INOKULASI VIRUS PADA TELUR AYAM BEREMBRIO
Oleh : Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten
: Dini Darmawati : B1J014058 :4 : V : Leader Alfason
LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI
KEMENTERIANRISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2016 I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Newcastle Disease (ND) atau tetelo merupakan penyakit yang disebabkan oleh Newcastle Disease Virus dari golongan Paramyxovirus. Virus ini biasanya berbentuk bola, meski tidak selalu (pleomorfik) dengan diameter 100 – 300 nm. NDV memiliki genom berupa rantai tunggal RNA (ssRNA-). Virus ini menyerang alat pernapasan, susunan jaringan saraf dan sistem reproduksi unggas. Virus ini menyebar dengan cepat, menular pada banyak spesies unggas yang bersifat akut, epidemik dan sangat patogen. NDV dibagi menjadi dua tipe yakni tipe Amerika dan Asia. Pembagian ini didasarkan pada tingkat keganasan virus dalam menyerang. Tipe Asia lebih ganas dan pada umumnya terjadi pada musim hujan atau musin peralihan (Akin, 2006). NDV dapat mengaglutinasi eritrosit ayam, marmut dan eritrosit manusia. Hemaglutinasi terjadi karena NDV mempunyai suatu protein yang terdapat pada selubung virus yaitu hematglutinin. Mekanisme terbentuknya hemaglutinasi disebabkan karena adanya ikatan antar hemaglutinin NDV dengan reseptor sel, yaitu mukoprotein yang terdapat pada permukaan eritrosit (Wibowo dan Amanu, 2010). Menurut Fenner (1995), penularan virus ini cepat dan kematian yang ditimbulkan sangat tinggi. Pengobatan untuk penyakit ini belum ditemukan, namun dapat dicegah dengan vaksin (Fenner, 1995). Newcastle Disease (ND) merupakan penyakit endemik di Indonesia dan ditemukan di berbagai daerah. Penyakit ND pertama kali ditemukan pada tahun 1926 di daerah Jakarta oleh Kraneveld. Sejak saat itu, kejadian ND dilaporkan terjadi di berbagai negara di dunia. Hampir semua jenis unggas rentan terhadap infeksi oleh virus NDV dengan tingkat keparahan penyakit yang berbeda-beda (Saepulloh dan Darminto, 2005).
B. Tujuan Tujuan praktikum inokulasi virus pada tellur ayam berembrio adalah untuk memberikan pemahaman tentang macam-macam inokulasi virus, mengetahui bagaimana cara menginokulasikan virus pada telur ayam berembrio, dan mengetahui ciri-ciri embrio ayam yang terinfeksi virus New Castle Disease (ND). II.
MATERI DAN METODE
A. Materi Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu masker, sarung tangan, jarum, kapas, spuit injeksi, alat senter, cawan petri, pembakar spiritus, pensil dan inkubator. Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu telur ayam berembrio umur 9-12 hari, alkohol 70%, lilin, dan suspensi virus Newcastle Disease (ND). B. Metode 1. Alat dan bahan disiapkan. 2. Telur ayam berembrio diteropong dengan menggunakan senter atau alat peneropong lainnya. 3. Batas kantung udara dengan letak kepala embrio ditentukan dan diberi tanda. 4. Alkohol 70% dioleskan, kemudian suspensi virus diinokulasikan ke dalam ruang alantois hingga melewati batas kantung udara dengan cara memasukkan jarum ¾ inci dengan sudut 45o dan diinjeksikan 0,1 cc, 0,3 cc dan 0,5 cc virus yang akan diinokulasikan. 5. Lubang tempat injeksi ditutup kembali dengan lilin. 6. Telur ayam berembrio dinkubasi dengan suhu 38-39ºC selama 7 hari. 7. Telur ayam berembrio dipecahkan dan diletakkan pada cawan petri kemudian dibandingkan telur yang diinokulasikan virus dengan telur yang tidak diinokulasikan virus.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Tabel 1. Hasil Inokulasi Virus pada Telur Ayam Berembrio Kelompok
Volume
Lesi pada
Lesi pada Otot
Perubahan Warna
1 2 3 4 5 6 7
Virus 0,1 cc 0,3 cc 0,5 cc 0,1 cc 0,3 cc 0,5 cc 0,1 cc
Embrio + + + + +
dan Bulu + + + + + + +
Hijau pada Kaki + + + + + +
Gambar 1. Hasil inkubasi telur ayam berembrio tanpa inokulasi virus.
