LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA II ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN SUKUN ( Artocapus altilis) altilis )
OLEH : KELOMPOK 4 : TRANSFER B 2016 RUTH M V TAHALELE
16.01.298
MARIA ANA FEBI
16.01.299
AHMAD KHAIRUL
16.01.300
HENDRA EKO SAMJANI
16.01.301
ANSYARULLAH
16.01.302
JANDRI LAYUK
16.01.304
MUH. RAMLI
16.01.303
JANUAR IBNU SUDRAJAT
16.01.305
ARIANTO D SYAHPUTRA
16.01.306
ISNAINA F.G. M
16.01.307
LABORATORIUM BIOLOGI FARMASI SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI MAKASSAR 2017
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar belakang Masyarakat Indonesia telah mengenal berbagai tanaman obat tradisional yang dapat digunakan untuk pemeliharaan kesehatan dan mampu mengobati penyakit, namun penggunaan secara luas dan optimal masih mengalami kendala antara lain kurangnya informasi mengenai keamanan dan kemanfaatan
dari tanaman obat itu
sendiri. Seiring
berkembangnya
pengobatan
di
Indonesia,
perkembangannya kini mengarah ke sistem pengobatan herbal yang memanfaatkan tanaman yang mempunyai khasiat obat atau menyembuhkan penyakit. Sediaan herbal dapat berupa simplisia, jamu, herbal terstandar, dan fitofarmaka. fitofarmaka. Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain berupa bahan yang dikeringkan. Simplisia dapat berupa simplisia nabati (tumbuhan), simplisia hewani (hewan), simplisia
pelikan
(mineral).
Daun
Sukun
( Artocapus Artocapus
altilis) altilis)
merupakan Salah satu tanaman yang dapat dibuat simplisia dan dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Daun sukun ( Artocapus Artocapus altilis) altilis) merupakan salah satu tanaman yang mudah didapatkan dan secara empiris telah digunakan di masyarakat tertentu di Indonesia sebagai obat tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Daun sukun bany ak mengandung senyawa kimia yang bermanfaat seperti polifenol, asam hidrosianat, asetilkolin, tanin, tanin, riboflavin, riboflavin, fenol, dan flavanoid. flavanoid. Berdasarkan uraian diatas maka dilakukanlah percobaan pembuatan simplisia nabati dari sampel daun sukun ( Artocapus ( Artocapus altilis). altilis).
1.2. Maksud dan tujuan 1.2.1. Maksud percobaan Maksud dari percobaan ini adalah agar praktikan mengetahui cara penyiapan sampel daun sukun ( Artocarpus altillis), altillis), cara ekstraksi yang tepat berdasarkan sampel, isolasi senyawa kimia dalam ekstrak etanol daun sukun ( Artocarpus altilis) altilis) dengan metode KLTP serta untuk menguji aktivitas ekstrak etanol daun sukun ( Artocarpus Artocarpus altillis) altillis) dengan metode BSLT. 1.2.2. Tujuan percobaan Adapun tujuan dari percobaan percobaan ini adalah: 1.
Untuk memperoleh simplisia yang bermutu dari sampel daun sukun ( Artocarpus Artocarpus altillis) altillis)
2.
Untuk melakukan ekstraksi dengan metode maserasi.
3.
Praktikan dapat memperoleh senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol daun sukun ( Artocarpus altillis) altillis) melalui isolasi dan karakterisasi dengan metode KLTP dan KLT dua dimensi.
4.
Untuk
mengukur
aktivitas
ekstrak
etanol
daun
sukun
( Artocarpus Artocarpus altilis) altilis) terhadap larva udang denga metode BSLT.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA II.1
URAIAN TANAMAN II.1.1 Klasifikasi tanaman (Ning Harmanto,2012)
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Ordo
: Urticales
Famili
: Moraceae
Genus
: Artocarpus
Species
: Artocarpus : Artocarpus altilis
Selain Artocarpus altilis, tanaman sukun mempunyai beberapa nama ilmiah lain yang sering digunakan yaitu Artocarpus communis Forst dan Artocarpus dan Artocarpus incisa Linn. Linn.
II.1.2 Sinonim (Nama Daerah) Beberapa daerah di Indonesia tanaman sukun memiliki nama daerahnya masing-masing. Misalnya nama tanaman sukun untuk daerah Madura (sokon), Irian (kamandi), Gorontalo (amu). ( amu). II.1.3 Morfologi Tanaman Pada dasarnya sukun ( Artocarpus altilis) altilis) tergolong tanaman tropik sejati dengan tempat tumbuh terbaik didataran rendah , sukun juga tumbuh diberbagai tempat karena daya daya adaptasinya yang tinggi. Tanaman ini tumbuh baik didaerah basah, tetapi dapat juga tumbuh didaerah yang sangat kering asalkan ada air tanah dan aerasi tanah yang cukup. Bahkan pada musim kemarau, sukun dapat tumbuh dan berbuah dengan lebat (Ning Harmanto,2012). Tinggi tanaman sukun dewasa dapat mencapai 30 meter dengan tajuk menyerupai piramida. Umumnya tanaman sukun membentuk percabangan mulai di ketinggian ketinggian 1,5 meter
diatas
permukaan tanah. Daun sukun berbentuk oval dengan ujung meruncing. Ukurannya tergolong besar dengan ukuran panjang 3060 cm dan lebar 20-40 cm. Warna daun dibagian atas hijau tua mengkilap dengan permukaan halus. Sementara itu daun bagian bawah berwarna hijau pucat, bertekstur kasar dan berbulu halus (Ning Harmanto,2012). II.1.4 Khasiat dan kandungan kimia Daun sukun mengandung beragam zat yang sangat ampuh menyembuhkan penyakit. Adapun kandungan kimia dalam daun sukun adalah asam bidrosianat, aseticolin, riboflavin, tanin, flavonoid dan sitosterol. Zat asam hidrosianat, asetilkolin, tanin dan ribovlavin terbukti mengatasi peradangan dan penyakit ginjal. Kandungan flavonoid dan sisterol dalam daun sukun berfungsi menunjang kesehatan jantung dan pembuluh darah (Abdul Waid,2011).
II.2
Simplisia II.2.1 Definisi Simplisia (Dirjen POM,1986) Simplisia adalah bahan alam yang digunakan untuk obat dan belum mengalami perubahan proses apapun dan kecuali dinyatakan lain umumnya berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia tumbuhan obat merupakan bahan baku proses pembuatan ekstrak, baik sebagai bahan obat atau produk. Berdasarkan hal tersebut maka simplisia dibagi menjadi tiga golongan yaitu simplisia nabati, simplisia hewan dan simplisia pelikan/mineral. 1.
Simplisia Nabati Simplisia nabati adalah simplisia berupa tanaman utuh, bagian tanaman dan eksudat tanaman. Eksudat tanaman adalah isi sel yang secara spontan keluar dari tanaman atau isi sel dikeluarkan dari selnya dengan cara tertentu atau zat yang dipisahkan dari tanaman dengan cara tertentu yang masih belum berupa zat kimia murni.
2.
Simplisia Hewani Simplisia hewani adalah simplisia hewan utuh, bagian hewan atau belum berupa zat kimia murni.
3.
Simplisia Mineral Simplisia hewani adalah simplisia berasal dari bumi baik telah diolah atau belum, tidak berupa zat kimia murni.
II.2.2 Pengelolaan Simplisia (Gunawan,2004) Proses awal pembuatan ekstrak adalah tahapan pembuatan serbuk simplisia kering. Dari simplisia dibuat serbuk simplisia dengan perakatan tertentu sampai derajat kehalusan tertentu proses in dapat mempengaruhi mutu ekstrak dengan dasar beberapa hal yaitu makin halus serbuk simplisia proses ekstraksi makin efektif, efesien namun makin halus serbuk maka makin rumit secara teknologi peralatan untuk tahap filtrasi. Selama penggunaan peralatan penyerbukan dimana ada gerakan dan interaksi dengan benda keras maka akan
timbul panas yang dapat berpengaruh pada kandungan senyawa aktif. Namun hal ini dapat dikompesasi dengan penggunaan nitrogen cair. Untuk menghasilkan simplisia yang bermutu dan terhindar dari cemaran industri obat tradisonal dalam mengelola simplisia sebagai bahan baku pada umumnya melakukan tahapan kegiatan berikut ini: 1.
Sortasi basah Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotorankotoran atau bahan-bahan asing lainnya dari bahan simplisia. Misalnya simplisia yang dibuat dari akar suatu tanaman obat, bahan-bahan asing seperti tanah, krikil, rumput, batang, daun, akar yang telah rusak, serta pengotoran lainnya harus dibuang. Tanah yang mengandung bermacam-macam mikroba dalam jumlah yang tinggi. Oleh karena itu pembersihan simplisia dari tanah ..yang terikut dapat mengurangi jumlah mikroba awal.
