Makalah fitokimia “identifikasi dan isolasi senyawa lipid”
Disusun oleh: Deri Reinaldo M
A 01010006
Yogma Purnarit M
A 01010010
Merry
A 01010017
Margianna wijayanti A 01010027 Marizca Mudiarti
A 01010029
Dewi Sri Rahayu
A 01010035
Sutopo
A 01010083
Indra Lesmana
A 0820044
Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Bandung
Kata Pengantar Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa, sehingga kami dapat menyelesaikan penyusunan makalah ini yang tepat pada waktunya yang berjudul “ identifikasi dan isolasi senyawa lipid”, guna memenuhi tugas
fitokimia. Kami menyadari masih banyak kekurangan dan kelemahan dalam penyusunan makalah ini, oleh karenanya kami penyusun megharapkan keritik dan saran yang sifatnya membangun demi perbaikan. Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi siapa saja yang membaca nya. Bandung, Desember 2012 Tim penyusun
BAB I Pendahuluan
1.1 Latar belakang
Salah satu kelompok senyawa organik yang terdapat dalam tumbuhan, hewan, dan manusia dan sangat berguna bagi kehidupan manusia adalah lipid. Lipid adalah senyawa organik yang terdapat dalam alam serta tak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik non polar seperti hidrokarbon atau dietil eter. Suatu lipid tersusun atas asam lemak dan gliserol (Jatilaksono,2007).
Struktur lipid Berdasarkan strukturnya, lipid dapat dibagi menjadi 2: 1. lipid dengan rantai hidrokarbon terbuka. Contohnya, asam lemak, TAG, spingolipid, fosfoasilgliserol, glikolipid 2. lipid dengan rantai hidrokarbon siklik Contohnya, steroid (kolesterol)
Lipid memiliki sifat umum sebagai berikut:
tidak larut dalam air
larut dalam pelarut organik seperti benzena, eter, aseton, kloroform, dan karbontetraklorida
mengandung unsur-unsur karbon, hidrogen, dan oksigen, kadang-kadang juga mengandung nitrogen dan fosfor.
Apabila dihidrolisis akan menghasilkan asam lemak
Berperan pada metabolisme tumbuhan dan hewan Struktur lipid yaitu memiliki kepala yang bersifat polar dan ekor
hidrokarbon yang bersifat nonpolar. Dalam suatu larutan, kepala yang bersifat polar dapat berasosiasi dengan air, sehingga membentuk senyawa amfipatik (memiliki dua kutub positif dan negatif). Selain itu, lipid dapat membentuk formasi satu lapis lipid (monolayers), dua lapis lipid (bilayers), misel, dan vesikula (shofyan, 2010).
Klasifikasi lipid a.
Menurut sifat kimia (berdasarkan atas reaksinya dengan basa kuat) 1. Lipid
tersabunkan
(hidrolisis
dengan
basa)(latin:
sapo
,
soap=sabun=garam asam lemak). Contohnya adalah TAG (triasil
gliserol) dan fosfolipid. 2. Lipid tak tersabunkan. Contohnya : sterol (kolestrol), vitamin yang larut dalam lemak. b.
Menurut Bloor : 1.
Lipid sederhana. Contohnya: minyak (TAG/trigliserida) jika
dihidrolisis menghasilkan asam lemak dan gliserol. 2.
Lipid kompleks. Contohnya: fosfolipid dan glikolipid.
3.
Lipid turunan adalah senyawa-senyawa yang dihasilkan bila lipid
sederhana dan lipid kompleks mengalami hidrolisis. Contohnya: asam lemak, gliserol, alkohol padat, aldehid, keton bodies. (shofyan, 2010) Lipid berperan penting dalam komponen struktur membran sel. Lemak dan minyak dalam bentuk trigliserol sebagai sumber penyimpanan energi, lapisan pelindung, dan insulator organ-organ tubuh. Ada beberapa fungsi dari lipid, yaitu: 1. Sebagai sumber energi (memiliki kandungan 9 kkal/g) 2. Unsur pembangun membran sel dan bertanggung jawab untuk lewatnya berbagai bahan yang masuk dan keluar sel. 3. Sebagai pelindung organ-organ penting, penyekat jaringan tubuh. 4. Menjaga tubuh terhadap pengaruh luar. Misalnya: suhu, luka (infeksi). 5. Insulator listrik (agar impuls-impuls syaraf merambat dengan cepat). 6. Membantu melarutkan dan mentransport senyawa-senyawa tertentu (misal vitamin) dalam aliran darah untuk keperluan metabolisme.