Gambar 2. Hasil inkubasi telur ayam berembrio yang telah diinokulasikan dengan 0,1 cc NDV.
B. Pembahasan Berdasarkan pengamatan embrio ayam yang telah diinkubasi selama tujuh hari, didapatkan hasil bahwa hampir semua kelompok dengan masing-masing konsetrasi volume virus menunjukkan gejala pada embrio ayam. Semua kelompok menghasilkan embrio ayam dengan lesi pada otot dan bulu. Hampir semua embrio ayam pada masing-masing kelompok mengalami perubahan warna pada kaki ayam, kecuali embrio ayam kelompok 3 tidak mengalami perubahan warna. Selain itu, hampir semua kelompok memiliki embrio dengan gejala lesi pada embrio kecuali kelompok 2 dan 3. Hasil yang didapat sesuai dengan pernyataan Shane (1998), bukti adanya infkesi virus pada embrio ayam ditunjukkan dengan kematian embrio, pembentukan lesi pada CAM, lesi pada embrio, perkembangan otot dan buku yang abnormal, abnormalitas pada organ visceral dan perubahan warna kehijauan pada kaki. Newcastle Disease Virus (NDV). Menurut Feller (1969), apabila virus berada pada khorioalantois maka akan mengalami tiga tahap perkembangan. Tahap 1 ditandai dengan dimulainya hipertrofi, hiperplasia sel dan kehadiran dari sedikit badan inklusi sitoplasma yang biasanya ditemukan dalam sel. Tahap 2, juxtanuclear agregat nukleokapsid-glikogen munculdan ada peningkatan jumlah mikrovili. Sedangkan, Tahap 3 ditandai dengan peningkatan kepadatan sitoplasma, perakitan virus dan pelepasan. NDV memiliki ukuran 100-250 nm, materi genetik berupa Ribonucleic Acid (RNA) yang dilengkapi protein dan lemak. Serogroup Paramyxovirus-1 dengan prototype Newcastle Disease Virus (NDV) adalah penyebab penyakit tetelo pada ayam yang utama. Virus prototype ini mempunyai sifat hayati dapat menggumpalkan (haemaglutination) sel-sel darah merah ayam, selain itu virus ini mengeluarkan toksin dan hemolisin (Saepulloh dan Darminto, 2005). Menurut Boostani et al., (2013), Newcastle disease adalah penyakit virus yang sangat menular dan mematikan. Virus ini menginfeksi sebagian besar spesies burung dari semua kelompok usia. Hal ini disebabkan oleh Newcastle Disease Virus (NDV) dari keluarga Paramyxoviridae dan genus Avulavirus. Virus ini memiliki selubung (envelope) dan RNA negatif beruntai tunggal. Panjang genomnya diperkirakan mencapai 15.186 nukleotida dan terdiri dari enam gen yang menyandi protein nukleokapsid (NP), phosphoprotein (P), protein matriks (M), protein fusi (F), haemaglutinin-neuraminidase (HN) dan protein large polymerase (L). Menurut
Hewajuli (2011), selama proses transkripsi gen P, terdapat 2 protein non-structural yang dihasilkan yaitu V dan protein N. P, HN dan F terletak di bagian luar envelope, sedangkan protein M terdapat di lapisan dalam virion. Protein-protein ini mempunyai peran masing-masing dalam menentukan virulensi virus ND. Protein HN berperan dalam tahap penempelan virus ND pada reseptor sel inang atau induk semang yang mengandung sialic acid. Molekul sialic acid ini terdiri atas glycoprotein dan glycolipid. Penempelan virus dilakukan dengan penyatuan virus dan membran sel yang diperantarai oleh protein F. Virus RNA kemudian dilepaskan dalam sitoplasma dan terjadi replikasi. Envelope virus masuk ke dalam sel melalui dua cara utama, yaitu penyatuan secara langsung antara envelope virus dengan membran plasma dan diperantarai