Género Vibrio

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Contenido INTRODUCCIÓN........................................... INTRODUCCIÓN............................................................................. ................................................................... ................................................. ................ 3 GÉNERO VIBRIO .......................................... ............................................................................ ................................................................... ................................................. ................ 4 Características Generales ............................................... ................................................................................. ............................................................. ........................... 4 Reservorios................................................................. .................................................................................................. .................................................................. ................................. 5 VIBRIO CHOLERAE ....................................................................................... ........................................................................................................................ ................................. 6 Morfología e identificación................................................................ ................................................................................................... ............................................ ......... 6 Microorganismos Microorganismos típicos ..................................................................... ....................................................................................................... ...................................... .... 6 Cultivo ............................................................... ................................................................................................. .................................................................... ...................................... .... 6 Características de crecimiento ..................................................... ...................................................................................... ............................................ ........... 7 Desarrollo Y Estructura ............................................................................... ................................................................................................................ ................................. 8 Estructura antigénica y clasificación biológica.................................................................... ............................................................................. ......... 8 Enterotoxinas Enterotoxinas de Vibrio cholerae cholerae ............................................................................................ ................................................................................................. ..... 9 Patogénesis Patogénesis ................................................................ ................................................................................................. ................................................................ ............................... 11 - Pérdida de líquidos............................................................... .................................................................................................. ................................................ ............. 12 - Regulación genética de la virulencia................................................................ .................................................................................... .................... 12 Manifestaciones Manifestaciones clínicas............................................................. ............................................................................................... ................................................ .............. 12 Pruebas diagnósticas de laboratorio laboratorio............................................................... .............................................................................................. ............................... 13 Muestras ............................................................... ................................................................................................. .................................................................... .................................... .. 13 Identificación del V. Cholerae................................................................. ................................................................................................... .................................... .. 16 Prueba de oxidasa................................................................... ..................................................................................................... ............................................... ............. 16 Método del papel de filtro humedecido ........................................................................... .................................................................................. ....... 16 Método del hisopo ................................................................................... .................................................................................................................. ............................... 16  Análisis bioquímicos bioquímicos adicionales adicionales ................................................................... ............................................................................................ ......................... 17 Producción de la toxina del cólera para las pruebas de laboratorio .......................................... .......................................... 22 Producción de la toxina del cólera................................................ cólera................................................................................. .......................................... ......... 22 Detección de la toxina del cólera ................................................................................. ............................................................................................... .............. 23 Resumen histórico de los métodos de valoración de la toxina del cólera ............................. ............................. 23 Inmunidad.............................................................................................. ................................................................................................................................. ..................................... .. 30 Tratamiento................................................................. .................................................................................................. ................................................................ ............................... 30 Epidemiología, Epidemiología, prevención prevención y control ............................................................................ .......................................................................................... .............. 31 OTROS VIBRIOS ...................................................................... ....................................................................................................... ..................................................... .................... 32 1. Vibrio parahaemolyticus parahaemolyticus ......................................................... ........................................................................................... ................................................ .............. 32 2. Vibrio Vulnificus ........................................... ............................................................................ .................................................................. .......................................... ......... 33 3. Otros vibrios.................................................................. ................................................................................................... .......................................................... ......................... 33 BIBLIOGRAFÍA............................................................... ................................................................................................ ................................................................ ............................... 34

