LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TEKNIK KULTUR EMBRIO KACANG MERAH (Phaseolus vulgaris L.) SECARA IN VITRO dan SUBKULTUR ANGGREK
Laporan ini disusun guna memenuhi nilai praktikum matakuliah Kultur jaringan yang dibimbing oleh Dra. Triastinurmiatiningsih, MSi
Disusun oleh: Sara Azzahra (0611 14 015) Mastika Sihaloho (0611 14 0
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PAKUAN 2017
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, sala h satu contohnya adalah dengan perbanyakan secara vegetatif. Cara perbanyakan vegetatif umumnya akan menghasilkan tanaman yang lebih cepat tumbuh. Dapat tumbuhnya bagian terkecil dari tumbuhan menjadi individu baru karena tumbuhan memiliki sifat mampu untuk tumbuh menjadi tanaman yang sempurna bila disekitar lingkungan tersebut sesuai. Sifat tumbuhan inilah yang kemudian mencetuskan suatu metode perbanyakan
tumbuhan
secara
vegetatif,
yaitu
dengan
kultur
jaringan
tumbuhan.Indonesia adalah negara agraris yang sangat kaya akan hasil pertanian, salah satunya adalah kacang-kacangan. Kacang-kacangan sebagai bahan pangan sumber energi dan protein. Untuk menghasilkan tanaman kacang yang seragam dalam waktu yang singkat dilakukan kultur embrio. Kultur jaringan sering dijadikan salah satu solusi sebagai metode perbanyakan tanaman dan juga dapat digunakan sebagai suatu metode penyimpanan plasma nutfah yang tidak membutuhkan tempat yang besar. Keberhasilan dari kultur jaringan sangat bergantung dari ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur. Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan unsur hara. Sehingga, pembuatan larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan. Umumnya bagian daun dan plumule tumbuhan yang sering diperbanyak dengan metode ini. Oleh sebab itu, dilakukan kultur jaringan pada bagian plumule tumbuhan kacang merah (Phaseolus vulgaris L.) Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan tertua dilakukan pada biji anggrek dengan tujuan untuk mengecambahkannya dalam media yang kaya nutrisi karena biji dari anggrek tidak mempunyai cadangan makanan. Kultur jaringan terus berkembang dari mengkulturkan biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus
berkembang hingga mampu mengkulturkan satu sel dari tanaman. Penggunaan kultur jaringan mempunyai kelebihan, yaitu mampu memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif singkat. Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat tergantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya unsur-unsur hara dan mikro, tetapi juga karbohidrat yang pada umumnya berupa gula-gula untuk menggantikan karbon yang biasanya didapat dari atmosfer melalui fotosintesis. Pertumbuhan tanaman anggrek baik vegetatif maupun generatif tidak hanya ditentukan oleh faktor genetik, tetapi juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti cahaya, suhu, kelembaban, kadar O2 dan media tumbuh. Media tumbuh merupakan salah satu syarat penting yang perlu diperhatikan dalam budidaya anggrek, karena media berfungsi sebagai tempat berpijaknya tanaman, mempertahankan kelembaban dan tempat penyimpanan hara serta air yang diperlukan (Batchelor, 1981, dalam Wuryan, 2008). Dalam usaha pengembangan budidaya, salah satu syarat penting yang perlu diperhatikan adalah penggunaan media tumbuh. Media tumbuh yang baik harus memenuhi beberapa persyaratan, yaitu : tidak cepat melapuk, tidak menjadi sumber penyakit, mampu mengikat air dan zat-zat hara secara baik, mudah didapat dalam jumlah yang diinginkan dan murah, ramah lingkungan. Dalam
perbanyakan
tanaman
anggrek
yang
sudah
ada
(platelet)
maka perbanyakan ini disebut dengan subkultur plantlet anggrek. Perbanyakan dalam istilah kultur jaringan mengacu pada istilah multiplikasi. Mult iplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar (Muhayat, 2012).
1.2 Tujuan
1. Mengetahui persiapan yang dilakukan sebelum penanaman eksplan. 2. Mengetahui tahapan penanaman eksplan anggrek 3. Untuk mengetahui teknik dan cara melakukan kultur organ. 4. Untuk mengetahui tahapan-tahapan dan proses dalam megkultur organ. 5. Untuk memahami apa itu kultur organ.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Biologi Kacang Merah (Phaseolus vulgaris L.)
