Laboratorio de Bioquímica, Diciembre 7 de 2105 Informe No.5
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Gutiérrez, ian!, ian!, 2111 "odrí#uez $. Du%&n, 2111'(1 2111'(1
Resumen: Se emplearon dos métodos para cuantificar una proteína, Albumina sérica bovina (BSA): el método de Bradford y el método de Biuret, que mediante la preparación de una curva de calibración calibración sirvieron para determinar determinar la concentración concentración de BSA en una muestra muestra desconocida desconocida de la proteína método de Bradford, Bradford, método método de Biuret Biuret,, curva de calibr calibraci ación, ón, !ey de Palabr Palabras as claves claves:: método !ambert"Beer
1. Intr Introd odc cc! c!"n "n #uando se quiere conocer la actividad específica de una en$ima o el contenido proteico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentrac ración de prote oteínas nas Se %an %an desarrollado diferentes métodos que se basan en la formación de comple&os entre las proteínas y reactivos específicos 'l método de Bradford cuantifica la unión entre un colorante y una proteína, y compara su seal a *nm con soluciones patrón de la misma +tro método es la técnica de Biuret, que forma un comple&o violeta con la proteína, y compara su seal a nm
)étodo de Bradford
'st- basado en el cambio de color del colo coloran rante te a$ul a$ul brill brillan ante te de #o #oom omass assie ie en resp respue uest staa a dife difere rent ntes es conc concen entr trac aciion ones es de proteínas 'ste compuesto inter acciona con amino-cidos b-sicos (especialmente ar.inina) y arom arom-t -tic icos os 'sta 'sta un unió iónn del colora colorant ntee con las las proteínas provoca un cambio en el m-/imo de absorción absorción del colorante colorante desde desde 0 a * nm 1or lo tanto, tanto, este método método se basa en la propiedad propiedad del A$ul A$ ul Bril Brilla lant ntee de #o #oom omas assi siee 2"3 2"344 de presentarse en dos formas con colores diferentes, diferentes, ro&o y a$ul !a forma ro&a se convierte convierte en a$ul cuando cuando el colorante colorante se une a la proteína proteína '/pe '/peri rime ment ntalm alment entee se mide mide la difer diferen encia cia de Absorbancias Absorbancias entre * * y 0 nm (*"0nm (*"0nm) ) 'l método tiene una sensibilidad de 5"5 6.
#. $arc arco te" te"r! r!co co 5
)étodo de Biuret
!a reacción de Biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un comple&o de #u en un medio alcalino en compuestos que poseen m-s de un enlace peptídico, como las proteínas:
Banco
0
0,001
1 2 (
0,2 0, 0,' 1
). +robema ) 1
4,*
0,6 1,0 1,1(6 1,(22 1,027
Tabla 1. Dato4 e4+ectrometrico4 obtenido4 durante e en4a!o de Bradford.
)étodo de Biuret.
2
Figura 1. *om+e-o formado de *u .
'ste método tiene una sensibilidad de 5444"54444 6.
*oncentraci/nm# m
3b4orbancia
Banco
0
0,000
5 7 ' 6 10
2,5 5,0 7,5 10 15 20 5,'0
0,05 0,11 0,162 0,257 0, 0,(7' 0,150
). +robema ) 2 Tabla 2. Dato4 e4+ectrometrico4 obtenido4 durante e en4a!o de Biuret
%. Resltados & d!scs!"n !as tablas 5 y 3 muestran los datos espectrometricos obtenidos lue.o de aplicar los métodos de cuantificación de proteínas7 en ellas se especifica la concentración de cada patrón de la curva y su respectiva absorbancia así como la absorbancia de la muestra problema que en los dos métodos se ubicó dentro del ran.o de cuantificación por lo que no fue necesario diluir la muestra
A partir de los datos de las tablas 5 y 3 se construyeron las .r-ficas de absorbancia en función de la concentración con el fin de %allar la e/presión matem-tica que correlacione de forma lineal las dos variables y así poder %allar la concentración de la muestra problema por interpolación
)étodo de Bradford
tubo
tubo
*oncentraci/nm#m 3b4orbancia
3
Método de Bradford Método de Biuret 1.42 f(x) = 0.9x + 0.49 R² = 0.98
1.07
1.15 f(x) = 0.02x + 0.01 R² = 1
0.67
Gráfica 1.Curva de calibración. Lo4 dato4 e8+erimentae4 no 4e a-u4tan de manera e4tricta a una reaci/n inea.
Gráfica 2. Curva de calibración. Lo4 dato4 4e a-u4tan +erfectamente a una reaci/n inea
A partir de la e/presión matem-tica presentada en la .r-fica 5 se puede %allar la concentración de la muestra anali$ada por el método de Bradford Sustituyendo el valor obtenido de absorbancia, 5,438 se obtiene: A = 0,902 C + 0,4902 1,027= 0,902 C + 0,4902
1or lo que la concentración en m.9ml de la solución es C =
1,027 −0,4902 0,902
=0,59 mg / ml
e i.ual forma se %alló la concentración de una muestra problema empleando el método de Biuret A partir de la .r-fica 3 se obtiene que la concentración est- dada por la e/presión
C =
0,150 −0,0135 0,0235
=5,80 mg / ml
;
'l resultado del método de Bradford es aceptable, sin embar.o cabe resaltar que la curva de calibración puede me&orarse ya que la concentración calculada debería ser un poco menor dada la correlación e/istente entre las patrón
absorbanci a
1roteína (m.9ml)
5 3 ; 0 8 > * 54 ?5 ?3
0,6
0,2
1,0
0,
1,1(6
0,'
1,(22
1
0,05
2,5
0,11
5,0
0,162
7,5
0,257
10
0,
15
0,(7'
20
5,438 4,54
4,05 ,>4
absorbancias 1or el contrario el método de Biuret funcionó muy bien y el resultado es confiable ya que se ubica entre una concentración de y 8, m.9ml tal como el valor de absorbancia lo predice
1roteína (m.9ml) #oncentración medida 4,45> 4,4 4,483 4,4*4 4,33 4, 4,08 4,* 5,; 5,> 4,4 4,33
1roteína (m.)== 4,434 4,4 4,48* 4,45 4,3> 4, 4,83 4,** 5,* 5,*> 4,40 4,8
Tabla 3. *antidad de +roteína en cada mue4tra. 9De cada +at/n 4e tom/ una aícuota de 0,1 m ! 4e mezc/ con 1m de reacti%o. 99La cantidad de +roteína en a mue4tra anaizada 4e :aa muti+icando a concentraci/n de a 4ouci/n medida +or e %oumen fina de 1,1 m.