2. Pencucian Pencucian dilakukan untuk mennghilangkan tanah dan pengotor lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air sumur dari PAM. Bahan simplisia yang mengandung zat yang mudah larut dalam air yang mengalir, pencucian hendaknya dilakukan dalam waktu yang sesingkat mungkin. 3. Perajangan Beberapa
jenis
perajangan.
Perajangan
mempecepat
proses
bahan
simplisia
bahan
perlu
simplisia
pengeringan,
mengalami
dilakukan
untuk
pengepakan,
dan
penggilingan. Semakin tipis bahan yang akan dikeringkan maka semakin cepat penguapan air, sehingga mempercepat waktun pengeringan. Akan tetapi irisan yang terlalu tipis juga dapat menyebabkan
berkurangnya
zat
berkhasiat
yangmudah
menguap, sehingga mempengaruhi komposisi, bau, dan rasa yang diinginkan. 4. Pengeringan Tujuannya yaitu untuk mendapat simplisia yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik akan dicegah penurunan mutu atau perusakan simplisia. Air yang masih tersisa dalam simplisia pada kadar tertentu dapat menjadi media pertumbuhan kapang dan jasad renik lainnya. Proses pengeringan sudah dapat menghentikan proses enzimatik dalam sel bila kadar airnya dapat mencapai kurang dari 10%. Hal-hal yang perlu diperhatikan selama proses pengeringan adalah suhu pengeringan, kelembapan udara, aliran udara, waktu pengeringan, dan luas permukaan bahan. Suhu yang terbaik pada pengeringan adalah tidak melebihi 600C, tetapi bahan aktif yang tidak tahan pemanasan atau mudah menguap harus dikeringkan pada suhu serendah mungkin, misalnya 300C sampai 450C. Terdapat dua cara pengeringan
yaitu
pengeringan
alamiah
dan
pengeringan
buatan. 5.
Sortasi Kering Sortasi setelah pengeringan sebenarnya merupakan tahap akhir pembuatan simplisia. Tujuan sortasi adalah untuk memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diiinginkan dan pengotoran-pengotor lainnya yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. Pada simplisia bentuk rimpang, sering jumlah akar yang melekat pada rimpang terlalu besar dan harus dibuang. Demikian pula adanya partikelpartikel pasir, besi dan benda-benda tanah lain yang tertinggal harus dibuang sebelum simplisia di bungkus.
6. Penyimpanan Setelah tahap pengeringan dan sortasi kering selesai maka simplisia perlu ditempatkan dalam suatu wadah tersendiri agar tidak saling bercampur antara simplisia satu dengan yang lainnya.
Selanjutnya,
wadah-wadah
yang
berisi
simplisia
disimpan dalam rak pada gudang penyimpanan. Adapun faktorfaktor yang mempengaruhi pengepakan dan penyimpanan simplisia adalah cahaya, oksigen, atau sirkulasi udara, reaksi kimia yang terjadi antara kandungan aktif tanaman dengan wadah,
penyerapan
air,
kemungkinan
terjadinya
proses
dehidrasi, pengotoran atau pencemaran, baik yang diakibatkan oleh serangga, kapang atau jasa renik lainnya. Untuk persyaratan wadah yang akan digunakan sebagai pembungkus simplisia adalah harus inert, artinya tidak mudah bereaksi dengan bahan lain, tidak beracun, mampu melindungi bahan simplisia dari cemaran mikroba, kotoran, serangga, penguapan kandungan aktif serta
dari pengaruh cahaya,
oksigen, dan uap air. II.3
METODE EKSTRAKSI Ekstraksi adalah pemisahan suatu zat dari campurannya dengan pembagian sebuah zat terlarut antara dua pelarut yang tidak dapat tercampur untuk mengambil zat terlarut tersebut dari satu pelarut ke pelarut yang lain. Ekstraksi bertujuan untuk melarutkan senyawa-senyawa yang terdapat dalam jaringan tanaman ke dalam pelarut yang dipakai untuk proses ekstraksi tersebut. Jenis-jenis ekstraksi bahan alam yang sering dilakukan adalah : II.3.1 Ekstraksi Cara Dingin ( Dirjen POM, 1986). Metode ekstraksi cara dingin tidak menggunakan proses pemanasan selama proses ekstraksi berlangsung, tujuannya untuk menghindari
rusaknya
senyawa
yang
tidak
tahan
karena
pemanasanan. Jenis ekstraksi dingin adalah maserasi dan perkolasi.
1.
Metode Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dengan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Prinsip maserasi adalah ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam pelarut yang sesuai selama beberapa hari pada temperature kamar terlindung dari cahaya, pelaut akan masuk kedalam sel tanaman melewati dididing sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan didala sel dengan diluar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdeak keluar dan diganti oleh pelarut dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut akan berulang sampai terjadi keseimbangan antara larutan didalam sel dan larutan diluar sel (Ansel, 1989). Maserasi biasanya dilakukan pada temperatur 15 o20oC dalam waktu selama 3 hari sampai bahan-bahan yang larut,
melarut
(Ansel,1989).
Pada
umumnya
maserasi
dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat kehalusan yang cocok, dimasukan kedalam bejan kemudian dituangi dangan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya, sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 5 hari diserkai, ampas diperas. Pada ampas ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk
dan
diserkai
sehingga
diperoleh
seluruh
sari
sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup dan dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Pelarut Yang Digunakan Dalam Metode Maserasi, Farmakope Indonesia menetapkan bahwa sebagai cairan penyari adalah air, etanol, etanol-air atau eter. dipertimbangkan
sebagai
penyari
karena
Etanol
lebih
selektif,
kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas, tidak
beracun, netral,
absorbsinya
baik,
etanol
dapat
bercampur dengan air pada segala perbandingan dan panas yang
diperlukan
untuk
pemekatan
lebih
sedikit
(Dirjen
basa,
minyak
POM,1979) Etanol menguap,
dapat glikosida,
melarutkan
alkaloid
kurkumin,
kumarin,
antrakinon,
flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak, malam, tanin dan saponin hanya sedikit pengganggu
yang
larut. Dengan demikian zat
terlarut hanya
meningkatkan penyarian biasanya etanol dan air. Perbandingan
terbatas. Untuk
menggunakan
jumlah
etanol
jumlah dan
air
tergantung pada bahan yang disari (Dirjen POM,1979). 2.
Metode Perkolasi Perkolasi adalah proses penyarian simplisia dengan jalan melewatkan pelarut yang sesuai secara lambat pada simplisia dalam suatu percolator. Perkolasi bertujuan supaya zat berkhasiat tertarik seluruhnya dan biasanya dilakukan untuk zat berkhasiat yang tahan ataupun tidak tahan pemanasan. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak kebawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk
menahan. Kekuatan yang berperan pada perkolasi antara lain: gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, adesi, daya kapiler dan daya geseran / friksi. II.3.2 Ekstraksi Cara Panas (Dirjen POM,1986) Metoda ini pastinya melibatkan panas dalam prosesnya. Dengan adanya panas secara otomatis akan mempercepat proses penyarian dibandingkan cara dingin. Jenis ekstraksi panas adalah refluks dan sokletasi. 1.
Metode Refluks Salah satu metode sintesis senyawa anorganik adalah refluks, metode ini digunakan apabila dalam sintesis tersebut menggunakan pelarut yang volatil. Pada kondisi ini jika dilakukan pemanasan biasa maka pelarut akan menguap sebelum reaksi berjalan sampai selesai. Prinsip dari metode refluks adalah pelarut volatil yang digunakan akan menguap pada suhu tinggi, namun akan didinginkan dengan kondensor sehingga pelarut yang tadinya dalam bentuk uap akan mengembun pada kondensor dan turun lagi ke dalam wadah reaksi sehingga pelarut akan tetap ada selama reaksi berlangsung. Sedangkan aliran gas N2 diberikan agar tidak ada uap air atau gas oksigen yang masuk terutama pada senyawa organ logam untuk sintesis senyawa anorganik karena sifatnya reaktif (Dirjen POM,1986).
2.
Metode Sokletasi Sokletasi adalah suatu metode atau proses pemisahan suatu komponen yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyaringan berulang-ulang dengan menggunakan pelarut tertentu, sehingga semua komponen yang diinginkan akan terisolasi. Sokletasi digunakan pada pelarut organik tertentu. Dengan cara pemanasan, sehingga uap yang timbul setelah dingin secara kontinyu akan membasahi sampel, secara teratur
pelarut tersebut dimasukkan kembali ke dalam labu dengan membawa senyawa kimia yang akan diisolasi tersebut. Pelarut yang telah membawa senyawa kimia pada labu distilasi yang diuapkan dengan rotary evaporator sehingga pelarut tersebut dapat diangkat lagi bila suatu campuran organik berbentuk cair atau padat ditemui pada suatu zat padat, maka dapat diekstrak dengan
menggunakan
pelarut
yang
diinginkan
(Dirjen
proses
ekstraksi
adalah
POM,1986). Faktor-faktor
yang
mempengaruhi
(Dalimantha,2013): a.
