Guia Prac Fisiologia Humana 2013 - i upsjb

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6. Datos de reactividad 7. Procedimientos para derrames, fugas y desecho 8. Información de protección personal. 9. Precauciones especiales y comentarios

Manejo de Animales La mejor manera para aprender a manejar correctamente los animales de laboratorio es la instrucción práctica directa. directa. Pueden enunciarse enunciarse aquí algunos principios generales. generales. El personal de laboratorio puede recibir de casi todos los animales (conejos. cobayas. ratones)., pequeños arañazos cuando el animal trata de escapar; pero raras veces intenta éste lesionar al operador. En el caso de las ratas, las cosas cambian; pueden realizar muchos esfuerzos para escapar. y producir mordeduras peligrosas, También También los monos deben manejarse con cuidado. En cualquier caso, es indispensable indispensable que aun los pequeños arañazos de animales se traten en forma adecuada; si el animal ha sido inyectado con material patológico la naturaleza de dicho material material puede obligar a tomar ciertas medidas para proteger al personal contra las consecuencias de la mordedura. Por lo tanto, debe reportarse de inmediato, y tratarse médicamente médicamente cualquier lesión, por pequeña que sea. Toma de Muestras de Sangre La muestra de sangre para las pruebas p ruebas de laboratorio pueden tomarse en diferentes sitios: capilar o periférica, venosa y ocasionalmente arterial. Esta muestra se utiliza para la valoración de diversos parámetros del medio interno que puede llevarse a cabo en sangre completa o una fracción de la misma. sea plasma o suero. Si la muestra sanguínea no se recoge con una técnica adecuada puede ocurrir que los exámenes proporcionen información inexacta inexacta o incorrecta ó bien que la muestra se rechace y sea necesario repetir la punción. Deben tomarse precauciones en todos los casos por lo que la obtención y manipulación de las muestras se harán con guantes quirúrgicos descartables.. Sangre Capilar o Periférica La sangre que suele llamarse capilares, al menos parte arteriolar se obtienen por o general de: a). La yema del dedo; b). el borde del lóbulo de la oreja; y c). el talón en los niños pequeños En cualquier de estos sitios el área debe de estar tibia (ni fría ni congestionada) ya que de otra manera la composición de la sangre varia por la éxtasis o la dilución. dilución. Sin embargo debe recordarse que que aun ejecutando una una buena toma, los valores de los parámetros difieren entre la sangre capilar y la venosa. Usar alcohol y lancetas descartables. TECNICA 1. Limpie la piel con una torunda de algodón con alcohol de 70º o con otro desinfectante desinfectante adecuado y deje secar. 2. Haga una punción profunda (2- 3 mm con una lanceta o aguja estéril desechable. La punción debe efectuarse de un golpe y rápidamente para que resulte casi indolora (sobre todo el borde del d el lóbulo de la oreja). 3. La primera gota de sangre se elimina por que contiene desechos tisulares. La sangre no debe exprimirse o se obtendrá una muestra diluida; peso sí puede hacerse presión a d istancia del sitio de la punción. Tras concluir la toma de la muestra se entrega al paciente una torunda limpia que debe presionar sobre el el sitio de lesión. lesión. SANGRE VENOSA Por lo general se utiliza una de las venas de las fosas ante cubitales, pero con frecuencia también se puncionan las venas de las manos las muñecas o cualquier vena visible de buen calibre (en los pacientes prematuros es posible punzar las venas del cuero cabelludo ó la yugular externa o la femoral) Las venas





























muestra y las de mayor grosor se reservan para la obtención de sangre para transfusiones). transfusiones).

TECNICA 1. El paciente debe estar acostado o sentado cómodamente y con el brazo apoyado en una mesa o soporte. Algunas pacientes – en especiales los jóvenes – pueden sufrir malestar o incluso desmayarse. Por tanto manténgase alerta ante señales como palidez o piel fría. 2. Coloque el torniquete con un medio lazo para poder retirarlo fácilmente. fácilmente. No efectué demasiada presión ya que puede detener la circulación circulación arterial. arterial. 3. Pida al paciente que abra y cierre el puño un par veces para obtener obtener mayor distensión de las venas. venas. Algunas veces las venas no se ven con claridad pero se palpan. 4. Una vez elegido el sitio de punción se procede a limpiar con alcohol y se deje secar. Enseguida se fija la vena sosteniendo el brazo del d el paciente con la mano mientras se estiran y comprimen con el pulgar y los tejidos blandos situados justo debajo del escogido para punzar. La jeringa se sujeta entre el pulgar y los tres últimos dedos de la otra mano y sus dorsos se apoyan con el brazo del paciente. El dedo índice se coloca sobre el casquillo de la aguja y sirve como guía. E l bisel de la aguja debe quedar hacia arriba. 5. Cuando la vena es prominente se punza en forma directa con la aguja colocada horizontal y dirigida en paralelo a la vena. Al perforar la pared se percibe una sensación de crujido. Cuando el acceso a la vena no es tan perceptible, la punción se efectúa en dos tiempos: primero se punza la piel y luego la vena. Para que la sangre entre a la jeringa se hace una tracción ligera sobre el embolo evite realizar una tracción excesiva porque la vena puede contraerse e impedir el paso de la sangre hacia la jeringa. Algunas veces al puncionar se traspasa la vena; entonces debe retirarse ligeramente la aguja al verificar la entrada de la sangre. Esta operación puede producir hematomas; si se advierte señales de extravasación de sangre a los tejidos, retire la aguja de inmediato y aplique presión local. 6. Antes de retirar la aguja, quite el torniquete y pida al paciente que abra el puño. En cuanto se adquiera la destreza necesaria, esta última operación se efectúa cuando la sangre termina de entrar a la jeringa. El paciente debe mantener la presión con una torunda en el sitio de la punción y el brazo flexionado flexionado durante unos minutos minutos para evitar evitar hematomas. 7. Tras la obtención de la sangre, se retira retira la aguja de la jeringa con una pinza de metal y con un movimiento de torsión y con la ayuda de otra pinza se coloca el extremo del embolo sobre la pared interna del tubo. Nunca Nunca realizar el reenfundamiento reenfundamiento de la aguja sin pinzas. La sangre se vacía vacía suavemente para evitar que se forme espuma y produzca hemólisis. Si la determinación que se va efectuar exige sangre completa o plasma la muestra se coloca con un tubo con anticoagulante y se invierte con suavidad varias veces para mezclar. Si en cambio se desea obtener suero, la sangre se coloca en tubo, de preferencia de 37 ª C para que el coágulo se forme más rápido. La retracción del coágulo puede acelerarse separando de la pared del tubo con un aplicador de madera. Es imperativo usar destructores de agujas en todos los casos.





























