronsfusôes de songue Erro técnico
Doença de Chagas Varicela
O primeiro reste, não-treponêmico, fo i descrie desenvolvido por Wasserma nn et ai. em 1906,
a partir de uma adaptação da reação de fixação de complemento, utilizando, como antígeno, extraro de fígado de recém-nascidos vítimas de sífil is congên ita. Posteriormente, foi comprovado que não era a presença do agente infeccioso que induzia a reação, já que extraros de coração de boi tam bém poderiam ser utilizados como antígeno. Na década de 40, foi desco berto que o componente antigênico responsável por essa reatividade era um fosfo lípide: a cardiolipina. A partir daí, vários testes foram desenvolvidos utilizando cardiolipina combi nada com lecitina e colesterol para detecção de anticorpos não-trepo-
672 ( Medicina laboratorial para o clínico
Idade avançado
Infecção pelo H IV Sarampo Mononucleose infeccioso Caxumba Hepatites virais Treponêmicos (FTAABS, hemoglutinoção)
Doença de Lyme Honsenísose
Lúpus eritemotoso sistémico
Malária
Artrite reumotó1de
Mononucleose infeccioso
Cirrose biliar
Leptospirose Adaprado de Hook & Marra. N Engl J Med 1992. 326: 1060-9
) 1 - - - - - - - - - - - - - -- -- - - - - - - - - - - - - - - -
Os restes não-rreponêmicos mais comumenre usados na prática clínica são o VDRL (Venera/ Disease Research Laboratory) e o RPR (Rapid Plasma Reagin). Consistem, bastcamenre. em suspensões de cristais de colesterol como suporte da cardiolipina, em meio comendo lecitina. Uma gota do reagente é adicionada ao soro do paciente, a mistura é agitada por aproximadamente cinco minuros e o material é levado ao microscópio ótico para verificação da floculação. A Figura 54.1 ilustra resces de VDRL reagentes e não-reagentes. Soros reagentes devem ser titulados até que não mais se observe a reação e o resultado deve ser liberado comendo a última diluição em que ocorreu floculação (por ex. reagente até 1/64). ~ tmporrante lembrar que títulos mais alcos esrão assooados à menor freqüência de resultados falso-positivos.
~ .-..
,.
:
./
• Figura 54.1 - Imagem de microscopia de VDRL. À esquerda de floculação em reste reagente. À dtretra, ausênc1a de noculação em reste não reagente. \rtt IJTOilt "'' t 1o"''"
res realizados com soro puro e diluído, demonstraram freqüência extremamente baixa de efeito pró-zona, de tal forma que a prática de diluição pode ser considerada desnecessária. Além disso, nos raros relatos de efeiro pró-zona, geralmente observa-se reação fraca com soro não diluído (em vez de ausência de floculação), o que, certamente, levaria à diluição subseqüence. Acrescentase que tal fenômeno é observado durante a fase secundária da sífilis, caraccerizada pelo excesso de anticorpos anticardiolipina. Assim, diante da suspeita diagnóstica de secundarismo, o clínico deve solicitar que seja realizada diluição do soro a ser restado, através da solicitação de VDRLquancirarivo, além do qualitativo. Os testes não-treponêmicos são usados na propedêutiCa inicial de pacientes com suspeita de sífilis e no rastreamenro da doença em gestantes. Resultados posmvos devem ser confirmados por cesres creponêmiCos, espectaimente aqueles de baixos títulos. Apresentam sensibilidade próxima de 100% para sífilis secundária e latente recente, com menos sensibilidade nas fases primária e teroária (Quadro 54.2). São usados, ainda, no controle de tratamento, já que os títulos caem com o sucesso terapêutico. Outra utilidade é no diagnóstico de sífilis congênita. pela comparação de títulos maternos e do recém-nascido. Além disso, o VDRL pode ser realizado no líquido cefaloraquidiano no diagnóstico da neurossífilis. São testes de execução simples, rápidos e de baixo custo, amplamente difundidos e muico utilizados na prática clínica atual.
Dados não publicados do secor de Soroimunologia
e Homônios do HC/UFMG, referentes ao ano de 2005, mostram que de 375 amostras com restes não-rreponêmicos reagentes, 94 (25%) apresentaram resultado negativo em testes treponêmicos. Na grande maioria (85%), os testes não-treponêmicos positivos se apresentavam em diluições baixas, até 1/2. Contudo, amostras positivas aré de 1/64 foram encontradas. Resultados fa lso-negativos podem ocorrer na presença de grandes quantidades de anticorpos anricardiolipina, em um fenômeno conhecido como pró-zona, razão pela qual os fabricantes dos restes recomendam realização em soro puro e diluído em salina na proporção de 1/10. Tal fenômeno, inerente a codos os testes de aglutinação, ocorre devtdo a uma desproporção entre as concentrações de antígenos e anticorpos, impedindo a agregação das partículas. Apesar disco, estudos máis recentes, em que foram comparados resultados de ces-
Quadro 54.2 - Sensibilidade dos pnncipats restes nàorreponêmicos, de acordo com as fases da sífil1s
% de sensibilidade e fase da sífilis Teste
Primário
Secundário
latente
Terc1ário
VDRL
78%
100%
95%
71%
RPR
86%
100%
98%
73%
Adaptado de Larsen et a/. Clm M 1crob1ol Rev 1995. 8 1-21.
Testes tre ponê micos
Os testes treponêmicos foram desenvolvidos para confirmar resultados positivos de testes não-treponêmicos, devido à baixa especificidade destes. Utilizam antí-
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Treponema pallidum
673
genos do T pallidum de forma a detectar apenas anticorpos específicos contra componentes do microrganismo. Os mais utilizados na prática clínica são hemaglutinaçào indireta (MHA-TP - Microhemagglutination-Treponema pallidum), imunofluorescência indireta (FTA-ABS -Fiuorescent Treponemal Antibody-Absorption) e ensaios imunoenzimáricos. A hemaglutinação para sífilis é realizada utilizando-se hemácias recobertas por antígenos de T. pallidum. O soro do paciente é diluído com suspensão de exuaw anrigênico de Treponema spp. não-pawgênico, para absorção de anticorpos inespecíficos que poderiam apresentar reação cruzada com Treponema pallidum, e posteriormente incubado por aproximadamente uma hora com as hemácias sensibilizadas. A leitura visual é realizada em microplacas de plástico com diversas cavidades de fundo cônico. Se houver presença de anticorpos antitreponema, ocorrerá reaçào de aglutinação das hemácias, formando um tapete no fundo da placa. Ausência de reação é caracrerizada pela sedimentação das hemácias e formação de um pequeno círculo (Figura 54.2).
Figura 54.2 - Reaçâo de hemaglurinaçào 1ndirera (MHA-TP). À esquerda, imagem em rapere do resre reageme. À dire1ra. 1magem em borào do resre não reagente. Ve1 prancha colonda
A imunofluorescência indireta, como a hemaglutinaçào indireta, é realizada em duas etapas. Primeiramente, o soro do paciente é incubado com exuaws antigênicos de Treponema spp. não-pacogênico para absorção de anticorpos inespecíficos. Após a absorção, o soro, em diferentes diluições, é colocado sobre T. pallidum fixado em lâmina de microscopia, com posterior lavagem e nova incubação com anticorpos antiimunoglobulina humana conjugados com fluoresceína. Após nova lavagem, a lâmina é levada a microscópio de fluorescência para leitura. A fluorescência dos ueponemas indica soro reagente (Figura 54.3). É possível a realização de FTA-ABS lgM por meio da utilização de conjugado fluorescenre específico
antilgM, que seria útil no diagnóstico de sífilis congênita, já que anticorpos lgM maternos não arravessam a barreira placentária. Entretanto, por apresentar várias limitações, como inexistência de soros-controle disponíveis e baixas sensibilidade e especificidade, seu uso rocinei ro não é recomendado.
Figura 54.3 -Foro de m1croscopia de fluorescência de imunofluorescência indirera (FTA-ABS) para sífilis. A presença de rreponemas fluorescentes indica teste positivo. Ver prancha colonda
Os tesres treponêmicos apresentam alta sensibilidade em wdas as fases da doença, embora a sensibilidade da hemaglutinação seja ligeiramente inferior à do FTA-ABS na sífilis primária (Quadro 54.3). Apesar disco, a hemaglutinação apresenta execução mais simples e não depende de equipamentos como microscópio de fluorescência para a leiwra. Testes treponêmicos não devem ser usados no controle de tratamento da sífilis, uma vez que permanecem reagentes por muicos anos após a cura da infecção, podendo perdurar por coda vida do paciente. Resultados falso-positivos podem ocorrer em algumas doenças infecciosas ou não (Quadro 54.1). Quadro 54.3 - Sensibilidade dos pnncipais resres rreponêmicos, de acordo com as fases da sífilis
%de sensibilidade e fase da sífilis Teste
Primária
Secundária
Latente
Terciário
FTA-ABS
84%
100%
100%
96%
Hemaglutmação
76%
100%
97%
94%
Adaptado de Larsen
et ai. Clin Microb1ol Rev ·1995, 8: 1-21.
674 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1--- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - -- -
Os mérodos imunoenzimácicos (ELISA). apesar de ainda menos empregados na rorina laboramrial, apresentam como vantagens a possibilidade de aummação e alta sensibilidade. Por isso, são os de escolha na triagem de doadores de sangue.
RECOMENDAÇÕES PARA USO DE EXAMES LABORATORIAIS NA INFECÇÃO PELO Treponema pal/idum
hemaglucinação ligeiramente inferior à do FTA-ABS. É importante lembrar que testes rreponêmicos permanecem reagentes por vários anos após infecção tratada. Assim, em pacientes com história anterior de sífilis, apresentam utilidade bastante li mitada no auxílio diagnóstico, podendo os testes não-rreponêmicos auxiliar, sendo que o aumento matar do que quatro vezes nos seus títulos indicam reinfecção. A Figu ra 54.4 ilustra a utilização dos exames laboratoriais na sífi lis primária.
A utilização racional dos restes laboratoriais para diagnóstico e acompanhamento da sífilis depende do conhecimento prévio do quadro clínico do paciente e do significado dos resultados dos diferentes testes nas diversas situações. A seguir são apresentados roteiros de utilização dos exames laboratoriais no diagnóstico e acompanhamento da infecção pelo T pa/11dum.
SÍFILIS PRIMÁRIA A sífi lis primária é suspeitada pela presença de lesão genital ou extragenital característica, associada ou não à história de contato sexual com parceiro acometido. Como o T pa/lldum pode ser detectado diretamente nas lesões, a pesquisa direta do microrganismo está sempre indicada. Em caso de positividade. o diagnóstico é confirmado e o tratamento deve ser real1zado. Resultados negativos não excluem o diagnóstico, já que a sensibilidade do teste é bastante vanável. dependendo da colheita e transporte adequados do material e da experiêncta do observador. Nestes casos. devem ser pesquisadas as presenças de Haemophllus ducrey1ou de células gigantes multinucleadas de Tzanck associados ao cancro mole e herpes genital. respectivamente, importantes diagnósticos diferenciais de lesões genitais. Testes não-rreponêmicos, como o VDRL. geralmente se tornam positivos aproximadamente duas semanas após o aparecimento do cancro. Assim, podem auxiliar o diagnóstico, mas, como apresentam menos sens1bdidade nessa fase da doença. devem ser repetidos após duas semanas nos casos de resultados não-reagentes (Quadro 54.2). Testes rreponêmicos estão geralmente positivos na fase tardia da sífilis primária (Quadro 54.3). sendo a sensibilidade da
• Em pocienles com história pregresso de sífilis, solicitar somente VDRL ou RPR. Aumento igual ou superior o quatro vezes no título do reoçào, em relação oo exame após o trotamento anterior, indico reinfecção.
Figura 54.4 - Exames laboraronats no dtagnósuco de síftlts primária.
Investigação laborawrial do paciente com infecção pelo Trepon ema pallidum
675
SÍFILISSECUNDÁRIA
SÍFILIS TERCIÁRIA
Na suspeita de sífilis secundária, restes não-neponêmicos, como o VDRL. apresentam sensibilidade próxima de 100% (Quadro 54.2). Deste modo, resulcados nãoreagentes praticamente excluem a doença. Como ocorre em qualquer outra fase, os exames reagentes devem ser confirmados por restes u eponêmicos. Em pacientes com história pregressa de sífilis tratada, o diagnóstico pode ser inferido pelo aumento de pelo menos quatro vezes nos cítulo de VDRL, em relação aos cítulos apresentados pelo paciente no final do tratamento anterior. A pesquisa de T. palltdum também pode estar positiva nesta fase. A detecção do microrganismo em materiais colhidos das lesões secundárias confirma o diagnóstico. A Figura 54.5 ilustra a utilização dos exames laboracoriais na sífilis secundána.
Na suspeita de sífilis terciária, a sensibilidade dos restes não-rreponêmicos é inferior à dos ueponêmicos, sendo que até 30% dos pacientes podem apresentar VDRL não-reageme (Quadro 54.2). Assim, a realização de restes ueponêmicos pode ser valiosa mesmo em pacientes com testes não-n eponêmicos negativos, razão pela qual os laboratórios devem ser informados sobre a suspeita clínica. Tanto o FTA-ABS como a hemaglurinação apresentam alta sensibilidade nesta fase da doença (Quadro 54.3), podendo representar os únicos mécodos sorológ1cos reagentes em muicos casos (Figura 54.6). Vale lembrar que pacientes com história de sífil1s pregressa uarada permanecem com restes rreponêm1cos positivos por vários anos após o tratamento, o que dificulta a interpretação dos resultados. t possível que técnicas de genérica molecular, como PCR, venham a ter papel importante no diagnóstico de sífilis terciária no futuro. Suspeita clínica de sífilis terciária
Teste nõo-treponêmico *
(VDRL/RPR)
· A completo exclusão de sífili s terciórío com teste não-treponêmico negativo não é possível, devido à sensibilidade insuficiente do teste. É necessário teste treponemico negativo.
Figura 54.6 - Exames laboraronats no dtagnósttco de sífilts terctárta. A sífilis terciána pode se apresentar como quadros clínicos extremamente variados, simulando diversas outras doenças. Portanto, é importante tentar afastar outras possíveis causas para as manifestações apresentadas e, assim, aumentar a confiabilidade do diagnóstico.
•Em pacientes com história pregresso de sífilis, solicitar somente VDRL ou RPR . Aumento igual ou superi or o quatro vezes no título do reação, em relação ao exa me a pós o trotamento anterior, indico reinfecção.
Figura 54.5 - Exames laboratoriais no diagnóstico de síf1lis secundária.
676 [ Medicina laboratorial para o clínico
NEUROSSÍFI LIS O diagnóstico laboracorial da neurossífilis pode ser realizado através da constatação de produção inrrarecal de anticorpos, detectada pela positividade do VDRL no
líquor. A especificidade do teste é bastante elevada nesses casos. chegando a aproximadamente 99.8%. Apesar disto. a sensibilidade é baixa (em média 50%). variando de 10% nos casos de neurossífilis assintomática a 90% nos muito sintomáticos. Então, VDRL reagente no líquor confirma o diagnóstico de neurossífilis, mas testes nãoreagentes não excluem o diagnóstico. A utilização de testes creponêmicos no líquor para diagnóstico de neurossífilis é bastante controversa. Apesar da alta sensibilidade do FTA-ABS na fase terciária, a especificidade para neurossífilis é muito baixa. já que o teste apresenta-se positivo nas outras formas de sífilis. sem comprometimento do sistema nervoso central. Portanto, apesar de resultados não-reagentes praticamente afastarem a possibilidade de neurossífilis, testes reagentes não constituem informação relevante para o diagnóstico do acometimento neurológico da doença. Além dos testes sorológicos. outras alterações liquóricas podem auxiliar no diagnóstico da neurossífilis. A citometria do líquido cefalo-raquidiano apresenta-se. em geral. com aumento da celularidade representada pela contagem de células nucleares superior a S/mm 3, com predomínio de mononucleares. Ocorre. ainda. aumento da proteína liquórica. com valores acima de 40mg/dl. Essas alterações, contudo, não são específicas da neurossífilis, podendo acontecer em diversas outras situações, como nas meningites virais. por exemplo. Nos casos de suspeita de neurossífilis e exame de VDRL no líquor não-reagente, é sempre importante afastar outras causas para as manifestações neurológicas. No futuro, é possível que a detecção de material genético do T pa/lidum por PCR no líquor venha facilitar o diagnóstico da neurossífilis nessas situações.
RASTREAMENTO DA SÍFILIS Exames sorológicos podem ser usados para rastreamento de sífilis latente em pessoas assintomáticas. O rastreamento é realizado por testes não-treponêmicos (VDRL), devido à sua praticidade. baixo custo e rapidez. Resultados reagentes devem ser confirmados por testes treponêmicos. Devido à alta sensibilidade do VDRL na sífilis latente. resultados não-reagentes afastam o diagnóstico.
Atualmente, é recomendado o rastreamento em todas as mulheres grávidas. já na pri meira consulca de pré-natal. para detecção e tratamento precoce da sífilis, o que diminui o risco de sífilis congênita. Para gestantes com resultado de VDRL não-reagente, o teste deve ser repetido no início do terceiro trimestre (28ª semana de gestação) e no momento do parto. Idealmente. as mulheres deveriam ser rastreadas para sífilis antes mesmo de engravidar. nos casos de gravidez planejada. Vale lembra r que a própria gravidez pode ser responsável por resultados falso-positivos de VDRL(Quadro 54.1). Em locais em que não há possibilidade de realização de testes treponêmicos confirmatórios, resultados isolados de VDRL reagentes em qualquer titulação devem ser considerados. desde que não haja histórico de tratamento adequado anteriormente. O rastreamento de sífilis latente pode ser recomendado, também, para populações que apresentam comportamento de risco ou para pacientes com diagnóstico de outras doenças sexualmente transmissíveis. Para a população em geral. o rascreamento não é recomendado. uma vez que apresenta custo-benefício desfavo rável e resultados falso-positivos poderiam levar à propedêutica mais extensa, tratamentos e preocupações desnecessárias para o paciente. A Figura 54.7 resume os exames laboratoriais utilizados no rastreamenco de sífilis latente em assintomáticos.
SÍFI LIS CONGÊN ITA A sífilis congênita deve ser pesquisada em todos os recém-nascidos de mães que apresentaram sífilis, sintomática ou não, durante a gravidez. Como anticorpos lgG maternos atravessam passivamente a barreira placentária. podem ser encontrados resultados reagentes de testes treponêmicos e não-treponêmicos no soro da criança, sem que isto signifique infecção congênita. Assim, resultados reagentes de testes não-treponêm icos podem ser encontrados até os seis meses de vida, devido à presença desses anticorpos maternos. Testes treponêmicos podem permanecer reagentes por um tempo ainda maior (cerca de 18 meses) em filhos de mães seropositivo, sem que isto represente sífilis congênita. A comparação dos títulos de VDRL da mãe e do recémnascido é uma possível estratégia para diagnóstico da
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Treponema pallidum
677
sífi lis congênita. Títulos de VDRL no recém-nascido quatro vezes ou mais elevados que os da mãe são indicativos da doença. O acompanhamento dos dtulos de VDRL no recém-nascido é outra forma de evidenciar a infecção congênita, relacionada à presença de valores ascendentes no teste semiquantitarivo. A pesquisa de anticorpos amiT pa/lidum da classe lgM (FTA-ABS lgM), que não atravessam a barreira placentária, poderia ser utilizada para diagnóstico de sífilis congênira. Entretanto, apresentam resultados falso-positivos em até 10% dos casos, por interferência de fatores reumatóides eventualmente presentes no soro, e falso-negativos em cerca de 35%. devido à competição com anticorpos da classe lgG pelos sírios de ligação do T pallidum fixado em lâm ina. Além d1sso, outro fator limitante é a dificuldade de padronização da reação, como descrito anteriormente, pelo fato de não haver soros-controle disponíveis para essa reação. Segundo as Diretrizes para Controle da Síf1lis Congênita publicadas pelo Ministério da Saúde em 2005, a investigação de sífilis congênita deve ser realizada em todas as crianças de mães com sífilis diagnosticada clínica ou laboratorialmente durante a gestação, parto ou puerpério e em codo indivíduo com menos de 13 anos de idade com suspeita clínica ou epidemiológica da infecção. Casos de sífilis congênita devem ser considerados quando houver preenchimento de qualquer um dos seguintes critérios: a) Toda criança ou abarco ou natimorto de mãe com evidência clínica para sífilis e/ou com sorologia não-treponêmica reagente para sífilis com qualquer titulação, na ausência de reste confirmatório treponêmico realizada no pré-natal ou no momento do parco ou curetagem, que não tenha s1do tratada ou renha recebido tratamento inadequado; b) Todo indivíduo com menos de 13 anos de idade com as seguintes evidências sorológicas: titulações ascendentes (restes não-creponêmicos); e/ ou testes não-treponêmicos reagentes após seis meses de idade (exceto em situação de seguimento terapêutico); e/ou testes treponêmicos reagentes após 18 meses de idade; e/ou títulos em teste não-treponêmico superiores aos da mãe;
678 ( Medicina laborarorial para o clínico
c) Todo indivíduo com menos de 13 anos com reste não-treponêmico reagente e evidência clín ica, liquórica ou radiológica da sífilis congênita; d) Toda situação clínica de evidência de infecção pelo T pallidum na placenta ou no cordão umbilical e/ou em amosuas da lesão, biópsia ou necropsia de criança, produco de aborto ou natimorco, por meio de exames microbiológicos. É importante repetir que a sífilis congênita é uma do-
ença de notificação compulsóna no Brasil desde 1986.
Teste treponêmico (FTA-Abs/ HAI/ ELISAI
Sífilis a nterior trotado adequadamente
Exclui sífili s latente
Obs.: Gestantes com testes po sitivos (mesmo se somente teste nõo-treponêmico e sem possibilidade de realizar teste treponêmico). considerar trotamento, coso não haja histór ia anterior de sililis tro tado adequadamente.
Figu ra 54.7 - Exames laboraroriats no rastreamenro de síftl is la reme em assimomártcos.
ACOMPANHAMENTO DE TRATAME NTO
REFERÊNCIAS 1.
Testes treponêmicos permanecem reagentes por vários anos. mesmo após o tratamento adequado da sífilis. de tal modo que não são indicados para o acom-
Bras1l. M 1msténo da Saúde. D1retnzes para o Controle da Síf1hs Congénita I Mm1sténo da Saúde, Secretana de V1g1lânc1a em Saúde, Programa Naoonal de DST e A1ds. Brasília: M1n1sténo da Saúde; 2005. D1sponível em: hrtp://www.alds.gov.br/data/
panhamemo terapêutico. Jáos testes não-ueponêmicos
doeu men ts/stored Doeu men ts/%7 BB8 EFSOA F-
apresentam queda em seus títulos, relacionada com a eficácia terapêutica, podendo tornar-se não-reagentes ou permanecer reagentes em títulos baixos num fenômeno comumente denominado cicatriz sorológica. Via de regra, o acompanhamento do tratamento é feito a partir do VDRL solicitado em três, seis e 12 meses após o início do tratamento. A resposta adequada pode ser evidenciada por queda de quatro vezes nos títulos de VDRL após seis meses e de oito vezes após 12 meses de acompanhamento. Os VDRLs não-reagentes são encontrados após três anos de acompanhamento em cerca de 72% dos pacientes com sífilis primária e 56% dos pacientes com sífilis secundária. Esquemas complementares de tratamento antimicrobiano devem ser reavaliados sempre que não houver resposta sorológica. Após o tratamento adequado da neurossífilis, também ocorre queda gradual dos títu los de VDRL no líquor, sendo que. em raros casos, o teste pode permanecer reagente por alguns anos, mesmo após a normal1zação da citometria e da dosagem de proteínas liquóricas.
23AE-4891-AD36 -1903553A3174%7D/%7B21 EA 1403385F- 4 34 E- BA 9 E-9 D2C EA4 6(589% 7D/ma n ua l_ 2.
de_s%EDfills_cong%EAnlta_2005.pdf B1rnbaum NR, Goldschm1dt RH, Buffer WO. Resolving the common cl1n1cal dilemmas of syphilis. Am Fam Phys.
1999;59:2233-46. (amargo ME. Sífilis. ln: Ferre1ra AW, Áv1la SLM, editores. Diagnóstico laboratorial das pnncipa1s doenças infecciosas e auto-Imunes. Rio de jane1ro: Guanabara Koogan; 2001. p.215-20. 4. Clyne B, )errard DA. Syphilis resring.) Emerg Med. 2000; 18:361-7. 5. Hook EW, Marra CM. Acquired syph1hs 1n adulrs. N Engl J Med. 1992;326:1060-9. 6. )acobs RA. lnfectious d iseases: Spirocheral. Syph1hs. ln: Tierney LM, McPhee S). Papada kis MA, ed1tores. (u rrem medical diagnosis and rrearmenL San Franc1sco: McGraw-Hill; 2004. p.1380-99. 7. Larsen AS. Sreiner BM. Rudolph AH. Laboratory d1agnosis and imerprerarion of resrs for syphilis. Clin M1crob1ol Rev 1995; 8:1-21. 8. U.S. Prevemive Services Task Force. Screen1ng for syphil1s infecrion: recommendarion sraremen r. Ann Fam Med 2004; 2:362-5. 9. White RM. Unraveling rhe Tuskegge Srudy of Unrreared Syphilis. Arch lnrern Med 2000; 160:585-97. 3.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A sífilis é uma doença infecciosa crónica causada pelo Treponema palildum. que apresenta quadro clínico variado, razão pela qual os exames laboratoriais assumem importante papel para seu diagnóstico. Testes microbiológicos e sorológicos são rotineiramente usados na prática clínica para diagnóstico e acompanhamento da infecção e apresentam indicações e significados clínicos diferentes, dependendo da fase da doença e do material biológico estudado. Assim, o conhecimento dos métodos laboracoriais e o comportamento de seus resultados nas diversas etapas da doença. incluindo o acompanhamento do tratamento, é de fundamental importânCia para a correta interpretação dos laudos. proporCionando diagnóstico adequado e tratamento eficiente.
Invest igação laboratorial do p aciente com infecção pelo Trepo nema paflídum
679
Cleonice de Carvalho Coelho Mota Leonardo de Souza Vasconcellos Silvana Maria Eloi Santos
55
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL
DO PACIENTE COM FEBRE REUMÁTICA AGUDA
No início deste novo século, quase 400 anos após sua descrição por Guillaume de Baillou como uma entidade nosológica separada dos "reumatismos", a febre reumática aguda (FRA), no nosso meio, continua um desafio e grave problema de saúde pública. Doença inflamatória sistêmica, auto-imune, manifesta-se entre uma e cinco semanas após um processo infeccioso de vias aéreas superiores por Streptococcus pyogenes, em indivíduos susceptíveis e com resposta imunológica de hiperreatividade. Trata-se de síndrome que, como bem indica seu nome, tem caráter eminentemente agudo. O processo é aurolimitado, mas novo contato com a bactéria, na ausência de prevenção e tratamento da nova 1nfecção, reinicia o ciclo, caracterizando as recorrências da doença. Infelizmente, cerca da metade dos casos de FRA é acompanhada por acometimento cardíaco, com quadro de pancardite, responsável por quadros graves e até fatais.
EPIDEMIOLOGIA
A epidemiologia da FRA coincide com a da infecção de orofaringe pelo S. pyogenes, que é a bactéria responsável por 15-30% das amidalites em crianças e 5-10% em adultos. Acomete preferencialmente crianças e adolescentes de cinco a 15 anos. Entretanto, relatos recentes ampliam a faixa etána de ma1or prevalênCia para três a 22 anos. Em períodos não endémicos, a doença ocorre como complicação de 1%
dos casos de infecção de orofaringe pelo S. pyogenes, mas após epidemias de faringite estreprocócica, a ocorrência de FRA pode atingir cerca de 3%. Apresenta caráter recorrente na vigência de novos episódios de faringoamigdalite esueptocócica não rratados e a freqüência de novos casos é maior principalmente nos dois primeiros anos após surto inicial e em pacientes com acometimento cardíaco em surtos agudos prévios. Geralmente, os surtos subseqüentes mimetizam as manifestações clínicas do surro inicial. Parece não existir diferença de incidência quanto ao gênero, embora uma de suas manifestações, a coréia de Sydenham, seja mais observada no gênero feminino. Quanto a lesões vaivares cardíacas, a estenose mitral é mais comum no gênero femi nino e a estenose aórtica no masculino. A FRA é mais freqüente em regiões de clima tropical em relação aos subtrópicos, correlacionando-se com o desenvolvimento socioeconômico da região. Nos países desenvolvidos, sua freqüência diminuiu consideravelmente a partir da década de 50, simultaneamente à melhoria das condições de vida da população, pnncipalmente diminuição dos aglomerados humanos nos domicílios, e ao emprego da penicilina no tratamento e prevenção das infecções estreptocócicas. Nos países em desenvolvimento, como o Brasil, a incidência, a prevalência e a mortalidade da doença ainda são elevadas. A Organização Mund1al de Saúde (OMS), em 1994, registrou estimativa mundial de 12 milhões de pessoas portadores de FRA e cardiopatia reumática crónica, das quais três milhões demandaram internações repetidas
por insuficiência cardíaca, com estimativa de 332.000 óbitos para o ano 2000. Na análise da morbidade, o cálculo do índice DALY- disability-adjusted /ife years (anos potenciais de vida perdidos ajustados para incapacidade) cocalizou 6,6 milhões de anos perdidos por ano no mundo em decorrência da febre reumática. A análise do índice no Brasil, baseada em dados do ano 2000, registrou o cocai de 55.000 anos. ou seja, 26 anos por paciente. 25000
20000
1999 a 2003 foi registrada média anual de 13.116 cirurgias valvares; nos pacientes com lesões valvares de etiologia reumática, cuja estimativa inclui 99% do tocai. o custo em 2001 foi de R$89.854.577,00 e a caxa de óbito de 94:1.000. Em adultos brasileiros, a valvopacia reumática é a causa mais freqüeme de indicação de cirurgia cardíaca. A figura 55.1 ilustra a incidência de FR no Brasil. entre os anos de 1984 e 2001. Nas famílias mais pobres. que vivem em condições de superpopulação, a incidência é ainda mais elevada.
ASPECTOS RELEVANTES DA DOENÇA
ETIOLOGIA
15000
10000
5000
o 1984
1986
1988
1990
1992
1994
1996
1998
2000
Fome: OATASUS Figura 55.1 - Incidência anual de Febre Reumática no Brasil. emre 1984 e 2001.
No nosso meio, a FRA é a causa mais comum de cardiopatia no adulto jovem. Segundo modelo epidemiológico da OMS, no Brasil estima-se freqüência anual de 10 milhões de faringoamigdalices escrepcocócicas, com incidência anual de 15.000 a 18.000 novos casos de FRA. Em Belo Horizonte, foi registrada prevalência de 3,6 I 1.000 em estudantes na faixa etária de 10 a 20 anos. A Organização Pan-americana de Saúde (OPAS) e o Comitê Pan-americano de Estudo e Prevenção da Febre Reumática revelam a possibilidade do surgimento anual de 960 novos casos de cardiopatia reumática no Brasil, ou seja, quase crês casos novos por dia. Nas últimas décadas, a prevalência e a incidência vêm diminuindo progressivamente, principalmente após melhoria da economia e da assistência à saúde. Além disso. são substanciais os custos do setor público em cirurgias cardíacas para o tratamento das seqüelas encontradas na fase crónica da doença. Segundo dados do DATASUS, no período de
682 [ Medicina laboratorial para o clínico
A FRA é conseqüente à infecção, sintomática ou assintomática, das vias aéreas superiores por cepas reumatogênicas de Streptococcus pyogenes, também denominado Streptococcus ~-hemol ítica do grupo A de Lancefield. A classificação dos Streptococcus proposta por Lancefield baseia-se nas diferenças imunológicas dos polissacarídeos que compõem sua camada média e central (grupos A B, C F e G). A proteína M, presente na camada externa bacteriana, constitui o principal ancígeno relacionado à patogênese da cardiopatia da FRA. Confere resistência à fagocitose. aumentando a virulência bacteriana. As diferenças antigénicas da proteína M são respo nsáveis pela classificação dos Streptococcus do grupo A em mais de 80 subtipos. sendo os tipos 3. 5, 18, 19 e 24 considerados os mais reu matogênicos. Devido à maior prevalência de outros grupos de Streptococcus que não o A em alguns países tropicais e não tropicais, tem sido sugerida a possibilidade de outros grupos, como o C e G, causarem FRA e glomerulonefrite, como proposto no I Workshop Africano em Febre Reumática, ocorrido na África do Sul, em 2005. Entretanto, ai nda faltam evidências diretas que corroborem essa hipótese.
PATOGENIA Os mecanismos patogénicos da FRA ainda não estão esclarecidos, mas há fortes indícios, epidemiológicos e experimentais. de que fatores genéticos estejam
envolvidos. Estima-se que 2 a 3% da população sejam susceptíveis a desenvolver a doença após uma faringoamigdalite estreptocócica. Vários marcadores genéricos de susceptibilidade, HLA relacionados ou não, têm sido descritos na FRA. Entretanto, os achados são inconsistentes. No Brasil, por exemplo, já foi relatada associação positiva entre FRA e os subripos HLA-DR7 e HLA-DR53. Alterações no gene do TNF-a também já foram associadas à predisposição para FRA. Muitas teorias foram propostas para explicar as lesões clínicas apresentadas na FRA. Muito tem sido enfatizada a natureza auto-imune dos mecanismos fisiopatológicos que seriam induzidos por mimetismo molecular entre as estruturas antigênicas do Streptococcus ~-hemol ítico do grupo A. principalmente a proteína M, com os tecidos humanos como sarcolema das fibras estriadas cardíacas, glicoproteínas esrrucurais das valvas cardíacas, células da parede vascular, proteínas sinoviais, cartilagens articulares e tecido nervoso. Anticorpos antiesrrepcococos são capazes de reconhecer proteínas presentes em tecidos humanos como miosina, accina, laminina, queratina, vimentina. Em 1969, Kaplan e Frengley demonsrraram por imunofluorescência a presença, no soro de pacientes com íRA, de anticorpos que reagiam com tecidos cardíacos. Segundo essa hipótese, a partir da infecção esrrepcocócica de orofaringe, a liberação de antígenos estreprocócicos desencadearia resposta imunológica sistêmica, com sensibi lização dos linfócicos Te Be conseqüente formação de reação imune antiestrepcocócica com reatividade cruzada para estruturas cardíacas, articulares e nervosas. Para promover o desencadeamento da reação imunológica. o estrepcococo deve causar infecção verdadeira de orofaringe e não apenas colonização. Escudos de valvas cardíacas removidas de pacientes submetidos à cirurgia mosrram que o infiltrado linfocitário do interstício valvular é rico em células T CD4 + e bastante pobre em células CD8+. Com freqüência, as células CD4+ encontram-se justapostas a fibroblastos e fibras colágenas. Esses achados reforçam o papel da imunidade celular na fisiopacologia da cardite reumática. Em relação ao quadro articular, alterações locais sugerem que o depósico e posterior fagocicose de imunocomplexos sejam o fenômeno fisiopatológico predominante. Também no acometimento do sistema nervoso, anticorpos antineuronais têm sido descritos em pacien-
tes com coréia de Sydenhan. É provável que a presença de imunocomplexos no plexo coróide determine a ativação do sistema do complemento e outros mediadores que resultariam em aumento da permeabil idade da barreira hematoliquórica.
APRESENTAÇÃO ClÍNICA Não há manifestação exclusiva da doença. O diagnóstico da FRA é fundamentado exclusivamente em dados clínicos, com suporte de evidências laboratoriais do quadro inflamatório, ocorrendo desde fo rmas subclínicas até casos graves, de evolução fulminante. Algumas características, principalmente quando associadas, são úteis no encam inhamento diagnóstico. Nos casos duvidosos, o acompanhamemo freqüeme ao paciente permite confi rmar ou excluir a hipótese diagnóstica e muitas vezes o diagnóstico da valvopatia crônica possibilita o esclarecimento de episódios anteriores até então indefinidos. De maneira geral, pode-se considerar que o processo que resulta na FRA compreende duas situações clínicas distintas e definidas. A primeira consiste na infecção estreptocócica de vias aéreas inicial e a segunda no quadro de FRA propriamente dito. Esses dois quadros clínicos estão separados por período sem sintomas de cerca de uma a cinco semanas. Assim, quatro fases clínicas distintas são verificadas na doença: a) faringoamigdalite estreptocócica, b) período de latência, c) fase aguda; d) e, eventualmeme, a fase crônica, quando persistem as lesões cardíacas - valvopatia reumática crônica. Como as lesões inflamatórias da FRA são difusas e com afinidade aos tecidos conjuntivos, os sintomas são variados e a doença acomete principalmeme as articulações, o coração, o sistema nervoso e a pele. As lesões também podem coexisti r, o que amplia as possibilidades de apresentação clínica. As principais manifestações clínicas de FRA incluem: cardite, poliartri te, coréia, nódulos subcutâneos e ericema marginatum. Pelo poder diagnóstico que possuem e conseqüente valor preditivo positivo elevado, fora m classificadas como critérios maiores para o diagnóstico de FRA. Artralgia e febre também são achados comuns em portadores de FRA, entretanto, por serem inespecíficos, foram caracterizados como critérios menores
Investigação laborawrial do paciente com febre reumática aguda
683
de Jones, mas apresentam alco valor preditivo negativo. Na forma inicial, também são comuns cefaléia, epistaxes, dores abdominais, náuseas e vômitos, aparencemence em decorrência da mobilização de imunocomplexos. Na maioria dos casos, as manifestações agudas da FRA são autolimitadas, desaparecendo no período de um a seis meses. Porém, em cerca de 5% dos casos, a coréia e/ou cardite, principalmente nas formas graves, podem persistir por períodos mais prolongados. A Labela 55.1 moSLra a freqüência dos sinais maiores relatados em diferences estudos realizados em diversas cidades brasileiras.
Cardite
O acometimento cardíaco, presente em 50 a 60% dos casos, é a manifestação mais importante da doença. Na infância, é tão freqüente quanro a artrite, diferindo da apresentação no adulto, quando a artrite é a man ifestação mais comum. O processo inflamatório envolve os três segmentos do coração - endocárdio, miocárdio e pericárdio, caracterizando a pancardite, mas é o envolvimento do endocárdio mural, principalmente das valvas cardíacas, o responsável pelo quadro de insuficiência cardíaca na fase aguda e pelas seqüelas na fase crônica da doença, em conseqüência ao processo cicatricial. Cerca de um terço dos pacientes com acometimento cardíaco na fase aguda evolui para cardiopatia reumática crôni-
ca. O grau do acometimento cardíaco na fase aguda e a presença de recorrências constituem os fatores mais importantes para determinar-se o prognóstico na fase crônica da doença. A primeira descrição histopatológica específica da FRA, o nódulo de Aschoff, foi feita por Aschoff, em 1904, em corações de pacientes falecidos na fase aguda da doença. É uma lesão granulomatosa que aparece, em média, na segunda semana da doença e tende a persistir, sem relação com a atividade inflamatória. É considerado característico e consiste de granulomas de macrófagos em volta do material fibrinóide. Os nódulos de Aschoff situam-se no interstício encre os feixes de miocardiócitos e, freqüencemente, próximos a vasos. Os macrófagos podem apresentar a cromatina condensada no centro do núcleo, dando o clássico aspecto de "olho de coruja". As chamadas células gigances de Aschoff são macrófagos multinucleados. A fagocitose do material fibrinóide por macrófagos é seguida de fibrose, que pode levar à disfunção permanente. O caráter recidivante das lesões inflamatórias, a cada novo surto de infecção pelo estreptococo, causa piora progressiva do quadro fibrótico, principalmente das valvas cardíacas. Na fase cicatricial. observam-se verrucosidades, espessamento e aderências de cordoalhas e cúspides, que levam às disfunções vaivares. A cardite é a manifestação mais grave da FRA, sendo a única capaz de causar a morte na fase aguda ou produzir seqüelas definitivas. Em geral, o endocárdio é o folhe-
Tabela 55.1 - Freqüência dos critérios de Jones maiores encontrados em diferentes cidades brasileiras localidade São Paulo
Artrite
Cardite
Coréia
Eritema marginado
Nódulos subcutâneos
Total (n)
57,6
50,4
34,8
1,6
1,5
786
Uberlãndio
53
70
41
3
3
148
Ribeirão Preto
77
79
32
1,7
2,5
120
Porto Alegre
84,3
56
11,8
11,8
7,8
51
Goiãnio
82
80
30
7
9
52
Florionópolis
60
94
7,5
1,8
1,8
53
70,4
69,7
24,6
3,6
5,0
1066
Belo Horizonte*
Adaptação da tabela original do amgo Silva CHM et ai. Rheumaticfever. VerHosp Clin Fac Med SPaulo 1999; 54:85-90. • Fome:Taroco DS. Pic1n1n tF,Meira ZMA, Mota CCC. Apresentação cllnica da febre reumática em 1066surtos agudos de criançaseadolescemes,arendidos no Hospitalda Clínicas·UFMG. Rev Med Minas Gerais 2006;15(3):44
684 (
Medicina laboratorial para o clínico )1-- - - - -- -- - -- - - - - -- - - - - - - - - - - - - - -
co mais aringido nos casos de acomerimenro cardíaco, o que ocorre em mais de 90% dos casos, mas miocardite e pericardi re podem também estar presentes, com infiltrado mononuclear. A pericardite, mais rara, não ocorre como manifestação isolada. A necrose miocárdica é mínima. Da mesma forma, pacientes com insuficiência cardíaca refratána. na fase aguda, apresentam rápida melhora após cirurgia de rroca valvar. Essas evidências confirmam a hipótese de que a disfunção valvar, e não a miocardite, seja a principal anormalidade responsável pelo quadro de insuficiência cardíaca. O surro de cardire rem duração de um a seis meses, com média de crês meses. Em crianças abaixo de seis anos de idade, o início costuma ser mais insidioso e com presença de sintomas constitucionais como fadiga. O comprometimento cardíaco na fase aguda pode ser assintomático e, quando sintomático, os sintomas mais freqüentes são dispnéia, dor precordial, dor abdominal e edema periférico, em crianças maiores e adultos. Mais recentemente, foram identificados pacientes na fase aguda com artrite e/ou coréia, apresentando ausculta cardíaca, exame radiológico do tórax e elerrocardiograma normais, porém com regurgitação valvar mirrai e/ou aórtica leve ao ecodopplercardiograma, caracterizando a valvite subclínica. Ao exame físico, os sinais mais freqüentes são: taquicardia - independente do quadro febril, ritmo de galope, abafamento de primeira bulha, cardiomegalia, sopro cardíaco e atrito pericárdico. Dor precordial e atrito pericárdico sugerem o comprometimento pericárdico. A insuficiência cardíaca, mais freqüente nas recidivas da doença, revela grave acometimento do coração e está sempre associada à lesão valvar significativa. O sopro localizado em área mirrai, holossistólico de regurgitação, de alta freqüência e com irradiação para axila, que está presente na maioria dos casos, deve-se à insuficiência mirrai. O sopro diastólico de insuficiência aórtica pode ocorrer isoladamente, mas é freqüente sua associação com a insuficiência valvar mitral e é caracterizado como um ruído de qualidade aspirativa, decrescendo após a segunda bulha, mais intenso nos terceiro e quarro espaços intercostais. A valva rricúspide é menos freqüentemente afetada e a pulmonar excepcionalmente é acometida pelo processo inflamatório. O sopro mesodiastólico de Carey-Coombs, de baixa freqüência e baixa intensidade, está presente somente durante a fase aguda. A concomitância de insufi-
ciência mitral e aórtica em paciente previamente sadio é altamente sugestiva de febre reumática. A insuficiência cardíaca grave geralmente ocorre em crianças pequenas ou naquelas em que recidivas da doença sobrepõem-se a lesões prévias significativas. A concomitância de achados histopatológicos típicos de fase aguda da doença reumática com achados histológicos da fase crônica, como fibrose intersticial e perivascular com neoformação vascular, indica tratarse de surto agudo sobre coração previamente lesado pela doença. As seqüelas cardíacas dependem primariamente da gravidade da valvite. As lesões podem evoluir para a cura, permanecer estacionárias ou sofrer agravamento progressivo. Exames complementares para avaliação cardiológica: no estudo radiológico do tórax, o aumento da área cardíaca é evidenciado em mais da metade dos casos de FRA. geralmente acompanhado de congestão pulmonar nos casos graves. Apesar da ausência de cardiomegalia não afastar o diagnóstico de cardite, em geral a magnitude do aumento da área cardíaca é proporcional à gravidade do acometimento cardíaco O eleuocardiograma evidencia taquicardia sinusal, alterações difusas e discretas de repolarização ventricular, como retificação e depressão do segmento ST, inversão de ondas T, alterações difusas de repolarização ventricular, como retificação e depressão do segmento ST, inversão de ondas T, além de sobrecarga de câmaras cardíacas esquerdas, em conseqüência de lesões valvares mitral e/ou aórtica. Outras alterações incluem o aumento da du ração dos intervalos QT e PR (bloqueio atrioventricular de primeiro grau) e exrra-sístoles ventriculares e supraventriculares. O ecodopplercard iograma constitui método complementar acurado e de grande importância no paciente com envolvimento cardíaco, para investigação das alterações morfológicas, hemodinâmicas e funcionais decorrentes da febre reumática.
Artrite
É a manifestação mais freqüente da FRA no adulta,
ocorrendo em cerca de 75% dos casos. Habitualmente, acomete grandes articulações, como joelhos (75%), rornozelos (50%), cotovelos, punhos e quadril, sendo menos freq üente o envolvimento das pequenas articu-
Investigação laboratorial do paciente co m fe bre reumática aguda
685
lações como mãos e pés. O acometimento articular é acompanhado de dor intensa. com tendência migratória, incapacitante, levando à limitação dos movimentos. As articulações são comprometidas em sucessão, com duração de um a cinco dias em cada articulação. caracterizando a poliartrite migratória. Outra característica importante da poliartrite na FRA é sua excelente resposta aos salicilaros. Casos de artrite monoarticular, embora raros, podem ocorrer. A duração rotai do surto articular geralmente não excede duas a três semanas, evoluindo para a cura completa, sem deixar seqüelas. Hisrologicamente, nas estruturas periarticulares e articulares, existem edema. angiogênese e infi ltrado inflamatóno perivascular mononuclear. principalmente de células CDLí+, plasmócitos e macrófagos. Pode ocorrer agregação da fibrina recobrindo a sinóvia e infiltração do líquido sinovial por células inflamatórias. Entretanto. após duas a quatro semanas, a artme tende a se resolver completamente. Inflamação de músculos e tendões também pode ocorrer em conseqüênCia à artrite. Eventualmente, fibrose periarticular pode persistir. levando a deformidades sinoviais semelhantes às observadas na artrite reumatóide, mas sem evidência radiológica de erosões. Essa condição. denominada síndrome de Jaccoud, surge após surtos repetidos de FRA e caracteriza-se por desv1o ulnar e subluxação das articulações metacarpofalangeanas.
Coréia de Sydenham
Também conhecida como coréia reumática ou dança de São Vito, foi descrita por Thomas Sydenham em 1686 e decorre de uma arterite do sistema nervoso central. com degeneração celular perivascular, hemorragias e petéquias. sobretudo nos núcleos denteado e subtalãmico, aparentemente secundária a depósitOs de imunocomplexos. Embora possa ser concomitante aos outros sinais maiores, geralmente é uma manifestação tardia da FRA. podendo ser, inclusive. única; e ocorre mais freqüentemente após remissão das ourras manifestações. Por isso, é o único sinal que isoladamente permite o diagnóstico de FRA, segundo as diretrizes da AHA (1992). Atinge mais o gênero fem1nino, na faixa etária escolar, sendo rara após a puberdade. t caracterizada por movimentos involuntários e clôn1cos da muscularura estriada esquelética,
686 [ Medicina laboratorial para o clínico
conscientes. rápidos. desordenados e arrítmicos, mais evidentes nas extremidades e na face e que desaparecem ou são reduz1dos durante o sono. A coréia geralmente é acompanhada por mudança repentina da personalidade da criança. que se torna insegura, irritada e com labilidade emocional, com crises de choro, traços obsessivo-compulsivos e incoordenação morora. Fraqueza e hipotonia musculares são freqüentes. Observam-se déficits motores. desordens posrurais. alteração da escrita e disarrria. O quadro clínico é insidioso. instalando-se em dias ou semanas e perdurando por dois a seis meses. Pode remitir completamente ou deixar seqüelas menores. como tremor fino de extremidades. instabilidade motora. Eventualmente, há recorrências e pode levar a distúrbios obsessivo-compulsivos. Curiosamente. existem evidências de que o compositOr Gusrav Mahler renha apresentado quadro de cardite reumática e coréia de Sydenham em sua infância. que teria deixado como seqüela provável valvulopatia, distúrbios obsessivo-compulsivos e quadro coréico persistente.
Nódulos subcutâneos
São manifestações menos comuns. de freqüência variável de 3-5% dos casos de FRA. Costumam aparecer após as primeiras semanas do início da doença. durando em méd1a uma ou mais semanas, raramente mais que um mês. Têm localização preferencial nas saliências ósseas, superfícies extensoras das articulações (joelhos, tornozelos. punhos, região occipital e processos espinhosos). ao longo de tendões e no couro cabeludo. São nódulos firmes. duros e indolores. podendo chegar a cerca de 2 cm de diâmetro, sem sinais flogísticos, movendo-se livremente sob a pele. Regridem espontaneamente, podendo acontecer recorrências. Histologicamente. caracterizamse por necrose central circundada por histiócicos epitelióides, linfócitOs e plasmócicos e células em paliçada ao redor, semelhantes aos da artrite reumatóide. Refletem atividade da doença e freqüentemente associam-se ao acometimento cardíaco. Esses nódulos não são patognomônicos da FRA. podendo ocorrer em outras doenças, como artrite reumatóide juvenil. lúpus eritemaroso sistêmico e, inclusive. mesmo sem associação a qualquer estado mórbido ou doença. caracrenzando-se nódulos subcutâneos benignos.