Kacang merah merupakan tanaman semak yang tegak dan ada yang merambat di para-para. Kacang merah dapat mencapai tinggi sekitar 3,5 - 4,5 meter, tumbuhnya memerlukan penyangga. Pengembangbiakannya dapat dilakukan dengan bijinya dan juga diperlukan tanah yang baik. Kacang merah akan dapat tumbuh baik di daerah basah atau dingin pada ketinggian 1400-2000 meter dari permukaan laut dan dipanen 6 bulan setelah penanaman.Tanaman kacang merah ini biasanya tumbuh melilit pada batang bambu. Daun majemuk, beranak daun tiga, daun berbentuk jorong. Perbungaan tandan di ketiak dengan panjang hingga 15 cm, dengan banyak buku dan bunga. Sayap bunga berwarna putih kekuningan atau ungu sedangkan lunasnya berwarna putih atau kadangkadang berwarna lain. Polong lonjong, pipih, berkulit keras bila tua, pada umumnya melengkung kadang-kadang dengan bentuk mengait pada bagian atasnya, berisi 4-5 biji. Bentuk, ukuran dan warna biji beragam, ada yang berbentuk mengginjal, membelah ketupat atau membundar. Warna seragam atau loreng, putih, hijau, kuning, coklat, merah, hitam atau ungu. sering terdapat garis melintang yang keluar dari hilum. Kacang merah akan berbunga pada panjang hari 9-18 jam dan untuk tipe berhari pendek memerlukan panjang hari terendah antara 11-12,3 jam untuk inisiasi bunga. Temperatur optimum antara 16 hingga 27 ° C. Curah hujan normal tahunan adalah 900-1500 mm tetapi dapat
toleran dengan sedikitnya 500-600 mm dalam satu musim penanaman. Kacang ini tumbuh di dataran rendah tropis dan area subtropis tetapi dapat tumbuh hingga ketinggian 2000-2500 m. Kacang merah menyukai lahan beraerasi dan berdrainase baik dengan pH 6,0-6,8. Beberapa kultivar tahan terhadap lahan asam dengan pH serendah-rendahnya . Berikut adalah klasifikasi dari kacang merah : Kingdom
: Plant
Divisio
: Spermatophyta
Sub divisio
: Angiospermae
Clas
: Dicotyledonae
Sub Clas
: Calyciflorae
Ordo
: Rosales (Leguminales)
Famili
: Leguminosae (Papilionaceae)
Sub famili
: Papilionoideae
Genus
: Phaseolus
Spesies
: Phaseolus vulgaris L.
2.1.1 Kandungan Kacang Merah (Phaseolus vulgaris L.)
Pada umumnya kacang merah sering dikonsumsi oleh masyrakat pedesaan, karena pada musim kemarau para petani lebih memilih menamam kacang merah daripada tanamamn yang lain karena lebih efisien. Selain itu penanamannya juga tidak terlalu sulit. Kacang merah memiliki kandungan gizi yang sangat baik, hal ini sangat menguntungkan bagi kesehatan tubuh manusia apalagi jika diolah secara baik dan benar. Kacang merah kering merupakan sumber protein nabati, karbohidrat kompleks, serat, vitamin B, folasin, tiamin, kalsium, fosfor, dan zat besi. Folasin adalah zat gizi esensial yang mampu mengurangi resiko kerusakan pada pembuluh darah. Kacang merah dapat ditanam pada berbagai jenis tanah dengan syarat struktur tanahnya gembur. Struktur tanah yang gembur dapat mempermudah akar tanaman menjalar mencari sumber hara yang terkandung dalam tanah. Tanah yang paling sesuai untuk penanaman kacang merah ini yaitu tanah gembur, subur, baik salirannya
dan pH 5,5 – 6,8. Kacang merah kaya akan asam folat, kalsium, karbohidrat kompleks, serat, dan protein yang tergolong tinggi. Kandungan karbohidrat kompleks dan serat yang tinggi dalam kacang merah membuatnya dapat menurunkan kadar kolesterol darah. Kadar indeks glikemik kacang merah juga termasuk rendah sehingga menguntungkan penderita diabetes dan menurunkan risiko timbulnya diabetes.Kandungan protein dan profil asam amino dalam 100 gr kacang merah (kidney bean) dari yang terbanyak adalah asam glutamat (1323 mg), asam aspartat (1049 mg), leucine (693 mg), lysine (595 mg), arginine (537 mg), serine (472 mg), phenylalanine (469 mg), valine (454 mg), isoleucine (383 mg), proline (368 mg), threonine (365 mg), alanine (364 mg), glycine (339 mg), dan lain-lain sisanya di bawah 300 mg. 5.2 Biologi Anggrek
Anggrek merupakan salh satu anggota Family Orchidaceae yang dapat dijumpai hampir diseluruh delahan dunia terutama daerah tropis mulai dataran rendah hingga dataran tinggi, bahkan sampai ke daerah perbatasan pegunungan bersalju. Bermacam-macam variasi bentuk, warna, bau dan ukuran dengan ciri-ciri yang unik menjadi daya tarik anggrek yang dikenal sebagai tanaman hias berbuga indah. Anggrek merupakan salah satu tanaman yang mempunyai kecepatan tumbuh lambat dan berbeda-beda. Hal ini sangat berpengaruh jika yang menjadi tujuan pemeliharaan adalah memproduksi bunga. Tanaman anggrek mempunyai pola pertumbuhan yang berbeda dengan tanaman hias lainnya. Pertumbuhan anggrek, baik vegetatif, serta pertumbuhan generatif tidak hanya ditentukan oleh faktor genetik, tetapi juga oleh f aktor iklim dan faktor pemeliharaan (Widiastoety, 2007). Pada dasarnya tanaman anggrek merupakan tanaman yang sulit untuk melakukan penyerbukan sendiri, sehingga perkembangbiakannya pun cukup sulit. Selain itu, biji yang kecil, tidak mengandung cadangan makanan dan kulityang sangat keras serta tebal membuat tanaman anggrek sulit ditumbuhkan tanpa bantuan manusia, kecuali anggrek yang tumbuh liar
di hutan. Untuk mengatasi hal tersebut dan menumbuhkan anggrek secara masal, maka tindakan yang bisa dilakukan adalah dengan mengawinkan tanaman anggrek (dapat sekaligus varietas persilangan yang baru). Perbanyakan
anggrek
pada
umumnya
dilakukan
dengan
cara
perkecambahan biji secara in vitro, sehingga hasil yang diperoleh tidak seragam dan menghasilkan warna bunga yang beragam (Rianawati dkk, 2009). Berdasarkan pola pertumbuhannya, tanaman anggrek dibedakan menjadi dua tipe yaitu, simpodial dan monopodial. Anggrek tipe simpodial adalah anggrek yang tidak memiliki batang utama, bunga keluar dari ujung batang dan berbunga kembali dari anak tanaman yang tumbuh. Kecuali pada anggrek jenis Dendrobium sp. Yang dapat mengeluarkan tangkai bunga baru di sisi-sisi batangnya. Contoh dari anggrek tipe simpodial antara lain: Dendrobium sp, Cattleya sp, dan Cymbidium sp. Anggrek tipe simpodial pada umumnya bersifar epifit. Anggrek tipe monopodial adalah anggrek yang dicirikan oleh titik tumbuh yang terdapat di ujung batang, pertumbuhannya lurus keatas pada satu batang. Bunga keluar dari sisi batang di antara dua ketiak daun. Contoh anggrek tipe monopodial antara lain: Vanda sp, Arachnis sp. Renanthera sp, Phalaenopsis sp dan Aranthera sp. Perbanyakan anggrek pada umumnya dilakukan dengan cara perkecambahan biji secara in vitro, sehingga hasil yang diperoleh tidak seragam dan menghasilkan warna bunga yang beragam (Rianawati, 2009).