oleh reseptor endositosis. Penetrasi virus melalui reseptor endositosis tergantung pada kondisi pHnya. Proses penyatuan membran virus dengan membran plasma inang atau induk semang pada Paramyxoviruses tidak tergantung pH. Penyatuan virus ND dengan sel mampu meningkatkan pH hal ini mengindikasikan bahwa penetrasi virus ND pada sel inang melalui reseptor endositosis juga dipengaruhi oleh kondisi pH (Hewajuli, 2011). Newcastle Disease sangat merugikan para peternak, hal ini dikarenakan virus ini sangat virulen. Berdasarkan atas virulensinya, NDV dikelompokkan menjadi tiga patotype, yaitu lentogenik, mesogenik dan velogenik. Lentogenik adalah strain virus yang kurang virulen. Mesogenik merupakan strain virus dengan virulensi sedang, dan velogenik adalah strain virus ganas. Strain velogenik dibedakan lagi menjadi bentuk neurotrofik dengan gejala gangguan saraf dan kelainan pada sistem pernafasan, dan bentuk viserotrofik yang ditandai dengan kelainan pada sistem pencernaan. Dampak dari penyakit Newcastle adalah angka kesakitan (morbiditas) maupun angka kematian (mortalitas) pada ternak unggas menjadi sangat tinggi. Mortalitas maupun morbiditas dapat mencapai angka 50-100% akibat infeksi virus ND strain velogenik terutama pada kelompok ayam yang peka terhadap virus, 50% pada strain mesogenik, dan 30% pada infeksi virus strain velogenik (Kencana et al., 2012). Penyakit Newcastle menyebabkan gangguan yang sangat berat pada sistem pernafasan, syaraf dan pencernaan pada ayam atau unggas lainnya. Berdasarkan gejala klinis yang ditimbulkan pada ayam, ND dapat dikelompokkan menjadi 5 patotipe yaitu viscerotropic velogenic, neurotropic velogenic, mesogenic, lentogenic dan asymptomatic enteric. Viscerotropic velogenic merupakan suatu bentuk penyakit
Newcastle yang sangat patogen dimana lesi pendarahan pada sistem pencernaan sering terlihat pada bentuk ini. Neurotropic velogenic adalah bentuk penyakit Newcastle yang menyebabkan mortalitas yang tinggi dan biasanya diikuti dengan gangguan sistem respirasi dan syaraf. Newcatle disease bentuk mesogenic menunjukkan gejala klinis gangguan sistem pernafasan tetapi gangguan sistem syaraf tidak selalu terlihat dan mortalitas yang rendah, sedangkan asymptomatic enteric merupakan suatu bentuk infeksi subklinik pada sistem pencernaan. NDV strain avirulent (lentogenik dan mesogenik) digunakan sebagai vaksin hidup untuk meningkatkan pengendalian penyakit Newcastle pada ayam, tetapi pemilihan jenis vaksin tergantung pada kondisi penyakitnya. Vaksin inaktif juga digunakan dalam pengendalian penyakit Newcastle. Patogenitas yang ditimbulkan NDV dapat ditentukan oleh beberapa faktor diantaranya tingkat virulensi NDV dan inang (Hewajuli, 2011). Gejala klinis yang dialami oleh ayam berupa penurunan nafsu makan, jengger dan pial sianosis, pembengkakan di daerah kepala, bersin, batuk, ngorok, dan diare putih kehijauan. Infeksi virus strain velogenik bersifat fatal, seringkali diikuti dengan angka kematian yang tinggi. Gejala-gejala tersebut sangat bervariasi, diawali dengan
konjungtivitis, diare serta dikuti dengan gejala saraf
seperti tremor,