Los cuatro anticoagulantes mas usados son una mezcla de oxalato amoniaco y potasio, citrato trisodico, Sequestrene (EDTA) y heparina. Los tres primeros impiden la coagulación al sustraer el calcio de l plasma sanguíneo por precipitación o fijación en forma no ionizada, e inhibe la activación de los factores de la coagulación. El citrato trisodico se utiliza para impedir la coagulación de la sangre destinada a transfusiones. El Sequestrene y la heparina pueden servir para el mismo fin, pero no la mezcla de oxalatos porque es toxica. La mezcla de oxalato de amonio y (6partes) y oxalato potasio (4partes) en la cantidad de 2 mg/ml de sangre no afecta el volumen globular medio y puede usarse para hemoglobina, hematocrito hematocrito y recuentos globulares. En frotis de sangre su utilidad esta limitada a los primeros minutos por que se desarrollan con rapidez formas dentadas en los hematíes, vacuolización en el citoplasma de los granulocitos y artefactos en los núcleos de linfocitos y monocitos y otras deformidades. Asimismo, la sangre tomada con esta mezcla de anticoagulantes anticoagulantes no puede emplearse emplearse para determinados determinados químicas de nitrógeno ni potasio. El citrato trisódico en solución acuosa al 3.8%, se mezcla a razón de 1/9 con sangre para investigaciones de coagulación. El Sequestrene Sequestrene (EDTA) se emplea en una concentración concentración de 1 a 2 mg/ml mg/ml de sangre. La sal di sódica o di potásica de Etilendiaminotetracetato es tal vez el anticoagulante que mas se emplea para el recuento de las células sanguíneas. Hay que mezclarlo minuciosamente con la sangre. Para el estudio del hematocrito es equiparable al oxalato y para estudios morfológicos lo supera, ya que impide la deformación y artefactos incluso después de un reposo prolongado. Se consiguen frotis aceptables aun cuando hayan pasado 2 o 3 hs y hasta 24 hs si la sangre se se refrigera. También es es posible realizar el recuento recuento de plaquetas aun después de unas pocas horas. La heparina, a razón de 0.1 a 0,2 mg/ml de sangre, no afecta el tamaño corpuscular ni el hematocrito. Es el mejor anticoagulante para prevenir la hemólisis y para las pruebas de fragilidad osmótica. No resulta satisfactoria satisfactoria para recuentos de leucocitos o cuando han de prepararse frotis (o extensiones de sangre por que en este segundo caso produce un fondo azul en las preparaciones teñidas con el colorante de Wright.

CUIDADO, INOCULACIÓN Y SANGRIA DE LOS ANIMALES y DIAGNOSTICO DE SUS ENFERMEDADES Fundamentos 1. Para determinadas investigaciones de laboratorio fisiológico es indispensable disponer de los animales apropiados. 2. Los animales habrán de ser sanos y seleccionados con cuidado y estar instalados con limpieza y comodidad, así como adecuada y suficientemente suficientemente alimentados. 3. Pocos métodos de inyección y sangría producen mayor dolor que los similares empleados en los seres humanos, y todos los métodos operatorios de importancia habrán de efectuarse con el animal anestesiado. Por otra parte estos animales habrán de ser tratados con la solicitud que merecen por los servicios que prestan a la humanidad .





























IDENTIFICACION DE LOS ANIMALES Es conveniente adoptar un sistema seguro para la identificación identificación de los animales .La practica de rotular las jaulas sirve para la distinción de los lotes numerosos de animales aun cuando para conseguir un registro completo conviene numera a cada animal y anotar los detalles relativos al sexo, descripción, etc. Chapas. Para los conejos y cobayos pueden emplearse unas pequeñas chapas de aluminio aluminio que se fijan a una oreja de animal por medio de una grapa o un hilo metálico que perfore estos órganos y atraviese también los orificios de las chapas. Para los animales de mayor tamaño pueden adquirirse adquirirse identificadores especiales especiales ..Pueden obtenerse en las casas de artículos veterinarios. Descripción. Cuando se use únicamente este método de identificación identificación y haya que alojar juntos en una misma jaula varios animales, deben seleccionarse los que presenten señales o colores diferentes .Para facilitar el registro debe disponerse de sellos de goma goma con dibujos de ratón , cobayo o conejo. conejo. Este método se utiliza utiliza junto con el de la chapa metálica a fin de asegurar la identificación identificación si la chapa se perdiera. Asimismo, debe anotarse anotarse cuidadosamente cualquier deformidad deformidad o seña particular .El sexo debe registrarse en la descripción (macho y hembra). Señales o marcas para identificación de animales Los animales pequeños, como ratones y ratas, ratas, pueden marcarse en el cuerpo o en la cola pintándose la piel y el pelo con colorantes (soluciones alcohólicas saturadas de fucsina o ácido pi crico).Las jaulas habrán de rotularse.

PREVENCION Y TRATAMIENTO DE LOS ACCIDENTES EN LOS LABORATORIOS DE FISIOLOGIA Las personas que trabajan en los laboratorios fisiológicos se hallan rodeadas de múltiples peligros, peligros, de modo especial a causa de las infecciones que pueden contraer durante el manejo de los animales de experimentación, ó durante el trabajo mismo con ellos como actos quirúrgicos, exposición de órganos, u otros trabajos que así lo demanden los experimentos experimentos fisiológicos, ó al manipular manipular productos sépticos durante las investigaciones investigaciones o sufrir quemaduras quemaduras o la deglución accidental accidental productos biológicos ó producirse a heridas consecutivas rotura de cristales cristales ,etc. A estos peligros peligros están principalmente expuestos los investigadores poco poco experimentados que que los ignoran o se entretienen entretienen o distraen mientras trabajan trabajan con animales de experimentación experimentación ó con productos infecciosos. ó con ácidos, álcalis, etc.

PREVENCION DE LOS ACCIDENTES Deben emplearse siempre guantes de goma descartables descartables en los experimentos, el investigador ha de tener





























Las pipetas, tubos de ensayo y demás instrumentos empleados en la experimentación experimentaci ón fisiológica también se desinfectarán con una solución lisol o tricresol al 2 por 100, o se esterilizarán inmediatamente por ebullición durante 20 minutos minutos o autoclave autoclave que es lo lo ideal. Los recipientes, láminas portaobjetos u otro material contaminado con orina ò heces ò secreciones biológicas de los animales, ò contaminados con productos biológicos humanos, no se volverán a tocar por ningún concepto sino que se someterán a un proceso de desinfección inmediata, como hemos indicado líneas más arriba Los calentadores y demás aparatos eléctricos se comprobarán con frecuencia para verificar la exactitud de su funcionamiento, funcionamiento, reparando sin pérdida de tiempo sus averías a fin de evitar cortos circuitos incendios .El mechero de Bunsen no debe utilizarse utilizarse nunca en la proximidad de materias inflamables .Siempre .Siempre se verificara que la llave de mechero quede bien cerrada cerrada antes de retirarse retirarse del Laboratorio Laboratorio , igualmente se asegurará de cerrar la llave del balón contenedor del gas ó la llave general del gas del Laboratorio de ser el caso. El éter, el alcohol y similares deben mantenerse alejados de todo posible contacto eléctrico. Es obligación del servicio de mantenimiento realizar revisiones revisiones periódicas de mantenimiento preventivo. preventivo.





