5.3 Tahapan Kultur Jaringan
5.3.1
Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan
Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang pertama harus dilakukan adalah memilih tanaman induk yang hendak diperbanyak. Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies dan varietasnya, serta harus sehat dan bebas dari hama penyakit. Setelah ditentukan tanaman induk
yang merupakan sumber eksplan, kegiatan berikutnya adalah mempersiapkan dan mengkondisikan tanaman induk sedemikian rupa agar eksplan yang digunakan tumbuh baik pada waktu dikulturkan secara in vit ro. Pentingnya lingkungan tanaman induk yang lebih higienis untuk mendapatkan eksplan yang lebih berkualitas dan lebih bersih terbukti pada pembiakan in vitro berbagai tanamna tropis, seperti jati, pisang, anggrek, vanili, dan pepaya. Tanaman sumber eksplan sebaiknya dikondisikan di rumah kaca atau rumah plastik. Pemeliharaan yang diperlukan meliputi pemangkasan, pemupukan, dan penyemprotan dengan peptisida (fungisida, bakterisida dan insektisida), sehingga tunas baru yang tumbuh menjadi lebih bersih dan sehat dari kontaminan. Di samping mengusahakan lingkungan tanaman yang lebih bersih dan higienis, perubahan status fisiologi tanaman induk sumber eksplan kadangkadang perlu diperhatikan, seperti memanipulasi parameter cahaya, suhu, dan zat
pengatur
tumbuh.
Manipulasi
tersebut
bisa
dilakukan
dengan
mengkondisikan tanaman induk dengan fotoperiodisitas dan temperatur tertentu untuk mengatasi dormansi serta penambahan ZPT seperti sitokinin untuk merangsang tumbuhnya mata tunas baru dan untuk meningkatkan reaktivitas eksplan pada tahap inisiasi kultur. 5.3.2
Inisiasi Kultur
Tujuan utama tahap ini adalah mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Untuk mendapatkan kultur yang bersih dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Steril isasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminasi mikroorganisme yang menempel dipermukaan eksplan. Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, dan HgCl2. Masalah hang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencoklatan atau penghitaman bagian eksplan. Pada waktu jaringan terkena sters mekanik, seperti perlukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari
tanaman induk atau proses sterilisasi eksplan, metabolisme senyawa berfenol ini sering bersifat toksik, menghambat pertumbuhan, atau bahkan mematikan jaringan
eksplan.
Untuk
mengatasi
pencoklatan
di
bagian
eksplan,
pengondisian tanaman induk di lingkungan yang bersih (sehat) pada tahap ini sangat membantu, karena tidak diperlukan sterilisasi yang terlalu kuat. Untuk mengatasi atau mengurangi pencoklatan atau penghitaman jaringan, George dan Sherrington (1984) menyarankan beberapa tindakan yang dapat dilakukan, yaitu sebagai berikut: 1. Mengurangi dan menyerap senywa fenol yang dihasilkan dengan perlakuan arang aktiv atau PVP (Poly Vinyl Pyrrolidone) 2. Memodifikasi potensial redoks dengan merendam atau menambahkan antioksidan atau gen pereduksi ke dalam media. Zat yang bisa digunakan di antaranya campuran antara asam sitrat dan asam karbonat. 3. Menghambat aktivitas enzim fenolase dengan agen pengelat seperti EDTA, DIECA, 8-HQ dan phenylthiourea. 4. Mengurangi aktivitas fenolase dan ketersediaan substratnya dengan cara perlakuan pH rendah dan inkubasi pada ruang gelap. 5. Menggunakan media tanpa Cu2+ dan Fe3+ pada tahap awal pengulturan eksplan, karena kedua ion ini berperan awal dalam kondisi fenol. Jika pencoklatan sudah teratasi, eksplan dapat dipindahkan ke media normal yang dilengkapi dengan kedua ion tadi.