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Contenido INTRODUCCIÓN........................................... INTRODUCCIÓN............................................................................. ................................................................... ................................................. ................ 3 GÉNERO VIBRIO .......................................... ............................................................................ ................................................................... ................................................. ................ 4 Características Generales ............................................... ................................................................................. ............................................................. ........................... 4 Reservorios................................................................. .................................................................................................. .................................................................. ................................. 5 VIBRIO CHOLERAE ....................................................................................... ........................................................................................................................ ................................. 6 Morfología e identificación................................................................ ................................................................................................... ............................................ ......... 6 Microorganismos Microorganismos típicos ..................................................................... ....................................................................................................... ...................................... .... 6 Cultivo ............................................................... ................................................................................................. .................................................................... ...................................... .... 6 Características de crecimiento ..................................................... ...................................................................................... ............................................ ........... 7 Desarrollo Y Estructura ............................................................................... ................................................................................................................ ................................. 8 Estructura antigénica y clasificación biológica.................................................................... ............................................................................. ......... 8 Enterotoxinas Enterotoxinas de Vibrio cholerae cholerae ............................................................................................ ................................................................................................. ..... 9 Patogénesis Patogénesis ................................................................ ................................................................................................. ................................................................ ............................... 11 - Pérdida de líquidos............................................................... .................................................................................................. ................................................ ............. 12 - Regulación genética de la virulencia................................................................ .................................................................................... .................... 12 Manifestaciones Manifestaciones clínicas............................................................. ............................................................................................... ................................................ .............. 12 Pruebas diagnósticas de laboratorio laboratorio............................................................... .............................................................................................. ............................... 13 Muestras ............................................................... ................................................................................................. .................................................................... .................................... .. 13 Identificación del V. Cholerae................................................................. ................................................................................................... .................................... .. 16 Prueba de oxidasa................................................................... ..................................................................................................... ............................................... ............. 16 Método del papel de filtro humedecido ........................................................................... .................................................................................. ....... 16 Método del hisopo ................................................................................... .................................................................................................................. ............................... 16  Análisis bioquímicos bioquímicos adicionales adicionales ................................................................... ............................................................................................ ......................... 17 Producción de la toxina del cólera para las pruebas de laboratorio .......................................... .......................................... 22 Producción de la toxina del cólera................................................ cólera................................................................................. .......................................... ......... 22 Detección de la toxina del cólera ................................................................................. ............................................................................................... .............. 23 Resumen histórico de los métodos de valoración de la toxina del cólera ............................. ............................. 23 Inmunidad.............................................................................................. ................................................................................................................................. ..................................... .. 30 Tratamiento................................................................. .................................................................................................. ................................................................ ............................... 30 Epidemiología, Epidemiología, prevención prevención y control ............................................................................ .......................................................................................... .............. 31 OTROS VIBRIOS ...................................................................... ....................................................................................................... ..................................................... .................... 32 1. Vibrio parahaemolyticus parahaemolyticus ......................................................... ........................................................................................... ................................................ .............. 32 2. Vibrio Vulnificus ........................................... ............................................................................ .................................................................. .......................................... ......... 33 3. Otros vibrios.................................................................. ................................................................................................... .......................................................... ......................... 33 BIBLIOGRAFÍA............................................................... ................................................................................................ ................................................................ ............................... 34

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INTRODUCCIÓN Las especies del género Vibrio tienen una amplia distribución en la naturaleza, la mayoría de especies del género vibrio son acuáticas, bien de aguas dulces o saladas. El vibrio cholerae, una de las especies más representativas del género es patógeno para humanos, constituyendo la causa específica de la enfermedad conocida como cólera; sin embargo este organismo normalmente no afecta a otras especies. El cólera es una de las enfermedades más comunes en países en vías de desarrollo o subdesarrollados. El microorganismo se transmite casi exclusivamente por vía hídrica y los resultados de su distribución que se hicieron en el siglo XIX demostraron la importancia de la purificación de las aguas en zonas urbanas, como medio más idóneo para cotar los brotes coléricos. V. cholerae O1, biotipo El Tor es el responsable de la séptima pandemia que se inició en 1961 cuando apareció la bacteria como causa de epidemia de cólera en Celebes (Sulawesi), Indonesia. La enfermedad se propagó rápidamente a otros países de Asia del este y llegó a Bangladesh en 1963, a India en 1964, y a la URSS, Irán e Irak en 1965-1966. En 1970 el cólera invadió el oeste de África, la cual no había experimentado la enfermedad por más de 100 años. La enfermedad se dispersó rápidamente a varios países de África y se convirtió en endémica en casi todo el continente. En 1991 el cólera golpeó a Latinoamérica, en donde también había estado ausente por más de un siglo. Su ingreso fue por Perú. En el primer año se propagó a 11 países, y subsecuentemente a través del continente. En Uruguay en el mismo año se crea una comisión con el fin de prevenir, monitorear y tomar las medidas necesarias para impedir la entrada o diseminación de la enfermedad en el país y que tuvo un éxito en sus cometidos. Es debido a esto, la importancia de poder conocer a este género de bacterias, y sobre todo a las especies patógenas en el ser humano, destacando entre ellas el Vibrio cholerae por la enfermedad infecciosa que produce y que en su momento fue un gran problema para los médicos de ese entonces. Si bien actualmente no llega a ser un gran problema su tratamiento, no debemos descuidarnos El vibrio parahaemolyticus es un microorganismo marino. Es una de las causas más comunes de casos de gastroenteritis en Japón ( donde se consume pescado crudo rutinariamente) y tambien se ha implicado en trastornos semejantes en otras partes del mundo incluyendo Estados Unidos.

