BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, mi kro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat : agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman. Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa organik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya), glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawa fenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar (Harianto, 2009) . Peranan media kultur berhubungan dengan penyediaan unsure hara dan energi serta zat-zat lain yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perkembangan bahan eksplan di dalam botol kultur sehingga sangat berpengaruh terhadap keberhasilan kultur jaringan Melihat peranan penting dari media kultur, maka melaui praktikum ini dilakukan pembuatan media kultur secar baik dan benar sesuai dengan prosedur yang ada
1
Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Dalam program pemuliaan tanaman suatu tanaman umumnya memerlukan beberapa tahun untuk menghasilkan tanaman baru, sehingga untuk mempercepat pertumbuhan tanaman baru tersebut maka dapat di lakukan dengan kultur anter yang merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman dengan teknik in-vitro yang bertujuan untuk mendapatkan tanaman haploid. Kultur anther merupakan salah satu teknik dasar penerapan bioteknologi untuk pemuliaan tanaman. Dari kultur anther akan didapatkan tanaman haploid. Pembentukan tanaman haploid melalui pembentukan kalus atau androgenesis langsung. Manfaat tanaman haploid dalam pemuliaan tanaman adalah apabila digandakan kromosomnya dengan kolkhisin atau melalui fusi protoplas akan diperoleh tanaman 100% homozigot. Kultur anther dan serbuk sari digunakan untuk menghasilkan tanaman monoploid atau haploid. Meskipun mutasi mudah terjadi dalam sel biakan namun banyak mutasi tersebut bersifat resesif. Oleh kare na itu tidak terdektesi karena selselnya dalam keadaan diploid atau poliploid (Wijayani, 1994). Kegunaan kultur anther antara lain mampu menghasilkan tanamn monohaploid yang dapat digunakan untuk pemuliaan tanaman selanjutnya dan dapat menghilangkan sifat resesif, serta dari monohaploid dapat dihasilkan derivate yang dihaploid (diploid) dengan cara merangkapkan kromosom dengan perlakuan kolkisin dan mengadakan silangan tanaman monohaploid dan untuk membuat tanaman homozigot homozi got (Bennet dan O’neil, 1989). Berdasarkan penjelasan diatas, maka kami melakukan praktikum terkait kultur anther untuk mengetahui pengaruh ZPT pada kultur kultur anther bunga turi putih. B. Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah adalah sebagai berikut : 1. Mengapa digunakan anther dalam kultur jaringan tumbuhan ? 2. Bagaimana pengaruh Zat Pengatur Tumbuh ( NAA; 2,4 D; BAP) terhadap pertumbuhan kultur anther bunga bunga turi putih (Sesbania ( Sesbania grandiflora)? grandiflora)? 3. Bagaimanakah morfologi eksplan anther bunga turi putih ( Sesbania grandiflora) yang grandiflora) yang mengalami induksi ?
2
C. Tujuan
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Mengetahui keunggulan anther sebagai eksplan dalam teknik kultur jaringan tumbuhan. 2. Mengetahui pengaruh Zat Pengatur Tumbuh ( NAA; 2,4 D; BAP) terhadap regenerasi bunga turi putih (Sesbania grandiflora). 3. Mengetahui morfologi eksplan anther bunga turi putih (Sesbania grandiflora) yang mengalami induksi.
3
BAB II KAJIAN PUSTAKA A. Pengertian Kultur Anther
Anther adalah kepala sari. Anther mengandung serbuk sari (polen), sehingga kultur anther berarti mengikutsertakan polen di dalamnya. Polen yang masih muda (immature) atau mikrospora yang terkandung dalam anther dapat secara langsung beregenerasi membentuk embrio, disebut androgenesis, atau membentuk jaringan kalus yang selanjutnya dapat diinduksi untuk bergenerasi menjadi tanaman di bawah pengaruh zat pengatur tumbuh yang terkandung dalam media tanam. Polen bersifat haploid, dan tentunya sel-sel yang diproduksi oleh polen selama dikultur adalah haploid pula. Tanaman haploid dapat dikembangkan dengan menggunakan teknik kultur invitro anther dan pollen. Anther diperoleh dari tunas bunga dan dapat dikulturkan pada medium padat atau cair sehingga terjadi embriogenesis. Selain itu pollen juga dapat diambil secara aseptik dan dikulturkan pada medium cair. Proses perbanyakan tanaman haploid dengan menggunakan gametofit jantan semacam ini diesebut sebagai androgenesis. Ada dua macam androgenesis yaitu androgenesis langsung dan tidak langsung. Androgenesis langsung adalah proses pembentukan plantlet haploid dengan menggunakan kultur anther, sedangkan pada androgenesis tidak langsung adalah plantlet terbentuk melalui pembentukan kallus yang kemudian