tortikolis (kelumpuhan pada leher dan sayap). Perubahan patologi anatomi yang patognomonis pada penyakit Newcastle ditandai dengan ptechie pada proventikulus, ventrikulus, usus, seka tonsil, trakea dan paru-paru. Selain itu, terjadi gangguan pernapasan, diare berwarna hijau, kelemahan, kehilangan nafsu makan, kehilangan nafsu minum, penurunan produksi telur dapat menyebabkan angka kematian yang tinggi (Kencana et al., 2012). Menurut Tabbu (2000), macam- macam inokulasi virus terbagi menjadi : 1. In Ovo Metode ini menggunakan telur ayam berembrio sebagai media pertumbuhan virus. Metode ini dapat dilakukan dengan berbagai cara antara lain: a. Inokulasi pada ruang khorioalantois Inkubasi ini biasanya digunakan embrio ayam dengan umur 10-12 hari. Jarum dimasukkan ¾ inci dengan sudut 45º dan diinjeksikan 0,1-0,3 ml virus yang akan diinokulasikan. Setelah 40-48 jam, cairan telur yang sudah diinkubasi dapat diuji untuk
hemaglutinasi dengan membuat lubang kecil pada kerabang di pinggir dari rongga udara dengan alat semprot yang steril dan jarumnya. Contoh virus yang diinokulasikan pada ruang khorioalantois ini antara lain, virus ND dan virus influenza. b. Inokulasi pada chorioallantoic membrane Inokulasi pada embrio umur 10-11 hari adalah yang paling cocok. Telur diletakkan horizontal di atas tempat telur. Kerabang di sekitar ruang udara dan daerah lain di atas embrio telur diberi alkohol. Buat lubang pada daerah tersebut dan diperdalam lagi hingga mencari membran kerabang. Virus diinokulasikan pada chorioallantoic membrane dan lubang ditutup dengan lilin dan diinkubasi. c. Inokulasi pada yolk sac Inokulasi dilakukan pada embrio umur 5-7 hari. Setelah diinokulasi
embrio
diinkubasi
selama
3-10
hari.
Virus
diinokulasikan pada bagian yolk sack dan dijaga agar tidak terkontaminasi bakteri. Virus yang biasa diinokulasikan di bagian ini adalah virus rabies. 2. In Vitro Metode ini merupakan suatu metode penginokulasian virus pada kultur jaringan. Sel-sel jaringan yang berbeda-beda lebih efektif untuk kultivasi beberapa virus ketimbang yang lain. Pendekatan ini telah memungkinkan kultivasi banyak virus sebagai biakan murni dalam jumlah besar untuk penelitian dan produksi vaksin secara komersial. 3. In Vivo Metode ini merupakan metode penginokulasian virus pada hewan laboratorium yang peka. Metode ini merupakan metode yang pertama kali dalam menanam virus. Metode ini dapat digunakan untuk membedakan virus yang dapat menimbulkan lesi yang hampir mirip misalnya FMDP atau Vesicular Stomatitics pada sapi. Hewan laboratorium yang digunakan antara lain mencit, tikus putih, kelinci atau marmut. NDV sangat mudah sekali menular, penularan NDV dapat terjadi secara langsung antar ayam dalam satu kelompok ternak tertular. Sumber virus biasanya berasal dari ekskreta ayam terinfeksi, udara yang tercemar virus, peralatan, dan
pekerja kandang. Patogenisitas virus NDV dipengaruhi oleh galur virus, rute infeksi, umur ayam, lingkungan, dan status kebal ayam saat terinfeksi virus. Selama sakit, ayam mengeluarkan virus dalam jumlah besar melalui feses (Kencana et al., 2012). Menurut Fenner (1995), faktor-faktor yang menentukan keberhasilan inokulasi pada embrio ayam adalah sebagai berikut: 1. Rute Inokulasi Inokulasi pada embrio dimana virus akan segera mendapatkan tempat untuk menginfeksi organ. Hasil paling baik adalah jika embrio telah mengalami abnormal organ sejak 24 jam setelah inokulasi. 