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GÉNERO VIBRIO Características Generales Los vibrios son unas de las bacterias más frecuentes en las aguas de superficie de todo el mundo. Son bacilos gramnegativos curvados ( Figura 1), son extremadamente móviles y poseen un flagelo polar, no forman esporas, son oxidasa-positivas y pueden desarrollarse bajo condiciones aerobias, pero pueden ser anaerobios facultativos. Las células pueden conectarse extremo a extremo, generando formas en S y espirales. La estructura de la envoltura celular es similar a la de otras bacterias gramnegativas.

FIGURA 1. Vibrio cholerae (micrografía electrónica de barrido). Observe los bacilos curvados y los

flagelos polares. CUADRO 1. Características de Vibrio, Campylobacter  y Helicobacter a BACTERIOLOGÍA Organismo

Desarrollo

PATOGÉNESIS Ureasa

Epidemiología

Adherencia

Toxinas

Enfermedad

Vibrio cholerae

Facultativo

 – 

Fecal-oral, transportado por agua, pandemias

Proteína superficialb, pelos

TCc

Diarrea acuosa (cólera)

Campyloba cter jejuni

Microaerófilo

 –

Animales, leche no pasteurizada

Desconocida

Desconocidase

Disentería, diarrea acuosa

Helicobacte r pylori 

Microaerófilo

+

Secreciones gástricas

PME

VacAg, ureasa, Cagh

Gastritis crónica, úlceras, adenocarcino ma, linfoma

humanas

a Todos son bacilos gramnegativos curvados morfológicamente similares. b La proteína de la superficie es capaz de fijarse a la quitina y a los intestinos humanos. c Toxina del cólera. d Lipooligosacárido, flagelina, proteína principal de la membrana externa (PPME) y proteína CadF fijadora de fibronectina son adherencias potenciales. e La t oxina citoletal-distensora es una toxina potencial. f PME, proteínas de membrana externa (BabA, SabA, AlpA, AlpB, HopZ). g Citotoxina vacuolante. h Técnicamente no es una toxina, pero Cag se asocia de manera poderosa con la virulencia.

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Los serogrupos de V. cholerae O1 y O139 producen cólera en el ser humano, en tanto que otros vibrios pueden ser causa de sepsis o enteritis. En el Cuadro 2 se presentan las principales especies de vibrios de importancia médica y en el Cuadro 3 los menos comunes. CUADRO 2. Vibrios de importancia médica Microorganismo

Enfermedad en seres humanos

Vibrio cholerae serogrupos O1 y O139

Cólera epidémico y pandémico Diarrea coleriforme; diarrea leve; raras veces infecciones

Vibrio cholerae serogrupos no O1/ no O139

extraintestinales

Vibrio parahaemolyticus

Gastroenteritis, tal vez infecciones extraintestinales

CUADRO 3. Características de las especies menos comunes de Vibrio ORGANISMO V. mimicus

CARACTERÍSTICAS

EPIDEMIOLOGÍA

Cercanamente relacionado con V. cholerae, enterotoxina similar al cólera

Ingestión de pescados y mariscos crudos

ENFERMEDAD Diarrea acuosa

V.  parahaemolyticus

Produce inflamación enterotoxina no clara

 Agua de mar costera; intestinal, ingestión de pescados y mariscos crudos; brotes en cruceros; común en Japón

