KROMATOGRAFI KERTAS I. TUJUAN PERCOBAAN Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari pemisahan senyawa sampel asam amino menggunakan teknik kromatografi kertas dan menentukan jenis asam amino yang terkandung dalam larutan sampel. Selain itu, praktikum ini juga bertujuan untuk mempelajari cara pengukuran kadar air dan fungsinya. II. DASAR TEORI Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan senyawa terlarut dalam senyawa pelarut. Teknik kromatografi berkembang pada tahun 1903 dan telah digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang berwarna. Sedangakan kromatografi kertas sendiri dikembangkan oleh Consden, Gordon dan Martin pada tahun 1941 (Plummer, 1978). Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Pemisahan suatu senyawa tergantung pada gerakan relatif dari dua fase tersebut. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam dan fase bergerak yang dapat berupa zat padat atau zat cair (Sastrohamidjojo, 2002). Berdasar fase diam dan fase bergeraknya teknik kromatografi dapat dibedakan menjadi 4 jenis yaitu: 1. Kromatografi serapan, yaitu apabila fase bergeraknya zat cair dan fase diamnya zat padat. Ada 2 macam kromatografi serapan yakni kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion. 2. Kromatografi gas-padat, yaitu apabila fase bergeraknya gas dan fase diamnya zat padat. 3. Kromatografi gas-cair, yaitu apabila fase bergeraknya berupa gas dan fase diamnya adalah zat cair. 4. Kromatografi partisi, yaitu apabila fase bergeraknya zat cair dan fase diamnya juga zat cair. Salah satu nacam kromatografi partisi yakni kromatografi kertas. (Conn and Stumpf, 1976) Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi dimana fase bergerak maupun fase diamnya berupa zat cair. Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas saring dan kemudian
senyawa tersebut akan meluas membentuk noda membulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang berisi pelarut sebagai fase ferak. Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen-komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauh atau setelah waktu yang ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawasenyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagi pita-pita atau noda-noda yang terpisah. Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka harus dideteksi dengan cara fisika atau secara kimia yakni dengan menggunakan pereaksi atau juga dengan deteksi menggunakan sinar ultraviolet atau teknik radiokimia (Sastrohamidjojo, 2002). Prinsip kerja kromatografi kertas uaitu pemiasahan senyawa-senyawa solute atau zat terlarut di dalam 2005 atau lebih solvent (pelarut) yang berlainan dengan menggunakan kertas sebagai medium penyangganya. Kemudian berdasarkan macam perambatan fase bergeraknya, kromatografi kertas dapat dibedakan menjadi 3 macam yaitu: 1. Ascending chromatography, yang solventnya merambat ke arah atas 2. Descending chromatography, yang solventnya merambat ke arah bawah 3. Circulair chromatography, yang solventnya bergerak melingkar atau mendatar (Heasley et al. 1997) Metode yang digunakan untuk identifikasi suatu senyawa menggunakan teknik kromatografi kertas adalah penghitungan Rf. Rf atau racing factor merupakan perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh senyawa yang diidentifikasi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut (solvent). Pada tiap-tiap senyawa mempunyai nilai Rf yamg berbeda-beda dan hal inilah yang dijadikan dasar pengidentifikasian suatu senyawa (Plummer, 1978). Dalam melakukan teknik kromatografi kertas perlu diperhatikan beberapa hal antara lain: 1. metode yang digunakan (penaikan, penurunan, atau mendatar) 2. macam kertas 3. pemilihan dan pembuatan pelarut (solvent) 4. penempatan cuplikan 5. metode deteksi dan identifikasi