mengalami regenerasi menjadi plantlet (Yuwono, 2008) Kultur anther atau kultur mikrospora merupakan teknik perbanyakan tanaman yang jauh lebih efisien dari kultur jaringan meristem pucuk/tunas, kultur suspensi sel, dan kultur protoplas. Hal ini dapat dicapai karena jumlah mikrospora dalam satu bunga, jauh lebih banyak jika dibandingkan dengan jumlah sel pada jaringan meristem pucuk/tunas, suspensi sel, dan protoplas pada penggunaan satu pohon sumber eksplan. Setiap mikrospora berpeluang untuk berkembang menjadi individu tanaman lengkap apabila dikulturkan di dalam medium yang kaya nutrisi karena sel tersebut memiliki sifat totipotensi (Suaib, dkk., 2014). Kultur anther merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman dengan teknik in-vitro dengan tujuan untuk mendapatkan tanaman haploid yang unggul yang dapat dipergunakan untuk menghasilkan kultivar-kultivar baru atau hibrida
4
F1. Tanaman haploid adalah tanaman yang mempunyai jumlah kromosom yang sama dengan kromosom gamet (N). Tanaman haploid yang diperoleh dari kultur anther dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi rekombinan yang unik, karena mutasi yang resesif tidak muncul dalam keadaan diploid, dan pada penggandaan jumlah kromosom akan diperoleh tanaman yang homozygot. Tanaman yang homozigot sangat penting untuk menghasilkan hibrida terkendali. Zhou (1996) menyatakan bahwa produksi tanaman haploid dari kultur antera tergantung pada empat faktor, yaitu: (1). Induksi kalus atau embriorid dari mikrospora atau pollen, (2). Regenerasi tanaman dari kalus atau embriorid, (3). Persentase tanaman hijau, dan (4). Penggandaan kromosom, baik secara spontan atau diinduksi oleh kolkisin. Induksi kalus dan regenerasi tanaman dipengaruhi terutama oleh kultur teknik, walaupun keduanya ada di bawah kontrol genetik. Frekuensi induksi kalus dan pembentukan tanaman hijau dikendalikan oleh banyak gen (gen minor/ poligenik). Bila dihubungkan dengan kemampuan meregenerasikan tanaman melalui kultur antera (anther culturability), jumlah regeneran tanaman hijau dikendalikan oleh satu region dari kromosom 10, sedangkan pembentukan kalus dikendalikan oleh satu region dari kromosom 1 (Yamagishi et al., 1998). B. Eksplan
Setiap jenis tanaman maupun organ memiliki ukuran optimum untuk dikulturkan. Eksplan yang terlampau kecil akan kurang daya tahannya jika dikulturkan, sementara bila terlalu besar akan sulit mendapatkan eksplan yang steril. Pertumbuhan atau morfogenesis eksplan dapat juga dipengaruhi oleh cara penempatan eksplan dalam medium. Faktor ini erat kaitannya dengan transportasi hara dan zat pengatur tumbuh ke dalam eksplan (Wattimena, et al., 1992 dalam Ardiana & Fitrianingsih, 2010). Bagian tanaman yang biasa digunakan sebagai eksplan adalah meristem pucuk, tunas, tunas aksilar, pucuk, bagian kecil batang, nucellus, dan embrio zygotic. Bagian tanaman seperti meristem interkalar, anther, polen, ovul, dan mikrospora sering dikulturkan untuk inisiasi kalus. C. Kegunaan Kultur Anther
Kegunaan dari kultur anther merupakan suatu usaha yang menghasilkan tanaman monohaploid yang dapat dikombinasikan dengan mutagen kimia dan
5
fisik sehingga menghasilkan mutan-mutan yang tahan terhadap penyakit khususnya penyakit rebah, toleran terhadap garam tinggi di tanah dan kondisi kekeringan dan tanaman cepat berbunga. D. Kelebihan dan Kekurangan Kultur Anther
Kelebihan daeri kultur anther antara lain : Merupakan cara untuk menghasilkan bibit tanaman dalam jumlah banyak
dengan waktu singkat. Tidak memerlukan tempat yang luas. Tidak bergantung pada musim sehingga bisa dilaksanakan sepanjang tahun. Bibit yang dihasilkan lebih sehat dan seragam. Memungkinkan untuk dilakukan rekayasa genetika.
Selain memiliki kelebihan, teknik kultur jaringan juga mempunyai kekurangan-kekurangan berikut : Memerlukan biaya besar karena harus dilakukan di dalam laboratorium yang
steril serta menggunakan bahan-bahan kimia. Memerlukan keahlian khusus. Memerlukan aklimatisasi ke lingkungan luar karena tanaman hasil kultur
berukuran kecil dan bersifat aseptik. E. Faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan Kultur Anther
Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan produksi haploid melaui kultur in vitro adalah: 1. Tingkat Perkembangan Pollen pada tanaman padi, frekuensi pembentukan kalus yang tertinggi diperoleh pada kultur anther dengan pollen yang nukleusnya terletak di pinggir sel (mid uninucleate microspore stage). Pembentukan terbentuknya kalus pada berbagai stage adalah sebagai berikut:
5.6% kultur membentuk kalus pada early-uninucleate stage, yaitu sesudah tetrad terbentuk.
35,7% kultur membentuk kalus pada mid-uninucleate stage.
