“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA”
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA
INFORME N°5 IDENTIFICACIÓN DE HONGOS MEDIO AMBIENTALES y CULTIVO EN CÁMARA HÚMEDA Integrantes: 20111360 20091001 20120456 20100472
Colquehuanca Mejía, Eliana Elsye Flores Calderon, Elvis Hedim Norabuena Damian, Juan Bernardo Tantahuillca Landeo, Pat Teresa
Mesa N°5 Grupo: Miércoles de 3 a 5 pm
2013
I.
INTRODUCCIÓN Se sabe que el hongo es un organismo que prospera en diversos ambientes, incluyendo el aire e interiores. Y este se desarrolla mejor en condiciones cálidas, mojadas y húmedas, también se propaga y reproduce por esporas, las cuales sobreviven en condiciones ambientales que no favorecen el crecimiento normal de hongo, permaneciendo dormantes hasta que las condiciones ambientales se tornen favorables. Algunas personas son sensibles a los hongos debido a las toxinas que estas liberan, su exposición a estas personas puede causarle síntomas como congestión nasal, irritación de los ojos o hasta reacciones más severas para las que tengan graves alergias. Al interior de la casa, el crecimiento del hongo puede ser disminuido manteniendo los niveles de humedad por debajo del 50% y ventilando las áreas por donde se circula. Esto ya que el aire es el medio de diseminación tanto de hongos como de otras sustancias que a la vez pueden estar cargadas de diversos grupos de microorganismos. Para esta práctica anteriormente se aislaron muestras de diversos ambientes en el hogar como la cocina, los cuartos, el baño y también del bus en el que se viaja. Cada placa Petri con agar sabouraud fue incubada por 1 semana aproximadamente, posteriormente se identificaron los hongos presentes en cada una. Se encontró que en su mayoría existen los hongos de tipo Aspergillus sp y Penicillium sp.
Adicionalmente se realizó un cultivo en cámara húmeda a partir de los hongos obtenidos en las placas, para poder hacerle un seguimiento sobre su desarrollo vegetativo.
Objetivos:
Determinar los géneros de hongos más frecuentes presentes en el medio ambiente.
Mediante la observación macroscópica, establecer características típicas para poder reconocerlas en adelante.
Determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a través de un cultivo en cámara húmeda y mediante observaciones periódicas al microscopio
II.
MARCO TEÓRICO Los hongos: Son hongos filamentosos que se encuentran en aire libre como en interiores, existe desde hace miles de años. El moho crece mejor en condiciones cálidas, mojadas y húmedas, se propaga y reproduce mediante esporas. Estas pueden sobrevivir en condiciones ambientales desfavorables como la resequedad, que no beneficien el crecimiento normal del moho. Algunas personas son sensibles a los mohos. La exposición a los mohos puede causar síntomas como congestión nasal, irritación de los ojos o resuello. Las reacciones severas pueden ocurrir entre trabajadores expuestos a grandes cantidades de mohos en los lugares de trabajo, como en el caso de los granjeros que trabajan todo el día alrededor del heno mohoso. Algunas reacciones severas pueden incluir fiebre y dificultad para respirar. Las personas con enfermedades crónicas, como enfermedad obstructiva de los pulmones, pueden presentar infecciones de moho en los pulmones. Los mohos se encuentran en diversos ambientes y pueden ser detectados, tanto en interiores como al aire libre, durante todo el año. Las condiciones húmedas y cálidas favorecen el crecimiento del moho. Al aire libre pueden encontrarse en áreas o lugares húmedos sombreados donde hay descomposición de hojas o de otro tipo de vegetación. En los interiores pueden encontrarse en lugares donde los niveles de humedad son altos como los sótanos o las duchas. Los tipos más comunes de mohos son Cladosporium sp, Penicillium sp, Aspergillus sp, Mucor sp y Aternaria sp.