(Plummer, 1978) Macam kertas yang digunakan dalam teknik kromatografi kertas adalah kertas khusus, yaitu kertas yang banyak mengandung selulosa. Berdasarkan sifat selulosa yang mempunyai daya serap tinggi terhadap suatu larutan, maka kertas berbahan selulosa sangat cocok digunakan dalam pelaksanaan teknik kromatografi kertas ini. Kebanyakan kertas yang digunakan dalam teknik kromatogrfai kertas adalah kertas Whatmann. (Sasrohamidjojo,2002) Kemudian penggunaan pelarut haruslah disesuaiakan dengan senyawa yang akan dipisahakn, untuk senyawa polar maka dibutuhkan pula pelarut yang bersifat polar. Hal ini sesuai hukum like dissolve like, dimana dua senyawa yang mempumyai kepolaran yang sama akan saling tarik menarik (Heasley et al. 1997). Beberapa pelarut atau solvent yang digunakan dalam teknik kromatografi kertas antara lain: Tabel 1. Pelarut-pelarut dalam teknik kromatografi kertas Pemisahan Asam-asam amino Karbohidrat (gula)
Pelarut Fenol, air n-buthanol, as. cuka, air n-buthanol, as. cuka, air n-buthanol, pirimidin, air Etil asetat, pirimidin, air Etil asetat, n-PrOH, air Etil asetat, as.cuka, air n-buthanol, 1,5 M NH3
Asam-asam lemak Fe, Cl, Br, I, Pirimidin, air (garam Na) Hg, Pb, Cd, n-buthanol, 3 M HCl Cu, Bi
Perbandingan Larutan jenuh 4:1:5 12 : 3 : 5 1:1:1 2:1:2 6:1:3 3:1:3 Larutan jenuh 9:1 Laruatan jenuh (Sastrohamidjojo, 2002)
Penggunaan pelarut untuk senyawa-senyawa organik dipilih senyawa-senyawa bersifat polar agar lebih mudah larut dalam air daripada dalam zat-zat cair organik. Dalam pemisahan asam-asam amino sasngat baik digunakan campuran berupa nbuthanol, asam cuka dan air. Pelarut n-buthanol sebenarnya bukan merupakan pelarut asam amino, akan tetapi bila dijenuhkan dengan air maka akan menjadi pelarut asam amino yang baik. Penambahan asam cuka dan pemberian lebih banyak air akan menjadikan kenaikan kelarutan asam-asam amino sehingga lebih mudah untuk berpisah (Sastrohamidjojo, 2002) Beberapa kelebihan menggunakan teknik kromatografi kertas dalam usaha pemisahan sekaligus pengidentifikasian suatu senyawa adalah pertama merupakan
metode pemisahan yang cepat dan mudah serta menggunakan peralatan yang mudah dan sederhana. Kedua, hanya membutuhkan campuran cuplikan yang sangat sedikit dan justru tidak menggunakan dalam jumlah yasng besar, dan ketiga pekerjaan dapat diulang-ulang. Keuntungan lainnya adalah dengan menggunakan teknik kromatografi kertas dalam menentukan suatu senyawa dapat digunakan berbagai cara antara lain dengan penentuan Rf dimana spesifik untuk suatu senyawa (Kalthoff and Sandel, 1952). Dalam menganalisis kandungan kimia suatu sampel berupa bahan segar, perlu dilakukan pengukuran kadar air. Pengukuran kadar iar dilakukan dengan mengeringkan bahan segar atau bahan setengah kering dalam oven, sampai didapatkan berat konstan. Penghitungan persentase kadar air sesuai rumus berikut: Berat segar – berat kering x 100 % Berat segar III. METODE A. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini antar lain: petridish glass, jangka, pipet kapiler, hairdryer, botol penymprot, benang katun, oven, pinset, penggaris, gunting serta pensil. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini yaitu larutan solute yang berupa campuran asam-asam amino, larutan solvent: n-buthanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 4 : 1 : 1, 6 asam amino standar (histidin, alanin, leusis, metionin, arginin,tirosin), kertas Whatmann no.1 dan regen Ninhydrin. B. Cara Kerja Kertas Whatmann digunting sebesar tutup petridish, lalu dibuat lingkaran berjari-jari 1 cm dari titik tengah kertas menggunakan jangka. Kertas Whatmann dibagi menjadi 8 bagian yang sama besar denagn menggarisnya menggunakan pensil. Pada tiap pertemaun anatara lingkaran 1 cm dan garis yang membagi kertas dibuat lingkara-lingkaran kecil serta diberi nomor secara urut. Pada tengah kertas dilubangi dan dimasukkan benang katun lalu diikat pada salah satu ujungnya agar tidak lolos dari kertas Whatmann, benang disisakan sepanjang 4-5 cm. Di tiap-tiap lingkaran kecil ditetesi dengan menggunakan pipet kapiler 6 macam sampel asam amino dan 2 larutan sampel. Penempatan larutan-larutan tersebut yakni:
1.
sampel
2.
asam amino metionin
3.
asam amino histidin
4.
asam amino tiroksin
5.
sampel
6.
asam amino alanin
7.
asam amino arginin
8.