membrana membrana celular tiene propiedades bien establecidas: Solo deja entrar las sustancias que se necesitan y solo deja salir las secreciones, los productos de desecho y las sustancias no indispensables, en otras palabras, es semipermeable. semipermeable. Estas funciones las realiza a través de diversos mecanismos, que hemos revisado con detalle en las clases teóricas. En la presente práctica trataremos de una de ellas que es la Osmosis. En general la osmosis significa el paso de líquidos y solutos a través de una membrana semipermeable. Cuando dos soluciones de diferentes concentraciones están separadas por una membrana semipermeable, el solvente y los solutos atraviesan la membrana membrana siguiendo las leyes de que rigen el fenómeno de la ósmosis. El agua es transportada a través de la membrana celular por una fuerza hidrostática llamada presión osmótica, dicho de otro modo, la presión osmótica es la fuerza de atracción que ejercen las partículas partículas sobre el agua atrayéndola .La osmolaridad osmolaridad depende del número número de partículas partículas que se encuentran encuentran es solución .La Unidades de Osmolaridad son el Osmol /Kg H2O , en medicina usamos el sub múltiplo mili Osmol /Kg H20 Un Osmol por Kg es la fuerza para atraer agua que ejerce un MOL de partículas que se encuentran en 1 Litro ó Kg de solución. solución. Cada partícula partícula (átomo) ejerce una presión osmótica independientemente; independientemente; por ejemplo un mol de glucosa disuelto en un Kg (litro ) de agua ejerce una presión osmótica de 1 Osmol /kg agua; en cambio un mol de ClNa disuelto en un litro de agua ejercerá una presión Osmótica Osmótica de dos Osmoles debido a las dos partículas en que se disocia, disocia, una de sodio y otra de cloro. (Na+ (Na+ y Cl- ) La capacidad de una partícula para producir un flujo de agua a través de la membrana celular se llama tonicidad. Una solución extracelular extracelular que permite permite que el el agua fluya hacia hacia dentro de la célula haciendo haciendo que ésta se hinche se llama hipotónica (Hipo osmolar) Una solución que permite que el agua fluya hacia fuera de la célula se llama hipertónica. (Hiper osmolar) osmolar) La membrana del glóbulo rojo nos servirá en la presente práctica para demostrar este fenómeno y asimismo demostrar que la membrana tiene ciertos límites de resistencia normales a variaciones de la tonicidad en el medio interno. Aplicación clínica. Existen algunas enfermedades en las las cuales cuales se producen alteraciones alteraciones en la la membrana membrana que generan hemólisis por mayor fragilidad de la membrana , son defectos genéticos heterogéneos que afectan a las proteínas constitutivas constitutivas de la membrana membrana del eritrocito eritrocito .La Enfermedad Enfermedad Esferocitosis es una de ellas, en en la en la cual se ha demostrado demostrado una disminución disminución de la proteína membranal Espectrina del hematíe, hematíe, y el grado de déficit de la la proteína Espectrina parece asociarse con con la gravedad clínica clínica de esta enfermedad, pues pues los hematíes son muy frágiles frágiles y se hemolizan hemolizan produciendo anemia anemia intensa.

Fundamento Se llama resistencia globular osmótica osmótica a la que presentan los hematíes suspendidos suspendidos en soluciones salinas hipotónicas. Si empleamos empleamos soluciones salinas de 0.76 a 0.9 % y suspendemos dentro de ellas los hematíes veremos que éstos se conservan sin alteración alteración durante varias varias horas, y que una una vez sedimentados (espontáneamente (espontáneamente ó por centrifugan), el líquido que sobrenada es claro y transparente como la misma misma solución salina. Pero si efectuamos suspensiones de hematíes en soluciones de cloruro sódico a































3.- Micropipetas de 0.1 ml 4.- Fiola de 100 ml 5.- Espectrofotómetro Espectrofotómetro 6.- Muestra de sangre sangre venosa desfibrinada ó hematíes hematíes lavados. 7.- Agua destilada 8.- Tubos de vidrio 13x 100 mm sin reborde

Metodo 1.- Preparar soluciones seriadas, en tubos de prueba prueba marcados del 1 al 19, según según la tabla adjunta, haciendo las diluciones con agua destilada según lo indicado : Marcar 19 tubos de prueba y repartir así: Sol. Agua % NaCl Mezclar Tubos NaCl Destil de Por inNº ml la sol resul 1% version tante Ml 1 1.0 9 sí 0.10 % 2 2.0 8 Sí 0.20 % 3 2.5 7.5 Si 0.25 % 4 3.0 7.0 Si 0.30 % 5 3.5 6.5 Si 0.35 % 6 3.75 6.25 Si 0.375 % 7 4.0 6.0 Si 0.40 % 8 4.25 5.75 Si 0.425 % 9 4.50 5.5 Si 0.45 %

El alumno calculará la Osmola ridad correspondiente a cada uno de los tubos :( expresar en unidades mOsm/Kg mOsm/Kg H20)































Valores Normales: Hemólisis inicial (leve) (empieza Hemólisis): 0.44 % + -- 0.02 Hemólisis Hemólisis Total (Hemólisis completa): 0.32 % + -- 0.02 CAUSAS DE AUMENTO DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA GLOBULAR: (Los hematíes son más frágiles frágiles que lo normal, tienen poca resistencia ante ligeras hipotonías, y se hemolizan muy fácilmente) -Anemia Hereditaria Esferocítica, en la Enfermedad Hemolítica del recién nacido por incompatibilidad ABO -Después de alguna injuria térmica (quemaduras) -Anemias Hemolíticas Hemolíticas sintomáticas en algunos casos de: Linfoma Maligno, Leucemias, Cáncer, Cirrosis, etc. CAUSAS DE DISMINUCIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA (Los hematíes hematíes son mas resistentes que lo normal a la hipotonía): En la primera Infancia, tempranamente en la infancia. En algunas Anemias por deficiencia de Hierro Talasemia mayor ( ó anemia de Cooley, ó anemia del Mediterráneo ) Anemia Drepanocitica ( Hoz, Sickle cell anemia) Anemia Megaloblástica Nutricional Post Esplenectomía y algunas hepatopatías con ictericia FRAGILIDAD EN MEDIO ACIDO: - En la Hemoglobinuria paroxística nocturna, que cursa con anemia hemolítica, usualmente la fragilidad fragilidad globular realizada realizada en sol. salina































La piel del sapo no solamente separa al espacio extracelular extracelular del medio ambiente ,sino que permite el pasaje de muchas sustancias ,incluyendo el agua, el sodio , el cloro y la glucosa. La dirección del intercambio depende del tipo de transporte involucrado y de la gradiente de concentración de los solutos .Cuando cambia la composición del liquido extracelular los riñones excretan las sustancias presentes en excesos o reabsorben las necesarias para lograr ppreservar reservar la homeostasis.

Material 17 sapos Beakers Agua destilada Solución de NaCI 7.5% Solución de dextrosa al 15 % Balanza Urinómetro Tubos de ensayo Pipetas de Pasteur Goteros Pinzas mosquito Método Experimento Nº 1: Preparación del animal Durante la noche previa al experimento se debe mantener a los sapos en un ambiente húmedo para que estén adecuadamente hidratados. Antes de la pruebas se vacía la vejiga de todos los animales y se liga la cloaca para analizar analizar la orina formada en condiciones experimentales. Si se coloca un sapo en una solución de dextrosa y luego se encuentra dextrosa en la orina, puede deducirse que fue absorbida a través través de la piel hasta alcanzar una concentración suficiente en liquido liquido extracelular que que obligase a los riñones a excretar excretar el exceso en la orina.Los orina.Los sapos son































6* 8 10 12 14* 16*

NaCl NaCl 1.36% 0.68% NaCl NaCl 0.68% 1.36% Dextrosa Agua 3.87% agua Dextrosa 3.87% Dextrosa Dextrosa 7.74% 3.87% Dextrosa Dextrosa al 3.87% al 7.74%

Experimento Nº 3 Después de 2 horas, se saca el sapo del beaker y se retira la ligadura ligadura de la cloaca .Se vacía comprimiendo el abdomen y se recolecta la orina. orina. Se pesa nuevamente al sapo sapo .La diferencia entre este peso y el obtenido inmediatamente inmediatamente antes de quitar la ligadura es igual al peso de la orina recolectada. La diferencia entre el peso después de recolectar la orina del animal y el peso inicial antes de sumergido equivale al peso ganado o perdido durante el experimento. Se debe tomar en cuenta el peso después de inyectar los 4ml.de solución en los sacos dorsales .Se calcula el porcentaje de variación de peso con respecto a la medida inicial y se registra la cantidad de orina formada durante el experimento. Experimento Nº 4: Análisis de glucosa en orina del sapo. La glucosa se determinara en la orina del sapo mediante el método de la glucocinta (Urine Strip Winer































el control de la duración duración , intensidad intensidad y frecuencia del estimulo. estimulo. Las relaciones estimulo-respuesta estimulo-respuesta se desarrollan en función al tiempo y al espacio.