Eritema marginatum
Manifestação pouco freqüente, mas muito específica. Ocorre em menos de 10% dos casos e também está geralmente associada à cardite. Caracteriza-se por lesão eritemacosa cutânea serpiginosa ou disposta em círculo, não pruriginosa, de taman ho vanado. entre 1 e 3 cm de diâmetro. apresentando-se em forma de máculas ou pápulas de coloração rosa ou roxo pálido, de bordas nítidas hiperemiadas e centro opaco. O termo "eritema margina tum" se deve ao fam de a lesão difundi r-se centrifugamente, deixando um centro claro, ficando as bordas rosadas. Aparecem preferencialmente em rronco e porções proximais dos membros e raramente na face. De caráter transitório e migratório, apresentam duração fugaz. de algumas horas ou mesmo minutos. Podem ser reproduzidos por aplicação de calor local e clareiam sob pressão e ser intermitentes por meses ou, ainda, reaparecer quando as demais manifestações da doença já tenham desaparecido.
festação isolada, cardite insidiosa e recorrências. Na última revisão da AHA. em 2002, dúvidas ainda permaneceram, principalmente com referência às novas condições clínicas, como a valvite subclínica e a artrite pós-esuepcocócica, registrando-se a necessidade de mais investigações na área, visco que os dados aruais são insufioenres para dar suporte a novas modificações dos criténos diagnósticos. Os critérios de jones modificados estão representados no tabela 55.2.
EXAMES LABORATORIAIS Pelos critérios de Jones. o diagnóstico da FRA é essencialmente clínico e os exames laboratoriais objetivam evidenciar processo inflamatório agudo e infecção estreptocócica prévia.
Comprovação de processo inflamatório agudo vigente CRITÉRIO DIAGNÓSTICOCRITÉRIOS DE JONES
Ainda hoje. o diagnóstico de FRA encontra-se fundamentado nos "critérios de Jones" definidos por Thomas Duckett jones (1899-1954), em 1944, e que apesar de não terem sido posteriormente validados por qualquer mécodo científico, ainda são am plamente utilizados. uma vez que concentram o poder diagnóstico nas manifestações clínicas mais sugestivas. Desde então, esses critérios vêm sofrendo revisões periódicas pelo Comitê de Febre Reumática/a Amencan Heart Association (AHA), que em 1992 definiu os criténos de jones modificados. Para a definição dos critérios de jones, os sinais clínicos da FRA foram classificados em sinais maiores, aqueles com valor preditivo positivo mais alto- cardite, poliartrite, coréia, nódulos subcutâneos e eritema marginatum; e sinais menores, aqueles com menos espeofiodade - febre, amalgia, elevação dos marcadores de fase aguda e aumento do intervalo PR ao ECG. A presença de dois sinais maiores ou de um sinal maior e dois menores, acompanhados de infecção prévia pelo Streptococcus ~-hemolítica do grupo A, indica alta probabilidade de FRA. Três situações clínicas dispensam os critérios de jones para o diagnóstico presuntivo de FR: coréia como mani-
Sendo uma enfermidade inflamatória por excelência, é rara a ocorrência de FRA sem a presença de marcadores da fase aguda da inflamação. Entre as provas de fase aguda, destacam-se a velocidade de hemossedimentação (VHS) e a proteína C reativa (PCR). Além de constituírem sinais menores para o diagnóstico, os marcadores de inflamação são importantes para documentar a regressão do processo inflamatório, principalmente na monitoração da resposta terapêutica (ver capítulo 56). • VHS: Como detalhado no capítulo 56, a VHS é um teste de baixa especificidade, mas que se apresenta freqüentemente elevada nas situações clínicas sugestivas de FRA, pois, em geral, seu aumento ocorre simulta neamente às manifestações de artri te e cardite. O aumento da VHS é normalmente proporcional à gravidade do processo inflamatório e o exame tende a se normalizar em duas a três semanas. independentemente da evolução. Ressalta-se que a VHS sofre influências de diversas med1cações. Incluindo algumas amplamente utilizadas nos casos de FRA, como antiinflamatórios esteróides ou não, que induzem queda da VHS, e a penicilina benzatina. que a eleva. Ainda, a insuficiência cardíaca nos casos graves de cardite pode induzir queda da VHS. levando a resultados falsamente inalterados;
Investigação laborarorial do paciente com febre reumática aguda
687
Tabela 55.2 - Crírénos de jones (modíftcados em 1992) para díagnós[ICO de FRA Sinais maiores
Sinais menores
l·Arlnle 2· Cordite 3· Coréio • 4· Erilemo morginotum
Clínicos: l·Artralgio 2· Febre
5 Nódulos subcutâneos
Laboratoria is: 1 · Alterações dos provas de fase agudo (aumento do VHS ou PC RI 2 · Eletrocordiogro mo: Aumento do intervalo PR
* Apesar de nenhum sinal ma ior ou menor ser específico do FRA, o coréio é o único sinal maior que isoladamente permite o diagnóstico de FRA
Evidência de infecção estreptocócica prévia •• 1· Aumento dos títulos de anticorpos onti estreptocócicos (ex. ASLOI.· De maior utilização clínico 2· Detecção de estreptococo do grupo A em teste de aglutinação direto ou cultura de oroforinge. 3· Escarlatina recente
* • A foringoomigdolite clínico não comprovo o evidência de es•reptococio anterior. Dois sinais maiores ou um sinal maior e dois menores Evidência de infecção prév ia pelo
+ Streptococcus
f3·hemolítico do grupo A
J. Alta probabilidade de FRA
• proteína C reariva: encontra-se elevada em praricamente wdos os casos de FRA, durante as duas primeiras semanas de evolução, persistindo até o fim da terceira semana. Por isso apresema elevado valor preditivo negativo. A ausência de elevação da PCR em medidas consecutivas é um forte indício de ausência de FRA. Da mesma forma que a velocidade de hemossedimemação, não é adequada como marcador isolado da resposta terapêutica no seguimento a pacientes. Valores elevados não representam necessariameme tratamento antiinflamatório ineficaz e níveis mats baixos podem ser observados ainda du rante fa se ariva da doença. Entretanto, o aumenw da PCR em fase mais tardia geralmente indica reativação do processo inflamatório; • mucoproteínas: são glicoproteínas plasmáticas cuja porção carboidrato de polissacarídeos ácidos está fortemente ligada à porção protéica. Descmas por Winzler no início dos anos 50, receberam o nome de "mucoproteínas" devido à viscosidade apresentada durante o processo de purificação, que é realizado a partir da precipitação com ácido perclórico. Metodologicamente, a quantificação da mucoproteína sérica é com -
688 [ Medi cina laborator ial para o clín ico
plexa e sujeita a diversos erros técnicos em várias etapas analíticas. Desta forma, não é mais utilizada na maioria dos laboratórios, tendo sido substituída amplamente pela quantificação da alfa-1 glicoproteína ácida. Encontra-se aumentada na maioria dos pacientes com FRA em atividade, elevando-se entre um e três dtas a parm do início da fase aguda e sua normalização correlaciona-se com o fi nal da fase ativa da doença. Apresenta proporcionalidade entre os níveis séricos e a gravidade da doença. Diferentemente da PCRe VHS, não sofre influência de medicação antiinflamatória, o que a tornaria útil para a monitoração do processo inflamatório e, conseqüentememe, na orientação quamo à imerrupção do tratamemo. Entretanw, suas limitações metodológicas impedem que seja uma prova sensível e de confiança na condução de casos de FRA; • alfa-1-glicoproreína ácida: fração mais importante das mucoproteínas plasmáticas, surge precocemente, cerca de 12 horas após o início ' do processo inflamatório, permanecendo por três a cinco dias no plasma. Essa curta meiavida deve-se à sua grande filtração glomerular, que favorece o retorno mais rápido aos níveis
normais, quando comparada com as ourras proteínas de fase aguda. É considerado um dos melhores marcadores de atividade inflamatória na FRA. Sua quantificação encontra-se bem estabelecida, com métodos automatizados sensíveis, reprodutíveis e com baixa variabilidade analítica. Sua dosagem está indicada no acompanhamento da FRA, em substituição à determinação das mucoproreínas; • eletroforese de proteínas: não faz parte da propedêutica habitual da FRA e as modificações observadas não diferem das alterações que ocorrem em vários outros processos inflamatórios agudos: diminuição da fração de albumina e elevação das frações alfa-globulina, devido principalmente ao aumento da alfa-1-glicoproteína ácida, por aumento da PCR ou das imunoglobulinas. Dessas alterações, a que apresenta mais estabilidade é a elevação da fração alfa-2-globulina, que é mantida elevada durante toda a fase aciva da doença, sendo um indicador confiável de acividade inflamatória.
Comprovação da infecção estreptocócica anterior
Embora, segundo os critérios de jones, a comprovação de infecção escrepcocócica prévia seja uma condição necessária para o estabelecimento do diagnóstico, a não confirmação laboratorial de infecção escreptocócica anterior ao surto agudo não exclui o diagnóstico de FRA, apesar de torná-lo menos provável. Na investigação laboratorial, a comprovação da infecção estreptocócica anterior pode ser feita pela detecção da baccéria ou antígenos bacterianos na orofaringe, ou pela detecção de anticorpos específicos. Entretanto, os métodos microbiológicos de detecção de estreptococos ou antígenos bacterianos podem não ter utilidade durante a FRA, uma vez que o episódio infeccioso primário geralmente não está mais em atividade e as baccérias podem não estar presentes na orofaringe Além disso, a detecção de estreptococos em cultura não confirma a ocorrência de infecção prévia, já que esse teste não é capaz de distinguir uma infecção verdadeira de um estado de colonização assintomática: o Streptococcus é um patógeno natural
da cavidade oral e, portanto, o paciente pode ser apenas portador do Streptococcus f5 hemolítica do grupo A, sem necessariamente apresentar processo infeccioso ativo. Tecnicamente, a pesquisa de antígenos escreptocócicos em swab de orofaringe é um teste rápido, que utiliza partículas de látex impregnadas de anticorpos específicos para identificação de carboidratos bacterianos. A baixa sensibilidade do método na FRA decorre da necessidade de grande carga antigênica para positivação, situação que freqüenremente não é encontrada nos quadros de FRA. Durante um episódio de FRA, a forma mais adequada de evidenciar a infecção escreptocócica anterior é a verificação de títulos elevados de anticorpos antiescreptocócicos. uma vez que a elevação dos dtulos coincide com a época de surgimento das manifestações clínicas de FRA. É sabido que o paciente responde com uma plerora de anticorpos contra diferentes componentes estreptocócicos. Dentre os anticorpos contra antígenos dos estreptococos. o mais utilizado é o antiestreptolisina O (ASLO). Anticorpos antidesoxirribo nuclease (antiDNAse), anti-hialuronidase (AHAD) e antiestreptoquinase (STK) não estão amplamente disponíveis e são, assim. menos empregados. Dosagem de antiestrepto/isina-0
A dosagem de antiestreptolisina-0 (ASTO) é a prova mais bem padronizada e que melhor acende à finalidade de evidenciar uma infecção escreptocócica anterior. uma vez que as maiores concentrações ocorrem simultaneamente à FRA. Earl W. Todd desenvolveu o ensaio em 1932, mas as técnicas mais empregadas acualmente são automatizadas (nefelometria e turbidimetria). o que reduz variações analíticas. Estudos cinéticas mostram que a concentração de ASTO aumenta cerca de uma a duas semanas após a infecção estreptocócica aguda, alcançando o valor máximo em torno de duas a seis semanas e retornando aos níveis basais após dois a 12 meses. Estima-se que aproximadamente 75-85% dos pacientes com quadro de FRA inicial apresentem concentrações elevadas de ASTO. Valores baixos podem ser encontrados nas fases precoces ou nas mais tardias. Diante do registro de concentrações baixas, recomenda-se a re-
Investigação laboratorial do paciente com febre reumática aguda
689
petição do exame em 10-14 dias para evidenciar eventual aumento. Nos quadros mais tardios, como quando da instalação da coré1a. a ASTO pode já estar normalizada, e recomenda-se a realização de antiDNAse. A definição dos valores de referências ainda não é consensual, variando de acordo com a região geográfica e a prevalência de mfecções estrepcocócicas nas diversas populações. Concentrações de ASLO entre 300-SOO Ul/ml são comuns em crianças escolares brasileiras. especialmente naquelas de níveis socioeconómicos mais baixos. Os critérios determ inados pelo Dr. Luiz Venere Décourr, em 1958, consideraram o nível de 250 unidades Todd (UT) normal para crianças com menos de cinco anos de idade e, para finalidades práticas, como anormais, as taxas aCima de 333 UT para crianças com menos de cinco anos de idade e taxas superiores a SOO UT para crianças acima dessa idade. Acualmente, com a utilização das técn1cas de nefelometria e rurbidimema, tem-se empregado a terminologia Ul/ml com o objetivo de padron1zação internacional dos resultados. Antidesoxirribonuc/ease 8
A dosagem de outros anticorpos. como o anci'desoxirribonuclease B (antiDNAse B). apresenta-se como boa alternativa propedêutica, especialmente nas manifestações tardias de FRA. como a coréia, considerando-se que suas concentrações máximas ocorrem em corno de seis a oiro semanas após a infecção. persistindo além de seis a oiro meses. Embora o mécodo ainda não esteja amplamente disponível. apresenta utilidade na coréia de Sydenhan, que se manifesta quando as provas de fase aguda costumam estar normalizadas. Teste da estreptozima
O teste da esrrepcozima (STZ) teve como objetivo detectar anticorpos contra vários antígenos estreprocócicos extracelulares (NADase, DNAse, estrepcoquinase, hialuronidase e a estrepcolisina "O"), a partir de um único teste laborarorial. Entretanto, as variações merodológicas não permitiram a padronização da técnica e seu uso foi abandonado. uma vez que os resultados não se mostraram superiores à pesquisa da ASLO.
690
Medicina laborawrial para o clínico
Hemograma
Normalmente, o hemograma não apresenta alterações marcantes. Pode haver leucocitose discreta, com pequeno desvio para a esquerda e anemia normocítica e normocrônica leve. A presença de leucocicose importante deve levantar a suspe1ta de outras doenças, como endocardite, artrite infecciosa, artrite reumatóide ou mesmo leucemias agudas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Deve-se enfatizar a importância do diagnóstico correcoe precoce da FRA. considerando-se que o tratamento de suporte com antiinflamatórios na fase aguda, apesar de não intervir na disfunção valvar residual, influencia de forma significativa os índices de morbimortalidade da doença. Considera-se, ainda, após o diagnóstico na fase aguda, a possibilidade de instituir-se a profilaxia de novos surros, evitando-se, com isso, o agravamento das lesões residuais. Devido à grande prevalência da FR em nosso meio, devem-se evitar os diagnósticos abusivas, po1s várias condições preenchem falsamente os criténos diagnósticos. Por outro lado, a eventual redução na wulênCia do esrrepcococo e menor prevalência das cepas reumacogênicas têm atenuado o quadro clínico, cornando-o menos característico e dificultando o diagnósCico. A arrralgia isolada com provas laboratoriais duvidosas. como elevação isolada e discreta de anticorpos antiesrrepcolisina O e de marcadores de fase aguda, não deve ser diagnosticada como FRA. É também importante cons1derar que as provas laboracoriais não são específicas da FRA. já que apenas traduzem a vigência de atividade inflamatória e/ou infecção estrepcocócica prévia. É essencial observar que os critérios de Jones, preconizados para o diagnóstico, apesar de amigos e sem respaldo científico comprovado, encontram-se sustentados pela prática clínica e, 60 anos após sua desmção inicial. permanecem como guia útil para o diagnóstico das fo rmas clássicas da doença. Os critérios de Jones orientam o diagnóstico e diminuem a possibilidade de erros. A presença de dois sinais maiores ou um maior e dois menores servem como guia diagnóstico, mas não substituem a experiência clínica do médico.
REFERÊNCIAS 1. Btsno AL. Gerber MA, Gwalrney JM Jr. Kaplan EL. Schwartz RH. Prawce gUidehnes for the dtagnosis and managemem of group A srrepmcoccal pharyngtns. lnfecnous Dtseases Soctety of Amenca. Clin lnfecr Dis. 2002;15;35(2):1 13-25
6. Meira ZMA Castilho SRT. Barros MVL. Mora CCC. Prevalência da Febre reumática em crianças de escola da rede pública de Belo Horizonte. Arq Bras Cardiol. 1995;65:331-4. 7. Sociedade Brasileira de Pediatria. 11 Consenso sobre pre-
2. Dajant AS. Ayoub EM. Bterman FZ. GUidehnes for rhe
venção da Febre Reumática. 2005. Disponível em: http://
diagnos1s of rheumanc fever: jones cmena. updared 1992. Commtnee on Rheuma[IC Fever. Endocardttis. and Kawasaki Dtsease of the Councd on Cardiovascular Disease in the Young of Amencan Heart AssoCia[lon. Clrculation. 1992;87:302-7. 3. Decourt LV, Papaleo Nem M. Giannini SD. Ferri RG. Spilborghs G, Tunya T. Serological tesrs 1n diagnosis of rheumatic acriviry I. Determtnation of mucopratetn. Arq Bras Cardiol. 1955:8(4):361-78. 4. Ferrieri P. Baddour L. Bolger A. Proceedmgs of )ones Cnteria Workshop (AHA Sciemific Statemem). Committee on Rheumatic Fever. Endocarditis. and Kawasakt Dtsease of the Council on Cardiovascular Disease 1n the Young of American Heart Association. Circulanon. 2002;106:2521-3. 5. Meira ZM. Goulart EM. Colosimo EA. Moca CC. Long term follow up of -heumaric fever and pred1cmrs of severe rheumatic va var disease in Braz1han chddren and adolescems. Heart. 2005;91(8):1019-22.
www.sbp.com.br/show_item2.cfm?id_categoria=24&td_ detalhe=1613&tipo_detalhe=s. 8. Vidoni MH, Kerr JFS. Valor dos exames laboramriats no diagnóstico e no seguimento de pacientes com Febre Reumática. Rev Soe Cardiol Estado de São Paulo. 2005;1:34-9 9. World Health Organ1zat1on. jo1nt WHO/IFSC mee[lng on RF/RHD conrrol w1rh emphasts on primary preven[IOn. Geneva. 7-9 Seprember 1994. ln: WHO Documenr WHO/CVD 94.1, Geneva, 1994. Disponível em: http:// whq libdoc.who.int/hq/1994/WHO_CVD_94.1 .pdf 10. World Health Organ1zacion. Rheumanc Fever and Rheumanc Hearr Dtsease. Repore of a WHO Ex per r Consulrauon. Geneva. 29 Ocmber- 1 November 2001. WHO rechnlcal repore senes. 923 Geneva. 2004. Dtsponível em: http://wwwwho.tnt/Cardtovascular_dtseases/resources/ trs923/en/tndex.html
Investigação laboratorial do paciente com febre reumát ica aguda
691
Guilherme Birchal Coi/ares Pedro Guatimosim Vidigal
56
MARCADORES LABORATORIAIS DE FASE AGUDA DA INFLAMAÇÃO
A reação inflamatória compreende uma série de alterações sistêmicas que ocorrem no organismo em resposta a agressões diversas, incluindo infecções, necroses, neoplasias, queimaduras, cirurgias, traumas, doenças inflamatórias. No local da agressão, ocorre liberação de substâncias pró-i nflamatórias como histamina, cininas, prostaglandinas e leucorrienos, que estimulam a vasodilatação local, o aumento da permeabilidade vascular, a migração de leucóciws e a liberação de uma série de proteínas que vão contribuir para a resolução do processo. Essas proteínas são reconhecidas como proteínas de fase aguda e se caracterizam por alterarem suas concentrações plasmáticas em resposta a estímulos inflamatórios de qualquer natureza. O fígado é o principal local de produção das proteínas de fase aguda, que é estimulada por citocinas, produzidas pelos monócitos, principalmente as interleucinas 1 e 6 (ll-1 e IL-6) e o fator de necrose tumoral. Com a agressão tecidual, há mobilização de leucócitos, acompanhada do aumento do cortisol. Após cerca de seis horas, é possível observar alteração na concentração sérica das proteínas de fase aguda, que é mais intensa quanto maior a área afetada. Essas proteínas permanecem elevadas por aproximadamente uma a duas semanas e, posterio rmente, são depuradas pela ação do sistema mononuclear fagocitário. Ocorre, também, a diminu ição da produção de IL-6 pelos macrófagos, desesti mulando a síntese de pro teínas de fase aguda pelos hepatócitos.
Os reagentes de fase aguda incluem a proteína C reativa (PCR), fibrinogênio, haptoglobina, amilóide A sérico, ceruloplasmina, alfa-1-antitripsina, alfa-1 -glicoproteína ácida (AGP), fator VII I da coagulação, ferritina, lipoproreínas, proteínas do complemento e imunoglobulinas. Dentre estes, a PCR apresenta elevação mais precoce, valores mais elevados em relação à concentração inicial e rápido retorno aos níveis basais com a resolução do quadro. O Quadro 56.1 apresenta as principais propriedades físico-químicas das proteínas de fase aguda. Algu mas proteínas apresentam diminuição de sua concentração sérica frente ao estímulo inflamatório, como a albumina, transferrina e pré-albumina. Dois mecanismos foram propostos para explicar essa redução: a) o aumento da permeabilidade capilar e extravasamento dessas proteínas para o interstício; b) a diminuição da síntese hepática para priorizar a produção de proteínas de fase aguda. A Figura. 56.1 apresenta o comportamento dessas proteínas após uma agressão aguda ao organismo. Mesmo não sendo específica, ou seja, não determinando a natureza da agressão, a verificação da presença de resposta inflamatória sistêmica por meio de exames laboratoriais representa importante auxílio no diagnóstico e principalmente no acompanhamento do tratamento de algumas afecções. Os exames mais utilizados na prática clínica são a velocidade de hemossedimentação (VHS), a dosagem de PCR, AGP e mucoproteínas. Apesar do amilódie A sérico ser considerado o marcador mais sensível, a escassez de estudos sobre essa proteína e a
resrrira disponibilidade de restes para sua medição nos laboratórios clínicos têm limitado a sua utilização. Outras prmeínas que apresemam aumenco de sua concentração plasmática durame processos inflamatórios. cais como fibrinogênio, haproglobina, ceruloplasmina, alfa1-amitripsina e ferritina, não são ainda utilizadas como marcadores laborawriais de fase aguda.
MARCADORES DE FASE AGUDA UTILIZADOS NA PRÁTICA CLÍNICA
PROTEÍNA C REATIVA A PCR foi descoberta em 1930 por William S. Tillet e Thomas Francis. no lnstiwco Rockefeller, EUA. Os aucores observaram que o soro de paciemes com pneumonia formava um precipitado quando misturado a extrato solúvel
Quadro 56.1 - Propriedades físico-químicas das proceínas de fase aguda posicivas· Proteína
Peso molecular (kDa)
Faixa eletroforética
Tempo de resposta (horas)
Concentração sérico após agressão
Proteína C reolivo
118- 144
gomo
6- 8h
10- 100 vezes
Ami lóide A sérico
11 - 14
alfa 1/ alfa 2
6 - Bh
10 - 100 vezes
Alfo·1·glicoproteíno ócido
44
olfo 1
24h
2 - 4 vezes
Allo·1·onltquim1olrips1no
68
alfa 1
24h
2-
.a vezes
Alfa I ontitripsina
54
alfa 1
24h
2-4 vezes
Fibr nogên1o
340
beta/ gomo
48h
2-
Ceruloplosmina
130
olfa 2
48h
1 -2 vezes
Haptoglobina
99
olfa 2
24h
1 -2 vezes
.a vezes
'Aumento da concentração sénca em relação ao valor basal
31001 ~
- - - · Proleíno C reativa
3000 y
o
//.
•O
.....
!?
êQ)
u c: o u
o -u
o •O ..... o '§ >
---- -- .. - •• Amilóide sérico A • ac1 • 'da , . a , g1·1coprotema •· •• • a , inibidores de proteases , "'
300
, ,'
C3 •• Haptoglobina ," ...... .. ..... ..... _. Ceruloplosmina •: • ·::.-- • • • • --------- Fibrinogênia . _••••• / •' .-
200
100
o -100
. . . . .. -- Albumina - -.....~--- • ·- • · ----------Transferri na · - • ·- - ----- - --- - • • • • ·- - - ·Pré-
1/ 4
2
7 Tempo (dias)
Figura 56.1 - Cmécica das concentrações séricas das prmeínas de fase aguda após escímulo.
694 [ M edicina laboratorial para o clínico
14
21
de Streptococcus pneumoniae. Esse extrato solúvel. posteriormente identificado como um polissacarídeo da parede celular do pneumococo. foi chamado de fração "C. Em 1941, O. T. Avery e Theodore ). Abernethy identificaram como proteína a substância sérica responsável pela formação do precipitado com a fração "C do pneumococo, nomeada, então, "Prmeína C Reativa". Essa reação de precipitação, também observada com o soro de pacientes com outras doenças (osteomielite, febre reumática, endocardite bacteriana subaguda, entre outras), tornava-se negativa com a resolução do processo. Entretanto, nos casos de evolução desfavorável, a reação permanecia positiva. A PCR foi a primeira proteína reconhecida como reagente de fase aguda. Até há poucos anos, a PCR era tida como um bom marcador de resposta aguda, mas sem função conhecida. Atualmente, é reconhecida sua participação na defesa em infecções por diversos microrganismos, na reabsorção de material necrótico e na regulação de processos inflamatórios. Possivelmente, também participa do processo inflamatório que dá origem às lesões ateroscleróticas.
Metabolismo da PCR
Os níveis séricos da PCR começam a aumentar enrre quatro e 10 horas após o início do estímulo. atingem valores de pico de até mil vezes sua concentração inicial em cerca de 48 horas e, como sua me1a-v1da é de quatro a nove horas, retornam rapidamente a valores basais após a melhora do processo. A concentração sénca da PCR é determinada pela sua taxa de síntese, já que a taxa de degradação não é influenciada pelas diversas doenças. É produzida principalmente no fígado, mesmo local onde é degradada em sua maior parte. Produção extra-hepática em linfócitos. placas ateroscleróticas e neurônios de paCientes com doença de Alzheimer também é relatada. O prino pal fator de estímulo para a produção da PCR é a IL6. O TNF-a e a IL-1 ~. entre outros, atuam s1nergicamente com a interleucina-6. exacerbando esse estímulo.
Métodos de dosagem
lnioalmente, a dosagem de PCR era realizada a partir da reação de precipitação em tubo capilar, método qualitativo de sensibilidade baixa e utilidade clímca restrita, já que
Ma rcadores laboratoriai s de fase ag uda da inAamação
era positivo em várias situações associadas à inflamação ou lesão tecidual. Posteriormente, foi desenvolvido teste semiquantitativo por aglutinação do látex, mas ainda de valor clínico limitado, sendo utilizado principalmente para o acompanhamento da evolução e da resposta ao tratamento de algumas doenças. A dosagem da PCR continuou sendo realizada por métodos qualitativos ou semiquantitativos até a década de 80, quando sua caracterização bioquímica possibilitou o desenvolvimento de anticorpos monoclonais. Surgiram, então, métodos imunológicos quantitativos, sendo a turbidimecria e a nefelomecria os mais usados. Os pnme1ros restes quanritativos desenvolvidos e ainda utilizados não têm sensibilidade suficiente para detectar a PCR no soro de indivíduos saudáveis que apresentam. geralmente, valores inferiores a 2 mg/L. Esses testes têm mais utilidade clínica no monitoramento da resposta de fase aguda em doenças infecciosas e inflamatórias. O reconhecimento de que o processo inflamatório crônico está implicado na gênese da aterosclerose revelou a importanre assooação da inflamação da parede arterial com o desenvolvimento de doença coronariana. Considerando a importância da PCR como marcador de inflamação, foram desenvolvidas técnicas com alta sensibilidade para sua dosagem (PCRultra-sensível- PCRus ou PCR de alta sensibilidade - PCRas), principalmente para avaliar o risco da ocorrência de evento coronariano. Já estão validados e disponíveis no mercado ensa1os de ELISA e métodos automatizados de turbidimetna e nefelometria. Atualmente, os métodos disponíveis para PCRas apresentam sensibilidade analítica alta (0,04 mg/L). rap1dez de execução (15 a 30 min) e necessitam de pequeno volume de amostra de soro para a sua realização.
Valores de referência
Em indivíduos saudáveis, existe grande variação da concentração sérica da PCR, tanto intra-individual quanto entre Indivíduos, que pode alcançar valores iguais a 52,6% e 84,4%, respectivamente. O valor médio da PCR em pessoas saudáveis é de até 0,8 mg/L. Cerca de 99% da população geral cem valores de PCR menores que 1,0 mg/L. Valores maiores que 1,0 mg/L estão associados com maior risco de evento coronariano e valores maiores que 10 mg/L indicam processo inflamatório em acividade (Quadro 56.2).
695
Quadro 56.2 - Risco relativo de evento coronariano futuro associado à concentração sérica de proreína C reativa ulrra-sensível (PCRus) Risco
PCR (mg/L}
Baixo
Inferior o
1,O
Mode rado
Entre 1,0 e 3,0
Alto
Superior o 3,0
Indicações clínicas
A dosagem da PCR é usada na prática clínica como um marcador de fase aguda, identificando atividade de processos inflamatórios e/ou necróticas. Uma dosagem única pode auxiliar no diagnóstico, mas não deve ser usada isoladamente, uma vez que sua elevação ocorre em diversas situações clínicas. Tem sido recomendada a dosagem seriada da PCR em intervalos de tempo variáveis, dependendo da doença em questão, pois seus níveis séricos refletem a evolução clínica ou a resposta ao tratamento em várias doenças. Assim, a elevação dos níveis séricos pode significar falha terapêutica ou progressão do quadro, enquanto que sua redução pode indicar boa resposta ou remissão do processo e, portanto, melhor prognóstico. Infecções bacterianas geralmente estão associadas a valores de PCR superiores a 100 ou 150 mg/L. Cerca de 80% a 85% dos pacientes com PCR acima de 100 mg/L têm infecções bacterianas. Por outro lado, a maioria dos pacientes com infecção virótica isolada apresenta PCR com valores abaixo de 20 a 40 mg/L. Entretanto, infecções por adenovírus, citomegalovírus, influenza, herpes simples, sarampo e caxumba podem cursar com valores de PCR acima de 100 mg/L. Deve ser ressaltado que muitos estudos que comparam os níveis de PCR em infecções bacterianas e viróticas não consideram a possibilidade de infecção mista por vírus e bactéria. Além disso, a comparação entre os diversos trabalhos é prejudicada pelo emprego de diferentes pontos de corte na diferenciação entre os dois tipos de infecção. De qualquer modo, a PCR elevada está relacionada a mais alto grau de lesão tecidual e, portanto, mais freqüentemente associada a infecções bacterianas. Alguns autores sugerem que a PCR possa ser útil na diferenciação entre pneumonia bacteriana e virótica, quando associada a dados clínicos, principalmente em casos em que a radiografia não é típica ou na ausência
de febre ou leucociwse. Nesses casos, valores acima de 80 mg/L apresentam alta especificidade para infecção bacteriana. Outros aurores condenam seu uso com tal finalidade, já que muitas pneumonias bacterianas cursam com valores de PCR abaixo de 20 mg/L. De qualquer forma, a dosagem da PCR pode auxiliar no acompanhamento do tratamento das pneumonias, sendo que persistência ou aumento de seus valores esrão associados à falha terapêutica ou à ocorrência de complicações e, conseqüentemente, pior prognóstico. A dosagem da PCR pode ser usada, também, no acompanhamento do tratamento da osteomielite em conjunto com critérios clínicos. Há tendência a aumentar rapidamente com a doença e a cair para os valores de referência com uma semana de tratamento eficaz. Um segundo aumento indicaria recrudescência da infecção ou artrite séptica associada. A dosagem da PCR pode auxiliar no diagnóstico diferencial entre meningite bacteriana e virótica, particularmente na população pediátrica. A concentração da PCR encontra-se freqüentemente aumentada no líquor de pacientes com meningite bacteriana. Em pacientes pediátricos, a dosagem de PCR no líquor mostrou ser teste mais sensível na diferenciação das men ingites bacterianas das não bacterianas do que outros exames realizados no líquor (citometria, citologia, dosagens de glicose e proteína e esfregaço corado pelo Gram). A dosagem de PCR pode ser usada, ainda, como ferramenta auxiliar no diagnóstico de sepse, na avaliação da gravidade do quadro e de seu prognóstico. Valores séricos mais elevados estão relacionados a pior prognóstico e a quadros clín icos mais graves, como o choque séptico. Mais importante que uma determinação isolada de PCR sérica na sepse é a avaliação seriada de seus níveis. Valores continuadamente crescentes por dois a três dias na ausência de uma causa evidente estão relacionados a processo infeccioso ativo. Seu acompanhamento seriado é importante na avaliação da resposta ao tratamento da sepse, uma vez que seus níveis séricos tendem a cair rapidamente após a instituição de tratamento adequado, como em outras infecções. Caso haja persistência dos níveis da PCR, deve-se pensar em falha terapêutica. Nos casos em que seus níveis séricos diminuem e em seguida observa-se novo aumento, pode-se pensar na possibilidade de infecção recorrente.
696 ( Medicina laboratorial para o clínico )1-- - - - - - - - - - - - -- - -- - -- - - - - - - - - -- -
Como a PCR macerna auavessa a placenta em quanCidades mínimas e sua produção hepática no recémnasodo ocorre normalmente em resposta a esrímulos infla matórios, seus níveis séricos refletem a atividade de processos inflamatórios do recém-nascido. O principal facor de aumento da PCR em recém-nascidos é infecção. Aspiração meconial. síndrome da angústia respiratória do recém-nascido, hipóxia fetal e hemorragia intraventricular também podem elevar a PCR, diminuindo a especificidade do teste em relação à presença de infecção. Vários estudos diferem quanto à sensibilidade e à especificidade da PCR no diagnóstico de sepse neonatal. A sensibilidade varia de 47% a 100% e a especificidade de 6% a 97%, segundo diferences autores. Esta grande variabilidade se deve às diferenças das técnicas e dos valores de corte usados nos d1versos trabalhos, assim como do período entre início dos sintomas e coleta de sangue. Uma dosagem isolada de PCR dentro dos valores de referência não é suficiente para descartar defi nitivamente a hipótese de sepse neonatal. já que pode demorar algumas horas para elevar-se em resposta à infecção. Ainda assim a PCR tem se mostrado o melhor teste isolado para o diagnóstico de sepse neonatal e, para aumentar a sensibilidade desse diagnóstico, é recomendada sua dosagem seriada em conjunto com outros exames, como o hemograma. Dosagens seqüenciais de PCR são importantes no acompanhamento da resposta ao tratamento da sepse neonatal e na avaliação da suspensão da antibioticorerapia. Valores abaixo de 10 mg/L após 24 horas do início da antibioticoterapia auxiliam na decisão de suspensão do tratamento, diminuindo o custo e a indução de resistência bacteriana. A dosagem de PCR pode ser útil em diversas outras Situações. como no acompanhamento do tratamento da doença inflamatória pélvica. no diagnóstico de compl icações da pancreatite aguda (em que valores acima de 160 mg/L na segunda semana estão relacionados a pior prognóstico). Nas doenças reumáticas, é empregada no acompanhamento do tratamento de artrite reumatóide. Em relação ao lúpus eritematoso sistémico, a atividade da doença não se reflete nos níveis séricos da PCR, que tendem a se elevar. em contrapartida. na vigência de complicações infecciosas. Outras doenças como polimiosite e síndrome de Sjbgren pnmária também costumam cursar sem aumento significativo da PCR.
Marcado res laboratoriais de fase aguda da inAamação
Após cirurgias, a PCR aumenta progressivamente, atingindo valores máximos acima de 100 mg/L após o terceiro dia, na maioria das vezes. Após esse pico. ela tende a cair até valores basais entre o sexco e o décimo dia de pós-operatório, caso não haja complicações, principalmente infecciosas. Assim, valores acima de 130 mg/L após o sexto dia pós-operatório apresentam alta sensibilidade e especificidade na detecção de infecção. Após queimaduras extensas. a PCR tende a subir, retornando progressivamente a valores normais com a cicatrização do processo. Um segu ndo pico de PCR ocorre nos casos de in fecção secundária e. por isso. sua dosagem seriada cem valor na monitorização do processo de recuperação. A dosagem de PCR sérica não se mostrou útil no diagnóstico de infecções em pacientes com câncer, mas pode ter valor no acompanhamento do tratamento desses casos. Além disso. a PCR pode indicar o prognóstico em alguns tipos de neoplasia, uma vez que valores mais altos parecem estar relacionados a menor sobrevida em casos de câncer pancreático. colo-retal. ovariano, carcinoma de células renais, mieloma múltiplo e linfomas. Com o reconhecimento de que o processo inflamatório crônico da parede arterial está implicado na fisiopatologia da aterosclerose e o surgimento, em meados da década de 90, de técnicas de alta sensibilidade para detectar pequenas elevações da PCR (PCRas), novas aplicações clínicas têm sido sugeridas. Estudos recentes demonstraram que a PCRas é o marcador inflamatório sérico de escolha, sendo facor de risco preditivo de eventos coronarianos independente dos níveis séricos de colesterol e suas frações. É importante destacar que a determinação da PCRas para estratificação do risco de eventos coronarianos não se aplica a fu mantes, o besos, dia béticos, portadores de osteoarrrose. mulheres sob terapia de reposição hormonal. indivíduos em uso de antii nflamatórios ou na presença de infecções, resfriado, febre. vacinação. cefaléia. dor lombar, tratamento dentáno ou colocação de brincos, piercings ou tatuagens nas últimas duas semanas. Para reduzir a variabilidade intra-individual, a determinação da PCRas deve ser rea lizada em indivíduos metabolicamente estáveis, que não apresentam evidência de infecção ou outro processo inflamatório. O resultado
697
deve ser obtido da média das medições realizadas em duas amostras, colhidas com imervalo de duas semanas. Concemração de PCR superior a 10,0 mg/Lindica a presença de infecção ou outro processo inflamatório, que deve ser investigado e impede a utilização desse marcador na avaliação de risco coronariano. Esse resultado deve ser desconsiderado e a PCR deve ser determinada novameme após a resolução do processo. A Tabela 56.2 mostra a relação entre concemração sérica de PCR e o risco relativo de evento coronariano futuro. Indivíduos
com concentrações maiores que 3mg/L têm risco relativo de evento coronariano futuro duas vezes maior que indivíduos com concemração menores que l,Omg/L (baixo risco). Em resumo, a PCR tem se mostrado bom método para avaliação das reações de fase aguda e o acompanhamento de sua concentração sérica é recomendado em diversas situações clínicas. As indicações para o uso da PCR nas diversas situações clínicas estão listadas no Quadro 56.3.
Quadro 56.3 - Indicações clínicas para o uso da Proteína C reativa (PCR) Grau de Utilidade
Condição Clínica
Indicação
Sepse
Diagnóstico, avaliação de gra vidade e prog nóstico M onitorização do resposta ao tra tamento
Útil Útil
Sepse neonotol
Diagnóstico M onitorização da resposta ao tratamento Decisão de suspensão do a ntibio ticoterapia
Útil Útil Útil
Pós-opero tório
Detecção de complicações infecciosas
Útil
Queimadura s
Detecção de infecções secundários
Útil
Osteomielite
M onitorização da resposta ao trata mento Detecçã o de complicações
Útil Útil
A rtrite reumatóide
Evolução e monitorização do resposta ao tratamento
Útil
LES
Detecção de complicações infecciosos
Útil
Febre reumático
Diagnóstico
Útil
Doença de Crohn
Diagnóstico
Útil
Doença Inflamatória Pé vico
Avaliação da gra vidade da doença M onitorização do resposta ao trota mento
Útil Útil
Aterosclerose IPCRas)
Avaliação de risco cardíaco Marcador prognóstico na doença coronariona oguda
Util Útil
Pneumonia
Diferenciação entre etiologia bacteriano e virótico M onitorização do resposta ao tro tamento
M eningite
Diferenciação entre infecção bacteriano e não- bacteriano em p acientes ped iótricos (dosagem no líquor) M onitorização do resposta ao trota mento (dosagem no soro) Diferenciação entre infecção bacteriano e virótico (dosagem no soro)
Útil Restrito
Poncreotite agudo
Diagnó stico Detecção de complicações Marcador tardio do p rog nóstico
Restrito Útil Útil
O tite médio aguda
Diagnóstico
Restrito
Infecção do tro to uriná no
Diag nóstico diferenc ia l entre cistite e pielonefrite Monitorização do resposta ao llo tomento
Restrito Restrito
Apendicite
Diagnóstico
Restrito
Câncer
Prognóstico (alguns tipos de tumores)
Restrito
LES: Lúpus enremamso Slstêmlco; PCRas: Dosagem de alta sens1bil1dade da PCR.
698
M edicina laborator ia l para o clínico
Restrito Útil Útil
VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO A VHS é um teste simples e de baixo custo utilizado há mais de 50 anos como marcador de resposta inflamatória. O exame consiste na medida da camada de plasma de uma amoma de sangue venoso anticoagulado que se sedimenta espontaneamente em um cubo de vidro graduado, num determinado período de tempo. A1nda hoje a VHS vem sendo utilizada com freqüência na prática clínica como um marcador inespecífico de processos inflamatórios. Porém, vários fawres podem interferir no seu desempenho, produzindo ramo resultados falso-positivos como falso-negativos, podendo dificultar o diagnóstico ou induzir a investigações subseqüenres caras e desnecessárias. Ainda assim, pode ser um exame útil. quando utilizado à luz de suas limitações e com indicações precisas.
Metodologia
O método consiste em colocar sangue venoso anticoagulado com citraw de sódio a 3,8% (relação 4:1) em um cubo de vidro graduado, com 200 mm de comprimento e 2,5 mm de diâmetro interno. O cubo é preenchido até a marca zero e deixado na posição vertical por uma hora. A VHS expressa em milímetro por hora (mm/h) será a distância do menisco superior do plasma aré o início da coluna de erirrócitos. Uma variação desse método, com a utilização de EDTA como anticoagulante, apresenta boa correlação dos resulcados e permite a realização do exame até 12 horas após a colera. Pela maior comodidade, desde 1993 o método considerado de referência para a med1ção da VHS passou a ser o que utiliza amostras anticoaguladas com EDTA.
Princípio da sedimentação das hemácias
A sedimentação eriuocirária depende da agregação das hemácias e da formação de rouleaux. Quando as hemáclas se agregam ao longo de um mesmo eixo formando rouleaux, o peso da partícula aumenta em relação à sua superfície, aumentando sua densidade e promovendo sedimentação mais rápida. A formação de rou/eaux é limitada pela carga negativa das hemácias, que tendem a se repelir. Várias macromoléculas plasmáticas são carre-
Marcadores laboraroriais de fase aguda da inAamaçào
gadas posicivamente e, assim, são capazes de neurrahzar a carga da superfície erirrocitária, levando à maior agregação e à conseqüente formação de rouleaux. Entre as proteínas plasmáticas responsáveis pela formação de rouleaux, o fibrinogênio, uma proteína de fase aguda, apresenta o mais efeito agregante. Adicionalmente, hemácias macrocícicas apresentam diminuição da relação superfície/volume da hemácia. o que reduz sua carga elétrica em relação à sua massa, facilitando a agregação. Desta forma, macrócitos sedimentam-se mais rapidamente, enquanto micrócitos sedimenram-se mais lentamente. Hemácias com formas irregulares (poiquilócitos) impedem a formação adequada de roleaux, diminuindo a VHS. No Quadro 56.4 esrão relacionados fatores capazes de influenciar a VHS. Alguns erros analíticos podem acelerar a VHS levando a resultados falsamente aumentados. A inclinação do tubo provoca separação do plasma e das hemácias, o que promove a formação de rouleaux e aumento da sedimentação. Uma inclinação de apenas 3° pode provocar aumento de até 30% na VHS. Outros fatores, como concentração de anticoagulante maior que a recomendada e temperatura amb1enre elevada (>25° C), também aumentam a VHS. Entre os erros analíticos que podem reduzir a VHS, levando a resultados falso-diminuídos, destacam-se a temperatura am biente mais baixa que a recomendada (<20° C) e a demora na realização do resre.
Situações clínicas capazes de alterar a VHS
Entre as alterações patogénicas que aumentam a VHS estão processos de diferentes causas, como doenças malignas. infecções diversas. doenças inflamatórias e várias outras listadas na Quadro 56.4. Na anem1a, a hemossedimentação fica facilitada pela redução do número de hemácias em relação ao volume de plasma. Desta forma, em condições associadas à anemia moderada ou grave, a VHS apresenta utilidade bastante limitada. O uso de medicamentos, especialmente heparina e contraceptivos orais, também é um importante interferente capaz de aumentar a VHS. Medicamentos como antiinflamatórios. salicilaros em altas doses e corricosteróides estão entre os fatores capazes de diminuir a VHS (Quadro 56.4). Esse fato rem maior relevância quando o reste é utilizado para verificar a ativldade de doenças inflamatórias do tecido conjuntivo. nas quais essas drogas são usadas com freqüência. O aumen-
699
to do hemarócrito, como na policiremia, dificulra a sedimentação das hemácias. A presença de hemácias falciformes, na drepanociwse. impede a formação de rouleaux. Em ambos os casos. a VHS também estará diminuída. A hipofibrinogenemia hereditária primária e a coagulação
valores de referência mais altos para essa faixa etária. O aumento da VHS na gravidez parece estar relacionado ao aumento do fibrinogênio e à maior prevalência de anemia durante esse período.
imravascular disseminada esrão emre as alrerações paro-
Quadro 56.5 - Valores de referência para VHS
gênicas que reduzem a VHS devido à redução do fibrinogênio. No entanto, valores baixos de VHS apresentam pouco ou nenhum valor diagnóstico nesses casos.
Faixa etária (anos)
Va lores de Referência (mm/ h) Homens
Mulheres
:5::50
<15
<20
>50
<20
<30
Valores de refe rê ncia
Os valores da VHS encontram-se no Quadro 56.5. Observa-se que eles são mais alws nas mulheres, o que pode ser explicado. em parte, pelos valores de hematócrito mais baixos nestas e por diferenças hormonais. Há aumenco da VHS de cerca de 0,85 mm/h a cada cinco anos de acréscimo na idade, que parece ser devido ao aumento do fibrinogênio com o avançar da idade. Por ouuo lado, isso pode ser decorrente da maior prevalência de diversas doenças em pacientes idosos. Por esse motivo, alguns aucores recomendam que não se deve utilizar
Indicações clínicas
A VHS nunca deve ser usada para rastreamemo de doenças em pacientes assintomáticos ou com sintomas tnespecíficos. Apesar de, na prática clínica, ainda ser muito usado com essa finalidade, vários estudos demonstraram que a VHS apresenta valor limitado nessas situações. Na maioria das vezes em que se observa aumento da VHS, sem qualquer outra alteração clínica ou laborato-
Quadro 56.4 - Fatores que influenciam a velocidade de hemossedimentaçào (VHS) Fatores
Aumento do VHS
Pré-analíticos e analíticos
Tubo inclinado Temperatura ambiente Erro no diluição
Diminuição da VHS >2S0 C
Demoro no realização do teste Temperatura ambiente <20° C
Medicamentos
Conlroceptivos 01ais Heporina
Anliinllamotórios SoiiCiloto !altos doses) Corlicosteró de
Fisiológicos e Po lológicos
Sexo feminino Idade avançado Gravidez D1abetes mel1to Hipotireoid ismo Doenças do cológeno Processos infecciosos Processos infla matórios N eoplosios IRC !estágio final) O besidade Hipercolesterolemio Dono teciduol (IAM, AVC) Anem io Mocrocitose
Hipofibrinogenemio Hipogamoglobulinemia CIVD Dreponocitose Policitemia Microcitose Anemias hemolíticas Hemoglobínopotios Esferocilose Leucocitose extremo ILLC)
IRC· 1nsuf1C1ênC1a renal cróniCa; IAM: mfarto agudo do m1ocárd1o; AVC: aCidente vascular cerebral: ( IVO coagulação imravascular d1ssem1nada: LLC. leucem1a linfocí[lca crôn1ca.