asam amino leusin
Larutan sampel yang diletakkan pada lingkaran nomor 1 dan 5 merupakan larutan yang jenisnya sama dan dilakukan dengan tujuan sebagi ulangan. Setelah itu kertas Whatmann dimasukkan pada tutup petridish dan kemudian tutup tersebut dipasang pada petridish yang telah diisi dengan larutan solvent kurang lebih 10 ml sehingga ujung benang tercelup ke dalam solvent. Dibiarkan selama 45 menit, kemudian tutup diangkat, batas daerah resapan solvent ditandai dan setelah itu dikeringkan dalam oven selama 3 menit pada suhu 105 ºC. Setelah kering kertas Whatmann disemprot dengan reagen Ninhydrin dan dikeringkan kembali dalam oven kurang lebih selam 3 menit. Noda-noda berwarna ungu akan tampak kemudian diukur jarak masing-masing bagian tengah jarak tengah rambatan (berwarna ungu) baik larutan sampel maupun larotan asam amino standar. Kemudian dihitung nilai Rf-nya dan dibandingkan antar larutan-larutan tersebut unruk menentukan asam amino apa saja yang menjadi komponen larutan sampel. IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, didapatkan Rf untuk masingmasing larutan baik larutan sampel maupun asam amino standar sebagi berikut: Tabel 2. Rf larutan sampel dan asam amino standar No. 1.
2. 3. 4. 5.
Larutan Sampel Rf 1 Rf 2 Rf 3 Metionin Histidin Tiroksin Sampel
Rf 0,09 0,30 0,78 0,37 0,19 0,56
Rf 1 Rf 2 Rf 3 Alanin Arginin Leusin
6. 7. 8.
010 0,30 0,55 0,30 0,15 0,65
Kemudian dapat dicari rata-rata Rf tiap sampel sebagai berikut: Rf 1 = 0,09 + 0,10 = 0,095 (Arginin = 0,10) 2 Rf 2 = 0,30 + 0,30 = 0,30 (Alanin = 0,30) 2 Rf 3 = 0,78 + 0,55 = 0,66 (Leusin = 0,66) 2 Pada percobaan pengukuran kadar air, didapatkan hasil seperti berikut: Tabe 3. Hasil pengukuran kadar air No
Berat kering
Botol (g)
Berat awal
45’ pertama (g)
45’ kedua (g)
45’ ketiga (g)
(g) 1.
Sampel 1
13,99
2,65
1,97
1,18
0,77
2.
Sampel 2
24,82
1,79
1,31
0,61
0,39
Kadar air sampel 1 = 2,65 – 0,77 x 100 % = 70,9 % 2,65 Kadar air sampel 2 = 1,79 – 0,39 x 100 % = 78,2 % 1,79
B. Pembahasan Nilai Rf merupakan nilai perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh solute (zat terlarut) dengan jarak yang ditempuh solvent (pelarut). Jarak yang ditempuh solute Rf = -----------------------------------Jarak yang ditempuh solvent Kertas yang digunakan dalam percobaan ini adalah kertas Whatmann no. 1 karena merupakan kertas yang banyak mengandung selulosa (96 %), dan sangat efektif sebagai media perambatan asam amino yang mempunyai berat molekul (BM) cukup besar sehingga asam amino tersebut dapat merambat dengan baik. Kertas
Whatmann termasuk media penyangga suatu larutan dengan kecepatan perambatan sedang serta mempunyai ketebalan yang tipis, hal ini akan mempermudah pengamatan walaupun jumlah asam amino yang diteteskan sangat sedikit. Prinsip perambatan pada kertas adalah gaya kapiler dari kertas yaitu pada poro-porinya yang besar sehingga molekul terutama yang dalam wujud cair dapat melewatinya. Fungsi kertas dalam pemisahan terutama mempunyai pengaruh pada kecepata aliran pelarut. Efek-efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugusgugus hidroksil dan sejumlah gugus karboksil dari selulosa akan dapat menaikkan efek-efek pertukaran ion. Kemudian selama perlakuan dengan kertas Whatmann, diusahakan agar tidak ada kontak langsung antara kulit dengan kertas atau kertas terlipat. Hal ini agar tidak terjadi penempelan asam amino atau senyawa lain yang berasal dari tubuh kita, misal dari pengeluaran keringat sehingga menyebabkan kontaminasi pada kertas. Dalam percobaan ini menggunakan solvent yaitu campuran n-buthanol ,air, dan asam asetat dengan perbandingan 4:1:1. Yang menjadi fase diam atau stationary adalah air. Sedang yang menjadi fase gerak atau mobile adalah n-buthanol. Fungsi dari penyemprotan Nynhidrin (indanatrioan hidrat) adalah sebagai pereaksi yangdigunakan untuk mendeteksi asam-asam amino. Pada suhu kamar pereaksi ini baru memberikan warna pada asam amino kira-kira setelah 24 jam. Namun, pada pemanasan pada suhu 100 ºC warna akan timbul kira-kira setelah 4 menit saja. Inadanatrion hidrat + asam amino → kompleks warna ungu Ada beberapa faktor yang deapat mempengaruhi jarak tempuh suatu senyawa pada teknik kromatografi kertas ini, yaitu: 1. Pelarut Karena pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan jarak tempuh suatu larutan. 