IMUNOHISTOKIMIA PENGERTIAN Definisi imunohistokimia
Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Prinsip imunohistokima
prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan antibodi dan histomenunjukkan jaringan secara mikroskopis. Tujuan Imunohistokimia
untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup. Manfaat imunohistokimia
Teknik imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. Dalam melakukan iminohistokimia, terdapat 4 metode yaitu: Metode Direct
Prinsip dari metode imunohistokimia direct adalah menggunakan antibodi primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung. Metode langsung (direct method) merupakan metode pengecatan satu langkah karena hanya melibatkan 1 jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) atau rodhamin Pada metode direct, antibodi spesifik yang meng enali antigen jaringan akan dimodifikasi dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibod i tersebut. molekul indikator tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enzim peroksidase, sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut.
Metode Indirect Prinsip metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari antibodi primer. Metode tidak langsung (indirect method) menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel) dan antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer bertugas mengenali antigen yang d iidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi kedua merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan penambahan substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan senyawa tertentu. Penggunaan kromogen fluorescent dye seperti FITC, rodhamin, dan Texas-red disebut metode immunofluorescence, sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase disebut metode immunoenzyme. Pada metode ini antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai an tibodi primer dan tidak dilakukan modifikasi pada antibodi ini. Namun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan dengan antibodi primer yang disebut dengan antibodi sek under. Antibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Setiap 1 antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah d iberikan substrat akan terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut.
Metode Peroxidase – anti anti – Peroxidase Peroxidase (PAP) Adalah analisis imunohistokimia menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi yang membentuk seperti roti sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadap antigen (enzim) untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses kimia terkonjugasi Fitur unik dari prosedur ini adalah larutan enzim enzim – – antibodi antibodi dan kompleks imun PAP. Enzim Horseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik spesies tertentu dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim. Antiserum ini dipanen dan ditempatkan dalam larutan pada enzim sehingga membentuk kompleks imun yang larut.
Metode Avidin-Bioti Avidin-Biotin-Complex n-Complex (ABC) Adalah metode analisis imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan b eberapa biotin dalam molekul avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target.
A. Pembuatan paraffin block 1. Jaringan dicuci dengan PBS 2. Difiksasi dengan formalin 10% 3. Dilakukan dehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolute) 4. Clearing menggunakan xilol 2 kali, masing-masing 60 menit. 5. Infiltrasi menggunakan paraffin lunak selama 60 menit pada suhu 480C. 6. Block dalam paraffin keras pada cetakan dan diamkan selama sehari. 7. Tempelkan. Pada holder dilakukan pemotongan setebal 4-6 mm dengan rotary microtome. 8. Mounting pada objek dengan gelatin 5% B. Proses deparafinisasi
1. Slide direndam xilol 2 kali, masing-masing selama 5 menit. 2. Rehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolute) masing-masing 5 menit 3. Bilas dengan dH2O selama 5 menit
C. Proses imunohistok imunohistokimia imia terhadap eNOS 1. Slide preparat dicuci dengan PBS pH 7,4 2. Aplikasikan 3% h2o2 (daco, Inc) selama 10 menit. 3. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali 4. Blocking menggunakan serum 2% BSA (Sigma USA) selama 60 menit (1%) 5. Inkubasi dengan antibody primer mouse monoclonal vcam-1 human absorbed semalam pada suhu 40C (1:100) 6. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali 7. Tetesi dengan anti body sekunder berlabel biotin (Santa Crus) dan inkubasi selama 1jam(1:200 8. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali 9. Tetesi dengan SA-HKP (Strep Avidin horse radis peroxidase) (Dako,Inc) selama 40 menit (1:500) 10. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali 11. Aplikasikan cromogen untuk HRP yaitu DAB (Diamono Benzidine) (Daco,Inc) 12. Bilas dengan H2O 13. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali 14. Counter straining dengan mayer Hematoxilen (lab Vision) selama 10 menit 15. Cuci dengan tap Water 16. Kering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta cover Glass
D. Pembuatan media Larutan PBS 1. Na H2 PO4 2 H2O 2,4 gram 2. Na2HPO4 1,2 gram 3. KH2PO4 0,7 gram 4. KCI 6,8 gram
Pembuatan 1. Dilarutkan ke 4 bahan tersebut dengan aquadest sampai 1 L 2. Diletakkan di atas magnetic stirrer agar homogen 3. Diukur pada pH 7,4 dan disterilisasi 4. Simpan disuhu dingin 5. Jika ingin diencerkan, ambil 100 cc, tambahkan 900 mL Aquades