Material Sapos grandes Tabla de fijación para batracios Miógrafo Alambre de cobre Estimulador eléctrico Alambre de zinc Equipo de disección Quimógrafo Quimógrafo Método Experimento N° 1 Se anestesia al sapo por destrucción del cerebro y la médula espinal. Con unas tijeras se hace un ojal en la piel de la región anterior homóloga al tronco. Se continúa la incisión de la piel en cinturón. Una vez completado el cinturón, se desprende la piel de un tirón hacia abajo. En la región dorsal se debe tener cuidado por la adherencia de la piel al urostilo. Se levanta el urostilo con la pinza de disección y se se seccionan los elementos paravertebralmente paravertebralmente y en dirección cefálica, cefálica, fracturando el proceso del iliaco paralelo paralelo al urostilo que se articula con el proceso transverso de la novena vértebra. Inmediatamente Inmediatamente se observan dos formaciones blancas que se introducen por tres raíces más arriba en la columna vertebral. vertebral. Estas estructuras son los nervios ciáticos. ciáticos. Por debajo se observa la aorta dorsal con sus bifurcaciones. Con las tijeras se secciona transversalmente transversalmente el urostilo, urostilo, evitando traccionar o lesionar lesionar los dos nervios ciáticos. Se pasa un hilo por debajo de cada uno de los nervios ciáticos y se realiza una ligadura lo mas proximal posible a la columna columna vertebral. vertebral. En este momento momento se observa observa una reacción muscular. muscular. Se secciona el nervio proximalmente proximalmente a la médula, entre la columna vertebral y la ligadura. ligadura. Con la ayuda del hilo se puede efectuar la disección del nervio ciático, no siendo necesario manipularlo con ningún instrumento. Para poder liberar el nervio, es necesario cortar el músculo músculo piriforme, después se lo aísla por disección roma

































Experimento N° 5: tetania Se realizan estimulaciones intensas y continuadas y se obtiene una serie de contracciones sucesivas antes de que el músculo alcance su relajación completa. Se continúa hasta obtener una contracción permanente. Experimento N° 6: Relación longitud longitud - tensión Se da una vuelta completa del quimógrafo para inscribir una línea basal en reposo. A continuación se estimula para que el músculo se contraiga sin vencer ninguna resistencia. Se obtiene un trazado en el quimógrafo. Se colocan 10 gramos de peso, con lo que la línea basal del quimógrafo desciende. A continuación se estimula al músculo y se obtiene un trazado. Se aumentan otros 10 gm de peso con lo que la línea basal desciende aún mas.Se mas.Se vuelve a estimular el mús músculo culo y se obtiene un trazado. Repetir varias veces el procedimiento, incrementando incrementando sucesivamente el peso.

Discusión

































La terminal presináptica posee vesículas sinápticas, las cuales han sido sintetizadas en el soma neural, y presenta canales canales de membrana de sodio y calcio calcio dependientes del voltaje. La generación del potencial de acción da lugar a la apertura de los canales de calcio y se incrementa la concentración citosólica de calcio. Este incremento promueve la fusión de las vesículas sinápticas con la membrana citoplasmática del rafe sináptico, liberando acetilcolina. La acetilcolina actúa sobre receptores nicotínico presentes en el miocito y produce despolarización de la membrana celular muscular. Este fenómeno es denominado potencial de la placa terminal. Este potencial de acción excita excita a las miofibrillas para que se contraigan. Para el control de la actividad muscular existe además además una vía vía inhibitoria recurrente, es decir, un mecanismo mecanismo de retroalimentación retroalimentación negativa que mejora la resolución resolución espacial de la acción neural. Esta Esta vía inhibitoria provee un mecanismo para evitar la la contracción muscular muscular persistente. persistente. El axón de la motoneurona A sale de la sustancia gris a nivel de la medula espinal, pero emite antes una rama colateral, la rama rama recurrente. Esta rama se desprende a partir del primer primer nódulo de Ranvier, permanece

































Discusión La succinilcolina es un bloqueador muscular despolarizante. despolarizante. Inicialmente simula el efecto de la acetilcolina, produciendo apertura de los canales iónicos y despolarización persistente. Inicialmente puede producir excitación, la que se manifiesta por fasciculaciones transitorias. Esta fase es seguida por el bloqueo de la transmisión neuromuscular y parálisis flácida. La estricnina actúa a nivel de la medula espinal, bloqueando bloqueando la sinapsis inhibitoria de las células de Renshaw sobre las motoneuronas α, en las que ejerce el rol de antagonista competitivo selectivo que bloquea los

efectos inhibitorios de la glicina. La estricnina produce aumento de los impulsos nerviosos sucesivos, creando contracciones similares a las tetánicas. Origina una contracción muscular sostenida de extensores y flexores y espasmo muscular persistente. persistente.

































Sol.Ringer para batracio.

Método Experimento N° 1: PREPARACIÓN DEL SAPO ESPINAL Observar la postura, los movimientos espontáneos y respuesta a los diversos estímulos, movimientos respiratorios, reflejos reflejos del salto, respuesta a la rotación y posición de espalda del sapo normal. Se fija al animal con la mono izquierda y se determina lasa siguientes líneas: una línea transversal a nivel del límite posterior de la membrana timpánica ( A-B), Una segunda línea entre el ojo y la membrana timpánica (X-Z). Se toma una tijera y se introduce uno de sus extremos en la boca del animal y se lo decapita con un solo golpe, procurando que en este momento el sapo se encuentre con el dorso hacia abajo, a lo largo de la línea X-Z Realizar hemostasia por compresión y realizar las mismas observaciones que en el sapo normal. Este es el sapo descerebrado. En este caso, el sapo puede realizar movimientos complejos tales como saltar y si se coloca de espalda puede regresar a la posición normal. En otro sapo hacer las observaciones del tono y la respuesta a la estimulación eléctrica y luego realice el corte a lo largo de la línea A-B. Inmediatamente Inmediatamente se observa el tono y la actitud postural del animal y se efectúa el pinzamiento de uno de sus dedos. d edos. Se objetivará la depresión motora que constituye uno de los

































Experimento Experimento N° 7 Se empapa un papel de filtro en ácido acético puro y se lo coloca en el dorso del animal Se observa y se registra las características de la respuesta. Experimento N° 8 Se hace una incisión en el abdomen y se expone con mucho cuidado una parte del intestino. Se estimula cuidadosamente con el carrete de inducción. Se observa y se registra las características características de la respuesta. Al principio se observará una ligera contracción de la musculatura abdominal que aumentará al incrementar la intensidad del estímulo hasta llegar a desarrollar una respuesta flexora amplia. Experimento N° 9 Se introduce un estilete dentro del canal vertebral y se destruye la médula. Después se repite las mismas estimulaciones estimulaciones hechas previamente.-



































regresar al órgano efector, son de este tipo. Los reflejos espinales no requieren de intervención del sistema nervioso central y funcionan igualmente bien en un animal cuya médula se ha seccionado por encima de la localización de las neuronas de los nervios correspondientes. Las inserciones tendinosas de los músculos poseen receptores sensitivos especiales que responden a ala

































































sea reducida y, por lo tanto, sea menor su posibilidad de discriminación. Cuando se estimulan dos puntos cercanos de la piel, cada uno excitará de forma máxima al centro de su campo cortical; pero como los campos se superponen parcialmente, la resultante será una excitación mayor, aunque se mantienen los máximos de excitación separados.



