10.5% pada saat late-uninucleate stage.
6.7% pada saat mitosis pertama dari pollen.
0% pada saat polen mencapai bi-nucleat stage.
6
2. Perlakuan fisik sebelum inokulasi Perlakuan keberhasilan
temperatur
kultur
anther
rendah dalam:
sebelum Nicotiana
inokulasi, tabacum,
meningkatkan
Datura
innoxia,
Hyosciamus niger, Hordeum vulgare dan Oryza sativa. Pada umumnya, temperatur antara 3-10oC. Bila dipergunakan temperatur rendah 3-5oC, maka waktu perlakuan dapat dipersingkat, sedangkan pada terperatur rendah 10-15 oC, waktu perlakuan lebih panjang. Percobaan Wang dan grupnya (Chen, 1986) dalam kultur padi hsien menunjukkan:
Bila temperatur 3-5oC, dibutuhkan 10 hari.
Bila temperatur 6-8 oC, dibutuhkan 15 hari.
Bila temperatur 9-10oC, dibutuhkan 20 hari.
3. Perlakuan kimia sebelum inokulasi Anther yang dikultur dalam media cair yang ditambah dengan 50-250 mg/l colchisine selama 4 hari, meningkatkan frekuensi pembentukkan kalus dan diferensiasi. Colchicine dapat meningkatkan tanaman double haploid hingga 79%, sedangkan anher tanpa perlakuan pendahuluan, hanya menghasilkan 53,8% tanaman. Jika konsentrasi colchicine ditingkatkan hingga 500 mg/l akan mengakibatkan frekuesi tanaman anakan yang abnormal seperti albino akan meningkat. Selain senyawa tersebut senyawa ethrel juga sering digunakan untuk praperlakuan pada media cair + 5 g/l ethrel (Gunawan, 1988). 4. Media tumbuh Androgenesis dapat diinduksi pada media yang umum digunakan adalah MS (Murashige dan Skoog, 1962) dan N6 (Chu, 1978) atau variasi kedua media tersebut. Dalam beberapa hal media perlu diperkaya dengan senyawa organik komplek seperti ekstrak kentang, air kelapa dan casein hidrolisat. Pada sebagian besar spesies, sukrosa yang digunakan dalam media antara 2-3% sementara untuk beberapa spesies lain khususnya tanaman serealia responnya lebih baik apabila konsentrasi gulanya lebih tinggi (hingga 15%). Pada beberapa spesies lain, penggunaan sumber karbohidrat seperti ribosa, maltosa dan glukosa mempunyai pengaruh yang lebih baik dibanding dengan sukrosa.
7
Pada beberapa spesies, penambahan zat pengatur tumbuh pada media kultur anther diperlukan misalnya auksin dan sitokinin. Auksin dan sitokinin yang dikombinasikan terutama untuk spesies yang memerlukan fase kalus sebelum dihasilkan tanaman haploid. Kultur antera umumnya memerlukan bahan pemadat berupa agar. Akan tetapi karena agar mengandung senyawa yang dapat menghambat proses androgenesis, maka diperlukan bahan pemadat alternatif. Agarose merupakan bahan pemadat yang paling baik untuk kultur antera dari spesies serealia. Alternatif lain adalah dengan menggunakan media cair dengan cara menaruh antera di atas permukaan media yang disebut kultur mengapung atau ”float culture”. 5. Zat Pengatur Tumbuh Zat pengatur tumbuh merupakan salah satu faktor terpenting dalam keberhasilan pertumbuhan tanaman yang dikulturkan. Zat pengatur tumbuh tanaman dapat dibedakan menjadi zat pengatur tumbuh endogen dan eksogen. Zat pengatur tumbuh endogen disebut fitohormon, sedangkan zat pengatur tumbuh eksogen disebut zat pengatur tumbuh sintetik. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdiri dari 5 kelompok yaitu auksin, giberelin, etilen, sitokinin dan asam absisat (ABA) (Wattimena, 1992 dalam Nurhidayati, 2012). Zat Pengatur Tumbuh pada kultur anther Solanaceae tidak diperlukan cukup media dasar N6. ZPT yang biasa digunakan untuk memacu pertumbuhan embriogenesis pada kultur anther adalah senyawa TIBA (Tri iodobenzoic acid). Disamping itu penambahan 2 mg/l 2,4D pada media dasar digunakan untuk kultur anther padi, dan kombinasi ZPT: 4 mg/l NAA + 1 mg/l 2,4D dan 1-3 mg/l kinetin sering ditambahkan pada media dasar untuk kultur anther. Penambahan bahan bahan organik seperti: ekstrak pisang, air kelapa, ensdosperm serealia, ekstrak ragi, alanin, folic acid dan Co-enzym A, dapat memacu pertumbuhan pada kultur anther.Penambahan 2% arangaktif dapat memperbaiki androgenesis.