A s p e r g i l l u s sp:
Este microorganismo es la causa más frecuente de “Aspergilosis” en humanos y animales. En individuos sin inmunocompromiso alérgeno
puede actuar como un potente
o causar infecciones localizadas de los pulmones. En pacientes
inmunocomprometidos (alteración del sistema inmunologico)
la inhalación de
esporas puede producir una aspergilosis invasora de los pulmones o de los senos paranasales
C l a d o s p o r i u m sp:
Este hongo con más frecuencia en el aire y uno de los hongos alergénicos respiratorios más importantes, se le implicado en casos de asma y fiebre. Se le asocia a los casos de rinitis en loso que los síntomas no parecen coincidir con la cantidad de polen de gramíneas.
No es un agente infeccioso importante, pero en climas cálidos, puede producir infecciones cutáneas, subcutáneas
y queratitis. Estas infecciones tienen un
desarrollo lento y su tratamiento incluye exeresis quirúrgica de los tejidos afectados. Penicillium sp:
La inhalación de esporas de Penicillium en concentraciones comparables a la de una exposición natural puede inducir asma en individuos sensibles. Los penecilos crecen sobre los alimentos, ya sea de origen vegetal o animal. Lo que causa alergias son las micotoxinas, estas consumidas regularmente, aun en cantidades mínimas, causan lesiones irreversibles en riñón, hígado, cerebro y tienen actividad teratogenica. Alternaria sp:
Este hongo una de más infecciosas
puede provocar lesiones cutáneas y
subcutáneas después de traumatismos en personas con inmunosupresión. Se han observado infecciones invasoras sistemáticas en pacientes con sida. Las lesiones cutáneas se curan espontáneamente con la mejora o la resolución de los factores subyacentes del enfermo. El tratamiento se basa en la administración intravenosa de concentraciones elevadas de anfotericina B-desoxilicato durante varias semanas.
Hongos en frutas y verduras: La mayoría de las frutas son sensibles a varias especies de hongos pero algunas de estas especies de hongos, pero algunas de estas especies afectan solo a una clase de fruta. En la práctica, los aspectos externos de los distintos tipos de lesiones son denominados enmohecimientos, son difíciles de diferenciar
Las principales formas de enmohecimientos y alteraciones que se producen son: Húmeda: producida por Rhizopus Seca: originada por Gleosporium y Sclerotinia Frutas de pepita (pera y manzadas): se debe a Fusarium, Botrytis,
o o o
o o
Alternaria Cladosporium, Penicillium. Amarga: Gleosporium , Trichotechium Roña o moteada: Venturia y Fusicladium
Método de aislamiento de hongos de aire: Es la forma más sencilla su aislamiento consiste:
Elegir un punto determinado del ambiente de estudio.
Destapar la placa Petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que las esporas de hongo se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 min, vuelva a tapar la placa , rotular el lugar de muestreo En el laboratorio incubar las placas en una estufa de 30ªC por 4 a 5 días. Transcurrido el tiempo, examine las placas y realizar una descripción, detallada de las mismas.
Una desventaja es que las UFC (Unidades Formadoras de Colonias) obtenidas no se pueden relacionar con el volumen de aire.
Método de cámara húmeda Un dispositivo para cultivo de cámara húmeda es un sistema esterilizado que consta de una placa Petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio en “U” que soporta dos laminas porta y cubre objetos. Asépticamente se secciona una pequeña porción de medio de cultivo estéril (agar sabouraud), y se coloca sobre la lámina porta objetos. Realizada la siembra del hongo en estudio, la preparación se cubre con otra lámina y el papel filtro se humedece conservando la asepsia. La placa es incubada a temperatura ambiente (20-25 °C) por 4 o 5 días. En la presente práctica se observara el crecimiento mitótico de los filamentos para solo 2 días después de la incubación.
Agar Sabouraud Este medio de cultivo es utilizado para cultivos de mohos y levaduras patógenas y no patógenas. Utiliza la peptona, la tripteina y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol, el pH es acido, de pH 5.6±0.2, inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y levaduras. El agar es un agente solidificante. Sus características:
Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogéneo, libre deslizamiento. Medio de cultivo preparado: color ámbar claro , ligeramente opalescente sin precipitado
III.