700 ( Medicina laboratorial para o clínico
rial. este é um aumento transitório. Nesses casos, não é necessária qualquer propedêutica mais aprofundada além da repetição do exame. que retornará aos valores de referência após algumas semanas, na maioria dos pacientes. Em pacientes sintomáticos, o exame clínico e outros exames complementares levarão ao diagnóstico, ficando a VHS em segundo plano. No rasueamento de infecções, febre e leucocitose são alterações mais fidedignas e mais precoces que a elevação da VHS. Além disso, outros testes laboratoriais. como a dosagem da proteína C reativa. apresentam melhor desempenho como marcadores de fase aguda._ Por outro lado, a VHS tem seu uso estabelecido no diagnóstico específico de algumas doenças, como polimialgia reumática, arterite temporal, amite reumatóide e febre reumática. A polimialgia reumática é caracterizada por dor imporranre e rigidez nas regiões do pescoço, ombros e pelve. Em alguns pacientes, podem predominar manifestações sistêmicas ou inespecíficas como anemia, febre de origem indeterminada, hiporexia e perda de peso. Nesses casos, a VHS aumentada é um dos critérios diagnósticos. Apesar disso, escudos retrospectivos têm mostrado ocorrência relativamente alta de casos de polimialgia reumática com VHS na fa ixa de referência. A arterite temporal caracteriza-se por cefaléia, sintomas visuais (inclusive perda da visão), dor facial e claudicação mandibular. Vasculite excracraniana no fígado. rins ou sistema nervoso periférico também pode estar presente. As manifestações sistêmicas incluem anemia, febre, perda de peso e alterações em enzimas hepáticas (principalmente elevação da fosfatase alcalina). O valor médio da VHS supera os 90 mm/h e em cerca de 99% dos pacientes é supenor a 30 mm/h. Nos casos com suspeita clínica importante (sintomas específicos como cegueira unilateral transitória e claudicação mandibular), a doença pode estar presente independente da VHS aumentada e deve ser considerada a biópsia de artéria temporal ou o tratamento empírico com corticosteróide. Em casos com fraca evidência clínica de arterite temporal. a VHS na faixa de referência exclu1 o diagnóstico. A VHS também está aumentada na artrite reumatóide e pode auxiliar no diagnóstico. Entretanto, a Amencan Rheumatism College utiliza o aumento da VHS apenas como critério de possível artrite reumatóide. ressaltando que este é um entre 20 achados que podem estar
Marcadores laboratoriais de fase aguda da inflamação
presentes. De modo geral, a VHS rem valor limitado no diagnóstico diferencial de sintomas articulares, sendo o exame físico local muito mais importante. Valores dentro da faixa de referência não afastam artrite reumatóide e valores alterados indicam doença in flamatória, mas não são diagnósticos. Da mesma forma a VHS alterada pode auxiliar no diagnóstico da febre reumática, desde que associada a outras alterações clínicas e laboratoriais. Segundo os critérios de jones, o diagnóstico é feito quando há evidência anterior de infecção por Streptococcus beta-hemolítica do grupo A, associada a dois critérios maiores ou a um critério maior e dois critérios menores. A VHS elevada é considerada um dos critérios menores para diagnóstico da doença. A VHS se mantém útil nos dias atuais no acompanhamento do tratamento de algumas poucas doenças, como arterite temporal, polimialgia reumática, artrite reumatóide e doença de Hodgkin. Na arterite temporal e na polimialgia reumática, a VHS diminui em poucos dias após o início da corticoterapia, um achado que reforça o diagnóstico dessas entidades. Geralmente, após sua queda, a VHS se mantém em valores acima dos de referência, mesmo quando há melhora importante do quadro clínico do paciente. Portamo, ramo o quadro clínico quanto a VHS devem ser avaliados como critério para a monitorização da terapia com corticosteróide. Na artrite reumatóide, a VHS tende a acompanhar a atividade da doença e geralmente seus valores caem quando há resposta clínica ao tratamento com corticosteróide. Entretanto, cerca de 5 a 10% dos pacientes com doença ativa têm VHS dentro dos valores de referência. Por outro lado, VHS aumentada não significa, necessariamente, atividade da doença. Portanto, esse teste nunca deve ser usado isoladamente para investigar a atividade da amite reumatóide, sendo os critérios clín icos indispensáveis. Na doença de Hodgkin, a VHS aumentada após a quimioterapia está associada à recorrência da doença e pior prognóstico. A fraca evidência clínica de recorrência da doença de Hodgkin pode ser confirmada por um resultado de VHS dencro dos valores de referência, entretanto, na presença de forte suspeita clínica, esse resultado passa a ter pouco valor. O Quadro 56.6 contém as recomendações para o uso da VHS e resume as poucas indicações para sua solicitação nos dias atuais.
701
Quadro 56.6 - Recomendações para o uso clínico da velocidade de hemossedimentação (VHS) Os resultados de VHS devem ser interpretados sempre considerando o quadro clínico apresentado pelo paciente A VHS não deve ser ultlizoda para rastreamento de doenças
em cerca de três a cinco dias. Apesar de ser uma das proteínas mais extensamente estudadas, sua função biológica permanece obscura. A dosagem da AGP não é útil para o diagnóstico etiológico do processo inflamatório, porém auxilia no monitoramento da evolução do processo e na resposta
em pacientes ossintomóhcos ou com sintomas inespecíficos
ao rraramemo. Elevadas concentrações rêm sido observadas
Deve ser utilizada para o diagnóstico e controle de tratamento das seguintes doenças:
em diversas condições, tais como: tnfecções agudas. artme reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, doença inflamatória intestinal. infarto agudo do miocárdio, cirurgia, traumatismos, neoplasias. queimaduras. acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca congestiva com edema pulmonar e uso de coricosteróides. Baixas concentrações são observadas durante o tratamento com estrógeno. Sua dosagem tem sido utilizada no acompanhamento da febre reumática. em substituição à determinação das mucoproteínas. A dosagem de AGP acrescenta pouca informação para o diagnóstico das doenças às quais sua elevação está associada, de tal maneira que tem pouca utilidade na prática clínica. Os procedimentos analíticos mats freqüentemente utilizados para quantificar a AGP são a rurbidimetria e a nefelomeuia, que permitem medição autOmatizada. As excelentes reprodutibilidade e especificidade desses procedimentos fazem com que a dosagem de AGP substitua com vantagens a dosagem das mucoproteínas. Apesar disso. como marcador de fase aguda. apresenta pior desempenho que a PCR.
• Polimiolgio reumática • Arterite temporal • Artrite reumatóide1 • Febre reumólica2 Pode ser empregado como folar prognóstico no doença de Hodgkin 1 Os cménos clín1cos são 1nd1spensáveis para o diagnóstiCO da artrite reumatóide. 2 Representa um criténo menor para o d1agnóst1co da febre reumánca.
MUCOPROTEÍNAS
As mucoprmeínas. também denominadas seromucóides. compreendem um grupo heterogêneo de substâncias glicoprméicas com carboidraws fortemente ligados ao componente protéico. São definidas por serem solúveis em ácido perclórico a 0,6 Me insolúveis em ácido fosfmúngstico a 1%. Sofrem elevações em diversas situações associadas à reação inflamatória, já que seu principal componente é a AGP. uma prmeína de fase aguda. Por muims anos, a dosagem de mucoprmeínas foi U(llizada como marcador de atividade de doenças inflamatórias, infecciosas e neoplásicas. Sua medição é trabalhosa. envolvendo etapas de precipitação, e seu desempenho como marcador de fase aguda é inferior ao de outros marcadores arualmente disponíveis. Por esses motivos a dosagem de mucoproteínas tem sido abolida da prática clínica, sendo substituída por muitos pela dosagem direta de AGP.
ALFA-1-GLICOPROTEÍNA ÁCIDA A AGPé uma proteína de fase aguda, sintetizada no fígado, que representa o principal constituinte das mucoproteínas. Sua concentração plasmática está geralmente elevada 12 horas depois do início do processo inflamatório, com pico
702 [ Medicina laboratoria l para o clínico
CONSIDERAÇÕ ES FINAIS
Vários testes vêm sendo utilizados ao longo dos anos para monitorizar reações inflamatórias agudas. São testes que se alteram em diversas situações clínicas, como em doenças infecciosas, inflamatórias e neoplásicas e que. portanto, devem ser utilizados cri teriosamente, sempre à luz do quadro clínico. A VHS é um indicador indireto da resposta de fase aguda, pois seus valores dependem princtpalmente da concentração de fibrinogênio no plasma. Além disso. enquanto a VHS se altera lentamente com a evolução da doença, a PCR sofre alterações muito mais acentuadas em questão de horas. Por 1sso. entre os exames usados como marcadores de fase aguda, a dosagem da PCR é a que apresenta melhores resultados na prática clínica. Outros testes. como a dosagem de AGP. apresentam indicações mais restritas, sendo que suas limitações devem ser conhecidas para assegurar seu uso de forma apropriada.
REFERÊNCIAS 1. Abhj HC. Me1nders AE. C-reac[lve prote1n: h1story and reviva!. Eur) lm Med. 2002;13:412-22. 2. Asher TM. Cooper GR. Seromuco1d determ1na[lon: variables and modifiCa[lons. Clin Chem. 1960;6:189-98. 3. Blackburn WD )r. Vahd1ty of acure phase prore1ns as ma-
9.
rkers o( d1sease aniviry. J Rheumatol Suppl. 1994;42:9-13. Brigden M . The erythrocyte sedimentation rate: S[lll a helpful rest when used judiciously. Postgrad Med. 1998;103:257-74. S. Clyne B. Olshaker )5. The C-reactive prote~n . J Emerg Med. 1999;17:1019-25. 6. Collares GB. Vid1gal PG. Recomendações para o uso da veloc1dade de hemossedimentação. Rev Med M1nas Gerais. 2004;14:52-7. 7. Corrêa CR, Bun111 RC. Proteínas plasmáticas rea[lvas positivas à fase aguda. J Br Pato!. 2000;36:26-34. 8. Expert Panei on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adules. Execurive Summary of The Th1rd Report of The Nacional Cholesterol Educarion Program (NCEP) Expert Panei on Derewon, Evaluanon, And Treatment of H1gh Blood Cholesrerol ln Adults (Adulr Treatment Panei III). )AMA. 2001;285:2486-97.
Scand J Pnm Healrh Care. 1995;13:39-45. 11. Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW. Andersen )L, Cannon III RO. CriqUI M , er ai. Markers of lnflammation and Cardiovascular Disease. Application to Clinical and Public Health PraCLice. A Sratement for Healrhca re Profess1onals From the Centers for Disease Contrai and Prevennon and rhe Amencan Hearr Association. C1rcular1on. 2003;107:499-511. 12. P1chet G, Bresohn PL Pere1ra Jún1or O, )aworsk1 MCG. Santos CM. P1nto AP. et ai. Mucoproteína versus alfa-1ghcoprmeína ác1da: o que quantificar/ J Bras Patol Med Lab. 2002;38:87-91. 13. Sociedade Brasileira de Cardiologia. III D1retnzes Brasilei ras sobre Dislipidemia s e Diremz de Prevenção da Aterosclerose do Departamemo da Aterosclerose. Arq Bras Card1ol. 2001;77 supllll:l-48.
4.
Marcadores laboratoriais de fase aguda da inAamação
Fourn1er T, Medjoubi-NN, Porquet D. Alpha-1-acid glycoprorein. Bioch1m B1ophys Acta. 2000;1482:157-71. 10. Hansson LO. Carlsson I. Hansson E. Hovehus B, Svensson P, Tryd1ng N. Measurement of C-reactiVe prme1n and rhe erythrocyte sed1menta[lon rate 1n general prac[lce.
703
Suzane Pretti Figueiredo Neves Raquel Lara Fu rlan
57
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune na qual órgãos, tecidos e células são lesados, pri ncipalmente, por auto-anticorpos e pela deposição de imunocomplexos. Trata-se de uma doença inflamatória crónica, sistêmica, caracterizada por períodos de exacerbação e remissão, de grande morbidade, mortalidade e para a qual ainda não há cura. Atualmente, o tratamento antiinflamatório e imunossupressor muito tem contribuído para o controle da doença e para a prevenção de danos a órgãos-alvo, como o ri m. A etiopatogenia do LES ainda não foi totalmente esclarecida. Sabe-se que a doença é poligênica e multifatorial, envolvendo múltiplos genes MHC e não MHC relacionados. O evento resultante e característico é uma resposta imune anormal e aberrante. Como parte dessa resposta imune aberrante, tem-se uma grande produção de aura-anticorpos pacogênicos com potencial para lesão tissular. Entender o conceito de auto-anticorpos patogênicos, bem como de auto-anticorpos patológicos e auto-anticorpos naturais é fundamental na doença auto-imune. Por muitos anos, o dogma central da imunologia baseou-se na deleção de clones auto-reativos e a "permissão" para a sobrevivência apenas de células B e T capazes de reconhecer antígenos estranhos, não próprios (non se/f). Sabe-se, entretanto, que certo nível de auto-reatividade existe em codo indivíduo e que aura-anticorpos fazem parte do nosso repertório imune natural, estando presentes em baixas concentrações durante toda a vida. São predominantemente
lgM, polirreativos, de baixa afinidade, com grande reatividade cruzada e possivelmente necessários à fisiologia e homeostase do organismo. Sabe-se, também, que autoantígenos auxiliam na formação e manutenção de um repertório imune maduro e que não há diferença fundamental entre a estrutura destes e a dos antígenos estranhos. Desta forma, acredita-se que o repertório linfocítico evoluiu não para distinguir entre self e non-self mas para reagir adequadamente a antígenos em determinados microambiemes, geralmente na presença de citocinas inflamatórias, reação esta sempre visando ao restabelecimento da homeostase. Uma vez que a autoreatividade é fisiológica, resta-nos tentar compreender por que, em certas situações, ocorre o adoecimento em conseqüência desta e, no caso específico do LES, por que auto-anticorpos naturais passam a ser produzidos em altas concentrações e sofrem mudança de classe, tornando-se lgG de alta afinidade, os chamados autoanticorpos patológicos. E mais, entre estes anticorpos patológicos, por que alguns se tornam patogênicos, capazes, portanco, de causar lesão. Grande esperança reside no projeto Genoma Humano, que provavelmente contribuirá para a elucidação de fato res tais como: a combinação dos genes envolvidos e a identificação dos polimorfismos gênicos participanres no processo e na inreração dos diversos genes entre si e com o meio ambiente, resultando na expressão final da doença. Em relação aos aspectos epidemiológicos, entre os indivíduos acometidos, 90% são mulheres em idade fér-
til e observa-se maior número de casos na raça negra. Embora a prevalência do lúpus eriremaroso no Brasil não seja conhecida com exatidão, estima-se que seja semelhante à encontrada nos Estados Unidos e outros países do mundo, numa proporção de 10 a 50/100.000
EXAMES LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO DO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO O FENÔMENO "CÉLULA LE"
pessoas. Arenção especial deve ser dada ao fam de que
A pesquisa de células LE foi o primeiro exame labo-
a incidência das doenças auto-imunes, bem como das
ratorial utilizado no diagnóstico do LES. O princíp1o do
alergias, rem aumentado nos países desenvolvi dos nas
teste consiste em provocar a ruptura das células sanguí-
à diminuição
neas para a exposição do material nuclear e, caso haja auto-anticorpos "antinúcleo" no soro, haverá opsonização dos componentes nucleares e posterior fagocitose desse material por leucócitOs polimorfonucleares. Para a execução do reste, a amostra de sangue é cenrrifugada e a parte
últimas uês décadas, concomitantemente na incidênc1a de doenças infecciosas.
Como o próprio nome sugere, o LES é uma doença sisrêmica, podendo se manifestar por acometimento músculo-esquelético, cutâneo, renaL dos sistemas nervoso e cardiocirculatório e danos pulmonar. gastrimestinal e ocular. São freqüentes febre, emagrecimenw e ouuos sintomas sisrêmicos, como fadiga e queda de cabelo.
superior do coágulo é retirada e macerada. O macerado é incubado em banho-maria 37°C por uma hora e posteriormente centrifugado. A camada leucocitária é retirada
Pode ocorrer anemia, bem como leucopenia e plaquetopenia. (Tabela 57.1)
e corada pelo método de Giemsa. Analisam-se SOO neutrófilos e o teste é considerado positivo a partir do encon-
Devido à extrema complexidade e à diversidade de apresentações clínicas da doença, o Am erican College oj Rheumatology (ACR) estabeleceu critérios para seu diagnóstico. Na presença de quatro ou mais critérios, jumos ou presentes em algum momento na história do indivíduo, o diagnóstico pode ser firmado com 95% de especificidade e 75% de sensibilidade. São eles: (Tabela 57.2)
tro de duas células LE típicas, ou seja, leucócitOs comendo grande inclusão citOplasmática, homogênea e levemente acidófila que desloca o núcleo para a periferia. A ba1xa sensibilidade (em torno de 30%) assoc1ada às dificuldades de execução e padron 1zação do reste levou à sua substituição pelo teste de FAN. Entretanto, o estudo da célula LE foi importante para a compreensão da patologia das doenças auto-imunes. Hoje, sabe-se que o
Tabela 57.1 - Pnnc1pais eventos clínrcos e parológicos no LES Drversrdode de órgãos-alvo Diversidade no apresentação clínica Presença de altos níveis de anticorpos contra constituintes celulares Apaptose aumentado e expressão aumentado de debris celulares/opoptóticos Anormolrdodes relacionados a células B/ respasto humoral: hipergomaglobulinemio e proliferação policlonol Persistência e deposição de imunocomplexas na superfície endotelial com subseqüente ativação de complemento e inflamação Anormalidades no compartimento celular !células T): defeitos de memorana e pós·sinalrzação Predomrnãncia de ambiente pró-inflamatório com persistência de ambiente do tipo 2 de citocinas Coróter familiar Influências hormonais (o estradiol aumento o ativação e sobrevivência de células B e T) Influências do meio ambiente: exposição à luz UV desencadeando a fotossensibilidade e surtos la luz UV estimula as células dendrí· ticos da pele a apresentar antígenos de forma amplificada). LES induzido por drogas (ex. após uso de procainamida e hidralazina). expOSIÇão o xenobióhcos Fonte: Adaptado de Souza Passos (2000).
706 [ Medicina laboratorial para o clínico ) 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Tabela 57.2- Critérios diagnósticos para lúpus eritematoso sisrêmico do American College of Rheumatology Critério
Definição
Erilemo molar
Eritema fixo, plano ou elevado, sobre os malares e sulcos nasolabiais
Eritemo discóide (lúpus discóide)
Eritemo em placas com cerotose
Fotossensibilidode
Rosh cutâneo como
Úlceras orais
Ulceração oral ou nosoforíngeo, usualmente indolor
Artrite
Artrite não erosivo envolvendo duas ou mais articulações periféricos, caracterizadas por edema ou efusão (derrame)
Serosites
Pleurite: história convincente de dor pleural ou efusão pleural ao exame físico e radiológico ou Pericordite: documentado por eletrocardíograma ou rub ou evidência de derrame pleural
Doença renal
Síndrome nefrótico (proteinúria) ou Síndrome nefrítica ou IRC = cil indros celulares: hemáticos, granu losos, tubulares ou mistos
Desordens neurológicas (psicose, convulsão)
Convulsões: na ausência de drogas indutoras ou desarranjos metabólicos, como uremio, cetoocidose ou desequilíbrios hidroeletrolíticos ou Psicose: no ausência de drogas indutoras ou desarranjos metabólicos, como uremio, cetoocido· se ou desequilíbrios hidroeletrolíticos
Desordens hemotológicos (anemio hemolítica auto-imune ou leucopenio ou ploquetopenia)
Anemia hemolítica com retic ulocitose ou leucopenio (< 4 x 103/ mcl) em duas ou mais ocasiões ou Linfopenio: < 1500/mcl em duas ou mais ocasiões ou Tromb ocitopenio: < 100 X 1o3/ mel no ausência de drogas indutoras
Anticorpos antinucleares positivo
Título anormal no FAN p or imunofluorescêncio ou metodologia equiva lente no ausência de droga
Desordens imunológicas
• • • (1) (2)
resultado
à exposição ao sol
Anti-dsDNA em títulos anormais ou Anti-Sm positivo ou Pesquiso de anticorpos ontifosfolípides baseado em : níveis aumentados de anticorpos onticordiolipino (lgG ou lgM) ou resultado positivo poro anticoagulante lúpico ou (3) VDRL falso-positivo
Fome: Tan et a/, 1997 Observação: o ACR recomenda que seja solicitada a pesquisa de anticorpos antinucleares em pacientes que apresentem dois ou mais dos sinais e sintomas citados. Em negrito, critérios laboratoriais.
anticorpo responsável pelo encontro da célula LE, ramo
ticorpos contra constituintes citoplasmáticos, envoltório
in vivo quanto in vitro, é uma amidesoxiribonucleopro-
nuclear, estruturas imranucleares (DNA, RNA. histonas, proteínas do núcleo e do nucléolo) e anticorpos dirigidos para antígenos expressos apenas dura me a divisão celular. Podem ser detectados no sangue circulante e constituem ferramentas úteis para o diagnóstico da doença - um teste de FAN positivo constitui um dos 11 critérios diagnósticos do LES - e, em alguns casos, para prognóstico e monitorização da doença. A seguir, descreveremos o reste lembrando que o nome FAN/ANA vem sendo man-
reína (amiDNP/cromatina). Apesar do reste não ser mais utilizado, o encontro casual da célula LE em derrames cavirários é considerado extremamente sugestivo de LES.
ANTICORPOS CONTRA CONSTITUINTES CELULARES Anticorpos contra constituintes celulares são extremamente prevalentes no LES. Embora inicialmente fossem conhecidos como anticorpos antinucleares (ANA) ou fator antinuclear (FAN), sabe-se hoje que esse vasto grupo de auto-anticorpos reage com, potencialmente, qualquer esuutura celular. Assim, podemos encontrar an-
tido devido a seu largo emprego, mas após o Consenso Brasileiro para a Padronização de Laudos de FAN-Hep-2, em Goiânia, 2002, foi modificado para "FAN- pesquisa de auto-anticorpos contra consti tuintes celulares (citoplasma, núcleo e nucléolo)".
Investigação laboratorial do paciente com lúpus eritematoso sistêmico
707
O TESTE DE FAN O FAN é um exame que rem como princípio a imunofluorescência indireta, cuja técnica consiste na incubação de soro do paciente com um subsrrato celular disposto numa lâmina. O imunocomplexo resultante é então revelado pela ad1ção de antiimunoglobulina G humana marcada com um Auorocromo e a lâmma examinada em m1croscóp10 de luz UV. Dependendo do (s) anncorpo (s) existente (s). diferentes arranjos fluorescentes (padrões) podem ser observados em cor verde fluorescente. (Figuras 57.1 A à 57.1 E).
Figura 57.1 D - Padrão nuclear pontilhado cenrromérico. Vê-se fluorescênCia dos centrômeros e placa merafásica fluorescente devido ao alinhamento dos cromossomas na metáfase. Vet praodw colntrda
Antiimunoglobulino humano marcada com fluorocromo
Autcxmticarpa na amostra
Célula Hep-2
Figura 57.1 A - FAN HEp2 por imunofluorescência indirera.
Figura 57.1 E- Padrão nuclear pontilhado. Veêm-se pontos fluorescentes correspondentes a anrtcorpos conrra proteínas nucleoplasmáricas, que poupa a região dos nucléolos. VC'1 prclllrha r olor1rla
O teste utilizava substrato animal (cortes histológicos ou in prints de fígado de roedor), que há alguns anos foi substituído pela linhagem celular Hep-2, derivada de carcinoma humano da laringe. As vancagens de seu uso são inúmeras: mais sensível. as células são grandes e fáFigura 57. 1 B - Padrão nuclear homogéneo. No meto do campo vemos uma placa merafásica fluorescente, indtcando presença de anticorpos antiDNA ou ann-htstonas. Não há marcação do citoplasma. Vet prar1Cha co/onda
ceis de visualizar. têm maior relação núcleo/citoplasma, alto índtce mitórico. muitos nucléolos, além de serem ricas em organelas citoplasmáncas. O soro é inioalmenre testado numa diluição 1:80, considerado como valor de corre adequado para nosso me1o, permitindo sensibilidade e especificidades adequadas. Não é necessário jejum para a coleta, porém. altos níveis lipêmicos podem prejudicar o exame. Alguns laboratórios utilizam valor de corte mais alto, 1:160, devido ao microscópio mais
Figura 57.1 C- Padrão nucleolar. Ver prancho co!onao
708 [ Medicina laborato rial para o clínico
potente. Uma vez observada fluorescência na diluição inicial. procede-se a diluições seriadas do soro (1:160. 1:320, etc.) para observação do pomo final da reação, ou seja. até em que diluição (tículo) o teste é positivo. Quanto maior o título, maior a quantidade de anticorpos presentes na amostra (ex: um resultado de t ículo 1:1280 é maior do que 1:320).
]1------ - - - -- - - -- - - - -- - - -- - - - - - - - - - -
O exame é extremamente sensível para LES, resultando positivo em 95-100% dos casos. Portanto, sempre que a suspeita diagnóstica for de LES, um teste de FAN deve ser solicitado. A especificidade é mais baixa, em torno de 57%, pots inúmeros casos que não são LES cursam com FAN positivo. Situações em que existe grande estimulação antigênica, aguda ou crónica, principalmente viroses, podem levar à detecção de auto-anticorpos circulantes. Também deve ser lembrado que parte da população sadia tem o teste positivo em títulos baixos, bem como indivíduos com outras doenças auto-imunes (Tabela 57.3 e Figura 57.2). Em nosso meio, um estudo realizado em São Paulo encontrou 22,6% de positividade em doadores de sangue. Para o clínico, é im portante ressaltar os valores preditivos negativo (VPN) e positivo (VPP) do teste. O primeiro aproxima-se de 100%, enquanto o VPP está em torno de 12%. Ou seja, diante de um teste de FAN negativo, é extremamente improvável a ocorrência do LES, 1:1280 LES Doença M isto do Cológeno Lúpus induzido por Drogas Artrite Reumatóide Esclerose Sistêmico Hepatite auto-imune crônico Síndrome de Sjogren Miosite N eoplosio, especia lmente Linfomo Infecção pelo HIV Endocardite bacteriana Lúpus eritemotoso d iscóide Mulheres sadios, especialmente > de 20 anos
Títulos
1:40
Figura 57.2 - Dtspersão dos títulos de FAN na população.
enquanto um FAN positivo reflete a doença em apenas 12% das vezes. Uma única exceção deve ser levada em consideração diante de um paciente com suspeita de LESe FAN negativo. Trata-se de casos em que o ancígeno SSA-Ro, responsável por um FAN positivo padrão pontilhado fino, é perdido das células du rante a confecção do exame, por ser solúvel na solução salina utilizada nas etapas de lavagem da lâmina. Recomenda-se que, diante de um FAN negativo, mas com forte suspeita clínica, a pesquisa específica do anti-SSA-Ro seja solicitada. Sua positividade cem o mesmo valor de um FAN positivo. É também o anticorpo envolvido no lúpus neonatal. em que o feco recebe o anticorpo presente na circulação da mãe. Neste caso, o anci-SSA-Ro pode vir a interferir nos mecanismos de condução cardíacos, levando ao bloqueio. Os sintomas desaparecem com a depuração dos anticorpos maternos. Deve ser pesquisado em toda gestante com diagnóstico de LES ou bebês sintomáticos. O FAN não deve ser utilizado para monirorizar a atividade da doença. Não há correlação encre os títulos e curso clínico, além disro, o teste pode negativar com o uso de corticóides. A pesquisa pela imunofluorescência é a técnica considerada padrão, porém, recentemente, a metodologia de ELISA foi introduzida. Os kits, disponíveis comercialmente, utilizam diferences substratos antigênicos, de extratos nucleares a misturas de ancígenos purificados ou recombinantes. Essa metodologia apresenta vantagens, como ser de fácil execução, ser quantitativa e poder ser automatizada. Entretanto, quando comparada à imunofluorescência, apresenta desvantagens fundamentais:
Tabela 57.3- Sensibilidade e especificidade do FAN nas diversas doenças reumatológicas Doença Reumatológica
Sensibilidade
Especificidade
Lúpus Eritemotoso Sistêmico ILES)
93 o 100%
57%
Esclerose Sistêmico
60 o 85%
54%
40·70%
52%
Polimiosite
50 o 70%
63%
Artrite Reumatóide
30 o 50%
56%
Síndrome de Sjogren
Doença Misto do Tecido Conjuntivo
100%
Lúpus induzido por drogas
100%
Adaptada de Wanchu (2000) e Solomon (2002}.
Investigação laboratorial do paciente com lúpus eritematoso sistêmico
709
• os amígenos nucleares usados não apresentam a conformação terciária que há em células intactas, o que pode diminuir a sensibilidade do teste para alguns anticorpos; • a variabilidade de preparações antigênicas usadas nos diferentes kits acarreta problemas de reprodutibilidade; • como todos os amígenos ainda não foram identificados, as preparações podem ser deficientes; • apenas detecta os anticorpos, mas não há visualização do padrão fluorescente, tão importante para orientar os testes subseqüemes. Desta forma, devem-se avaliar os resultados com cautela, sempre correlacionando-os com a clínica e a história do paciente e, se necessário, repetindo o exame após algum tempo para excluir falso-positivos transitórios.
O FAN E SEU FRACIONAMENTO Como já mencionado, o FAN permite que uma série de padrões fluorescentes seja observada. A cada arranjo fluorescente, corresponde(m) determinado(s) anticorpo(s). Alguns deles têm relações específicas com doenças distintas, incluído o LES. Portamo, o clínico deve ter em mente se há necessidade ou não de prosseguir na identificação dos diversos anticorpos. Para tal, deve partir do padrão fluorescente relatado. Para auxiliá-lo, a Tabela 57.4 mostra as associações dos padrões com anticorpos e doenças. Observem que, de acordo com a Tabela 57.4, não é possível o encontro de antidsDNA (double-stranded DNA ou DNA nativo), caso o padrão seja pontilhado, uma vez que a presença deste anticorpo é traduzida morfologicamente por um padrão fluorescente homogêneo. Também deve ser levado em consideração se a pesquisa do anticorpo específico irá acrescentar informação relevante na condução do caso. Por exemplo, desde que relacionado com o padrão adequado, a pesquisa do antidsDNA é importante porque este está relacionado com a presença de nefrite ou vasculite. Se positivo, pode ser uma ferramenta útil na monitorização da atividade da doença, sendo também um critério diagnóstico de LES. Já um padrão pontilhado grosso sugere a pesquisa do anti-Sm (uma anti-ribonucleoproteína) que, embora pouco sensível (cerca de 30% dos casos), é considera-
710 [ Medicina laboratorial para o clínico
do marcador do LES. A pesquisa de ami-hisconas deve seguir um FAN positivo padrão homogêneo apenas na suspeita de lúpus induzido por drogas. Esses anticorpos são pesquisados por técnicas tais como imunodifusão dupla, hemaglutinação e ELISA mas é preciso analisar com extremo cuidado os anticorpos detectados pelas duas últimas, devido à extrema sensibilidade e conseqüente baixa especificidade. Alguns resultados positivos para ami-Sm têm sido relatados em casos que não LES, habitualmente com valores próximos ao corte. Os anticorpos antidsDNA relevantes no lúpus são geralmente lgG reativas contra a estrutura de duplahélice. São encontrados em 70% dos casos e sinalizam dano renal e/ou vasculite. São visualizados no FAN como padrão fluorescente homogéneo. Supõe-se que causem lesão por três mecanismos: • formação e deposição de imunocomplexos DNAami DNA nas membranas basais, com ativação de complemento; • ligação direta a estruturas das membranas basais por reatividade cruzada com constituintes da matriz extracelular; • penetração di reta na célula por mecanismo ignorado: desencadeando apoptose? Alterando função7
t detectado mais comumeme por exame de imunofluorescência indireta, cujo substrato é um protozoário flagelado, Crithidia lucilae, que tem o cinetoplasto rico em DNA mitocondrial, portamo, em sua conformação nativa. O valor de corte é de 1:10 e, quando positivo, o soro é titulado até o ponto final, ou seja, a maior diluição na qual ainda ocorrer fluorescência. Títulos maiores que 1:160 apresentam melhor correlação com a nefrite lúpica. Anticorpos anticromatina são também conhecidos como antinucleossomo, antiDNP e ami-H2A-H2B-DNA. São também os anticorpos responsáveis pelo fenômeno LE, como já explicado. A cromatina é definida pelo complexo nativo formado por proteínas histonas, proreínas não histonas e DNA e à microscopia eletrônica assemelhase a um colar de comas, cada coma sendo um nucleossomo. Os anticorpos amicromatina compreendem aqueles que reagem com a porção de histonas e/ou DNA enquanto mantidos na estrutura de cromatina. Assim, alguns, mas não todos os anticorpos antidsDNA ou anti-histonas, podem também ser anticromatina. Estão presentes em 75% dos indivíduos com LES e potencialmente em 100%
]1 --- - - -- - - - - - -- - - -- - - - - - -- -- - - -
daqueles com lúpus induzido por drogas. Podem também ser encontrados em até metade dos casos de hepatite auco-imune do tipo 1 (lupóide). Um estudo recente encontrou 100% de sensibilidade, 97% de especificidade e melhor correlação com a atividade da doença. Segundo os aurores, anticorpos anticromatina correlacionam-se melhor com doença renal do que o antidsDNA; escudos em animais sugerem que esses anticorpos desempenham papel importante na parogênese da glomerulonefrite. Em nosso meio, já existem kits comerciais para sua detecção por ELISA Alguns aucores sugerem, inclusive, que sejam incluídos nos critérios diagnósticos de LES.
ANTICORPOS ANTIFOSFOlÍPIDES Anticorpos antifosfolíp1des abrangem um grupo heterogéneo de anticorpos que reconhecem combinações variadas de fosfolípides e estão presentes nos pacientes com síndrome do anticorpo antifosfolípide (SAF). No LES, inde-
pendente da presença de SAF, são encontrados em cerca de 30 a 40% dos pacientes. geralmente em baixos títulos. Apesar de alros títulos serem encontrados nas fases de atividade da doença, a titulação seriada desses anticorpos não parece ser particularmente útil na monirorização da doença. Sua descrição remonta a 1983, quando um grupo de pesquisadores do Hospital Hammersmith, de Londres, percebeu que alguns dos pacientes com LES apresentavam um tempo parcial de uomboplastina ativado (PTTa) prolongado. O fenômeno foi atribuído a um "anticoagulante lúpico" (AL). Paradoxalmente, em vez desses doentes apresentarem sangramento, havia risco de trombose. A seguir, foi demonstrado que 25 a 50% dos pacientes com anticoagulante lúpico apresentavam VDRL falso-pos1t1vo. Como os anticorpos responsáveiS pelo VDRL ligam-se à card1olip1na. postulou-se que o anticoagulante lúpico fosse um anticorpo antifosfolípide que. ao ligar-se a estes in vitro, tornava-os indisponíveis para servir como co-faror essenciala duas reações na cascata de coagulação: a conversão de protrombina em trombina e a ativação do fator X. o que explicaria o PTTa alongado.
Tabela 57.4 - Correlações enrre padrões de FAN, anricorpos e doenças Padrão nuclear
Avaliação inicial
Doença Associada
Nuclear Homogênea
Antids·DNA Anti·histonas Anticromatina
LES LE induzido por drogas LES e LE induzido por drogas
Nuclear Ponhlhado Pleomórfico (PCNA)
Ant núcleo de células em orol,feroçõo
LES
Nuclear Pontilhado Grosso
Ant1·Sm Anti·RNP
LES DMTC, Esclerose Sistémico, LES, AR
Nuc.ear Ponulhado Fino
Anti·SS·A/ Ro Anti·SS·B/La
Síndrome Sjõgren, LES Síndrome Sjogren, LES
N uclear Pontilhado Centromérico
Anticentrômero
CREST, Cirrose Biliar Primário
M embrana N uclear Contínuo
Antilom1na
Heporites Auto-imunes
Nucleolor Aglomerado
Antifibrilorino (U3·nRNP)
Esclerose Sistêmico
Nucleolar Pontilhado
AntNOR-90 Ant1·RNA polime1ose I
Esclerose Sistémico Escle1ose Sistémico
N ucleolor Homogêneo
AntiPM/Scl
Superposiçào de Pol1m10S1te e Esclerose Sistémico
Misto do tipo Nucleolor Homogêneo e Nuclear Pontilhado G rosso com placa metafósico decorado em onel(cromossomos negativos)
Superpos•çào de Polimios1te e Esclerose S1slêm1CO,
Misto do tipo N uclear e N ucleolor pontilhado com Antitopoisomerose I (Scl-70) placa metolósico positivo
Esclerose Sistémico formo difuso
Adaptada do lt Consenso Brasileiro de Faro r Anrinuclear em Células HEp-2
Investigação laboratorial do paciente com lúpus eritematoso sistêmico
711
é feita a partir da adaptação dos testes de coagulação e Na prática, a pesquisa do anticoagulante lúpico
está sujeita a diversas variáveis, incluindo a preparação e conservação da amostra e o tipo de reagente utilizado. A dificuldade de padronização somada à baixa sensibilidade levou os pesquisadores a propor o uso de um teste sorológico tendo a cardiolipina como antígeno para detecção dos antico rpos com atividade anticoagulante lúpica. Surge assim a pesquisa da anticardiolipina, primeiramente como radioimunoensaio e posteriormente como ELISA Esse teste provou ser mais sensível que a pesquisa do anticoagulante lúpico e, atualmente, apresenta padronização mais refinada. A sensibilidade gira entre 80 e 90%. O teste foi refinado pela diferenciação dos grupos de anticorpos (lgG, lgM) e os resultados avaliados em termos semiquantitativos: não reagente ou negativo, fracamente reagente ou positivo baixo, moderadamente reagente ou positivo moderado e reagente ou positivo alto. Entretanto, como os dois testes não identificam necessariamente os mesmos anticorpos, devem ser utilizados em conjunto. Um teste positivo é um dos critérios diagnóstico de LES. Uma abordagem racional é solicitar inicialmente o VDRL (um teste barato e encontrado em prat icamente todo laboratório) e, caso negativo, pedir os outros dois exames. Atenção para a possibilidade do encontro de anticorpos antifosfolípides após infecções virais ou com o uso de algumas drogas. Nesses casos, os títulos são baixos e a positividade não costuma perdurar por mais de seis meses. Cuidados na coleta do sangue: para a pesqu isa de anticoagu lante lúpico: deve ser utilizado plasma colhido em citrato de sódio e tornado pobre em plaquetas pela centrifugação. O uso de heparina deve ser informado ao laboratório, de modo a adequar a coleta. Em caso de uso de heparina intermitente, o sangue deve ser colhido uma hora ames da próxima dose ou após três horas da aplicação da última dose. Em caso de infusão contínua, o uso de heparina deve ser interrompido por três horas para, então proceder-se à coleta da amostra. Para a pesquisa dos anticorpos anticardiolipina, não são necessárias essas observações. O exame é feito em tubo seco - sangue colhido sem anticoagulante - e não é necessário o preparo do paciente.
712 ( Medicina laboratorial para o clínico
EXAMES LABORATORIAIS NO MONITORAMENTO DO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO Uma vez que o LES pode apresentar diversas manifestações clínicas, um acompanhamento cl ín ico-laboratorial rigoroso é fundamental no manejo da doença. Na prática clínica, após o estabelecimento do d iagnóstico, uma série de testes laboratoriais deve ser solicitada para estabelecer o estado basal do paciente antes do tratamento. A partir daí, visitas periódicas com repetição desses testes buscarão avalia r o estado geral do paciente, com especial atenção ao funcionamento dos órgãos-alvo, principalmente o rim. A Tabela 57.5 apresenta sugestão de painel laboratorial para avaliação inicial e monitoramento do paciente com LES na prática clínica rotineira. O hemograma é pedido para avaliar anemia. leucopenia (linfopenia) e trombocitopenia, devidas tanto à própria doença quanto a efeito colateral de drogas terapêuticas. A anemia requer especial atenção para a difere nciação de sua etiologia. Os índices hematiméuicos ajudam a orientar quanto à sua classificação, principalmente o volume corpuscu lar médio (VCM) e a hemoglobina corpuscular média (HCM). O índice RDW, que atualmente faz parte do hemograma automatizado, avalia a variação do tamanho das hemácias, e também se mostra muito útil. A causa mais comum de anemia no LES consiste em doença crónica: as hemácias são normocíticas e normocrómicas (VCM e HCM normais), a contagem de reticulócitos apresenta-se normal e as reservas de ferro estão adequadas. O encontro de hipocrom ia e microcitose (VCM e HCM baixos) sugere anemia ferropriva, geralmente por perda crónica de sangue do trato gastrintestinal secundária ao uso de antii nflamatórios não-este róides (AINES) e esteróides. A anemia hemolítica, considerada critério diagnóstico do LES, apresenta grande heterogeneidade no tamanho das hemácias (RDW aumentado) e pode ser confirmada pela contagem elevada de reticulócitos, aumento de bilirrubinas à custa da fração indireta e teste de Coombs positivo. Outros achados na anemia hemolítica são: haptoglobina baixa(< 30 mg/dl)e aumento da LDH. Pode ocorrer também hemoglobinúria.
Tabela 57.5- Sugestão de painellaborawrial para avaliação inicial e moniwramemo do pacieme com LES na prática clínica rotineira Monitoramento Exame laboratorial
Avaliação inicial Em toda consulta
Urino rotina
+
+
Hemogromo
+
+
VHS & PCR
+
+
Creatinino, uréia
+
+
Função hepático
+
Pesquisa dsDN A
quantitativa de anli-
Anualmente
+
+ *
+*
ClOO, C3/C4
+
+
Cleoronce de creotinino
+
+
• Em casos de pacienres com FAN padrão nuclear homogêneo e corre,ação comprovada com atividade da doença Velocidade de hemossedimentação (VHS) e proteína C reativa (PCR), marcadores inflamatórios, podem ajudar a monitorar a atividade da doença e distinguir entre uma exacerbação da doença e uma infecção. Surpreendentemente, o LES é uma das raras condições clínicas que ainda impõem a solicitação de VHS. Isto porque a PCR, considerada um teste mais específico, não se eleva, como seria esperado em condição tão inflamatória. O mecanismo responsável por esse fenômeno ainda não está completamente elucidado, mas escudos recentes apontam produção diminuída da IL- 6 como responsável pela baixa resposta da PCR à inflamação lúpica. Entretanto, a PCR apresenta aumentos significativos na presença de infecção. Diante da atividade da doença, espera-se VHS aumentada e PCR praticamente normal. Já diante de infecção, ambas estariam aumentadas. (ver capítulo 56) Como a nefrite lúpica pode atingir até 50% dos pacientes, a avaliação da função renal em toda consulta é mandatária. Um exame de urina-rotina pode ser muito informativo. A bioquímica urinária realizada por fita reativa pode detectar perda de proteínas, sinalizando a possibilidade de síndrome nefrótica, que deverá ser quantificada em urina de 24 horas. A presença de hemácias e leucócitos sugere o diagnóstico de síndrome nefrítica e deve ser acompanhada da sedimentoscopia. Achados compatíveis com glomerulonefrite são hematúria com dismorfismo eritrocitário e cilindros hemáticos, podendo haver leucocitúria. Muitas vezes, a detecção de cilindros celulares e protéicos pode revelar uma doença clinicamente ainda silenciosa. Cilindros graxas
e corpos graxos ovalados indicam síndrome nefrótica. É freqüente a ocorrência de infecções urinárias nos pacientes e a constatação de leucócitos acima do esperado e nitrito positivo alertam para a instituição de antibioticoterapia após coleta do material para urocultura. Não é demais enfatizar a necessidade da refrigeração da amostra, caso o exame não seja realizado imediatamente. A urina em temperatura ambiente deteriora-se rapidamente, com perda dos elementos celulares (leucócitos, hemácias, cilindros) e proliferação bacteriana. A creatinina sérica é usada para avaliar a função renal: um aumento rápido da creatinina implica atividade da doença, transformando-se em dano permanente. Infelizmente, a sensibilidade do teste é baixa, uma vez que a alteração dos níveis séricos ocorre apenas após a perda de mais de 50% do parênquima renal. A uréia, usada com o mesmo intuito, apresenta sensibilidade ligeiramente maior, mas sofre interferência da dieta. Deve-se complementar a propedêutica com clareamento de creatinina. A amostra de urina coletada em 24 horas é mais representativa, mas o exame sofre interferências provenientes da dificuldade de se obter uma coleta completa, bem conservada e em frasco limpo. Sempre recomende a seu paciente obter as orientações de coleta no laboratório. A biópsia renal muitas vezes é crucial para melhor definição do quadro e do prognóstico. Em alguns pacientes, o aumento ou diminuição dos títulos de antidsDNA tem relação direta com nefrite e vasculite lúpicas. Em outros, já foi demonstrado que o aumento nos títulos antecede as crises, muitas vezes em alguns meses. Assim, para todos os pacientes com LES
Investigação laboratorial do paciente com lúpus eritema toso sistêmi co
713
e FAN positivo e padrão homogêneo, a pesquisa de antidsDNA deverá ser solicitada e, caso positiva, a relação com a atividade da doença deverá ser investigada. Se essa relação for estabelecida, a pesquisa e titulação desse anticorpo deverão ser solicitadas em rodas as consultas
para detecção de doença ativa. As medições seriadas fornecem melhor abordagem da atividade inflamatória e as dosagens de (3 e C4 devem ser pedidas a cada consulta, juntamente com os demais exames citados. Atualmente, vários estudos têm sido conduzidos na
como parte da monitorização da doença.
busca de outros possíveis marcadores da doença. Recen-
O sistema do complemento participa da parogenia do lúpus eritemaroso sistêmico, na medida em que os imunocomplexos formados ou depositados nas membranas basais ativam seus componentes, levando à lise celular, liberação de mediadores inflamatórios e migração de neutrófilos para o local, resultando em lesão. Há muiro se postulou que a medida da atividade torai do complemento e a determinação quantitativa de seus componentes poderiam ser úteis na avaliação dos pacientes pois, as proteínas do sistema do complemento seriam consumidas a uma taxa proporcional à atividade da doença. Portanto, a "atividade hemolítica total do complemento" (CHSO) e as dosagens das frações C3 e (4 têm sido tradicionalmente solicitadas no acompanhamento periódico dos pacientes. Todos os três testes apresentam baixa sensibilidade e especificidade. A atividade hemolítica do complemento foi desenvolvida inicialmente como um teste funcional titulométrico, em que é determinada a diluição do soro do paciente, com 50% das hemácias de carneiro sensibilizadas apresentando hemólise (CH 50 ), sendo manual, trabalhoso, sujeito a inúmeros interferentes e considerado ultrapassado. Hoje, tanto as frações do complemento como a atividade hemolítica total (C100) são avaliadas por técnicas de nefelometria ou turbidimetra, ou ELISA mais bem padronizadas, passíveis de automação e rapidez de execução. Os níveis plasmáticos de C3 e (4 refletem os resultados de um estado dinãmico entre a síntese do complemento e seu consumo. Como na inflamação os dois processos estão aumentados, podem ser encontrados resultados dentro da faixa de referência, o que levaria a erro de interpretação: a doença seria dada como estável ou sob controle, quando, na ver· dade, o processo inflamatório estaria em plena atividade. Portanto, um único teste pode ter baixa sensibilidade
temente, os produtos da ativação do complemento - C3d e C4d - têm sido apontados como mais sensíveis. Oucro teste promissor é a detecção de anticorpos antiClq. Sua presença e seus níveis parecem estar relacionados com o envolvimento renal e exacerbações nefríticas mais que qualquer outro ensaio laboratorial, entretanto, esses exames ainda não estão disponíveis para uso na rotina clín ica.
714 ( Medicina laboratorial para o clíni co
CONSIDERAÇÕES FINAIS
• O LES é caracterizado por inúmeros auto-anticorpos circulantes; • O FAN é o teste inicial para a pesquisa de anticorpos, juntamente com a pesquisa de antifosfolípides e sua solicitação deve seguir uma hi pótese diagnóstica sólida de LES; • O teste de FAN, isoladamente, não é diagnóstico deLES; • A pesquisa de anticorpos antifosfoli pídes deve ser iniciada pelo VDRL e, se necessário, expandida para anticardiolipina e anticoagulante lúpico; • O antidsDNA e anti-Sm somente devem ser pesquisados em casos de FAN positivo e conforme o padrão fluorescente; • O FAN não serve para mon itorização da doença e controle de tratamento; • São exames utilizados no acompanhamento do paciente: hemograma, urina rotina, creatinina, complemento (3 e C4, VHS e PCR e, em alguns casos, antidsDNA; • Os demais exames laboratoriais visam a avaliar o estado geral do portado r do LESe o acometimento dos órgãos-alvo.
[ Suspeito Clínico de LES )
[ [
~ Positivo
~
~
l
FAN-HEp2
I
l
l
l
Padrões nucleares de FAN e frocionomento • PCNA • Homogêneo ~ ontids-DNA, histonos, cromatina • Ponti lhado Grosso ~ onti-Sm, U 1-Rnp • Pontilhado Fino ~ onti-SSA/Ro, SSB/ Lo
~ N egativo
J
~
Diagnóstico de LES improvável Pesquisar onti-SSA/ Ro d iante de suspeito forte
j
~ Pesquiso de anticorpos ontifosfolipídes • VDRL • Anticord iolipino • Anticoagulante lúpico
~ Monitorização laboratorial • ClOO, C3 e C4 • AntidsDNA quantitativo • Hemogromo • Urino Rotina • Uréio e C reotinino • VHS e PCR
Figura 57.3 - Fluxograma para conduta na suspeita deLES.
REFERÊNCIAS 1. 2.
3.
4. S. 6. 7.
Burlingame R. Cervera R. Ami-chroma(ln (an(l·nucleossome) auroamibodies. Auroimmunity. 2002;1:321 -28. Counnho A. Kazatchkine MD, Avrameas S. Natural auroan(lbodies. Curr Op1n lmmmunol. 1995.7(6):812-8. Dellavance A. Gabriel Júnior A, Cimra AFU. X1menes AC. Nuccitelli B. Ben Hur T. 11 Consenso Brasileiro de Faror Am1nuclear em Células HEp-2. Rev Bras Reumatol. 2003;43(3):125-40. Fernando MMA. lsenberg DA How ro mon1ror SLE in rounne clin1cal pra((lce. Ann Rheum D1s. 2005;64:524 -7. Franceschm1 F, Cavazzana I. Anu-Ro/SSA and La/SSB an(lbOdles. Auro1mmun1ry. 2005;38(1):55-63. Hahn BH. Annbod1es ro D A N Engl JMed. 1998.338(19): 1359-68 Lara RMC, Neves SPF. O laboratóno nas doenças SIStémicas auro-1munes: da célula LE à célula Hep-2. uma JOrnada de 50 anos revelando auro-anncorpos. Rev Med M1nas Gera1s. 2004;14(4):216-21.
8.
9. 10. 11.
12.
13.