8
Tabel 2.1. Kombinasi perbandingan ZPT auksin dan sitokinin dalam metode
Mohr (Mohr dan Schopfer, 1978 dalam Hendaryono & Wijayani, 1994). ZPT
Dosis kombinasi perbandingan ZPT (ppm)
Sitokinin
Auksin
Hasil pertumbuhan
0
1
2
3
4
5
5
4
3
2
1
0
Akar saja
Akar dan Tunas
Tunas saja
6. Genotipe tanaman donor Tidak semua kultuvar dari setiap tanaman organ anthernya dapat menghasilkan tanaman haploid, seperti kultivar dari Lycopersicon esculentum dari 43 kultivar hanya 3 kultivar saja yang anthernya dapat ditumbuhkan. Triticum aestivum hanya 10 kukltivar saja yang anthernya dapat ditumbuhkan menjadi tanaman haploid dari 21 kultivar yang ada. 7. Kondisi Tanaman Donor Umur fisiologi tananam donor ternyata dapat mempengaruhi pertumbuhan tanaman enther. Bunga dari tanaman muda pada saat permulaan pembungaan, ternyata lebih baik dari pada bunga yang keluar kemudian. Kondisi nutrisi tanaman donor: tembakau yang diberikan perlakuan larutan Hoagland selama 2 minggu, mempunyai bunga dengan vigor yang lebih baik. Temperatur waktu menumbuhkan tanaman donor. Contohnya pada tanaman Datura, tanaman donor yang ditumbuhkan pada suhu 24 oC frekuensi terjadinya androgenesis sebesar 45% dan bila tanaman donor ditumbuhkan pada temperatur 17 oC, frekuensi tumbuhnya turun menjadi 8%. Cahaya selama pertumbuhan tanaman donor. Triticum aestivum
yang
ditumbuhkan
di
lapangan
dengan
cahaya
yang
penuh,
menghasilkan kultur anther yang lebih baik dari tanaman yang ditumbuhkan di rumah kaca pada musim dingin dengan penyinaran yang kurang.
9
Tanaman yang dihasilkan melalui kultur antera dapat berupa tanaman haploid, haploid ganda spontan, poliploid, mixopoid, dan aneuploid. Perbedaan morfologi tanaman haploid, haploid ganda (spontaneous doubled haploid), poliploid, mixopoid dan aneuploid menurut Zhang (1992) adalah sebagai berikut:
Tanaman haploid. Dibandingkan dengan tanaman diploid, pada umumnya tanaman haploid lebih kecil dan mempunyai banyak anakan serta tidakmempunyai ligula dan aurikel. Panjang dan lebar daun, demikian juga malai dan glumennya lebih kecil. Tanaman berbunga, tetapi tidak berbiji (steril).
Tanaman haploid ganda (dihaploid atau diploid). Tanaman ini mempunyai morfologi seperti tanaman diploid biasa yang fertil. Populasi regeneran selanjutnya akan tetap homozigous dan homogen, tidak bersegregasi.
Tanaman mixopoid adalah suatu tanaman yang mempunyai bagian haploid dan diploid sekaligus. Bagian tanaman yang diploid dapat juga terjadi diantara anakan, cabang malai dan bahkan pada spikelet secara individual dari tanaman yang haploid.
Tanaman yang poliploid ditandai dengan pertumbuhan tanaman yang terlalu tergar (vigorous), daun yang lebih tebal, stomata yang lebih besar, dan biji yang lebih besar serta berbulu (pubescent) dengan duri (awn) yang pendek. Laju pembentukan biji rendah dan regeneran mempunyai sifat- sifat yang serupa dengan generasi tanaman pertamanya.
Tanamn yang aneuploid serupa denagn tanaman diploid. Pertumbuhannya tegar dengan daun yang tegak serta anakan yang lebih banyak. Ukuran glumennya sama dengan tanamn diploid atau bahkan sedikit lebih besar. Tanaman ini semi atau steril penuh. Biji cenderung mudah rontok. Laju pembentukan biji lebih rendah dari progeninya.
Keuntungan: teknik isolasinya lebih mudah, dapat menghasilkan tanaman dengan jumlah kromosom yang bervariasi (n, 2n dan 3n). Kerugian : Tanaman yang diperoleh bermacam-macam karena kemungkinan tanaman tersebut berasal dari jaringan lain seperti jaringan tapetum (3n), atau jaringan penyambung (conective tissue), sehingga masih perlu tahapan seleksi.
10
F. Permasalahan dalam kultur anther
1. Kontaminasi Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya.Fenomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll). Upaya mencegah terjadinya kontaminsi:
Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.
Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar. 2. Pencoklatan/browning Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam
yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan. 3. Vitrifikasi Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan: Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal. Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil. Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent. Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade. 4. Variabilitas Genetik Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena:
Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol.
11
Penggunaan teknik yang tidak sesuai.
Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan. 5. Pertumbuhan dan Perkembangan Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh. Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali. Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya.Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen. 6. Praperlakuan Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya. 7. Lingkungan Mikro Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi
12
pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.
13
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimen karena menggunakan beberapa variabel yaitu variabel kontrol, manipulasi dan respon serta kami menggunakan pembanding dalam penelitian ini (kontrol). B. Waktu dan tempat penelitian Waktu penelitian
: pada hari Rabu, 26 April 2017
Tempat penelitian : laboratorium kultur jaringan gedung C9 lantai 2.