PARTE EXPERIMENTAL Ejercicio 1: Identificación de hongos medio ambientales Materiales.
Aislamientos de hongos medio ambientales en placas de agar sabouraud.
Procedimiento.Observación macroscópica 1. Observar el típico desarrollo de hongos en medio de cultivo. Cada una de las masas de forma definida que puede observar constituye una colonia. 2. Contra el número total de colonias que aparecen en cada placa. Se asume que cada colonia desarrollada proviene de una espora captada del aire. 3. Establecer los tipos morfológicos más saltantes entre las colonias presentes. Obtenerlos de acuerdo a la observación de las características externas en ellas (color, forma y aspecto de la colonia en el haz y envés de la placa). 4. Determinar la frecuencia de cada tipo morfológico con respecto al número total de colonias. 5. Describir cada tipo morfológico detallando color, forma, aspecto y cualquier otra característica saltante que se observe.
Observación microscópica 1. Observar en el microscopio compuesto en pequeño y mediano aumento las características de cada tipo morfológico. 2. Determinar en detalle los tipos de hifas presentes y las diferenciaciones de hifas en estructuras nutricionales, estructuras de reproducción, de resistencia, etc. 3. Con ayuda de un Manual de Identificación de hongos hacer una aproximación válida para determinar los géneros aislados. 4. Elaborar con detalle los esquemas correspondientes.
Ejercicio 2: Cultivo en cámara húmeda Materiales.-
Placas Petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.
Agua destilada estéril.
Dispositivo para cultivo en cámara húmeda.
Mechero de alcohol.
Procedimiento.1. Utilizando una aguja de kölle o estilete, picas una colonia y extraer una fracción mínima de esporas o micelio. 2. En forma aséptica depositar la fracción sobre la porción de agar dispuesta en el portaobjetos de la cámara húmeda. 3. Con ayuda de una pinza estéril cubrir cuidadosamente la preparación con la lámina cubre objetos. 4. Humedecer el papel filtro de la placa con agua destilada estéril. 5. Incubar la placa a temperatura ambiente (20 - 25 °C). 6. Examinar diariamente al microscopio de lámina sembrada hasta verificar el completo desarrollo del hongo. Retirar cada vez la lámina del cultivo de la cámara húmeda y una vez realizada la observación devolverla a su lugar cuidando de mantener la humedad constante, de ser necesario añadir más agua al sistema. 7. Observar la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificaciones del micelio, la aparición de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproducción. 8. Con ayuda de un Manual de Identificación de hongos determinar el género correspondiente. 9. Elaborar en detalle los esquemas de cada etapa de desarrollo.
IV.
OBSERVACIONES y RESULTADOS 4.1 Identificación de hongos medio ambientales
4.1.1
Observación macroscópica:
PLACA 1: Lugar de exposición: Dormitorio Tiempo de exposición: 15 minutos Tiempo de incubación: 7 días
Tipos morfológicos de las colonias presentes y sus características Número total 5 colonias Color Turquesa Verde petróleo Marrón amarillento Frecuencia 2 2 1 Forma Circular Circular Circular Aspecto Aterciopelado Aterciopelado Algodonoso
PLACA 2:
Lugar de exposición: Cocina Tiempo de exposición: 15 minutos Tiempo de incubación: 7 días
Tipos morfológicos de las colonias presentes y sus características Número total 45 colonias Color Verde petróleo Crema Frecuencia 2 43 Aspecto Aterciopelado Agamuzado Forma Circular Circular
4.1.2
Observación microscópica
PLACA 1 División: Género: Tipo de hifas: Tipo funcional: Tipo de estadío: G.A.:
Ascomiceto Penicillium sp Septadas Conidióforo Conidias 400X
PLACA 1 División: Género: Tipo de hifas: Tipo funcional: Tipo de estadío: G.A.:
Ascomiceto Aspergillus sp Aceptadas Conidióforo Conidias 400X
PLACA 2 División: Género: Tipo de hifas: Tipo funcional: Tipo de estadío: G.A.:
4.2 Cultivo en cámara húmeda
Día 04 de octubre:
a) Penicillium sp
Vista de 100X
Ascomiceto Cladosporium sp
Septadas Conidióforo Conidias 400X
Vista de 400X
b) Cladosporium sp
Vista de 100X
Vista de 400X
V.