Terdapat beberapa jenis-jenis lipid, yaitu:
Asam lemak, terdiri atas asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh
Gliserida, terdiri atas gliserida netral dan fosfogliserida (fosfolipid)
Lipid kompleks, terdiri atas lipoprotein dan glikolipid
Non gliserida, terdiri atas sfingolipid, steroid, dan malam
Reaksi kimia dan sifat khas lipid 1.
Hidrolisis Hidrolisis lipid seperti triasilgliserol dapat dilakukan secara enzimatik dengan
bantuan lipase, menghasilkan asam-asam lemak dan gliserol. 2.
Penyabunan Hidrolisis lemak oleh alkali disebut penyabunan, yang dihasilkan adalah
gliserol dan garam alkali asam lemak yang disebut sabun. 3.
Cara analisis untuk mengenali sifat lipid Ini termasuk penetapan titik lebur, suhu, beku dan angka bias, serta penetapan kimia tertentu seperti berikut: a. Bilangan penyabunan b. Bilangan asam c. Bilangan polenske d. Bilangan reichert meissl e. Bilangan yodium
4.
Kromatografi gas-cairan Kromatografi gas-cairan menyangkut pemisahan fisik dari fasa gas yang
bergerak oleh adsorpsi pada fasa stasioner yang terdiri atas zat padat yang lamban terdiri atas batu tahan api. 5.
Kromatografi lapis tipis Kromatografi lapis tipis dilakukan pada lempengan gelas yang sebelumnya
dilapisi dengan bubur adsorben yang tipis.
6.
Zat yang tidak dapat disabunkan Zat yang tidak dapat disabunkan adalah zat dalam lemak alam yang tidak
dapat disabunkan dengan alkali tetapi larut dalam eter atau petroleum eter. 7.
Hidrogenasi Hidrogenasi lemak tidak jenuh dengan adanya katalisator (nikel) dekenal
sebagai “pengerasan” (hardening).
8.
Ketengikan Ketengikan adalah perubahan kimia yang menimbulkan bau dan rasa tidak
enak pada lemak. 9.
Oksidasi spontan Minyak yang mengandung asam lemak sangat tidak jenuh (misalnya, minyak
biji rami) dioksidasi spontan oleh oksigen atmosfir pada temperatur biasa dan membentuk zat yang keras dan tahan air. 10. Membran, misel, liposom, dan emulsi Pada umumnya lipid tidak larut dalam air, karena mereka banyak mengandung gugus nonpolar (hidrikarbon).
1.2. Metode Isolasi
1.2.1 Ekstraksi Jaringan daun segar diekstraksi secara maserasi dalam 20 volume isopropanol dingin (alkohol ini menginaktifkan enzim hidrolitik) dan dilanjutkan dengan ekstraksi ulang memakai campuran kloroform-metanol ( 2:1 ). Jaringan biji dapat diekstraksi langsung dengan campuran pelarut terakhir ini atau dengan eter minyak bumi. Untuk jaringan yang lipidnya terikat sangat kuat, seperti padipadian dianjurkan ekstraksi menggunakan campuran kloroform-metanol-air (200:95:5). Ekstrak langsung hendaknya disimpan pada suhu -5
0
C dengan
menambahkan sesepora antioksidan 0,005 % hidroksi-toluena terbutilasi ( BHT ).
1.2.2 Fraksinasi Sebelum dianalisis lebih lanjut, pada tahap ini sering kali kita harus memisahkan lipid ke dalam fraksi netral dan fraksi polar, serta menghilangkan steroid dan pencemar lain. Hal ini dapat dilakukan dengan kromatografi kolom pada asam silikat dalam larutan eter. Lipid netral akan lewat, meninggalkan fosfo dan glikolipid lipid yang terjerap, dan kemudian dapat diperoleh kembali dengan mengelusi kolom menggunakan campuran kloroform-metanol. Hasil yang sama dapat diperoleh dengan KLT preparatif pada silika gel dengan kloroform sebagai pengembang ; trigliserida bergerak sampai setengah jalan ke bagian atas plat, meninggalkan lipid lain pada garis awal.
