LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “PEMBUATAN MEDIA KULTUR”
Nama NIM Kelompok Asisten
Disusun Oleh: : ………………….. : ………………….. : Rabu, 11.00 WIB : Rifad
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN MALANG 2012
1
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme dapat berkembangbiak dengan alami atau dengan bantuan manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan manusia diantaranya melalui substrat yang disebut media. Untuk membuat media ini haruslah dimengerti mengenai jenis-jenis nutrient yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. Alat-alat yang digunakan pun haruslah steril. Agar, tidak ada mikroorganisme yang tidak diinginkan dapat tumbuh, yang mungkin dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.
1.2 Tujuan 1. Mahasiswa dapat mengetahui jenis-jenis media dalam kultur jaringan 2. Mahasiswa dapat mengetahui teknik-teknik aseptik dalam pembuatan media 3. Mahasiswa dapat mengetahui komposisi dan fungsi-fungsi unsur-unsur dalam media MS 4. Mahasiswa dapat mengetahui rumus larutan stok 1.3 Manfaat Dalam praktikum ini dapat diperoleh manfaat diantaranya: mahasiswa mengetahui secara langsung bahkan praktek secara langsung cara membuat media kultur. Selain itu dari pengamatan mahasiswa bisa mengetahui media yang kontaminasi dan dapat mengaplikasikan serta bisa berhati-hati dalam membuat media untuk ke depannya supaya tidak terjadi kontaminasi.
2
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jenis-jenis Media pada Kultur Jaringan Serta Aplikasi Kegunaannya Kita mengenal beberapa macam media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain adalah: 1. Medium Dasar Murashige dan Skoog (MS): Digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceus. Media ini mempunyai konsentrasi garam- garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO 3 dan + NH4 . (Hendaryono,1994) 2. Medium dasar B5 atau Gamborg: Digunakan untuk kultur alfafa dan legum lain. suspensi sel kedelei, (Hendaryono,1994) 3. Medium dasar White: Digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah. (Hendaryono,1994) 4. Medium Vcin Went (VW): digunakan khusus untuk medium anggrek. (Hendaryono,1994) 5. Medium dasar Nitsch dan Nitsch: Digunakan untuk kultur tepungsari ( pollen)dan kultur sel. (Hendaryono,1994) 6. Medium dasar Woody Plant Medium (WPM): Digunakan untuk tanaman yang berkayu. (Hendaryono,1994) 7. Medium dasar Schenk dan Hildebrandt: Digunakan untuk kultur jaringan tanaman monokotil. (Hendaryono,1994) 8. Medium dasar N6: Digunakan untuk tanaman serealia terutama padi. (Hendaryono,1994)
3
2.2 Komposisi dan Fungsi Unsur dalam Media MS (Murashige & Skogg) Media dalam kultur jaringan tanaman umumnya terdiri dari komponen-komponen sebagai berikut: 1. Hara makro Terdiri dari enam unsur utama yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel dan jaringan tanaman, yaitu: nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg) dan sulfur (S). Media kultur harus mengandung sedikitnya 2560 mM nitrogen anorganik untuk pertumbuhan sel tanaman. Sel-sel tanaman mungkin dapat tumbuh pada sumber N dari nitrat saja, tetapi diketahui bahwa pertumbuhan yang lebih baik adalah apabila mengandung nitrat dan amonium. Nitrat yang disediakan umumnya berkisar 25-40 mM, konsentrasi amonium berkisar antara 2-20 mM. Akan tetapi untuk beberapa spesies tanaman konsentrasi amonium > 8 mM akan menghambat pertumbuhan sel. Sel-sel dapat tumbuh dalam media kultur yang hanya mengandung amonium sebagai sumber nitrogen jika satu atau lebih terdapat asamasam yang terlibat dalam siklus TCA (seperti sitrat, suksinat, atau malat) juga terdapat dalam media pada konsentrasi sekitar 10 mM. Apabila nitrat dan amonium sebagai sumber nitrogen digunakan bersama dalam media maka ion-ion amonium akan digunakan lebih cepat dibandingkan dengan ion-ion nitrat. Kalium dibutuhkan untuk pertumbuhan sel bagi sebagian besar spesies tanaman. Umumnya media mengandung kalium (dalam bentuk nitrat atau klorida) pada konsentrasi 20-30 mM. Konsentrasi optimum untuk unsur P, Mg, S dan Ca berkisar antara 1-3 mM. Konsentasi yang lebih tinggi dari hara-hara tersebut mungkin diperlukan jika terjadi defisiensi dari hara yang lain. (Gunawan,1988) 4