Temperatur Pada temperatur tinggi umumnya kelarutan juga tinggi. Tetapi dalam beberapa hal temperatur juga dijaga rendah untuk mencegah terjadinya penguapan pelarut dan rusaknya zat terlarut.
b.
Ukuran partikel Semakin kecil ukuran partikel maka semakin luas permukaan kontak antara padatan dan pelarut sehingga perpindahan massa juga semakin tinggi. Partikel yang terlalu kecil dan halus akan menimbulkan kesulitan dalam hal pemisahan padat-cair
c.
Waktu kontak Semakin lama waktu kontak antara pelarut dengan campuran, laju perpindahan zat terlarut semakin besar, namun saat mencapai waktu kontak optimum perpindahan zat terlarut ke dalam pelarut menjadi setimbang dengan perpindahan zat terlarut kembali ke padatannya.
d.
Jenis pelarut dan jumlah pelarut Pelarut
dipilih
dengan
mempertimbangkan
segi
selektivitas, harga, viskositas dan toksisitas. Jumlah pelarut harus cukup untuk melarutkan zat terlarut sampai tingkat yang
diinginkan. Jumlah pelarut sebanding dengan laju leaching, semakin banyak pelarut maka laju leaching juga makin cepat. e.
Kecepatan pengadukan Semakin cepat pengadukan maka jumlah zat terlarut yang berpindah ke dalam pelarut semakin banyak yang berarti laju leaching juga semakin cepat.
II.4
Fraksinasi Fraksinasi
adalah
pemisahan
yang
bertujuan
untuk
memisahkan golongan utama kandungan yang lain. Senyawa yang bersifat polar akan masuk kedalam pelarut-pelarut polar dan senyawa yang bersifat nonpolar akan masuk ke dalam pelarut nonpolar. Bila kita meneliti fropil fitokimia lengkap daru suatu jenis tumbuhan, maka sebelum dikromatografi ekstrak kasar perlu difraksinasi untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari golongan utama yang lainnya (Harbone,1987). Fraksinasi juga dapat dilakukan dengan metode ekstraksi padat-cair
atau ekstraksi dengan pelarut terjadi dengan proses
pelarutan selektif dari satu atau lebih pelarut dari matriks padatan dengan cairan pelarut. Prinsip dasarnya adalah berdasarkan kelarutan. Untuk memisahkan zat analit yang terdapat dari matriks padatan,maka fase padat dikontakkan dengan fase cair. Pada kontak fase tersebut, zat terlarut berdifusi dari fase padat kefase cair
sehingga
terjadI
pemisahan
dari
matriks
padatan
(Akbar,2012). II.5
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) II.5.1 Pengertian KLT Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode kromatografi cair yang paling sederhana yang berdasarkan proses adsorbsi (Dewi,2005). Proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam sedangkan proses pemindahansolut dari fase diam ke fase gerak disebut ”desorbsi”. Kedua proses tersebut terjadi terus
menerus selama pemindahan kromatografi karena berada dalam sistem kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian dengan perbandingan distribusinya untuk menjaga keadaan kesetimbangan (Gritter,dkk.,1991). Ada empat jenis mekanisme absorbsi, yaitu (Rohman dan Gandjar 2008) 1.
Adsorbsi , merupakan penyerapan pada permukaan yang melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti pada gaya antarmolekuler pada fase diam dengan fase gerak, misalnya: kromatografi kertas dan KLT.
2.
Partisi , merupakan proses sorbsi seperti pada proses ekstraksi pelarut dengan cara solut akan terdistribusi diantara fase diam sesuai
dengankelarutan
relative
keduanya,
misalnya:
kromatografi cair-gas. 3.
Pertukaran ion, merupakan proses pertukaran solut-solut ion diantara ion-ion yang terikat pada fase diam yang dinamakan resin berupa padatan polimer oraganik yang bermuatan. Misalnya: kromatografi kolom.
4.
Eksklusi, berdasarkan pada ukuran molekul dari zat padat (fase diam) yang berupa gel sedangkan fase gerak berupa cairan. Proses tersebut dikenal sebagai eksklusi gel. KLT mempunyai kelebihan dibandingkan dengan kromatografi
kertas karena membutuhkan waktu elusi yang lebih pendek dan diperoleh pemisahan yang lebih baik untuk analisa kuantitatif. Hasil pemisahan yang baik dari KLT mempunyai kapasitas lebih besar dibandingkan dengan kromatografi kertas. Serta dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar apabila dilakukan pada kromatografi kertas (Sastrohamidjojo, 2005). Kromatografi Lapis Tipis (KLT) melibatkan dua sifat fase yaitu: sifat fase diam (sifat lapisan/fase penyerap) dansifat fase gerak
(pelarut pengembang). Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat). (Dewi 2005). sebagai fase diam dapat digunakan silika atau alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau alumunium. Jika fase diam berupa silika gel maka bersifat asam, jika fase diam alumina maka bersifat basa. Fase gerak atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campuran organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik (Gritter, dkk.1991). II.5.2 Sistem Fase Diam Silika Gel pada KLT Fase diam yang paling banyak digunakan adalah silika gel dan alumunium oksida. Jenis adsorben yang umum digunakan untuk KLT adalah silika gel, karena silika gel adalah fase diam universal yang dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat netral, asam atau basa. Silika gel merupakan penyerap yang paling banyak dipakai dalam KLT. Senyawa netral yang mempunyai gugusan sampai tiga pasti dapat dipisahkan pada lapisan yang diaktifkan dengan memakai pelarut organik atau campuran pelarut yang normal. Karena sebagian besar silika gel bersifat sedikit asam, maka asam selalu sedikit mudah dipisahkan. Fase diam silika gel meminimumkan reaksi asam/basa antara penyerap dan senyawa yang dipisahkan (Gritter, dkk.,1991). II.5.3 Sistem Eluen (Fase Gerak) KLT Polaritas fase gerakk perlu diperhatikan pada analisa dengan KLT,
sebaiknya
digunakan
campuran
pekarut
organik
yang
mempunyai polaritas serendah mungkin. Campuran yang baik memerika fase-fase bergerak yang kekuatan bergerak sedang. Secara umum dikatakan bahwa fase diam yang polar akan mengikat senyawa polar dengan kuat sehingga bahan yang kurang sifat kepolarannya akan bergerak lebih cepat dibandingkan bahan-bahan polar (Gritter, dkk.,1991).
Pemilihan sistem pelarut dan komposisi larutan ditentukan oleh prinsp kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syriringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian pelarut kromatografi (sebanyak yang dipisahkan) dan harus cukup baik sebagai pelarut yang bersaing dengan daya serap penyerap. Keadaan yang ideal tersebut mungkin terjadi jika pelarut tidak berproton seperti hidrokarbon, eter dan senyawa karbonil dipakai sebagai pelarut pengembang (Gritter,dkk.,1991). Kromatografi
dengan
fase
diam
silika
gel,
sering
menggunakan fase gerak organik atau campuran pelarut organik. Fase gerak berfungsi untuk menggerakkan permukaan pada silika gek dengan memindahkan analit dari partikel-Prtikel fase diam. Molekul analit bebas untuk beripindah bersama pelarut, jika molekul analit tidak berikatan dengan permukaan silika gel. Pertama golongan
polar
pelarut
dapat
bersaing
dengan
analit untuk
menempatkan ikatan pada permukaan silikal gel. Oleh karena itu, jika pelarut yang digunakan terlalu polar
akan berinteraksi kuat
dengan permukaan silikal gel dan akan meninggalkan tempat fase diam dengan membebaskan ikatan dengan anali tersebut. Kemudian analit bergerak cepat pada fase diam. Dengan cara yang sama, kelompok polar pelarut dengan mengikat kuat dengan fungsional polar
pada
analit
dan
menghalangi
interaksi
analit
dengan
permukaan silikal gel. Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh olehh komponen di bagi dengan ajrak yang ditempuh oleh eluan. Adapun rumus dari nilai retensi (Rf) yaitu :
Rf = Jarak tempuh komponen Jarak tempuh eluen
Harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf (Sastrohamidjojo, 2005): a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan b. Sifat Penjerap c. Tebal dan kerataan dari lapisan Penjerap d. Pelarut dan derajat kemurniannya e. Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f.
Teknik percobaan
g. Jumlah cuplikan yang digunakan h. Suhu i.
Kesetimbangan Nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa tertentu pada
eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf yang lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah. Begitu juga sebaiknya. Hal tersebut dikarenakan fase diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fase diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2-0,8. Jika Rf terlalu tinggi yang dilakukan adalah mengurangai kepolaran eluen dan begitupun sebaliknya. II.6
Kromatografi Kolom II.6.1 Definisi Kromatografi Kolom Istilah kromatografi berasal dari kata latin chroma berarti warna dan graphien berarti menulis. Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tsweet (1903) seorang ahli botani dari Rusia. Michael Tsweet dalam percobaannya ia berhasil memisahkan klorofil dan pigmen-pigmen warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat yang diisikan ke dalam kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses pemisahan itu diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada
permukaan atas kalsium karbonat, kemudian dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan (Alimin, 2007). Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar, 2008). Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair (Yazid, 2005). Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbedabeda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk
pada
cara
pemisahan
cair-padat.