1.3. Cara Identifikasi Lipid
Terdapat berbagai macam uji yang berkaitan dengan lipid yang meliputi analisis kualitatif maupun kuantitatif. 1.3.1. Uji Kualitatif Lipid a. Uji kelarutan Lipid Uji ini terdiri atas analisis kelarutan lipid maupun derivat lipid terhadap berbagai macam pelarut. Dalam uji ini, kelarutan lipid ditentukan oleh sifat kepolaran pelarut. Apabila lipid dilarutkan ke dalam pelarut polar maka hasilnya lipid tersebut tidak akan larut. Hal tersebut karena lipid memiliki sifat nonpolar sehingga hanya akan larut pada pelarut yang sama-sama nonpolar. b. Uji akrolein Dalam uji ini terjadi dehidrasi gliserol dalam bentuk bebas atau dalam lemak/minyak menghasilkan aldehid akrilat atau akrolein. Menurut Scy Tech Encyclopedia (2008), uji akrolein digunakan untuk menguji keberadaan gliserin atau lemak. Ketika lemak dipanaskan setelah ditambahkan reagen pendehidrasi (KHSO4) yang akan menarik air, maka bagian gliserol akan terhidrasi ke dalam
bentuk aldehid tidak jenuh atau dikenal sebagai akrolein (CH 2=CHCHO)yang memiliki bau seperti lemak terbakar dan ditandai dengan asap putih. c. Uji ketidakjenuhan lipid Digunakan untuk mengetahui asam lemak yang di uji apakah termasuk asam lemak jenuh atau tidak jenuh dengan menggunakan pereaksi Iod Hubl. Iod Hubl ini digunakan sebagai indikator perubahan. Asam lemak yang diuji ditambah klorofor sama banyaknya. Tabung dikocok sampai bahan larut. Setelah itu, tetes demi tetes pereaksi Iod Hubl dimasukkan kedalam tabung sambil dikocok dan perubahan warna yang terjadi terhadap campuran yang diamati. Asam lemak jenuh dapat dibedakan dari asam lemak tidak jenuh dengan cara melihat strukturnya. Asam lemak tidak jenuh memiliki ikatan ganda pada gugus hidrokarbonnya. Reaksi positif ketidakjenuhan asam lemak ditandai dengan timbulnya warna merah ketika Iod Hubl diteteskan ke asam lemak, lalu warna kembali lagi ke warna awal kuning bening. Warna merah yang kembali pudar menandakan bahwa terdapat banyak ikatan rangkap pada rantai hidrokarbon asam lemak. d. Uji ketengikan Dalam uji ini, diidentifikasi lipid mana yang sudah tengik dengan yang belum tengik yang disebabkan oleh oksidasi lipid. Minyak yang akan diuji dicampurkan dengan HCl. Selanjutnya, sebuah kertas saring dicelupkan kelarutan floroglusinol. Floroglusinol ini berfungsi sebaai penampak bercak. Setelah itu, kertas digantungkan di dalam erlemeyer yang berisi minyak yang diuji. Serbuk CaCO3 dimasukkan kedalam erlemeyer dan segera ditutup. HCl yang ditambahnkan akan menyeimbangkan ion-ion hidrogennya yang dapat memecah unsur lemak sehingga terbentuk lemak radikal bebas dan hidrogen radikal bebas. Kedua bentuk radikal ini bersifat sangat reaktif dan pada tahap akhir oksidasi akan di hasilkan peroksida.
e. Uji salkowski untuk kolestrol Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi keberadaan kolestrol. Kolestrol dilarutkan dengan kloroform anhidrat lalu dengan volume yang sama ditambahkan asam sulfat. Asam sulfat berfungsi sebagai pemutus ikatan ester lipid. Apabila dalam sampel tersebur terdapat kolestrol, maka lapisan kolestrol dibagian atas menjadi berwarna merah dan asam sulfat terlihat berubah menjadi kuning dengan warna flouresens hijau. f.