DISCUSIONES 5.1 Identificación de hongos medio ambientales En la placa Petri con agar sabouraud se logró aislar hongos del medio ambiente más comunes encontrados en lugares como la cocina y el dormitorio de la casa, como se muestra en la figura 1.
Figura1. Placas Petri con agar sabouraud donde han crecido hongos
Para cada cepa identificada, se muestran características macroscópicas, microscópicas y el género. 5.1.1
Penicillium sp
a) Características macroscópicas: Las
colonias
presentaron
color
turquesa,
algo
aterciopelado y forma circular. Reverso incoloro a amarillo, pequeñas gotas incoloras.
b) Características microscópicas: Con conidios ramificados, terminantes en fiálides. Presenta conidióforos de tipo terverticilado. a.
b.
Figura 2. Penicillium sp. 2a. Penicillium sp macroscópicamente. 2b. Penicillium sp microscópicamente.
5.1.2 Aspergillus sp
a)
Características macroscópicas Las colonias se observaron de color marrón amarillento, de aspecto algodonoso y forma circular.
b)
Características microscópicas Conidióforos cortos, de paredes lisas con cabezas conidiales columnares. Fiálides aglomeradas, conidios globosos a subglobosos. a.
b.
Figura 3. Aspergillus sp.3a. Aspergillus sp macroscópicamente. 3b. Aspergillus sp microscópicamente. 400X.
5.1.3
Cladosporium sp
a) Características macroscópicas Las
colonias
presentaron
color
verde
petróleo,
aterciopeladas y de forma circular, en el centro presenta una elevación.
b) Características microscópicas Conidióforos
anchos
y
poco
ramificados.
Poseen
ramoconidios con septos. Los conidios tienen pared verrugosa. a.
b.
Figura 4. Cladosporium sp. 4a. Cladosporium sp macroscópicamente. 4b. Cladosporium sp microscópicamente
Se observaron muestras de diferentes géneros que a simple vista parecían iguales y otras nos, como se muestra en la figura 1; sin embargo, al microscopio éstas mostraban diferencias por lo que siempre es necesario un estudio detallado al microscopio. De necesitarse una clasificación evolutiva o taxonómica se requeriría de métodos de genética como la de secuenciación de bases. En la figura 2 se puede observar a colonias de hongos más comunes que pudimos identificar, estas son del genero de Penicillium sp, según Soriano (2007) esta especie es muy común en suelo, en vegetación en descomposición y aire. Además suele ser considerada como una de las principales especies causantes del biodeterioro de alimentos y otro tipo de sustratos. Se pudo observar que en ambas placas Petri crecieron hongos del género Cladosporium sp, por lo tanto se puede considerar esta especie como
cosmopolita, al igual que la otra especie muy común Aspergillus sp.
5.2 Cultivo en cámara húmeda El primer día de cultivo se pudo observar poco crecimiento, muy pocas hifas. En el segundo día ya se veía un aumento de hifas en el caso del Cladosporium estas eran septadas. Según Forbes y col. (2007) la velocidad de crecimiento de los hongos es importante para su identificación, pero este puede variar según la cantidad de inoculo presente en la muestra, así que es necesario utilizarla junto con otras características. De acuerdo con estudios realizados en Norteamérica y Europa, las esporas de Cladosporium están circulando en el ambiente todo el año. Sin embargo, la
concentración o la población es extremadamente baja durante el invierno. El crecimiento de las especies de Cladosporium son diferentes dentro de las casas y otros edificios depende de la concentración de los ambientes externos. La concentración también puede estar influenciada por las fuentes interiores del crecimiento.