Diarrea acuosa, disentería ocasional

V. vulnificus

 Agua de mar costera, en especial cuando aumenta la Produce sideróforos poderosos temperatura del agua; que secuestran el hierro de la ingesta de pescados o transferrina y la lactoferrina del mariscos crudos o por hospedador contaminación de heridas con agua de mar

Bacteriemia fulminante posterior a la ingestión, celulitis por contaminación de heridas, altas tasas de mortandad en aquellos con enfermedades de almacenamiento de Fe+

V. alginolyticus

Heridas contaminadas con agua de mar

Celulitis

Reservorios El principal reservorio es el ser humano; observaciones en Australia, Bangladesh y Estados Unidos han demostrado la existencia de reservorios en el ambiente, al parecer con la participación de copépodos u otras clases de zooplancton de aguas salobres o estuarios. Hay microorganismos que pueden persistir en el agua por mucho tiempo y en la literatura se menciona que el alza de la temperatura del mar, producto de la corriente del niño, favorecía la sobrevida y su replicación. Las personas son infección asintomática juegan un importante rol en acarrear el vibrio de un lugar a otro, produciendo la diseminación de las epidemias. 5

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VIBRIO CHOLERAE Las características epidemiológicas del cólera son muy parecidas al reconocimiento de la transmisión de V. cholerae en el agua y el desarrollo de sistemas sanitarios de agua.

Morfología e identificación Microorganismos típicos En el aislamiento inicial, V. cholerae es un bacilo curvo de forma de coma de 2 a 4 µm de longitud (figura 2). Se mueve por medio de un flagelo polar. En el cultivo prolongado, los vibrios pueden convertirse en bacilos rectos que se parecen a las bacterias entéricas gramnegativas.

FIGURA 2. Tinción de Gram de Vibrio cholerae. A menudo tienen forma de coma o levemente curveados (flechas) y miden 1 × 2 a 4 µm. Aumento original × 1 000.

Cultivo V. cholerae produce colonias convexas, lisas y redondas que son opacas y granulosas en la luz transmitida. V. cholerae y la mayor parte de los demás vibrios se multiplican bien a una temperatura de 37 °C en muchas clases de medios, incluidos los medios definidos que contienen sales minerales y asparagina como fuentes de carbono y nitrógeno. V. cholerae se multiplica bien en agar de tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS, thiosulfate-citrate-bilesucrose), en el cual produce colonias amarillas que son fácilmente visibles sobre un fondo de color verde oscuro de agar (figura. 3). Los vibrios son oxidasa positivos, lo que los distingue de las bacterias gramnegativas entéricas. Es característico que los vibrios se multipliquen a un pH muy alto (8.5 a 9.5) y que rápidamente sean destruidos por ácido. Por tanto, los cultivos que contienen hidratos de carbono fermentables se vuelven estériles con rapidez. 6

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En zonas donde el cólera es endémico, son apropiados los cultivos directos de las heces en medios selectivos, como el TCBS y cultivos enriquecidos en agua de peptona alcalina. Sin embargo, los coprocultivos sistemáticos en medios especiales como TCBS por lo general no son necesarios ni rentables en zonas donde es infrecuente el cólera.

FIGURA 3. Colonias de Vibrio cholerae en agar de tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS). Las colonias de color amarillo brillante tienen un diámetro de 2 a 3 mm y están rodeadas por un color amarillo difuso del indicador en el agar de hasta 1 cm de diámetro. La placa tiene un diámetro de 10 cm.

Características de crecimiento Por lo regular V. cholerae fermenta sacarosa y manosa pero no arabinosa. Una prueba de oxidasa positiva es un paso clave en la identificación preliminar de V. cholerae y otros vibrios. Las especies del género Vibrio son susceptibles al compuesto O/129 (f osfato de 2,4diamino-6,7-diisopropilpteridina), que los diferencia de las especies del género Aeromonas, que son resistentes al compuesto O/129. La mayor parte de las especies del género Vibrio son halotolerantes y el NaCl a menudo estimula su multiplicación. Algunos vibrios son halófilos y necesitan la presencia de NaCl para multiplicarse. Otra diferencia entre los vibrios y las aeromonas es que los primeros crecen en medios que contienen NaCl al 6%, y las aeromonas no.