Investigação laboratorial do pacien te com lúpus eritematoso sistêmico
L1u CC. Manz1 S. Danchenko N, Ahearn JM. ew advances in measuremem of complemem awvanon: lessons of systemic lu pus erythemawus. Cur Rheum Rep. 2004; 6:375-81. Miglionni P. Bald1n1C. Rocch1 V, Bombardieri S. Ann-Sm and ann-RNP amibod1es. Auwimmun 1ty. 2005;38(1):47-54. Passos LFS. Great Expectations: SLE and the Human Genome Projecr. Rev Bras Reumarol. 2000;40 (6):251-304. Pierangeli SS. Nigel Harris E. Clinical laborarory test1ng for the antiphospholipid syndrome. Cl in Ch1m Acta. 2005;357:17-33. Rose NR. Hamilwn RG. Detrick B. Manual of Clinical Laborawry lmmunology. 6th ed. Washingron: American Society Microbiology; 2002. Sinico RA, Bollini B. Sabadini E, Di Toma L. Radice A The use of laborawry tests in diagnosis and moniroring of systemiC lupus eryrhemarosus. J Nephrol. 2002;15 Suppl 6:S20·7.
715
58
Ana Beatriz Cordeiro de Azevedo Luis Eduardo Coelho Andrade
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTE COM ARTRITE REUMATÓIDE
A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmica caracterizada por po liart ri te crônica, que acomete principalmente pu nhos e pequenas articulações das mãos. Pode levar a graus variáveis de incapacidade funcional e comprometimento sistêmico, com impacto económico significat ivo para o paciente e a sociedade.
ASPECTOS RELEVANTES DA AR
ETIOLOGIA E ETIOPATO GENIA A etiologia da AR é ainda desconhecida. Estudos fami liares revelaram que irmãos de pacientes com AR têm risco duas a quatro vezes maior de desenvolver a doença em relação à população geral, havendo concordância maior para gêmeos, em maior extensão para os monozigóticos. Essa observação embasa a teoria de que a AR é uma doença que se desenvolve em indivíduos geneticamente predispostos. Alguns genes do complexo principal de histocompatibilidade, localizados no cromossoma 6, que codificam os antígenos de histocompatibilidade, conhecidos como HLA, têm sido fortemente associados à AR. Estudos demonstraram associação da doença com os segui ntes alelos: HLA-DRB1*0401, *0404, *0408, HLA-DRBl*OlOl, *0102 em caucasianos e HLADRB1*040S em asiáticos. Alguns destes foram associados a formas mais graves da AR.
No entanto, a predisposição genética é insuficiente para explicar a ocorrência dessa enfermidade. Postulase que fatores externos causem quebra da tolerância do sistema imunológico a antígenos próprios, levando a anormalidades imunológicas que culminam com resposta inflamatória crónica, afetando principalmente a membrana sinovial das articulações diartrodiais (articulação diartrodial: duas extremidades ósseas adjacentes recobertas por cartilagem limitadas por uma membrana sinovial e cápsula articular). Agentes infecciosos bacterianos e virais têm sido implicados na gênese da AR, entre eles o vírus Epstein-Barr, o parvovírus Bl9, o vírus da hepatite C, citomegalovírus, alguns retrovírus e micobactérias. A homologia entre determinadas estruturas antigênicas desses agentes infecciosos e epiropos presentes na sinóvia e na cartilagem seriam responsáveis pela quebra da tolerância e desencadeamento de respostas auto-imunes. Até o momento, nenhum microrganismo relacionado à AR foi isolado na articulação dos pacientes com a doença. Também se observou em estudos epidemiológicos risco aumentado de desenvolvimento de AR entre tabagistas. As alterações imunológicas descritas na AR são características marcantes dessa doença, que a distinguem de outras enfermidades articulares inflamatórias e degenerativas. Vários auto-anticorpos foram descritos em pacientes com AR, como o fator reumatóide, anticorpos contra componentes da cartilagem, anticorpos anticolágeno,
anticorpos contra ancígenos citrulinados, anticorpos antinucleares e anticorpos contra proteínas do choque térmico (heat chock proteins). A maioria deles carece de especificidade para AR, com exceção dos anticorpos contra antígenos citrulinados. O papel dos auto-anticorpos na fisiopatologia da AR ainda está para ser esclarecido, podendo representar uma conseqüência ou causa do processo inflamatório crónico observado. O infiltrado celular inflamatório predominante de linfócitos T CD4+ é característico da sinovite reumatóide. A expansão oligoclonal de linfócitos T na membrana sinovial sugere que elas se proliferam em resposta a antígenos locais específicos, até o momento desconhecidos. O desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórias produzidas por essas células seria responsável pela perpetuação da resposta inflamatória e destruição articular, entre elas IFN-y. IL-l, IL-15, IL-4, IL-13 e o TNF-a. Esta última merece destaque, pois pesquisas revelaram ser este fator extremamente importante na sinovite reumatóide e alvo de uma das terapêuticas biológicas disponíveis hoje para o tratamento da AR. Devido ao processo inflamatório persistente, a membrana sinovial torna-se hiperplásica e mais vascularizada, formando o pannus, que destrói a cartilagem e leva à formação de erosões ósseas. As citocinas inflamatórias, como a IL-1 e o TNF-a, regulam a produção de metaloproteinases e outras proteinases pelos fibroblastos e monócitos da membrana sinovial. Os condrócitos e osteoclastos também reagem a essas citocinas, reduzindo a produção de colágeno e proteoglicanos e aumentando a síntese de colagenase e estromolisina. Assim, contribuem para a reabsorção de matriz óssea extracelular. A fagocitose de imunocomplexos pelos neutrófilos presentes no líquido sinovial resulta na produção de prostaglandinas e leucotrienos, degranulação de neutrófilos e dano oxidativo.
EPID EM IO LOG IA A AR pode ocorrer em qualq uer idade, mas tem pico de incidência entre a quarta e quinta décadas de vida e afeta preferencialmente mulheres. Estudos de prevalência da AR estimam que ela varie de 0,5 a 1,1% em países da Europa, América do Norte, Ásia e África do Sul. No Brasil, uma pesquisa real izada em 1993
encontrou prevalência variável nas diferentes regiões do Brasil: de 1,0% na região Norte, 0,57% no Nordeste, 0,50% no Nentro-Oeste, 0,6% no Sudeste e 0,20% na região Sul.
APRESENTAÇÃO ClÍNICA A AR freqüentemente apresenta-se de maneira insidiosa ou subaguda, com comprometimento simétrico de pequenas articulações das mãos e pés, punhos e tornozelos, associada à rigidez matinal, que pode dura r de minutos a horas. O início agudo com poliartrite comprometendo pequenas e grandes articulações associado à incapacidade funcional significativa é menos comum, ocorrendo geralmente em idosos. A AR também pode se iniciar como uma monoartrite aguda ou crónica, que afeta grandes articulações como ombro ou joelho. Episódios recorrentes de artrite súbita com comprometimento de uma ou mais articulações, com duração de horas a dias, que desaparecem completa e espontaneamente, conhecidos como reumatismo palindrómico, podem anteceder o início de uma poliartrite persistente. De maneira geral, os sintomas iniciais da AR são predominantemente articulares, mas podem vir associados a feb re, emagrecimento, fadiga e comprometimento sistêmico. Em idosos, a presença de manifestações sistêmicas associadas à mialgia intensa em região próxima do pescoço, ombros, quad ris e/ou joelhos impõe o diagnóstico diferencial com polimialgia reumática. Também podem estar presentes man ifestações extraarticulares como tenossinovite volar do punho associada à síndrome do túnel do carpo, bursites e cistos sinoviais. A presença de rigidez matinal superior a uma hora é um sintoma importante e característico da doença, sendo poucas as enfermidades que causam rigidez matinal maior que uma hora. Pacientes com altos títulos de facor reumatóide têm maior risco de desenvolver manifestações extra-articulares, como nódulos subcutâneos, vasculite, neuropatia periférica, pericardite, pleurite, comprometimento pulmonar intersticial, ocular, renal e síndrome de Felty. A síndrome de Felty é uma condição rara, caracterizada pelo desenvolvimento de esplenomegalia, leucopenia, anemia e trombocitopenia em pacientes com AR. Geralmente ocorre em pacientes com doença de longa evolução e associa-se à presença de fator reumatóide,
718 [ Medicina laboratorial para o clínico ]1-------------------------------~
nódulos subcurâneos, deformidades articulares. emagrecimento. linfadenomegalia, úlceras de membros inferiores. h1perpigmentação cutânea, neuropatia periférica. ep1sclerite e anticorpos antinúcleo. Infecções bacterianas são comuns nesses pacientes e se relacionam a maior risco de morte. Vale lembrar que aproximadamente 33% dos pacientes com síndrome de Felty não apresentam doença articular em atividade quando do seu desenvolvimento.
Quadro 58.1 - Cménos pa ra class1ficaçào de artrite reumatóide do ACR· 1987
Critério
Definição
Rigidez molina i
M ínimo de 1 hora
Artnte de lrês ou mo:s articulações
Pelo menos 3 ou mors articulações, acometidos simultaneamente, com edema ou efusão, vislo por médico
Artrile de orliculoções dos mãos
Pelo menos uma articulação edema· ciodo em punhos, M C Fs ou IFPs, visto por médico
Artrile srmétrico
Envolvimento bilo·ero srMullôneo. não sendo necessário srmet11a absolulo aos orliculoções IFPs, MCFs e MTFs, visto por médico
Nódulos reumolóides
N ódulos subculôneos sobre eminên· cios ósseos ou superfície exlensoro ou em regiões juslo·orticulores, observo· do por médico
Falar reumalóide
Demonslróvel por quaisquer mélodos em que seja positivo em menos de 5% dos controles normais
Alterações rodiogró· ficas
Alterações lípicos vistos em radiografias convencionais de mãos e punhos em PA: osteopenia penorticulor e erosões
CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS
Nas últimas décadas, houve esforços para padronizar a classificação de doenças reumáticas, com o objetivo de uniformizar populações de pacientes para a realização de pesquisas. Em 1987. o American College oj Rheumatology (ACR) havia publicado uma nova lista de critérios de classificação para AR. em substituição à anterior, de 1956. Esses critérios foram considerados simples de ser aplicados. sensíveis. específicos e tão bons ou melhores que os anteriores, com sensibilidade entre 77 e 95% e especificidade de 85 a 98%, em estudos realizados em diferentes populações. Desde então. têm sido usados também para o diagnóstico de AR na prática clínica. apesar de terem sido criados com o propósico de classificação e não de diagnóstico. (Quadro 58.1) Quadros de artrite de início recente 1mplicam uma avaliação de diagnósticos diferenciais. antes de se estabelecer o diagnóstiCO de AR. Não só outras doenças reumáticas podem se manifestar com quadro clínico semelhante à AR, como também infecções. doenças tireoidianas e neoplasias. (Quadro 58.2)
EXAMES LABORATORIAIS NA ARTRITE REUMATÓIDE
ALTERAÇOES LABORATORIAIS GERAIS
Muitas das alterações laboracoriais observadas na AR carecem de especificidade, sendo comuns a outras doenças inflamatórias crónicas. No entanto, o conjunto de alterações clínicas, radiológicas e laboratoriais possibilita o diagnóstico correto e acompanhamento adequado da resposta do paciente à terapêutica instituída.
Investigação laboratorial do paciente com artrite reumatóide
Obs.: Os cnténo~ de I a 4 devem estar presentes por um período mí· nrmo de sers semanas. Quatro dos sete cménos são necessános para classificar um pacienre como portador de artme reumatóide. Paoentes com dois ou três cm énos não estão excluídos da possrbilidade de fururo desenvolvrmento da doença.
Quadro 58.2 - Pnnopais dragnósrtcos dtferenoats da arrrtte reumatóide A rtrite pós·infecçõo virai Espondiloortropalios (artrite psoriática, enleroortropatiosl Doenças reumáticas oulo·imunes (LES, esclerose sistémica, DMTCI Osteoorlrite Arlrile por cristal Arlrites infecciosos Polimiolgio reumólico Osleoorlropalia hiperlrófica Miscelânea : sorcoidose. endocardite bacteriano, doenças do tireóide, hepotrte auJo-imune, ortropohos enleropóltcas, doenças neoplásicas, hemoglobinopolias, hemocromotose, amiloidose
Provas de atividad e inflamatórias
Habitualmente, as provas de atividade inflamatória, discutidas mais detalhadamente no capítulo 56. encontram-se alteradas nas fases de atividade da doença. No entanto, esses exames podem apresentar valores dentro
719
da normalidade em até 40% dos paciences. Em relação a paoences com doença de início recente. até 50% destes podem exibir valores de velocidade de hemossedimentação (VHS) menores que 28mm na primeira hora. AVHS e proceína C reativa (PCR) são exames freqüentemente utilizados na prática clínica para a avaliação de pacientes com AR e fazem parte de algumas das medidas de avaliação para o status da AR. como o Disease Activity Score (DAS), o Simplified Disease Activity Index (SDAi) e o American College of Rheumatology (ACR) Core Data Set.
ser observado em pacientes com doença em atividade, que melhora com controle. No entanto, uma série de fármacos utilizados no tratamento da AR. entre os quais os antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) e fármacos moduladores de doença (DMARDs). podem causar alterações nas enzimas hepáticas, o que pode dificultar a diferenciação entre efeitos adversos relacionados à medicação e atividade de doença. Um critério prático é que quando as alterações relacionam-se às medicações, a interrupção do uso destas leva à normalização das enzimas hepáticas.
Alterações hematológicas
OS AUTO-ANTICORPOS NA AR
É comum a observação de anemia, normocítica nor-
mocrômica ou hipocrômica. em pacientes com AR. Habitualmente. a presença de anemia correlaciona-se com a atividade da doença e melhora quando o cratamenm específico para o seu controle é bem sucedido. A anemia na AR é multifamrial. relacionada à ação de citocinas próinflamátorias sobre as células precursoras da medula óssea, deficiência de eriuopoetina, prejuízo na utilização de ferro e aumento da fagocitose das hemácias pelo baço. O ferro sérico pode estar normal, baixo ou aumentado. Nos casos em que o ferro sérico está baixo, a saturação da cransferrina também pode estar baixa, mas, geralmente. a ferritina está normal ou aumentada. A presença de ferritina baixa sugere deficiência de ferro associada. o que requer suplementação adequada. Trombocitose e eosinofilia também podem ser observadas nas fases de atividade da doença e podem estar relacionadas ao desenvolvimento de manifestações extra-articulares. O mecanismo fisiopatológico relacionado a esses achados ainda não é bem compreendido. Vale ressaltar que a presença de trombocitose nesses pacientes não foi correlacionada a um aumento na freqüência de eventos trombóricos. A presença de uombocitopenia e leucopenia é rara na AR, estando relacionada ao uso de drogas imunossupressoras ou à síndrome de Felty.
A AR, assim como as demais doenças auto-imunes. cursa com a presença de vários auto-anticorpos circulantes. O fator reumatóide e os anticorpos antipeptídeos citrulinados são aqueles com maior aplicabilidade para o diagnóstico.
Fator reumatóide
Em 1940, E. Waaler descreveu o fator reumatóide (FR) como o primeiro auto-anticorpo relacionado à AR. O FR representa um conjunto de auto-anticorpos dirigidos contra diferentes epitopos da porção Fc da imunoglobulina G (lgG). Essa porção da 1munoglobulina é essencial para a fixação do complemento e ativação das células do sistema imunológico. (Figura 58.1)
AA Folar reumolóide do classe lgM
Folar reumolóide do classe lgG
A
B
Alterações hepáticas
Um aumento nos níveis séricos das enz1mas hepáticas, especialmente de y-GT e fosfatase alcalina, também pode
Figura 58.1 - Desenhos esquemáticos de fator reumatóide da classe lgM (A) e da classe lgG (B). formando grandes imunocomplexos.
720 [ Medicina laboratorial parao clíni~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~-
O FR pode ser de qualquer classe de imunoglobulinas, mas, habitualmente, na prática clínica, os ensaios comerciais detectam a presença do FR da classe lgM. Porém, FR do tipo lgA e lgG podem ser encontrados no soro e líquido sinovial de pacientes com AR. O papel do FR na fisiopatologia da AR cem sido bastante investigado, mas ainda não está esclarecido se ele é importante no desenvolvimento da doença nas suas fases in iciais ou representa apenas um epifenômeno. Existem várias técnicas laboracoriais para identificar a presença do FR e mensurá-lo, entre elas: • aglutinação de partículas de látex recobertas com lgG humana; • aglutinação de hemácias de carneiro recobertas com lgG de coelho (reação de Waaler-Rose) - atualmente em desuso; • nefelometria; • turbidi metria; • ELISA Os testes de aglutinação, tanto de partículas de látex quanto a reação de Waaler-Rose, detectam preferencialmente o FR do tipo lgM que, por sua forma pentamérica, mosrra-se mais eficiente que os demais na aglutinação. Comparando os dois métodos de aglutinação, o teste de aglutinação do látex apresenta-se mais sensível e o de Waaler-Rose mais específico. Porém, este é um dado controverso. Atualmente, o último tem sido muito pouco utilizado na prática clínica, não sendo realizado na maioria dos laboratórios. Uma característica dos testes de agl uti nação é a determinação de títulos, o que faz deles testes semiquantitativos. Considerando-se a reação de aglutinação do látex, títulos superiores a 80 encontram-se mais associados à AR e, em geral. os estudos concordam que a presença de FR em altos títulos correlaciona-se com doença articular mais grave e com maior freqüência de manifestações extra-articulares. Os testes nefelométricos e turbidimécricos tornaram-se os de referência atual e são altamente sensíveis e reprodu cíveis. Detectam as três classes de FR e fo rnecem resultados em Ul/ml. O teste de ELISA, menos utilizado, também permite a identificação dos outros subtipos de FR (lgA e lgG), além do tipo lgM. Embora o FR seja reconhecido como um anticorpo freqüencememe relacionado à AR, e inclusive faça parte dos critérios de classificação para a AR do ACR, ele não é
Investigação laboratorial do paciente com artrite reumatóide
específico dessa enfermidade e pode ser encontrado em outras condições além da AR. (Quadro 58.3). Entre elas, encontram-se: enfermidades reumáticas, como a síndrome de Sjógren (em torno de 75-95% dos pacientes), a doença mista do tecido conjuntivo (50-60%), o lúpus eriremacoso siscêmico (15-35%), esclerodermia (20-30%) além de poli miosite, dermatomiosite e crioglobulinemia misra (tipo 11 e III). Também pode ser encontrado em condições infecciosas e inflamatórias crônicas, como a endocardite bacteriana subaguda, infecções pelos vírus da hepatite B e C tuberculose, hanseníase, doenças pulmonares inflamatórias ou fibrosantes - como sarcoidose, silicose e fibrose pulmonar intersticial -a cirrose biliar primária e neoplasias. O FR pode ser encontrado ainda em indivíduos normais, em até 5% dos jovens saudáveis e 3 a 25% dos idosos podem apresentar teste positivo para a pesquisa do FR. Quadro 58.3 - Freqüência de FR em outras condições que não artrite reumatóide Condição Idade (> 60onosl
Freqüência de FR (%) 5-25%
Outros doenças reumáticos Síndrome de Sjogren LES
DMTC Esclerose sistémico Polimiosite
33-66% 3-27% 6-23% 2- 44%
0- 18%
Infecções Endocard ite bacteriano Hepatite C ou B Tuberculose Sífilis Honseníose
25-50% 20-75%
8% até 13%
5-58%
Doenças pulmonares Sorcoidose Doença pulmonar intersticial Silicose Asbestose
3 -33%
lO- 50% 30 - 50% 30%
Outros Cirrose biliar primário Doenças neoplásicas
45 - 70% 5 -25%
A sensibilidade do FR para AR varia de 50 a 90%, dependendo do método utilizado. Utilizando-se a aglutinação do látex, a sensibilidade situa-se em torno de 75% e a especificidade de 60%. Nas fases iniciais da doença, o
721
FR pode estar preseme em apenas cerca de 40% dos paoemes. O Projero Direu izes da Associação Médica Brasileira e Conselho Federal de Medicina recomenda que, se inicialmente negativa, a pesquisa de FR deve repetida em 6-12 meses. No entanto, a presença do FR cem sido apancada como imporcance faror preditivo de progressão radiológica e incapacidade funcional. Vários escudos tentaram identificar associação entre os diferemes isotipos de FR com a progressão da AR, mas os resultados observados nem sempre são concordantes.
especificidade para AR (88 a 99%), com sensibilidade variando de 36 a 59%. Esse aura-anticorpo também é dececeado por imunofluorescência indireca. em esuaw de epitélio de esófago de raw (Figura 58.3).
Anticorpos anticitrulina
Em 1964, N1enhuis e Mandema descreveram um novo marcador sorológico em pacientes com AR, conhecido com antifatar perinuclear (APF). Esses auwanticorpos ligam-se a grânulos cerawhialinos localizados ao redor do núcleo de células humanas da mucosa das bochechas. O APF pode ser dececcado por lmunofluorescência indireca, uDhzando-se como subscraw células humanas da mucosa das bochechas (F1gura 58.2). A freqüência do APF em pacientes com AR varia de 49 a 91% e sua especificidade de 73 a 99% em diferentes escudos.
Figura 58.2 - Anucorpo antifawr perinuclear (APF). lmunofluorescênoa 1ndireta em querarinócitos da mucosa oral. Soro diluído 1/160. Conjugado: 1sotiocianaw de fluoresceína. Magnificação 400X. Os corpos ceratohialinos replews de filagrina apresentam-se d1sposros e corados ao redor do núcleo. Ver prancha w lm 1dn
Um ouuo am1corpo encontrado na AR e conhecido como anticorpo antiqueracina (AKA), descriw por Young em 1979, também cem sido considerado de alca
722 ( Medicina laboratorial para o clínico
Figura 58.3 - Anucorpo amiquerarina (AKA). lmunofluorescência 1nd1rera em corte transversal de esôfago de raw. Soro diluído 1/10. Conjugado: ISOliOCianaro de nuoresceina. Magnificação 200X. A reanv1dade resrma à camada córnea está representada por fluores· cênoa lam1nar e linear concêntrica. A coloração Intensa da mucosa é não específica h , pranL ha co•O• ,da
No início dos anos 90, os investigadores demonsuaram que esses auw-amicorpos reagem com a prmeína filagrina e seu precursor pró-fi lagri na. A filagn na é uma prmeína produzida durante as fases tardias de diferenciação de células epiceliais de mamíferos, portamo. preseme em células da mucosa oral e na camada córnea do esófago de ram. No final dos anos 90, foi elucidado que os epicopos reconhecidos pelo APF e AKA eram ricos no aminoáodo m rulina. Essa observação possibiliwu o desenvolvimento de testes de ELISA contendo um painel de peptídeos citrul inados como substrato antigênico. Posceriormeme, observou-se que o uso de peptídeos cicrulinados cíclicos apresentava melhor desempenho diagnóstico. Assim, o cesce conhecido como antiCCP (Cycilc Citrullmated Pepttde) estabeleceu-se como uma alternativa comercial vantajosa para substitUir os tradicionais cesces APF e AKA na pesquisa de anticorpos conua ancígenos ciuulinados. O anciCCP mantém as características de alca especificidade (96-100%) e sensibilidade (70-75%) para diagnóstico da AR. O APF, o AKA e o antiCCP apresentam desempenho diagnóstiCO ligeiramente distinto para o d1agnóscico de
AR. O AKA possui a menor sensibilidade e a maior especificidade emre os três. O APF em baixos títulos exibe baixa especificidade. o que pode ser corrigido valorizando-se títulos iguais ou superiores a 1/80. Essas diferenças devem-se ao faro de que os crês testes identificam painéis de epicopos apenas parcialmente superposcos, de maneira que o soro de um determinado paciente com AR pode reagir com um, dois ou os crês testes. A prevalência desses auro-anticorpos também aumenta com a idade, porém o número de falso-positivos em idosos é bem menor que o descriro com o faror reumatóide. As duas pnncipa1s vantagens desses crês testes antipeptídeos citrulinados são sua alta especificidade e sua precocidade de aparecimento. A literatura ainda é controversa sobre uma possível associação dos anticorpos anti peptfdeos citrulinados e a gravidade da AR. O anti-Sa, um anticorpo direcionado contra uma proteína ciu uhnada de SOkDa encontrada no baço e placenta humanos. está presente em cerca de 40% dos pacientes com AR. Também apresenta alta especificidade para essa doença. Contudo, as dificuldades merodológicas do método e sua baixa sensibilidade têm impedido sua utilização em larga escala na prática clínica.
Anticorpos antinúcleo
Os anticorpos antinúcleo (ANA) são uma das características sorológiCas das doenças reumáticas autoimunes, principalmente o lúpus eritemaroso sistémico, a síndrome de Sjogren e a esclerose sistémica. Na AR, são encontrados em cerca de 20 a 30% dos pacientes, geralmente em títulos baixos ou moderados. Em algumas Situações, a presença de ANA na AR deve-se à síndrome de Sjogren secundária ou à síndrome de Felty associada. Alguns anticorpos di recionados contra antígenos nucleares, como o anti-RA33. parecem cer alguma relevância para a patogénese e diagnóstiCO da AR. Esses anticorpos reagem com proteínas associadas ao RNA mensageiro imaturo (hnRNA) e foram originalmente identificados em cerca de um terço dos pacientes com AR. Entretanto, apresentam especificidade inferior à dos anticorpos amipeptídeos citrulinados para o diagnóstico de AR, podendo ser encontrados em outras doenças reumáticas, como o lúpus eriremacoso sistémico e a doença mista do tecido conjuntivo. A pesquisa de anticor-
Investigação laboratorial do paciente com artrite reumatóide
pos anti-RA33, habitualmente, não faz parte da rotina para diagnóstico e avaliação de pacientes com AR.
EXAMES LABORATORIAIS NO MO NITORAMENTO DA AR AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INFLAMATÓRIA Os exames de velocidade de hemossedimentação (VHS), proteína C reativa (PCR) e hemograma são os mais utilizados na prática clínica para a avaliação de ativldade de doença na AR. Como descrito anteriormente, de um modo geral. os pacientes com doença em acividade apresentam provas de arividade inflamatória alteradas, anemia normocícica normocrômica ou hipocrômica, podendo-se observar ainda crombocitose e eosinofilia. No entanto, vale lembrar que até 40% desses pacientes podem apresentar exames de VHS e PCR normais. Sendo assim, a avaliação de atividade de doença nesses casos deve incorporar, além de parâmetros laboratoriais, cuidadosa avaliação de parâmetros clínicos, como a presença de rigidez matinal, dor articular em repouso e à movimentação, presença de edema articular e limitação da am plitude de movimentos das articulações. Vários índices foram elaborados para a avaliação da atividade de doença em pacientes com AR. uma vez que. até o momento, não existe uma única medida que reflita de mane1ra adequada o status da doença. (Quadro 58. 4). Os mais utilizados acualmente são o ACR Core Data Sete o Disease Acttvity Score (DAS). Inicialmente, esses índices foram elaborados para serem utilizados como medidas de avaliação em ensaios clínicos de novas terapêuticas para a AR, mas progressivamente têm sido Incorporados por muitos especialistas na rotina de avaliação de pacientes com AR, sendo possível o acesso pela lmernet (www.das.org).
MON ITO RAMENTO DA TERAPÊUTICA NA AR Sendo a AR uma doença crônica de controle muitas vezes difícil, que exige o uso de mais de um medicamento, é preciso estar atento quanto aos efeitos colaterais das drogas e interações medicamentosas. Fazem parte do arsenal de medicamentos disponíveis para tratamento da
723
AR os corricosreróides, amiinflamarórios não esteróides (AINEs) e várias drogas modificadoras de doença. enue as quais os antimaláricos, a sulfassalazina. o mewuexato, os sais de ouro, o leflunomide, a ciclosporina e os agentes biológicos (antiTNF e inibidores de IL-1). Quadro 58.4 - fndices de avaliação do scacus de aciv1dade
da artrite reumatóide Índice
Parâmetros utilizados
ACR
n° de articulações dolorosos n° de articulações edemociodos estado global de saúde avaliado pelo médico estado global de saúde avaliado pelo paciente capacidade funcional
dor VHS ou PCR DAS
n° de articulações dolorosos n° de articulações edemociodos estado global de saúde a valiado pelo paciente
SDAI
n° de orhculoções dolorosos n° de articulações edemociodos estado global de saúde avaliado pelo médico estado global de saúde avaliado pelo paciente VHS ou PC R
VHS
São bastante conhecidos os efeiws adversos relacionados ao uso crônico de corticosteróides e AINEs. em especial o dtabetes e a osteoporose induzidos pelos primeiros e a redução da função renal pelos últimos. Em relação às outras medicações utilizadas no tratamento da AR. mUltas delas apresentam como principais efeiws colaterais mielowxicidade e hepawtoxicidade. Portanto, é importante o conhecimento da farmacologta dessas medicações para solicitar os exames adequados a intervalos regulares para o moniwramento seguro dos efetros adversos relacionados à terapêutica na AR.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O grande desafio arual quanto ao manejo da AR reside em realizar o diagnóstico da doença o mais rápido possível. pois existem evidências de que a instituição de tratamento precoce e agressivo melhora a evolução da doença. reduz a velocidade da progressão radiológica e incapacidade funcional. melhorando a qualidade de vida
724 [ Medicina laboracorial para o clínico
dos paciemes. Arualmeme. recomenda-se que rão logo o diagnóstico de AR seja esrabelecido, se inicie tratamento adequado com o uso de drogas modificadoras de doença (DMARDs), uma vez que o dano articular ocorre precocemente, já nos primetros três anos da doença. Existe muita discussão na literatura sobre o desempenho dos critérios de classtficação do ACR de 1987 para o diagnóstico precoce da AR. Apesar de terem sido criados com o propósito de classificação e não de diagnóstico, têm sido largamente utilizados na prática clínica com propósito diagnóstico. Diversos estudos têm demonstrado que a sensibilidade e especificidade dos critérios do ACR para diagnóstico de AR de início recente variam de 83.5 a 90% e de 86 a 90%, respectivamente. Entretanto, Saraux et ai. demonstraram que alguns desses critérios (artnte em mats de três articulações. artnte em pequenas articulações das mãos, artrite simétrica e rigidez matinal). embora muito sensíveis para AR. são pouco específicos; enquanw os outros (nódulos reumatóides e alterações radiológicas típicas) são muiw específicos, mas pouco sensíveis nas fases iniciais da doença. Nesse mesmo estudo. o fawr reumatóide foi o critério ACR que apresentou isoladamente o melhor desempenho e constttuindo-se no critério do ACR com mato r valor predititivo para AR. Ainda assim, o FRé um elemento de pouca especificidade, já que é encontrado com razoável freqüência em diversas condições inflamatórias sistêm icas. Nesse sentido, os anticorpos contra pepcídeos citrulinados apresentam uma de suas melhores propriedades, já que ocorrem quase que exclusivamente na AR. Acualmente, muiw esforço tem sido direcionado para a identificação de fawres prognóstiCOSque auxiliem na diferenciação de quadros de artrite de início recente com potencial de evolução para artropatia erosiva, progressiva e destrutiva, como a AR. daquelas persistentes, mas não erosivas, e/ou de quadros articulares aurolimitados. Entre as variáveis laborawriais estudadas, a presença de fawr reumatóide, de anticorpos antipeptídeos citrulinados, em especial o antiCCP, e de alguns subtipos de HLA DR4 foi associada a maior risco de evolução de artrite persistente e erosiva. Diante dessas considerações, embora o fator reumatóide seja o úntco exame laboratorial incluído nos critérios de classificação do ACR para AR, a pesquisa de anricorpos antipeptídeos citrulinados também pode auxiliar o diagnóstico precoce da AR, sendo especialmente útil na avaliação de casos sugestivos de AR com fawr reumatóide negativo.
Üu(ros famres identificados como de mau prognóstico para a evolução de AR são: maior tempo de duração dos sintomas à época do diagnóstico, presença de erosões em rad ografias de pés e mãos nas fases iniciais da doença. presença de história familiar de AR, início dos sintomas em idade jovem, dor à compressão lateral das metatarsofalangeanas, comprometimento de mãos, níveis educacional e socioeconômico baixos e preenchimento dos critérios do ACR para AR logo no início dos sintomas. A AR é uma doença crónica de alto impacco para o indivíduo e para a sociedade, que requer diagnóstico precoce para o início de terapêutica adequada. As pesquisas em áreas básicas direcionadas ao melhor conhecimento da imunopatologia da AR e os escudos clínico-epidemiológicos podem trazer importantes contribuições para a melhor eficiência do diagnóstico precoce da doença. bem como para a identificação de fatores prognósticos. A incorporação de novas tecnologias à prática clínica para o cuidado de pacientes com ARdeve ser adequadamente analisada. principalmente em relação ao contexto em que sua utilização seja relevante, agregada à avaliação de indicadores que permitam estimar seu impacto na redução da morbimortalidade e dos cusros relacionados à doença em longo prazo. Em relação ao seu diagnóstico, é pertinente ressalcar o limitado papel do laboratório. A pesquisa de FR, que deve ser realizada apenas na avaliação inicial para estabelecer-se o diagnóstico, não se apresenta como um teste útil para triagem. pelo seu baixo valor preditivo negativo. nem para confirmação. pelo seu também baixo valor preditivo positivo. A pesquisa de anticorpos antipeptídeos citrulinados e antifilagrina tem se mostrado promissora para o diagnóstico nas fases iniciais, além de apresentar mais especificidade que o FR. Entre pacientes com poliartrite de início recente, os anticorpos antipeptídos citrul inados apresentam alto valor preditivo positivo para evolução de arrrite reumatóide.
Investigação laboratorial do pacienre com artrite re umatóide
REFERÊNCIAS 1.
2. 3.
4.
5.
6
7.
8.
9.
10.
11.
Aho K, von Essen R, Kurki P. Palosuo T. Heliõvaara M. Annkerann antibody and anriperinuclear factor as markers for sub clin1cal rheumaroid d1sease process. JRheumatol. 1993;20:1278-8. Consenso Brasileiro para o 0 1agnósnco e Tratamento da Artnte Reumatóide. Rev Bras Reumatol. 2002;42:355-61. Hochberg MC Sllman AJ. Smolen JS, We1nblatt ME, We1sman MH. Rheumarology. 3rd ed. Edmburgh: Mosby; 2003. jansen LMA, Schaardenburg DV, Van der Horst-Brulnsma IE. Van de Stadt R). Kon1ng MHMT. Oijkmans BAC. The predictive value of anri-cycl ic mrulhnared pept1de annbodies in early arthriris. J Rheumatol. 2003;30:1691-5. Meyer O, Labarre C Oougados M. Goup1lle P, Canragrel A. Dubois A, et ai. Amimrullinared prorein/pepnde annbody assays in early arrhm1s for pred1wng five year rad1ographic damage. Ann Rheum 01s. 2003;62:120-6. Nonrake D. Colburn K. Chan G. We1sbarr RH. RheumatOid facrors speofiC for awve rheumaro1d arthrms. Ann Rheum 0 1s. 1990;49:910-15. Palosuo l Tilv1s R. Strandberg T. Aho K. F1laggnn related antibodies among the aged. Ann Rheum 01s. 2003;62:261 -3. Saraux A. Berrhelm JM. Chales G. Le Henaff C Thorel JB. Hoang S. er ai. Abiliry of rhe Amencan College of Rheumatology 1987 Criteria to predict rheumatoid arrhrit1s in patiems with early arthrim and classirication of these patients rwo years larer. Arthritls Rheum. 2001;44:2485-91. Saraux A, Berrhelm )M, Oevauchelle V. Bendaoud B. Chales G, Le Henaff C er ai. Value of antibodies to citrulllne-conralnmg pepndes for d1agnos1ng early rheumatoid arrhnris. J Rheumarol. 2003;30:2535-9. Slack SL Mann1k M, Oale BA. 01agnosnc value of antlbodies to filagnn 1n rheumaro1d arrhrms. J Rheumarol. 1998;25:847-51. Van Gaalen FA, L1nn-Rasker SP. van VenroOIJ WJ. de Jong BA. Breedveld FC Verwe J CL et ai. Auroannbodies to cyclic cirrulhnated peptides predict progress1on m rheumamid arthriris in parienrs with undifferentiared arrhritis. A prospecrive cohort srudy. Arthritis Rheum. 2004;50:709-15.
725
59
Rômulo Carvalho Vaz de Mel/o Guilherme Birchal Coi/ares
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DOS MARCADORES TUMORAIS
O organismo humano saudável encomra-se em perfeim estado de equilíbrio emre famres que levam à agressão tecidual e famres de proceção_ O desenvolvimemo de neoplasias é um exemplo de alteração nesse equilíbrio, seja por agressão extensa, deficiência dos mecanismos de proteção ou mesmo soma desses fatores_ O termo câ ncer pode ser definido, de maneira simplificada, como a proliferação anormal de um grupo celular, com crescimemo autónomo e perda da dife renciação celular. Além de ser uma doença de elevada incidência em todo o mundo, o diagnóstico de câncer provoca grande temor, justificado pela alta taxa de mortalidade. Someme em 2002. estima-se que essa enfermidade tenha afetado cerca de 11 milhões de pessoas, causando mais de 6 milhões de mortes. Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer - INCA, estima-se, para o ano de 2008, mais de 467 mil novos casos de câncer no Brasil, sendo a segunda principal causa de morte entre os brasileiros, superado apenas pelas doenças do aparelho circulatório. No sexo masculino, excetuandose os tumores de pele não-melanomas, os mais incidemes são os da próstata, pulmão. estômago e cólon e rem. No sexo feminino, o mais incideme é o da mama, seguido por colo do útero, cólon e reto e pulmão. Em decorrência das diferenças de agressividade e evolução, a mortalidade por câncer não acompanha a incidência dos diferentes tipos de neoplasia. Assim, no sexo masculino, o câncer de pulmão é o responsável pelo maior
número de mortes, seguido por estômago, próstata e esófago. Já no sexo feminino, a mortalidade por câncer é maior nas neoplasias da mama, seguido por pulmão, estômago e cólon e rem. Atualmeme, o câncer é entendido como uma doença multifatorial (Figura 59.1). Vários agentes podem atuar na célula, levando à alteração em seu material genético, o que faz com que essa célu la não mais responda aos sistemas de controle e balanceamento fisiológicos para o grupo celular, passando a multiplicar e dividir-se descontroladamente. Além dism, observa-se, muitas vezes, perda da capacidade de diferenciação dessas células. A grande marca da neoplasia maligna é a mutação do DNA em várias classes de genes, incluindo os promotores do crescimento (oncogenes), os que controlam o crescimento (supressores de tumor) ou, ainda, genes que regulam o apopmse, resultando em expansão clonai da célula. Dietas ricas em gorduras e calorias em detrimento da ingesta de frutas e verduras parecem correlacionar-se com o desenvolvimento de vários tipos de rumores. Várias substâncias classificadas como indutoras já possuem papel definido na gênese de neoplasias. O álcool e o cigarro; agentes químicos, como o asbesto, benzeno e inúmeros outros; agentes infecciosos, como os vírus; e radiação ionizante são alguns dos fatores inducores recon hecidos. t importame lembrar, porém, que o aparecimento de uma neoplasia depende não apenas da presença de agentes indutores, mas, também, da susceptibilidade genética individual.
Fatores Ambienta is
Agentes Qím icos
Predi sposição Genético
Agentes Físicos
Mutação no DNA
Perda do controle e do regulação Proliferação rápido
A lterações na diferenciação celu lar
i Proteínas normais e
Proteínas ca rcinoembrionários e ma rcadores ectápicos
metabálitos
Figura 59:1 - Atuação dos vários fawres de agressão sobre a célula. levando à alteração cenual da neoplasta maligna: a mutação do DNA. Após esse even to, a célula perde seus mecanismos de controle e regulação e segue-se a expansão clonai da célula, com produção de exagerada de metabóliws ou produws celulares fisiológicos ou produção de proreínas anómalas.
O conjunto desses agravos atuando sobre a célula leva a alterações no material genético, traduzido por mutações, translocações e deleções; secreção exagerada de metabólitos fisiologicamente produzidos pela célula; e produção e expressão de moléculas anómalas na superfície celular.
processo de malignidade já se encontra em estado avançado. Portanto, a real utilidade dos marcadores tumo rais atuais encontra-se no monitoramento do cratamenco e na detecção de recidivas.
HISTÓRICO CONCEITO
Segu ndo Tietz, o marcador tumoral ideal seria conceituado como: "substância produzida exclusivamente pelo tumor ou pelo organismo em resposta a ele, específica para um determinado tipo celular, sensível o bastante para permitir o rastreamento e o diagnóstico de pequenas massas tumorais potencialmente curáveis". lnfelizmente, as substâncias disponíveis atualmente para o uso como marcadores tumorais não possuem essas características. Na maioria das vezes, o marcador está presente tanto em tecidos benignos quanto malignos, sem possuir valor de corte claro que permita a distinção entre esses dois tipos de processo. Outras vezes, qua ndo apresentam alteração significativa em sua concentração, o
O primeiro marcador tumoral descrito foi a proteína de Bence-Jones, em 1847. Inicialmente uma descoberta casual, quando o próprio verificou a presença de um precipitado protéico ao aquecer a urina de alguns pacientes, que acabou sendo, posteriormente, identificado como a cadeia leve, monoclonal da imunoglobulina secretada por células tumorais de paciences portadores de mieloma (Tabela 59.1). A partir de 1928, seguiu-se a utilização de enzimas, hormônios e proteínas no diagnóstico de tumores. Porém, somente em 1963 iniciou-se o monitorame nco de tumores por meio de marcadores tumorais pro priamente ditos, com a descoberta da alfafeto proteína por Abelev e do ancígeno carcinoembrionário, em 1965, por Gold e Freeman. O desenvolvimento das técnicas de fabricação
728 [ Medicina laboratorial para o clínico ] f - - - - - -- -- - - - - - -- - -- -- - - - -- - -- - - - -
e manipulação de anricorpos monoclonais possibilirou a detecção de vários outros antígenos protéicos expressos em maior quanttdade em células de linhagem tumoral, como oCA 125. Recentemente, com a disseminação das técnicas de biologia molecular, vários genes relacionados à fisiopacogenia do câncer, como oncogenes e genes supressores tumorais, passaram a ser escudados. constituindo uma nova classe de marcadores tumorais. Tabela 59.1 - H rstónco dos marcadores rumorars
Ano
Autor
Marcador
BAIXA PADRONIZAÇÃO METODOLÓGI CA Apesar dos esforços feitos pelos fabricantes na tentativa de padronizar as dosagens, ainda está longe de ser observada uniformidade nos resultados apresentados quando o mesmo analrro é dosado por mérodos diferentes. Desta forma, resultados obtidos em um laboratório não devem ser comparados com os obtidos em outro, especialmente se os mécodos ou fabricantes dos ensaios forem diferentes. Isto é muito importante quando se está monirorando paciente portador de neoplasia, com um marcador tu moral. Os exames desse indivíduo devem ser realizados sempre no mesmo laboratório. Este, por sua vez, tem obrigação de manter a mesma merodologta em uso por um período de tempo adequado e evenruats trocas devem ser precedidas por validação rigorosa.
1846
H . Bence:lones
Proteína de Bence:]ones
1928
W. H. Brown
Síndrome hormonal eclópico
1930
B. Zondek
hCG
1932
H Cush,ng
ACTH
1949
KOh·Uh
Deleções em ontígenos do grupo sanguíneo
EFEITO GANCHO
1959
C Morken
lsoenzrmos
1963
G . l. Abelev
AFP
1965
P. G old ond S. Freemon
CEA
1969
R. Heubner e G . Todoro
O ncogenes
1975
H
Anticorpos mo noclonors
1980
G Cooper, R. W einberg eM. Bishop
Probes de oncogenes e tronsfecçõo
1985
H Horns. R Sogere A Knudson
Genes supressores
Característica exclusiva dos imunoensaios do tipo "sanduíche" ou não-competitivos. Quando acontece, apesar da amosrra apresentar nível muiro elevado de uma substância, o valor da dosagem está dentro do Intervalo de referência ou muito próximo dele. O analiro é colocado no poço de reação e reage com o anticorpo fixado à fase sólida. Como ele se apresenta em grande concentração, ocorre saturação dos sítios de ligação, permanecendo boa parte das moléculas livres na suspensão. O segundo anticorpo que faz a marcação da ligação entre analito e anticorpo fixado à fase sólida liga-se não neste imunocomplexo, mas nas moléculas que ficaram livres na suspensão. Com a etapa de lavagem, o anticorpo marcado é lavado JUntamente com as moléculas livres, ocasionando resultado falso-negativo. Grande parte dos fabricantes conseguiu di minuir bastante a ocorrência desse efeito em seus ensaios a partir do aumento no número de sítios de ligação. Porém, ainda pode ser encontrado. Suspetta-se de sua ocorrência em paciente com níveis prévios muiro elevados do marcador, mas que na dosagem seguinte passa a apresentar valores normais ou pouco elevados sem que tenha sido realizado procedimento algum para rratamento da neoplasia, que pudesse levar à queda nos níveis do marcador; ou naquele com doença extensa. que seriam esperados níveis bastante elevados. Essa
ohrer e G Milstein
Adaptado de Chan DW. Sell S. Trerz Fundamentais of Chn1cal Chemrsrry 1996:326·3'•0
ASPECTOS METODOLÓGICOS IMPORTANTES
A maioria dos marcadores tumorais utilizados na prática clínica é dosada por imunoensaios. Todo imunoensaio apresenta a mesma base (mecodológica): ligação do antígeno com o anticorpo, variando entre si pela maneira de revelação dessa ligação - substratos quimiluminescentes, enzimáticos, fluorimétricos, etc. É rm portante, portanto, conhecer alguns facores que podem ter influência nessa reação, trazendo problemas na interpretação do resultado.
Investigação laboratorial dos marcadores tumorais
729
suspeita deve ser informada ao laboratório para que as providências necessá rias a fim de evitar esse efeiro possam ser romadas e o resultado ser liberado com segurança (Figura 59.2). b)
a)
•• • •
y y y y y y y
"A
• •••• • y y y ••••••• y y y
+ ;.!
"A "A
"A
y y y y
y
.A .A
"A
.A
•••• y y
+
y
"A "A
•••
;<+
••••••• y y y y y y y
.A
x!! x!x! Figura 59.2 - a) Observa-se reação do tipo "sanduíche" acontecendo de maneira correta. O analito liga-se ao primeiro anticorpo fixado à fase sólida. A segu1r, o segundo anticorpo, marcado, liga-se a um outro sítio antigênico da molécula, formando um imunocomplexo. A etapa de lavagem remove as substâncias não ligadas. A presença do anal iro é revelada pela ação da marcação no substrato; b) Evidência de efeito-gancho: o anticorpo marcado liga-se às moléculas que estão livres na suspensão. A marcação é então lavada. A presença do analiro não é revelada.
ANTICORPOS HETERÓ FILOS
São anticorpos humanos que podem se ligar a proteínas provenientes de animais de outra espécie (hetero - filo). Como nos imunoensaios, são utilizados anticorpos de coelho, camundongos, cabras, etc. para detecção dos analicos. Anticorpos heterófilos podem interferir, ligando-se a esses anticorpos e levando a resultados tanto falso-posit ivos quanto falso-negativos . A presença desses interferentes é mais comum no soro de pessoas que apresentam contam íntimo com animais, como fazendeiros e veterinários, ou naqueles que, devido a alguma situação específica, fizeram uso de soros produzidos com anticorpos de animais. Existem relatos desse tipo de interferência em quase todos os imunoensaios para marcadores tumorais, como PSA, CA 125, tireoglobulina, e, especialmente, na dosagem da gonadotrofina coriônica humana - hCG. São de ocorrência rara, mas não desprezível.
APLICAÇÃO CLÍNICA DOS MARCADORES TUMORAIS RASTREAME NTO Mais da metade das solicitações de testes para marcadores tumorais são feitas com o intuito de rastrear neoplasias. Isto reflete a falta de conhecimento de grande parte dos clínicos a respeito desse tema. A maioria dos marcadores está presente em tecidos sadios e em crescimentos benignos ou malignos. Portanto, nenhum deles possui sensibilidade e especificidade suficientes para ser utilizado no rasueamento. Além disso, soma-se a baixa prevalência individual dos tumores na população geral, o que diminui drasticamente o valor preditivo do teste, constituindo mais um fator contra o uso dos marcadores nesse tipo de abordagem.
DIAGNÓSTICO As baixas sensibilidade e especificidade dos marcadores atuais desencorajam seu uso com esse fim. Podem, contudo, ser utilizados como testes adjuntos no diagnóstico, frente a um paciente com achado ou suspeita clínica bastante significativos. Mesmo neste caso, poucos marcadores possuem valor de corte bem definido que permita a distinção entre tumores benignos e malignos. Contudo, é evidente que quanto maior a concentração sérica do marcador ao diagnóstico, maior a chance de malignidade.
MO NITORAMENTO DE TRATAMENTO Principal utilidade dos marcadores tumorais. Diminuições no volume da massa tumoral geralmente são seguidas por diminuição nos valores do marcador a elas associada. Da mesma forma, os aumentos de volume da massa - progressão da doença - também se associam a elevações nos marcadores. A maioria correlaciona-se bem com a efetividade do tratamento, principalmente cirúrgico. Ausência de queda de um marcador após a realização de tratamento com fins curativos está associada à ressecção incompleta do tumor, recidiva ou presença de metástases.
730 [ Medicina laboratorial para o clínico ]f - - - - - -- -- - -- - -- -- - -- - - -- - - -- - -- -
PaCienres submecidos a cracamenros curacivos devem ser monirorados pela dosagem do marcador associado à neoplasia por ele apresentada. É notória a capacidade que vários marcadores possuem de apresentar elevações em seus níveis bem antes da detecção clínica ou radiológica da recorrência da doença, possibilicando o emprego de terapia adjuvante precocemente - se esta estiver disponível - que pode interferir na sobrevida do paciente.