Substrat
padat
(adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase geraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir
membawa
komponen
campuran
sepanjang
kolom.
Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fase gerak. Pada saat teradsorpsi, komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase gerak yang ditambahkan secara kontinu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben yang akan
secara selektif tertahan. Komponen dengan afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut (Yazid, 2005). II.6.2 Teknik
Pemisahan
Kromatografi
Kolom
Dalam
Memisahkan Campuran. Kolom yang telah dipilih sesuai ukuran diisi dengan bahan penyerap (adsorben) seperti alumina dalam keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan batang pengaduk untuk memampatkan adsorben dengan gelas wool pada dasar kolom. Pengisian harus dil akukan secara hatihati dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung
udara.
Untuk
membantu
homogenitas
pengepakan, biasanya kolom setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu. Sejumlah cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom, dengan penambahan pelarut (eluen) secara terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran, dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan. Jika kolom cukup panjang dan semua parameter pemisahan betul-betul terpilih seperti diameter kolom, adsorben, pelarut dan kecepatan alirannya, maka akan terbentuk pita-pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang keluar dari kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari kolom. Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya, misalnya dengan cara titrasi atau spektofotometri (Yazid, 2005).
Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi kolom adsorpsi. Perbedaan utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa materi padat berpori seperti kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya. Fase diam zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh mungkin inert terhadap senyawa-senyawa yang akan dipisahkan. Zat penyokong padat harus menyerap dan menahan fase diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk mengalirnya fase gerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase diam lebih polar dari pada fase gerak. Dalam kromatografi partisi, fase geraknya dapat berupa zat cair dan gas yang
mengalir
membawa
komponen-komponen
campuran
sepanjang kolom. Jika fase geraknya adalah zat cair, maka akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini banyak digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik maupun anorganik (Yazid, 2005). Teknik pemisahan kromatografi kolom terbagi atas beberapa teknik diantaranya yaitu : 1.
Kolom konvensional Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan tarhadap kromatografi lapis tipis sebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna (Sastrohamidjojo, 1985).
Pada
kromatografi
kolom,
campuran
yang
akan
dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak0, dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau di dorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom (Sastrohamidjojo, 1985). Kromatografi kolom dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi dan siap di pakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung
pada
bagian
atas
kolom
atau
pada
lapisan
prapenjerap dan dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulam fraksi (Sastrohamidjojo, 1986). Kolom keromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan kran. Ukuran keseluruhan kolom beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin juga sampai 100 kalinya. Nisbah panjang terhadap lebar sebagian besar ditentukan oleh mudah sukarnya pemisahan, nisbah lebih besar untuk pemisahan yang lebih sukar. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap ditentukan oleh bobot campuran linarut yang akan dipisahkan. Sifat, derajat, atau tingkat keaktifan penjerap, dan ukuran partikelnya betulbetul penting dalam pengembangan sistem kromatografi.
Ukuran penjerap biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Kemasan kolom biasanya 63-250 mikro meter untuk kolom yang dijalankan oleh gaya gravitasi (Sastrohamidjojo, 1985). Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam (Sastrohamidjojo, 1985) : a.
Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapaskemudian ditambahkan cairan pengelusi.
b.
Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yangakan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secarakontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Kolom dapat dibuat dari berbagai jenis material, seperti stainless steel, aluminium, tembaga, gelas dan paduan silika. Sebagian besar sistem kolom modern terbuat dari gelas atau paduan silika. Kolom konvensional
dibuat dari material pendukung yang dilapisi fase diam dari berbagai pembebanan yang dikemas di dalam kolom. Kolom kapiler terdiri dari tabung kapiler panjang yang didalamnya dilapisi dengan fase diam (fase diam dapat juga
direkatkan
langsung
pada
permukaan
silika).
Sebagian besar kolom kapiler terbuat dari paduan silika yang dilapisi polimer di bagian luarnya. Paduan silika sangat mudah pecah sedangkan lapisan polimer tersebut bertindak sebagai pelindungnya (Sastrohamidjojo, 1985). Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus
sehingga
terjadi
pemisahan
dalam
kolom
vacum
liquid
(Sastrohamidjojo, 1985). 2.
Kolom cair vakum Kromatografi
Suction
Column
atau
chromatography (VLC) atau Kromatografi Cair Vakum) adalah bentuk kromatografi kolom khususnya berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakum adalah alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas kebawah. Metode ini sering digunakan untuk fraksinasi awal dari
suatu
ekstrak
non
(Sastrohamidjojo, 1985).
polar
atau
ekstrak
semipolar
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode
fraksinasi
extract menjadi
yaitu
dengan
fraksi-fraksinya
yang
memisahkan crude lebih
sederhana.
Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida. Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen(Sastrohamidjojo, 1985).. Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai. II.6
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa
Yunani
(chromato =
penulisan
dan grafe =
warna).
Kromatografi berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary ) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas (Rohman, 2009). Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang
sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar, 2008). Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut kromatografi cair (Hendayana, 1994). Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif (Gritter,dkk., 1991). Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap
maka
semakin
besar
kemungkinan
penguraian.
Pendeteksian bercak hasil pemisahan dapat dilakukan dengan beberapa cara. Untuk senyawa tak berwarna cara yang paling sederhana adalah dilakukan pengamatan dengan sinar ultraviolet. Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluorosensi jika disinari dengan
sinar
ultraviolet
gelombang
pendek
(254
nm)
atau
gelombang panjang (366 nm). Jika dengan cara itu senyawa tidak dapat dideteksi maka harus dicoba disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemanasan (Gritter,1991). Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca, dapat pula terbu at dari plat polimer atau logam. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum (pati). Penjerap yang umum dipakai untuk kromatografi lapis tipis adalah silika gel, alumina, kieselgur, dan selulosa (Gritter, dkk.,1991). Dua sifat yang penting dari fase diam adalah ukuran partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada kedua sifat tersebut. Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu cara
untuk
memperbaiki
hasil
pemisahan
adalah
dengan
menggunakan fase diam yang butirannya lebih halus. Butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih lambat dan resolusi yang lebih baik (Sastrohamidjojo, 2005). Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985). Dalam pemisahan senyawa organik selalu menggunakan pelarut campur. Tujuan menggunakan pelarut campur adalah untuk memperoleh pemisahan senyawa yang baik. Kombinasi pelarut adalah berdasarkan atas polaritas masing-masing pelarut, sehingga dengan demikian akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Pelarut pengembang yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis
antara lain: n-heksana, karbontetraklorida, benzena, kloroform, eter, etilasetat, piridian, aseton, etanol, metanol dan air (Gritter,dkk.,1991). II.7
Uji Bioaktivitas II.7.1 Uji Antoksidan Radikal bebas merupakan atom molekul yang memiliki kereaktifan tinggi, hal ini dikarenakan adanya elektron yang tidak berpasangan. Sumber radikal bebas dapat berasal dari sisa hasil metabolisme tubuh dan dari luar tubuh seperti makanan, sinar UV, polutan dan asap rokok. Jumlah radikal bebas yang terus meningkat dalam tubuh dapat mengakibatkan terjadinya stres oksidatif sel. Hal ini terjadi karena terjadi ketidakseimbangan antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan yangdihasilkan oleh tubuh. Jika hal ini terus menerus terjadi maka dapat memicu munculnya penyakit degeneratif
seperti
kanker,
diabetes,
peradangan
dan
kardiovaskuler. Oleh karena itu, diperlukan antioksidan yang berasal dari luar tubuh. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memperlambat proses oksidasi dari radikal bebas. Mekanisme kerja senyawa
antioksidan
salah
satunya
yaitu
dengan
cara
menodonorkan atom hidrogen atau proton kepada senyawa radikal. Hal ini menjadikan senyawa radikal lebih stabil. Antioksidan sintesis yang selama ini sering digunakan oleh masyarakat yaitu (Butil Hidroksi Anisol) BHA dan (Butil Hidroksil Toluen) BHT. Namun pada penggunaanya, obat ini menimbulkan efek samping seperti dapat merusak paru-paru dan hati serta bersifat karsinogenik. II.7.2 Uji Toksisitas Toksikologi adalah ilmu yang mempelajari mengenai efek toksik dari suatu senyawa kimia (obat). Produk atau sediaan obat harus memenuhi syarat khasiat (eficacy), bermutu (quality) dan aman (safety). untuk membuktikan khasiat maka dilakukan pengujan farmakologi, untuk mutu maka dilakukan pengujian karakteristik produk yang seharusnya diproduksi sesuai CPOB ; CGMP.
1.
Uji Toksisitas Akut Uji toksisitas akut adalah pengujian yang dilakukan untuk mengetahui nilai LD50 dan dosis maksimal yang masih dapat ditoleransi hewan uji (menggunakan 2 spesies hewan uji). pemberian obat dalam dosis tunggal dan diberikan melalui 2 rute pemerian (misalnya oral dan intravena). hasil uji LD50 dan dosisnya akan ditransformasi (dikonversi) pada manusia. (LD50 adalah pemberian dosis obat yang menyebabkan 50 ekor dari total 100 ekor hewan uji mati oleh pemerian dosis tersebut).