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Desarrollo Y Estructura V. cholerae tiene una baja tolerancia al ácido, pero crece bajo condiciones alcalinas (pH 8.0 a 9.5) que inhiben a muchas otras bacterias gramnegativas. Se distingue de los demás Vibrio por sus reacciones bioquímicas, estructura antigénica lipopolisacárida (LPS) O y por su producción de la toxina del cólera (TC). Existen más de 150 serotipos antigénicos O, sólo dos de los cuales (O1 y O139) causan el cólera. El biogrupo El Tor de V. cholerae, una variante de O1, es un biotipo de la cepa clásica. Las cepas O139 se asemejan fenotípicamente a las cepas El Tor O1. V. cholerae posee largos pelos fi lamentosos que forman haces sobre la superficie bacteriana y que pertenecen a una familia de pelos cuya estructura química es similar a las de los gonococos y de numerosos otros patógenos bacterianos. Todas las cepas capaces de causar el cólera producen un factor de colonización denominado pelo corregulado por toxina (PCT) a causa de que su expresión se regula junto con la de la TC.

Estructura antigénica y clasificación biológica Muchos vibrios comparten un solo antígeno H flagelar termolábil. Los anticuerpos contra el antígeno H probablemente no intervienen en la protección de los hospedadores susceptibles. V. cholerae tiene lipopolisacáridos O que le confieren una especificidad serológica. Existen por lo menos 139 grupos de antígeno O. Las cepas de V. cholerae del grupo O1 y del grupo O139 producen el cólera característico; en ocasiones, los cóleras V. cholerae no O1/no O139 producen una enfermedad parecida al cólera. Los anticuerpos contra los antígenos O tienden a proteger a los animales de laboratorio contra las infecciones por V. cholerae. El antígeno del serogrupo O1 de V. cholerae tiene determinantes que permiten una tipificación adicional: los serotipos son Ogawa, Inaba e Hikojima. Se han defi nido dos biotipos de V. cholerae epidémico, el clásico y El Tor. El biotipo El Tor produce una hemolisina, da resultados positivos en la prueba de VogesProskauer y es resistente a la polimixina B. También se pueden utilizar técnicas moleculares para tipificar V. cholerae. Se utiliza la tipificación para los estudios epidemiológicos y por lo general sólo se llevan a cabo las pruebas en laboratorios de referencia. V. cholerae O139 es muy similar a V. cholerae O1 biotipo El Tor. V. cholerae O139 no produce el lipopolisacárido O1 ni tiene todos los genes necesarios para elaborar este antígeno. V. cholerae O139 elabora una cápsula de polisacárido, al igual que otras cepas de V. cholerae no O1, en tanto que V. cholerae O1 no sintetiza una cápsula.

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Enterotoxinas de Vibrio cholerae El V. cholerae invade la mucosa intestinal y se adhiere a las microvellosidades del borde en cepillo de las células epiteliales intestinales. V. cholerae, casi siempre el serotipo O1 (y O139), produce una enterotoxina termolábil con un peso molecular de 84 000. La toxina del cólera, TC (Figura 4 y 5), es una toxina ADP-ribosilante tipo A-B que consta de dos subunidades: las subunidades tóxicas A, que se degrada hasta formar dos péptidos, A1 y  A2, unidos por un puente disulfuro; y cinco unidades de fijación B (cinco péptidos idénticos). Las unidades B se fijan al receptor GM1-gangliósido que se encuentra sobre la superficie de muchos tipos de células. Una vez fijada, la subunidad A1 se libera de la molécula de toxina mediante la reducción del enlace disulfúrico que la une a la subunidad A2 e ingresa en la célula por translocación. Dentro de la célula ejerce su efecto sobre el sistema adenilciclasa asociado con la membrana sobre la superficie de la membrana basolateral. El blanco de la subunidad tóxica A1 es una proteína nucleótida de guanina (G), Gsa, que regula la activación del sistema adenilciclasa. La TC cataliza la ADP ribosilación de la proteína G, haciéndola incapaz de disociarse del complejo activo de la adenilciclasa. Esto ocasiona la activación persistente de la adenilciclasa intracelular que, a su vez, estimula la conversión del trifosfato de adenosina en 3ʹ, 5ʹ -monofosfato cíclico de adenosina (cAMP). El efecto neto