5.3.3
Multifikasi atau Perbanyakan Propagul
Pada prinsipnya, tahap ini bertujuan untuk menggandakan propagul atau bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas atau embrio, serta memeliharanya dalam keadaan tertentu sehingga sewaktu-waktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya. Pada tahap ini perbanyakan tunas dirangsang, umumnya dengan mendorong percabangan tunas lateral atau merangsang pembentukan tunas advektif. Kondisi ini memerlukan sitokinin seperti BA,2-iP, kinetin atau zhidiozuron. Cara pemakaiannya, eksplan yang hidup dan tidak terkontaminasi (aseptik) dari tahap inisiasi
kultur dipindahkan atau disubkulturkan ke media yang mengandung sitokinin. Propagul yang dihasilkan dalam jumlah propagul yang diharapkan. Setelah itu, tunas mikro yang dihasilkan dapat diakarkan dan diaklimatisasi. Subkultur dapat dilakukan beberapa kali sampai jumlah tunas yang dihasilkan sesuai dengan yang kita harapkan, tanpa mengorbankan kualitas tunas. Subkultur yang terlalu banyak dapat menurunkan mutu tunas, seperti terjadinya vitrifikasi (suatu segala ketidaknormalan fisiologis) dan aberasi (penyimpanan) genetik. Keadaan ini terjadi karena semakin banyak subkultur dilakukan berarti semakin sering dikondisikan dalam media yang mengandung
sitokinin,
sehingga
daya
regenerasinya
meningkat.
Akibatnya, kultur yang semula hanya menghasilkan tunas advektif dalam jumlah banyak. Dengan demikian, metode perbanyakan in vitro yang digunakan kadang-kadang sulit menetapkan percabangan tunas lateral atau bersamaan dengan pembentukan tunas advektif.
5.3.4
Pemanjangan Tunas, Induksi dan Perkembangan Akar
Tunas-tunas yang dihasilkan pada tahap multifikasi dipindahkan ke media lain untuk pemanjangan tunas. Media untuk pemanjangan tunas mengandung sitokinin sangat rendah atau tanpa sitokinin. Tunas tersebut dapat dipindahkan secara berkelompok lebih ekonomis daripada secara individu. Setelah tumbuh cukup panjang, tunas tersebut dapat diakarkan. Pemanjangan tunas dan perakaran dapat dilakukan sekaligus atau secara bertahap, yaitu setelah dipanjangkan, baru diakarkan. Pada spesies-spesies yang mudah berakar, seperti pisang, strawberi, vanili, dan spathyphyllum, pemanjangan tunas dalam media tanpa sitokinin juga dapat sekaligus merangsang pembentukan akar, sehingga tidak diperlukan pengakaran tunas secara tersendiri. Pengakaran tunas dapat dilakukan secara in vitro at au ex vitro (extra vitrum atau in vivo). Untuk skala komersial, pengakaran ex vitro mempunyai banyak kelebihan karena dapat menghemat tenaga dan biaya,
serta morfologi akar yang terbentuk juga lebih baik. Pengakaran yang umumnya memerlukan auksin seperti NAA atau IBA. Alternatif lain, induksi pengakaran dapat dilakukan secara in vitro, lalu perkembangan akarnya dilakukan secara ex vitro. Keberhasilan tahap ini tergantung pada tingginya mutu tunas yang dihasilkan pada tahap sebelumnya. Di samping itu, berapa perlakuan yang disebut hardening in vitro telah dilaporkan dapat meningkatkan tunas pada tahap ini, sehingga planlet atau tunas mikro tersebut dapat diaklimatisasi dengan potensi yang lebih tinggi. Beberapa perlakuan yang biasa dilakukan sebagai berikut : 1. Mengondisikan
kultur
di
tempat
yang
pencahayaannya
berintensitas lebih tinggi (misal 10.000 lux) dan suhunya lebih tinggi. 2. Pemanjangan dan pengakaran tunas mikro dilakukan dalam media kultur dengan hara mineral dan sukrosa lebih rendah dan konsentrasi agar-agar yang lebih tinggi.
2.4 Subkultur
Subkultur merupakan salah satu tahap dalam perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan. Pada dasarnya subkultur kita me motong, membelah dan menanam kembali eksplan yang telah tumbuh sehingga jumlah tanaman akan bertambah banyak. Subkultur adalah tahap kegiatan yang relatif mudah dibandingkan dengan kegiatan lain dalam kultur j aringan. Kegiatan subkultur dilakukan sesuai dengan jenis tanaman yang dikulturkan. Setiap tanaman memiliki karakteristik dan kecepatan tumbuh yang berbeda-beda. Sehingga cara dan waktu subkultur juga berbeda-beda. Tanaman yang harus segera atau relatif cepat disubkultur adalah jenis pisang, alokasia dan caladium. Tanaman yang relatif lama adalah aglaonema (Pelatihan, 2009).
Untuk tanaman yang diperbanyak dengan multifikasi tunas, maka subkultur dapat dilakukan dengan memisahkan anakan tanaman dari koloninya atau melakukan penjarangan. Contoh tanamannya adalah anggrek, pisang dan tanaman lain yang satu tipe pertumbuhan. Untuk tanaman tipe pertumbuhannya dengan pemanjangan batang maka subkultur dapat dilakukan dengan memotong tanaman per ruas tanaman yang ada. Namun, jika ada planlet yang masih terlalu kecil atau beresiko tinggi untuk dipotong, maka subkulturnya cukup dilakukan dengan memisahkan dari induknya dan ditanam kembali secara terpisah.
BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilakukan pada hari jumat tanggal 19 Mei 2017 di Laboratorium Biologi Universitas Pakuan Bogor. Pengamatan dilakukan seminggu sekali dengan mencatat perubahan yang terjadi 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1
Alat
PH meter, magnetic stirrer, berbagai ukuran pipet, berbagai ukuran Erlenmeyer, berbagai ukuran labu ukur, dan alat-alat gelas, oven, autoklaf,wadah kultur/botol kultur, dissecting kitt, labu ukur, botol kultur, alumunium foil,spidol, autoklaf, oven, gelas piala, dan hot plate. 3.2.2
Bahan
Larutan makro, larutan mikro, vitamin, inositol, larutan zat pengatur tumbuh auksin (IAA 2,4-D, IBA, NAA) kacang jogo ( Phaseolus vulgaris). 3.3 Metode Kerja 3.3.1 Sterilisasi Wadah Kultur dan Alat-Alat Diseksi
1. Wadah kultur berupa botol kultur, Erlenmeyer, Cawan petri ataupun tabung reaksi dicuci bersih menggunakan deterjen. 2. Wadah kultur tersebut kemudian dimasukan kedalam oven dalam posisi terbalik dan sterilkan pada suhu 150°C 3. Wadah disimpan di dalam oven dan baru dikeluarkan jika akan digunakan. 4. Alat berupa pisau, scapel, pinset, gunting dan alat diseksi lainnya dicuci menggunakan deterjen cair dan dikeringkan 5. Alat yang telah bersih tersebut dibungkus satu persatu menggunakan kertas atau koran 6. Dimasukan kedalam autoclave dan sterilkan pada s uhu 150° tekanan 15 psi selama 25 menit
7. Alat siap digunakan, dan dikeluarkan jika akan digunakan.
3.3.2 Pembuatan Medium teknik inokulasi
1. Disiapkan erlenmayer ukuran 1000 ml atau ukuran lain disesuaikan dengan kebutuhan. Isi akudes kurang lebih 1/3 dari volume medium yang akan dibuat. 2. Kemudian dimasukan larutan induk hara makro sebanyak 100 ml , induk mikro sebanyak 20 ml, vitamin dan inositol sesuai dengan volume medium yang dibuat, setiap memasukan larutan induk isi Erlenmeyer terus diaduk menggunakan magnetic stirrer 3. Untuk pembuatan media MS BAP ditambahkan zat pengatur tubuh 4. Dipindahkan larutan ke labu takar sesuai ukuran dan ditambahkan aquades sampai tanda tera dan atur pH antara 5,6 – 5,8. Jika terlalu asam dapat ditambahkan larutan basa (NaOH 0,1 N) dan jika terlalu basa dapat ditambahkan larutan asam (HCL 0,1 N). 5. Ditambahkan aquadest sampe tanda tera 6. Dituangkan kedalam Erlenmeyer lalu ditambahkan agar-agar yang telah ditimbang sesuai kebutuhan dan panaskan media sampai agar-agar larut 7. Masukan medium kedalam wadah kultur seperlima volume botol kultur yang digunakan 8. Wadah kultur yang telah berisi media dan siap disterilisasikan di masukan kedalam autoklaf pada suhu 120°C dengan tekanan 15psi selama 15 menit 9. Setelah media memadat dapat disimpan didalam laminar air flow jika akan digunakan.
3.3.3 Sterilisasi Bahan Tanaman
1. Dicuci embrio kacang merah kedalam deterjen cair selama 30 menit 2. Kemudian dicuci menggunakan air mengalir selama 1 jam 3. Direndam kedalam larutan fungisida selama 1 jam 4. Dicuci air mengalir 15 menit
5. Direndam alcohol 70% selama 5 menit kemudian bilas dengan air mengalir sampai bau hilang 6. Dilakukan sterilisasi dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan merendam biji didalam larutan 10% Clorox selama 15 menit bilas menggunakan akuadest steril 7. Direndam kembali kedalam larutan Clorox 5 % selama 15 menit dan dibilas menggunakan aquadest steril 8. Direndam kedalam alcohol 70% selama 10 menit 3.3.4
Metode kerja teknik inokulasi.
1. Disiapkan alat dan bahan untuk melakukan kultur embrio kemudian seluruh alat di buat aseptis yakni dengan cara dilakukan sterilisasi dengan menggunakan oven dan autoklaf. 2. Dilakukan pembuatan larutan induk untuk medium yakni dengan membuat larutan stok untuk media MS nol dan MAS BAP 3. Dilakukan sterilisasi bahan yang terdiri dari sterilisasi dalam dan luar 4. Setelah semua alat dan bahan siap dan dalam keadaan aseptis dapat dilakukan proses inokulasi. 5. Disiapkan bahan tanaman (embrio kacang merah) yang telah steril, kemudian alat-alat disksi, beberapa cawan petri, alcohol 90% (untuk sterilisasi) dimasukan kedalam Laminar Air Flaw Cabinet. Sebelumnya matikan lampu germicidal dan nyalakan blower dan lampu penerangannya. 6. Tangan sebelum masuk kedalam Laminar Air Flow disemprot terlebih dahulu menggunakan alcohol 70% 7. Kupas kacang merah dan pisahkan kotiledon dengan embrionya di dalam laminar menggunakan pinset yang sebelumnya dibakat terlebih dulu. 8. Diambil botol kultur yang telah disiapkan, buka didepan nyala api dan masukan kotiledon kacang merah ke dalam botol kultur yang berisi media MS nol dengan menggunakan pinset steril. 9. Botol kultur ditutup menggunakan alumuniumfoil hingga rapat dan ditambah karet untuk menguatkan penutupan botol kultur agar tidak terkontaminasi.
10. Simpan botol kultur diartas rak kultur kemudian diberi pencahayaan sebesar….
11. Kemudian diamati perkembangan embrio selama beberapa minggu. 12. Dicatat perubahan yang terjadi kemudian dianalisi menggunakan table annnova.