VI.
CONCLUSIONES
Se logró demostrar que los hongos son organismos cosmopolitas ya que el muestreo se dio en diferentes lugares a diferentes horas y las colonias presentadas en las placas mostraban repeticiones de las mismas que al microscopio se reconocía que pertenecían al mismo género. El caso más frecuente fue Cladosporium sp. el cual presentaba coloración verde petróleo y Aspergillus sp que presenta color marrón amarillento.
Se demostró que la clasificación de hongos se basa en la observación de hifas, si estas son septadas o aseptadas; si presenta conidios o esporangios, la forma y el tamaño de estos; etc. Además si presenta esporangios, observar alguna zona que presente rizoide o no.
Se determinó que en el crecimiento vegetativo hay ausencia de órganos reproductivos, y al pasar los días el hongo presentará hifas vegetativas indiferenciadas en los extremos
VII.
BIBLIOGRAFIA
BONIFAZ, A. 1991. Micología médica básica. Editorial Méndez. 2a edición. México D.F.
FORBES, B., Sahm W. 2007. Diagnostico microbiológico. Editorial Médica Panamericana. 12a edición .España.
GRANDA, E. M. 2011. Pontificia Universidad Católica del Ecuador-PUCE, Evaluación del efecto de la presencia de hongos en la calidad del aire como causa del síndrome enfermo en las edificaciones antiguas de la PUCE. Ecuador. p 34-37. Consultado 8 de octubre del 2013. Disponible en http://www.puce.edu.ec/documentos/Investigacion/2011/PUCEInvestigacion-2011-BIO-Hongos-Calidad-del-aire-PUCE.pdf
SORIANO, J. M. 2007. Micotoxinas en alimentos. Ediciones Díaz de Santos. España.
Los mohos en el medio ambiente 2003, Department of Health and Human Services (en línea), EEUU, consultado 8 jun. 2013. Disponible en
http://www.cdc.gov/mold/es/pdfs/faqs.pdf
VIII.
CUESTIONARIO 8.1 De la observación de hongos del medio ambiente 1. Haga una descripción morfológica de 5 géneros de hongos del medio ambiente considerando las características de desarrollo en medio de cultivo y las características observadas al microscopio. Aspergillus: Presentan conidióforo corto, liso, vesícula con fiálides,
uniseriada, ocupando 2/3 de la vesícula. Los conidios en cadenas forman una compacta columna sobre la vesícula, son de color verde, finamente rugosos, globosos o subglobosos. La textura de las colonias es aterciopelada, afelpada, vellosa o algo plegada, con margen blanquecino o beis. El color inicialmente es blanco virando en aproximadamente siete días a un verde azulado por la producción de conidias. El reverso de la colonia es incoloro.
Fusarium: El color de las colonias es blanco, crema, pardo claro o pardo
rojizo mezcladas con zonas de color púrpura; raramente en cepas de aislamientos clínicos pueden presentar masas mucosas verdes azuladas, formadas por macroconidias que nacen de esporodoquios. La textura es algodonosa o lanosa. Se caracteriza por presentar conidióforos de esporodoquios cortos, ramificados. Conidióforos de hifas aéreas generalmente no ramificados, muy largos, reducidos a una simple fiálide más o menos cilíndrica, en cuyo ápice se puede encontrar un conidio no desprendido. Macroconidias en masas mucosas, hialinos, mayormente con tres septos, ligeramente curvados, fusiformes, pero con extremos más o menos redondeados.
Mucor : El color de las colonias es blanquecino al inicio, con el tiempo
cambia a marrón. El reverso de la colonia es blanquecino. La textura es algodonosa. Presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por presentar esporangióforos, esporangios. Carecen de apófisis, estolón y rizoides. Las columnillas son hialinas, siendo visibles si el esporangio se encuentra intacto. Los esporangios son esféricos o redondos y de color gris a negro, estando llenos de esporas.