es una acumulación excesiva de cAMP en la membrana celular, lo que ocasiona una hipersecreción de cloro, potasio, bicarbonato y moléculas de agua asociadas hacia el exterior de la célula. La diarrea producida algunas veces es masiva (p. ej., 20 a 30 L/día), lo cual da por resultado deshidratación, choque, acidosis y hasta la muerte. Los efectos nocivos del cólera son secundarios a la pérdida del líquido y al desequilibrio acidobásico; por lo tanto, el tratamiento es la restitución de líquidos y electrólitos. FIGURA 4. Acción de la toxina del cólera. Se muestra a la toxina completa fijándose al receptor GM1 - gangliósido de la membrana celular por medio de las subunidades de fijación (B). La porción activa (A1) de la subunidad A cataliza la ADP-ribosilación (ADPR) de la proteína reguladora G   (estimulante), s

“fijándola” en el estado activo. Debido a que la proteína

G   actúa para retornar a la adenilciclasa de su forma s

inactiva a su forma activa, el efecto neto es la activación persistente de la adenilciclasa. El aumento en la actividad de la adenilciclasa (AC) provoca la acumulación de 3’, 5’ -monofosfato cíclico de adenosina

(cAMP) a lo largo de la membrana celular. El cAMP ocasiona la secreción activa de sodio (Na+), cloro (Cl-), potasio (K+), bicarbonato (HCO3-  ) y agua hacia el exterior de la célula hacia la luz intestinal.

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FIGURA 5. Acción de la enterotoxina del cólera

(1) El proceso normal del tráfico de iones en el intestino y la colonización de Vibrio cholerae siguiendo la liberación de la enterotoxina y la unión al gangliósido GM1 de las células del hospedador.

(2) Las toxinas A-B actúan internalizando el componente A y activando la adenilato ciclasa.

+

(3) Bloqueo del flujo normal de sodio (Na ).

(4) La pérdida de agua en el lumen y la diarrea.

La terapia del cólera se basa en la reposición de iones y la hidratación. El tratamiento antibiótico puede acortar la enfermedad por limitar el crecimiento de los V. cholerae, pero no tiene efecto en la toxina ya liberada.

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Patogénesis El cólera, V. cholerae debe llegar al intestino delgado, nadar al interior de las criptas intestinales, multiplicarse y producir factores de virulencia (Cuadro 4). En las personas sanas, se requiere de la ingesta de grandes cantidades de bacterias, cuando el vehículo es agua se requiere 1010 o más microorganismo para infectarse y cuando el vehículo es alimento, se necesita un mínimo de 102 a 104 microorganismos por la capacidad amortiguadora del alimento. El cólera no es una infección invasiva, los microorganismos no llegan al torrente sanguíneo sino que permanecen en el tubo digestivo. La colonización del tracto intestinal completo desde el yeyuno al colon por V. cholerae requiere de la adherencia a la superficie epitelial por medio de la proteína antes mencionada y los pelos de su superficie. La característica sobresaliente de la patogenicidad de V. cholerae es la capacidad que las cepas virulentas tienen para producir la TC, que es la responsable de la enfermedad del cólera. El cambio de agua y electrólitos de la célula a la luz intestinal es la causa fundamental de la diarrea acuosa del cólera. Cuadro 4. Factores de virulencia en las especies Vibrio Especies

Factor de virulencia

Efecto biológico

Toxina colérica

Hipersecreción de electrólitos y agua

Pilus corregulado por la toxina

Proteína quimiotáctica

Lugar de unión para CTXɸ; media la adherencia a las células de la mucosa intestinal Factor adhesina