2. Hara mikro Unsur hara mikro yang paling dibutuhkan untuk petumbuhan sel dan jaringan tanaman mencakup besi (Fe), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B), terusi (Cu) dan molibdenum (Mo). Besi dan seng yang digunakan dalam pembuatan media harus dalam bentuk yang ter ”chelate”. Besi adalah yang paling kritis diantara semua hara mikro. Besi sitrat dan tartrat dapat digunakan untuk media kultur, tetapi senyawa ini sulit untuk larutdan biasanya akan terpresipitasi setelah media dibuat. Masalah ini dipecahkan oleh Murashige & Skoog dengan men ”chelate” besi dengan menggunakan asam etilen diamintetraasetik (EDTA). Kobal (Co) dan iodin (I) juga dapat ditambahkan dalam media tetapi kebutuhan yang jelas untuk pertumbuhan sel belum diketahui. Natrium (Na) dan klorida (Cl) juga digunakan pada beberapa media tetapi tidak begitu penting untuk pertumbuhan sel. Konsentrasi Cu dan Co yang biasanya ditambahkan pada media sekitar 0.1 µM, Fe dan Mo 1 µM, I 5µM, Zn 5-30 µM, Mn 20-90 µM, dan B 25100µM.(Gunawan,1988) 3. Vitamin Pada beberapa media kultur juga sering ditambahkan vitamin-vitamin seperti biotin, asam folat, asam askorbat, asam panthotenat, vitamin E (tokoperol), riboflavin, dan asam p-aminobenzoik. Meskipun vitamin-vitamin tersebut bukan merupakan faktor pembatas pertumbuhan, tetapi sering memberikan keberhasilan dalam kultur sel dan jaringan tanaman. Biasanya penambahan vitamin-vitamin tersebut ke dalam media dilakukan apabila konsentrasi thiamin dianggap dibawah taraf yang diinginkan atau
5
apabila jumlah populasi sel-sel yang tumbuh masih rendah. (Gunawan,1988) 4. Asam amino atau suplemen nitrogen lainnya Sumber nitrogen organik yang paling banyak digunakan dalam media kultur adalah asam amino campuran (casein hidrolisat), L-glutamin, L-asparagin, dan adenin. Casein hidrolisat umumnya digunakan pada konsentrasi antara 0.05-0.1%. Asam amino biasanya ditambahkan pada media terdiri dari beberapa macam, karena sering diperoleh bahwa penambahan satu jenis asam amino saja justru dapat menghambat pertumbuhan sel. (Gunawan,1988) 5. Karbon dan sumber energi Sumber karbohidrat yang biasanya digunakan dalam media kultur adalah sukrosa. Glukosa dan fruktosa dalam beberapa hal dapat digunakan sebagai pengganti sukrosa, dimana glukosa mempunyai efektivitas yang sama dengan sukrosa dibanding dengan fruktosa. Karbohidrat lain yang pernah dicobakan adalah laktosa, galaktosa, rafinosa, maltosa dan pati, tetapi semua karbohidrat tersebut umumnya mempunyai hasil yang kurang baik dibandingkan sukrosa atau fruktosa. Konsentrasi sukrosa normal dalam media kultur berkisar antara 2 dan 3%. Karbohidrat harus tersedia dalam media kultur karena sangat sedikit sel dari jenis tanaman yang diisolasi dapat bersifat autotropik, yaitu kemampuan menyediakan kebutuhan karbohidrat sendiri melalui asimilasi CO2 selama proses fotosintesa. Sukrosa dalam media kultur secara cepat akan diurai menjadi fruktosa dan glukosa. Glukosa adalah yang pertama digunakan oleh sel, diikuti oleh fruktosa. Saat media disterilisasi dengan autoclave, sebagian sukrosa akan mengalami hidrolisa. Apabila sukrosa yang diautoklap ada 6
bersama komponen media lain maka proses hidrolisa akan lebih besar. Kultur dari beberapa spesies tanaman akan tumbuh baik pada media yang sukrosanya diautoklap dibandingkan dengan media yang sukrosanya disterilisasi dengan filter. Hal ini dimungkinkan akan menguntungkan sel-sel karena tersedianya glukosa dan fruktosa. (Gunawan,1988) 6. Bahan organik komplek Pengaruh arang aktif umumnya diarahkan pada salah satu dari tiga hal berikut: penyerapan senyawa-senyawa penghambat, penyerapan zat pengatur tumbuh atau menggelapkan warna media. Penghambatan pumbuhan karena kehadiran arang aktif umumnya karena arang aktif dapat menyerap ZPT. NAA, kinetin, BAP, IAA dan 2iP semuanya dapat terikat oleh artang aktif. IAA dan 2iP merupakan ZPT yang paling cepat terikat oleh arang aktif. Arang aktif dapat menstimulasi pertumbuhan sel umumnya karena kemampuan arang aktif mengikat senyawa fenol yang bersifat toksik yang diproduksi biakan selama dalam kultur. Konswentrasi aArang aktif yang ditambahkan kedalam media kultur umumnya sebanyak 0.5-3%. (Gunawan,1988) 7. Bahan pemadat (agar), dan Media kultur jaringan tanaman dapat dibuat padat atau semi padat, yaitu dengan penambahan bahan pemadat berupa agar. Dibandingkan bahan pemadat lain, agar mempunyai beberapa keuntungan, yaitu (i) saat dicampur dengan air, agar akan terbentuk bila dilelehkan pada suhu o o o 60 -100 C dan memadat pada suhu 45 C; (ii) gel agar bersifat stabil pada suhu inkubasi; (iii) agar gel tidak 7