PROGNÓSTICO Aplicação dos marcadores que vêm aumentando bastante nos últimos anos. Os estudos têm demonstrado forte associação entre níveis elevados dos marcadores e pior prognóstico. Vários protocolos de abordagem de tumores já incluem a dosagem de marcadores ao diagnóstico para estabelecimento do prognóstico e estadiamenco da doença. Apesar disso, poucos aurores recomendam mudanças terapêuticas baseadas em valores alterados dos marcadores tumorais. Mesmo assim, parece ser questão de tempo até que essa prática seja rot1ne1ra.
PRINCIPAIS MARCADORES TUMORAIS DISPONÍVEIS
Várias substâncias podem ser utilizadas como marcadores de wmor. Porém, para a maioria delas faltam estudos que corroborem seu uso e demonstrem os benefíCIOS de sua dosagem para o paciente. Serão abordados. a partir de agora. os marcadores que já atingiram um grau mais elevado de padronização. tanto em relação à sua aplicação clínica quanto à sua interpretação.
ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO - PSA Descoberta por Hara et ai. em 1971, o PSA é uma enzima produzida pelas células epiteliais da próstata, que promove a liquefação do líquido seminal. Foi inicialmente descrito como o protótipo do marcador tumoral ideal: ótima sensibilidade. permitindo seu uso no rastreamento do câncer da próstata, e altamente específico para este tecido. Sabe-se. hoje. porém, que o PSA não é
Investigação laboratorial dos marcadores tumorais
nem rão sensível quanto se pensava, po1s 15 a 20% dos tumores prostáticos não elevam seus níveis, nem tão específico, estando presente em vários outros tecidos do corpo humano, como glândulas uretrais, perianais, mamárias e pancreáticas, tecido pulmonar sadio e endomécrio. Além de escar alcerado em decorrência do carcinoma prostática, pode elevar-se devido a prostarite, infarto prostática, manipulação fís1ca da glândula, ejaculação e hiperplasia prostática benigna. O uso do PSA como marcador tumoral é cercado de controvérsias e incertezas. pnncipalmenre no que tange ao seu uso no rastreamenco em populações assinromáticas. Não existem evidências que comprovem diminuição na mortalidade pelo câncer da próstata secundária a essa prática. Há dois grandes estudos ra ndomizados em andamento, com término prevista para o fim desta década, que talvez possam definir de uma vez se o rasrreamenro deve ou não ser recomendado. Se a resposta for positiva, espera-se ainda que sejam definidos, também, outros pomos: a idade na qual deva ser iniciado, qual o intervalo entre as dosagens e quais os valores de corte apropriados. As respostas atuais a essas questões foram baseadas mais em critérios empíricos do que Científicos. dada à ausência destes nos dias de hoje. A grande dificuldade em se chegar às respostas está relacionada à própria história natural dessa neoplasia. Caracteristicamente, possui elevada prevalência, porém baixa monalidade. Cerca de 50% dos homens acima dos 50 anos apresentam câncer de próstata à biópsia, índ1ce que chega a 70% aos 70 anos. Alguns aurores acreditam que os indivíduos que ainda não apresentaram esse tumor é porque não viveram tempo suficiente para tal. Porém. a imensa maioria desses homens morrerá de outras causas que não o câncer da próstata. Todavia, esses tumores poderão ser detectados pelo rastreamenro e os pacientes poderão sofrer algum t1po de imervenção, trazendo mais malefícios do que o câncer em si. Desta forma. temos. não só no Brasil. mas em rodo o mundo, de um lado InStituições que não recomendam o uso do PSA no rastreamemo de pacientes asslntomátiCOS, como o INCA, e de outro instituições, como a Sooedade Brasileira de Urolog1a, que recomenda rasrreamenro anual a rodos os homens com 1dade acima de 50 anos e abaixo de 70 anos, com expectativa de vida superior a 10 anos. Para os pacientes com risco mais elevado, a idade de início no rastreamenro passa a
731
ser 40 anos. Vale lembrar que a dosagem de PSA, mesmo quando utilizada no rasueamemo de câncer, não substirui o exame de coque retal. O valor de corre para neoplasia é, também, alvo de discussão. Com a utilização de valores acima de 4,0ng/
processo de envelhecimento. A Tabela 59.2 mostra os valores preconizados por alguns autores:
Densidade do PSA
ml, independentemente da raça ou da idade, obrêm-se sensibilidade e especificidade médias de 71 e 75%, respectivamente, alcançando-se valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) de 37 e 91%, respectivamente. Recentemente. vános autores e a Associação Americana de Câncer passaram a recomendar valor de corre de 2.5ng/ml. Com esses níveis, a sensibilidade fica próxima de 90%, porém com queda da especificidade para níveis de 20 a 30%. Na tentativa de melhorar a exatidão do PSA no diagnóstico de malignidade. existem algumas estratégias que podem ser seguidas. Entre elas:
É obtida pela d ivisão do valor numérico da concen-
tração sérica do PSA cotai pelo volume prostática estimado pela ulrra-sonografia trans-retal. Valores superiores a 0.15 são indicativos de câncer de próstata. Essa abordagem possui uso limitado por sofrer variabilidade avaliador-dependente na estimativa do tamanho da próstata, além de aumentar consideravelmente os custos, pela necess1dade da realização da ultra-sonografia. Apresenta desempenho inferior à relação entre PSA livre e PSA rotai.
Velocidade do PSA Valores de referência aj ustados por idade
Partindo do pressuposto de que a diminuição do limite superior do valor de referência pode aumentar a detecção de tumores em pacientes mais jovens nos quais a prostatecromia radical é mais benéfica. a utilização de valores de referência ajustados por idade tem sido preconizada. Essa abordagem leva. ainda. em conSideração a elevação dos valores de PSA decorrentes do aumento no volume da glândula. parte natural do
Avaliação da variação da concentração sénca do PSA total em um determinado período de tempo, em geral um ano. Elevações superiores a 0,75ng/ml/ano são observadas em pacientes com câncer de próstata. Possui também valor prognóstico, abordado mais adiante. Uma variante da velocidade do PSA é o PSA doublmg time, ou seja, o tempo que o PSA leva para dobrar o valor de sua concentração sérica. Valores inferiores a dois anos parecem se correlacionar-se com doença agressiva.
Tabela 59.2 - Valores de referência para PSA ajustados por idade Idade (anos)
MMAS*
Dalkin el o/.
PSA total (ng/ ml)** 40-49
Oesterling e t o/.
Lein e t o/.
2.0
1.75
50-59
284
35
3.0
2 27
60-69
5.87
54
4.0
3.48
70-79
9.03
6.3
5.5
4 26
15.0
12.6
% PSA livre Todos os idades
13.2
• Massachusetts Mole Aging Group ' • L1m1tes suoeriores Adaptado de Bunt1ng OS Chn Ch1m Acta 2002;31).71-91
732 [ Medicina laboratorial para o clínico
)r-- - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
PSA complexado
Consiste na dosagem do PSA ligado à a,antiquimiocripsina. Os estudos sobre seu desempenho diagnóstico são divergentes, uns moscrando desempenho superior, outros inferior e outros, ainda, evidenciando desempenho semelhante quando comparados ao uso da relação entre PSA livre e PSA total, não sendo utilizados com freqüência na prática clín1ca.
Relação entre PSA livre e PSA total
Abordagem mais utilizada na diferenoação entre câncer da próstata e h1perplasia prostática benigna ou prosrarite. A relação é com freqüência mais baixa em pacientes com o carcinoma. Deve ser usada em indivíduos que apresentem níveis de PSA total situados entre 4,0ng/ ml (ou 2.5 ng/ml. como preconizam alguns autores) e IO,Ong/ml, intervalo conhec1do como "zona cinza". Os valores de sensibilidade e especificidade variam rnuiro de acordo com o ponto de corte estabelecido. sendo mais comumente utilizado valor de 0,15 (15%), apresentando sensibilidade e especificidade de 72 e 83% e valores preditivos positivo e negativo de 91 e 56%, respectivamente. No moniroramento do tratamento, o PSA apresenta uso consagrado. Níve1s 1ndetectáveis do marcador devem ser obtidos após prostatecromia radical. Devido à meiaVIda do marcador ser de dois a três dias, seus níveis duas a três semanas após a prostateccomia devem estar abaixo dos limites de detecção metOdológica. já que todo tecido prosrát1co foi retirado. Níve1s elevados após esse período devem ser encarados corno presença de doença residual ou metástases. Geralmente, recomenda-se dosagem trimestral no primeiro ano. quadrimestral no segundo, semestral até o quinto ano e anual após esse período. Não existe consenso, ainda, ern relação ao valor que defina a recorrência bioquírn1ca do rumor. A divergência está entre acima de 0,2ng/ml e acima de 0.4 ng/rn l. Este último é, provavelmente. o mais adequado. pois os rnérodos disponíveis para dosagem do PSA apresentam grande variabilidade para amostras com valores lnfenores a 0.4ng/ml, conforme estudos do Colégio Americano de Patologistas - CAP. O tempo enue elevação dos níveis do PSA e recorrência clínica da doença varia de um a cinco anos.
Investigação laboratorial dos marcadores tumorais
Níveis sencos pré-operatórios de PSA entre 2 e 10ng/rnl não permitem predizer sucesso terapêutico. ramo na prostatecromia radical quanto na terapia com radiação. ou seja. um paciente com níveis séricos de PSA de 2,0ng/rnl possui a mesma chance de cura que outro com nível de lOng/mL. t rara a presença de metástases com valores de PSA aba1xo de 20ng/ml, não sendo recomendado escaneamento ern busca de metástases ósseas. Dificilmente um paciente com níveis pré-operatórios de PSA acima de SOng/mL apresenta doença restrita à próstata. Pacientes com velocidade de PSA superior a 2,0ng/ml por ano antes do diagnóstico apresentam maior mortalidade em relação àqueles com velocidade de PSA 1nferior esse valor. t 1mponame salientar que rodas as solicitações de dosagem do PSA devem estar acompanhadas por exame de urina rotina, visro que infecções do trato urinário podem alterar os valores desse marcador e dificultar a imerpretação dos resultados.
GO NADOTROFINA CORIÕNICA HUMANA, SUBUN IDADE BETA - ~ - H CG Hormônio sintet izado e secretado por células trofoblásticas, é produzido, de forma mais marcante, pela placenra. durante a gravidez. Porém, pode estar elevado em decorrência de outras situações. Como marcador tumoral. apresenta relevância no monitoramento da doença trofoblástica gestaoonal e nos tumores de células germinativas dos testículos. Na doença trofoblástica gestacional. deve ser usado exclusivamenre no moniroramento do tratamento. sendo o mérodo mais confiável no acompanhamento da moléstia. Após o tratamento, as dosagens devem ser real1zadas semanalmente até a negativação, o que ocorre em até oiro semanas em 50% dos casos. Após dois testes negativos, espaçar as dosagens para três em três meses até um ano, quando a paciente é considerada curada. Quaisquer alterações nesse esquema devem ser encaradas como falha terapêutica ou reod1va. Já nos tumores de células germ1nat1vas dos testículos. é recomendada sua avaliação sempre em conjunto com a alfaferoproteína - AFP. São pouco sensíveis para o diagnóstico, apresentando elevação em somente 20% dos pacientes com rumores precoces. Níveis mais elevados
733
são encontrados em estadias mais avançados da doença. Apesar da baixa sensibilidade, podem auxiliar na diferenciação do tipo hisrológico do rumor (Tabela 59. 3). Tabela 59.3 - AFP e ~-hCG nos tumores de células germinativas dos testículos, ao diagnóstico ~-hCG
AFP elevada Não
elevado Pouco
Carcinoma de células embrionários
Sim
Sim
Teratomo
Não
Não
Tumor Seminomo e disgerminomo
Seu uso é imperativo no monitoramemo do tratamento, no qual a resposta à quimioterapia só é aceita quando os níveis se normalizam, sendo recomendada dosagem semanal durante o tratamento. Ausência de queda dos marcadores indica pior prognóstico e a terapia deve ser alterada. Após o tratamento, recomenda-se dosagem mensal no primei ro ano, bimestrais no segundo e terceiro anos e semestrais até o quinto ano. Elevações de ~-hCG ou da AFP geralmente são a primeira evidência da recorrência da doença, sendo recomendado retorno da terapia com base nessa elevação. Pacientes que apresentam níveis de AFP superiores a 10.000ng/ml ou de ~-hCG superiores a SO.OOOUI/ml ao diagnóstico apresentam pior prognóstico, com sobrevida média de 50% em cinco anos.
a- FETOPROTEÍNA -AFP Pertence à classe dos amígenos oncofetais, sendo uma das principais proteínas produzidas pelo feto. Seus níveis começam a declinar com o nascimento, atingindo os níveis de adulw até o fim do segundo ano de vida. Pode estar alterada em decorrência de várias siruações clínicas, como hepatite e cirrose hepática. Utilizada como marcador tumoral para o moniroramento dos tumores de células germinativas dos testículos. como visto anteriormente, e no carcinoma hepatocelular. O rasueamemo do carcinoma hepawcelular por meio da dosagem da AFP na população geral não é recomendado. Apesar disto, em populações com preva-
734 [
lência aumentada alguns estudos mosuaram benefício dessa abordagem. Porém, rodos eles apresentaram metodologia estatística pouco confiável e, portamo, não podem servir como base científica para essa recomendação. Estudos mais bem controlados têm mostrado que a AFP não apresenta valores de sensibilidade, especificidade e preditivos suficientes para ser recomendado como método de triagem para o carcinoma hepatocelular nem mesmo em portadores de condições sabidamente associadas ao desenvolvimento dessa neoplasia, como os hepatopatas crónicos e portadores de hepatites virais crónicas. Para o diagnóstico em casos suspeitos de carcinoma hepatocelular, AFP também apresenta valor limitado. A recomendação é apenas para uso como auxiliar diagnóstico, confirmatório em indivíduos com fawres de risco. portadores de nódulo hepático. Valores elevados de AFP, acima de 100 ou 200ng/ml, nesse tipo de paciente possuem especificidade superior a 95% para o carcinoma hepatocelular. Níveis elevados após procedimento cirúrgico podem indicar ressecção incompleta do rumor ou presença de metástases. Os valores de alfafewproteína não possuem associação com o tipo histológico do tumor, com o seu tamanho ou presença de metástases, não apresentando valor prognóstico.
ANTÍGENO CARCI NOEMBRIONÁRIO - CEA Glicoproteína oncofetal. está expressa de maneira fisiológica na superfície de células mucosas. Níveis pouco elevados do CEA, geralmente até 10ng/m l , podem ser encontrados em várias situações clínicas, como úlcera péptica, doença inflamatória intestinal, pancreatites, cirrose, obstrução biliar e em tabagistas. A superexpressão dessa proteína ocorre na presença de adenocarcinomas diversos, estando elevada em decorrência de neoplasias do colo, rem, estômago e mama, entre outros. Apesar disto, é indicado apenas como marcador no carcinoma coloretal. Como w do marcador tumoral. apresenta sensibilidade baixíssima para essa neoplasia, inferior a 40%, com especificidade de cerca de 85%, principalmente em lesões precoces, não sendo recomendado para o rastreamenw.
Medicina laboratorial para o clínico ]1-- - - - - - - - - -- - -- - -- - -- - -- - - -- - - --
Possui uso limitado para o diagnóstico, não sendo utilizado rotineiramente para esses fins. Todavia, níveis cinco vezes acima do valor de corre em pacientes sintomáticos e com suspeita clínica de câncer são bastante sugestivos, indicando propedêutica complementar investigativa. Cerca de 50% dos pacientes cracados cirurgicamente evoluem para cura. Os níveis do CEA devem recornar aos valores de normalidade entre quatro e seis semanas após a ressecção cirúrgica. Nos pacientes com doença metastática no fígado, é recomendada a solicitação do CEA no pré e pós-operatório, na tentativa de verificar a eficácia do tratamento cirúrgico para remoção dos implantes. O monitoramento do paciente pós-cirúrgico com CEA apresenta sensibilidade de 80% e especificidade de 70% na detecção de recorrências ou merásrases, com tem po médio de cinco meses entre início da elevação e detecção cirúrgica da recorrência. Sugere-se solicitar dosagem do CEA a todos os pacientes candidatos a tratamento cirúrgico. que estejam no estadia 11 ou III da doença. As dosagens devem ser realizadas a cada 2-3 meses após o tratamento, por pelo menos três anos. Após, esse intervalo pode ser espaçado para dosagens semestrais. Apenas elevações acima de 25-30% do valor basal são consideradas significantes. O CCA é considerado faror prognóstico independente da idade, tamanho tumoral e envolvimento nodal. Em pacientes no estadia 11 da doença, cuja terapêutica não está bem estabelecida, valores elevados de CEA indicam pior prognóstico, sugeri ndo a uti lização da quimiOterapia como adjuvante no tratamento desses pacientes.
~ 2 -M I CROG LOBU LI NA - ~2M
Proreína de baixo peso molecular, expressa na superfície da maioria das células nucleadas, relacionada ao antígeno de histocompatibilidade humano - HLA. Liberada na circulação em decorrência do metabolismo das células nucleadas, passa pelos glomérulos e é reabsorvida pelos túbulos renais proximais. Encontra-se alterada em várias situações, como doenças inflamatórias - hepatites, AIOS, lúpus eritematoso sistêmico, art rite reumatóide e doenças que cursam com di minuição da função renal. onde há distúrbios na fil tração glomerular ou da reabsorção tubular. Níveis séricos de ~2M correlacionam-se com arividade de linfócitos, sendo utilizada como marcador de neoplasias linfóides de células B, incluindo as leucemias linfóides
Investigação laboratorial dos marcadores tumorais
crônicas de células B, linfomas não-Hodgkin e o mieloma múltiplo. Nesses casos, seu uso restringe-se ao monitoramento da arividade dessas doenças. É importante lembrar que boa parte dessas neoplasias não produz ~2M (até 10% dos casos de mieloma múlciplo), o que inviabiliza sua utilização nesses casos. Mais recentemente, rem sido apontada como importante faror prognóstico nessas doenças. Nos portadores de mieloma múltiplo, é o principal faror prognóstico, sendo que valores abaixo de 2ng/dl estão associados a bom prognóstico, enquanto valores acima de 6ng/dl estão associados a pior prognóstico. Atenção especial deve ser dispensada à função renal desses pacientes, visto que pode dificultar a interpretação dos resultados.
TIR EOGLOBULINA Glicoproreína produzida pelas células foliculares de rireóide. Encontra-se elevada em qualq uer situação, benigna ou maligna. que leve a aumento da glândula, portanto, não possui valor diagnóstico. É o melhor método para monitoramento de pacientes portadores de carcinomas diferenciados da rireóide submetidos à terapia curativa, com retirada completa da ti reóide. Deve ser lembrado que alguns pacientes são submetidos à tireoidecwmia parcial. com retirada de metade da glândula e, nestes casos, a dosagem da tireoglobulina não deve ser realizada com fins de moniroramento. Após a tireoidectomia total. os pacientes devem apresentar valores inferiores a O,Sng/ml. Níveis elevados da proteína podem indicar a presença de micromerástases, devendo ser considerada terapia adjuvante. No segui mento pós-operatório, qualquer elevação da rireoglobulina deve ser encarada como recidiva e os pacientes devem ser investigados. Apresenta sensibi lidade de 88% e especificidade de 99% na detecção de recorrência. Não apresenta valor prognóstico. Não deve ser utilizada no moniwramento dos carcinomas medulares da tireóide.
CA 15-3 O gene MUC-1 codifica uma glicoproreína que está presente na superfície apical de células epiteliais. principalmente da mama. Pacientes portadores de carcinoma
735
mamário apresentam aumento da expressão dessa proteína, o que leva a aumento nos seus níveis circulantes. Existem dois imunoensaios disponíveis para a dosagem sérica dessa proteína: CA 15-3 e oCA 27.29. De maneira geral, o desempenho deles é equivalente. A escolha entre oCA 15-3 ou CA 27.29 no monicoramento de uma neoplasia mamária deve ser baseada menos no desempenho individual de cada um deles, se é que essa diferença existe, e mais na faci lidade que o clínico rem para fazer uso do marcador, levando em consideração qual deles está disponível e melhor padronizado no laboratório da instituição em que estiver aruando. Em nosso meio, o exame mais comumente utilizado é oCA 15-3. O CA 15-3 apresenta baixa sensibilidade para doença precoce, não sendo indicado para rasrreamento ou diagnóstico. Somente 23% dos pacientes com câncer primário e 69% com câncer metastático apresentam níveis elevados do marcador Além disso, cerca de 5% da população geral também podem apresentar níveis elevados do marcador. Aproximadamente 66% dos pacienres com regressão da doença induzida por quimioterapia apresenram redução dos níveis de CA 15-3; 73% com doença estável mantêm níveis estáveis e 80% com doença progressiva apresentam elevação nos níveis desse marcador. Detecta doença recorrente dois a nove meses ames de haver evidência clínica ou radiológica, com sensibilidade de 67% e especificidade de 92%, em média. Pacientes que recebem tratamento com base exclusivamente na elevação dos níveis de CA 15-3 apresentam maior intervalo enue elevação dos níveis e detecção da doença, em comparação com pacientes que não recebem tratamento algum. Estudos recentes têm mostrado que pacientes com níveis pré-operatórios acima de 30U/L apresenram pior prognóstico, independentemente do tamanho do tumor, envolvimento nodal e idade.
Apresenta, da mesma forma que oCA 15-3, péssimo desempenho no rasrreamenro e diagnóstico do carcinoma mamário, com sensibilidade de cerca de 30% para lesões precoces, desencorajando seu uso com essas finalidades. Existem poucas referências em relação ao uso do CA 27.29 no monitoramento do tratamento, mas alguns estudos têm demo nstrado boas sensibilidade e especificidade na detecção da recorrência, em média cinco meses ames da detecção clínica da mesma.
CA 27.29
CA 125
lmunoensaio que mede a glicoproteína MUC-1 circulante, da mesma forma que oCA 15-3, porém, ligando-se a um sítio diferente na molécula da proteína. Está elevado em vários transtornos benignos da mama, fígado, rim e ovário, porém, na maioria das vezes, com valores inferiores a 100 Ul/ml.
Glicoproceína presente no envelope seroso que recobre os ovários e algumas cavidades do organismo. Alterase em várias situações benignas. como cirrose hepática, hepatite, endometriose, pericardite, gravidez, e malignas, principalmente no câncer do ovário, mas também nos rumores do endométrio, do pâncreas, pulmão e mama.
736 ( Medicina laboratorial para o clínico
CA 19-9
Glicoproteína do tipo mucina, cuja expressão é dependente do produto do gene Lewis, do grupo sangüíneo. Desta forma, os indivíduos que não possuem o antígeno Lewis, aproximadamente 5% da população, também não expressam essa glicoproteína. É produzido por células dos canalículos biliares, fígado, pâncreas, cólon e endoméu io. Altera-se em situações ben ignas envolvendo esses órgãos, como cirrose, colestases, colangites e pancreatites, porém, com níveis que dificilmente ultrapassam 100UI/ml (cerca de três vezes o valor de referência). Utilizado como marcador do carcinoma pancreático e do carcinoma de vias biliares - colangiocarcinoma. O CA 19-9 apresenta sensibilidade e especificidade bastante elevadas na detecção de recorrência do câncer de pâncreas, após tratamento cirúrgico. Níveis pré-cirúrgicos acima do valor de corre - 37UI/ml estão associados à irressecabilidade do tumor. Valores muito elevados associam -se a pior prognóstico. No colangiocarcinoma, valores acima de 100U I/ml possuem sensibi lidade de 60 a 80% no diagnóstico. Valores muito elevados, acima de 1000UI/ml, associam-se fortemente à irressecabilidade do rumor.
Seu uso como marcador tumoral se rescringe ao carcinoma ovariano. A sensibilidade geral para o diagnóstico fica em rorno de 80%, porém é menor que 50% para tumores precoces, no estadia I da doença, o que. somado à ba1xa prevalência da neoplasia, inviabiliza seu uso no ras-
são (proco-oncogenes) para o estado de acivação (ancagenes), estimulando proliferação e divisão celulares. Já os supressores de tumor são genes que inibem a proliferação e multiplicação celular, a partir de vários mecanismos.
creamemo. Além disw, escudos prospeccivos demonscraram não haver redução da mortalidade com essa prática. Grande aplicabil idade no diagnóstico diferencial de massas anexiais palpáveis. Utilizando-se valor de CA 125 de 6SUI/ml, obtêm-se excelentes valores de sensibi lidade, especificidade e preditivos para o carcinoma ovariano, principalmente em mulheres pós-menopausadas. O marcador correlaciona-se com a atividade da doença, sendo, porta nto, excelente ferramenta para o monicoramento do tratamento, orientando a terapêutica. Valores elevados após três ciclos de quimioterapia estão relacionados à resposta ru im e pior prognóstico. Pacientes submetidas a tratamento curativo deve m ser monicoradas através de dosagens de CA 125 trimestrais por dois anos e semestrais após esse período. Elevações do marcador indicam recorrência e nova terapêutica deve ser considerada. Níveis préoperatórios mui to elevados estão associados a menor sobrevida em cinco anos.
MARCADORES GENÉTICOS Nova classe de marcadores tumorais. Começaram a ser mais bem estudados nos últimos anos. Seu uso na prática, além de poder vir a auxiliar no diagnóstico, avaliação do prognóstico e resposta a tratamento, pode determinar, também, mudança no foco da abordagem, passando-se da procura pelo tumor em si ou por suas manifestações para a procura por marcadores de suscetibilidade individual a cercos tipos de tumores, buscando-se, a partir daí, estratégia preventiva. O real valor da maioria desses marcadores ainda não está bem definido na literatura. Vários problemas relacionados à fa lta de padronização das metodologias nos laboratórios e à metodologia estatística util izada nos escudos disponíveis limitam o seu uso rotineiro e a interp retação de seus resultados. Duas classes princi pais de genes estão sendo mais pesquisadas. Os oncogenes são os que sofrem alguma mutação e passam do estado inativo ou de baixa expres-
Investigação laboratorial dos marcadores tumorais
HER-2/neu (c erbB 2) Oncogene que determina a formação de uma proteína ligada à membrana celular, também chamada HER-2/ neu. Ela é expressa fisiologicamente em células epiteliais de vários órgãos, como pulmão, pâncreas, mama e próstata. A superexpressão ou superamplificação do gene HER-2/neu, presente em 25% dos pacientes com câncer de mama, leva ao aumento na densidade da proteína expressa na membrana das células. A HER-2/neu sérica é formada a partir da clivagem do domínio extracelular dessa proteína, sendo lançada na corrente sangüínea como um antígeno, o que possibilita sua detecção por imunoensaios. Ela pode refletir o estado de expressão do gene no rumor. A determinação do status da proteína tecidual HER-2/neu é importante, pois seleciona, entre as mulheres portadoras de carcinoma da mama metastático, as candidatas à terapia com a herceptina, um anncorpo monoclonal que bloqueia essa proteína. Seu uso não está indicado para rastreamento nem para diagnóstico da neoplasia da mama. No moniroramento de tratamento, vários estudos mostram que pacientes com níveis elevados de HER-2/neu sérica apresentam pior resposta à quimioterapia, boa sensibilidade e especificidade na monitorização de recorrência em pacientes positivos pré-tratamento. Pelo menos três estudos, rodos retrospectivos, demonstram pior prognóstico e menos tempo livre de doença em pacientes com níveis elevados de HER-2/neu sérica.
p -53
É um gene que controla a divisão celular, porém pode
perder essa função em decorrência de alguma deleção ou mutação puntiforme. A grande maioria dos cânceres de cólon, mama e pulmão apresenta deleção ou mutação em um alelo desse gene. Apesar desse achado, não se recomenda a pesquisa rotineira de alterações desse gene nessas neoplasias.
737
BRCA1e2
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Aproximadamente 5 a 10% dos cânceres de mama são causados pela mutação em um gene de predisposição a esse câncer. BRCAl e BRCA2 são os mais im-
Os princípios que regem a utilização dos marcadores tumorais na prática clínica são os mesmos para a maioria deles, senão todos, e estão resumidos na Tabela 59.4.
porcames. Mulheres com hiscória familiar de câncer de
Os escudos acuais mosuam não haver benefício no
mama e que carregam esses genes mutados apresentam altíssimo risco de desenvolvimento desse câncer, além do risco de desenvolvimento de câncer de ovário. São, portanto, marcadores de suscetibilidade individual e não marcadores tumorais em si. Sua pesquisa também não está recomendada como rotina e a interpretação de seus resultados gera importantes discussões éticas, devido às medidas a serem recomendadas às pacientes com resultados positivos.
uso dos marcadores no rastreamento de neoplasias na população geral ou em situações específicas e poucos apresentam valor no diagnóstico; e, ainda assim em situações específicas. No momento, a grande utilidade é o monitoramento de tratamento e detecção de recorrência da doença e, para alguns deles, o estabelecimento de prognóstico.
Tabela 59.4 - Principais aplicações dos marcadores tumorais Marcador
Neoplasia
Principais aplicações
PSA
Carcinoma da p rósta ta
Auxiliar diagnóstico - associado ao toque reta! Controle de tra tamento Prognóstico
j3 hCG
Coriocorci noma
Monitora mento do trata mento
Células germinativos dos testículos*
Diagnóstico diferencial do tipo de tumor Monitoramento do tratamento Prognóstico
* associado o AFP
Alfafetoproteíno
Hepatocorcinoma
Auxiliar diagnóstico em pacientes com nódulo hep ático Controle de tratamento
CEA
Carcinoma coloretal
Auxiliar diagnóstico - sintomáticos Monitoramento de tra tamento Fotor prognóstico independente
j32-Microglobulina
linfóides
Monitoromento de tratamento Prognóstico (o principal no mieloma)
Tireoglobulina
Carcinoma medular da tireóide
Monitoramento de tra tamento
CA 15-3
Mamário
Monitoramento de tra tamento Fa tor prognóstico independente
CA 19-9
Pâncrea s
Monitoramento de trota mento Prognóstico
Colangiocarcinomo
Monitoromento de trotamento Prognóstico
Ovários
Auxiliar d iagnóstico em pacientes com ma ssa anexial palpável Monitoromento de tratamento Prognóstico
CA 125
738 ( Medicina laboratorial para o clínico ]1--- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
REFERÊNCIAS Bunr1ng PS. Screening for pros[a[e cancer Wl[h pros[a[e-specifíc amigen: beware [he biases. Clln Ch1m Ac[a. 2002;315:71-91. 2. Chan DW, SeiiS. Tumor Markers. ln: Bur[ÍS CA. Ashwood ER Tie[z Fundamentais of Clínical Chem1my. 4th ed. Philadelphia: W. B. Saunders; 1996:326-40 3. Duffy MJ. Biochemical Markers in Breas[ Cancer: Which ones are clinically useful? Clin Biochem. 2001;34:342-52. 4. Durry MJ. van Dalen A. Haglund C. Hansson L Klapdor R, Lamerz R. e[ ai. Clinícal U[ili[y of Biochemical Markers ln ColoreC[al Cancer: European Group on Tumor Markers (EGTM) Guidelines. Eur J Cancer. 2003;39:718-27. S. Swrgeon C. Prac[ice Guidelines for Tumor Marker Use in [he Chn1c. Chn Chem. 2002;48:1151-9. 1.
Investigação laboratorial dos marcadores [Umorais
6. Trevisani F. D'lmíno PE. Morselle-Laba[e AM, Mazzella G. Accogli E, Caraceni P. e[ ai. Serum a -femprmein for d1agnosis of hepawcelular carc1noma 1n panenrs wi[h chronic hver disease: influence of HbsAg and am1-HCV smus. J Hepaml. 2001;34:570-5. 7. Wu JT. Diagnosis and Managemenr of Cancer Using Serologic Tumor Markers. ln: Henry JB. Clinical Diagnosis and M anagemenr by Laboramry Me[hods. 2oth ed. Philadelphia: W. B. Saunders; 2001 . p. 1028-42.
Sites úteis: • www.inca.gov.br • www.cancer.org
739
Myriam de Siqueira Feitosa Silvana Maria Eloi Santos Vânia Abadia Soares Lino
60
DOSAGEM DE hCG NO DIAGNÓSTICO DA GRAVIDEZ
A gonadotrofina coriônica (hCC), hormônio glicoprotéico (30% de carboidraw) é um heterodímero composw de duas subunidades polipepddicas diferentes ligadas de forma não covalente: alfa (a ) e beta ((3). A subunidade a, codificada por um único gene no cromossoma seis e composca de 92 aminoácidos é a mesma em três hormônios glicoprméicos hipofisárias: FSH (hormônio folículo-estimulante), LH (hormônio luceinizante) e TSH (hormônio tireoestimulante). As propriedades biológicas e imunológicas desses hormônios são determinadas pelas diferenças na seqüência de aminoácidos da subunidade f3 de cada um. Isco é, a cadeia f3 é particular para cada um desses hormônios. Considerando a cadeia f3 do hCG, existe grande semelhança com a subunidade f3 do LH, uma vez que compartilham 97 dos 121 aminoácidos. A região carboxiterminal (C-terminal) é aq uela onde são verificadas as maiores diferenças. Assim, anticorpos desenvolvidos contra o peptídeo C terminal apresentam menor reatividade cruzada com a molécula de LH. Fisiologicamente, é produzido na gravidez, entretantO, situações pacogênicas podem cursar com produção de hCG, como doenças trofoblásticas, nas quais geralmente são encontrados níveis séricos elevados, e em alguns tumores pouco diferenciados, em que se observam concentrações menores. Circula sob diferentes formas moleculares: intactas (hormônio biologicamente ativo); degradadas; parcialmente degradadas; e subunidades livres. Uma forma com moléculas de carboidracos mais complexas ligadas
lateralmente e aos terminais N e O -o hCG hiperglicosilado - é produzida por células trofoblásticas presentes na mola hidatiforme, coriocarcinoma e tumor de células germinativas do testículo.
ASPECTOS RELEVANTES DA PRODUÇÃO DE hCG NA GESTAÇÃO Na gravidez, o hCG é produzido pelas células do sinciciotrofoblasto após nidação do blastocisto, para manter a função secretória do corpo lúteo, essencial na manutenção de níveis elevados de progesterona e estrogênio, garantindo a sustentação da gestação. No início da gravidez normal, o nível sérico de hCG aumenta rapidamente. Após oito a 11 dias da fertilização, pequenas quantidades quanto SmUI/mL podem ser detectadas. Níveis de 25mUI/mL podem ser verificados em cerca de 50% das mulheres no primeiro dia de atraso menstrual. A concentração passa a crescer de forma geométrica, dobrando inicialmente a cada dois a três dias e posteriormente a cada quatro dias, até atingir o pico de mais ou menos 100.000 mU/mL com 10 semanas de gestação. A par tir daí, observa-se queda da concentração de hCG e involução do corpo lúteo. Nesse momento, o tecido trofoblástico da placenta já produz estrógeno e progesterona eficientemente. A concentração de hCG se mantém entre 5.000 e 15.000 mUI/ ml no fim do segundo trimestre. Um segundo pico de
hCG. menor, é descriro na 36a semana, de significado desconhecido. Se essa cinética de produção de hCG não se apresenta, é indicativo de anormalidade. Após o parra de uma gravidez a termo, os níve1s de hCG caem a níveis não detectáveis em aproximadamente duas semanas. (Figura 60.1 e Tabela 60.1) Como o nível de hCG depende da vitalidade placentária, nas gestações anormais e ectópicas a produção de hCG é menor que nas gestações normais. Inversamente, na gravidez gemelar os níveis de hCG estão muiro elevados.
MÉTODOS LABORATORIAIS DE DETECÇÃO DE hCG
Os primeiros métodos de detecção de hCG eram ensaios biológicos baseados na atividade luceotrópica do hCG. Assim, injecava-se urina contendo hCG para induzir corpórea lútea e corpórea hemorrhagica em ovários de camundongos imaturos (teste de Aschheim - Zon-
dek) ou ovulação e formação de corpórea lútea em fêmeas de coelho (teste de Friedman) e/ou expulsão de espermatozóides em sapos machos (reste de Galli Maininl). Esses restes eram trabalhosos, demorados e tinham pouca sensibilidade. tendo sido substituídos pelos imunoensalos. Os métodos em uso podem ser qualitativos (fornecendo resulcados positivos ou negativos) ou quantitativos (com resultados liberados em mUI/mL).
MÉTODOS QUALITATIVOS Entre os qualitativos. os de inibição de aglutinação e hemaglutinação foram usados durante muito tempo. mas já estão obsoletos. Foram substituídos por técnicas mais fáceis e sensíveis, como imunocromawgrafia e aglutinação do látex, que apresentam sensibilidades entre 50 e.200 mUI/mL. Nos métodos de aglutinação. partículas de látex revestidas com anticorpos anti - ~hCG são misturadas com a amostra de urina. Quando a concentração de hCG na
I G ravidez gemelor ou tumor trofoblóstico
I I I
100.000 mUI/ml
I I I I I I
I
!
•• ••
··· · · · 1• trimestre
··· ··· ··· G ravidez ectóp ico ou a bortamento
7' trimestre
3• trimestre
Porto
Figura 60.1 - Representação gráfica da o nénca de valores séricos de hCG encontrados no curso da gravidez. Na linha contínua, estão representados vanação de valores freqüentemente encontrados ao longo da gravtdez normal. A linha traceJada indica cinéttca freqüememente encontrada em gravidez gemelar ou tumores trofoblásttcos. A linha pontilhada mostra valores freqüentemente encontrados na gravtdez ectóptca ou abortamento.
742 [ Medicina laboratorial para o clínico
com anticorpo ami-hCG. Pelas dificuldades inerentes a rodas as reações de RI E, essa metodologia foi substituída por outros imunoensaios, também quantitativos, como a quimiluminescência, nefelometria, imunofluorimerria e ensaios enzimácicos. Testes recentes podem detectar diferentemente as formas moleculares do hCG. Essa é uma das razões para as variações encontradas entre os diversos métodos para dosagem de hCG. Essa variação é menos significativa na gravidez normal, mas pode ser muiw expressiva cm gestações anormais com aborto espontâneo, pré-eclâmpsia, doença crofoblásrica, síndrome de Down e neoplasias do testículo, bexiga ou ovário. Nesses casos, a proporção de moléculas de hCG fragmentadas ou de fração bera livre pode ser muito maior.
amosu a for superior ao li mire de derecção do resre, ocorre aglucinação macroscópica das partículas de lácex (Tesce Positivo). Quando não há hCG na amostra ou a concentração é inferior ao limice de dececção do ceste, não ocorre aglutinação das parcículas de látex (Teste Negativo). Os testes rápidos geralmente empregam método de imunocromarografia com amicorpo monoclonal ami~hCG conjugado com algum marcador cromatográfico, como ouro coloidal. que reage com amostras de soro ou urina. A mistura se move através de uma membrana por ação capilar. As amostras com concentrações superiores ao limite de detecção do método formam uma linha colorida na região onde o imunocomplexo será imobilizado por anti-hCG monoclonal fixado na membrana. Os testes "de farmácia" para diagnóstico de hCG são bastante difundidos. São restes simples e rápidos e usam como metodologia a imunocromatografia ou enzimaimunoensaio. Embora o procedimenw seja simples, os pacientes cometem erros ao fazê-lo, o que prejudica o seu desempenho.
AMOSTRAS BIOLÓGICAS O hCG produzido na placenta circula no plasma e é excretado na urina,. onde predominam os fragmentos ~ e a forma intacra. Assim, os restes podem usar tanto soro quanto urina. A concentração de hCG na primeira urina da manhã, isco é, na urina concentrada, é próxima da concentração sérica. Os testes qualitativos geralmente utilizam urina como amostra. A primeira urina da manhã deve ser sempre a preferida, por apresentar maiores concentrações do hormônio.
MÉTODOS QUANTITATIVOS Dos métodos quantitativos, a reação de radioimunoensaio (RI E) já foi amplamente adorada. Trara-se de uma reação competitiva, na qual o hCG presente no soro e o hCG marcado por radioisótopo competem pela ligação
Tabela 60.1 -Valores esperados de hCG sénco ao longo de gravidez normal (em mUI/mL)
Semanas de gestação
Unidades de hCG
Primeiro d ia do último menstruação
o
Fecundação
2
Implantação
3
o o o
3 l/2
5-50
Primeiro d ia d e atraso menstrual
4
3-400
Soco gestocionol visro ao ulrro-som
5
19 -7000
Pico de hCG
9
25.000- 120.000
Término do primeiro trimestre
13- 16
13.000- 120.000
Segundo trimestre
17-24
4.000 - 80.000
Terceiro trimestre
25-40
3.000 - 60.000
Produção placentá rio d e hCG
Duas semanas após porto
Dosagem de hCG no diagnóstico da gravidez
o
743
Uma amosrra com urina diluída pode apresentar concenuações de hCG menores, faco que assume importância nas primeiras semanas de gestação. quando os níveis sérrcos estão ainda baixos. Para restes quantitativos, util1za-se soro ou plasma. A presença de hemólise, lipemia ou turbidez grosseiras pode interferir nos resultados.
Diagnóstico de morte ovular
Em casos de suspeita de aborto, a curva de hCG deve ser analisada em testes seriados, uma vez que a estabilização ou queda nos níveis séricos é indicativo de morte ovular.
Monitoramento de tratamento e acompanhamento de tumores trofoblásticos e testiculares
INDICAÇÕES
TESTES QUALITAT IVOS DE PESQUISA DE hCG São empregados para o diagnóstico de gravidez, uma vez que a pesquisa de hCG é o melhor parâmeuo laboratorial para esse fim. Ao interpretar um resultado, devem-se levar em consideração dois dados: a sensibil idade do teste empregado e a idade gestacional presumida. Um teste pouco sensível não deve ser utilizado para o diagnóstico de uma gravidez muito inicial. Atualmente com uso de mécodos muito sensíveis. é possível detectar hCG a partir de uma semana após a implantação. Mas, como a maioria dos testes detecta níveis de hCG acima de 25 a 200 mUI/mL. eles devem ser feitos somente a partir do atraso menstrual.
TESTES QUANTITATIVOS DE DOSAGEM DE hCG Algumas situações clínicas demandam conhecer a concentração de hCG, principalmente quando se pretende acompanhar a evolução dos níveis de hCG, seja como indicador da função placentária ou como marcador tumoral.
Na presença de doença uofoblástica gestacional. os níveis de hCG são iguais ou mais altos que aqueles produzidos na gravidez normal. considerando-se a mesma idade gestacional. Usado como marcador tumoral, é capaz de detectar tecido trofoblásrico em arividade (ver capítulo 59). Os ensaios capazes de dosar tanto a molécula de hCG total quanto suas frações livres são os mais indicados na detecção e no monitoramento dessas doenças, já que alguns tumores secretam, além da molécula rotai do hCG, grande quantidade de frações livres. A produção de hCG por carcinomas testicu lares (linhagem germinativa) é altamente representativa da massa tumoral, resultando em níveis marcadamente elevados no sangue e na uri na. Assim, o hCG pode ser adorado como marcador tumoral e. no caso, técn icas que detectam também as frações livres devem ser utilizadas (ver capítulo 59).
INTERPRETAÇÃO
A interpretação do reste vai depender essencialmente da indicação clín1ca e da sensibilidade do teste empregado, pois a presença do hCG não é sinôn1mo de gestação e sua ausência não a exclu1.
Diagnóstico de gravidez ectópica
As concentrações de hCG são tipicamente mais baixas na gravidez ecróp1ca do que na gestação inua-urerina de mesma 1dade. A mudança na velocidade de aumento dos níveis de hCG durante as 10 primeiras semanas é um dos Indicativos de gravidez anormal. Dois terços das paoentes com gravidez ecrópica exibem queda ou estabilização dos níve1s de hCG, quando submetidas a dosagens senadas du rante esse período.
744 [ M edicina laboratorial para o clínico
RESULTADOS FALSO-NEGATIVOS PARA GRAVIDEZ Ocorrem geralmente pela baixa concencração de hCG no soro ou na urina, seja por estágio precoce da gravidez. por déficit na produção (gravidez ectópica, ameaça de abortamento) ou simplesmente pelo emprego de unna diluída. Nessas situações, recomenda-se a repetição do exame, após 2-4 dias.
)r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - -
RESULTADOS FALSO-POSITIVOS PARA GRAVIDEZ
REFERÊNCIAS 1.
Os falso-positivos acontecem principalmente pela presença de hCG produzida por outra situação que não a gravidez. Produção hipofisária de hCG pode acontecer
2.
e níveis abaixo de 5 mUI/mL podem ser encontrados em mulheres não-grávidas. A lém das doenças trofoblásticas
3.
(que produzem altíssimas concentrações de hCG), tumores testiculares de células germinativas dos túbulos
4.
seminíferos, tumor ovariano, tumor de bexiga, carcinomas do pulmão, estômago, pâncreas, fígado e mama podem cursar com níveis detectáveis de hCG.
5.
Outras vezes, os resultados falso-positivos ocorrem devido
à existência de moléculas semelhantes ao hCG,
6.
presentes em associação com cistos de ovário ou doença inflamatória pélvica. Eventualmente, resultados falso-positivos podem ocor-
7.
rer por questões técnicas secundárias a proteinúria ou substâncias interferentes na urina, como drogas, bactérias, leucócitos e hemácias. Anticorpos heterófilos podem interferir
8.
na reação, levando a resultados falsos de níveis persistentemente elevados de hCG no soro. Uma maneira simples
9.
de esclarecimento é pesquisar o hCG na urina, usando um método qualitativo, pois, normalmente, os anticorpos não atravessam o trato urinário, não interferindo no exame.
10.
Surtis CA, Ashwood E 1. R. Bruns DE. Tietz Textbook of Clinical Chemisrry and Molecular Diagnosrics. 4th. ed. St Louis: Elsevier Saunders; 2006. Butler SA. Khanlian SA. Cole LA Detection of early pregnancy forms of human chorionic gonadotropin by home pregnancy test devices. Clin Chem. 2001; 47: 2131-6. Cole LA, Sutton JM, Higgins TN, Cembrowski GS. Between- method variation in human chorionic gonadotropin test resu lts. Clin Chem. 2004: 50: 874-82. Cole LA, Sutton )M. Selecting an appropriate hCG test for managing gestational trophoblastic disease and cancer. J Rep Med. 2004: 49:545 - 53. Cole LA. lmunoassay of human chorionic gonadotropin, its free subunits, and metabolites. Clin Chem. 1997;43:2233-43. Maestá I, Rudge MVC, Passos )RS. Calderon IMP, Carvalho NR. Consonni M. Caracter"sticas das curvas de regressão da gonadotrofina coriônica pós-mola hidatiforme completa. Rev Bras Gin Obst. 2000: 22: 373-80. McPherson RA, Pincus MR. Threatte GA. Woods GL. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st ed. St Louis: Elsevier Saunders; 2007. OIVD: Home an Lab Tests [Home page da internet]. Disponível em: http://www.fda.gov/cdrh/oivd/tips/hcg. html Rormensch S. Cole LA. False diagnosisand needless therapy of presumed malignam disease in women with falsepositive human chorionic gonadotropin concentrations. Lancet. 2000; 355: 712-5. USA Reference Service [H ome Page da internet]. Disponível em: www.hcglab.com
CONSIDERAÇÕES FINAIS A avaliação laboraorial do hCG apresenta ampla aplicação clínica, contudo, a sua principal utilização é no diagnóstico de gravidez, para o qual estão indicados os testes qualitativos. Os testes quantitativos são geralmente empregados para avaliação da função placentária ou como marcador tumoral. É importante reforçar que existe grande diversidade de ensaios disponíveis que usam diferentes preparações de anticorpos, com diferentes pontos de corte e, co11 isto, não é incomum a obtenção de resultados discrepantes em uma mesma amosua, quando dosada em sistemas e/ou laboratórios diferentes. Cabe ao clínico ponderar sobre a situação e decidir por condutas que possam antes esclarecer o caso, sem levar prejuízo ao paciente.
Dosagem de hCG no diagnóst ico da gravidez
745
61
Guilherme Birchal Coi/ares Marília Campos Abreu Marina Rômulo Carvalho Vaz de Mel/o Edgar Nunes de Moraes
PARTICULARIDADES DA MEDICINA LABORATORIAL NO PACIENTE IDOSO
O envelhecimento da população é um fenômeno mundial que acontece tanto nos países desenvolvidos como nos em desenvolvimento. O Brasil passa por um processo de envelhecimento populacional rápido e intenso, ocasionando mudanças importantes no seror saúde. Segundo dados do IBGE, o percentual de idosos dobrou da década de 70 até os dias atuais, subindo de aproximadamente 5% para cerca de 10% da população brasile1ra. o que corresponde a mais de 17 milhões de brasile1ros acima dos 60 anos. Dev1do ao envelhecimento da população e ao aumento de sua expectativa de vida, o SIStema de saúde, público (SUS) e privado. terá que fazer frente à demanda crescente por procedimentos diagnósticos e terapêuticos das doenças crônicodegenerativas. Assim, para atenção adequada ao idoso (2: 60 anos), há necessidade de abordagens diferenciadas relaoonadas a essas afecções. Nesse contexto, os exames complementares, utilizados de maneira racional e interpretados de forma adequada, são ferramentas importantes no auxílio diagnóstico para avaliação do paciente idoso. São freqüentes no 1doso as limitações dos dados obtidos na anamnese e no exame físico, bem como as apresentações atípicas de doenças, o que aumenta a importância dos exames laboratoriais na prática clínica. Entretanto, estes têm caráter complementar e devem ser solicitados apenas com indicação clínica bem definida. A maioria dos valores de referência dos exames laboratoriais é estabelecida a partir de estudos em populações
adultas de 20 a 40 anos de idade. Entretanto. com o envelhecimenro, várias mudanças fisiológicas ocorrem nos diversos sistemas, o que pode refletir ou não nos valores dos exames laboratona1s (Tabela 61.1). Portanto, rorna-se imprescindível a construção de tabelas de valores de referência a partir de estudos feitos com a população idosa. Alguns desses valores já estão definidos, mas muitos ainda estão por definir. Geralmente, há dificuldade para escolha de uma amosrra representativa da população de idosos saudáveis, devido à maior prevalência de doenças subclínicas, à freq üência aumentada de co-morbidades e ao aumento de indivíduos em uso constanre de um ou mais medicamentos nessa faixa etária (polifarmácia). Esses fatores também devem ser cons1derados para adequada interpretação dos resultados de exames laboratoriais em idoso (ver tam bém capítulo 6 - produção de imunoglobulinas pelo idoso).