Cara kerja Imunohistokimia Hari pertama 1. Deparafinisasi a. Teteskan Xylol 2×10 menit b. Teteskan ethanol absolute 1×5 menit c. Teteskan ethanol 90% 1×5 menit d. Teteskan ethanol 80% 1×5 menit e. Teteskan ethanol 70% 1×5 menit f. Teteskan Sterile aquades 3×5 menit 2. Slide siap untuk dilakukan Imunohistokimia : a. Dicuci PBS steril 3×5 menit b. Dikeringkan dengan tissue c. Ditambah H2O2 3% dalam methanol inkubasi 15 sampai dengan 20 menit d. Dicuci PBS steril3x5 menit 3. Blocking unspesifik protein : a. Ditambah 0,255 triton-x100 dalam blocking buffer BSA selama 1 jam pada suhu ruang b. Dicuci dengan PBS steril 3×5 menit 4. Inkubasi antibodi primer : a. Ditambah antibodi primer dalam blocking buffer BSA b. Inkubasi semalam pada 4°C c. Dicuci PBS steril 3×5 menit
Hari kedua 1. Inkubasi antibodi sekunder : a. Ditambah antibodi sekunder kit, inkubasi 60 menit pada suhu kamar (walapun menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya) b. Dicuci PBS steril 3×5 menit 2. Inkubasi SAHRP : a. Ditambah SAHRP kit, inkubasi 40 menit pada suhu kamar b. Dicuci PBS steril 3×5 menit c. Dicuci akuades steril 3×5 menit 3. Aplikasi kromagen DAB (dipilih DAB karena lebih awet) : a. Ditambah (DAB :buffer DAB = 1:50), inkubasi 20 menit pada suhu kamar b. Dicuci PBS steril 3×5 menit diaminobenzidine 4. Counterstain dengan mayer hematoxilen : a. Ditambah (mayer : tap water =1:10), inkubasi 5-10 menit pada suhu kamar b. Dicuci tap water steril 3×5 menit c. Dikeringkan anginkan 5. Mounting dengan entellan kemudian diangin-anginkan 6. Amati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskop
Aplikasi Imunohistok Imunohistokimia imia Imunohistokimia dapat digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit, seperti kanker, tumor dan dapat digunakan untuk identifikasi sel atau jaringan. Contoh penyakitnya yang dapat dideteksi dengan Imunohistokimia adalah adenocarcinoma, carcinoma, sarcoma, Hodgkin’s disease, tumor yolk sac, karsinoma hepatoselluler, gastrointestinal stromal tumors (GIST), renal cell carcinoma, acute lymphoblastic leukemia, Identifikasi sel B dan sel T limfa. Masalah-Masalah Dalam Teknik Imunohistokimia 1. Pengolahan jaringan Pengolahan jaringan dilakukan secara sempurna tahap demi tahap melalui alkohol yang bertingkat kadarnya dan impregnasi dalam paraffin dengan titik leleh maksimum 600C. Pengolahan jaringan yang tidak sempurna dapat menghambat proses pulasan karena jaringan yang tidak homogen dalam paraffin mudah terlepas dari kaca benda. Mudahnya jaringan terlepas dari kaca benda disebabkan karena pada proses pulasan, dilakukan prosedur “antigen retrieval” yaitu pemaparan terhadap gelombang elektromagnetik atau pemanasan; serta pemaparan dengan larutan-larutan yang keras sifatnya, dimana tahapantahapan ini tidak dilakukan pada prosedur pulasan hematoksilin eosin yang rutin.
2. Fiksasi Fiksasi sangat penting peranannya, karena teknik ini bertumpu pada reaktifitas antigen dalam sel. Fiksasi yang suboptimal dapat menurunkan bahkan meniadakan reaktifitas antigen, sehingga memberikan sinyal yang lemah atau negative palsu 3. Quality control” dan “Quality assurance” Berbagai faktor menyebabkan perbedaan hasil pemeriksaan, antara lain jenis antibody, metode “antigen retrieval”, factor-faktor preanalitik dan interpretasi hasil. Untuk menekan perbedaan ini dianjurkan melakukan “quality control” dan “quality assurance. 4. Nilai cut off Walupun sedikit, variasi dalam penggunaan nilai cut off masih dilaporkan. Namun berbagai penelitian, untuk berbagai petanda lazimnya digunakan nilai cut off 10% 5. Tempat pemeriksaan Teknik ini relative mudah dalam arti prosedurnya sederhana, namun diperlukan kecermatan yang tinggi dalam pelaksanaannya pada setiap tahap. Di United State Kingdom, dianggap bahwa laboratorium yang ideal adalah yang melakukan tes minimal 250 kasus dalam 1 tahun. Laboratorium lokal yang ingin melakukan tes ini sangat dianjurkan untuk melakukan “quality assurance. assurance.
Contoh hasil pemeriksaan Histokimia
Gbr 1.
Immunohistochemistry terhadap Vasculoendothelial Growth Factor (VEGF): positif sedang sampai kuat pada 90% sel-sel tumor
Gbr 2.
Immunocytochemistry terhadap CD20: positif kuat pada kurang dari 20% sel-sel tumor
Gambar 1. Fotomikrograf preparat histologis ginjal dengan pewarnaaan imunohistokimia untuk mendeteksi kandungan Cu, SOD (superoksida dismutase) (a) Perbesaran 100x, (b) Perbesaran 200x dan (c) Perbesaran 400x.
Kesimpulan Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selanjutnya dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim, isotop, fluoropore,atau coloidal gel. Metode yang dilakukan dalam Imunohistokimia adalah metode direct, metode indirect, Metode Peroxidase – Peroxidase – anti – anti – Peroxidase Peroxidase (PAP), Metode Avidin-Biotin-Complex (ABC). Mekanisme Imunohistokimia dimulai dengan pengambilan sampel lalu pembuatan paraffin block. Setelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Teknik Imunohistokimia dapat digunakan untuk deteksi berbagai jenis kanker, tumor, Hodgkin’s disease, identifikasi sel B dan sel T dan dapat digunakan pada jaringan kuda laut untuk mengetahui aktivitas proteinnya.