Rhizopus: Inicialmente son blancas pero luego cambian a gris parduscas.
El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los esporangióforos no son ramificados, tienen una longitud de 2 mm, generalmente están en grupos, formando verticilos en cuya base se sitúan los rizoides. Las apófisis pueden estar presentes pero son poco evidentes. Presentan esporangios esféricos, los cuales son de color gris pardusco a negro. La columnilla es subesférica. Las esporangiosporas son angulares y con estrías longitudinales, grisáceas, subesféricas o elipsoidales.
Penicillium: Este género se caracteriza por formar conidios en una
estructura ramificada semejante a un pincel que termina en células conidiógenas llamadas fiálides. En la figura 5.1 se esquematizan los tipos de conidióforos del género Penicillium, cuyas ramificaciones se ubican formando verticilos. Si hay sólo un verticilo de fiálides el pincel es monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poliverticilado son ramas,
rámulas, métulas y fiálides. Los conidios generados en fiálides suelen llamarse fialoconidios para indicar su origen. En la fiálide, al dividirse el núcleo, se extiende simultáneamente el extremo apical que luego se estrangula separando a la espora recién formada. Se llama conectivo a la porción de pared que une entre sí a los conidios permitiendo la formación de cadenas, y en algunas especies se aprecia claramente con el microscopio óptico. Las colonias de Penicillium son circulares si no hay impedimento alguno para su crecimiento, con un borde neto muchas veces sin fructificación y mostrando el color del micelio. Éste es generalmente blanco, pero en algunas especies es amarillo, anaranjado, púrpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura, o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con pequeños haces (fascículos) de conidióforos. En unos pocos casos los haces miden varios milímetros (coremios) con el extremo constituido por las cadenas de esporas.
2. Los nombres genéricos de muchos hongos son derivados de características morfológicas. ¿De cuáles derivarán los nombres de Penicillium , A s p e r g i l l u s y R h i z o p u s ?
El primero deriva de “ penicillius”, que significa “pincel” en latín, ya que la estructura fructífera asume esta forma. El segundo fue dado por el sacerdote y biólogo italiano Pier Antonio Micheli, quien al ver la estructura reproductiva del hongo le pareció un hisopo de los usados para salpicar agua bendita. Estos, en latín, se llaman “ aspergillus”, sustantivo que proviene del verbo latino “ spargere”, que significa “esparcir, salpicar”. El tercero se llama así ya que en griego “ρήιζω” es “raíz”, en referencia a las “raíces” de este hongo .
3. ¿Por qué razón algunas de las colonias aisladas del medio ambiente no desarrollan esporas en el medio de cultivo utilizado? Porque el agar muchas veces satisface las necesidades nutritivas del hongo, por lo que este se extiende de manera vegetativa. Este comportamiento se puede entender considerando que la producción de esporas es un proceso altamente energético y de dispersión, por lo que mientras haya nutrientes necesarios y suficientes, se priorizará el crecimiento vegetativo.
8.2 Cultivo en cámara húmeda
1. ¿Cuál es la ventaja del empleo de la cámara húmeda en el cultivo de hongos? Permite aislar pequeñas cantidades de hongos para separarlos y proceder a su identificación a través de la observación de las estructuras vegetativas, que al ser pocas son más fáciles de observar; a la vez que se exigió el crecimiento de cuerpos fructíferos y las estructuras reproductivas se observaron con mayor claridad.
2. ¿Existen diferencias entre los hongos a nivel de crecimiento y diferenciación del micelio? Sí, ya que no solo se distinguen entre especies, si no que entre grupos se puede observar diferente tipo de colonización. Los basidiomicetos desarrollan la mayor complejidad al formar estructuras erguidas y altamente especializadas. Dependiendo de la estructura del micelio, se puede asignar el espécimen a un orden taxonómico.