V. cholerae Enterotoxina colérica accesoria Toxina de la zónula oclusiva

Neuraminidasa

V. parahaemolyticus V. vulnificus

Hemolisina Kanagawa

Cápsula de polisacáridos Citolisinas, proteasas, colagenasa

 Aumenta la secreción de líquido intestinal

Aumenta la permeabilidad intestinal Modificá la superficie celular para aumentar el número de sitios de unión de GM1 para la toxina colérica Enterotoxina que induce la secreción del cloruro (diarrea acuosa) Antifagocítica

Media la destrucción tisular

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- Pérdida de líquidos La pérdida de líquidos que se produce por la estimulación de la célula con adenilciclasa depende del equilibrio entre la cantidad de crecimiento bacteriano, producción de toxina, secreción de líquidos y absorción de los mismos en la totalidad del tracto intestinal. La salida de líquidos y electrólitos es máxima en el intestino delgado, donde la capacidad de secreción es elevada y la capacidad de absorción es baja. El líquido diarreico puede llegar a muchos litros por día, con un contenido de sodio aproximadamente igual al del plasma, pero con concentraciones entre dos y cinco veces mayores de potasio y bicarbonato. El resultado es la deshidratación (pérdida de líquido isotónico), hipopotasemia y acidosis metabólica (pérdida de bicarbonato). La mucosa intestinal permanece inalterada a excepción de cierta hiperemia, dado que V. cholerae no invade ni daña al enterocito de otras maneras.

- Regulación genética de la virulencia La expresión de los diversos factores de virulencia de V. cholerae se controla por medio de un sistema coordinado que involucra sensores ambientales y hasta 20 genes cromosómicos divididos entre una isla de patogenicidad (PAI) que contiene la TC y otra que contiene PCT. El regulador principal es una proteína transmembránica (ToxR) que “detecta” los cambios

ambientales en pH, osmolaridad y temperatura, que la convierten en una forma activa. En el estado activo, ToxR puede encender los genes de TC de manera directa además de activar la transcripción de una segunda proteína reguladora, ToxT. ToxT, cuyo efector natural podría ser la bilis, activa la transcripción de los genes de virulencia que se encuentran en ambas PAI, incluyendo PCT y TC. En apariencia, sistemas detectores de quórum parecen desplegar esta expresión de genes de virulencia en un punto en que hay una masa crítica de V. cholerae presente para sostenerla.

Manifestaciones clínicas Casi 60% de las infecciones por V. cholerae clásico son asintomáticas lo mismo que casi 75% de las infecciones por el biotipo El Tor. El periodo de incubación es de uno a cuatro días para las personas que presentan síntomas, lo cual depende en gran parte del tamaño del inóculo ingerido. Hay inicio brusco de náusea y vómito y una diarrea abundante con cólicos abdominales. Las heces, que semejan “agua de arroz”, contienen moco, células

epiteliales y un gran número de vibrios. Hay una pérdida rápida de líquidos y electrólitos, lo cual lleva a una deshidratación intensa, colapso circulatorio y anuria. La tasa de mortalidad sin tratamiento es de 25 a 50%. El diagnóstico de un caso de cólera real no plantea problemas cuando hay una epidemia. Sin embargo, los casos esporádicos o leves no son fáciles de distinguir de otras enfermedades diarreicas. El biotipo El Tor tiende a producir enfermedad más leve que el biotipo clásico.