bereaksi dengan komponen dalam media dan tidak dicerna oleh ensim tanaman. Kualitas fisik agar dalam media kultur tergantung pada konsentrasi dan merek agar yang diguinakan serta pH media. Konsentrasi agar yang digunakan dalam media kultur berkisar antara 0.5-1%, dengan catatan pH media sesuai dengan aturan. Penggunaan arang aktif (0.8-1%) dapat mempengaruhi kepadatan agar yang terbentuk.Kemurnian agar yang digunakan dalam media kultur juga merupakan faktor yang penting. Agar yang mengandung garam-garam Ca, Mg, K dan Na dapat mempengaruhi ketersediaan hara dalam media. (Gunawan,1988) 8. Zat pengatur tumbuh (hormon). Terdapat empat klas zat pengatur tumbuh (ZPT) yang penting dalam kultur jaringan tanaman, yaitu: auksin, sitokinin, giberelin dan asam absisik. Skoog dan Miller adalah yang pertama melaporkan bahwa perbandingan auksin dan sitokinin menentukan jenis dan berapa besar proses organogenesis dalam kultur jaringan tanaman. Auksin dan sitokinin yang ditambahkan kedalam media kultur mempunyai tujuan untuk mendapatkan morfogenesis, meskipun perbandingannya untuk mendapatkan induksi akar dan tunas bervariasi baik ditingkat genus, spesies bahkan kultivar. Sitokinin yang ditrambahkan dalam media kultur umumnya ditujukan untuk menstimulasi pembelahan sel, menginduksi pembentukan tunas dan proliferasi tunas aksiler, dan untuk menghambat pembentukan akar. Mekanisme kerja sitokinin tidak secara pasti diketahui, namun demikian beberapa senyawa yang mempunyai aktivitas mirip sitokinin diketahui terlibat dalam transfer8
RNA (t-RNA). Sitokinin juga menunjukkan dapat mengaktivasi sintesa RNA dan menstimulasi aktivitas protein dan enzim pada jaringan tertentu. (Gunawan,1988)
2.3 Teknik-teknik Aseptik dalam Pembuatan Media Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. 1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik. (Machmud, 2008) 2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. (Machmud, 2008) A. Pemanasan
Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 600 180 C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf B. Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang
9
menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV (Machmud, 2008). 3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. (Machmud, 2008) 4. Sterilisasi dengan panas adalah unit operasi dimana bahan dipanaskan dengan suhu yang cukup tinggi dan waktu yang cukup lama untuk merusak mikrobia dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan yang disterilkan akan memiliki daya simpan lebih dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng seperti kornet, sarden dan sebagainya. Perkembangan teknologi prosesing yang memiliki tujuan mengurangi kerusakan nutrien dan konponen sensoris dan juga mengurangi waktu prosesing menjadikan teknik serilisasi terus dikembangkan. Lamanya waktu sterilisasi yang dibutuhkan bahan dipengaruhi oleh: resistensi mikroorganisme dan enzim terhadap panas, kondisi pemanasan, pH bahan, ukuran wadah atau kemasan yang disterilkan, keadaan fisik bahan (Machmud, 2008). 5. Sterilisasi10dengan udara kering, alat yang umum dikenal adalah oven. Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti erlenmeyer, petridish, tabunng reaksi dan alat gelas lainnya. bahan-bahan seperti kapas, kain dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini. pada umunhya suhu yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 170 - 180 C selama palinng sedikit 2 jam. Lama isterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya (Machmud, 2008). 6. Sterilisasi dengan uap air panas , bahan yang mengandung cairan tidak dapat didterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. alat ini disebut Arnold steam sterilizer 0 dengan suhu 100 Cdalam keadaan lembab. Secara 10