2. Strain virus Strain virus menentukan efek infeksi pada masing-masing embrio yang diinokulasikan virus. Strain yang paling virulen merupakan strain yang paling baik untuk digunakan pada uji in ovo karena akan langsung terlihat gejalanya. 3. Titer Virus Banyaknya titer virus yang diinokulasikan merupakan hal yang penting untuk mencapai keberhasilan inokulasi dan menyebabkan efek infeksi yang terlihat jelas pada embrio yang diujikan dengan kontrolnya. 4. Tahapan perkembangan embrio Embrio yang sudah mengalami tahap dewasa akan lebih resisten terhadap virus, hal ini dikarenakan sistem imunnya telah terbentuk. Sebaliknya embrio dengan umur yang lebih muda akan lebih rentan terkena virus karena sistem imunnya belum berkembang. 5. Temperatur Inkubasi Temperatur yang terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein yang terdapat di dalam telur. Hal ini akan menyebabkan enzim–enzim tertentu yang dibutuhkan untuk perkembangan embrio juga terhamba dan virus akan memiliki lingkungan hidup yang optimum. 6. Waktu inkubasi Jika inkubasi dilakukan terlalu lama kemungkinan virus akan terus bereplikasi menghasilkan virion–virion baru yang dapat menyebabkan sel inang lisis dan mati. Sel inang yang sudah mati tidak dapat mendukung hidup virus yang merupakan parasit intraseluler obligat.
IV.
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan praktikum postulat Koch, maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1. Macam- macam inokulasi virus yaitu melalui metode in ovo, in vitro dan in vivo. 2. Cara menginokulasikan NDV pada telur ayam berembrio dapat melalui tiga cara utama yaitu inokulasi pada ruang khorioalantois, inokulasi pada membran khorioalantois dan inokulasi pada yolk sac. 3. Ciri- ciri embrio ayam yang telah terinfeksi virus adalah adanya perubahan menjadi warna kehijauan pada kaki, lesi pada embrio, lesi pada otot dan bulu. B. Saran Seharusnya dalam pengerjaan praktikum dilakukan dengan tenang dan sesuai dengan petunjuk asisten praktikum, sehingga tidak ada telur yang pecah.
DAFTAR REFERENSI
Akin, Hasriadi. 2006. Virologi. Yogyakarta : Kanisius. Boostani., A.R, Pourbakhsh., S.A, Momayez., R, dan Charkhkar., S. 2013. Molecular characterization and phylogenetic study of Newcastle disease virus isolates from the 2010 to 2011 outbreaks in Shiraz, Iran. African Journal of Microbiology Research, 7 (8) pp. 657-660. Feller., U, Dougherty., R.M dan Stefano., H.S. 1969. Morphogenesis of Newcastle Diseasevirus in chorioallantoic membrane. Journal of virology, 4 (5) pp. 753-762. Fenner, Frank J. 1995. Virologi veteriner edisi kedua. California : Academic Press INC. Hewajuli, D.A., dan N.L.P.I. Dharmayanti. 2011. Patogenitas Virus Newcastle Disease pada Ayam. WARTAZOA, 21 (2) pp. 453-464. Kencana., G.A.Y, Kardena., I.M dan Mahardika., I.G.N.K. 2012. Peneguhan diagnosis penyakit Newcastle Disease lapang pada ayam buras di Bali menggunakan teknik RT-PCR. Jurnal Kedokteran Hewan, 6 (1) pp. 28-31. Saepulloh., M dan Darminto. 2005. Kaman Newcastle disease pada itik dan upaya pengendaliannya. Jurnal Wartazoa, 15 (2) pp. 84-94. Shane, simon M. 1998. Buku pedoman penyakit unggas. Singapore : American Soybean Assosiation. Tabbu, C. R. 2000. Penyakit ayam dan penanggulangannya. Yogyakarta : Kanisius. Wibowo M. H., dan Amanu S. 2010. Perandingan beberapa program vaksinasi penyakit Newcastle pada ayam buras. J. Sain, 28 (1) pp. 287-299.