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































Reactivos y Aparatos: Tubos de prueba de 8 mm diámetro, limpios y secos Agujas y jeringas para uso endovenosos descartables, estériles. estériles. Baño maría 37 °C Reloj cronómetro Procedimiento: Obtener 3 ml de sangre venosa, anotando la hora exactamente (Para controlar el tiempo de inicio) Inmediatamente transferir 1.5 ml de sangre a cada uno de dos tubos y colocarlos en Baño María a 37°C. Luego de tres min. de reposo ir sacando cada uno de los tubos e ir inclinándolos suavemente en 90° cada minuto, hasta que no se observe desplazamiento de sangre y pueda ser completamente invertido el tubo sin caerse la sangre. Anotar el tiempo. Valores referenciales: Con este método de Lee White los valores normales para hombres y mujeres varía varía entre: 5 a 8 min. Los valores referenciales dependen del diámetro del tubo empleado: Usando tubos de diámetro interno de 11 mm: 9 a 15 min. Usando tubos de diámetro interno de 8 mm: 6 a 10 min. Existen otros métodos para determinar el tiempo de Coagulación por ejemplo el método del portaobjetos: Valor normal de 2 a 8 minutos. Método del Tubo Capilar: Valor referencial de 3 a 7 min. Tiempo de Sangría El tiempo de sangría depende de la elasticidad de la pared vasos sanguíneos y de la cantidad y capacidad funcional de las plaquetas. El tiempo de sangría es el tiempo transcurrido desde el momento en que se hace una punción standard profunda en la la oreja o en el pulpejo pulpejo del dedo y aquél en que la sangre sangre deja de brotar brotar de la herida. herida. METODO DE DUKE Reactivos y Aparatos: Cronómetro, lancetas lancetas descartables, desinfectante desinfectante de piel, papel de filtro. Procedimiento: Desinfectar la yema de un dedo (anular) ó el lóbulo de una oreja y punzar con la lanceta descartable standard standard de manera que la sangre fluya libremente, gota a gota, sin necesidad de exprimir la piel. Anotar el tiempo de aparición de la primera gota y, luego con el papel de filtro ir secando cada gota, cada 30 segundos sin tocar la piel, hasta que deje de sangrar. Anotar el tiempo transcurrido. Valores Referenciales: 1 a 3 MINUTOS.

TIEMPO DE PROTROMBINA Y TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL En la presente práctica evaluaremos las dos vías de la coagulación por separado: Primero determinaremos la VÍA EXTRÍNSECA de forma global mediante la determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick, que determina los factores involucrados en esta vía como son: Factor VII llamado Proconvertina, el Factor II ó Protrombina, el Factor V ó Proacelerina y el Factor X llamado Factor de Stuart-Prower. Cualquier alteración de estos factores será detectado por la determinación del Tiempo de Quick. Esta prueba no detecta detecta deficiencias en los factores factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI, XII). Para el TP usaremos un exceso de Tromboplastina Tisular o Factor III (de cerebro) y calcio. Puede usarse Simplastin de Warner Chilcota. El método que emplearemos para TP es el de la Casa Wiener que se



























Tubos de ensayo de vidrio de 12 x 75 mm. Cronómetro Baño María 37 °C Asa de alambre Níquel Cromo Nuevas (Bacteriológicas) Micropipetas 100 y 200 lambdas. Muestra de plasma sanguíneo: En un tubo de ensayo contendiendo 0.5 mI de anticoagulante citrato trisódico 3.8 % u oxalato de sodio añadir 4.5 ml de sangre venosa Mezclar suavemente, centrifugar y separar el plasma.

Procedimiento para TP: Usar tubos de 13 x 100 mm: Pre incubar el plasma: en un tubo de ensayo, marcado (Px) colocar 1 ml del plasma en BM 37 °C, por 3 min. (El saldo del plasma refrigerarlo). (No pre incubar mas de 10 min.) Pre incubar el Soluplastin: en otros dos tubos de ensayo colocar 0.2 ml de Soluplastin en cada uno y colocar en BM a 37 °C por 3 min. (No pre incubar mas de 10 min.). Pipetear 100 lambdas del plasma Pre incubado y añadir rápidamente al tubo conteniendo los 0.2 ml de Soluplastin, disparando simultáneamente el cronómetro. Soluplastin pre incubado 37°C ( incluye calcio) ml

0,2

Plasma pre incubado 37°C ml Simultáneamente, de inmediato iniciar cronómetro

0.1 y ! cronómetro!! Simultáneo

Mezclar y esperar coágulo y de d e inmediato frenar cronómetro Anotar tiempo en segundos. Mantener el tubo dentro del Baño María cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulación sacar el tubo del baño e inclinar suavemente por una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento exacto de la aparición del coágulo, que se manifestara por la aparición de muy discretos hilos de fibrina, en ese instante precisamente para el cronómetro. Repetir por triplicado esta prueba. Calcular el valor promedio en segundos.

Valores Referenciales: 11- 12 sgs. + - 2 segs del control Normal El control Normal estará entre 10 a 13 segundos +- 0.5 2DS. Con estos valores en segundos a través de una curva de calibración podemos podemos expresarlos en porcentaje de actividad protrombinica en relación a los valores normales: examinemos el siguiente cuadro que muestra los valores porcentuales:



























11 - 12.5

100 %

13.5

60 %

15

50 %

17

40

19.5

30

22

25

24 – 36

20

37 – 40

10

55 – 65

5

El tiempo de Protrombina se encuentra alargado por defectos de Factor I (Fibrinógeno), Factor H (Protrombina), (Protrombina), Factor V (Proacelerina ó F. Lábil), Factor VII (Factor Estable ó Proconvertina), y Factor X (Factor Stuart-Prower). El TP se encuentra prolongado en pacientes con dieta deficitaria en Vit K, infantes prematuros, infantes recién nacidos de madres que están con deficits de Vit K (es la enfermedad hemorrágica del recién nacido). En la mala absorción de las grasas, ictericia obstructiva, obstructiva, diarrea crónica, etc. El TP está prolongado también en el daño hepático severo (envenenamientos, hepatitis, cirrosis). Por Drogas (tipo coumarínico de la terapia anticoagulante) Presencia de anticoagulantes circulantes, hipofibrinogenemia adquirida o hereditaria. En resumen, debo decirles que el Tiempo T iempo de Protrombina es primariamente usado con TRES fines: 1.- Para la evaluación de los desórdenes de la Coagulación: para investigar la anormalidad de los factores involucrados en la vía Extrínseca V, VII, X, Protrombina P rotrombina y Fibrinógeno. Y debe ser usada junto con el tiempo tiempo de Tromboplastina Tromboplastina Parcial Activada. 2.- Para controlar la terapia anticoagulante oral a largo plazo con coumadinas y derivados indanedionas. 3.- Evaluación de la función hepática: el test del Tiempo de Protrombina es uno de los mas útiles para evaluar la capacidad del hígado en la síntesis de los factores del complejo Protrombínico: Protrombínico: II, VII, yX.

DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO. (TTPA Ó APTT Ó PTT). El TTPA es un método de investigación de la VÍA INTRÍNSECA de forma global XII, XI, IX, X, VIII, V, II y I. En esta prueba APPT se usa un activador específico de la Vía Intrínseca (del Factor XII) y es un Fosfolípido CEFALINA activado con caolín ó sílice micronizado. El test de TTPA consiste en la recalcificación del plasma en presencia de un exceso de cefalina fosfolípido, (que es un sustituto de las plaquetas y factor plaquetario) plaquetario) preparado preparado a partir de cerebro de conejo y de un activador Kaolín Kaolín tamponado. tamponado. Esta prueba usa este activador específico de la vía intrínseca que es el Factor plaquetario -3 sustituido por la cefalina fosfolípido de cerebro de conejo y que tiene además un activador k aolín en finísimas partículas ó sílice micronizado (activador para el Factor XII) de la vía intrínseca solamente y un tampon de piperazida estanolsulfónico. Además este reactivo tiene una especial reactividad con la presencia de heparina lo cual lo hace especial para el monitoreo de la terapéutica con heparina. Emplearemos en esta practica el método de la casa WIENER LAB. Que usa cefalina fosfolípido y que se llama reactivo APTTEST



























B. Reactivo de APTT: al vial del liofilizado, añadir el volumen de agua indicado en el rasco que es 2.5 cc de agua destilada, tapar y mezclar suave por inversión, queda así listo el homogenizado. C. Obtencipón de la muestra de sangre: A 4.5 cc de sangre venosa añadirle 0.5 cc del anticoagulante oxlato de sodio. Centrifugar para separar el plasma. D. Distribuir los reactivos en la lsiguiente forma utilizando tubos de vidrios de 12 x 75 mm de diámetro o 13 x 100 ml: TUBO 1 Plasma desconocido

TUBO 2

100 ul (LAMBDAS)

PLASMA CONTROL NORMAL O ESTANDAR REACTIVO DE APTT 100 ul (LAMBDAS) (HOMOGENIZADO)

100 ul (LAMBDAS) 100 ul (LAMBDAS)

Mezclar e incubar por 3 minutos cada uno de los tubos a 37°C. Al tubo N° 1 añadirle solución de cloruro de calcio pre incubado a 37 °C …. 100 ul.