C. Variabel Penelitian Variabel Kontrol
: Anter bunga turi putih dan ukuran botol kultur.
Variabel Manipulasi
:
-
Perlakuan A (NAA 1 ml + 2,4 D 2 ml +BAP 3 ml)
-
Perlakuan B (NAA 2 ml + 2,4 D 2 ml +BAP 2 ml)
-
Perlakuan C (NAA 3 ml + 2,4 D 2 ml +BAP 1ml)
Variabel Respon
: Pertumbuhan kalus pada anter
D. Alat dan bahan
Adapun alat dan bahan yang digunakan yaitu: 1.
Alat :
Lampu spirtus
Botol kultur
Penyemprot botol
Gelas piala
Rak kultur dengan lampu 40 watt
Pinset
petridish
gelas ukur
Pisau bedah
Laminar air flaw/ enkas
Tissue
2.
Bahan :
Anthera bunga turi putih (Sesbania grandiflora)
Aquades steril
Alkohol 70%
Bayclin/sunclin 20%
Kertas saring steril
Media kultur A, B dan C
14
E. Prosedur Kerja
1.
Persiapkan alat dan bahan untuk sterilisasi anther bunga turi putih dalam laminar air flaw
2.
Bahan tanaman berupa kuncup bunga turi putih dilakukan dibersihkan dengan disikat perlahan menggunakan larutan baycline 20%
3.
Kuncup bunga turi putih di rendam larutan fungisida selama 30 menit
4.
Selanjutnya kuncup bunga turi putih diangkat dari larutan fungisida dengan pinset dan diletakkan kedalam botol kultur kemudian dicuci dengan air mengalir. Proses dilakukan dengan steril sehingga kuncup bunga tidak boleh disentuh tangan
5.
Sterilkan kuncup bunga turi putih dengan meremdam secara berurutan di alkohol 70% selama 2 menit, kemudian melanjutkan dengan aquades selama 3 menit, kemudian larutan bayclin 5 % selama 3 menit dilanjutkan aquades selama 3 menit, kemudian direndam baycline 10% selama 3 menit dan dilanjutkan dengan aquades 3 menit.
6.
Setelah itu kuncup bunga di rendam dan dibilas dengan aquades steril selama 3 menit dengan 3 kali pengulangan.
7.
Setelah dibilas, kuncup bunga turi putih dipindahkan dalam cawan petri yang dilapisi kertas saring steril
8.
Kuncup bunga turi putih dipotong menggunakan scaple, diambil bagian anter sebanyak 6 buah.
9.
Siapkan botol kultur yang sudah terdapat media A,B dan C.
10. Setiap botol kultur ditanam sebanyak 2 buah anter bunag turi putih. 11. Setelah itu tutup botol kultur dengan alumunium foil dan lapisi dengan wrap. 12. Inkubasi kultur anter pada ruangan kultur pada keadaan gelap 13. Dilakukan pengamatan kultur anter apakah sudah tumbuh kalus.
15
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Induksi Anther pada bunga Sesbania grandiflora A. Hasil Pengamatan
Berdasarkan hasil praktikum mengenai Isolasi dan Induksi Anther pada bunga Sesbania grandiflora diperoleh dengan hasil sebagai berikut : Tabel 4.1 Hasil Pengamatan Isolasi dan Induksi Kultur Anther Pada Bunga Turi
Putih (Sesbania grandiflora)
No.
ZPT
Keterangan
NAA (1 ml) + 1.
A
BAP (3 ml) + 2,4 D (2 ml) NAA (2 ml) +
2.
B
BAP (2 ml) + 2,4 D (2 ml)
3.