2.
Uji Toksisitas Sub Akut Uji
toksisitas
sub
akut
adalah
pengujian
untuk
menentukan organ sasaran tempat kerja dari obat tersebut, pengujian selama 1-3 bulan, menggunakan 2 spesies hewan uji, menggunakan 3 dosis yang berbeda. 3.
Uji Toksisitas Kronik Uji toksisitas kronik pada tujuannya sama dengan uji toksisitas sub akut, tapi pengujian ini dilakukan selama 6 bulan pada hewan rodent (pengerat) dan non-rodent (bukan hewan pengerat).
uji
ini
dilakukan
apabila
obat
itu
nantinya
diproyeksikan akan digunakan dalam jangka waktu yang cukup panjang. 4.
Uji Efek Pada Organ Reproduksi Pengujian ini dilakukan untuk melihat perilaku yang berhubungan
dengan
reproduksi
(perilaku
kawin),
perkembangan janin, kelainan pada janin, proses kelahiran, dan perkembangan janin setelah dilahirkan. 5.
Uji Karsinogenik Pengujian yang dilakukan untuk mengetahui efek yang ditimbulkan obat jika dikonsumsi dalam jangka panjang apakah dapat menimbulkan kanker. dilakukan pada 2 spesies hewan uji
selama 2 tahun, pengujian ini dilakukan apabila nanti obat ini diproyeksikan digunakan pasien dalam jangka yang panjang. 6.
Uji Mutagenik Pengujian yang dilakukan untuk mengetahui apakah efek obat dapat menyebabkan perubahan atau mutasi pada gen pada pasien.
II.7.3 Uji Antibakteri Antibakteri adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan atau
bahkan
mematikan
metabolismemikroba menyebabkan
yang
bahaya
bakteri
dengan
merugikan.
karena
cara
mengganggu
Mikroorganisme
kemampuan
menginfeksi
dapat dan
menimbulkan penyakit serta merusak bahan pangan. Antibakteri termasuk kedalam antimikroba yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Antibakteri hanya dapat digunakan jika mempunyai sifat tosik selektif, artinya dapat membunuh bakteri yang menyebabkan penyakit tetapi tidak beracun bagi penderitanya. Mekanisme kerja dari
senyawa
antibakteri
diantaranya
yaitu
menghambat
sintesisdinding sel, menghambat keutuhan permeabilitas dinding sel bakteri, menghambat kerja enzim, dan menghambat sintesis asam nukleat dan protein. Langkah pertama kerja obat berupa pengikatan obat pada reseptor sel (beberapa) diantaranya adalah enzim transpeptida. Kemudian dilanjutkan dengan reaksi transpeptidase dan sintesis peptidoglikan terhambat. Mekanisme diakhiri dengan pembuangan atau penghentian aktivitas penghambat enzim autolisis pada dinding sel. Pada lingkungan yang isotonislisis terjadi pada lingkungan yang jelas hipertonik, mikroba berubah menjadi protoplas atau sferoflas yang hanya tertutup oleh selaput sel yang rapuh. Pengujian sebagai
indikator
mikrobiologi pengujian.
memanfaatkan Dalam
hal
ini
mikroorganisme mikroorganisme
digunakan sebagai penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran kompleks kimia, untuk mendiagnosa penyakit tertentu serta untuk menguji bahan kimia untuk menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik suatu bahan. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba seperti dijelaskan berikut ini: 1.
Metode difusi a. Metode disc diffusion, untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. diletakkan
Piringan pada
agen
media
yang
agar
berisi
yang
antimikroba
telah
ditanami
mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar. b. Metode
E-test, digunakan
untuk
mengestimasi
MIC
(minimum inhibitor cocentration), yaitu konsentrasi minimal suatu
agen
antimikroba
untuk
dapat
menghambat
pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga kadar tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar yang ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkan yang
menunjukkna
kadar
agen
antimikroba
yang
menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar. c.
Ditch-plate technique, pada metode ini sampel uji berupa agen
antimikroba
yang
diletakkan
pada
parit
yang
digunakan dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan
mikroba uji (maksimum enam macam) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba. d. Cup-plate technique, metode ini serupa dengan disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengam mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji. e. Gradient plate technique, pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoritis bervariasi dari nol hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian tituangkan kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua kemudian dituangkan diatasnya. Plate inkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal enam macam) digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi kerendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan. Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair, faktor
difusi
agen
antimikroba
dapat
mempengaruhi
keseluruhan hasil pada media padat. 2.
Metode dilusi Metode dilusi dibedakan menjadi dua, yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution). a.
Metode dilusi cair, digunakan unutk mengukur MIC atau kadar hambat minimum dan MBC atau kadar bunuh minimum. Cara yabg dilakukan adalah dengan memberi seri pengenseran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan
dengan
mikroba
uji.
Larutan
uji
agen
antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa
adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagi KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba dan diikubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KMB (Sri,2015). b.
Metode dilusi padat, metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (soil). Keuntungan metode ini adalah suatu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Sri,2015).
II.8
Pemurnian Pemisahan dan pemurnian merupakan suatu cara yang dilakukan untuk memisahkan atau memurnikan suatu ssenyawa atau sekelompok senyawa yang mempunyai susunan kimia yang berkaitan dari suatu bahan, baik dalam skala laboratorium maupun skala
industri.
Pada prinsipnya,
pemisahan
dilakukan
untuk
memisahkan dua zat atau lebih yang saling bercampur, sedangkan pemurnian dilakukan untuk mendapatkan zat murni dari suatu zat. Pemisahan dan pemurnian campuran memiliki manfaat yang sangat penting dalam ilmu kimia, industri maupun dalam kehidupan sehari-hari, dalam banyak kasus kita dapat menggunakan material tanpa pemurnian, baik material itu dari alam (misalnya minyak tanah) atau yang disintesis di laboratorium, Pemisahan atau pemurnian dengan metode tertentu perlu dilakukan. Dalam melakukan pemisahan dan pemurnian diperlukan pengetahuan dan keterampilan, terutama jika harus memisahkan komponen dengan kadar yang sangat kecil. Untuk tujuan itu, dalam ilmu kimia telah dikembangkan berbagai cara pemisahan dari pemisahan sederhana yang serig dilakukan sehari-hari sampai metode pemisahan dan pemurnian yang kompleks. Zat atau materi
dapat dipisah dari campurannya karena campuran tersebut memiliki perbedaan sifat, itulah yang mendasari pemisahan campuran atau dasar pemisahan (Satari,1999). Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi diantara 2 fase yaitu fase gerak (mobile) dan fase diam (stationary ). Metode kromatografi banyak digunakan
dibandingkan metode lain seperti destilasi,
kristalisasi, pengendapan, ekstraksi, dan mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih sederhana, penggunaan waktunya singkat dan terutama mempunyai kepekaan yang tinggi serta kemampuan untuk memisahkan yang tinggi. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisis kuantitatif
dan
analisis
kualitatif
adalah
kromatografi
kertas,
kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena lebih mudah dan sederhana.Kromatografi kolom memberikan pemilihan fase diam yang lebih luas dan berguna untuk pemisahan suatu campuran secara kuantitatif.Kromatografi gas dan kromatografi
cair
kinerja
tinggi
kedua-duanya
membutuhkan
peralatan yang lebih rumit dan umumnya merupakan metode dengan resolusi tinggi yang dapat digunakan untuk identifikasi serta penetapan kuantitatif bahan dalam jumlah yang sangat kecil (Gritter,dkk.,1991). Teknik pemurnian dan pemisahan terdiri dari beberapa macam diantaranya yaitu : 1.
Pemurnian dua dimensi Pemurnian 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagai mana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat
berbeda
dapat
digunakan
memungkinkan
secara
untukmelakukan
berurutan
pemisahan
sehingga
analit
yang
mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Ibnu, 2008). Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satusystem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90°, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi (Ibnu, 2008). Zat identifikasi oleh 2D-TLC juga sering dilakukan dalam penyelidikan phytopharmaceuticals, yang biasanya memiliki komposisiyang kompleks. Dari sudut pandang logis, 2D-KLT menggunakan pelarutyang sama dalam dua arah harus sistem yang
terbaik.