sederhana dapat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 100 0C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetatif mikrobia. kemudian disimpan pada suhu kamr 24 jam untuk memberi kesempatan spora 0 tumbuh menjadi sel vegetatif, lalu dipanaskan lagi 100 C 30 menit. dan diinkubasi lagi 24 jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan (Machmud, 2008). 7. Sterilisasi dengan uap air panas bertekanan, alat ini disebut autoklaf (autoclave) untuk steriliasasi ini alat dilengkapi dengan katup pengaman. Alat diisi dengan air kemudian bahan dimasukkan. Panaskan sampai mendidih dan dari katup pengaman kelaur uap air dengan lancara lalu ditutup. Suhu akan naik sampai 121 0C dan biarkan selama 15 menit (untuk industri pengalengan ada perhitungan tersendiri), lalu biarkan dingin sampai tekanan normal dan klep pengaman dibuka, cara ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel atau spora sehingga lebih cepat. Cara mana yang dipilih tergantung bahan, biaya dan ketersediaan alat, untuk bahan yang tidak tahan panas, maka cara diatas tidak dapat dipakai (Machmud, 2008). 2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok Cara perhitungan kebutuhan media dan larutan stok disajikan dibawah ini dan hasilnya secara lengkap pada Tabel 1 berikut ini. Tabel 1 menyajikan macam-macam larutan stok yang sebaiknya ada pada pembuatan media MS, pengelompokan bahan-bahan penyusun larutan stok, perhitungan kebutuhan bahan-bahan untuk pembuatan larutan stok per 10 liter media, ukuran volume wadah untuk tempat larutan stok, perhitungan konsentrasi masing-masing stok, dan banyaknya pengambilan 11
(volume) larutan stok yang diambil untuk keperluan pembuatan media 1 liter.(muslim, 2009)
Tabel 1. Kebutuhan Bahan Larutan Stok untuk 10 liter Media 12
MS (10 kali pembuatan, masing-masing pembuatan 1 liter) Perhitungan kebutuhan mMMedia dan larutan stok untuk melengkapi tabel di atas adalah sebagai beriut: a) Kebutuhan bahan-bahan untuk 10 liter media MS (kolom 2) = 10 x bobot bahan-bahan media MS (mg/l) pada Tabel 1. Contoh: KNO3 = 1900 mg x 10 = 19.000 mg b) Volume pengambilan stok untuk setiap pembuatan media 1 liter menggunakan rumus: V1 x M1 = V2 x M2 dimana: - V1 adalah volume stok yang dicari M1 adalah kosentrasi larutan stok V2 adalah Volume larutan stok M2 adalah kosentrasi yang diinginkan Contoh: banyaknya (volume) stok mikro besi (Fe-EDTA) yang diambil untuk membuat 1 l media sebagai berikut. V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 278 = 100 x 27,8 V1 = 2780 : 278 = 10 ml (muslim, 2009)
13
III. METODOLOGI 3.1 Alat, Bahan, dan Fungsi A. ALAT 1. Gelas ukur Untuk mencampurkan semua bahan sebelum di tuang ke dalam botol kultur. 2. Stirer Untuk mengaduk bahan supaya tercampur secara merata (homogen). 3. Microwave Untuk mengoven bahan. 4. Botol kultur Untuk meletakan media. 5. Autoclave Untuk sterilisasi media beserta tempatnya. 6. Timbangan Untuk menimbang bahan-bahan. 7. Sendok Untuk mengambil bahan dalam bentuk bubuk. 8. Pipet Untuk mengambil bahan cair. 9. Gunting Untuk mengunting plastik wrap atau alumunium foil. 10. Tabung ukur Untuk mengukur bahan supaya tepat. B. BAHAN 1. Aquades Untuk mencuci alat maupun sebagai campuran bahan untuk membuat media. 2. Unsur (makro,mikro A, mikro B, Fe EDTA,Vitamin, CaCl2)
14
Sebagai bahan untuk membuat media yang nanti akan dicampur dengan komposisi yang berbeda-beda. 3. Kertas lakmus Untuk mengukur pH larutan perlu di tambah NaOH atau HCl atau tidak. 4. NaoH Untuk ditambahkan ke larutan jika larutan tersebut bersifat asam. 5. HCl Untuk ditambahkan ke larutan jika larutan tersebut bersifat basa. 6. Sukrosa. Untuk makanan atau sebagai nutrisi untuk tanaman. 7. Agar Sebagai media tanam. 8. Plastik Wrap Untuk menutup botol. 9. Aluminium foil Untuk menutup botol. 10. Alkohol Untuk sterilisasi plastik wrap atau alumunium foil. 11. Karet Untuk mengikat plastik atau alumunium foil pada botol kultur.