C
NAA (3 ml) + BAP (1 ml) +2,4 D (2 ml)
Tanggal Pengamatan
Tgl
04-05-
05-05-
07-05-
07-05-
2017
2017
2017
2017
26 April 2017
-
X
X
X
26 April 2017
-
X
X
X
26 April 2017
-
-
X
X
26 April 2017
-
-
X
X
26 April 2017
-
-
X
X
26 April 2017
-
-
X
X
Penanaman
Keterangan: (-)
: Belum tumbuh
(K)
: Tumbuh Kalus
(A)
: Tumbuh Akar
(X)
: Kontaminasi
(T)
: Tumbuh Tunas
B. Analisis Data
Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa praktikum
isolasi dan
induksi kultur anther bunga turi putih pada tiga perlakuan yang berbeda menunjukkan hasil yang relatif sama, yakni terjadi kontaminasi oleh bakteri pada ketiga perlakuan. Tiga perlakuan tersebut terdiri dari media A, B dan C. Media A terdiri dari media MS yang dipadukan dengan NAA 1ml + BAP 3 ml + 2,4 D 2 ml; media B terdiri dari media MS yang dipadukan dengan NAA 2 ml + BAP 2
16
ml + 2,4 D 2 ml; dan pada media C terdiri dari media MS yang dipadukan dengan NAA 3ml + BAP 1 ml + 2,4 D 2 ml. Pada perlakuan A (NAA 1ml + BAP 3 ml + 2,4 D 2 ml) diketahui bahwa pada hari pertama pengamatan anter belum mengalami induksi dan anter berubah warna menjadi coklat. Namun pada hari kedua perlakuan A mengalami kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang ditandai dengan disekelilingi anther terdapat lender bewarna putih dan coklat, sehingga dapat dikatakan bahwa anther bunga turi putih sudah tidak mengalami partumbuhan. Pada perlakuan B (NAA 2 ml + BAP 2 ml + 2,4 D 2 ml) diketahui bahwa pada hari pertama dan kedua pengamatan pertumbuhan anter belum mengalami induksi dan anter berubah warna menjadi oranye kecoklatan. Namun pada hari kedua perlakuan B mengalami kontaminasi yang disebabkan oleh jamur yang ditandai dengan disekelilingi anther terdapat lender berwarna kehijauan, sehingga dapat dikatakan bahwa anther bunga turi putih sudah tidak mengalami partumbuhan. Pada perlakuan C (NAA 3ml + BAP 1 ml + 2,4 D 2 ml) diketahui bahwa pada hari pertama dan kedua pengamatan pertumbuhan anter belum mengalami induksi dan anter berubah warna menjadi coklat kehitaman. Namun pada hari ketiga perlakuan C mengalami kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang ditandai dengan disekelilingi anther terdapat lender bewarna putih dan coklat kekuningan, sehingga dapat dikatakan bahwa anther bunga turi putih sudah tidak mengalami partumbuhan C. Pembahasan
Berdasarkan kegiatan praktikum dan pengamatan yang telah dilakukan, dapat diketahui bahwa kegiatan praktikum seharusnya dilakukan sesuai tahap berikut : persiapan (sterilisasi alat dan media), isolasi bahan tanam (eksplan), sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. Sterilisasi alat dan media diperlukan untuk mengurangi resiko kontaminasi dengan membunuh bakteri-bakteri yang tidak sengaja tercampur dalam alat dan media saat proses pembuatan media dengan suhu tinggi di autoklaf. Alat dan media disterilisasi dengan suhu 121 C, pada tekanan 1,5 kg/cm 2 selama 20 menit. Sebelum kegiatan praktikum berlangsung,
17
ruangan harus disterilisasi menggunakan formalin dan juga UV agar ruangan terbebas dari kontaminan. Saat kegiatan praktikum berlangsung, dilakukan dalam keadaan yang sangat aseptik guna menghindari adanya kontaminan yang memungkinkan masuk ke dalam alat atau media yang digunakan saat kegiatan praktikum kultur jaringan tumbuhan. Kegiatan praktikum isolasi dan induksi kultur anther bunga dilakukan dengan menggunakan eksplan berupa anther bunga turi putih. Sebagai sumber utama kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada proses sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen ditujukan untuk menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya di rendam dalah alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya dicelupkan pada larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di bagian dalam eksplan. Digunakan pula fungisida untuk membunuh spora ataupun cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan. Isolasi dilakukan dengan menggunakan media Murashige dan Skoog (MS) dengan tiga perlakuan yang berbeda, yakni penambahan Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) yang berbeda-beda pada tiap media. Ada 3 macam media MS, yaitu pada ZPT A dengan kombinasi NAA 1 ml + BAP 3 ml + 2,4 D 2 ml; ZPT B dengan kombinasi NAA 2 ml + BAP 2 ml + 2,4 D 2 ml; dan pada ZPT C dengan kombinasi NAA 3ml + BAP 1 ml + 2,4 D 2 ml. Dengan adanya perbdaan ZPT pada tiap media dijadikan manipulasi untuk melihat pertumbuhan eksplan anther bunga turi putih yang telah diisolasi. Setelah tahap isolasi anther turi putih pada semua media (A, B dan C) selesai dilakukan, dilanjutkan dengan peletakan hasil isolasi di tempat gelap agar ZPT yang berupa auksin dapat bekerja maksimal. Zat pengatur tumbuh merupakan salah satu faktor terpenting dalam keberhasilan pertumbuhan tanaman yang dikulturkan. Zat pengatur tumbuh tanaman dapat dibedakan menjadi zat pengatur tumbuh endogen dan eksogen. Zat pengatur tumbuh endogen disebut fitohormon, sedangkan zat pengatur tumbuh eksogen disebut zat pengatur tumbuh sintetik. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdiri dari 5 kelompok yaitu auksin, giberelin, etilen, sitokinin dan asam absisat (ABA) (Wattimena, 1992 dalam Nurhidayati, 2012).