PARTICULARIDAD ES DE ALGUNS EXAMES
Os exames laboratoriais podem ser utilizados no rastreamento de doenças mais prevalentes na população idosa e no auxílio diagnóstico de doenças em idosos sintomáticos. Para que um exame seja utilizado como rastreamento de doença em assmmmático. é necessário que apresente relação custo-benefício favorável. Para tanto, deve ser direcionado para doenças prevalentes na população idosa, além de ser capaz de apresentar-se ai-
rerado mesmo em paciemes assimomáricos, indicando a possibilidade de doenças cujo prognóstico é melhorado com o tratamento precoce.
--
Nos idosos simomáricos, os exames auxiliam o diagnóstico, devendo ser sempre interpretados a partir da correlação com dados clínicos, levando-se em conta suas
l.1bela 6 1 I Alterações de valores de referência de exames laboratoriais nos paoentes tdosos Analito
Alteração
Acido úrico
Pequeno aumento
Alanina aminotronsferase
Não se altera com o idade
Albumino
Pequeno diminuição
Asportoto ommotronsferose
Não se altero com o idade
B1lirrubino
Não se altera com o idade
Cálcio
Pequeno aumento e diminuição após 90 anos
C leoronce de creolinino
Diminuição de 8ml/min por década de vida
Cloreto
Não se o fero com o ioode
Colesterol total
Aumento de + l mg/ dl o cada ano de vida
Creohnmo
Nao se altero com o idade
Fosfatase alcalina
Aumento de até 30% dos 30 aos 80 anos
Goma glutamil tronspeplldose
N ão se altera com o idade
Glicemio de jejum
Aumento de 2mg/dl por década de vida
HDL
Pecueno aumento
Hemácias
Não se altero com a idade
Hemotócrila
Não se altero com a idade
Hemoglobina
Não se altera com o idade
Leucócitos
Pequena diminUição
Magnésio
Diminuição de olé 15% dos 30 aos 80 anos
PC(n
Não se altera com o idade
PH
N ão se altera com o idade
Plaquetas
Não se altero com o idade
p02
Diminuição de até 25% dos 30 aos 80 anos
Potássio
Não se altero com o idade
Sódio
Não se altero com o idade
TJ
Pequeno d 1m1nuiçõo Nco se altero com a idade
Triglicérides
Aumento de até 30% dos 30 aos 80 anos
TSH
Nco se altero com a idade
VHS
Aumenta olé 45mm/ h
Vitamino B12
N ão se altero com o idade
Fonte: modificado Bridgen ML. Heathcote JC. Problems in inrerpreting laboratory reses. Posrgrad Med 2000; 107:145-61.
748
Medicina laboratorial para o clínico
limitações e possíveis farores interferentes, mais comuns na população idosa. A seguir são descritas particularidades sobre as indicações e interpretação de alguns exames para a população idosa.
HEMOGRAMA Os valores da contagem de hemácias (Hm), hemoglobina (Hb), hematócmo (Ht), volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) não se alteram com a idade, a não ser por um ligeiro aumento de VCM após os 80 anos de idade. Recentemente, estudos americanos relataram prevalência de anemia em 11% dos homens (Hb < 13 g/ dL) e 10,2% das mulheres (Hb < 12 g/dL) entre 65 e 85 anos e 20% naqueles com mais de 85 anos. Entretanto, o achado de anemia é freqüentemente subestimado e não recebe a dev1da atenção, apesar da sua associação com aumento da morbidade e mortalidade em idosos. Assim, o encont ro de anemia deve sempre ser investigado, não existindo, portanto, a chamada "anemia fisiológica do 1doso" ou "anemia da senescência". O envelhecimento é acom panhado por alterações qualitativas e quantitativas na hemaropoese. tais como: redução média na concentração das células da medula óssea e na produção do fator hematopoético de crescimento e dimmuição na sensibilidade para erirropoetina. A reserva func1onal da medula torna-se reduzida e favorece o aparecimento da anemia decorrente de diversas afecções. Dados de um estudo americano mostraram três causas para a anemia no idoso com freqüência aproximadamente semelhante: a) anemia devido à perda de sangue/deficiências nucncionais (34%); b) anem1as associadas à doença crônica/inflamação ou insuficiência renal crônica (32%); c) anemias não explicadas (34%). No idoso, é importante a distinção entre anemia causada pela perda de sangue/deficiência de ferro e anemia de doença crônica. Para mais detalhes remeter-se ao capítulo específico (Capítulo 23). A presença de macrocicose (VCM > 95 fL), mesmo isoladamente, deve ser sempre investigada e as causas mais comuns são: medicamentos, alcoolismo, hiporireoidismo, mielodisplasia e deficiência de vitamina B12 e /ou ácido fálico. Na presença de VCM > 100 fL. a prevalência
Parti cula rid ad es da Medicina Laboracorial no pacienre idoso
de defioência de vitamina B12 e /ou ácido fá lico é bastante aumentada. Com o envelhecimento, ocorre discreta redução da contagem rotai de leucóciros, principalmente pela diminuição da conragem de linfóciros. Os valores de referência considerados são de 3.000 a 9.000 leucóciros/mm 3 lsro é importante porque, apesar da menor freqüência de leucocitose em resposta à 1nfecção, o que 1mpl1ca em menor sensibilidade do exame, uma contagem elevada de leucócitos está relacionada ao aumento da mortalidade. Não ocorrem mudanças significativas na contagem de plaquetas com o envelhecimento.
VITAMINA Bn E ÁCIDO FÓLICO O rasrreamento da defic1ência da Vl[am1na B12 em idosos é importante e justificado não só pela sua prevalência (5% a 43%), como pela existência da "janela terapêutica curta" para a reversão das complicações. Assim. o verdadeiro desafio é diagnosticar a deficiência da vitamina B11 no estadia pré-clínico, quando o tratamento pode prevenir as conseqüências desse quadro (Tabela 61.2). A abordagem diagnóstica do paciente com suspeita de deficiência de cobalamina requer duas determinações distintas: a demonstração da existência da deficiência e identificação da sua causa. A determinação da concentração sérica da vitamina B12 é o exame inicial a ser realizado para rastreamento dessa deficiência. A disponibilidade, baixo custo e familiaridade com os vários mécodos de dosagem contri buem para seu emprego na avaliação do status da vitamina 812 . O limite inferior do valor de referência para a dosagem sérica da vitamina B 2 é variável e dependente do método usado. Consideram-se. em adultos e de modo geral. 200pg/ml como ponto de corte para a dosagem da vitamina B1r Esse valor foi derivado de vários estudos nos quais os pacientes tinham deficiência da vitamina B11 definida por critérios clínicos e hemarológicos quando comparados com controles normais. Porém, resultados de diversos estudos clínicos mostraram que, em idosos, esse valor apresenta limitações tanto na sensibilidade como na especificidade para a determinação dessa deficiência, subestimando sua freqüência. A especificidade da concentração sérica reduzida da vitamina B12 é variável na determinação dessa deficiên-
749
cia. É considerada muito específica (90% de especificidade) para concentração sérica da vitamina B12 menor que 100pg/ml. Porém, apresenta valor discriminatório pobre para concentrações séricas entre 100 e 200 pg/ml e também entre 200 e 350 pg/ml. Assim, baseado em estudos com indicadores mais sensíveis na avaliação da deficiência da vitamina B12 (homocisteína e ácido metilmalônico) e no desaparecimento das suas alterações metabólicas depois do tratamento, foi sugerido. em idosos, o valor de 350pg/ml como ponto de corte para identificar os casos não reconhecidos de deficiência presumível. Esse valor é utilizado pela maioria dos pesquisadores nos diversos estudos que abordam essa deficiência. Contudo. alguns autores uti lizam, para esse grupo erário, o valor ~ 300pg/ml para a deficiência da vitamina B12 . Deve ser lembrado que a deficiência de
ácido fólico pode causar níveis séricos reduzidos (falsopositivos) da vitamina B,2. Um estudo mostrou que um terço dos pacientes com deficiência de ácido fólico tinha a dosagem da vitamina B11 reduzida, alguns com níveis séricos < 100pg/ml que retornaram ao normal com uso do folato. Assim, é importante que as duas vitaminas sejam dosadas em cada paciente suspeito de ter deficiência de vitam ina B12 ou de folato. Os vários fluxogramas existentes aconselham as dosagens da homocisteína, do ácido metilmalônico ou ambos quando as concentrações séricas estão entre 200 e 300 pg/ml. A utilização da homoCisteína e ácido menlmalônico, tndicadores mais sensíveis na avaliação da deficiência da vitamina B12, pode ajudar, principalmente, no diagnóstico dos estadias subclínicos. Em um estudo de pacientes com deficiência de vitamina B12• a dosagem da
Tabela 61.2 - Comparação entre as deficiênoas clínica e subclínica da v1tam1na B·.
Sinais C línicos e Sintomas
Níveis de v1lomino 8 ,
Deficiência "Clínico"
Deficiência "Subclínico"
Presentes lpor definiçã o!. mos - nem todo manifestação !neurológico ou hemo tológico) aparece em cada paciente - monifesroções podem ser leves
Ausentes !por def1niçãol. mo s: · alguns poc1entes podem ler alterações no eletrofis1ologio neurológico
J- em 9 7% d os casos: <
H :<
200 pg/ ml
100 pg/ ml
· Usualmente t r. · Presença do :01x0 250 350 pg/ml
normol·reduzrdo
Anormalidades metabólicos
- Presente em 99% dos ca sos i tHcy em 96% . > 50 ~Jmol/l i N\MA em 98%: > 1.0J.Imol/l
- Presença de pelo menos uma alteração lpor definição): i tHcy: 15 o 25 f.lmoi/L ou i MMA: 0.3-0,8 ~Jmol/l
C ousas do deficiência
Identificados no moiono d os casos mol·obsorção do vitamino B•? livre
· Não 1denl1f1codos em aproximadamente 50% dos ca sos · mol·obsorção do vitamino 8 ? ligado ao o l1mento 130-40% d os casos)
Evolução
- Progressivo em todos os casos: levo anos poro aparecer - p rogressão mais rápido quando sintomas surgem
- Desconhecido; lento !muitos onosl · a ssinlomálica em alguns pacientes por > 1O anos, até aparecimento dos alterações b ioquímicos · progressão mais rápido com moi-a bsorção do vitamino 8:2 livre
M anuseio
· Avaliação drognóslrco · Intervenção te1opêulico
· Avol1oção dro gnó strco Intervenção leropêuloco rndivíduol
Frequência
· lnfreqüente, mesmo no idoso: < 10% dos níveis reduzidos de vitamino 8 2 são a ssocia dos com sinais clínicos do defic iência
· Presente em 10-20% dos id osos: · 70% com níveis reduzidos de 812 · 30% com níveis normol·reduzidos d e 8 2
l reduzida; U , muitO reduzida; tHcy, homocisteína rotai; MMA. ácido metilmalón1co: i. aumentada Valor de referênoa para homoosteína: > 15].Jmol Fonte: modificado de Carmel R, Rosenblatt DS. Watk1ns D. Update on cobalam1n. folate and homcysce1ne. ASH.Hematology 2003: 63-81.
750 ( Medicina laboratorial para o clínico
homocisteína mosrrou sensibilidade de 95,9%. Também a homocisteína é marcador sensível para a deficiência de ácido fólico e vitamina B6. A insuficiência renal pode aumentar os níveis de homocisteína, embora as elevações sejam mais modestas que aq uela causada pela deficiência da vitamina B1r O ácido metilmalônico é marcador sensível e específico para a defiCiência da Vl[amina 812. A vitamina B12 pode apresentar-se com níveis acima do valor superior de referência (às vezes até 10 vezes esse valor). Um valor elevado pode ser considerado marcador de alro risco de mortalidade em idosos. Emre as causas dessa alteração têm-se: doenças hemarológicas (leucemia mielóide crônica, policitemia vera, mielofi brose, leucemia mieloblástica, sínd rome hipereosinofílica e outras), doenças hepáticas (hepatite aguda, cirrose hepática, carcinoma hepacocelular, metástases), presença de anticorpos ancicranscobalamina 11 e uso de preparações com essa vitamina. Em relação ao ácido fól ico, a era pós-fortificação ou enriquecimento das farin has e grãos com essa substância tem alterado sua prevalência em vários países do mundo. No Brasil, a fortificação das farinhas de trigo e mil ho está sendo feita desde dezembro de 2002. Para idosos, o pomo de corte para deficiência de ácido fólico não difere do estabelecido(< 3 ng/mL).
GLICEMIA
Os níveis de glicemia de jejum estão apenas pouco aumentados na população idosa. Esse aumento é de cerca de 2mg/dLa cada década, atingi ndo no máximo um valor elevado em 5 a 10mg/dL. Quamo ao teste de rolerância à glicose, há aumenro mais significativo de seus valores com o avançar da idade (cerca de 5 a 13mg/dL a cada década de vida). Não se sabe ao cerco se esse aumenro significaria doença ou apenas parte do processo natu ral de envelhecimento. Para o diag nóstico de diabetes melito, os mesmos critérios são usados ta nto para pacientes jovens como para idosos. Assi m, valores de glicemia (medida em qualquer momento) acima de 200mg/dl e de glicemia de jejum acima de 126mg/dL são utilizados para o diagnóstico. Em caso de dúvida diagnóstica, pode-se fazer o teste oral de rolerâ ncia à glicose (TOTG). Valores acima de 200mg/dL na segu nda hora após inges-
Particularidades da Medicina Laboratorial no paciente idoso
tão de 75g de glicose anidra confirmam o diagnóstico (ver capítu lo 36). É recomendada a realização de testes de glicemia de jejum a cada três a cinco anos para todas as pessoas acima de 45 anos de idade e mais freqüente nos casos em que houver outros fatores de risco associados, tais como: história familiar, excesso de peso, sedentarismo, HDL baixo, hipertensão arterial, diabetes gestacional prévio ou uso de medicação hiperglicemiante (por ex.: corticoste róides, tiazídicos e/ ou beta-bloqueadores).
GLICO HEMOGLOBI NA
A utilização da glicohemoglobi na para diagnóstico e rastreamento de diabetes melito ainda não está estabelecida. Sendo assim, o exame deve ser usado apenas para o controle da doença. Não há consenso entre os vários autores no que diz respeito às variações da glicohemoglobina com a idade. Alguns afirmam não haver alterações, enquanto outros relatam aumento, principalmente após a menopa usa. As comparações emre os diversos trabalhos se to rnam difíceis em decorrência dos vários métodos empregados para a dosagem da glicohemoglobina. Porém, atualmeme, não há evidências claras de que a idade altere a relação entre glicohemoglobina e a média de glicose sanguínea. As recomendações atuais não consideram a idade na interpretação dos resultados da glicohemoglobina e os valores de referência não se alteram com o avançar da idade.
COLESTE ROL E T RIGLICÉRID ES
Há elevação na taxa de colesterol total de cerca de 1mg/dL a cada ano com o au menro da idade. No homem, esse aumemo ocorre após a terceira década de vida e o colesterol atinge seu valor máximo em corno dos 50-60 anos. Nas mulheres. o aumemo ocorre principalmente após a menopausa e pode ultrapassar os valores dos homens. Alguns autores relatam que esse aumento se deve mais ao estilo de vida dos idosos americanos do que à idade por si só, baseando-se no fato de que os níveis de colesterol total não se alteram com
751
a idade em estudos em populações de baixo risco para doença coronariana. Quanto às frações do colesterol, o HDL-colesterol se mantém estável ou aumenta com a idade. Esse aumento é bastante variável. princi palmente após os 80 anos. Já o LDLcolesterol aumema cerca de 1,4mg/dl ao ano dos 20 aos 70 anos de idade. Os u iglicérides também estão aumentados entre os 60-90 anos. mas diminuem após os 90 anos, provavelmente devido à diminuição de sua absorção. Colesterol rotai aumentado e HDL baixo estão associados a maior risco de doença coronariana em qualquer idade. Como o colesterol tem seus valores reduzidos em reações de fase aguda. valores baixos podem estar associados a doenças sistêmicas e a maior mortalidade na população idosa.
ÍONS Os valores de sódio, potássio e cloreto no idoso saudável são semelhantes aos encontrados em adultos jovens. Apesar disso, os mecanismos reguladores do equilíbrio hidroelerrolítico sofrem mudanças com a idade, principalmente devido à deterioração da função renal. Assim, qualquer situação de estresse a que o paciente idoso é submetido, pode resultar em desvios nesse equilíbrio, o que torna importante mais atenção e atuação do médico no sentido de prevenir possíveis complicações. O nível sénco de cálcio total aumenta nos indivíduos entre 60 e 90 anos de idade e diminui entre os 90 e 100 anos. Essa diminuição relaciona-se à menor conversão de vitamina D em 1,25 diidroxivitamina D3e. conseqüentemente. menos absorção Intestinal de cálcio. O cálcio iônico deve ser dosado diretamente. O cálculo indireto a partir dos níveis de cálcio total e albumina não é fidedigno devido às variações que podem ocorrer nos valores da albumina em diversas situações no idoso. Não há alteração relacionada à idade ou à menopausa em relação aos níveis de cálcio iônico.
TESTES DE FUNÇÃO RENAL já está bem estabelecido que após a quarta década de vida há diminuição no fluxo plasmático renal,
752
Medicina laboratorial para o clínico
na taxa de filtração glomerular e nas capacidades de excreção e reabsorção renal. Aliado a isso, podem estar presemes processos que aceleram a deterioração da função renal. como a aterosclerose, a hipertensão arterial sistêmica. o diabetes meliro e a exposição a medicamentos nefrotóxicos. Os valores de uréia aumentam sign ificarivameme com a idade. Independentemente da idade, não é um bom teste para avaliar a função renal. isoladamente. pois sofre influência de diversos fatores, como dieta, estado de hidratação e balanço entre anabolismo e catabolismo. Os níveis de crearin1na podem não sofrer alterações significativas com o envelhecimento, já que há redução concomitante da taxa de filtração glomerular e da produção de creatinina. Esta última é di retamenre proporcional à massa muscular, geralmente diminuída no idoso. Assim, enquanto um valor de creatinina sérica de 1mg/dl em um adulto jovem s1gnifica. em média, depuração de 120ml/ m1n, esse mesmo valor em um 1doso com arrof1a muscular pode representar aproximadamente 60ml/min. Após a quarta década de vida, ocorre perda linear de 8ml/min x 1.73m 2 I década na depuração plasmática de creatinina. Sendo assim, o valor médio do clearance aos 85 anos de idade é de 60ml/min x 1.73m2• podendo chegar a 25ml!min x 1.73m 2 em condições normais. Portanto o clearance de creatinina é o melhor método para a avaliação da função renal. t im portante, no manuseio do idoso. a detecção de insuficiência renal em pacientes com crearinina sérica normal porque o ritmo de filtração glomerular reduzido está associado a maior risco de efeitos adversos dos medicamentos. Porém, existem dificuldades para a realização desse reste em idosos, principalmente devido à necessidade de colheita do volume urinário de 24 horas, que pode ser prejudicada por diversos farores como alterações cognitivas ou incontinência urinária, entre outros. A fim de solucionar essa dificuldade, foram propostas várias fórm ulas para a estimativa do clearance de creatinina utilizando a concentração de crearini na plasmática. Entre essas, as fórmulas de Cockcrojt e Gault (1974) e MDRD (Modijication oj Oiet in Renal Disease) fornecem a melhor estimativa e são recomendadas para a medida do ritmo de filtração glomerular em idosos. A fórmula de de Cockcroft e Gault (1974) é mais difundida e mais fácil de ser usada, com menos complexidade, do que a fórmula MDRD.
Fórmula de
Cockcroft e Gault:
Clearence de Creatinina
(140 - idade) x peso em Kg 72 x creotinina (mg/ dl)
* Para mulheres multiplica-se o resultado por 0 ,85
Fórmula MDRD
RFG (ml/min) = 186 x [crealinina (mg/ dl)]-1- 15 4 X
idade.0·203 x 0 ,7 42 (se mulher) x 1,2 1O (se negro)
Ambas as fórmulas apresentam limitações, podendo subestimar ou superestimar o rirmo de filtração glomerular. Apesar das limitações, fornecem melhor informação sobre a função renal do que a dosagem da creacinina isoladamente. Na presença de problemas que cornem impossível a realização da medida direra do rirmo de filtração glomerular, a fórmula de Cockcrofr e Gaulr deve ser a preferida. A fórmula MDRD deve ser usada quando não estiver disponível a informação sobre o peso, podendo ser uma vantagem para a estimativa do rirmo de filtração glomerular em pacientes acamados.
TESTES DE FUNÇÃO HEPÁTICA Com o envelhecimento, ocorrem diminuição no número de heparóciws e algumas alterações morfológicas sugestivas de hiperfunção nas células remanescentes. Assim, a homeoscase normal é mantida, o que faz com que as provas de função hepática permaneçam inalceradas. Apesar disso, fica faci litada a diminuição da função hepática em decorrência de sobrecarga relacionada a diversas doenças ou ao uso de medicamentos. Deste modo, os valores de referência de aminouansferases, bilirrubinas, tempo de protrombina e gamagluramiluanspepridase não se alceram com o envelhecimento.
FOSFATASE ALCALI NA Valores elevados de fosfatase alcalina se relacionam a doença hepática ou óssea em qualquer idade. Acontece
Particularidades da Medicina Laboratoria l no paciente idoso
que cerca de 10% da população idosa apresentam níveis de fosfatase alcalina elevados. Na maioria desses casos (90%), existe associação com afecções hepatobiliares, ósseas (ru mores, hiperparatiroidismo, doença de Pager óssea, fratura óssea em processo de cura, osteomalácia e osteodiscrofia renal) e alguns medicamentos (narcóticos)_ Os demais (aproximadamente 1% da população coral de idosos) apresenta aumento inespecífico da fosfatase alcalina. Portanto, aumentos discrews em pacientes assintomáricos não necessitam de propedêutica mais extensa_ Nos casos sintomáticos ou de elevação moderada da fosfatase alcalina, está indicada investigação mais cuidadosa. A dosagem de gamaglucamiluansferase (Gama GT) pode auxiliar na investigação da causa de elevação da fosfatase alcalina e eleva-se juntamente com a fosfatase alcalina em lesões hepacobiliares e não em doenças ósseas.
PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Nos idosos sadios ocorrem alterações pouco significativas nas proteínas plasmáticas com o envelhecimento. Há decréscimo gradual da concentração da al bumina em homens e mulheres, porém sua dosagem continua dentro da faixa de referência. A posição recumbenre pode causar queda de até O,Sg/dl na albumina sérica de alguns indivíduos devido à redistribuição de fl uidos. A redução da albumina pode ser relacionada às seguintes condições: infecções crônicas, hepawparias e/ou má nutrição. A albumina tem demonstrado utilidade como medida inespecífica de prognóstico na comunidade. Dosagem de albumina abaixo de 3,5g/dl foi preditor significativo de limitação funcional e declínio na saúde. Assim, mais recentemente, a albumina está sendo utilizada como marcador inespecífico de doença em idosos e rem mostrado superioridade em relação ao VHS e à proteína C reariva. Há escudos demonstrando que valores de albumina abaixo de 3,3g/dl estão relacionados a maior mortalidade e pior prognóstico de doenças em pacientes idosos. Outros escudos mostraram que a hipoalbuminemia no idoso relaciona-se melhor com os marcadores de fase aguda do que com a desnutrição. Com o envelhecimento, as globulinas podem apresentar elevação com aumento de lgA e lgG ou, também, não mostrar alterações significativas. Em relação à lgM, pode ocorrer queda ou, ainda, não apresentar alteração.
753
PROTEÍNA C REATIVA (PCR)
AUTO-ANTICORPOS
Também tem menor valor em paoemes 1dosos devido à inexistência de valores de referênoa bem estabeleCIdos. presença do "fenômeno do iceberg" (co-morbidades oculcas) e afecções freqüemes, como infecção unnária, que podem alterar seus valores e dificultar o d1agnóst1co de doenças mais graves. Apenas 1 a 2% dos paciemes com 1nfecções bacterianas apresentam valores de PCR demro da referência. portamo, possui bom valor pred1t1vo negativo nesses casos. A PCRé mais sensível que a VHS como marcador de fase aguda e valores muito elevados estão relacionados a p1or prognóstico em doenças agudas.
Grupo de exames cuJO número de soliotações rem aumentado bastante nos últimos anos e. infelizmente. para investigação de pacientes de qualquer faixa etána com quadros inespecíficos e vagos como anralgias ou anemias. No 1doso. essa sohmação pode ser a1nda ma1s danosa, v1sto que a presença de auto-anticorpos. fenômeno comum a rodos os seres. atinge níveis altíssimos. o que dificulta a interpretação do resultado. Cerca de 40% das pessoas acima de 70 anos têm presença de fawr reumatóide e 15 a 20% possuem reatividade para a pesqu1sa de auw-ant1corpos (FAN), principalmente mulheres, sem que isto esteja relacionado a qualquer doença. A maiona, todavia, apresenta níveis baixos. próx1mos dos valores de corte. Desta forma, a soliCItação desses testes deve estar fundamentada em suspe1ta clín1ca e os resultados analisados em conjunto, somando-se os critérios para o estabeleomento do d1agnóst1co.
VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) ~ um marcador 1nespecífico de doença. Tem valor discutível em pessoas idosas. pois os valores de referênCia não esrão bem defin1dos e seu aumento pode ocorrer dev1do a 1nfecções maparemes. espeoalmeme do trato urináno e a outros fatores como anem1a e hlpoalbuminemia, comuns nessa faixa etária. Além disso, o aumento da VHS pode ocorrer devido a alterações benignas de proteínas plasmáticas. Vale ressaltar que, atualmente, a VHS tem poucas indicações clínicas precisas como ferramenta de diagnóstico (por ex: polimialgia reumática e artente temporal) e que. como marcador de fase aguda. tem s1do substituída por testes de melhor desempenho, como a dosagem de proteína C reativa. A veloc1dade de hemossedimentação aumenta significativamente com a idade. Pode ser considerado. em méd1a, cerca de 0,8Smm/h para cada cinco anos de aumento. Existem divergências na literatura em relação aos valores de referênoa da VHS para o 1doso. Alguns pesquisadores encontraram valores médios de VHS de cerca de 30mm/h para mulheres e 20 mm/h para homens. Ourros encontraram números bem mais baixos (10-14mm/h). Quanto ao limite superior de referência da VHS. também ex1srem d1scordânoas nos d1versos estudos. Alguns trabalhos relatam valores mais ba1xos (19mm/h para homens e 23mm/h para mulheres acima de 90 anos) e outros mais altos (30mm/h para homens e 36mm/h para mulheres). Apesar desses números, foram encontrados. em idosos saudáveis de 70 a 89 anos acompanhados por três a 11 anos. valores acima de 69mm/h.
754 ( Medicina labora torial para o clínico
TSH Com o envelhecimento. os valores de referênoa de TSH e T4permanecem inalterados, enquanto T3 apresenta-se um pouco diminuído (principalmente após os 90 anos de idade). Várias mudanças nesses valores podem ocorrer devido ao uso de medicamentos ou às doenças próprias da 1dade. A prevalênCia de h1pomeo1d1smo subclímco (TSH aumentado e T, l1vre normal) é elevada nos 1dosos. pnnopalmente nas mulheres. Esse fato isolado Já poderia justificar o rastreamento por meio do TSH. Nos casos de hiporireo1d1smo subclínico, é possível. a1nda. dosar antiCOrpo antitireoperox1dase (antl - TPO) que. estando presente, indica chances de 5% ao ano de evolução para h1pomeo1d1smo franco, na ausência de tratamento. Outro fator a ser cons1derado é que a doença meo1diana no 1doso se apresenta, muitas vezes, com sintomas 1nespecíflcos e a dosagem de TSH é o melhor método diagnóstico. ~ Importante ressaltar que paoenres com doença aguda não-meoidiana podem apresentar valores alterados de TSH. Nestes casos, o teste deve ser repet1do após a resolução do quadro. Além disso. uma série de medicamentos pode alterar os resultados de TSH. o que torna importante uma avaliação amda mais critenosa dos resultados (ver capítulo específico).
MARCADORES TUMO RAIS
URI NA ROTINA
Com o progredir da idade, o desenvolvi menw de neoplasias se rorna mais comum e, na maioria das vezes, ocorre de forma insidiosa. Desta forma, o rasrreamenco dessas malignidades é feiro de forma rotineira na população idosa. Apesar da solicitação freqüeme de dosagens de marcadores cumorais com este intUIW, nenhuma das substâncias utilizadas arualmente apresenta sensibilidade e especificidade suficientes para permitir o rameamemo e o diagnóstico de pequenas massas tumorais, potencialmente curáveis. Somente alguns deles apresentam valor no diagnóstico, codavia, sempre apoiados em achados importantes da anamnese ou do exame fís1co. A principal uril1dade dos marcadores está no monitoramento do rraramenco. Pacientes submetidos à terapia curativa devem apresentar diminuição nos valores do marcador ou até mesmo negarivação. Podem permitir, também, a busca por recidivas ou metástases. Além disto, alguns deles são bons marcadores de prognóstico. Informações mais detalhadas sobre as utilidades clínicas dos marcadores cu morais estão descritas no capículo 59.
Não ocorrem alterações significativas com a idade, mas a interpretação deve ser distinta devido à diferença de prevalência de cerras doenças no idoso. Na ausência deglicosúria, não se deve excluir odiabe[es meliro, pois há mais reabsorção renal de glicose no 1doso. A proteinúna pode estar preseme devido à contaminação da uri na ou ao uso de fármacos. Em caso de proteinúria superior a 3,0 g/24h, deve-se suspeitar de amiloidose ou neoplasia, que são as causas secundárias mais comuns de síndrome nefrótica no idoso. Como a obtenção de urina de 24 horas pode estar dificultada no idoso. pode ser usado o índice proreína/crearinina em amostras simples de urina. Índices proteína/creatinina superiores a 3,0 relacionam-se à proremúria maior que 3.5g/24h, enquanto índ1ces menores que 0,2 ind1cam proteinúria insignificante. Pode ocorrer leucocitúria assincomárica devido ao uso de fármacos, vagmite, isquem1a renal ou tuberculose renal. Neste último caso há, geralmente, associação com hemarúria. A bacreriúria assincomática também pode estar presence, sendo que em 35 a 79% dos idosos não há relação com a leucocitúria. O tratamento da bacreriúria assintomárica do idoso não apresenta efeico benéfico, podendo levar a aumenco de resistência bactenana.
PESQUISA DE SANGUE OCU LTO NAS FEZES
A pesquisa de sangue oculco nas fezes é recomendada como método de rasrreamento do carcinoma colo-recai nos Estados Unidos desde 1995, em virtude de alguns escudos terem demonstrado diminuição na mortalidade por essa neoplasia a partir da realização anual do teste. Apesar dessa redução, ainda está em debate o custo-benefício dessa abordagem freme a métodos invasivos, como a colonoscopia e a rewss1gmo1doscop1a. Existem dois méwdos pnncipais para realização do exame. O mais comum é o do guaiaco, baseado na atividade "peroxidase-like" do grupo heme da hemoglobina. Sofre influência da alimentação, necessitando de dieta específica para sua realização. Já os méwdos imunológicos base1am-se na ligação de um anticorpo à hemoglobina humana, apresentando melhores índices de sensibilidade e especificidade que o guaiaco, além de apresentar mais adesão do paciente, pelo faco de não precisar de dieta prévia à coleta. São recomendadas pelo menos três amostras consecutivas devido ao faro do câncer apresentar sangramenco intermitente.
Par tic ular idades da M ed icina Lab o ratorial no paciente idoso
REFERÊNCIAS Brigden M, Heathcore JC. Problems in interpreting laborarory rests. What do unexpected results mean? Post grad Med. 2000;107(7):151-8. 2. Cavalten TA, Chopra A, Bryman PN. When out s1de the norm 1s normal: interpreting lab data in the aged. Genatncs. 1992;47(5):66-70. 3 Chanopadhyay I. Measunng renal funcnon 111 old age. Rev Clin Geronrol. 2003;13:297·302. 4. Fabri RMA. Alterações laboraror1a1s no idoso. Gerontologia. 1993;1(3):109·113. 5. Kaferz K. Blood rem 1n elderly people and rhe1r 1nterpre· rarion. Rev in Clin Gerontol. 1998;8:305-18 6. Kafetz K. Laboratory tesrs in older people: an updare Rev Clin Geromol. 2003,13:273·82. 7. Maclennon WJ. Unnary t racr infecnons in older patients. Rev Clin Geronrol. 2003;13:119-27. 8. O'Neill PA. Ag1ng Homeosras1s. Rev Clin Geronrol.
1.
1997;7:199-211. 9.
Roch man H. Problems 1n chemical pathology Interpreta· rions in the elderly. Rev Cli n Geronrol. 1995;5:165-78. 10. W 1nder A. Managemenr of lip1ds 1n the elderly. J R Soe Med Soe Med. 1998;1:189·91.
755
Eugênia Ribeiro Va/adares
62
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DO PACIENTES COM ERRO INATO DO METABOLISMO
Os erros inatos do metabolismo representam uma categoria hecerogênea de doenças genéricas causadas por deficiências enzimáticas. que isoladamente são raras, mas coletivamente numerosas, com mais de 500 conhecidas. A maioria se manifesta na faixa etária pediátrica e representa causa relevante de morbidade e mortalidade. Para a doença tratável, o objetivo principal da intervenção terapêutica é o reconhecimento precoce seguido prontamente pelo tratamento. visando a impedir os danos neurológicos progressivos e os altos índices de morbidade e mortalidade. A apresentação clínica e a época de início dos sintomas são muito variáveis. A possibilidade de tratamento eficaz fez com que doenças como a fenilceronúria e algumas outras fossem pesquisadas em triagem neonatal desde a década de 1960. lnicialmeme, o método de Guthrie foi usado para o diagnóstiCO de aminoacidopatias, com teste específico realizado separadameme para cada doença. Ma1s recentemente, a triagem neonatal que usa a espectrometria de massa em tandem (MS/MS) permite detectar mais de 40 doenças metabólicas por meio da análise de aminoácidos e acilcarnitinas em uma única gota de sangue coletado em papel-filtro. A análise de aminoácidos possibilita o diagnóstico das aminoacidopatias e dos defeitos do metabolismo do ciclo da uréia. O perfil de acilcarnitlnas permite diagnosticar mais de 20 doenças. dos grupos das acidemias orgânicas e dos defeitos de oxidação de ácidos graxos. Além disso, este método pode ser útil
para o diagnóstico retrospectivo de pacientes que morreram por razões não esclarecidas. A eficácia do tratamento da doença de Gaucher tipo adulto com reposição enzimática abri u um novo horizonte para o tratamento de outras doenças lisossomais. como mucopolissacaridoses (MPS) tipo I, 11 e VI e doença de Fabry, repercutindo no maior interesse pelo diagnóstico laboratorial que confirma a doença. O diagnóstico exaro propicia também o aconselhamento genético, o diagnóstico pré-natal e a identificação de heterozigotos. Na sua grande maioria, as deficiências enzimáticas são herdadas de forma aurossômica recessiva, exceto a MPS tipo 11 e a doença de Fabry, que têm herança ligada ao cromossoma X. Duas perguntas são fundamentais no estudo dos erros inatos do metabolismo: quando suspeitar e quais exames complementares devemos solicitar. Os exames laboratoriais iniciais podem falhar, mas se houver force suspeita clínica. deve-se avançar na propedêutica mais específica.
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS GERAIS
A história clínica é fundamental. Na anamnese, observa-se a época de início dos sintomas, identifica-se se há caráter crónico e progressivo ou se o quadro clínico é de doença aguda fulminante, forma mais freqüence em recém-nascidos. t importante a história familiar de consangüinidade entre os pais, de irmãos falecidos no período
neonatal ou de morte súbita ou, ainda. de casos semelhantes na famíl ia. Os pacientes nascem norma1s e malformações congênitas em geral não estão relacionadas. Nos erros 1naws do metabolismo, de modo geral, os pacientes não apresentam malformações. Emretamo, alterações dismórficas congênitas podem ser observadas em algumas doenças dos peroxissomos (síndrome de Zellweger), na acidem1a glutárica tipo 11, na síndrome de Smith-Lemli-Opitz e em algumas doenças miwcondriais. Alrerações físicas surgindo após alguns meses de vida e progredindo com a evolução da doença, como fácies grosseira e alterações esqueléticas do tipo "disostos1s multiplex", são a chave para a suspeita clínica específica das mucopolissacandoses e de algumas oligossacaridoses.
b)
APRESENTAÇÃO ClÍNICA NO PERÍODO NEONATAL Nesta fase predominam os defeitos no metabolismo de moléculas pequenas, como erros inams do metabolismo de aminoácidos, ácidos orgânicos, carboidratos ou do ciclo da uréia. Assim sendo, a deficiência enzimática pode se manifestar clinicamente como quadro de "intoxicação" ou "déficit" energético ou, ainda, como disfunção hepática (Saudubray et ai., 1991). Além destas três formas clássicas de manifestação, acrescentam-se os quadros de convulsões em recémnasodo aparentemente bem e as doenças que causam dismorfismos. como algumas lisossomais, peroxissomais e a síndrome de Smith-Lemli-Opitz. a) "intoxicação": o acúmulo dos metabólitos que estão antes do bloqueio enzimático leva à intoxicação aguda ou gradualmente progressiva. Os sintomas surgem depois de um intervalo assimomátiCO de horas ou semanas após o nascimento e se assemelham aos da sepsis: sucção débil. vômitos, letargia/coma, hiperronia. convulsões, icterícia. Não há melhora do quadro com a terapêutica habitual para sepsis. O quadro piora com a alimentação e melhora com exsanguíneotransfusão ou diálise peritoneal. Achados laboratoriais inespecíficos freqüentes são acidose, cetose e hiperamonemia. Fazem parte deste grupo as aminoacidopat1as (doença do xarope de bordo leucinose, tirosinemia), as acidúrias orgânicas, os defeitos do ciclo da uréia e as intolerâncias a açú-
758
Medicina laboratorial para o clínico
c)
d)
e)
cares (galacrosemia, frurosemia). Nestes casos, o tratamento de longo prazo, se possível, consiste na resrrição dietética dos metabóliros excess1vos; "déficit energético": a sintomacologia advém do déficit dos metabólitos envolvidos na transferência de energia, freqüentemente sem intervalo assintomático. O quadro clínico é marcado por hi poronia muscular grave, piora rápida do quadro neurológico, cardiomiopatia h1pertrófica. colapso circulatório e também possíveis dismorfismos. Morre súbita do lactente pode ser manifestação tardia. Aodose lácnca é achado laboraronal freqüente. Deficiência de piruvarodesidrogenase, deficiência de piruvarocarboxilase, mirocondrioparias, doenças dos peroxissomos e distúrbios de oxidação de ácidos graxas fazem parte desse grupo. O tratamento, se possível, consiste na reposição dos metabólicos deficientes; disfunção hepática: o recém-nascido evolui com heparomegalia, hipoglicemia, provas de função hepátiCa alteradas e coagulação sanguínea alterada. Exemplos: distúrbios da gliconeogênese, glicogenose tipo I ou III, galacrosem1a, frurosemia (se a dieta contém frucose), tirosinemia ripo I, deficiência de alfa-1-antitri psina; convulsões em recém-nascido aparentemente bem: afastadas as causas freqüentes de convulsão metabólica no recém-nasodo (hipogl1cemia, h1pomagnesem1a, hipocalcem1a). está 1nd1cado o tratamento de prova com 100 mg de p1ndoxina (vitamina B6) venosa. Se as convulsões cessarem, o diagnóstico provável é de dependênCia de pindoxina, doença autossômico-recessiva rara. A piridoxlna é co-fawr para a produção de GABA. neurorransmissor 1nibidor essenoal no córtex cerebral. Outra doença que se manifesta com convulsões no recém-nasc1do é a deficiência de co-fator de molibdênio, suspeitada pelo baixo nível plasmátiCO de ácido úrico, mesmo na ausência de dlsmorfismos e luxação do cristalino; recém-nascido dismórfico: alguns erros inatos do metabolismo causam dismorf1smos congênlms. Fácies grosseira, hipem ofia geng1val, heparoesplenomegalia e hidropisia fetal podem ser manifestações de doenças lisossomais, como a mucolipidose I (sialidose). a mucolip1dose 11 (/-ce/1
disease) e mucopolissacaridose VIl. Hipoconia de nuca, fontanelas amplas, prega simiesca e cistos renais estão associados a doenças dos peroxissomos, como a síndrome de Zellweger e a adrenoleucodistrofia neonatal. A síndrome de Smith-Lemli-Opitz, caracterizada por dismorfismos faciais (ptose palpebral, microcefalia, epicanto interno, narinas antevertidas, fenda palatina, micrognatia), hi pospádia, cardiopatia e sindactilia de segundo e terceiro artelhos, é um erro inaw da biossíntese de colesterol, com níveis baixos de colesterol plasmático e acúmulo do precursor do colesterol, o 7-dehidrocolesterol. Pacientes com acidúria glutárica tipo 11 têm fenótipo característico, com fronte alta, hipertelorismo, implantação baixa de orelhas, defeitos da parede abdominal, rins volumosos, hipospádias e pés wrtos. Algumas acidúrias orgânicas estão associadas a dismorfismos; na deficiência de piruvawdesidrogenase (PDH) os dismorfismos são semelhantes aos da síndrome fetal alcoólica. Pacientes com hiperglicinemia não cetótica freqüentemente apresentam agenesia do corpo caloso e defeitos da migração neuronal. Agenesia do corpo caloso é também vista na deficiência de PDH. A doença de Menkes, erro inato do metabolismo de cobre de herança ligada ao X, é caracterizada por dismorfismos, hipopigmentação e cabelos com "pi/i torti".
no exame físico comple~o e o padrão de envolvimento orgânico são fundamentais para se resrringir o especrro de possíveis diagnósticos, possibilitando a solicitação de exames laboracoriais mais direcionados. A sintomacologia, entretanto, também pode ser a descrita no período neonatal, associada a erros inaws do metabolismo intermediário e ao déficit energético, man ifestando-se como ataques recorrentes de coma metabólico, neurológico e/ou hepático, letargia, ataxia e Sintomas psiquiátricos (alucinações, delírio, agressividade, agitação, quadro semelhante ao da esquizofrenia). Convulsões no lactente jovem devem ser abordadas como já descritas anteriormente em "convulsões no recém-nascido aparentemente bem", incluindo aqui a possibilidade de hi poglicorraquia (doença de De vivo).
LABORATÓRIO
Os testes iniciais são usados para identificar metabólicos anormais. É fundamental informar ao laboratório a idade e o quadro clínico do paciente e também a medicação em uso.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL NO PERÍODO NEONATAL Os exames laboracoriais podem ser solicitados em etapas.
APRESENTAÇÃO ClÍNICA NO LACTENTE E NA CRIANÇA MAIOR Exames de primeira linha
Nesta fase predominam os defeitos no metabolismo de moléculas complexas, como as doenças de depósito lisossomal e doenças dos peroxissomos. Estes erros inatos que se manifestam clinicamente com curso crônico e progressivo, com sintomatologia multissistêmica, atingindo tecidos e órgãos (fígado, baço, medula óssea e encéfalo) nos quais os substratos (glicogênio, lipídeos complexos, mucopolissacarídeos) que não podem ser degradados se depositam. Neste grupo, os sintomas clínicos podem ser permanentes e não se relacionam com fases catabólicas agudas ou alimentação. Avaliações clínica, neurológica, oftalmológica e auditiva dos pacientes são geralmente necessárias. A história clínica, os achados
• gasomerria, HC03. glicose. ionograma. ácido úrico plasmático (convulsões no recém-nascido aparentemente bem); • urina: testes de triagem metabólica simples* (açúcares, aminoácidos, ceconas); • testes de função renal; • testes de função hepática; • propedêutica completa para afastar sepsis e hemorragia intracran iana no recém-nascido: hemograma, hemocultura, exames do líquor (rotina e cultura). exames de urina (rotina e cultura), Rx do tórax. ultra-sonografia uansfontanela.
Investigação laborato rial do pacientes com erro in ato do metabo lism o
759
Alterações sugestivas de erro inam do metabolismo nos exames de primeira linha são: acidose metabólica. anion-gap elevado e hipoglicemia. Cemnúria no recém nascido é sempre sugestiva de erro inaro do metabolismo. Alterações na triagem metabólica simples na urina devem ser investigadas. Panciropenia. neuuopenia. plaquempenia podem ser devidas a acidúrias orgânicas, o que pode ser confundido com sepsis. Baixo nível plasmático de ácido úrico pode estar relacionado à deficiência do co-fator molibdênio.
Exames de segunda linha
Devem ser solicitados caso o paciente não esteja apresentando melhora clínica com o tratamento para sepsis ou caso haja alterações nos exames de primeira lin ha. • sangue: amônia e lactato (colher o sangue sem ga rrotear, tra nsportá-lo em gelo e realizar o exame imediatamente}; • sangue e urina: cromamgrafla de aminoácidos (urina fresca ou congelada); • urina: cromatografia de carboidrams. Hiperamonêmia, acidose láctica e padrões anormais nas cromatografias de am inoácidos e de carboidratos começam a defi nir os possíveis erros do metabolismo. Nas infecções e na hipóxia há elevação de lactaro, mas não há cetose. Hiperamonêmia pode ocorrer nos defeitos do ciclo da uréia, nas acidúrias orgânicas. na insuficiência hepática grave, na hioeramonêm1a transitória e na atividade muscular aumentada (ex: pós-convulsão). São suspeitos de erros inatos do metabolismo níveis acima de 200 IJmoiJL no recém-nascido e acima de 100 IJmoi/Lapós o período neonatal. Falsas elevações de amónia são freqüentes e devem ser sempre confirmadas em nova amostra. Acidose lática pode ocorrer nas acidúrias orgânicas. nos defeitos do ciclo da uréia (especialmente citrulinemia), nos defeitos de ox1dação dos ácidos graxos, nas doenças de metabolismo de glicogênio hepático. nos defeicos da gliconeogênese hepática. nos defeitos da oxidação de lacrato-piruvato, do complexo piruvato-desidrogenase ou do ciclo de Krebs e ainda nas deficiências de atividade de um dos componentes da cadeia respiratória.
Exames de terceira linha
• sangue: análise quantitativa de am1noácidos e perfil de acilcarnitinas; • urina: análise quantitativa de ácidos orgânicos na urina (cromamgrafia gasosa/ especrromeuia de massa). Estes exames são solicitados de acordo com alterações específicas encontradas nos exames de segunda linha. A espectrometria de massa Tandem. pouco disponível no nosso meio. detecta aminoacidopatias, acidúrias orgânicas e defeitOs da beta-oxidação mirocondrial de ácidos graxos em sangue coletado em papel-filtro e é o método mais amplo de detecção de doenças metabólicas em triagem neonatal (Tabela 62.3). Alguns serviços recomendam que assim que houver suspeita clínica, ou seja, na fase crítica da sintomatologia, deve-se coletar e congelar a urina, plasma heparinizado (2 a S mL) e. se possível, líquor (0.5 a 1 mL) do paciente suspeito em -20"C e aguardar a evolução do caso. Posteriormente, caso não haja melhora efet1va do quadro clínico. fazem-se análises de segunda e/ou tercei ra linha destes materiais. que refletem o estado metabólico agudo do pacienre. Em caso de êxitO letal agudo. pode-se coletar urina por punção suprapúbica.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL NO LACTENTE E NA CRIANÇA MAIOR No lactente e na criança maior, além dos exames citados para investigação laboracorial do recém-nascido. solicita-se uma triagem mais abrangente ou mais específica, conforme a avaliação clínica. 1. Testes simples de triagem metabólica urinária; 2. Análise de am inoácidos no sangue (plasma ou soro) e/ou urina (Tabela 62.1); 3. Cromatografia de glicídios; 4. Análise quantitativa de ácidos orgânicos na urina (Tabela 62.2); S. Cromacografia ou eletroforese de mucopolissacarídeos na urina; 6. Atividades enzimáticas específicas para doenças lisossomais em leucóciros ou sangue em papelfiltro (Tabela 62.5);
7. Ácidos graxas de cadeia muiro longa no plasma para doenças peroxissomais (Tabela 62.4); 8. Carnitina total e perfil de acilcarnitinas no soro ou sangue em papel-fil tro em caso de suspeita de defeiros da beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxas (especuomerria de massa Tandem) - (Tabela 62.3); 9. lsoelerrofocalização de transferrinas séricas em caso de suspeita de CDG (defeims congênims da gl1colização); 10. Atividade da biocinidase no sangue em caso de suspeita de deficiência de biocinidase. O quadro clínico da deficiência de biocinidase é variável; classicamente se manifesta por volta de seis semanas de vida, com letargia, ataxia, convulsões, surdez, alopecia, lesões de pele eczema ró ides, acidose metabólica e acidose lática; 11. Cobre sérico e urinário e ceruloplasmina sérica quando houver suspeita de doença de Wilson ou doença de Menkes; 12. Ácido úrico plasmático em caso suspe1to de doença de Lesch-Nyhan; 13. CreatinioqUinase (CK) em caso suspeitO de mioparia; 14. Atividade de galacrose-cransferase e ep1merase no sangue, se houver suspeita de galacmsemia; 15. Pesquisa de porfinnas na urina, se houver suspeita de porfina.