Uji lieberman buchard Prinsip uji ini adalah mengidentifikasi adanya kolestrol dengan
penambahan asam sulfat kedalam campuran. Sebanyak 10 tetes asam asetat dilarutkan ke dalam larutan kolestrol dan kloroform(dari percobaan salkowski). Setelah itu asam sulfat pekat ditambahkan. Tabung dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Mekanisme yang terjadi dalam uji ini adalah ketika asam sulfat ditambahkan kedalam campuran yang berisi kolestrol, maka molekul air berpindah dari gugus C3 kolestrol kemudian teroksidasi membentuk 3,5kolestadiena. Produk ini di konversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang menghasilkan warna hijau. Warna hijau ini menandakan hasil yang positif. Reaksi positif uji ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari terbentuknya warna pink kemudian menjadi biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau tua. 1.3.2. Uji Kuantitatif Lipid Untuk menganalisa kandungan lemak dalam makanan yang dapat dilakukan dengan cara volumetri, gravimetris, dan kromatografi. Kromatogarafi yang dapat dipakai seperti kromatografi gas (GC), kromatografi lapis tipis. 1.3.2.1 Kromatografi Lapis Tipis Lipid total jaringan tumbuhan dapat dianalisis secara KLT 2 arah, suatu contoh pemisahan dilukiskan pada gambar 4.4. Hasil ini didapat dari umbi
kentang, tetapi kebanyakan jaringan tumbuhan lain menunjukkan sederetan komponen yang sama. Pengembang pada arah pertama adalah kloroformmetanol-asam asetat-air ( 170:25:25:4 ), dan pada arah kedua kloroformmetanol-amonia ( 65:30:4 ). Untuk menghindarkan penguraian lipid selama KLT dianjurkan penambahan BHT ( 5 mg % ) ke dalam pengembang pertama dan 0
mengeringkan plat pada 50 C dalam suasana nitrogen setelah pengembangan pertama.
Pada umumnya KLT satu arah sudah cukup untuk memisahkan lipid sebelum dianalisis. Lipid netral dapat dipisah pada plat silika gel, menggunakan isopropil eter- asam asetat ( 24:1 ) dan eter minyak bumi- eter- asam asetat (90:10:1) sebagai pengembang berurutan pada 1 arah. Dengan cara ini trigliserida ( R f kirakira 70 ) memisah dari digliserida ( R f 50 ) dan monogliserida
( Rf 15 ).
Hidrokarbon bergerak sampai ke dekat garis depan dan fosfolipid tetap pada garis awal. Trigliserida masing-masing, pada pita dengan R f 70, kemudian dapat dipisah secara KLT-AgNO 3 berdasarkan derajat ketakjenuhannya. Plat silika direndam dengan AgNO3 5% dan dikembangkan dengan isopropanol-kloroform (3:197). Trigliserida terpisah menjadi beberapa fraksi,
Rf menurun dengan
naiknya jumlah ikatan rangkap dari 1 – 6. Untuk campuran gliserida rumit, mungkin diperlukan pemisahan lebih lanjut. Kromatografi partisi fase balik dapat digunakan, untuk itu plat silika gel direndam dalam minyak silikon dan pengembangnya ialah aseton nitril- asam asetat- air ( 14:2:5 ). Fosfo dan glikolipid dapat dipisah secara satu arah pada plat silika gel dengan menggunakan pengembang seperti kloroform-metanol-asam asetat-air (170:30:20:7) dan aseton-benzen-air ( 90:30:8 ). Fosfatidilgliserol terpisah lebih baik dari fosfatidil etanol amina dengan mengembangkan pelarut kedua pada plat pada sebelumnya direndam dengan amonium sulfat 0,15 M. Angka R f kirakira dari berbagai lipid dengan menggunakan 2 sistem utama ini ditunjukkan pada tabel 4.3.