18
Eksplan yang telah ditanam secara in vitro diamati pertumbuhan dan perkembangannya setiap hari. Parameter yang diamati adalah warna eksplan, ukuran eksplan (mangalami induksi atau tidak), adanya kontaminasi atau tidak serta tumbuhnya kalus. Parameter pertumbuhan kalus yang diamati dan diukur adalah kecepatan waktu induksi kalus dan penampakan kalus. Penampakan kalus ditinjau dari tekstur yang dihasilkan selama masa inkubasi. Penampakan kalus dapat diamati secara langsung. Berdasarkan kegiatan pengamatan yang telah dilakukan, eksplan anther turi putih mengalami kontaminasi pada semua media. Baik pada media MS dengan penambahan ZPT A dengan kombinasi NAA 1 ml + BAP 3 ml + 2,4 D 2 ml; ZPT B dengan kombinasi NAA 2 ml + BAP 2 ml + 2,4 D 2 ml; dan pada ZPT C dengan kombinasi NAA 3ml + BAP 1 ml + 2,4 D 2 ml semuanya mengalami kontaminasi. Namun kontaminan yang ada berbeda jenis. Pada media A dan C kontaminan yang ada merupakan bakteri yang melingkupi eksplan. Hal tersebut dapat dianalisa bahwa kontaminan berasal dari eksplan yang ditanam, kemungkinan
eksplan
yang
ditanam
belum
steril
seutuhnya
sehingga
mengakibatkan kontaminasi setelah dikulturkan. Pada media B kontaminasi terjadi karena adanya jamur. Hal tersebut dimungkinkan karena media berair dan airnya tidak dibuang saat penanaman eksplan sehingga menyebabkan media lembab dan ditumbuhi jamur sebagai kontaminan. Untuk membedakan kedua jenis kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang muncul pada eksplan maupun media kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka tanaman akan basah atau menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri langsung menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan muncul hifa jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya garis – garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abu – abu. Penyebab terjadinya kontaminasi bisa diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman, sa at sterilisasi media dan eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media (Rohmah, 2013). Sebelum terjadinya kontaminasi pada eksplan yang ditanam, terjadi beberapa perubahan morfologi pada eksplan dan media, salah satunya yakni perubahan warna. Eksplan yang ditanam pada media warnanya berubah menjadi
19
lebih kecoklatan dibandingkan sebelum dikulturkan. Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan (Nurhidayati, 2012). Tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari praktikannya. Beberapa kemungkinan yang bisa terjadi kenapa tidak terbentuk kalus, yaitu kemungkinan lingkungan pertumbuhan donor yang tidak baik sehingga terjadi stress pada tanaman dan hal tersebut mempengaruhi pertumbuhan bunga pada tanaman turi putih.Umur tanaman donor juga ikut berpengaruh bila tanaman donor sudah terlalu tua maka kemungkinan gagalnya semakin tinggi, dan sebaliknya apabila tanaman donor dari tanaman yang masih muda kemungkinan keberhasilan kultur anther semakin tinggi, hal ini dikarenakan pada tanaman muda jaringannya masih terus tumbuh dan berkembang sehingga kemungkinan regenerasi pada in vitro lebih mendukung (Suliansyah,2013). Apabila tidak terjadi kontaminasi pada eksplan, tahap pertama setelah eksplan dikulturkan adalah terjadinya proses induksi, yakni eksplan membesar. Menggelembung
atau
melengkungnya
eksplan
ini
dapat
terjadi
akibat
penambahan hormon NAA yang merupakan hormon auksin. Hormon tersebut menginduksi pembentangan sel dengan mengendurkan dinding sel akibat penurunan pH, pH rendah dapat mengaktifkan beberapa enzim perusak dinding sel (selulosa). Enzim tersebut diduga memutuskan ikatan pada polisakarida dinding sehingga menyebabkan dinding elastis dan mudah merenggang (Salisbury dan Ross, 1992). Selain itu NAA sebagai auksin berperan untuk memacu proses dediferensiasi sel, menekan oragonogenesis serta menjaga pertumbuhan kalus (Rohmah, 2013). Induksi yang terjadi pada eksplan kemudian diikuti dengan tahap pembentukan kalus. Proses induksi kalus ini diawali dengan mengelembungnya
20
atau melengkungnya eksplan kemudian dilanjutkan dengan munculnya tonjolantonjolan bewarna putih pada bagian luka bekas potongan yang akan terus berkembang menjadi kalus. Kalus merupakan proliferasi massa jaringan yang belum terdiferensiasi, massa jaringan ini terbentuk akibat adanya luka atau bekas potongan pada eksplan sehingga sel-sel yang kontak dengan media akan menjadi meristematis (Katuuk, 1989). Penambahan zat pengatur tumbuh pada suaru media juga mepengaruhi waktu induksi yang terjadi pada kultur anther. konsentrasi yang dibutuhkan untuk menghasilkan kalus pada kultur jaringan adalah perbandingan konsentrasi NAA sebagai auksin harus lebih tinggi dibandingkan dengan BAP atau sitokinin. Penambahan hormon NAA yang merupakan hormon auksin menginduksi pembentangan sel dengan mengendurkan dinding sel akibat penurunan pH, pH rendah dapat mengaktifkan beberapa enzim perusak dinding sel (selulosa). Enzim tersebut diduga memutuskan ikatan pada polisakarida dinding sehingga menyebabkan dinding elastis dan mudah merenggang (Salisbury dan Ross, 1992). Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa pemberian hormon auksin (NAA dan 2,4 D) yang lebih tinggi dibandingan BAP dapat mempercepat terjadinya induksi dan pembentukan kalus pada eksplan yang ditanam pada media.