Namun,
ini
tidak
biasanya
menyebabkan
informasi tambahan, karena semua zat akan berbaring pada diagona. Metode 2D-KLT hanya menjadi menarik jikareaksi telah terjadi antara dua eluen, dan penyimpangan dari garis diagonal dapat diamati setelah elusi kedua (Hahn, 2007). Dalam hal untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama ini cukup sulit tetapi penting (Wall, 2005). Secara singkat pengerjaan KLT dua dimensi ialah sebagai
berikut:
dikembangkan
Sampel
dengan
ditotolkan
pada
satusistemfase
lempeng
gerak
lalu
sehingga
campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90°, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan
pertama terletakdibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi (Rohman, 2009). Keberhasilan pemisahan akan
tergantung
pada
kemampuan
untuk
memodifikasi
selektivitas eluen kedua dibandingkan dengan selektivitasdari eluen pertama (Satari, 1999). Pemisahan 2-D yang terbaik TLC adalah ketika semua komponen
dipisahkan
dan
didistribusikan
pada
seluruh
permukaan dari pelat kromatografi. Estimasi pemisahan ini dapat dibuat dengan sebuah fungsi objektif. Umumnya, kesepakatan yang baik antara evaluasi visual dari kromatogram dan evaluasi komputer menggunakan fungsi objektif adalah melihat. Di sisi lain, fungsi yang diperlukan yang dapat memprediksi nilai Rf dari satu komponen fungsi komposisi dari fase gerak . Ada program untuk simulasi kromatogram yang sebanding
dengan
yang
diperoleh
dengan
percobaan
kromatogram (Satari, 1999). 2. Multi eluen Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Ibnu, 2008). Dalam
multi
eluen,
setelah
pengembang
tunggal
menaik,kromatogram diangkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit. Kromatogram tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang sama.Proses ini, yang dapat diulang berkali-kali, meningkatkan resolusikomponen dengan nilai RF bawah 0,5. Beberapa pengembang dilakukandengan pelarut yang berbeda dalam arah yang sama, masingmasingyang menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi bertahap. Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh faseyang lebih polar, atau
sebaliknya. Pemindahan material nonpolar kebagian atas lapisan, meninggalkan zat terlarut polar terganggu darimana dia berasal.
Setelah
kering,
zat
terlarut
polar
dipisahkan
olehpengembang dengan eluen (Fried,1999). 3. Kristalisasi Merupakan suatu metode untuk pemurnian zat dengan pelarut dan dilanjutkan dengan pengendapan. Dalam kristalisasi senyawa organik dipengaruhi oleh pelarut. Pelarut kristalisasi merupakan pelarut dibawa oleh zat terlarut yang membentuk padatan dan tergantung dalam struktur kristal – kristal zat terlarut tersebut ( Ibnu,
2008). II.9 Karakterisasi Spektroskopi merupakan suatu metode untuk penentuan rumus struktur dari suatu senyawa. Menurut Anwar (1994) bahwa spektroskopi bila dibandingkan dengan metode kimia konvensional (metode basah), spektroskopi memiliki beberapa keuntungan, diantaranya: 1.
Jumlah zat yang diperlukan untuk analisis relatif kecil dan zat tersebut sering kali dapat diperoleh kembali.
2.
Waktu pengerjaannya relatifcepat. Dasar metode spektroskopi adalah molekul pada suatu energi
level tertentu, misalnya E1, disinari dengan sinar tertentu. Sinar ini akan melewati molekul itu dan seterusnya melewati suatu detektor. Selama molekul itu tidak menyerap sinar itu maka sinar yang terdeteksi akan sama intensitasnya dengan sinar yang berasal dari sumber. Pada frekuensi yang memungkinkan terjadinya pemindahan energi level molekul misalnya dari E1 ke E2, maka sinar akan diserap oleh frekuensi yang memungkinkan terjadinya pemindahan energi level molekul misalnya dari E1 ke E2, maka sinar akan diserap oleh molekul dan tidak akan tampak dalam detektor (Rohman, 2009).
Spektrofotometri UV adalah suatu alat yang menggambarkan antara panjang gelombang atau frekuensi lawan intensitas serapan (absorbansi).
Spektrosfotometri
UV
ini
menghasilkan
radiasi
(cahaya) dengan panjang gelombang 200 – 400 nm (Anwar, 1994). Pada umumnya spektrofotometri UV umumnya hanya menunjukkan jumlah
peak
(puncak) yang
kecil
jumlahnya.
Puncak-puncak
dilaporkan sebagai panjang gelombang. Spektrofotometri
ini
biasanya
juga
digunakan
untuk
mendeteksi konjugasi. Molekul-molekul yang tidak mempunyai ikatan rangkap atau hanya mempunyai satu ikatan tidak menyerap sinar 200-800
nm.
Lain
halnya
dengan
senyawa-senyawa
yang
mempunyai sistem konyugasi yang dapat menyerap sinar pada daerah ini, semakin panjang sistem konyugasinya maka makin besar panjang gelombang absorpsi (Rohman,2009). Untuk menganalisis struktur dari senyawa-senyawa dari metabolit sekunder seperti senyawa flavonoid, spektroskopi UV merupakan cara yang terbaik untuk mengkarakterisasi jenis-jenis senyawa flavonoid dan menentukan pola oksigenasi. Kedudukan gugus hidroksil fenol bebas yang terdapat pada inti flavonoid dapat ditentukan juga dengan menambahkan pereaksi. Penampakan noda pada sinar UV dapat diamati dengan menggunakan UV 254 nm, UV 366 nm dan pereaksi semprot H 2SO4 10%. 1.
Pada UV 254 nm Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat
energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energy (Gritter,dkk.,1991) 2.
Pada UV 366 nm Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm (Gritter,dkk.,1991)
3.
Pereaksi Semprot H2SO4 10% Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H 2SO4 10% adalah berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata (Griter,dkk.,1991)
BAB III METODE KERJA III.1. Alat Peralatan yang digunakan dalam percobaan ini adalah pisau, gunting, baskom, seperangkat alat maserasi, alat – alat kaca, cawan porselin, pipa kapiler, lampu ultra violet 254 dan 366 nm, lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT) GF254, lempeng Kromatografi Lapis Tipis Preparative (KLTP), timbangan analitik (Mettlet Toledo*) dan timbangan kasar. III.2. Bahan Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah daun sukun (Artocarpus altilis), etanol 70%, Koran, aquadest, etanol 70%, etil asetat, kloroform, metanol, n-heksan, dan serbuk silika gell 60 GF254. III.3. Prosedur Kerja III.3.1 1.
Pengambilan dan Penyiapan sampel
Daun sukun (Artocarpus altilis) diambil dari pohon sukun yang tumbuh disekitar rumah warga. Daun sukun yang diambil adalah daun sukun yang berwarna hijau segar.
2.
Daun sukun yang telah diambil kemudian dipisahkan dari kotoran yang melekat.
3.
Daun sukun dicuci dengan air mengalir.
4.
Daun sukun dipotong-potong kecil menggunakan gunting.
5.
Daun
yang
telah
dipotong
kecil
kemudian
dikeringkan
menggunakan alat pengering (oven). 6.
Daun yang telah kering kemudian disimpan dalam wadah yang tertutup baik.
III.3.2 1.
Proses ekstraksi
Ditimbang 50 gram simplisia daun sukun dan dimasukkan kedalam bejana maserasi.
2.
Sampel dibasahi dengan 50 mL etanol 70% selama 30 menit.
3.
Setelah itu ditambahkan 450 mL pelarut etanol 70 % sampai menutupi permukaan sampel.
4.
Didiamkan selama 3-5 hari, sambil diaduk setiap 6 jam tiap hari.
5.
Kemudian disaring, filtrat disimpan dalam wadah lalu maserat dimaserasi kembali dengan 300 mL etanol 70%. Dibiarkan selama 2 hari dan disaring.
6.
Filtrat yang didapatkan dari maserasi dan remaserasi diuapkan menggunakan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak akhir.
III.3.3
Proses Partisi / Ekstraksi Cair Cair
1.
Ekstrak etanol ditimbang sebanyak 1 gram,
2.
Ekstrak kemudian dilarutkan dengan air 25ml ditambahkan nheksan 25ml dan dimasukkan kedalam corong pisah lalu dikocok dan didiamkan beberapa saat hingga terbentuk dua lapisan pelarut.
3. Lapisan n-heksan ditampung dan lapisan air dimasukkan kembali dan ditambah 25ml n-heksan yang baru. 4.
Lapisan n-heksan yang diperoleh kemudian diuapkan, kemudian ditimbang.
III.3.4 1.
Identifikasi Senyawa
Pemeriksaan kandungan alkaloid a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi b. Ditambahkan 2ml HCl 2N, kemudian dipanaskan selama 2-3 menit, dinginkan lalu ditambahkan NaCl kemudian disaring c.
Filtrat ditambahkan HCl 2N
d. Dibagi menjadi 3 bagian dan dimasukkan kedalam tabung reaksi: tabung reaksi (1) ditambahkan pereaksi dragendorf akan membentuk endapan merah jingga (+alkaloid) : tabung reaksi (2) ditambahkan pereaksi mayer, akan terbentuk endapan putih (+alkaloid) : tabung reaksi (3) ditambahkan pereaksi wagner akan terbentuk endapan coklat (+alkaloid).
2.
Pemeriksaan kandungan saponin a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi b. Ditambahkan air panas lalu dikocok secara konstan c.