Inmediatamente disparar el cronometro, agitar suavemente y mantenerlo en el baño maría por 25 segundos solamente y luego retirarlo para observar la formación del coagulo, que se manifestara por la aparición de filamentos de fibrina inmediatamente detener el cronómetro, este es el tiempo de Tromboplastina Parcial, valores normales de 33 a 48 4 8 segundos. Al tubo N°2 que es el control normal le añadiremos luego Cloruro de calcio 100 ul y procederemos exactamente igual que el caso anterior y servirá como control normal, cuyos valores normales van desde 33 a 48 segundos.

También podemos emplear los reactivos de cefalina con caolín de la casa francesa que vemos a continuación. Equipos, reactivos y materiales .-(idem que TP).Procedimiento para APTT: Emplearemos CK Prest™ activado (Cefalina con Kaolin) (APTT) (Diagnostica Stago-Francia). Stago-Francia). Reactivo N° 1: Cefalina Reactivo N° 2: Kaolín tamponado : Agitar el contenido del frasco N°2 y transferido completamente dentro del frasco N°1 . Dejar que repose 30 min. para embeber el gel. Y después de la imbibición, agitar suave y circunferencialmente para homogenizar la mixtura. Solución de Cloruro de calcio (C12Ca): 0.025 M …………………….. 1.38 gm Cl2 Ca anh Agua destil ……………………………..500 ml Pipetas automáticas de 100 lambdas



























React 1 Cefalina Bien Reconstituido y resuspendido

0.1

Mezclar y pre incubar 37°C Exacto

3 minutos

Simultáneamente: Simultáneamente: Añadir Cl2Ca 0.025M precalentado e INICIAR INICIAR CRONOMETRO

0.1

ml

ml

Mezclar y esperar coágulo. Parar cronómetro inmediatamente que aparezca el coágulo Anotar tiempo en segundos

EXACTO

Los valores referenciales varían de 30 a 45 segundos y deben reportarse en relación a un control normal Cuando el Tiempo Tromboplastina Parcial está prolongado, pero el Tiempo de Protrombina es Normal nos indica un a alteración de alguno de los factores de la vía intrínseca de tipo congénito: VIII, IX (Hemofilias), XI, XII. Si todos estos factores están normales, puede haber una deficiencia de HMWK kininógeno (Factor Fritgerald). También se encuentra alargado el APPT en deficiencias adquiridas ó condiciones anormales como: Enfermedades hepáticas, Coagulopatía por consumo, anticoagulantes circulantes, en la terapia anticoagulante oral, o en la heparización. Ó en el tratamiento tratamiento con inhibidores de la trombina como hirudina, argatroban., etc

Vía Extrínseca

Vía Intrínseca XII

FACTOR Pre K

TISULAR

HMWK

Tiempo Tromboplastina Parcial Activada Celafina y kaolín (activador del XII) APPT

VII

XI

IX

Tiempo Protrombina Tromboplastinas Tisulares: Simplastin Soluplastin





























Referencias Bibliográficas: Clinical Hematology Wintrobe. EJ. Lea Feboger. Feboger. Phila. London. 1998 Technical Hematology Simmons. Lippincott. 1999. Laboratory Methods by J. B. Henry. Saunders Co. 1999. The Principles and Practice of Blodd Grouping Addine G Mosby Co 1993 Fisiología Médica W Ganong El Manual Moderno 2002 An Introduction to Inmunohematology Inmunohematology N Bryant W B Saunders Co. Pfila. London 1997

GRUPOS SANGUÍNEOS Y FACTOR RH Introducción: En 1900, Landsteiner descubrió que el suero de algunas personas aglutinaba los glóbulos rojos de otras y que éste fenómeno podría ser usado para clasificar a las personas en diferentes fenotipos de grupos sanguíneos. Se reconocen 4 fenotipos cimunes: O, A, B, y AB. También se han identificado antígenos de los subgrupos del tipo A y B.





























Los reactivos usados para la tipificación de los grupos del Sistema ABO contienen anticuerpos monoclonales IgM. Estos reactivos producirán aglutinación directa de los glóbulos rojos que transporten el antígeno específico correspondiente. La determinación del grupo sanguíneo puede hacerse por el método del tubo de ensayo ó por el método en lámina portaobjeto.

MÉTODO EN LÁMINA PORTAOBJETO: Materiales y Reactivos: Suero monoclonal Anti A Suero monoclonal Anti B Suero monoclonal Anti AB Lámina excavada o lámina portaobjetos Lancetas descartables Muestra de sangre Algodón y desinfectante Procedimiento para Determinar el Grupo Sanguíneo 1.- Dividir una lamina portaobjetos en 3 secciones: izquierda, central y derecha con lápiz de cera marcador. La muestra de sangre puede obtenerse de la yema del dedo o por venipuntura. Colocar una gota suero Anti A en el lado izquierdo y una gota del suero Anti B en el centro y una gota del suero Anti – AB AB en la derecha de una lámina de vidrio plana. Colocar una gota de sangre al lado de cada una de las gotas del antisuero correspondiente sin tocar los reactivos !!, para evitar evitar contaminación cruzada, cruzada, y luego mezclar bien usando aplicadores aplicadores o baguetas distintas. 2.- Hacer girar el porta objetos con la mano y observar si existe aglutinación macroscópica. La aglutinación aglutinación se producirá en unos pocos segundos. La lectura deberá hacerse antes de que q ue se seque la mezcla. El tiempo máximo habitual es de tres minutos.

INTERPRETACION INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS CON ERITROCITOS EN LA DETERMINACION DEL GRUPO SANGUÍNEO Suero Anti Suero Anti Suero Anti Grupo Sanguineo -A -B - AB O A

+

+





























Fisher-Race Dce DCe DcE Dce dCe dcE dCE DCE

Wiener Rho Rh1 Rh2 rh (hr’) rh’ rh”

Rhy Rhz

El factor D, es con mucho, el más antigénico y el término “Rh Positivo”, como generalmente se usa, significa que el individuo tiene Aglutinógeno D. El individuo Rh Negativo Negativo no tiene antígeno D y solo forma la aglutinina aglutinina Anti D cuando se le inyectan inyectan células D positivas. El suero que se emplea rutinariamente para tipificar el Rh es un suero Anti D. El 85% de los caucásicos son Rh Positivos y el 15% restante restante Rh Negativos. Las personas Rh negativas negativas (D Negativas) que que reciben una transfusión de sangre Rh Positiva Positiva (aún muchos muchos años antes) antes) forman Anticuerpos Anticuerpos Anti Rh y tienen títulos Anti D apreciables y dan reacciones transfusionales graves cuando reciben una transfusión de sangre Rh (D) Positiva. Igualmente sucede cuando una madre Rh (D) Negativa concibe un hijo D positivo, porque pequeñas cantidades de sangre del feto se filtran a la circulación materna en el momento del parto y desarrollan títulos elevados de aglutininas Anti Rh durante el post parto. Durante el embarazo siguiente las aglutininas desarrolladas contra el antígeno RH cruzan la placenta y llegan al feto que ha heredado el antígeno Rh positivo del padre y se produce la reacción Antígeno-anticuerpo que produce hemólisis y la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido (Eristroblastosis (Eristroblastosis Fetal).

DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh. Materiales y Reactivos: Reactivo Antisuero Monoclonado Anti Anti - Rho (Anti D) Lámina portaobjeto Varillas de vidrio ó aplicadores Lancetas descartables





























INVESTIGACIÓN DE LA SENSIBILIZACIÓN DE LOS HEMATÍES Cuando algún anticuerpo (por ej. Garnmaglobulina - IgG) se fija y recubre al glóbulo rojo se dice que el eritrocito está sensibilizado. Los eritrocitos pueden sensibilizarse in vivo, y esto ocurre por ejemplo en la Eritroblastosis Fetal (EF), que es una enfermedad del Feto y del Recién nacido y se caracteriza por aglutinación y fagocitosis de los eritrocitos del feto, que se produce cuando una madre siendo Rh Ne gativa y el esposo Rh Positivo, concibe un niño Rh positivo. El niño hereda el Rh Positivo del padre. Durante el embarazo la madre desarrolla Aglutininas Aglutininas Anti - Rh por la exposición al antígeno (Aglutinógeno Rh) del niño. A su vez, éstas aglutininas Anti Rh de la madre difunden por la placenta al feto y recubren los glóbulos rojos del feto. Los hematíes del niño están ahora sensibilizados y esto produce la aglutinación y lisis de los hematíes del propio hijo. Durante el primer embarazo puede no producirse daño, pero durante el segundo embarazo el 3 % presentarán E F; durante el tercer embarazo el 10 % presentarán p resentarán EF, y así va aumentando la incidencia. Se puede investigar la presencia de estos anticuerpos (IgG- anti Rh) que recubren a los hematíes del niño mediante el Test de Coombs Directo (test de Antiglobulina directo) y que es el objeto de la presente práctica.

TEST DE COOMBS DIRECTO: Esta Prueba se realiza en los hematíes del paciente. Fundamento Esta prueba se fundamenta en la aglutinación de los eritrocitos humanos sensibilizados por anticuerpos gamma-globulínicos que se produce cuando se les coloca en presencia de un suero antihumano gammaglobulínico preparado en conejos. Este suero antiglobulínico puede ser específico para globulina IgG, ó también puede ser un preparado monoclonalmente obtenido. Esta Prueba DIRECTAMENTE demuestra la sensibilización de los eritrocitos que se ha producido in vivo. Materiales y Reactivos: Centrífuga Clínica y Microscopio Binocular Suero Antiglobulínico de Coombs (Gamma IgG) (Monoclonal) Hematíes del paciente (Niño) Solución Salina 0.85 % Tubos de prueba de vidrio 13 x l00 mm y 12 x 75 mm; algodón, desinfectante de piel (Alcohol iodado), ligadura ligadura venosa, aguja y jeringas jeringas descartables. Varillas Varillas de vidrio ó mondadientes mondadientes de plástico, pipetas pipetas Pasteur. Procedimiento: Lavado previo de los glóbulos rojos: 1.- Medir aproximadamente aproximadamente 0.4 ml de sangre y colocar en el fondo de un tubo de prueba de 13 x 100 mm, añadir luego 6 ml de solución salina 0.85 %. Mezclar suavemente por inversión. 2.- Centrifugar a 3400 rpm. Por 30 segundos hasta que las células se empaqueten al fondo del tubo. 3.- Decantar la solución salina completamente, limpiando la boca del tubo con papel servilleta.





























La presencia de aglutinación indica una Prueba de Coombs Directa POSITIVA, demostrando que los eritrocitos están sensibilizados. Ausencia de Aglutinación: Test de Coombs Directo: NEGATIVO.

Interpretación: Esta Prueba Coombs Directa es POSITIVA en los casos de: Eritroblastosis Eritroblastosis Fetal ,Anemias Hemolíticas Autoinmunes Autoinmunes y sirve también para el diagnóstico de reacciones transfusionales debido a Incompatibilidad Incompatibilidad sanguínea. TEST DE COOMBS INDIRECTO Detecta los anticuerpos presentes en el suero del paciente (madre) y para ello deben sensibilizarse primero in vitro algunos glóbulos rojos de otra persona de grupo conocido (Tipo O por ejemplo) y luego de haber sensibilizado los glóbulos rojos escogidos se les aplica el Coombs Directo. Para sensibilizar a los para glóbulos rojos seleccionados (conocidos) se debe primero incubar el suero del paciente (madre) con los eritrocitos seleccionados (grupo O por ejemplo) para que las células se sensibilicen (es decir, se recubran con el anticuerpo sérico) si es que está presente, y, después averiguar si están sensibilizadas aplicándoles el test de Coombs Directo, tal como hemos descrito líneas arriba.. TEST DE COMPATIBILIDAD CRUZADA MUESTRAS Y REACTIVOS Suero del Paciente Receptor Hematíes del Dador Suspensión al 2 % En salina Albúmina Bovina 22% Centrifugar (serofuga a 1000 rpm) 1 minuto

TUBO A

TUBO B

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

----------

2 gotas

sí

sí

EXAMINAR ambos tubos por aglutinación ó hemólisis. Luego INCUBAR ambos tubos A y B, en BM B M a 37 °C por 15 minutos CENTRIFUGAR por 1 minuto a 1000 RPM. Lectura del tubo B por aglutinación ó hemólisis. Luego CONTINUAR con el tubo "A": Tres T res lavados en sol salina 0.9 % Añadir suero de Coombs 2 gotas





























































Defensa

Exógeno

Homeostasis celular

Endógena Exógena

Microorganismos Microorganismos Polen Remoción de células viejas o dañadas

Vigilancia celular

Endógena Exógena

Remoción de células mutantes.

Alergia

Deficiencia inmune

Enfermedad autoinmune: Formación de auto anticuerpos Artritis reumatoidea, lupus. Enfermedad maligna

FILOGENIA DE LA INMUNIDAD INMUNIDAD NO ESPECÍFICA.En los animales más primitivos, como como en los unicelulares, el mecanismo de resistencia es la fagocitosis la cual es esencialmente una función nutritiva: y en las formas evolutivas más elevadas involucra también un mecanismo defensivo. A medida que evolucionan a formas más complejas aprenden a reconocer los cuerpos extraños. En los invertebrados superiores se desarrollan desarrollan un sistema vascular en el cual la fagocitosis se desarrolla además por medio de células circulantes y en el ser humano por fin hay cinco células circulantes (leucocitos), tres de los cuales son fagocitarias o fagocíticas (monolitos, polinucleares y eosinófilos). Entonces filogenéticamente los elementos no específicos más importantes, fagocitosis y respuesta inmunitaria vienen desde la forma más primitiva de vida. Con la evolución, estos mecanismos persistieron y fueron suplementados e implementados implementados por la adición de nuevos componentes componentes tales como la inmunidad específica y los sistemas de amplificación de esta inmunidad, por ejemplo el complemento, coagulación, etc. Entonces, pues, en resumen, estos mecanismos antiguos no fueron reemplazados por la evolución de las las especies sino que más bien continuaron y fueron fueron reforzados adicionalmente con nuevas respuestas (amplificadora (a mplificadoras). s).































ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS Ig

Función

Estructura

Cadena pesada

Ig G

Fijación del Complemento

Monomérica

Gama 1 gama2 Gama 3

Cadena Concentración Adicional Plasmática mg/dl 700 - 1600































En la presente práctica práctica tiene por objeto determinar determinar la respuesta bursal bursal en personas normales normales y en pacientes con inmunodeficiencia inmunodeficiencia por desnutrición, a través de la determinación cuantitativa cuantitativa de Ig A, Ig M, Ig G empleando anticuerpos específicos que formen inmunocomplejos insolubles, turbios, y su medición espectrofotométrica.

MATRIALES Y REACTIVOS. Solución salina fisiológica 9/1000ml Solución anticoagulante: anticoagulante: heparina sódica, frasco por 5 ml, 500 U.I./ml (LIQUEMINE). Jering descartabla por 5 ml y aguja de 20x1´´. Antisueros: anti Ig A, anti Ig M, anti Ig G. Buffers Ig A, IgM, Ig G. Solución patrón de proteínas de concentración conocida. Suero sanguíneo o plasma heparinizado normal Suero sanguíneo o plasma heparinizado de paciente desnutrido. 1 sapo grande grande para punción punción intracardiaca Equipo de disección completo y estilete para obtener animal espinal.. Espectrofotómetro Espectrofotómetro y microcubetas. microcubetas. Micropipetas automáticas automáticas de 0 á 200 y de 0 a mil microlitos o lambdas. Tubos de prueba 10x75 mm Cronómetro

PROCEDIMIENTO.Se repartirá el trabajo en 5 mesas diferentes del siguiente modo: Mesa 1: determinara en un suero normal la Ig A Mesa 2: determinará en un suero normal la IgM Mesa 3. determinará en un suero normal la Ig G































VALORES DE REFERENCIA NORMALES: 70 – 400 400 mg/dl DOSAJE DE LA Ig G Suero diluído 1/10 : 40 ul Buffer IgG 900 ul Homogenizar y leer la absorbancia en 340 nm (DO 1) llevando el aparato a 0 con agua destilada y luego agregar: Antisuero anti Ig G 160 ul Mezclar e incubar a temperatura ambiente Leer la absorbancia nuevamente a 340 nm (DO 2), llevando el aparato a 0 con agua destilada.

VALORES DE REFERENCIA NORMALES: 700 – 1600 1600 mg/dl DOSAJE DE LA Ig M Suero diluído 1/10 : 60 ul Buffer Ig M 900 ul Homogenizar y leer la absorbancia en 340 nm (DO 1) llevando el aparato a 0 con agua destilada y luego agregar: Antisuero anti Ig M 100 ul Mezclar e incubar a temperatura ambiente Leer la absorbancia nuevamente a 340 nm (DO 2), llevando el aparato a 0 con agua destilada.

VALORES DE REFERENCIA NORMALES: 40 – 260 260 mg/dl

































exceptuando las proteínas. La densidad del filtrado glomerular glomerular es 1010 y su pH es 7.40. Si este filtrado glomerular no fuese sometido a la acción tubular el organismo perdería grandes cantidades de agua, sales, elementos útiles como glucosa, aminoácidos, etc. Junto con los productos finales del metabolismo de las proteínas como la urea, creatinina, ácido úrico, y otros.

Concepto de Clearance: El concepto de CLEARANCE fue introducido por Van Slyke, la palabra clearance significa depuración o limpieza y se entiende por Clearance o Depuración renal de una sustancia al número de centímetros cúbicos de plasma que son liberados de dicha sustancia en la unidad de tiempo (minuto), por el riñón. Si una sustancia es únicamente filtrada por el glomérulo, y no reabsorbida, ni secretada por el túbuli, su depuración medirá el número de ml que los glomérulos filtran en un minuto. Es el caso de la Inulina, el manitol, thiosulfato, etc., que solo se filtran filtran por el glomérulo, pero no se reabsorben reabsorben ni secretan por los túbulis renales. La depuración de una sustancia se obtiene dividiendo la cantidad de dicha sustancia excretada en la orina en la unidad de tiempo entre entre la cantidad que existe existe de dicha sustancia en un ml de plasma. Llamemos V ’ el Vol. Minuto de orina; (Vol. recolectado/tiempo de recolección en minutos (cc/min.))

































LAB. Que es el método de Jaffé modificado empleando picrato alcalino en medio taponado con glicina, previa desproteinización desproteinización de la muestra de suero con ácido pícrico directamente directamente proporcional a la concentración de creatinina cuando se mide en 510 mm de Longitud de onda. Se comparará con la absorbancia de un patrón de creatinina de concentración conocida.

Equipos, Materiales y Reactivos 01 Espectrofotómetro y 01 Centrifuga clínica Jeringa descartables de 10 ml con aguja 20 x 1”

Algodón, alcohol yodado y ligadura 09 tubos de ensayo de 13 x 100 mm en cada mesa 01 tubo de ensayo de 12 x 75 mm en cada mesa mesa 06 Pipetas de 1 ml graduadas al 1/100 en cada mesa 03 Pipetas de 5 ml graduadas al 1/10 en cada mesa Frasco con agua destilada 100 ml en cada mesa Pipetas Pasteur de Vidrio (capilares) con chupón jebe, para separar sobrenadante. Frascos de boca ancha de 1 litro de capacidad ó beakers de plástico de 1 litro para obtención de muestras de

































Crs =

Conc St X Abs suero = Abs St – Abs blank

2 X Abs suero – Abs Blank = mg/dl Abs St – Abs Abs Blank

b.- Creatinina Creatinina en Orina (CrO): mg/dl Exactamente igual al anterior, sustituyendo las absorbancias del suero por las de la orina y se multiplica ademas por 100 (factor de dilución de la orina). c.- Calcular la Depuración Creatinina Endógena (Corregida por el ASC): Según: Depuración = U x V X 1.73 m2 P ASC m2

Nota: No se olvide de usar siempre las mismas unidades de medida para los cálculos Por ejemplo: U CrO mg/ml

































































el filtrado glomerular unas tres veces más que osmolaridad plasmática. Los valores normales pueden variar desde 50 hasta casi 1200 mOsm/Kg. agua. Uosm x V: Es la excreción de solutos por minuto, es la cantidad de solutos osmóticos activos excretados por minuto. Cosm: Depuración Osmolar: Uosm x V / Posm Es el volumen de plasma que es depurado de sus solutos en la unidad de tiempo. Representa la tasa a la cual las sustancias osmóticas activas son aclaradas ó depuradas del plasma. La depuración basal ó endógena en el hombre tiene un rango del 1 al 3 % del filtrado glomerular.

CH2O: Es depuración de agua libre de solutos que se elimina por la orina por minuto. Es igual al Volumen minuto menos la Dep Osmolar: CH2O = V – Cosm Cosm La depuración de agua libre es ese núcleo de agua en la orina en exceso de su depuración osmolar. Durante la diuresis de agua caracterizada por la excreción de gran volumen de orina ori na diluida debido a la gran ingesta de agua, la diuresis se debe a la inhibición de la hormona antidiurética de la neurohipófisis. Durante la diuresis de agua pura, de cualquier duración ó magnitud, la orina consiste de una mezcla de agua



































































































Y DILUCIÓN Urinaria Tiempos Tiempo de Acumulat Recolecc. min (minutos)

N° Vol. de Orina Mues ml tra

Vol. Minut ml/ min

Posm Densi Uosm U/P Cosm Tc CH2O mOsm Dad mOsm/ H2O ml/ Kg Kg ml/ min H2O Urina H2O min

































Acidificación y/o alcalinizaci6n urinaria. Introducción: Bases Fisiológicas: Existen tres grandes procesos de regulaci6n del pH en los líquidos del organismo: el mecanismo de intercambio i6nico (entre las células y los líquidos), el mecanismo respiratorio y el mecanismo renal.



























































































































































































































































































































































































































































































































































































Guia Prac Fisiologia Humana 2013 - i upsjb

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