1.3.2.2 Deteksi Lipid dapat dideteksi tanpa perubahan dengan menyemprot plat dengan zat warna berflouresensi. Larutan 2 ‘,7’ -dikloroflouresensi 0,2% dalam etanol
memberikan bercak berflouresensi hijau muda pada latar belakang ungu dibawah sinar UV. Penyemprotan dengan 0,5% Rhodamin B atau 6 G dalam etanol menghasilkan bercak kuning atau ungu kebiruan pada latar belakang
merah jambu. Penyemprot tidak khas yang dapat merusak, tetapi sangat peka 0
untuk lipid, ialah H 2SO4 25%, diikuti dengan pemanasan plat pada 230 C. Lipid yang mengandung basa atau gula dapat dideteksi dengan peraksi yang khas dengan sisa ini. Ninhidrin dapat digunakan untuk mendeteksi fosfolipid yang mengandung etanolamin dan serina. 1.3.2.3 Menentukan Komponen Lipid Penyabunan asam atau basa dari lipid menghasilkan asam lemak dan gliserol dan lipid polar dihasilkan gula atau amina dan fosfat. Hidrolisis asam 0
dilakukan dengan H 2SO4 2M dalam lingkungan nitrogen pada 100 C selama 6 jam. Setelah campuran diencerkan dengan air, asam lemak dan basa ( bila ada ) diekstraksi dengan kloroform. Larutan air dinetralkan dengan Ba 2CO3, disaring, dan kemudian dikromatografi kertas dengan n-butanol-piridina-air ( 7:3:1 ) selama 40 jam dengan menyertakan larutan pembanding gula dan gliserol. Adanya gliserol dan galaktosa terdeteksi dengan pereaksi AgNO 3 basa. Amina dalam lapisan kloroform dapat dideteksi secara KLT. Fosfat dalam lapisan air dapat dideteksi sebagai garam natrium. Deteksi dilakukan secara KLT pada silika gel S-HR dengan metanol-NH 4OH 1M-asam triklorasetat-air ( 10:3:1:6 ). Fosfat nampak sebagai bercak biru setelah disemprot dengan larutan amonium molibdat 1% dalam air, lalu dengan SnCl 2 1% dalam HCl 10%. 1.3.2.4 Kromatografi gas cair Asam lemak yang diperoleh setelah hidrolisis asam diubah menjadi ester metilnya dengan diazometana dalam eter, kemudian dianalisis sacara KCG. Cara lain, ester metil asam lemak dapat diperoleh langsung dengan transmetilasi lipid induk secara refluks dengan metanol-benzen-H 2SO4 ( 20:10:1 ) selama 90 menit. KGC umumnya dilakukan pada kolam polietilena gliko adipat ( 10% pada celite 0
100 – 120 mesh ) pada 200 C atau SE 30 3%. Puncak yang didapat dibandingkan waktu retensinya dengan ester metil asam lemak baku. Contoh pemisahan kedua kolom itu ditunjukkan pada gambar 4.5.
Beberapa asam tak jenuh tak dapat diidentifikasi hanya dengan KGC. Dalam hal ini perlu diperlukan KLT-AgNO 3 untuk menentukan derajat ketakjenuhannya. Hidrogenasi menjadi asam jenuh yang sesuai ada gunanya, yaitu untuk menentukan panjang rantai. Akhirnya, ikatan rangkap dapat ditentukan dengan pemecahan memakai permanganat atau dengan ozonolisis; pecahan yang dihasilkan diidentifikasi. 1.3.2.5 Pemastian Identitas Masing – masing lipid kemudian dicirikan dengan membandingkannya dengan cuplikan autentik ( asli ) dan dengan cara spektoskopik. Spektoskopik UV hanya bermanfaat untuk lipid yang mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi dalam strukturnya. Serapan tampak antara 240 dan 300 nm, sedangkan semua lipid lainnya tidak menunjukkan serapan diatas 220 nm. Spektroskopik inframerah kurang berarti. Gugus metilena dari asam lemak memberikan beberapa pita khas, sedangkan lipid tak jenuh menunjukkan pita tambhan karena adanya serapan cis-dan trans- etilena.
1.3.2.6 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ) Dalam hal asam lemak, kesulitan dapat ditanggulangi dengan membuat turunannya dan memisahkannya sebagai ester fenasil atau p-bromofenol. Dalam hal lipid terikat, kita dapat mengukur serapan akhirnya pada sekitar 195 nm atau menggunakan detektor indeks bias, tetapi pada umunya KCKT belum menjadi cara rutin dalam telaah lipid tumbuhan.