Didiamkan,
apabila
terbentuk
busa
ditambahkan
HCl
kemudian ukur ketinggian busa. Jika busa tidak lebih dari 1cm maka (+saponin). 3.
Pemeriksaan kandungan flavonoid a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi b. Dilarutkan dengan pelarut awal, kocok c.
Ditambahkan HCl pekat, kocok
d. Ditambahkan serbuk Mg. e. Amati perubahan warna yang terjadi, jika warna merah keunguan berati positif flavonoid, merah pucat berarti flavonon, dan warna orange untuk flavon. 4.
Pemeriksaan kandungan steroid a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi b. Dilarutkan dengan pelarut awal, kocok c.
Ditambahkan HCl 2N dan pereaksi Lieberman-Bouchardat 24 tetes.
d. Amati perubahan warna yang terjadi, jika berwarna merah atau merah jambu berarti (+steroid). 5.
Pemeriksaan kandungan tanin a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi b. Ditambahkan air panas 5ml, kocok c.
Ditambahkan NaCl 5 tetes
d. Disaring, filtratnya ditambahkan FeCl3 3-4 tetes e. Amati perubahan warna, jika berwarna hijau-biru (hijauhitam) berarti (+tanin katekol), sedangkan jika berwarna biruhitam berarti (+tanin pirogalol).
III.3.5 1.
Pengujian KLT
Dibuat eluen etil asetat : n-heksan 4:1 sebanyak 5 ml kemudian dijenuhkan
2.
Ditotolkan cuplikan ekstrak n-heksan dan ekstrak etanol (awal) pada lempeng KLT diamkan hingga kering
3.
Dilihat noda yang tampak dengan mata langsung menggunkan sinar UV 254 dan UV 365 mm
4.
Dihitung jarak RF.
III.3.6 1.
Pengujian kromatografi kolom konvensional
Penyiapan kromatografi kolom konvensional Alat-alat perangkat kromatografi kolom dicuci dengan metanol dan dikeringkan. Dirangkai alat kolom dan ditegakkan dengan bantuan statif dan klem. Dimasukkan kapas pada ujung kolom(dasar kolom),
2.
Pembuatan eluen sebanyak 200 mL Etil asetat : n-hexan (4:1) yaitu (160 mL:40 mL).
3.
Pengemasan suspense silica Ditimbang silica kasar sebanyak 40 gram, 38 gram silika disuspensikan dengan eluen, dihomogenkan sampai tercampur merata. Dimasukkan ke dalam kolom sambil diketuk dinding kolom.
4.
Penyiapan Fraksi Ditimbang fraksi etil asetat sebanyak 1 gram, ditambahkan 2 gram silika sambil diaduk ad homogen. Dimasukkan dalam kolom. Ditambahkan sisa eluen.
5. Fraksinasi Disimpan vial pada ujung kolom, dibuka kran kolom dibiarkan fraksi keluar tetes demi tetes sampai mencapai 5 mL. Diganti lagi dengan kolom berikutnya sampai fraksi yang dihasilkan jernih kembali atau sama dengan warna hasil fraksi 1.
III.3.7 1.
Pengujian KLTP
Penyiapan fase diam a. Disiapkan lempeng dengan ukuran 20 x 20 cm b. Digaris lempeng dengan batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm dengan menggunakan pensil
2.
Penyiapan fase gerak Dikelompokkan hasil fraksi berdasarkan warna, kemudian diambil salah satu hasil faraksinasi untuk dilanjutkan ke uji KLT.
3.
Cara kerja a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan b. Dibuat eluen etil asetat : n-hexan (4:1), dijenuhkan dengan menggunakan kertas saring. c.
Ditotolkan hasil fraksi dpada lempeng, kemudian dimasukkan dalam chember yang berisi eluen.
d. Diamati noda yang terelusi yang naik sampai tanda batas e. Diamati pada lampu UV 254 dan UV 365 nm f.
Fraksi yang menghasilkan noda yang baik dilanjutkan ke uji KLTP
4.
Prosedur kerja KLTP a. Ditotolkan fraksi yang sesuai secara berkesinambungan pada batas bawah lempeng KLT. Dimasukkan dalam chember yang berisi eluen. b. Diamati noda yang terbentuk pada lampu UV 254 dan UV 365 nm. Ditandai noda yang terbentuk berwarna terang pada lempeng preparative dengan menggunakan pensil c.
Dikeruk noda yang dihasilkan pada lempeng
d. Pita –pita yang telah dikeruk dimasukkan dalam
tabung
sentrifus. Ditambahkan 2 ml metanol. e. Disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 8 rpm/detik.
f. III.3.8 1.
Hasil sentrifugasi (isolat) dilanjutkan ke KLT dua dimensi Pemurnian dengan uji KLT dua dimensi
Disiapkan lempeng KLT 5x5 cm, diberi batas bawah, atas, samping kiri dan kanan @ 0,5 cm.
2.
Ditotolkan isolat pada lempeng, dimasukkan dalam chember diamati pergerakan noda yang terbentuk.
3.
Diamati noda yang terbentuk pada lampu UV 254 dan 366 nm.
4.
Diputar berlawanan arah jarum jam, kemudian dimasukkan dalam chember dan diamati perpindahan
5.
Diamati noda yang terbentuk pada lampu UV 254 dan 366 nm.
6.
Dihitung nilai Rf 1 dan Rf 2.
III.3.9
Pengujian Toksisitas dengan metode BSLT
1.
Penyiapan larva udang a. Telur udang Artemi salina diambil sebanyak 1 gram. b. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur tersebut dalam air laut (air laut buatan) sebanyak 2 L pada pH 7-8 dan diberi penerangan dengan lampu pijar serta diaerasi elama 48 jam. Air laut buatan dibuat dengan cara melarutkan 40 gram garam dalam 2 L air kemudian disaring. c. Telur udang akan menetas setelah 24 jam dan menjadi larva. Larva yang telah berumur 2 hari (48 jam) digunakan sebagai hewan uji aktivitas ketoksikan 2. Pembuatan Larutan Kontrol Dan Ekstrak Uji. a. Larutan ekstrak dibuat dengan melarutkan ekstrak sebanyak 50 mg dalam 50 ml air laut hingga diperoleh konsentrasi 1000 µg/mL. Untuk ekstrak yang kurang larut dalam air laut, dapat dilarutkan dengan DMSO atau pelarut yang cocok, pelerutnya diuapkan kemudian dicukupkan volunenya dengan air laut. b. Selanjutnya dari larutan stok dibuat 5 seri konsentrasi dengan
cara
memipet
masing-masing
larutan
sesuai
perhitungan dan dicukupkan volumenya dengan air laut hingga 5 ml. c.
Kontrol yang digunakan yaitu air laut 5 ml atau pelarut yang digunakan pengenceran ekstrak.
3.
Pelaksanaan Uji a. Dimasukkan 10 ekor larva udang yang telah berumur 48 jam yang diambil secara acak kedalam masing-masing vial yang berisi ekstrak sampel atau kontrol. Kedalam tiap vial ditambahkan 3 tetes suspensi ekstrak ragi (1 mg dalam 10 ml air laut) sebagai sumber makanan dan dicukupkan volumenya dengan air laut hingga 10 ml. b. Selanjutnya disimpan ditempat yang cukup mendapatkan cahaya lampu selama 24 jam. c.
Setiap konsentrasi dilakukan dua kali pengulangan dan dibandingkan dengan konrol. Jumlah larva udang yang mati dihitung setelah 24 jam.