3.4 Metode Sub Kultur Anggrek 3.4.1
Persiapan
1) Menyalakan LAFC beserta blower,. 2) Membersihkan seluruh dinding dalam LAFC dengan alkohol 70%. 3) Membersihkan alat-alat penanaman dengan mencuci dengan deterjen dan disemprot dengan alkohol 70%. 4) Memasukkan alat dan bahan untuk penanaman. 5) Menutup LAFC kemudian mematikan lampu TL dan blower. 6) Menyalakan lampu UV selama 45 menit. 7) Mematikan lampu UV dan menyalakan lampu TL dan Blower selama 15 menit. 8) Melakukan penanaman eksplan.
3.4.2
Penanaman Eksplan Anggrek
1) Membersihkan telapak tangan dengan alkohol 70%. 2) Menyalakan lampu spirtus kemudian memanaskan pinset. 3) Mengambil planlet anggrek dengan pinset, kemudian meletakkan planlet di petridish kemudian memanaskan skapel. 4) Memotong bagian planlet untuk mencari bagian yang terbaik untuk ditanam (eksplan).
5) Mengambil eksplan kemudian menanamnya di medium dengan cara sedikit membenamkan bagian pangkalnya. 6) Meletakkan hasil penanaman di rak kultur. 7) Membersihkan semua alat dan bahan dalam LAFC.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Pengamatan
Tabel 1. Data Pengamatan Kultur Embrio Kacang.
Perlakuan MS BAP NO
Nama Minggu Ke 1
Minggu Ke 2
Minggu Ke 3
Mulai Tumbuh 1.
Ayu Sri
daun kecil, Akar
Rahmawati
browning.
Kontaminasi
Kontamiasi
Akar browning,
Akar browning,
Akar Tumbuh
batang hijau
batang hijau
browning,
Zulfa
pucat, mulai
pucat, tumbuh
Tumbuh daun
Wulandari
tumbuh daun.
daun.
kecil satu.
Panjang 2 cm.
Panjang 2,75
Panjang 2,9 cm
Panjang 3 cm.
2.
cm. Tumbuh akar,
3.
4.
Erynia Dwi H
Nisa Silvanti
Tumbuh daun
batang warna
Panjang
kecil, akar besar
hijau, mulai
menjadi 3,25
berwarna krem,
tumbuh daun.
cm.
batang hijau.
Panjang 3 cm.
Panjang 3,5 cm.
Tumbuh daun 2,
4 Daun tumbuh
Batang hijau,
Panjang
daun hijau.
menjadi 3,5 cm. berwarna hijau, akar tumbuh,.
Panjang 2,75 cm.
besar, batang
Panjang 3,85 cm. Mulai tumbuh
5.
Dini Audina
Tumbuh daun
daun, batang
Panjang
empat, satu
berwarna hijau
menjadi 2,75
planlet
pucat.
cm.
browning.
Panjang 2 cm.
Panjang 3 cm. Tumbuh daun
Akar browning, 6.
Riska Fauzia
kecil 4, tumbuh
mulai tumbuh
Panjang
akar, daun hijau
daun.
menjadi 2,25
muda, batang
cm.
hijau.
Panjang 1,5 cm.
Panjang 3 cm. Browning semua Browning semua. 7.
Sara Azzahra Panjang 1,5 cm.
Panjang
bagian, tidak ada
menjadi 1,75
perkembangan
cm.
akar dan daun. Panjang 1,75 cm.
Tabel 2. Tabel Pertambahan Panjang Planlet Embrio Kacang Perlakuan I
II
III
I
3
0
0
II
2
2,75
2,9
III
3
3,25
3,5
IV
2,75
3,5
3,85
V
2
2,75
3
VI
1,5
2,25
3
VII
1,5
1,75
1,75
∑
15,75
16,25
18
Rata - rata
2,25
2,7
3
Ulangan
Tabel 3. Uji Annova Sumber Perlakuan
Db
JK
KT
F hitung
F table (0,05)
Perlakuan
2
0,399
0,1995
0,1828
3,55
Galat
18
19,5365
1,085
Jumlah
20
19,9355
Tabel 4. Data Pengaman Sub Kultur Anggrek.