Bab II ISOLASI DAN KARAKTERISASI TRIGLISERIDA KACANG TANAH Cara Kerja a. Isolasi Trigliserida pada Kacang Tanah
1. Sejumlah kacang tanah yang ditimbang kira-kira 4 biji dimaserasi dalam 0
lumpang dengan pasir dan 8 ml eter minyak bumi (td 40-60 C ) sesudah disentrifugasi, sisa diekstraksi sekali lagi dengan 8 ml eter minyak bumi. Ekstrak dicampur dan diuapkan sampai kering dalam labu yang telah ditimbang, penguapan dilakukan dalam aliran nitrogen. Ekstrak lipid ditimbang dan persentase lipid dalam kacang tanah asal dapat dihitung. 2. Selanjutnya ekstrak lipid dilarutkan dalam 5 ml sikloheksana dan ditotolkan 3 mikroliter pada plat silika gel. AgNO 3 5%, bersama-sama dengan larutan pembanding triolein dan tristearin. Plat dikembangkan dalam isopropanol-kloroform ( 3:187). 3. Sesudah dikeringkan, plat disemprot dengan dibromo-R-flouresein 0,2% dan diperiksa dengan sinar UV. Trigliserida yang telah terpisah tampak sebagai bercak kuning. Jumlah nisbi berbagai lipid tak jenuh kemudian dapat diperkirakan dari ukuran bercak yang terpisah. Bercak yang
bergerak lebih cepat mempunyai sisa asam lemak yang mengandung 1 ikatan rangkap dan bercak yang paling lambat mempunyai 2 atau 3 ikatan rangkap. 4. Untuk mengidentifikasi asam yang ada, ekstrak lipid yang tertinggal dididihkan selama 10 menit dengan 5 ml KOH 2M dalam air-etanol ( 1:1 ). Larutan ini didinginkan dengan menambahkan 5 ml air dan diekstraksi dengan eter minyak bumi ( 2 x 20 ml ) untuk menghilangkan lipid yang terhidrolisis. 5. Kemudian hidrolisit diasamkan dengan H 2SO4 10M dan asam lemah diekstraksi dengan eter minyak bumi 3 x 15 ml. Ekstrak ini selanjutnya dicuci, dikeringkan dan diuapkan sampai kering dalam lingkungan nitrogen. Ditambahkan kompleks boron triflorida, metanol ( 5ml ) dan larutan dididihkan selama 2 menit. Sesudah didinginkan dengan menambahkan 15 ml air etil metil diekstraksi dengan eter minyak bumi ( 2x 15 ml ). Ekstraknya dicuci, dikeringkan, diuapkan sampai kering. 6. Ester metil dilarutkan dalam sejumlah minimum eter minyak bumi, sebagian disuntikkan kedalam gerbang suntik KGC yang mempunyai kolom enaglikoladipat 10 % pada ‘ celite ‘ 100 -120 mesh. KGC dijalankan 0
pada suhu antara 180 dan 200 C. Waktu retensi nisbi ( RR t ) puncak yang terjadi diukur dengan menganggap RRt palmitat 1,0. 7. Suatu campuran baku ester metil dari asam palmitat, stearat, oleat, dan linoleat harus dikromatografi bersama-sama; semua asam ini keluar dari kolom KGC dengan urutan seperti tersebut di atas. Akhirnya, konsentrasi berbagai asam dalam minyak kacang tanah dapat ditentukan dengan mengukur luas daerah puncak.
Daftar Pustaka
Anonim. 1979. Farmakope Indonesia Edisi Ketiga. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Anonim., 1985. Tanaman Obat Indonesia, Jilid I, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. A n w a r , C h a i r i l , d k k . 1 9 9 6 . Pengantar Praktikum Kimia O r g a n i k . J a k a r t a : Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, DIKTI.
jatilaksono,Marsandre.2007. Lipid .http://jlcome.blogspot.com/2007/10/l ipid.html. diakses 28 Oktober 2011. Poedjiadi,Anna,1994, Dasar-Dasar Biokimia,Jakarta:Penerbit Universitas Indonesia. Sh of ya n. 20 10 .Lipid .http://forum.upi.edu/v3/index.php?topic=15636.0. diakses28 Oktober 2011. Sudarmadji,slamet. 1996.analisa bahan makanan dan pertanian. liberty. yogyakarta.
Lampiran
1 set alat soxhlet
Rotavapor
Biji kemiri