EXAMES lABORATORIAIS UTiliZADOS NO DIAGNÓSTICO DOS ERROS INATOS DO METABOliSMO TESTES SIMPLES DE TRIAGEM METABÓLICA URINÁRI A Alguns metabóliros urinários reagem com soluções específicas, alterando a cor da urina. Esces restes simples na urina são úteis para pequenos laboratórios e para países onde técn1cas mais sofisticadas não estão disponíveis. Alguns são inespecíficos, mas um resultado positivo fornecerá subsídios para a realização de exames mais específicos. A análise inicia-se pela cor e pelo cheiro da urina. A presença de eriuócitos, hemoglobina, porfirinas e algumas drogas na unna deixam sua cor avermelhada, en-
quanw o ácido homogentís1co, eliminado em grandes quantidades na alcapconúna. a de1xa azul/marrom. O cheiro de urina deram sugere fenilcemnúria, o cheiro de xarope de bordo ou de açúcar queimado é nocado na leucinose e o cheiro de pé suado na acidemia isovalérica ou acidem1a glurárica ripo 11. As reações qualitativas na urina são: • teste do cloreto férrico: ad1cionam-se algumas gocas de FeCI3 5 a 10% em pequeno volume de urina. Se a reação resultar em cor azul-verde, deve-se suspeitar de fen ilceronúria, histidinemia, tirosinemia tipos I e 11 e alcaptonúria, além de feocromocimma. A cor cinza-esverdeado aparece na leuCinose. Outros compostOs também reagem. como fenociazinas resulcando em cor púrpura ou verde, salicilams e corpos cetônicos em cor vermelho-púrpura e melanina na cor cinza escuro; • reação da dinitrofenilhidrazina (DNPH): a reação pos1tiva ocorre com 2-oxoácidos, formando hidrazonas que precipitam. t positivo na feni lcetonúria, leucinose, rirosinem1a tipos I e 11 e acidose lática e também quando há ceconúria; • teste do nitrosonaftol: detecta metabóliros da tiresina na urina. Ressalta-se que recém-nascidos freqüentemente apresentam ri rosinemia transitória; • teste do cianeto-nitroprussiato: este reste reage com ácidos sulfurados formando complexos de cor vermelha ou púrpura. É indicado para pacientes que apresentam luxação de cristalino (homocistinúria) ou aqueles com litíase renal recorrente (cistinúria); • teste da p-nitroanilina: detecta a acidemia metilmalônica; • pesquisa de substâncias redutoras na urina (Ciinitest): o reagente de Benedict ou Clinitesc reage com várias substâncias redumras na urina formando complexos de cor verde a laranja. A presença de glicose, galacmse. frumse. xilose. ácido úrico. ácido homogentísico ou ácido ascórbico na unna resulta em exame positivo; • teste do azul de toluidina (Berry-Teste): a reação ocorre com mucopolissacarídeos (glicosaminoglicanos. GAG) na urina. Reações falso-negativas são freqüentes. especialmente na mucopolissacaridose III (síndrome de Sanfillipo) e na mucopolissacaridose IV (síndrome de Morquio) ou quando a
Investigação laboratorial do pacienres com erro inato do metabolismo
761
urina está muiro diluída. Em recém-nascidos este teste é sempre positivo. sem signtficar doença; • teste do brometo de CTMA: reage também semiquantitativamente com mucopolissacarídeos na urina;
ção são as deficiências de acii-CoA desidrogenase de cadeia curta (SCAD). de acii-CoA desidrogenase de cadeia média (MCAD). de acii-CoA desidrogenase de cadeia longa I muito longa. de múltiplas acil CoA desidrogenases (MAO, acidemia glurárica ripo 11). de carnirina pal-
• comburtest • ou similar: pesquisa de pH, prore-
mimil rransferase 11e de 3-0H-acii-CoA desidrogenase
ínas. glicose, corpos cetônicos. urobilinogênio, bilirrubina e sangue na urina. Cetonúria pode estar presente nas ac dúrias prop1ônica e merilmalônica, na def1c1ênoa de 3-oxoriolase e na acidose lática.
de cadeia longa. As acidem ias orgânicas detectáveis pelo método são acidemia propiônica. acidemia isovalérica. acidemia glurárica ripo I, acidemias merilmalônicas. deficiênoa de merilcroronii-CoA carboxilase e deficiência de 3-0 H-3-merilglura rii-CoA liasa. Pesquisa de glicosaminoglicanos (GAGs) unnános: pode ser feita por cromatografia de camada delgada (TLC) ou por eletroforese. Ambas as técnicas separam qualitativamente os GAGs na urina, que são heparansulfaro. dermaransulfaro, condroirinsulfaro e queratansulfato. auxiliando fortemente no diagnóstico das mucopolissacaridoses (Tabela 62.5). Devem ser realizadas quando o teste do azul de toluid1na ou do brometo de CTMA forem positivos ou, ai nda, se houver fo rte suspe1ta cl ínica, mesmo com os ourros exames normais. Pesquisa de gl1cídios unnános: é feita na urina por cromatografia de camada delgada (TLC). A existênoa de galactose ou frurose na urina fornece subsídios para o diagnóstico de galactosemia ou galacmsúria secundária e frurosemia. respectivamente. É realizada quando o chmtest é positivo. Pesquisas de metaból1tos nas doenças dos peroxlssomos: determinação de ácidos graxas de cadeia muito longa no plasma (C26:0), ácido trihidroxicoprostânico (THCA) no plasma, áodo fitân ico no plasma e plasmalógenos em eriuóciros (Tabela 62.4).
ANÁLISE DE METABÓ LITOS Metabólicos específicos são detectados por meio de técnicas de cromatografia. eletroforese ou espectrometria de massa. Anál1se de ammoác1dos: é fei ta em plasma e/ou urina. O mérodo mais básico. semiquantitarivo, é a cromatografia em camada delgada (TLC) para aminoácidos. A análise quantitativa de aminoácidos é feira por cromatografia líquida de alra perfomance (HPLC), cromatografia iônica ou por espectrometria de massa Tandem. Anál1se quantitativa de ácidos orgâmcos: é feira na urina por meio de cromarografia gasosa/ cromatografia gasosa (GC/GC). cromatografia gasosa/ especrromerria de massa (GC/MS) ou cromatografia iônica. Pesqwsa de oligossacarídeos e sialiloligossacarídeos unnános: é feita por cromatografia de camada delgada (TLC). Apresenta padrão alterado típico nas gangliosidose GMl, doença de Sandhoff. mucolipidose I (sialidose), aspamlglicosamin úria e em algumas glicogenoses. Na mucolipidose 11 ("I-Ce//-01sease") e na mucolipidose III (polid1srrofia pseudo-Hurler) não há excreção urinária aumentada. nem de oligossacarídeos nem de mucopolissacarídeos. Análise de acilcarnitmas no sangue: feira por espectrometria de massa Tandem, possibilita o diagnóstico dos defeitos da bera-oxidação de ácidos graxas e de algumas acidemias orgânicas. Os defeitos da beta-oxida-
762 [ Medicina laboratorial para o clínico
ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ESPECÍFICAS Usadas especialmente nas mucopolissacaridoses, oligossacaridoses e outras doenças lisossomais. a fim de se obter o diagnóstico definitivo (Tabela 62.5).
TABELAS DE PRINCIPAIS ACHADOS LABORATORIAIS NAS PRINCIPAIS SÍNDROMES Tabela 62.1 - Pnnc1pais erros inaLOs do merabolismo associados à alreração dos níve1s de ammoác1dos no sangue e/ou na unna Doença
Sangue
Urina
Fenilcetonúrio e Hiperfeniloloninemio
Fenilolonino i Relação fenilolon111o/ tirosino
Fenilolonino
i
Trosino outros am·noócidos neutros
Tirosinemio
Tirosino
Doença do xarope do bordo
Leucino, isoleucino e volino
Acidemio propiônico
Glicino
Doenças do creio do uréio o) Deficiência de ocetilglutomino sinlerose b) Deficiência de corbomil·fosfoto sintefose !CPS 1) cl Deficiência d e ornitino lronscorbomilo se !OTC) dl Cilrulinemino e) Acidúrio orgininosucínico
Citrulrno J. Citrulino J. Citrulrno J. Citrulrno i Ácido orgininosucínico
Hi perorgininemio
Arginino
Hiperglicinemio não cetófco
Glicino
Homocrslinúno
Metiontno
i
Homocistino
Deficiência de cislolionino sinletose
Metionino
i , homocisfino i
Meiionino
lntolerãncio lisinúrico
à proteino
Hiperlisinemio
i
i
i
Leucino, isoleucino
i
e volino i
i
i,
Cilrulino
i
i
Citrulino i Ácido orgininosucínico i Arginino
i
Glicino
i
i i
i
Usina
i. glutomino i , citrulrno i
Lisino
i. o rg ntno i
Usina
i
Lisino
i
H stid1110
i
H istid ino
i
i
Asportilglicosominúrio
Asportilglicosomino
Defrciêncro de creolina
Arginrno
J.
Alrofro girolo
O mitino
i
Disl · 'b os do cobalomrno !CbiB CblDl
Csto tionrno
i
Cislolionrno
i
Deficiência de cistotionose
Cistotionino
i
Cistolionino
i
Deferias do rronspor•e de orrrnoócrdm o l Doença de Ho rlnup
Investigação labo r awrial do pacie mes com e rro inaw d o m et ab o lism o
Asportilglicosomino
i
Alo'l no i serino i Treonino i Glutami'lo i Va ino Leuciro lsoieucmo i Fenilolan.no i. Trros,no i. Tripto fãnio i Hrstrdrno i e Crtrulrna i
763
Tabela 62.2 - Principais acidemias orgânicas diagnosticadas pelo aumento dos níveis urinários de áctdos orgântcos ou perfil de carnttina e acilcarnitinas no sangue Doença
Ácidos orgânicos na urino
Acilcarnitinas no sangue
Acidemio propiõnico
Ácido 3-hidroxipropiõnico, ácido metilcítrico, ácido 3-hidroxivolérico, propionilglicino
propionilcornrtino (C3) C3/CO i. C3/C2 i
1\c,dem,o mefllmolônico
Ácido metilmolônico e metobólitos do ocidemio propiõnico
C3 i ou L se houver
Acidemio lético
Ácido lético, ácido pirúvico, ácido 2·hidroxibutíri· co, ácido 4 -hidroxife,illótico
Acidemio rsovolénco
lsovalerilglicino. ócido 3-hidroxiisovolérica, ácido 4·hidroxiisovolérico
Delrcrêncio múlttplo de corboxiloses, deficiência do holocorboxilose sintetose e dekiêncio de brotinidose
Ácido 3-hidroxiisovolérico, 3-metilcrotonilglicino, ácido metilcítrico, ácido 3-hidroxoipropiõnico, ácido lético
Delicréncio de 3-melitcro'oni'·CoA coroo·
Ácioo 3·htdrox,tsovolérico, 3-merilcrotonilglicino
i i.
mó nutrição, C3/CO i. C3/C2
CS i. C5/C2 i
CS·OH i
xlose Acidúrio 3-metilglutocõnico
Ácido 3-metilglutocõnico, ácido 3-metilglutórico, ácido 3-hidroxiisovolérico
Acidúrio 3·hrdrOXI·3·metilglutórico
Ácido 3-hidrox,·3·metilg utór,co. óodo 3-merilglutocônico, ácido 3-metilglutórico, ácido 3·hidroxiiso· vo érico, 3·metrlcroto1ilgrrcrno
C5·0H
Acidúrio glutórico tipo I
Ácido glutárico, ácido 3-hidroxiglutórico. ácido glutocõnico
CSDC
Acidúlio glutórico tipo 11(deficiência de desidrogenose múltiplo de ocii·CoA)
Ácido glutárico, ácido etilmolõnico, ácido odip ico, ócrdo subérico, ácrdo 2·hidroxrglutórico, rsovoleril glicino, isobutirilglicino
Todos os metobólitos de ocilcorn't nos i (de C 4·C 18)
Acidúrio L·2·hidroxiglutórico
Ácido L-2-hidroxiglutárico
Acidúrio D·2·hidroxiglutórico
Ácido D 2-h,drox,glutórrco
Acidúrio fumórico
Ácido fumórico
Acidúrio mevolônico
M evolonoloctono, ácid o mevolõnrco
Doença de Conovon
Ácido N ·ocetil ospártico
Acidúrio D·glicérico
Ácido D-glrcérico
Hiperoxolúrio tipo I
Ácido oxólico, ácido glicálico, ácido glioxílico
Hiperoxolúrio tipo 11
Ácid o oxálico, ácido 1-glicérico
Acidúrio 4·hidroxibutírico
Acido 4 -hidroxibutírico, ácido 3·4-dihidroxibutírico
764
Medicina laboratorial para o clínico
i
i
Ta bela 62.3 - Pnncipais defetros da bera-oxidação de ácidos graxas dtagnosncadas pelo perfil de acilcarninnas no sangue e ácidos orgânicos urinários Doença
Carnitina total e acilcarnitinas no sangue
Deficiência do transportador de cornilino
cornitino total .LH, M etobólitos de ocilcornitinos H
Deficiêneto de
C0 i
cornitino-polmito, tronsferose [CPT I)
Ácidos o rgânicos na urina
H , acilcornitinos 80-100% do total
Deficiência de cornitino·lronslocose
cornitino total
Deficiência de cornitino·polmitoitronsferose 11 [CPT ti)
i cl~· c16· c l61•
DeliciênCIO de desidrogenose de ocii.CoA de cadeia muito longo [VLCADI
i (12· Cf,!, c4 I ' C:ó• cló l
Ácidos dicorboxílicos c,2.cl4
Deficiência de desidrogenose de hidroxiocii·CoA de cadeia longo ILCHAD)
i OH·C 16 , OH·C 181 , OH·C 8 2
Ácidos dicorboxílicos C6 -C 1,rOH eC,.,·C
eiS•
Ácidos dicorboxílicos
c ,s 1
Deficiência de desidrogenose de de cadeia médio [MCAD)
Ácidos dicorboxílicos C6 -C 10, suberilglicino
DeficiênCia de des1drogenose de ocii·CoA de cadeia curto [SCAD)
Ácido etilrrolõnico, butirilglicina
oci~CoA
Tabela 62.4 - Doenças dos peroxissomos: determinação de ácidos graxas de cadeia mUiro longa no plasma (C26:0), THCA no plasma (ácido rrihidroxicoprosrânico), ácido fitânico no plasma e plasmalógenos em erirróciros C26:0 (f!moi/L)
THCA (f!moi/L)
Fitânico (f!moi/L)
Pristânico (f!moi/L)
Plasmalógenos (1Jmoi/L)
i
i
i
i
.L
normal
normal
normal
.L
Síndrome Zellweger
i
?
?
?
.L
Adrenole~codstrol o ligado ao X, formo 1rfon'1l e vonon'es
i
norr1ol
normal
normal
normal
Deficiência do ocii-CoA oxidose
i
normal
normal
normal
normal
P1oleíno bifuncionol e deliciêncio de tiolose
i
i
i
i
normal
normal
normal
normal
normal
.L
Doença peroxissomol Desordens do biogénese do peroxissomo Condrodisplosio 1izomélico clássico e não clássico
Desordens de síntese de ésteres de fosfolipídeos
Investigação laboratorial do pacientes com erro inato do metabolismo
765
Tabela 62.5 - Doenças lisossomais Doença
Defeito enzimático
Eliminação urinária
a-lduronidose (l,F,LA,VC)
DS/ HS
o} Mucopot,ssocoridoses MPS I
S Hurler S Hurler/Scheie S Scheie
MPS II
S. Hunler !grave} S. Hunter (grave}
lduronoto-S-Sulfotase (S,F,LA,VC)
DS/HS
MPSIIIA
Heparan-N-Sulfomidose !L,F, LA.VCJ
HS/CS
MPSIII B
s Sanfilippo A s Sanfilippo B
Heporon-N-Sulfomidose (L.F.LA.VC}
HS/CS
MPSIIIC
S Sonfilippo C
N-Acetii-Transferose (F,LA,VC}
HS/CS
MPSIIID
S. Sonfilrppo D
f\J-Acerlglicosom;no-6-Sulfotose (f,LA}
HS/CS
MPS IVA
S. Morquro A (grave) S. Morquio A (leve}
N-Acetilglicosomino-6-Sulfotose !f.LA)
KS/CS
MPS IV B
S Morquio B
[3-Goloctosidose (L,F,LA,VC)
KS/CS
MPS VI C
S. Moroteoux-Lomy
Arilsu fotose B !L.F LA}
DS
MPSVII
S Sly (grove} S. Sly (leve}
Arilsu iotose B !L.F LA}
CS ou DS/HS/CS
Trpo 11 (1-Ce//Drseose)
Fosfotro'ls;erme IS FLA VC,
Negotrvo
Trpo III (Pseudo-Hurler)
Fosfotro'lsferme IS F,LA.VC)
Negarrvo
a-M anos idose
a-Monosidose !S. L, F, LA,VC}
Positivo
P-Monosidose
P-Monosidose !S U LA.VCI
Positivo
bl Mucol p doses
c} Oligossocaridoses
Fucosidose
fucosídose !S.L.F.LAl
Positivo
Asportilglicosominúrio
N-osporhlglrcosom ntdose (L.f.LAI
Positivo
Leucodistrolro metacromótico
Arrlsu:lotme A (lJ.lA)
Nego-,,·o
Doença de Krabbe
Goloctocerebrosrocse
Negativo
G ,icogenose tipo 11 (Doença de Pompe}
a glrcosrdnse !LJ, LA, VC)
Negot,vo
Doença de Krobbe
Goloctocr•rel)rosidose
Negativo
d
ÜtJirOS
766 [Mcdtctna laboratorial para o clínico
----
REFERÊNCIAS 1. Blau N, Duran M, Blaskov1cs ME. Physician's GUJde to rhe Laborarory D1agnos1s of Merabolic D1seases. London: Chapman and Hall Med1cal; 1996. 2. Blom W, HuiJmans JGM, van der Berg G. A climcal B1ochem1st's V1ew of rhe lnvesrigarion of lnhemed Metabolic Disease. J lnher Metab Dis. 1989;12:64-88. 3. Burton BK. lnborn Errors of Metabolism in lnfancy: A Guide ro D1agnos1s. Ped1arncs. 1998;102(6):E69. 4. Deodato F, Boenz1S. R1zzo C Aben1D. Cav1glia S. P1cca S, er ai. lnborn errors of merabolism: an updace on epidemlology and on neonatal-onser hyperammonem1a. Acra Paed1arr Suppl. 2004;93(445):18-21 5. Fernandes), Saudubray jM, van den Berghe G, Walter )H. lnborn Metabolic D1seases: Diagnos1sand Trearmenr. 4t h ed. New York: Spnnger; 2006.
6.
7.
8.
9.
Investigação laboratorial do pacientes com erro inato do metabolismo
Han LS, Ye J, Q1u Wj, Gao XL. Wang Y, Gu XF. SeleCLive screen1ng for mborn errors of merabolism on chmcal parienrs usmg tandem mass spectrometry m Chma: A fouryear repore.) lnhem Metab D1s. 2007;30(4):507-14. Raghuveer T, Garg U, Graf W. lnborn errors of metabolism in infancy and early childhood: an updare. Am Fam Physimn. 2006;73(11).1981-90. Scriver C Beauder AL. Valle D, Sly WS, Vogelsrem B, Childs,B, K1nzler KW. The Online Merabolic and Molecular Bases of lnheri ted Disease. New York: M cGraw-Hdl. D1sponível em: lmp:l/www.ommbid.com. Wajner M , Vargas C Bunn M , Giuglian1 R. Coelho JC. lnvesngação de erros matos do metabolismo. HCP/\. 2001;3:343-60.
767
I ÍNDICE REMISSIVO
A
teste de HA/VI 303
Abcessos 22 Ácido fáli co 294. 296.749 deficiência 294 Ácido me tilmalônico 297 Acidose m etabólica 5 53 Acidosc respiratória 5 55 Aero monas 144 AI OS , ver Síndrome da im u nodeflc iê ncia adquirida Alcalose m etabó lica 554 Al calosc respiratória 555 Alfa- 1-anritripsina 426 Alfa-1-glicoproteína ácid a 688 . 702 Alfa-fetoprotcína (A FP) 426. 7 34 Alfa-talassemia 270 Aminorransferases 4 12 alanina aminorransferase 412 asparraro aminotransferase 4 12 razão AST/ ALT 4 13 Anemia(s) 259. 3 19 aplásrica 300. 302
adquirida 301 aspirado ml'dular 302 biópsia di' medula óssea 302 CD /5 303 CD55 303 CD59 303 celularidade medular 302 estudo círogenltiro 302 glicoforina 303 grave 301 Hemoglobimíritr f>a roxísrim Norurna (H PN) 303 hereditária 30 I moderada 301 muito gnwe 30 I panciropmitr 302
class ificação 260 doença crônica 287
captação e o tmmporte de ferro 289 eritropoese 289 estoque de ferro 289 hemogmma 290 reticulócitos 290 falc iforme 284
eletroforese de hemoglobina 286 fomlizaçno isoelétrica 286 lmnograma 2 85 reriwlócitos 285 ferropriva 263
crrpatidade total de ligação do jérro 267 Jerritina 266 hemograma 296 mewbolismo do ferro 263 rericulócitos 271 sruumção da tmmfrrrina 267 hemolí!ica(s)
auto-imune 297 enzi mopatias 280 esferocitose 277 folcifonne 284 ill/11111'5 297 induz idrr por droga 298 ralassemir1s 268 insu fi c iência renal 29 1 erirropoese 292 lmnogmmrr 292 rNimlórilos 292 macrocírica 260. 293 mega lobl:ísticas 293 ácido fiilico 293 rícido metilmalônico 297 DI-/L 3 UJ hemogm111a 296
homocisteintl 297 reticulócitos 296 vitamirltl B 12 293 microcítica 260. 263 normocítica 260. 277 refratária (AR) excesso de blastos (AREB) 319
e:r:cmo de blastos em transformação (AREB-7) 319 sideroblastos em anel (ARSA) 319 sicleroblásticas 272 protopo1jirina eritrocítica livre 274 Amicoagulaçáo o ral 358 monitorização laboratorial 358 Amicoagulante antitrombina 358 lúpico 353 oral 358 Anricorpo(s) 514. 527. 707, 722 anti-citrulina 722 amifosfolípiclc 358 antinucleares (ANA), ver tabém FAN 707 antinúcleo, ver FAN anti-rireóide 525 anti-receptom de TSH ( TSH-R) 525.527 anti-tireoglobulina (Anri- Tg) 525.527 anti-tireoperoxidase (TPO) 525.526 contra constitu intes celulares, ver também FAN 70 7 hetcrótllos 6 15. 730 imunoglobul inas 50 monoclo nais 52 policlonais 52 An tígeno carcinoemb rio nário (CEA) 734 An ti-HBc lgM 598 Anti- HBc total 598 Am i-HBe 598 Am i- HBs 599 Ami-receprores de T SH 527 Ami-ti reoglobulina (An ti-Tg) 527 Anri-tireopcroxid ase (T PO) 526 Anrirrom bina 358 deficiências, de 358 Apol ipopro tcínas 487 Artrite reumatóid e 717 critérios d iagnósticos 7 19 exames labo ratoriais 7 19 ti Iterações hematofógicas 720 alterações hepáticas 720 atividade inflamatórias, provas de 719 auto-anticorpos 720 mon itoramemo avaliação da atividade inflamatória 723 Aspergilose pulmonar 88 avaliação anaromoparológica 90 in vestigação micro biológica 89 técn icas de genética molecular 90 restes imu nológicos 90 Aspi rado de med ula óssea 30 Arerogênese 489 Auto-amicorpo(s), ver também FAN 476. 5 14. 754
770 ( Medicina laboratorial para o clínico
D iabetes Mel iro 476 ho rmônios tireoidianos 5 14 Avidez 52 avidez de IgG 60. 648. 649
B Baciloscopia 96 hansen íase I II tuberculose 96 Bacrcrcmia 128 Bacteri ú ria sig nifi cativa 165 Baermann-Moraes, método 223 Basofi lia 3 13 Basóftl o(s) 238. 253 Beta2-Microglobulina 7 35 Bera-talassemias 27 0 Bilirrubina(s) 4 1O. 4 12. 4 19 metabolismo 4 12 séricas 4 18 urinária 419 Biópsia de med u la óssea 31 Bioquímica 41 automação 47 cromatografia 44 aplicação clínica 46 métodos cromatográficos 45 eletrofo rese 42 aplicação clínica 44 classificação da cromatografia 44 princípio 42 sistema tÚ eletrofome 43 clerroquímica 46 amperometria 47 efetrodo tÚ pC0 2 47 efetrodos de fose sólida 47 efetrodos de referência 4 6 eletrodos de troca iônica 47 efetrodos de vidro 46 efetrodos íon seletivos 46 potenciometria 46 cspectroforometria 4 1 princípio 41 restes laboratoriais remoros 48 BRCAI 738 BRCA2 738
c CA 15-3 735 CA 19-9 736 CA 27 .29 736 CA 125 736 Cálcio 539 calcem ia total 540 hipcrcalcemia 54 1 causas 541 hiperparatireoidismo primário 541 hipocalcemia 540 calcitonina 540
ct/1/S/IS 540 controle hormonal 540 pamtormônio 540 vitamina 03 540 ion izado 540 sérico 437 Cam po escu ro 671 Campylobacter 14 I
Câncer ele ti reóiele 525 tratamenro 525
TSH plnsmrítico 525 Ca ndidíase vaginal 174 Capacidade rotai de ligação do Ferro 267 Carga virai para HIV 57 1 avaliação 57 1 Cateter venoso, coleta 22 Célula !.E 706 Célula-tronco 234 hemacopoética 234 Cc:ru loplasmina 428 doença de Wilson 428
CMnmydin tmchomntis 167 Cirogcnérica clássica 36 Ci tomegalovirosc 619 diagnóstico laboratorial 622
citologia e histologia 622 detecçrio do DNA vim! 623 determinarão da antigenemia 623 diagll(ístico sorológico 624 isolanmlto vim/ 624 princípios 622
acondicionamento e transporte 15
aparelho genitalfeminino e masculino 19 cateter venoso 22 exsudmos, trnnsutlntos, úlceras, feridas e abcessos 22 fozes 20 lesões genitais 20 líquor e outros líquidos corporais 2 I sangue 21 srcreçóo de ou11ido 16 secreção ocular 17 tecidos e fragmentos ósseos 2 1 urina 18 vias aéreas inferiores 11 uias respimtórim mperiores J1 microbiológicas 16 aparelho genital 19 cateter 11enoso 22 fezes 20 fragmentos ósseos 21 líquor 21 sangue 6. 21 secreção de ouvido 16 secreç:rio ocular 11 tecidm 21 urina 18. 442 vias aérens inferiores 11 vim respiratórias superiores 11 Colo ração(ões) branco de calcoflúor 26 direras 24
ácido-resistente modificada 25 auramina-rodaminrt 24 G'ram 24 Kinyoun 24 Ziehl-Neelsen 24 fluo rescentes 25 panóprica 34
perfll (is) sorológico(s) 625
infecrrio congénita 626 sorologirt na gestame 625 sorologia 110 indit1íduo imunocompetente 625 sorologia no indivíduo imunocomprometido 625 C iromcgalovírus, in fecção por 619 C irometria de fl uxo 35.63 C itoquímicas 35 CKMB 504 isoenzimas 504 metodologim 504 mbjormas 504 C loro 539 h ipcrclorem ia 539 h ipocloremia 539 Coles rase 4 I 9 AL~r
423 AST 423 bilirrubinas 423 enzimas 419 extra-hepática 4 26
FA 423 GGT 423 hcparopatias 423. 424 inrra-hcpática 425 padrão misto 424 Colesterol 75 1 Colera de am ostras 15
Índice Remissivo
pelo azul d e roluidina e azul de metileno 25 Wrighr-G iemsa 26 Complem en w 7 14, 390 Concentração de hemoglobina corpuscular média (CH CM) 247 Corrimenro vaginal 183 C rearinoquinase 502 Cromarografi a 44 aplicação cl ínica 46 métodos cromatográficos 45
Cryptococcus neoformans 120 Cultivo primário 26 secundário 26 Cultura para micobactérias, ver também micobactérias 97. 170 Curva ele Fragilidad e osmótica 279
D Desidrogen ase lá rica 4 13 Desordem leucocitária 305 Detecção de anticorpos anri-H!V 566 restes rápidos para 566 D iabetes Meliro 469. 480.481
771
b~,i fkt ção
47 1
f,rslflfÍOnn/ 471 1ipo I 471 1ipo 2 471 colesterol 48 1 diagnôqico 47 1 ai/trios 471 fruw~.tmina
480
funç~n renal 482
mirrordbumimírin 482 gemcio na l 471. 477
rrulrios dingnósliros 47 hcmoglo bina glicad.t 478 triglicérides 482 Di~gn ó~ t i co genérico. técnicas 65 apl icações cl ínica 72 cndon ucleases de r~mic;~o ••tnilise 68 hibridi1.ação 66 PC R. ver reação de polimerização c m cadeia rcação em cad eia da ligase ( LC R) 71 >cqlicnciamenro 70 D i.tg nósrico microbiológico 15 Diarré ia infecciosa aguda 135 ahordagem laboratorial 144 illt'mignçáo mirrobiológicn 146 agcm e eriológicos 136
admovirus 13Auomonas 144 nstrovim s 137 Cnmpylobacler 14 I Esrbericbia coli dirtrrriogénica 13 7 norovirus 137 prsquiJa de kuróri1osJrcniJ 145 Pl~siomonas sbigt'lloides 144 rotavim s 136 Salmonella en1rric11 14 I Sbigella 140 Vibrio 142 Yusinia 143 Di função renal 439 465 crcalinina 458
dt' fillraçáo glommtlnr 459 cxa m~ de urina de roli na I 65, 44 1. 44 2. 446.448.449. 4 53. tnXII
454 457 bt~rrtrias 457
bi/i"ubina 449 rilulm "Plll'li11is 453 d/ulm lt't't'duriformrs 45rilindros 449 colera tle amostras de urina 441 cor 444 corpos gmxos ot'alados 454 rristttÍJ 454 rrisrrris t' maraiais ammfos 454 ml111m 165. 166 dina 443 diumr 443 nforco jlsiro 443 t'Sflt'T/1111/0ZÓidr 457 t'Xrtlllt' microscópico 449
772
L
Medicina laboratorial para o clínico
frrsr pri-analítira 44 I fruom prt-ana/Í/iros 443 glirosr 446 gmvidade específlm 445 gmvidez 444 lm nácias 451 lm11n11Íria 452 jmo mMio 442 lruróritoi 448 453 11111terinis amorfos 454 11/UCO
457
nitrito 449 orirlttaçáo ao pacirlllr 442 parasitos 45posrura corporal 444 propriedadesJlsiras 444 prordna 446 sangru· 448 urina 444 urobilinogénio 449 função renal 439 fll'aliaráo 440 fomraráo dt1 urina 439 hemácia> dismó rfl .1 ~ 457
hemrlllirias glomrrularrs 457 não glomerularrs 457 insufic iência renal aguda 466 in uflc iéncia re nal c ró nica 465 investigJ áo labo ratorial 439 prore inúria de 24 horas 463
mirroalbumimíria, ver Diabete~ Mel ito raxa de filtração glomeru lar 460
l'fjlla(ao Cockcroji Gaul 462 imporrtincia clínica 460 limitarõrs 461 uréia 462
causas renais 463 rxtm-mwis 463 Oisli p idcrnias 485 apolipopro te inas 487
clasus 488 489 plnm rrrerosckrórica 490 cla~~ ill caç5o 493 origmr primária 493 origrm sew ndária 493 a t e rogC:nc~c
doença arterial coronaria na 485 dr idos graxos 486
colmrrol 485 fosfolípidrs 486 rriglidri&s 486 lipoprotcínas 486 /1/)/. 486
//)/. 486 LDI. 486 quilomícron 486 VI.DI. 486 perflllipídico 490 rquartin de Fril'dl'wald 490 llftritrçóes mwliricas 492
1111riações pré-analiticas 490 D isrú rbios á cido- básicos 545
prozona 52 Elcrroforese 42
hiato aniônico 551 hiaro aniônico uriná rio 55 1 misros 556 primários 553 Distúrbios hemorrágicos 346 avaliação laboratorial 348 conwge111 de plaquettts 349 fiiStlios de mistum 350 fibrinogênio 351 função plaquetária 349 tempo de p rotrombina 350 temp o de .•nngmmmto 349 tempo de trombino 35 1 tempo de tromboplastina parcial ativado 350 exame fís ico 348 m3nifcsrações clínicas 346 Doença arteria l coronaria n,t lt95 homocisreína 495 Doença de Chagas 65 1 diagnóstico de siruações especiais 658 inferçiw rongenita 658 rentivrt(tÍO de infecção crónicn 659 diagnósrico paras imlógico 655 màodos diretos 655 métodos pnmsitolõgicos i11diretos 656 diagnósti co sorológico 657 imerpreraçâo dos restes sorológicos 658 Doença de vo n Wille nbrand 352 Dosagens hormonais (sisrcm a c ndócri no) 512 basal 509 efeitos analíricos 512 anticorpos heterófilos 5 14 efeito grmrho 515 interferentes 512 complemmto 513 disalbuminemia 5 14 drogas 5 16 efi'itos di' matriz 5 12 fittor rmmatóide 5 13 hipertiroxinemica 5 14 honnônios livres 5 14 /;ormónio.r totais 514 inesperífiros 5 15 lisozima 5 13 m ecânicos 515 11/etabóltros 516 {JI"Otelnas 513 proteínas endógenas 513 sensibi lid ade analírica 512 alta sensibilidade 5 12 limite de detecçáo 512 1uartn grraçrío ) 12 terceira geração 512
aplicação clínica 44 e!etroforese capilar 44 eletroforese de proteínas em alta resolução 44 focalização isoelétrica 44 classificação da cromatografia 44 hemoglobina 272. 286 princípio 42 sistema de elerroforese 43 Eletróliros 529 água 529 água carpam! 530 líq uido extracelular 529 líquido intersticial 530 plasma 530 s6dio 530 líquido inrracdular 529 potássio 530 Eletroqu ím ica 46 amperometria 47 elerrodo de pC02 47 elerrodos de fase sólida 47 elen·odos de referência 46 eleuodos derroca ión ica 47 elerrodos de vidro 46 eletrodos íon selerivos 46 porenciomerria 46 ELISA, ver ensaios irnunoenzimáricos Endonucleascs d e restrição, análise 68 E nsaios irnunoe nz im á ticos 59 Enzimas pan creáticas 433.436 Enzirnopatias eritrocirárias 280 atividadc enzimática 283 hemograma 283 rericulóciros 283 Eosinofilia 3 11 síndromes hipereosinofílicas idiopáticas (SH E) 3 11
E Efeito gancho 729
lndtce Remiss1vo
Eosinófilo(s) 238. 253 Eosinopenia 312 Epsrcin-Barr vírus, infecção por 6 13 alreraçôes hernarológicas 616 diagnóstico sorológico 615 anticorpos contm o vírus Epstein-Barr 615 anticorpos heterófilos 615 Er irroblasro 236 o rroc romático 236 policromático 236 pró -erirroblasro 236 Erirróciro(s) 236.243. 248 avaliação morfológica 248 Erirrograma 246 Erros inaros do metabolismo 757.76 1 anál ise de metabóliros 762 arividades enzimáticas específicas 762 lacrente e na criança maior 760 período neonaral 759 exames de primeira Linha 759 exames de segunda linha 760
773
I'Xfllllt'S dr u•n·rim linhfl 760 triagem mct.thóli
.1
Fase sólida 52
urin.íri.t 76 I
Fatores de c re cimento 235
fsrberichin roli I 19 diarrciog.:nit.t 137 F~,fcrociro~c hcrcdir:íria
F:rror reumató ide 720 Fator V de Leide n 358 Fausr, m~rodo 224 Febre rcumárica aguda 681 687 critérios de Jo nes 687
277
LUrva de fr.t "ilid.~tk o~móti<-.l 279 hcmogram.t 27') rcriculóci to' 279
'·'"!;'"'
E,frcg.u,.o J c pcri féri~..v c oncd u l.t Ó>>ca 32 E~pccrrofotomctri3 4 I
princípio 'Í I
E'l rogênc~c 41)) proteína C rc.uiva de alta sensibilidade 495 Ex.tmc para,itológico d e fcz.c 221 w lora õe; empregadas 223 fase analític.t 2r f.tsc pós-atul ític.t 228 fJ.Se pré-:tn3lític..t 222 pc~q ui s.t de wtcídcos intc tinais 223 principai' métodos 222
!Jfllmiiiii/11-J\/omes 222. 223 Coprorm 222.223 dirrto 222 Ft~wt 222. 224 lmnrlloxilina ftrrim e rricrômiro 222 Hoffimm. f'om r }t~nrr 222 223 Kmo-1\1/{z 222.223 Lurz 222 MIFC 222 223 Nirchir 222. 223 Rugfli 22.J SIJenrlm· 222
\'(/ii/is 222. 223
gotn pl'lldt•ntr 23 microscopit1 dr mmpo rsmro 24 prrptlm(do com IJidróxido dr potássio - KOH ( I O'Jo 11 40°o) 23 P"PfiYII(IÍO (011/ Strlillft 23 prPptlm(dO rom ti11lfl dt1 CIJinlf 24 solurtio iodt~dn d~ Iugo/ 23 hematológicos 29
mrsibilidlldr r rsprriflridlfdr IJ mlorrs dr rrftrinria, ronuuo / I t•,dorrs prrduit•os / -1 I'III'Ífl(flO Úio/ógim fJ microbiológico. ver diagnó:. tico microbi ológico urina de rot in.t. ver ramhém Disfun .io renal I 65 44 1
-o6
774 ( Medicina laboratorial para o
elrrroforrsr de protrimts 689 mucoprotl'inas 688 protrílllt C rrrUÍ/111 61:J8 Fe no ripagcm erirroc idri3 )')') Feridas 22 Fe rririna 26fí Fe rro 26,, Ferro mcdu br 267 Fe1..es, colct:t 20 Fibrinogê nio 35 1 Fígado 409 4 I I aminotransfc rases 4 12
elrmpío 4 12 {/'<11/Jilll/11/tlSt!S
412
bile 4 10 bilirrubin.l ( ~)
4 I O 4 12 di ma (ronjugrula) •I! O indim11 (ndo ronjugad11) 410 lllf'{(tÚofÍJII/11 4/0
5'-Nurlroridase 421 dnoxifimrtio 411 disfimpio 4 /I mzimas brpdrims 4 11 l'XCI'I' (IÍO 4 /f /estio IJt•p~ttoalulnr 4 11 sinrrsr IJt'ptítim 4 11 funções 40') 753 flriWIU'IIflllll'J/10 410 drroxiflmctio 4 1O I'Xfl't'(tto 4/0 mr!Joidmros 409 lípirlrs 409 protrilllts 409 tempo dt· prorrombin:t 418
i nrerpreraç:io I I
F:rse analíric.t 6 Fase pós-a nal íric.t 7 Fase pré-atulític.t 2
processo infhm3tÓrio 687 rt!jft- 1-glitoproteina dl'irlr1 68/:J
sínrcsc 40')
coltrn dr tt/1/0stms 29
FA,
mui-drsoxirribonudrrtsr IJ 6!10 nmigrnos rsrreproróriros 689 dosrrgrm dr flmi-esm•ptolisinfl-0 689
exa mes bhor.ttoriais 4 I I
'cd iment açiio csponrà nea 223 Ex3me(s) di rcto a fresco I 70. I 78 di reto corado pelo Gram 170. 179 di rcto sem coloração 23
F
infecção cmcprocócica Jmcrior 689
uro bilinogénio urinário 4 19 Floculaçiio 55 Pocalizaçiio isocl érrica 286 Folato 296 Folaro e rirrocirá rio 296 Fo farasc alcalina (FAL) 420. 753 Fó foro 54 2 hiperfosfatemia 543 (t{/IJ({J
543
hipofosfaremia 54 2
~f-----------------------------
CI/1/SIIJ
542
Frurosarnina 480 FTA-ABS 674
G Garnagluramil r ran~rcra c 420 Gasom crria 437 )'iQ • mo
552
rolrtfl 552 snngue arterial 552 Illllglle /!e/lOSO ) 52 bi c~ rbonato padr.ío S'iO bicarbonato real 'iS I cxcc~so de base 5'i I paCO~
550
pa01 550 pH 550 sawração de 0 2 'i'iO va lores de referê ncia 552 Gc no ripagem para H IV 574 Gl icemia 4 37.75 1 Glicohcmoglobin:t, ver t:tmbém H emoglobina g licada 75 I Gl i oprorcína llbll lla r6 Glicmc 437.469.474.475 478. 481 wnrrolc 469 jtjum mrto 4-o ;tjum prolongl/(lo •1-,0 pós-nb.rorlitlft 470 dosagem 474 glicemia 4r gliccnlia capi i.Jr 481 gliccmia cm jejum 473 intolerância 473 imolcrância cm jejum 47 3 tc,rc oral d e 10ler:ínci.t 47 2.475 Clobina 268 Cram de gora ele urin:t rüo centrifugad a 165 CrJnulóciros 2r Cravidez 74 1 diagnóstico laborarori.tl 741 C rupo( ) sa nguínco(s) 365 372 ABO 369 D iego } 7 ) Duffy 37'5 Hh 37 1 Keil 374 Kidd 374 M:-.1 373 Rh r2
H Hal'mopbilus injlum Zite I 19 II AM/T P 577 ll.mscn íase I 07 exames gerais I I I investigação microbiológica I li bnciloscopia III métodos molewlnm 112
Índice Remissivo
rractio de Mitsudrt 112 Wfi'S sorológiros 112
H AV, in fecção por SR? H BcAg 597 I-I B~Ag 597
hCG 733 74 1 dw:cç:io de hCG 742 milodos qualiuuit•os 742 mrtodos qurlllllllllivos 1'1J indicações 744 interpretação 744 H CV, infecção por 607 HD . infecção por 595 Helirobacter pylori I 51 caracrcrísricas da bactéria I '52 di.rgnó~ ti co I 55 mm role de t'mtdic1t(tÍO dtt bnaàin 160 rri1lll(flS 159 mlwra 155 dNrcctio de nllt~~l'ltos dr I I. pylori 1'1/t 11mostms di' fi'zrs 157 rxamr direro do esfrrglt(O come/o 156 parirme com atrofia gdstrim e/ou carrinomn gástrico 159 pr,quisa dr muirorpos mui-li. pylori 157 pr,quisn de nnllrorpos seriros nnti-Cag/1 158 prsquisn de H. pylori rm rorm hmológtcos 156 ri'Sistência ti 11111imicrobirmos 160 tknirrzs moln ulares 158 tr,tr da urmse prr-fomwdn 156 trstt• rrspimtório com urfitt marmdtt 156 doenças asso iadas à i n rcc~·ão 15 1 f:uorcs de risco ligados ao hospedeiro 154 t:uorc; de virulência 1)J Hdm imíases imcstinais 218 lonn a diagnóstica 21? habttnr 21? mcc;tnismo de in fccç5o 2 1? nu.':rodos imunológicos 22? principais hclmi nros 21') Hem.ícias 243 di,mórflcas 4'iH cmatócri ro 242 Hcmaropocsc 233 télulas-tronco 233 llcmocul!llra 13 1 an.íl ise 132 tolera 2 1. 1.1 1 imcrprctac;:io de resulr.rdo' 132 llcmofl lia> 35 1 llcmoglobina 242. 267 . 478 glicada 478 H emoglobi n a A 26? H cmoglohi na A2 26? H cmoglo hin a corpuscu lar médi:1 (H C M) 246 11cmoglo bi na fera] 26? llcmog rama 24 1. 255 262. 296.437 749 anisocito,c 296 leucopcnia 296 macroova 16 iro 296 método, auro mati ~ad o, 243
775
métodos manuais 24 1 neutrófilos hipcrsegmenrados 296 plaquetopenia 296 poiquilocitosc.: 296 valores de referê ncia 25 5 Hemostasia , ver Sistema hemostático tempo de protrombina (T P) 350 tempo de sangramenro (TS) 34 9 tempo de trombina (TT) 35 I tempo d e tromboplastina parcial a tivado (TTPa) 350
Hipo ri reoidismo 523 critério diagnóstico 523 monitorizaçáo do rraramenro 524
r4L e 13L 525 /SI-I pfmmrítiro 52'1 TSH plasmático 524 Histop!asma capsufaru m 120
HIV, infecção pelo 559 diagnóstico molecular 568 diagnósrico sorológico ')(í4 linfóciros T C D4 ' , conragem 569
ensaios ele mistum 350 Hemorerapia 365 Hepariniwção 360 monitorilaçáo laboratorial 360 H epatirc A 587 alterações laboratoriais gerais 589 diagnóstico sorológico 590 Hepatite B 595 alterações laboraroriais gerai 597 diagnóstico molecular 599 diagnóstico sorológico 597
H LA. sistema 40.3
nnti-HBc lgM 598 r1111i-H Bc total 598 mni-H Be 598 a111i-HBs 599 HBeAg 597 H!JsAg 597 urilizando os marcadores 600 m uclm epiclemiológicos e após vacinação 602 indimçrío e monitorizrtçrio da respostrl 601 infi'cçrío aguda 600 infi-rrrio crônicn 600 infêrçrio pregressa 602 tmrnmellfo 60 I Hcparire C 607 alterações laboraroriais gerais 608 diagnóstico molecu lar 609 gmoripagem 610 PCR qualitatior1 609 PCR qwmritatioa 6/0 diagnóstico sorológico 608 pesquisa de amicorpos - Anti-HC\f 608 pesquisa de anrígenos- rore H CV 609 H epatite D 603 exames laboraroriais 604 co-infêcçrio HDV/HIJV 604 mperinfecçrío H D VIH B V 604 Hepatite E 590 alterações laboratoriais gera is 59 I diagnóstico sorológico 592 H ER-2 737 H EV, infecção por 587 Hibridação in situ com fluorescência (FlSH ) 38 Hibri dização 66 H iperrireoidismo 523 critério diagnóstico 523 mon itorização do tratamento 525 T4 e T3 525 TSH 525
ensaios imunométricos 520 gerrrçórs 521 mdioimuJJOI'IIStliO (f?JE) 520 HTLV. infecção 577 diagnóstico molecular 584 PCR qurmtitruioa 584 tme de PCR qutdirrttÍ/JO 584 diagnóstico sorológico 582
776 [ Medicina laboratorial para o clíni c o
Homocisteína 29 7.4 95 anem ia megalobl:ístic:.t 293 doença anerial corona riana 495 Hormônio(s) tireoid ia no(s) 520 rejlex usting 522 T 3 Livre 522 T3 Total 522 T4 livre 522 TSH 520.52 I
]1---- - -
I Icterícia 424.425 coksd tica -125 hcpárica 42'5 pré- h c p~ ri ca 42 'i Idoso 74 7 exames laboratoriais 747
dticlo JO!ico 749 tiiiiO-antirorpos 754 rolesterol 751 jôsfruase akalinrz (FAL) 753 Jimçrío !JefHÍI im 753 Jim rrío rrntd 752 gliremir1 751 glirobemoglobinn 751 bmwgmma 749 ÍOII>
7)2
marmdorrs tumorais 755 pesquisa de sangue oculto nas fi'ZI'S 755 proteína C rl'flriva (PC!?) 754 prordnas plrmndtims 75.> trig/iairides 751 TS H 754 urinfl rotina 755 l'eloâdadt· de bemossedimm tartio {\IHS) 754 ,,itamina R12 749 particularidades na medicina bhoratorial 747 lm un ofenotipagem por ciwmctria d e fluxo 63 l mu n o nu o n:sc~nc i a di rua '57
para clamídia 170
ImunoAuorescência indireta 58 lm u noglo bul ina(s) 50 caracrerísricas 50 produção na criança 50 produção pelo idoso 51 lmunohiswquímica 35 Índice(s) anisociwsc (RDW) 267 hemarimétricos 246 conmurnçrio de hemoglobina corpuscular média (CHCM) 247 hemoglobina corpuscular média (HCM) 246 RD\'(1 (Red Cell Disrriburion \X'idrh) 247 l!O!ume corpuscular médio (VCM) 246 aruraçáo da rransferrina 267 lnfa rro agudo do miocárdio 497 c rcarinoquinase 502 ÍSOf/IZÍ/1/tiJ 502 marcadores cardíaco 500 marmdores bioquimicos 500 mioglobina 504 mfrodos disponiveis 505 troponina 500 ensaios disponiveis 50 I merodologias e imerftrenres 50 I nít1fis plasmdúcos 500 In fecção d o rraro urin ário 161 ad ultos 164 agcnrcs e riológicos 162 elas~ i fkaçiio 161 cri.1nças 164 exame de urina rori na 165 memsl' leuroritdria 165 pesquistt de nitrito 165 sediml'lltO urinário 165 G ram de gota de urina não ccnrrifugada 165 hc:mocultura 166 urina , colcta I 64 aspimçrio suprrrptíbica 164 rateterizaçtio 164 coletor adesivo 164 )ato médio de micçrio espontr1nea 164 uroculrura I 65 lnAa mação, fase aguda 69.? a lb- 1-glicoprorcína ~c i cia 702 mucoprot:cínas 702 proteína C reati va 694 indicações clínicas 696 metabolismo da PC R 695 métodos de tlostlgem 695 tJalores de referência 695 velocidade de hc mosscd irncnração (VHS) 699 hemdcias, sedimentação das 699 indicrtçóes clínicas 700 metodologia 699 tJa!ores de referência 70 0 Insuficiê ncia hep<íti ca 353 lnvesrigaçáo m icrobio lógica da diarré ia in fecc iosa aguda 146 bactérias 146 wltitJO 146
Índice Rem i ssivo
exame direto a fi-esco 146 exame direro corado pelo Cmm 146 método de genética molecular em relação a in vestigaçáo micro bio lógica 149 l'xames gemis 149 vírus 146 detecrtío de antigenos 146 lo nograma 530 eletrodo íun sel~ tivo 53 1 fotometria de chama 530
J Ja nela imunológica 52
K Kato- Karz, m étodo 223 Klebsiella, na meningi te infecc iosa ag uda 119
L Leide n , fator V, ver faror V Leishmtmia, ver Le ish m an iose(s) Le ishman iose(s) 661 d iagnóstico 665 exames genéticos 667 extlmes imunoLógicos 666 exames parasitológicos 665 hemograma 668 rnielograrna 668 regumenta r 66 I classificação clínica 665 visceral 66 1 Lesões genita is, cole ta 20 Lcucc m ia(s) aguda 325 biópsia de medula óssea 328 citogenética cldssica 331 citologia 328 classificação 325 t'stut!o imunofonotfpico 328 estudo molecular 333 hemograma 327 im u nofonotipagem 328 mielogmma 328 bifcnotípicas 330 linfob lásticas agudas 329 linfóicle crónica 3 15 mielóidc crónica 31 7 m ielóides agudas 330 miclomonocítica crón ica (LMMC) 3 19 Lcucina aminopepridasc 422 Lc ucóciro(s) 242 rcaç:io lcucemóide 31 7 Leucograma 252 Li nf6c iro(s) 239. 254 lin fóc ito B 240 linfóciro NK 24 0 linfócito T 239 reacionais 254 . 6 I 6
777
Linfoci to e 3 15 Li nfócito T 04 ', co ntagem 569 Li n fopeni:~ 315 Lipoprotc ínas 486
Líquor .m.ílisc cito lógica 123 a ná l i~c imunológica 125
.tnálisc macroscópica 123 Jná l b~
mitrobiológit.J 125 wl111rn 125 /!X0/1/r 11//CI"OSCÓpico 125 análise química 124 l!~r róluos
125