4.2 Pembahasan 4.2.1 Kultur Embrio Kacang Merah
Kultur embrio merupakan kultur yang menggunakan embrio yang diperoleh dari benih suatu tanaman yang diambil embrionya atau isolasi secara steril embrio matang ataupun belum matang, dengan tujuan memperoleh tanaman yang viable. Dalam laporan praktikum ini akan di bahas mengenai kultur embrio dan cara pelaksanaan dalam pembuatan kultur embrio yang telah dilaksanakan di Laboratorium Biologi Universitas Pakuan dengan pengamatan selama 3 minggu. Hal pertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan dalam keadaan aseptic yaitu telah dilakukan sterilisasi sebelumnya. Oven digunakan untuk
sterilisasi alat taman dan alat-alat yang terbuat dari kaca dengan prosedur seluruh alat yang dimasuka kedalam oven dibungkus menggunakan koran agar tidak bergesekan satu dengan yang lain, sedangkan autoklaf digunakan untuk sterilisasi basah atau untuk bahan-bahan yang akan digunakan. Untuk sterilisasi bahan dibagi menjadi 2 tahapan yakni sterilisasi luar dan sterilisasi dalam. Pada sterilisasi luar digunakan beberapa bahan dalam proses sterilisi yani menggunakan deterjen dan alcohol 70% untuk mengurangi jumlah mikroba yang terdapat pada embrio dan larutan fungisida agar tidak terkontaminasi jamur, kemudian sterilisasi dalam menggunakan Clorox dan aquadest steril yang memiliki fungsi sebagai desinfektan. Kemudian dibuat media tanam yang terdiri dari media MS nol dan MS BAP. Selanjutnya dilakukan teknik inokulasi yang dikerjakan di dalam Laminar Air Flaw Cabinet. Untuk menggunakan LAFC dapat dilakukan dengan menekan tombol UV selama minimal 2 jam untuk mensterilkan alat tersebut dari mikroba. Jika akan digunakan UV dimatikan dan ditekan tombol blower dan lampu. Sebelum melakukan inokulan embrio dipastikan bahwa alat laminar terlah steril dan tangan praktikan di semprot menggunakan alkohl 70% untuk meminimalisir kontaminan. Embrio yang telah steril dipisahkan dengan kotiledonnya di dalam Laminar menggunakan pinset dan scapel, kemudian disiapkan botol kultur yang berisi media MS nol yang telah steril sebagai tempat tumbuh embrio tersebut. Setelah dilakukan penanaman embrio kedalam media, botol kultur tersebut harus benar-benar rapat dan tertutup dengan alumuniumfoil diikat menggunakan karet dan disimpan di rak kultur dengan pencahayaan sebesar 951 lux, kemudian diamati selama 3 minggu. Hasil pengamatan selama 3 minggu didapatkan bahwa setelah 3 hari penanaman semua kultur embrio yang menggunakan media MS nol terkontaminasi mikroorganisme baik bakeri maupun jamur. Hal ini dapat terjadi diduga karena media yang digunakan tidak steril. Tidak sterilnya media ini dapat terjadi dimungkinkan pada saat pembuatan media yang tidak sesuai prosedur maupun penggunaan alat yang kurang steril. Sedangkan untuk kultur embrio yang menggunakan media MS BAP ada 8 botol kultur yang mengalami kontaminan, hal ini diduga karena kurang sterilnya praktikan saat melakukan inokulasi embrio
kedam media ataupun tangan dari praktikan yang kurang s teril. Ada 7 botol kultur yang tidak mengalami kontaminan dan sebagian berhasil tumbuh daun. Pada minggu pertama pertumbuhan embrio kacang mendapatkan rata – rata 2,25. Pada minggu kedua pertumbuhan embrio kacang pada setiap kelompok bertambah dan kelompok satu mengalami kontaminasi, minggu ke dua mendapatkan rata-rata 2,7. Pada pengamatan terakhir atau mingguke 3 hampir semua tanaman mengalami browning. Pencoklatan adalah suatu keadaan munculnya warna coklat atau hitam yang menyebabkan tidak terjadi pertumbuhan dan perkembangan atau bahkan menyebabkan kematian pada eksplan. Pencoklatan umumnya merupakan tanda adanya kemunduran fisiologis eksplan biasanya eksplan akan mati. Menurut Cordut dan Aki dalam Sri browning terjadi akibat pengaruh akumulasi senyawa fenolik yang teroksidasi akibat stress mekanik atau pelukaan pada eksplan. Senyawa fenol tersebut adalah enzim polifenol eksidase dan tirosinase. Dalam kondisi oksidatif akibat pelukaan, enzim tersebut akan secara alami disintesis oleh tanaman sebagai bentuk pertahanan diri. Menurut Hutami (2008) dalam Sepdian (2014), ketika sel rusak, isi dari sitoplasma dan vakuola menjadi tercampur, kemudian senyawa fenol teroksidasi menghambat aktivitas enzim. Senyawa fenol yang berlebihan akan bersifat racun yang merusak jaringan eksplan dan akhirnya menyebabkan kematian eksplan. Dalam tiga minggu hasil pengamatan semua eksplan yang menggunakan media MS nol mengalamikontaminan dan untuk eksplan dengan menggunakan media MS BAP pada minggu bertama berhasil tumbuh hingga beberapa eksplan ada yang tumbuh daun tetapi ketika masuk minggu kedua ada satu eksplan yang mengalami kontaminan dan tejadi browning yang berdampak pada terhambatnya pertumbuhan eksplan. Diminggu ketiga semua eksplan mengalami browning atau pencoklatan sehingga eksplan tidak dapat berkembang dengan baik dan akhirnya mati. Hasil dari uji annova menunjukkan bahwa F hitung sebesar brapa lebih kecil di banding F table hal ini menunjukkan bahwa hasil yang didapatkan tidak signifikan atau tidak ada perbedaan secara nyata antar perlakuan.