15
3.2 Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir) Bilas gelas dengan aquades
Isi gelas dengan aquades ± 50 ml/100 ml Tambah unsur yang sudah di stok
Makro
: 30 ml
Mikro A
: 3 ml
Mikro B
: 0,3 ml
Fe EDTA
: 3 ml
Vitamin
: 0,3 ml
CaCl
:3 ml
Tambah aquades higga 500 ml
Stirer Ukur Ph
pH terlalu asam (<5,5) ditambah NaOH
pH terlalu basa (>5,8) ditambah HCl
masukkan sukrosa dan agar
sukrosa
: 9 gram
agar
: 2,1 gram
Stirer Tutup dengan plastik wrap (dilubangi)
16
Microwave selama 7 menit
Tuang ke botol kultur @ 20 ml (tutup plastik/ alofo steril)
Autoclave 20 menit
Angkat taruh dalam ruang 3
Amati setiap 2 hari sekali selama 2 minggu 3.3 Analisa Perlakuan Menyiapkan alat dan bahan. Mengisi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml atau 100 ml. Dan menambahkan unsur yang telah di stok sesuai dengan ketentuan di atas. Setelah itu ditambahkan aquades hingga 500 ml. Kemudian distirer dan diukur pH nya jika larutan asam ditambah NaOH, jika larutan basa maka ditambahkan HCl. Kemudian menimbang gula 9 gram dan agar sebanyak 2,1 gram. Kemudian dicampur dan dimasukkan dalam larutan dan di stirer supaya tercampur rata (homogen). Gelas tersebut ditutup dengan plastik wrap dan dilubangi setelah itu di oven dalam microwave selama 7 menit. Setelah itu langsung tuang ke dalam botol kultur yang telah bersih sebanyak 20 ml untuk tiap botolnya dan ditutup dengan plastik atau alumunium foil yang telah disterilkan dengan alkohol dan tangan tidak boleh menyentuh mulut botol supaya tidak terjadi kontaminasi. Kemudian di masukkan autoclave selama 20 menit untuk sterilisasi dan diangkat dimasukkan dalam ruang tiga untuk diamati 2 hari sekali selama 2 minggu. 17
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil (Tabel Perbandingan Perlakuan) a. Tabel Media Kultur dengan Penutup Plastik b. Tabel Media Kultur dengan Penutup Aluminium Foil 4.2 Pembahasan V. PENUTUP 5.1 Kesimpulan 5.2 Saran DAFTAR PUSTAKA
Gunawan,L.W. 1988. Teknik Kultur Laboratorium Kultur Jaringan PAU Pertanian Bogor. Bogor.
Jaringan Tumbuhan. Bioteknologi. Institut
Hendaryono,Daisy P.Sriyanti; dan Ari Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta. Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor. http://anekaplanta.wordpress.com/2008 /03/02/teknik-penyimpanan-dan-pemeliharaan-mikroba/. Diakses pada tanggal 31 Oktober 2012. Muslim,Ahmadi. 2009. Perhitungan Kebutuhan Media Dan Larutan Stok.http://mediaperbanyakansecarakulturjaringan.blogspot.com/2 010/08/perhitungan-kebutuhan-media-dan-larutan.html.diakses 31 oktober 2012.
LAMPIRAN
18