2. Ukuran dari bejana Volume bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer, jadi mempengaruhi kecepatan penguapan komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar
digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, lalu akan merubah koefisien partisi. 3. Suhu Perubahan pada suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran. 4. Kertas yang digunakan Pengaruh utama kertas pada harga jarak tempuh larutan timbul dari perubahan ion dan serapan yang berbeda untuk setiap kertas. Selain mempengaruhi kecepatan aliran, jenis kertas juga akan memprngaruhi keseimbangan partisi. 5. Sifat dari campuran Berbagai senyawa mwngalami diantara volume yang sama dari fase tetap dan fase bergerak akan mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang lain dan akhirnya mempengaruhi jauh dekat jarak yang ditempuhnya. Pada percobaan ini timbul 3 noda pada masing-masing sampel. Sehingga untuk masing-masing sampel dapat diketahui 3 jenis asam amino penyusunnya. Caranya adalah dengan mencari rata-rata nilai Rf kedua sampel tersebut pada ketiga noda yang terbentuk. Rf 1 sampel menunjukkan angka 0,09 dan 0,10. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 1 adalah sebesar 0,095. Hasil ini mendekati Rf Arginin sebesar 0,10 sehingga dapat dikatakan salah satu asam amino penyusun sampel adalah Arginin. Rf 2 sampel menunjukkan angka 0,30 dan 0,30. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 2 adalah 0,30. Hasil ini mendekati Rf Alanin sebesar 0,30 sehingga dapat dikatakan Arginin merupakan salah satu asam amino penyusun sampel. Rf 3 sampel menunjukkan angka 0,78 dan 0,55. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 3 sebesar 0,30. Hasil ini mendekati Rf Leusin sebesar 0,65 sehingga dapat dikatakan asam amino ketiga yang menyusun adalah Leusin. V. KESIMPULAN Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa asam amino yang terkandung dalam larutan sampel adalah Arginin, Alanin dan Leusin. Kromatografi kertas termasuk teknik kromatografi partisi dimana fase geraknya adalah n-butanol dan fase diamnya air. Prinsip kerja kromatografi kertas yaitu pemisahan senyawa-senyawa solute di dalam 2 atau lebih pelarut yang berlainan dengan menggunakan kertas sebagai media penyangganya. Kandungan air pada sampel 1 dan 2 berturut-turut adalah 70,9 % dan 78,2 %. Analisis kandungan kimia suatu sampel dilakukan pada bahan segar, sehingga fungsi
pengukuran kadar air adalah untuk mengetahui tingkat kesegaran sampel melalui persentase kadar airnya. VI. DAFTAR PUSTAKA Conn, E.E. and P.K. Stumpf. 1976. Outline of Biochemistry. 4th edition. John Willey and Sons Co., Inc. New York. p.590-595. Heasley, V.L., V.J. Christensen and G.E. Heasley. 1997. Chemistry and Life in Laboratory. 4th edition. Prentice Hall Co., Inc. USA. P. 56-70. Kalthoff, I. M. and E. B. Sandel. 1952. Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. 3rd Edition. The Mac Millan Co., Inc. New York.p. 654-662. Plummer, D.T. 1978. An Introduction to Practucal Biochemistry. 2th edit. Mc Graw Hill Book Co., Ltd. New York. p. 70-87. Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. Edisi kedua. Penerbit Liberty. Yogyakarta. Hal. 1-24.
LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIA ACARA VI
KROMATOGRAFI KERTAS
Disusun oleh : Nama : M.A.Fathoni NIM : BI/7660 Gol/Kel. : I B/ 2 Asisten : M. Rica A.
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2007