d. Persen kematian (mortalitas) dihitung dengan :
% Mortalitas =
x 100 %
Persamaan regresi dibuat dengan memplotkan nilai log konsentrasi pada sumbu x dengan probit mortalitas pada sumbu y. Nilai LC50 diperoleh dengan memakai persamaan regresi linear y = a + bx Suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila LC 50 <1000 µg.mL untuk extrak dan <30 µg/mL untuk suatu senyawa.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1 Hasil Pengamatan IV.1.1 Hasil ekstraksi Sampel
Simplisia
Ekstraksi Maserasi
3,6 kg
1 kg
50 gram + 500 mL etanol 70%
IV.1.2
(Ekstrak
Fraksi cair-
IV.1.3
5 gram
Bobot N-hexan Etil asetat Air
Hasil Identifikasi senyawa
No 1 2 3 4 5
Metode Hasil
Hasil Partisi
Metode ECC cair)
dengan
Identifikasi Senyawa Positif
Senyawa Alkaloid Flavonoid Saponin Tanin Steroid
IV.1.4
negatif
Pengujian KLT
Eluen
Sampel
Etil asetat : n-hexan Ekstrak (4:1) etanol daun sukun
Visualisasi UV 254 nm UV 366 nm Terbentuk noda Terbentuk dengan nilai Rf noda dengan 0,8 cm nilai Rf 0,8 cm
IV.1.5 Hasil Pengujian Fraksi Eluen
Sampel
Etil asetat : n-hexan (4:1)
Fraksi 3 Fraksi 5
Fraksi 7
Visualisasi UV 254 nm UV 366 nm Tidak terbentuk Tidak terbentuk noda noda Terbentuk noda Terbentuk dengan nilai Rf noda dengan 0,95 cm nilai Rf 0,95 cm Terbentuk noda Terbentuk
Fraksi 15 Fraksi 30
dengan nilai Rf noda dengan 0,8 cm nilai Rf 0,8 cm Tidak terbentuk Tidak terbentuk noda noda Tidak terbentuk Tidak terbentuk noda noda
IV.1.6 Hasil Pengujian KLTP Eluen
Sampel
Visualisasi UV 254 nm UV 366 nm Etil asetat : n-hexan Fraksi 7 Terbentuk noda Terbentuk (4:1) dengan nilai Rf noda dengan 0,69 cm nilai Rf 0,69 cm IV.1.7 Hasil Pengujian KLT dua dimensi IV.1.8 Pengamatan Uji Toksisitas 1. Tabel Pengamatan Pengamatan Replikasi Kontrol Ekstrak Etanol Daun Sukun 50 100 150 200 500 ppm ppm ppm ppm ppm I 10 10 10 10 10 10 Jumlah II 10 10 10 10 10 10 Larva Awal Total 20 20 20 20 20 20 I 0 6 7 6 7 7 Jumlah II 0 7 6 5 8 8 Mortalitas Total 0 13 13 11 15 15 0 65 65 55 75 75 % Mortalitas % % % % %
2. Tabel Persamaan Regresi Konsentraasi Log (ppm) Konsentrasi 50 1,69 2 100 150 2,17 200 2,30 500 2,69
% Mortalitas
Probit
65 65 55 75 75
5,39 5,39 3,13 5,67 5,67
3. Kurva Persamaan Regresi Linear
PROBIT 5.7 y = 0.333x + 4.7275 R² = 0.2936
5.6 5.5
PROBIT
5.4
Linear (PROBIT)
5.3 5.2 5.1 0
IV.2
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan pemisahan komponen
kimia dengan cara kromatografi kolom. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakn kromatografi serapan dan adsorpsi. Kromatografi kolom digolongkan ke dalam kromatografi cair-padat. Fase gerak pada kromatografi berupa cairan atau pelarut. Sedangkan fase diam berupa padatan yang bersifat sebagai adsorben dan tidak boleh larut dalam fase gerak. Ukuran partikel fase diam harus seragam. Zat pengotor yang terdapat pada fase diam menyebabkan adsorpsi tidak reversible. Fase diam yang digunakan dalam praktikum ini adalah silika gel. Silika gel merupakan suatu bentuk dari silica yang dihasilkan melalui peng gumpalan sol natrium silica (NaSiO2). Sol mirip agar-agar ini dapat didehidrasi sehingga berubah menjadi padatan atau butiran mirip kaca yang bersifat tidak elastic. Sifat ini menjadikan silica gel dimanfaatkan sebagai zat penyerap. Aktifasi silika gel merupakan tahap awal yang penting dilakukan dalam menyiapkan suatu kolom kromatografi. Sebelumnya serbuk silicka gel digerus dalam mortar adapun tujuan penggerusan ini adalah supaya
ukuran molekul pada silica sebagai fase diam dapat lebih kecil sehingga kerapatan peramukannya
akan lebih meningkat. Dengan semakin
rapatnya molekul-molekul silika sebagai fase diam maka semakin optimal suatu pelarut dapat melakukan pemisahan. Oleh karena itu ukuran partikel dari adsorben atau silika gel sangat berpengaruh pada bagaimana eluen bergerak melewati kolom. Penyiapan kolom (packing kolom) atau pengemasan adalah salah satu faktor penting untuk memperoleh hasil pemisahan yang baik. Dalam praktikum ini pengisian fase daim ke dalam kolom dilakukan dengan cara basah. Karena pada saat memasukannya kedalam kolom silika terlebih dahulu disuspensikan dengan eluen. Sebelum dimasukkan
silika
dimasukkan
dalam
kolom
terlebih
dahulu
kapas pada bagian dasar kolom hingga bagian tersebut
tertutup rapat oleh kapas. Fungsi kapas disini adalah untuk menahan silika yang memiliki molekul kecil tidak ikut keluar dari keran pada saat proses pemisahannya karena adanya desakan dari eluen atau fase geraknya. Pengisian silika dalam kolom harus benar-benar mampat, tujuannya untuk mencegah molekul-molekul silika yang kecil masuk ke dalam celah-celah yang renggang pada saat menuangan dan mengalirkan eluen ke dalamnya. Dalam proses pemisahannya langkah pertama adalah sampel yang telah dilarutkan dengan pelarut yang sesuai dimasukkan di bagian atas kolom yang sudah terisi silika (fase diam). Kemudian fase gerak dialirkan perlahan-lahan sepanjang kolom. Pada fase gerak mengalir sepanjang kolom, fase gerak akan membawa campuran komponen ke bawah. Kesetimbangan dinamis antara komponen yang teradsorpsi pada fase diam dengan komponen yang terlarut dalam fase diam akan terjadi selama fase gerak mengalir ke bawah. Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan diperoleh 40 fraksi dengan warna yang berbeda beda. Pada awalnya warna yang dihasilkan adalah larutan bening yang kemudian berubah warna menjadi
hijau dan hijau pekat yang semakin lama akan berubah warna menjadi hijau muda dan kembali lagi menjadi warna bening Konsep
pemisahan
menggunakan
kromatografi
kolom
ini
didasarkan pada sifat kepolaran senyawa yang digunakan. Fase diam (silika gel) yang bersifat polar akan berikatan lebih erat dengan senyawa polar sehingga senyawa senyawa polar lebih lama berada dalam berada dalam kolom. Setelah didapatkan hasil fraksi dari kromatografi maka hasil dari kromatografi kolom ini selanjutnya dilakukan pengujian kromatograf lapis tipis perparatif (KLTP)
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN V.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan 1. V.2 Saran
DAFTAR PUSTAKA Akbar. M.A. 2012. Optimasi Ekstraksi Spent Bleaching Earth dalam Recovery Minyak Sawit. Skripsi. Tidak diterbitkan. Universitas Indonesia: Jakarta. Ansel Alimin, dkk. 2007. Kimia Analitik . Makassar: Alauddin Press,halaman 73. Ansel HC. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi . Ibrahim F, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms. Dalimatha, Setiawan. 2013. Ramuan Herbal Tumpas Penyakit. Penerbit Swadaya; Jakarta Dewi, C.D. 2005. Kimia Analiik Teori Dasar dan Penerapannya. Malang: Universitas Islam Negeri. Dirjen POM. 1979. Farmakope Indonesia Ed.III . Departemen Kesehatan RI: Jakarta, Dirjen POM. 1986. Sediaan Galenik . Departemen Kesehatan RI: Jakarta, Fried, Bernard &Sherma, Joseph. (1999).Thin Layer Chromatography, 4th Edition, Revised and Expanded . New York:Marcel Dekker. Inc8. Gritter, R.J dan Harbone. 1991. Pengantar Kromatografi . Penterjemah: Kosasih Padmawinata. Edisi Kedua. Bandung: ITB. Gunawan, Mulyadi. 2004. Ilmu Obat Alam Farmakognosi. Penerbit Swadaya: Jakarta
Harmanto, Ning. 2012. Daun sukun si daun ajaib penakluk aneka penyakit . PT. Agro media pustaka: Jakarta. Harborne,
J., 1996. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Cetakan kedua. Penerjemah: Padmawinata, K. Dan I. Soediro. Bandung: Penerbit ITB.
Hahn-Deinstrop, Elke.(2007). Applied Thin-Layer Chromatography,Best Practiceand Avoidanceof Mistakes.Second, Revised andEnlarge Edition.Jerman: WILEY-VCH Hendayana,
Sumar, dkk. 1994. Kimia Semarang Press: Semarang.
analitik
instrumentasi .IKIP
Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta. Jayanti, Dwi. 2010. Aktivitas antibakteri ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia (Tennore) Steen) trhadap pseudomonas aeruginosa. Jurnal Ilmiah Khopkar., S.M., 2008, Dasar-dasar Kimia Analitik , Jakarta, Erlangga. Rohman, Abdul. 2009. “Kromatografi untuk Analisis Obat ”. Graha Ilmu : Jakarta. Rohman, A., dan Gandjar, IG. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta; Pustaka Belajar. Sastrohamidjojo. Sastrohamidjojo, Hardjono.1985. Kromatografi Edisi kedua, Liberty. Yogyakarta Satari,
RR.
(1999). Penelitian Produk ArahdanProspek.Jakarta.
Alam
Laut
Indonesia,
Sri,H.A. 2015. Mikrobiologi Kesehatan. Cv.ANDI OFFSET; Yogyakarta Stahl, Egon. 1991. “Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi” . Penerbit ITB: Bandung. Voigt, R. 1984. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. ITB. Bandung). Wall, Peter E. 2005.Thin-Layer Chromatography, A Modern Practical Approach . UK: RS.C7.
Yazid, E.2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta: Andi,halaman 198-204