'. Proble(as )ro)estos 'l reactivo de Biuret forma un comple&o colorido que tiene un m-/imo de absorción a nm 'l reactivo es una solución alcalina que contiene cobre y forma un comple&o con los enlaces peptídicos de la proteína, ver fi.ura 5 !a reacción se basa en la formación de un comple&o de color violeta, debido a la reacción entre los pares de electrones libres del nitró.eno que forman el enlace peptídico y los iones #u3@ 'ste comple&o posee m-/imo de absorción en ;44nm y en nm, pero la utili$ada es la se.unda debido a
a. Defina con 4u4 +ro+ia4 +aabra4 que e4 una cur%a +atr/n.
's un método que se utili$a para %allar una concentración desconocida de un analito, a partir de patrones con cantidades conocidas de este 1ara utili$ar la curva debe %aber una relación lineal entre la seal aportada por el instrumento y la concentración del analito de interés b. $8+ique +or qué en e método de Biuret a ab4orbancia de una +roteína 4e ee a una on#itud de 5(5nm.
que a ;44nm se encuentran interferencias con otros elementos
!a cuantificación de proteínas la %aría por el método de Biuret, es una muestra que muy probablemente posee la concentración en los c. ;*u& e4 e método m&4 4en4ibe ! e meno4 límites de detección 4en4ibe< ;=or qué<
!a sensibilidad de un método analítico mide la capacidad del método para diferenciar entre pequeas variaciones del analito se.n la CD1A# se define como la pendiente de la curva de calibración 1or lo tanto el método m-s sensible es el de Bradford, puede distin.uir menores diferencias de concentración y la pendiente de la curva de calibración es mayor en comparación del método de Biuret 'n consecuencia el método menos sensible es el de Biuret
rina
!a cuantificación de proteínas la %aría por el método de Bradford ya que, la presencia de nitró.eno en urea de la muestra crea interferencia, en el método de Biuret Durante a +urificaci/n enzim&tica
!a cuantificación de proteínas la %aría por el método de Bradford porque, es el método m-s sensible ideal para una muestra delicada y escasa Adem-s el calentamiento al que se debe someter la muestra en el método de Biuret podría desnaturali$ar las en$imas
d Decide qué método de determinaci/n de +roteína4 ee#iría4 +ara a cuantificaci/n de +roteína4 en> 4uero, orina, durante una +urificaci/n enzim&tica, en un e8tracto bacteriano concentrado, en +re+aracione4 de $n +re+aracione4 de membrana4 +a4m&tica4 membrana4 +a4m&tica4 4oubiizada4 con 4oubiizada4 con ?D? ! en +re+aracione4 de ?D?, en +re+aracione4 de membrana4 membrana4 mitocondriae4 4oubiizada4 con mitocondriae4 4oubiizada4 con @riton A @riton A100 !a cuantificación de proteínas la %aría por el 100. Cu4tifique 4u re4+ue4ta
método de Biuret ya que, el método de Bradford presenta interferencia con deter.entes
?uero ! e8tracto bacteriano concentrado
*. Concls!ones # !a concentración real de la muestra anali$ada por el método de Bradford es menor !as desviaciones de la curva de calibración .eneran un aumento de la concentración a la %ora de reali$ar la interpolación con la absorbancia obtenida
1 ada la sensibilidad de los dos métodos era de esperarse que la concentración de la muestra anali$ada por el método de Bradford tuviera una concentración menor que la muestra anali$ada por el método de Biuret
; #uando se presentan limitaciones en la cantidad de muestra disponible, el método de Biuret es una buena opción para reali$ar procedimientos de cuantificación de proteínas
CBAK'L #, Mor.e7 ?ACE'R+ ?, Rosa7 +RCA S, ?aría del #armen '/perimentos de química en microescala para nivel medio superior Dniversidad Cberoamericana ?é/ico, 344* 1-.s 3*5,3*3
Re+erenc!as
+!CN'R, Mordi7 R+#A, 1ilar7 R+RC2D'L, Ana ?aría BC+ODC?C#A, G'#EC#AS ?'G++S 'ditorial Pélice 'spaa, ?adrid, 344; 1-. 50
#'S1+E R+?'R+, Rosa ?aría 'SARR+!!+ ' ?FG++S AEA!HGC#+S ADG+?IGC#+S 1ARA !A 'G'R?CEA#CJE ' ?'GA!'S 'E '! ?'C+ A?BC'EG' !AB+RA! Dniversidad de Santia.o de #ompostela 'spaa, Santia.o de #ompostela, 3448 1-. 500
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