21
BAB V PENUTUP A. Simpulan
Berdasarkan
kegiatan
praktikum
yang
telah
dilaksanakan,
dapat
disimpulkan bahwa : 1. Kultur anther merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman dengan teknik in-vitro dengan tujuan untuk mendapatkan tanaman haploid yang unggul yang dapat dipergunakan untuk menghasilkan kultivar-kultivar baru atau hibrida F1. 2. Kultur anther memiliki banyak manfaat diantaranya : menghasilkan bibit tanaman dalam jumlah banyak dengan waktu singkat, tidak memerlukan tempat yang luas, tidak bergantung pada musim sehingga bisa dilaksanakan sepanjang tahun, bibit yang dihasilkan lebih sehat dan seragam dan memungkinkan untuk dilakukan rekayasa genetika. 3. Pemberian ZPT berupa auksin dan sitokinin yang tepat berpengaruh terhadap induksi dan pembentukan kalus pada eksplan. Konsentrasi yang dibutuhkan untuk menghasilkan kalus pada kultur jarin gan adalah dengan perbandingan konsentrasi NAA dan 2,4 D sebagai auksin harus lebih tinggi dibandingkan dengan BAP sebagai sitokinin. 4. Terjadi kontaminasi pada praktikum kultur anther bung turi, yang disebabkan keberadaan jamur dan bakteri. Penyebab kontaminasi dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari praktikannya. Dengan demikian ekspla anther tidak dapat masuk pada tahap
induksi
(mengelembungnya
atau
melengkungnya
eksplan
kemudian dilanjutkan dengan munculnya tonjolan-tonjolan bewarna putih pada bagian luka bekas potongan yang akan terus berkembang menjadi kalus).
22
B. Saran
Berdasarkan kegiatan yang telah dilakukan, praktikan dapat memberikan saran kepada pembaca atau praktikan selanjutnya agar lebih berhati-hati dalam melakukan kegiatan praktikum. Setiap tahap dalam kegiatan praktikum ini harus dilakukan secara aseptis dan mengikuti prosedur yang ada. Ketelitian dalam pembuatan media, proses pengkulturan dan pengamatan juga sangat diperlukan. Hal tersebut dilakukan agar dihasilkan eksplan yang tumbuh pada media tanpa adanya kontaminasi dan kalus dapat tumbuh dengan baik.
23
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana, Dwi Wahyuni & Fitrianingsih, Ida. 2010. Teknik Kultur Jaringan Tunas Pepaya dengan Menggunakan Beberapa Konsentrasi IBA. Buletin Teknik Pertanian. Vol. 15 ( 2): 52-55. Gunawan, L.W. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Hendaryono, D.P dan Wijayani, A. 1994. Tehnik Kultur Jaringan: Pengenalan dan
Petunjuk
Perbanyakan
Tanaman
secara
Vegetatif-modern .
Yogyakarta : Kanisius. Katuuk, J.R.P. 1989. Tekhnik Kultur Jaringan dalam Mikropropagasi Tanaman. Jakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Proyek Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan. Nurhidayati, 2012. Regenerasi Tunas dari Kultur Tangkai Daun Iles-iles (Amorphophallus muelleri Blume). Jurnal Biodiversitas. Vol. 9 (3): 173176. Rohmah, D.I. 2013. Pengaruh Berbagai Konsentrasi 2,4 D (Dichlorophenoxy Acetic Acid) Terhadap Induksi dan Viabilitas Kalus Daun dan Nodus Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) pada Medium New Phalaenopsis (NP) secara in vitro. Skripsi. Tidak dipublikasikan. Universitas Negeri Surabaya. Salisbury, F.B. & Ross, C.W. 1992. Plant Physiology. California: Wadswovth Publishing Co. Suaib, Arma, M.A. & Muhidin. 2014. Morfologi Bunga yang sesuai bagi Kultur Mikrospora pada Tanaman Jarak Pagar (Jatropha Curcas L.). Jurnal Agroteknos. Vol. 4 (1): 1-9. Suliansyah, Irfan. 2013. Kultur Jaringan Tanaman. Serial Online. Diakses melalui:
http://www.cs.unsyiah.ac.id/~frdaus/PenelusuranInformasi/File-
Pdf/Kultur%20Jaringan%20Tanaman%20SAMPLE%20DOWNLOAD.pd f pada 21 Mei 2017.
24
Yamagishi, M., M. Otani, M. Higashi, Y. Fukuta, K.
Fujui, M. Yano, T.
Shimada. 1998. Chromosomal regions controlling anther culturability in rice (Oryza sativaL.). Euphytica. 103: 227-234 Yuwono, T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Gadjah Mada University Press: Yogyakarta Zhang, J, dkk, 1992.
Anther and Embrio Culture . American Journal of
biotechnology. Vol. 82/No. 5.
25