4.3 Sub Kultur Anggrek
4.3.1 Hasil Pengamatan
Tinggi Tanaman
Kelompok
Tan 1
Jumlah Daun
Minggu I
Minggu II
Tan 2
Tan 1
Minggu I Tan 2
Tan 1
Keterangan Minggu II
Tan 2
Tan 1
Tan 2
1
0,4
0,3
0,45
Kontan
2
2
2
-
2
0,5
0,4
0,5
0,5
2
2
2
2
3
0.6
0,5
0,6
0,5
1
2
2
2
4
0,6
0,5
0,6
0,5
2
2
2
2
5
0,5
0,4
0,5
0,4
2
2
2
2
6
0,65
0,6
0,7
0,6
2
2
2
2
Minggu ke-2 1 tan.kontaminasi 2 Tan.sedikit browning 2 Tan sedikit browning 2 Tan.sedikit browning 2 Tan.sedikit browning 1 Tan.sangat browning Minggu 1 kontaminasi
7
0,65
0,6
0,7
0,6
2
2
2
2
8
0,3
0,3
Kontan
Kontan
2
2
-
-
9
0,5
0,5
0,5
0,6
2
2
2
2
10
0,6
0,5
0,6
0,5
2
2
2
2
11
0,2
0,3
0,3
0,3
2
2
2
2
1 Tan.browning 2 Tan sangat browning 2 Tan sedikit browning
12
Kontan
-
-
-
-
-
-
-
-
13
Kontan
-
-
-
-
-
-
--
-
X
0,42
0,37
0,41
0,34
1,61
2
1,53
1,38
4.3.2 Pembahasan Subkultur merupakan cara yang sederhana dengan metode kultur untuk memperbanyak suatu tanaman. Dalam praktikum ini, subkultur dilakukan pada tanaman anggrek yang sudah tersedia di lab kultur (planlet) untuk diperbanyak dalam medium baru. Sebelum melakukan subkultur, hal yang dilakukan yakni
meuvi alat dan bahan penanaman di dalam LAFC selama 45 menit. Tujuannya untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Dalam penanaman, hanya bagian kecil dari planlet saja yang diambil. Bagian yang diambil dan digunakan untuk ditanam dalam media kultur disebut dengan eksplan. Hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan eksplan yakni eksplan haruslah dalam keadaan bagus dan sehat, jadi yag dipilih dari planlet yakni masih terlihat sehat tanpa cacat. Karena jika cacat, kemungkinan eksplan tidak akan tumbuh atau kalaupun tumbuh akan menjadi tanaman yang kualitasnya jelek. Planlet anggrek yang akan ditanam diseleksi untuk diambil bagian yang bagus, setelah itu di tanamn di media MS dengan cara membenamkan sedikit pada bagian dangkal eksplan hingga eksplan berdiri tegak. Kondisi steril sangat berpengaruh untuk kelangsungan hidup eksplan, sehingga selama pengerjaannya diupayakan untuk menjaga kesterilan kondisi penanaman. Keberhasilan penanaman atau perbanyakan dilihat dari kesterilan media dan eksplan serta tumbuhnya akar pada eksplan setelah beberapa hari penanaman. Jika tidak tumbuh akar, eksplan tidak akan tumbuh menjadi planlet. Dari hasil penanaman subkultur Anggrek Dendrobium discolor , terdapat 4 kelompok yang terkontaminasi yaitu kelompok 1, 8, 12 dan 13. Pada kelompok 1 di minggu kedua pada tanaman dua terkontaminasi dan tanaman 1 masih tampak berwarna hijau segar. Pada kelompok 8 di minggu kedua semua tanaman 1 dan tanaman 2 terkontaminasi. Sedangkan pada kelompok 12 dan kelompok 13 di minggu pertama setelah penanaman sudah mengalami kontaminasi. Sedangkan pada tanaman yang lainnya terjadi browning dan ada juga yang tumbuh segar berwarna hijau. Kontaminasi pada bahan tanaman yang dikulturkan dapat terjadi karena adanya infeksi secara eksternal maupun internal. Usaha pencegahan kontaminasi eksternal dapat dilakukan dengan sterilisasi permukaan bahan tanaman. Infeksi internal tidak dapat dihilangkan dengan sterilisasi permukaan. Selain itu faktor sterilisasi juga sangat menentukan terhadap kontaminasi. Rungan yang sudah steril dapat saja berubah menjadi tidak steril pada saat musim hujan, sehingga dapat membawa masuknya bakteri dan jamur dari luar, serta dapat meningkatkan
kelembaban
yang
akan
mempercepat
perkembangan
mikroorganisme. Pengambilan meristem sebagai eksplan harus dilakukan dalam ruang steril (aseptik) agar tidak terkontaminasi (Sunarjono, 2002). Selain itu, kontaminasi terjadi juga disebabkan karena LAFC yang kurang bersih, media tumbuh yang digunakan dan rak kultur yang tidak steril sehingga pertumbuhan bakteri dan jamur sangat rentan. Kontaminasi disebabkan oleh jamur, bakteri dan cendawan. Kontaminasi oleh jamur terlihat jelas pada media dan eksplan diselimuti oleh spora berbentuk kapas berwarna putih, sedangkan kontaminasi oleh bakteri, pada eksplan terlihat lendir berwarna kuning sebagian lagi melekat pada media membentuk gumpalan yang basah. Jamuryang mengkontaminasi media dan eksplan adalah jamur yang bisa ada di laboratorium seperti Aspergillus sp, Monilla sp dan Penicillum sp (Setiyoko, 1995). Bakteri menurut Setiyoko (1995), yang mungkin berasal dari laboratorium adalah bakteri gram positif.
DAFTAR PUSTAKA Budi, Burhan Setia. 2013. Bioteknologi Kultur Embrio. Program Studi Agroekoteknologi Universitas Brawijaya: Malang Luri, sepdian. 2014. Permasalahan-permasalahan dalam kultur In Vitro.
Huntami, Sri. -. Jurnal AgroBiogen 4(2):83-88 “Masalah Pencoklatan pada Kultur Jaringan”. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Mahariyanto, 2012. Laporan Praktikum Kultur Jaringan. Muhayat, 2012. Laporan Subkultur (Anggrek dan Krisan). Wuryan, 2008. Dasar-dasar Kultur Jaringan. Cianjur: Pengembangan dan Penataran Guru Pertanian. Gunawan, L. Winata.1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Dept. Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB.