glicosr 124 úmnto 125 promlcitn/111111 124 prolt'Íno C-rl'fltit'll 124 protd na tora/ 124 ourros líqu idm co rporai~. colem 2 1 valores d e referência d.: cêlulas 124 LLtpus crirc mat oso sisrê mico 705 diagnóstico (,) bboratorial(is) 706 omicorpos Olllr{osfolípidB 7 I I d/uú1 I.F 706 monitora mcm o(s) laboratorial(is) 7 12
M Magn ésio 537 hipe rmagnc,cmia 538 hi poma gn e~c mia 537 Marcadores ca rdíacos SOO Marcad ores t u mora i ~ 727 7 55 aplicaçáo clínit.t 730 diagnóstico 730
monitortmlt'IIIO di! tmtttiii/!11/0 :30 prognóstico ~3 1 mstrMmmto 730 marcadore<; genético\ 73 7 BRCA I 1!2 738
HER-2
-r
p-53 ~r principais 73 1
nnrígmo CI/YCÍI/Of'lllbriondrio (CEA) 734 nntígmo prostdtico esperíflro (PSA) 73 I CA 15-3 735 CA 27.29 136 CA 125 736
gonadorrofina roriônicn humana 733 tirt!oglnbulina 735 CJ.-Frroprotdno (AFP) -.u ~r Mirroglobulmn -3 5 Med ici na Laboratorial , ver patologia clínica M edida de p H vaginal 178 Mcgaloblasto c 295 Mening ite in fecc iosa I 17 agem cs etiológicos I 18 :m álise cito lógica 123 análise macroscópica I 23 lí<.1uor, análi,e imunológica 125
778 [ Medici na laboratorial para o clíntco
líquor, análise microbiológica 125 cu/rum 125 exame mirroscópiro 125 líquo r. :m :í li ~e q uímica 124 & rrólitos 125 glicose 124 lnctnto 125 promlmonina 124 prolt!ÍIItl (..'- T?athlfl
f 2~t
protri1111 total 124 líquor, valo res de referl:ncia de células 124 meningite bacrcriana I 19 Esc!Jcrichill coli 119 Hnemophilus injlumZíll' I 19 Kkbsit!lút I I 9 Neisurin meningitidis 119 Pseudomonns aeruginosn 119 SnlmoJu[/n 119 Serrntin mnrcesci!IIS 119 Srnphylococcwnure/IS 119 Stnphylococrus epirlermidis 119 Streptococcu.s do gru pu 13 I 19 Streptocorcus pneumo11it11' 11 9 meningite fúngica 120 Cryptococcus neoformnns 120 Histoplnsmn cnpsulnhtm 120 me nin gi t e~ i nfecciosa~ 12(, mcn ingire vi rai I 18 M étod os moleculares, na h an s..: nía~e I 12 M ..!todo; ;uro lógicos 49. 53 aglutinaçfto 53 aglutiltn('tiO di! Mux 55 aglutillll(flO dirl!tn 54 aglutinnrtio indirf'tn 54 lum11glutinnrtio 54 en,aio; imunocnzimáricos 59 dt'lf'C(tiO dt' anticorpos 59 detrrrtio dr nntígrnos 60 cma i o~ imunoOuorim étricos 62 cll\.rim imu noq uimiolumincsccnre' (, I fl ow l.tçjo 55 illlUilOf.:nutipagem por CitomctTi:t de 0uxo (,J imu nnO uorescência 57 dima 57 inrlireta 58 imuno peroxidase 59 pretipitação 55 1/(fo/onmrirt 56 wrbJdunl'lrin 5radioimunocnçaios 6 1 rc~tc;~ rápidos 62 II'I'Stf'm-bfot 62 Mico h acté riaç 93 n ~o tuh~rcul o s a s 9.1. I 0 2 teste tub~ r<.. ulín ico 99 tuhcrculo,c cxtrapulmonar 99 aborrlll[!,l'lll rlingnósticn 104 T/J de l11ri11,'?,1' 102 tubermlou m tànl'll 101 rubrrculosr rio sistnrw nrrr•oso antml 101
rubrrculosr mdobrónquim 102
ia 319 citogenério lássica 321
Mielodi~pL1
tubermlosl! grmglionnr prriftrira I 00 rubrrmlosr grurrimrsrinnl I 02 rubaculosr grnirurindrin 100 rubt'rculosr milinr I OI wbt'rculosr oml11r 101 mbrrmfost' OSUOIIriÍCIIfllr I 00 rubrrmlosr prricdrdicn I 02 tubuculosl' p/mml 99 tuberculose pulmonar 96 bt~ciloscopitr 96
cu/rum 97 mhodos molrmltrrrs 98 mrrs sorológicos 98 Micoplmmn gmiralium 167 Micoplmmn hominis 167 ~..ticoses sub ur:ine:ts c profundas 185 195
aspergilose 2 1O
diagnóstico Lrbornrorinl 2 I 2 candidoçe 21 4
rlingnósriro lnborntorinl 2 I 5 cripwcocosc 208
diagnóstico labomrorinl 209 t romobLmomiw ,c I ?9 dillgtuúuco labomromrl 200 e,porotricosc 20 I durgt/Ostuo labor,rrorinl 102 fcohifomicmc 200
dillgtiÓSiiCO /tr!JOYtltOrill/ 201 his10plasmosc 205 dingnósrrco labomrorinl 208 micctoma I ?'5 diagnóstico lnbornrorinl I 96 par.tcot
idiodomito~c
202
diagnóstico /,r/mmwrrnl 204 tigo mi co~c I()7 ditrgnósrico /,rbomrorilll I 97. I 98 Micoses supcrfl i ai~ 185 tknnatofltosc(~) 18(, Tinell pu/is 18') Tinha cnpitis 192 TiniHr corporis 188 Tinha cm ris 189 Tinha dos pêlos 193 Tinha Jncinle 190 Tinha mrrnumn 190 Tinha unguium 191 d c rmatomi cosc(~)
I H') Idem iflcaçáo l.tbor.uori:tl dos dcnn,uóf110, I ')4
mltum 195 prsquisa dimn 194 MicrobiOla indígena 75 cavidade oral 76. 77 classifl caçiio 75 gasnimcstinal 77 importância 78 pele 76 traro gcn illlrin:írio 78 trato respiratório 76 77 Mic rocirosc 268
Índice Remissivo
sillllromr 5q- 321 estudo molecular 322 he rnograma 320 imunofenotipagem .n I miclograma c biópsia de medula óssc.t 32 1
A/lP 321 tlSf't'rlos mrgt~loblliSIÓidrs 321 bnsronrtrs dt' Aurr 311 micromegnrnrióritos 321 sirlrrob!asto t' lll anel 32 1 M ielogram a 30. 33 Mioglobi na 504 Monóciros 237 253 Monocirosc 314 Monon ucleose lnfcccio~a 6 13 Mucoprorcínas 688 702 Mycobnrtrrium leprne. ver hanscníasc Mycobncterium tuberculosis 93
N Nefelomcrria 56
Neisserin gonorrhoetrr 167 Neisserin ml'llingitidis I 19 Nemrofll ia 308 anomal ia de Alder-Reilly 309 anomalia de May-Hcgglin 309 corpúsculo dc Dõhle 309 gran ulação róxio 309 hipcrscgmcncaçáo 309 pseudopelger-H ui'r 309 síndrome de C héd iak-Sreinbrinck-Higashi 309 vacuoli7., Çiio 309 Neurrófllo(s) 237.252 Nc utropc nia (s) 305 adqu iridas 306 ben igna c rónica 308 he red itárias 306
im unes 306 indutida po r drogas 307 p~c udo ncurropcnias 308
o Oni com i co~c . ver
Tinba unguium
p p-53 7.'>7 Pan iropc nia .302 Panc n::nirc aguda 431 .unilase 433
crrflliniwr (U/g} 433 Sfrirtl 4JJ cákio :.érico 437 c ntinl.l' panue.íti c.t~ 436 g.t\0111Ctri.l 43n ' IIIÇfÍO r/r
glicemia
4r
779
hemogr:11na 437 lip.tse 434 t //1/0SII'l/S
435
/ip11St' srrim 4J4 proteína C rcativa (PC R) 436 Patologia líniC::t 1 colhei ta, 1ran porre e armazenamento do marerial bio lógico 6 Lontrolc d.t qualidade no bborarório clínico 7 (."<' onolót ic3 G t:tSc pó -arulític;t 7 f.lSc pré-a nalít ica 2 111it•idndr fisim 2 dil'lll 3 grt~vidn 2 lmnólisr 3 id11de 3 infimio dr fií m111cos 3 lipmlin e jtjum 3 postum 3 n•stdlfldos de exnmes 11r1 grnvidez 4 tomiqut•te 3 wo de drogns ternpéutims ou de 11bwo J l'tlrÍII(tÍO cronobiológicn 5 preparo do paciente 5 segurança no bborarório cl ínico 7 ;,olicit.tçáo médica 5 P R, ver pro reína C reativa PC R, ver rcaçáo de pol ime riL.aç:io em cadeia Pesquisa de coccídeos in tcHin ais 223 Pesquisa de leucócitos fe ais 145 .t fresco 14 5 detecção de lactoferrina I II) Pl.tquera(s) 238 242 349 Jv.tliaçáo da funçáo 239 contagem 2-4 funç.io 349 Pl:tqucrograma 254 Plrsiomonns shigelloides I4tí Pneumocisrose pulmon:tr 90 ex.tmcs específi co~ 91 exames gerais 91 Pneumo nia associada à a;.;.istência a ;,:tt'iélc 85 abordagem laboratorial 86 rxtmtrs rsprdjicos 87 hrmoru/11tms 88 agentes criol 6gi co~ ll5 Pneumo nias, ver Tra to re;.pi ratório inferior, infecç.'io Porás;. io 535 hiperpota;.;.emi.t ) J'i ({( 1/Sf/J 5. i ) hipopotaSSl'mia 'i)) (1(/IJ(/J
5J6
Pre são osmótiu do pl.t;,m.t 53 1 o~ mob li d.tdt· plJ\Jn.ÍlÍlot ) .\I osmolalidade urin.íri.t 'i 11 Primeiro jato urinário. colera 169 Proteína ativ.l<.b 358 rcsistênci.t :1 prutdna C .uivada 358 Protdna rt·.ui va (P R) 436 688.694. 754
alta semibil idade 495 mrogênese 495 Prorcína (s) 358 coagulaç:in vitaminas K-dependenres. da 358 plasrnát iC::t;. 753 'érica' 415 rrlbumit11t 4 16 globu!ium 4 17
ti I (,
rlt'l roforese 416 l'ro tcinúri a de 24 horas 463 Protozoo~cs inrcsrinais 218 forma di.tgnóstica 220 hnbir111 220 mecanismo de infecção 220 princi pais prorow:írios 220 Protrombina 358 mutação. da 358 P, A 731 fls('//clomonns neruginosn 11 9 Púrpum Trombociropênica Imunológica 354
Q Q uímica cl ín iC::t, ver Bioquím ica
R RDW (red cell distriburion width) 247 Rcação cadeia da ligase (LCR) 71 cadda da polimerase (PCR) 39 Mir uda 112 Momcncgro. ver teste intradérm ico Reperfusáo miocárdica 505 C KMB 505 marcadores ca rdíacos 505 repe1justio corondri11 505 mioglobina 505 troponina 505 Rericu lóciros 236. 251 . 262 296 eritropocse ineflca7 296 Rim , ver Disfunção rena l fu nçáo 440. - 52 RN I 359 Rubéola 629 defln içáo do diagnó,t ico 635 iuftrrtio imrn-títero 6.J5 inftcrlio pós-nmnl 63 5 rubéo/11 congéuitn 636 diagn6st ico laboratorial 632 derrcrtio dr muírorpos 633 isolmnrlllo do vírus (,32 trste dr 1111irlrz dr lg(,' ó34
s nlmonelln murim 14 I Srrlmone/111, na meningite infecc iosa aguda 1 19 angue. co lcra 21
angue o ulro, pc.:squisa nas fezes 755
ecreçáo ocular. colcta 17 ouvido, colcra 16 raspado endoccrvioi . colcta 169 raspado uretrais. coleta 169 cd imentaç:io esponrânea 223 cdimcmo urinário, ver rambém exame de urina de rotina 449 exa me m i cro~cóp ico 449 en ibilidade c especificidade 13 pomo de corte 14 Scpsc 127 cirocina:. 130 função hcp.ílica 13 1 fun ç.ío renal 13 1 gasometria arteriJI e IJuato 131 hcmocuhu ra 13 1 tmtílísr 132 roll.'lfl 131 inurprntt(áo de resu/111dos 132 hemograma 130 procalcironina 130 protd na C reativa 130 cqlicnciamcn ro 70 crr:uia marcescens 119 Sbigrlln 14O ífilb 669 congênira. diagnóstico 677 d ia~;n ósrico h acteriol ó~i co 671 mumojluort'srrncia dirrut 6 71 Trrponrulfl 671 diagnóstico sorológico (,72 rnus mio-trt'ponrmicos 6-2 I I!SI I'S trt'ponhniros 673 ncurossífll is, diagnósti o 676 prim.íria. diagnóstico 675 r.t~treamcnto da sífil is. d iagnó!>l ico 677 se undária , diagnó tico 676 tcrc.iária. diagnóstico 67 6 Sínd rome da imunodcnciência adquirida (A I OS) 559 detecção de anticorpos ant i- HIV 566 restes nfpidos pam 566 itwt~tigaç.ín laboratorial gcr.tl 563 índromc(,) 465. 466 467 476 Loronarianas Jguda:. 497 illjnrro ttguclo elo miocdrclio 497 mc:rabólica 476 ncfrítiC:t 467 ncfrótica 466 renal(is) 46'i Sistema cndôcrino 507. 508. 509 av.tliaçáo laboratorial 509 d i~tlt rbios
)08 /Jipt'1jiiii(ÓO 508 IJipofunráo 508 dosagens hormonais. ver Oo~Jgcns hormonais ( is tema endócrina) imagem 5 10 fcedhack 510 rrrro-alimemactio 51O urganizaçfto 507
lncltce Rem sstvo
fim cáo hipofistirifl 501
!Jormônios 507 hormônios rrófiros 508 setor rfetor 508 srror rrpt!Aclor 508 propedêmica soorgtmizti(ÓO 501 testeS din;t miCO!> ) (Ü t'SIÍ11111fo 510 mprmtío 5 10 istema hemosrático 343 anricoagulanrcs naturais 344 anrirrombinfl 345 prolt'ÍIIll C 345 prorríntt S 345 corrda áo clínico-laborato rial 3) I fll/1/rotlgulamr !tipiro 353 drfiriéncia dr vitflmina K 353 disjibrinogeJWIIÍas 351 domra ele 1'011 \Yii/únbmnd 352 lmnofilias 351 inibidores da roagula('tO 351 imufirienritt IJ~pdtirn 353 plaqnetopruias 353 Ptirpum Tromboritophrirn Imunológica 354 endotélio 343 fato t'l'\ pró-coagulantes ~44 rompl~xo prorrombinme 344 ;;uom de comaro 34•1 jirtor IX 344 Jiuor rrridr~t~l J4..f jiuor V 311 jiuor VI/ 344 jiuor X 3•N jibrmoghrio 344 iniiJiclor da via do jiuor teridrlfl! (TFPI) 344 proteína C 344 proteína S 344 prouína vitaminn K 344 rrombina 344 nh rin6lise 345 plaqucras 343 sistema fibrino lítico 54 5 /)-dimeros (DD) 345 plasminoghlio 345 produtos dr d~gmdartio do fibrinoghuo I' da Jibrinn (PDF) 345 Sisrmt as tam pões 545.546.547 amúnia 549 bic.trbonam 546 rqutt(áO dr Hmdason-Hnssrlbalcb 546 fo,f.uo 547 hemoglobina )47 H • li\'rC 5)0 proteína )47 Sódio 533 hipcrnatrcm ia 534 alremcõrs do LFí 534 hipo natrcmia 533 OSIIIOfafitfade pfliSIIIIÍtim t
5J3
olumt· do LEC. 'i.l l
781
tnpbylococcm nllre11s, n a me ning ite infecciosa aguda I 19 tnpbylococms epidermidis, na m eningite infecciosa ag uda 11 9 trrptoroccus d o grupo B, na m eni ng ite infecciosa ag uda 119 treptococcus pni'IIIIIOIIÍttl', na me ningite infecciosa agud a I 19 treptococw s pyogenes 68 1
T
T3 Livre 522 TJ Toral 522 T4 livre 522 métodos 522 diretos 522 indiretos 522 l~1 l assemias
26R
T.txa de filtra .io glomerula r 460 Tecidos e fragmcn ros ós eos, coleta 2 1 Técnica LISS - AGH 400 Técnicas bioq uím icas, ver Bio química Técn icas m icro cópicas ap licadas à mic ro b io logia 23 coloração com bra n o de calcofl úor 26 coloração de Wrighr-Giernsa 26 coloração pelo aw l de 10luid in a c azul de meri lcno 25 co lorações d irct.ts 24 rolomrtio drido-resistt'l/lt' modijicndn 25 colomrtio ''"'"mina-rodmnina 24 colornçtio dt' Crtt m 24 rolomçtio de Kinyo1111 24 mlomçtio de 7.ieiJ/-Neelsrn 24 olorações lluorcsccnres 25 cul tivo pri m.irio ::!.6 cultivo sccund:írio 26 exame di rcto sem colora áo 23 gorn pmdmu 2] microscopia dr campo esruro 24 prrpamrrio rom IJidróxido dr potdssio - K0!-1 ( I 0% ri 40%) 23 prepartl(ríO rom salina 23 prepamrtio com rinr11 dtl CIJi1111 24 solução iod11dn dr Iugo/ 2] testes de scm ibilidade a ant imicrobianos 27 merodologins 27 Tcmpka- Braun 295 anemia mcgalobLística 293 célu las 2?5 ·le rnpo p rotrombina 350 ei/StiÍOS dr III ÍStU T/1 350 sangrarnenro 349 trombina 35 1 trombopla.\tina parc ial ativado 350 Tcsre(s) 399 a rni nas. ver reste do KO H I0% compatibilidade pré-tram fusiona l 393 prsquisa dt' anticorpo irrt'gular - PAi 394 mipagrm Sflnguínrn ABOIR!Jo (D) 394 1ipngem sanguínefl AIJO/NIJo (D) do pt~t"ienrr 394 Coomhs 299 Coombs dircto 399 intr:tdérm ico 666 KOH 10°o 178
laboratoria is remow 48 rápidos 62 sensibilidade a antim icrobianos 27 lllt'lodologias 27 so ro lógicos. na ha n~eníasc I 12 ~oro l ógicos nas Lei hmanio es 66msaios imrmomzimtilicos- EI.ISA 66Tt'a(tÍO de aglruina(tÍO di reta- DA r 667 J't'll(tÍO dr imuuojluorrsdnci11 imlirrlrl - R/FI 667 lt'il l' imllnOCT0/111/IOgrtijico rrípido 667 tubcrculínico 9?
\XIi fT 178 T ipifi cação erirrocir:íria 377 Al30 382 Rho{O ) 382 variam e de D (O -Fraco) 380 Ti rcoglobulina - 35 T ireóide 519 c:mccr d e tireóidc 525 d ocnç.1 não tircoidia na 525
7J 525 T4 525 w tr do TR!-1 525 TSH 525 hipc:rr ireoidi:.mo 525 hipo ti reoidismo 524 hnrmón io(s) tireoidiano{s) '\ I ') libm1dor dr tirrotrofina (? RI{) 520 trrmiodotironina (T4) 5 19 rireotrófiro (1:5H ) 520 triiodorironinrt (7:3) 519 T ítulo, sorologia 53 7õxoplnsmn gondii. infecção por 639 Toxoplasmose 639 diagnóst ico labo ratorial 644 cinrtim dos anticorpos na in{r1p10 644 princípios 645 d iagnóstico sorológico da roxop lasmose congl:n i1n 648 diagnósti o sorológico em indi víd uos im unocompetemes 64(, d iagnóstico sorológico em indivíduos imunodeprimidos 64d iagnóstico so ro lógico na gc\l.t~.io 647 perfis :.orológicos na inf,·cç:io pelo 7óxoplnsma (,4? Tran sfcrrina 264 Tran uda tm 22 Trato resp iratório inferior, infc ç:io d o 81 aspcrgi losc pul mo nar 88 rwalitl(tio anatomopruológiw 90 imJrstigartio microbiológim 89 rlmims df' gml1icn molrmlnr 90 tmrs imunológicos 90 exame~ l'Spccíflcos 83 a/'ltfiti(IÍO dtl srcrr(tiO respimiÓT/fl 84 IJI'IIIOCIIfturtlS 84 tt•strs rir grniticn molt•mlm· 84 II'Sit'S iiiiiiiiOfógicos 81 exa mes gera is 83 pncumo istose pul monar 90 I'Xa mrs rspaificos 91 rxmnes grmis 91 Treponrmtl pallid um . infecção por 669
Trichomonas vagina/is 167. 174 Trig licérides 75 1
Trypnnosomn cm zi, infecção po r 651
trmims inmnoenzimdtirns 17 I Tricbomonas vagina/is I 67 Ureaplnsmn urenlyticum I 67 não gonocócica I 67 U rina cole ta 18. 442 exame de rotina, ver também Disfunção re nal 755 Urocu lrura 165
TSH 520.754 Tubnc ulose 93
v
Tro mbofll ia 355 investigação laboratorial 35') Troponina 500 elevação 50 I I rrmsilórins 50 I
Tuberc ulose exrrapulmonar 99 abordagem diagnósrica I 04 cut:l nca 101 e ndoh rônquica I 0 2 ga nglionar peri fé rica I 00 ga~ trimestin al I 02 gen it urinária I 00 laringe I 02 miliar 101 ocular I OI osreoa rricular I 00 prri ~rdica I 0 2 pleura l 99 sisrema nervoso cenrral I OI Tube rcu lose p ulmo na r 96 baciloscopia 9G cultura 97 mérodos moleculares 98 restes sorológ icos 98 Turbidimerria 57
u Úl e r:JS 22 U nidades in te rnac io nais 256 co nversão 256 Ureaplnsmn urenlyticum 167 Urcrri tc(s) gonocócica I 67 infecciosas I 67 nlgorftimo prtm a nborrlngem simplificndn dm u retrites I 72 Cblnmyrlia tracbomaris I 67 mlrurrt I 70 exnmr rlireto n ftrsro 170 exame clireto comt!o pelo Gmm 170 gonorócim 167 imunojluoresâncitt direla pam clamídin I 70 Micoplrtsmn genilnlium I 67 Micoplnsmn bominis 167 11(ÍO gonocócica 167 Neisserirt gonorrboene I 67 t!cnims dr genétim m olecular 171
Índ ice Remi ss ivo
Vagin ircs 173 abordagem sindrô mica de corrimenro vaginal 183 candid íase 174 c ulturas 180 exame de Papanicolaou 179 ex.une direto , 1 fresco 178 exame direro o rado pelo G ram 179 exames imuno lóg icos e hioquím icos 181 exa mes moleculares 18 1 medida de p H vaginal 17 8 mndidínse I 78 triromonÍtiSI' I 78 tlilginosr brtrlrritma I 78 te> te do KOH 10% 178 mndidíase 1-8 triromonínse 178. 179 l'ltginosr bartrrinna 178. 179 7/·iciJomontu o11ginalis 174 Vagi nose 173 Va lores predir ivos 14 Variação b io lógica 13 valor d e referenc ia individual 13 VD RL 673 Velo cidade de hc mossedimcnração (V H S) 688.699.754 Vias respirató rias sup eriores. colera 17 \librio 142 V itamina B 12 294. 296.749 ddlciência 294 Viramina K 358 amagonista, rla 358 defi ciência 353 Volume corpuscula r m éd io (VCM) 246. 263
w \'(frstem-blol 62
y Yersinia 143
783
Formaw: 210 x 280 mm Composro e m Cronos Pro, Furu ra e Wingd ings Papel couchê 80g/m 2 (miolo) Pa pe l couchê 150g/m 2 (capa) lmpressao e acabamento: Edelbra Belo Ho rizonre, 2009
SUMÁRIO
Pranchas Coloridas .................................................................................................................................................
01
In trodução
à Medicina Laboratorial ......................................................................................... 1
Luciana de Gouvêa Viana
02
Interpretando resultados de exa mes laboratoriais ....................................................... 11 Fernando Valadares Basques
03
Diagnóstico m icrobiológico: princípios
e técnicas
...................................................... 15
Lucienne França Reis Paiva, Maria de Fátima Fi/ardi Oliveira Mansur
04
Diagnóstico hematológico: princípios e técnicas ......................................................... 29 Cybele de Andrade Paes, Sandra Guerra Xavier, Teresa Bunte de Carvalho
OS
D iagnóstico bioquím ico: princípios
e técn icas ................................................................ 41
Myriam de Siqueira Feitosa, Rosângela Fátima Di Lorenzo Pires
06
Diagnóstico imunológico: princípios
e técnicas ............................................................ 49
Leonardo de Souza Vasconcellos, Silvana Maria Eloi Santos
07
Diagnóstico genético: princípios
e técnicas
....................................................................... 65
Edilberto Nogueira Mendes, Paula Prazeres Magalhães, Guilherme Birchal Coi/ares
08
M icrobiota indígena ................................................................................................................................ 75 Guilherme Birchal Coi/ares, Lucienne França Reis Paiva, Hyllo Baeta Marcel/o júnior
09
Investigação laboratorial do paciente
com infecção do trato respiratório inferior ........................................................................ 81 Bruno Horta Andrade, Stella Sala Soares Lima, Wanessa Trindade Clemente 1o
Investigação laboratorial do paciente com micobacterioses: Mycobacterium tuberculosis e micobactérias não tuberculosas ...................... 93
Silvana Spíndola de Miranda 11
Investigação laboratorial do paciente com m icobacterioses:
Mycobacterium leprae .......................................................................................................................... 107 Marcelo Grossi Araújo, Ana Regina Coelho de Andrade, Andréa Machado Coelho Ramos 12
Investigação laboratorial do paciente com meningite infecciosa ....................... 117
Luciana de Gouvêa Viana 13
Investigação laboratorial do paciente séptico ............................................................... 127
Luciana de Gouvêa Viana
14
Investigação laboratorial do paciente com diarréia infecciosa aguda .............................................................................. 135
Edilberto Nogueira Mendes, Paula Prazeres Magalhães, Mireille Ângela Bernardes Sousa, Rodrigo Estêvão Teixeira 15
Investigação laboratorial do paciente com infecção por Helicobacter pylori .................................................................................... 151
Andreia Maria Camargos Rocha, Gifone Aguiar Rocha, Taciana de Figueiredo Soares, Dulciene Maria de Magalhães Queiroz 16
Investigação laboratorial do paciente com infecção do trato urinário ......................................................................... 161
Luciana de Gouvêa Viana 17
Investigação laboratorial das uretrites infecciosas ........................................................ 167
Rodolfo de Braga Almeida 18
Investigação laboratorial das vaginites e vaginose ....................................................... 173
Rodolfo de Braga Almeida, Marcos Mendonça
19
Investigação laboratorial das micoses superficiais e profundas .................... 185 Marcus de Almeida Magalhães Gontijo, Marcelo Luide Pereira Gonçalves, Hyllo Baeta Marcel/o júnior
20
Investigação laboratorial do paciente com helmintíases e protozooses intestinais .................................................................... 217 Míriam Oliveira e Rocha
21
A origem, o desenvolvimento e a função das células do sangue ............................................................................................. 233 Henrique Neves da Silva Bittencourt, Gustavo Henrique Romani Magalhães, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
22
O estudo do sangue periférico através do hemograma ...................................... 24 1 Marcelo Eduardo de Lima Souza, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
23
O paciente anêmico ................................................................................................................................ 259 Cristiane Monnaísa Firmino da Silva, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
24
Investigação laboratori al do paciente com anemia m icrocítica ....................... 263 Rachel Aparecida Ferreira Fernandes, Maria Christina Lopes Araújo Oliveira, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
25
Investigação laboratorial do paciente com anemia normocítica ......................... 277 Rachel Aparecida Ferreira Fernandes, Camila Silva Peres Cancela, Paulo do Vai Rezende, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
26
Investigação laboratorial do paciente com anem ia macrocítica .......................... 293 Nelma Cristina Diogo Clementina, Fernanda Maria Lodi, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
27
Investigação laboratori al do paciente com desordem leucocitária ................................................................................... 305 Ana Beatriz Firma to Glória, }osé Roberto de Faria
28
Investigação laboratorial do paciente com m ielodisplasia ................................ 319 Evandro Maranhão Fagundes
29
Investigação laboratorial do paciente com leucemia aguda ............................ 325 Sandra Guerra Xavier; Cybele de Andrade Paes, Teresa Bunte de Carvalho
30
Investigação laboratorial do paciente com distúrbio hemorrágico ............. 343 Daniel Dias Ribeiro, Ana Flávia Leonardi Tibúrcio Ribeiro, Rosa Ma/ena De/bane de Faria
31
Investigação laboratorial do paciente com trom bofi lia ....................................... 355 Daniel Dias Ribeiro, Ana Flávia Leonardi Tibúrcio Ribeiro
32
Aspectos laboratoriais da hemoterapia .............................................................................. 365 Mitiko Murao, Henrique Neves da Silva Bittencourt, )osé Silvério Garcia
33
Investigação laboratorial do paciente com disfunção hepática ................... 409 Pedro Guatimosim Vidigal, Leonardo de Souza Vasconcellos, Lucimar Gonçalves de Souza Assunção, Elza Santiago Erichsen
34
Investigação laboratorial do paciente com pancreatite aguda ...................... 43 1 Raimundo Fontenelle Mascarenhas
35
Investigação laboratorial do paciente com disfunção renal ............................. 439 Pedro Guatimosim Vidigal
36
Investigação laboratorial do diabetes melito e outras categorias de distúrbios na homeostase glicêmica ................................. 469 Eduardo Pimentel Dias, Márcio Weissheimer Lauria, Maria Marta Sarquis Soares, Pedro Guatimosim Vidigal
37
Investigação laboratorial do paciente com doença aterosclerótica e dislipidemias ................................................................... 485 Letícia Maria Henriques Resende, Márcio Nunes da Silva
38
Investigação laboratorial nas síndromes coronarianas agudas ..................... 497 Márcio Nunes da Silva, Letícia Maria Henriques Resende
39
Metodologia da propedêutica do Sistema Endócrina: uma visão sistêmica e avaliação crítica ................................................................................ 507 Eduardo Pimentel Dias, Luisane Maria Falei Vieira, Maria Marta Sarquis Soares
40 Investigação laboratorial dos distúrbios da função tireoidiana .......................... 519 Maria Marta Sarquis Soares, Luisane Maria Falei Vieira, Eduardo Pimentel Dias 41
Investigação laboratorial dos distúrbios hidroeletrolíticos ................................ 529
Lucimar Gonçalves de Souza Assunção, Elza Santiago Erichsen 42
Invest igação laboratorial dos distúrbios ácido-básicos ......................................... 545
Elza Santiago Erichsen, Lucimar Gonçalves de Souza Assunção 43
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HIV ...................... 559
Fabiana Maria Kakehasi, Juliana Ribeiro Romeiro, Maria Luiza Silva, Si/vana Maria Elói Santos 44
Invest igação laboratorial da infecção pelo HTLV ....................................................... 577
Marina L. Martins, Edel F Barbosa Stancioli, Gustavo E. Brito Melo, jordana G. Alves Coelho dos Reis, O/indo A Martins Filho, Grupo Interdisciplinar de Pesquisa em HTLV (GIPH) 45
Investigação laboratorial do paciente com hepatite pelo HAV e hepatite pelo HEV ............................................................... 587
Eleonora Druve Tavares Fagundes, Alexandre Rodrigues Ferreira, Mariza Leitão Valadares Roquete
46
Investigação laboratorial do paciente com hepatite pelo H BV e pelo HDV ..................................................................................... 595 Eliane Lustosa Cabral Gomez
47
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo HCV ........................ 607 Eliane Lustosa Cabral Gomez
48
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Epstein-Barr vírus .................................................................................... 6l3
Silvana Maria Eloi Santos, Marcelo Luide Pereira Gonçalves, Suzane Pretti Figueiredo Neves,
49
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo citomegalovírus ....................................................................................... 6l9
Suzane Pretti Figueiredo Neves, Wanessa Trindade Clemente
50
Investigação laboratorial do paciente com rubéola ................................................ 629 Taciana de Figueiredo Soares
51
Investigação laboratorial do paciente com in fecção pelo Toxop/asma gondii ................................................................................. 639 Júlio César de Faria Couto, Suzane Pretti Figueiredo Neves
52
Investigação laboratorial do paciente co m doença de Chagas ..................... 651 Eliane Dias Gontijo, Lúcia Maria da Cunha Gaivão, Silvana Maria Elói Santos
53
Investigação laboratorial das leishmanioses .................................................................... 661 Luciana de Gouvêa Viana, Zélia Profeta da Luz, Ana Lúcia Teles Rabello
54
Investigação laboratorial do paciente com infecção pelo Treponema pallidum ........................................................................... 669 Rômulo Carvalho Vaz de Mel/o, Guilherme Birchal Cofiares
55
Investigação laboratorial do paciente com febre reumática aguda .................. 68 1 Cleonice de Carvalho Coelho Mota, Leonardo de Souza Vasconcellos, Silvana Maria Eloi Santos
56
Marcadores laboratoriais de fase aguda da inAamação ....................................... 693 Guilherme Birchal Cofiares, Pedro Guatimosim Vidigal
57
Investigação laboratorial do paciente co m I upus er1tematoso s1stem1co .......................................................................................................... 705 I
•
•
A
•
Suzane Pretti Figueiredo Neves, Raquel Lara Furlan
58
Investigação laboratorial do paciente com artrite reumatóide ..................... 717 Ana Beatriz Cordeiro de Azevedo, Luis Eduardo Coelho Andrade
59
Investigação laboratorial dos marcadores tumorais ................................................ 727 Rômulo Carvalho Vaz de M el/o, Guilherme Bircha/ Cofiares
60
Dosagem de hCG no diagnóstico da gravidez ............................................................. 741 Myriam de Siqueira Feitosa, Silvana Maria Eloi Santos, Vânia Abadia Soares Lino
61
Particularidades da Medicina Laboratorial no pacien te idoso ....................... 747 Guilherme Birchal Coi/ares, Marília Campos Abreu Marina, Rômulo Carvalho Vaz de Mel/o, Edgar Nunes de Moraes
62
Investigação laboratorial do paciente com erro inato do metabolismo ....................................................................... 757 Eugênia Ribeiro Valadares
Ín d.ICe Rem .. iSSIVO .................................................................................................................................................... 769
Figura 4.5 - Esfregaço de asp1rado de medula óssea corado por May-Grunwald·G1emsa. comendo panículas medulares na extremidade caudal Ver pag na 34
Figura 11.1 - Hanseníase tndetermrnada (Serv1ço de Dermarolog1a do Hosp1tal das Clínrcas da1JFMG). ~ na,: 1 709
Fiu
fluefeKttnc:KJ torr,"to fi\IC'ft!'t.c6nc.a Veri'TIO ho 250~
20CH R3
150
100
o
·50
e
"Zl
Q
O u
R2
0-t---;;:=:.. r o 50 100 150 200 250 FSC -
Figura 4.7 - Desenho esquemátiCO demonstrando o pnncipto da Ctromerna de Fluxo. Ver pag 1 a 37
Figura 11.2 - Hanseníase tuberculótde (Servrço de Dermarolog1a do Hosprtal das Clín1cas da UFMG). \ r 1 , , 1 109
Figura 4.9 - Hlbndação m srtu com fluorescêncra para pesqUisa do gene de fusão BCR ABL Ver pág 1 a 38
Pranchas colondas
Figura 11.3 - Hanseníase wchow1ana (Servtço de Dermarologra do Hospttal das Clín1cas da UFMG) ~ r 1', 70 L
III
F1gura 11.4 - Hanseníase d1morfa (Serv1ço de Dermatologia do Hosp1tal das Ciln1cas da UFMG). ~ pág r'
Figura 18.2- Vag1nose: célula 1nd1cadora, m1crob1ota alterada com Intensa redução dos lactobaolos. presença de cocobaolos e bastonetes curvos e finos. Gram lábe1s. Va oog1r1a 780
-
.. Figura 11.5 - Mycobactenum leprae em glob1as. corados em vermelho (aumenro de lOOOx). \- ·r págn' 1 li
Figura 18.3 - Esfregaço do flu1do vag1nal normal corado pelo Gram (x100) m1crob1ota vag1nal com a presença de bastonetes Gram positivos (Flora Dóderlem) e células superfioa1s da mucosa vag1nal. Vu pag,r1a ISO
-., ::
' p
~
~
-
/
Figura 18.1 - Esfregaço do flu1do vag1nal normal corado pelo Gram (x100): microbiota vag1nal com a presença de bastonetes GrampoSitivos (Flora Dóderlem) e células superfioa1s da mucosa vag1nal.
Verp(l..: •
IV
Medicina laboratorial para o clínico
Figura 18.4 - Esfregaço do flu1do vag1nal normal corado pelo Gram (xlOO): m1crob1ota vag1nal com a presença de basroneres Gram positivos (Flora Dóderle1n) e células superfioa1s da mucosa vag1nal. vc, pogaw 180
a
1 P1edra branca (lOOX).
F1 ur J 19 3 B Escamas dérm1cas de unha clanficadas com KOH 2096. lllfas sepladas e arroconid1os {400X). Ver pá! na 195 r
F1gura 19.4 - Phtalophora verrucosa. Ver pogmo 799
•
f1 1.1 a ~ A Escamas dérm1cas de unha clanficadas com KOH 20%. Hlfas sep[adas e arroconíd10S {400X~
Pranc.hJs c.olondas
Fgur.1 19 S A Esporocncose hnfocu[ânea. , 'pagma 203
v
Figura 19.7- Cryptococcus em t inta da China. h r págma 209
Figura 19.5 B- Espororricose linfocurânea. Ver págma 203
Figura 20.1 A - Método de Hoffman, Pons e)aner: fezesd1luídas em água. sendo filtradas em gaze com Oito dobras. V' 1 pQJ'itlO 2. •
Figura 19.5 C - Espororricose linfocurânea. Ver págma 203
Figura 19.6 - Grocott (400X). v~ r págma 205
VI
Medicina laboratorial para o clínico
Figura 20.1 B - Método de Hoffman, Pons e )aner: sed1menração • das fezes em cálice côn1co. Ver pag no ) 14
Figura 20.2 A -Método de MI FC (Biagg et a/.). Mareríal necessário. Ver pagma 224
Figura 20.3 A -Método de Baermann-Moraes. Ver pag1t1a 225
Figura 20.2 B- Tubos comendo as fezes em conservanre. após filrração em gaze; após acrescenrar o érer; após ag1ração v1gorosa; após cenrrifugação, mosrrando as camadas de érer, gordura e demros, conservame e o sedimemo e rubo comendo apenas o sedimemo, após a rerirada das camadas superiores. Ver pag1110 224
Figura 20.3 B- Mérodo de Baermann-Moraes. Ver págma 225
Pranchas coloridas
VIl
Figura 20.5 B - Oocrsros de I. belll {40X), corados pelo Método de Hennksen e Pohlenz {denvado do Zrehi-Neelsen). , ·r pagrna 2h
Figura 20.2 C - Método de Rugar. Ver pag ''O 225
-
I
I
I
i
•
~
Figura 20.4 - Preparação de lâmrna pelo método de Karo-Katz. Ver pag na 225
Frgura 20.6 A - Método de Faust et ai. Tubos de Wassermann, mostrando as vánas etapas do método. Fezes drluídas em água após 1•. 2• e 3• centrifugações. Após centrifugação com ZnSO" a 33%, mostrando a película superficral. onde estão as formas para srtanas mais leves (ovos leves, cisros e oocrsros). r 1;á ,,,a 226
Figura 20.5 A- Oocistos de C parvum (lOOX). Ver pagma 225
Figu ra 20.6 B - Coleta da película, com o auxílio de uma alça de plauna. Vu paJ?rna )(6
VIII ( Medicina laboratorial para o clínico
)f ----------- -- - - -- - - -- - - - -- - - -- - - -
Tomonho
Complexidade
Figura 21.5 - Foromicrograna de esfregaço de sangue periférico mostrando neutrófilos segmentados. Vet págma 1.37
Figura 22.3 - Representação esquemática da separação dos leucóciros por orometria de fluxo. Ver pagma 244
Figura 21.6 - Fotomicrografia de esfregaço de sangue periférico mostrando monómo. Ver pag1na 238
Figura 22.4 A - Fotomicrografla de esfregaço de sangue periférico mosrrando esferómos, aniSOCitose e pohcromarofiha. Ver pagma Lso
Figura 21.7 - Fotomicrografia de esfregaço de sangue perifénco mostrando eosinófilo. ver págma 238
Figura 21.8 - Forom1crografia de esfregaço de sangue perifénco mostrando basófilo. \> ., pag111a 238
Pranchas coloridas
Figura 22.4 B - Fotomicrografia de esfregaço de sangue penfénco mostrando hipocromia. m1crocirose, an1somose. po1quilomose e células em alvo.Ver pag1na 25 J
IX
Figura 22.5 - Representação esquemác1ca das células do sangue. A: emrómo; B: neutrófilo segmentado; C: eos1nófilo; D: basofilo; E:
monómo; F.linfóc1to; G: plaqueta. Ver pagma 252
Figura 29.4 - Fotom1crograf1a de esfregaço de asp1rado de medula óssea {May-Grünwald-G1emsa, x 1000), Leucem1a hnfoblást1ca aguda. Medula óssea h1percelular infiltrada por llnfoblastos pleomórflcos apresentando grande vanabihdade em formato e tamanho. \e1! 1 ,,
F1gura 29.7 - Hibndação m s1tu com nuorescênoa para pesqu1sa do gene de fusão BCR-ABL. H1bndação m s1tu com nuorescênoa de sonda específica para pesqu1sa do gene de fusão BCR-ABL em núcleo 1nterfás1co de medula óssea. A sonda é composta da m1s· cura de duas sondas de DNA. uma para o gene ABL {laranJa) em 9q34 e a outra para o gene BCR (verde) em 22q11.2. Nas células com translocação emre os cromossomas 9 e 22, um s1nal verde é observado no cromossoma 22 normal (seta ma1or), o Sinal laranJa pode ser v1sto em ambos os homólogos do cromossoma 9 (setas menores) e um sinal amarelo da fusão. resultante da presença dos sma1s verde e laranJa JUntos, é venficado no cromossoma 22 denvanvo (seta vazada). Coloração de fundo: DAPI (cortesia do Setor de Citogenética do Serviço de Med1ona Laboratonal do Hosp1ral das Clí111cas da UFMG). vt1 pag111o Jr,()
o tvt-) I moooctonal
ctl
11
A,
I
B
Prova rev./Rev gr Grupo inverso
133' 11
Figura 32.2 -Modelo de carrão (cartela) para t1pagem ABO (di reta e reversa) e Rho(D). h r ! ,~r a '8"
X
Medicina laboratorial para o clínico
Figura 32.5 - Exemplo de reação posmva fraca em gel. Ver pagma
386
Figura 32.3 - Exemplos de np1ficaçào ABO (direta e reversa) e Rho(D). va pagma 385
Figura 32.6 - Exemplo de reação pos1t1va 1+ em gel. \-'et págma
386
Figura 32.4 - Exemplo de reação negar1va em gel. Ver pág~r~a 385
Figura 32.7 - Exemplo de reação pos1uva 2+ em gel. Ver págma
386
Pranchas coloridas
XI
I
Figura 32.8 - Exemplo de reação pos1Uva 3+ em gel. vc:r pagmo
F1gura 35.29 A- HemáCias d1smórf1cas (Cortesia do Dr Leonardo de Souza Vasconcellos). Ver págma '158
~81
Figura 32.9 - Exemplo de reação pos1t1va 4+ em gel. Ver Vdg111u iBJ
Figura 32.10 - Exemplo de dupla população, reação pos1t1va 3+ a 4+ ~u oa ·rw ~"
XII
Medicina laboratorial para o clínico
Figura 35.29 B - HemáCias d1smórficas (Corres1a do Dr. Leonardo de Souza Vasconcellos). o' , 1 8
Figura 49.1 - B1óps1a teCidual corada por HE. ev1denmndo Inclusões v1ra1s. v ·r pog1r 1 6
Figura 49.2 - Anrigenemia para CMV demonstrando células posiuvas. Ver págma 623
F1gura 52.3 - Formas tnpomastigmas em sangue perifénco de paoenre com quadro de reativação após transplante cardíaco. ver p1giiJO 659
Figura 53.5 - Técn1ca de aplicação da Reação de Montenegro. Fome: Laboratóno de Pesquisas Clín1cas do Centro de Pesqu1sas René Rachou/FIOCRUZ. Ver pagma 60
Figura 53.6- Reação de Montenegro pos1t1va (delimitação da en· duração com caneta esferográfica). Fome: Laboratório de Pesquisas Clín1cas do Centro de Pesqu1sas René Rachou/FIOCRUZ. h:r pagma 667
.,.-'\
,. ./
• Figura 53.4 -Formas amast~gotas de Leishmama spp. Fome: Labo· ratóno de Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas René Rachou/ FIOCRUZ. Vu pag1na 665
Pranchas coloridas
Figura 54.1 - Imagem de microscopia de VDRL. À esquerda de floculação em teste reagente. À direita, ausênoa de floculação em reste não reagente. Ver págma 673
XIII
Figura 54.2 - Reação de hemaglutinação indireca (MHA-TP). À esquerda, imagem em tapete do reste reagente. À direita, imagem em botão do reste não reagente. Ver págma 674
Figura 54.3 - Foro de microscopia de Auorescência de imunofluorescência indirera (FTA-ABS) para sífilis. A presença de treponemas Auorescentes indica teste positivo. Ver págma 674
Figura 57.1 B - Padrão nuclear homogêneo. No meio do campo vemos uma placa metafásica fluorescente, indicando presença de anticorpos anri- DNA ou anti-hismnas. Não há marcação do citoplasma. Ver págma 708
XIV [ Medicina laboratorial para o clínico
Figura 57.1 C- Padrão nucleolar. Ver págma 708
Figura 57.1 D- Padrão nuclear pontilhado centromérico. Vê-se Auorescência dos centrômeros e placa metafísica Auorescente devido ao alinhamento dos cromossomas na metáfase. Ver págma 708
Figura 57.1 E - Padrão nuclear pontilhado. Vêem-se pomos fluorescentes correspondentes a anticorpos contra proteínas nucleoplasmáticas, que poupa a região dos nucléolos. Ver págma 708
]1----- - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - -
Figura 58.2 - Anr1corpo antJfawr pennuclear {APF). lmunofluorescêncía índ1reta em queratínómos da mucosa oral. Soro diluído 1/160. ConJugado: JSOtJooanaw de fluoresceína. Magmfícação 400X. Os corpos cerarohíalinos repleros de filagrína apresenram-se d1sposros e corados ao redo' do núcleo. Ver pagma '2:
Pranchas coloridas
Figura 58.3 - Anricorpo anrí-queratína (AKA). lmunofluorescênoa 1ndíreta em corte transversal de esôfago de rato. Soro diluído 1/10. Conjugado: JSotioc1anaro de fluoresceína. Magnificação 200X. A reatJVJdade resmta à camada córnea está represenrada por fluorescênoa lam1nar e linear concênmca. A coloração 1nrensa da mucosa é não específica. ver pag:na ~'
XV
I
l/Wl