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Pruebas diagnósticas de laboratorio Muestras Los cultivos con sospecha de ser V. cholerae deben subcultivarse en un medio no selectivo (por ejemplo, agar infusión de corazón [AIC] o agar triptona soya [ATS]) como preparación para la identificación por serología en lámina y pruebas bioquímicas. Las cepas de V. cholerae requieren de 0,5% de ClNa (sal) para un crecimiento óptimo en medio de agar; algunas formulaciones comerciales de agar nutriente no contienen sal y no deben usarse para el cultivo de V. cholerae . En general, el análisis con pruebas bioquímicas previo a la prueba con los antisueros O1 y O139 no es necesario cuando se sospecha presencia de V. cholera e en muestras de fecales. No obstante, si el suministro de antisueros somáticos es limitado, las pruebas bioquímicas pueden servir para la detección adicional de aislamientos, antes de ir a las pruebas con antisueros. Las pruebas de detección y la serología en lámina tienen que hacerse con el crecimiento de un medio no selectivo. La Figura 6 presenta un diagrama de flujo para el aislamiento y la identificación de cepas de V. cholerae y la Figura 7 provee un modelo de planilla que puede usarse para registrar los resultados de las pruebas de detección. Procedimiento 1. Asegurarse de que la persona defeque en un recipiente aparte (bacinilla) cuidando que la muestra no se mezcle con orina. 2. Tomar una parte de la muestra en un recipiente estéril de boca ancha y tapa rosca. 3. Rotular el frasco colocando el nombre del paciente, edad y fecha de recolección. 4. Introducir la(s) muestra(s) en una funda plástica y cerrarla evitando que se derrame y se mezcle con otras muestras. 5. Colocarlas en una caja, rodeándolas de papel picado asegurando que los recipientes no se muevan durante el transporte. 6. Adjuntar los formularios en donde constará nombres y apellidos de los pacientes, procedencia, fecha de toma de la muestra, nombre y teléfono de la persona que hizo la toma. 7. Sellar la caja y colocar un rótulo a un cost ado indicando “Peligro, Muestra Biológica” y una flecha indicando la posición “Hacia Arriba”, de manera que el transporte se haga de esa

forma. 8. Transportar las muestras rápidamente, antes de que transcurran 2 horas de su emisión. Luego de ese tiempo la muestra no será útil.

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FIGURA 6. Diagrama de flujo para el aislamiento y l a identificación de cepas de Vibrio cholerae

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FIGURA 7. Modelo de planilla para el registro de los resultados de la prueba de detección de Vibrio cholerae

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Identificación del V. Cholerae Prueba de oxidasa La prueba de oxidasa usa el reactivo de Kovac (una solución al 1% [p/vol] de N, N, N’, N’ – tetrametil-p-dihidroclorofenilendiamina) para detectar la presencia de citocromo c en la cadena respiratoria de la bacteria; si el reactivo de la oxidasa es catalizado, se torna púrpura. La prueba de la oxidasa se puede hacer en papel de filtro o en un hisopo. Haga la prueba de oxidasa con crecimiento fresco de la superficie inclinada (cuña) del AIC o  AHTA o cualquier otro medio no selectivo que no contenga carbohidratos; no use crecimiento de agar tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa [ATCSBS] porque puede producir tanto resultados falsos negativos como falsos positivos. No use asa de Nicromo para esta prueba, pues puede producir una reacción falsa positiva. Para los propósitos de control de calidad, los controles positivo y negativo se deben probar al mismo tiempo que se hace la prueba del aislamiento.

Método del papel de filtro humedecido a) En una placa de Petri, añada a un pedazo de papel de filtro dos o tres gotas de reactivo de oxidasa de Kovac y deje que el papel absorba el reactivo; el papel de filtro debe estar húmedo (pero no mojado) después que ha absorbido el reactivo.

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Identificación del V. Cholerae Prueba de oxidasa La prueba de oxidasa usa el reactivo de Kovac (una solución al 1% [p/vol] de N, N, N’, N’ – tetrametil-p-dihidroclorofenilendiamina) para detectar la presencia de citocromo c en la cadena respiratoria de la bacteria; si el reactivo de la oxidasa es catalizado, se torna púrpura. La prueba de la oxidasa se puede hacer en papel de filtro o en un hisopo. Haga la prueba de oxidasa con crecimiento fresco de la superficie inclinada (cuña) del AIC o  AHTA o cualquier otro medio no selectivo que no contenga carbohidratos; no use crecimiento de agar tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa [ATCSBS] porque puede producir tanto resultados falsos negativos como falsos positivos. No use asa de Nicromo para esta prueba, pues puede producir una reacción falsa positiva. Para los propósitos de control de calidad, los controles positivo y negativo se deben probar al mismo tiempo que se hace la prueba del aislamiento.

Método del papel de filtro humedecido a) En una placa de Petri, añada a un pedazo de papel de filtro dos o tres gotas de reactivo de oxidasa de Kovac y deje que el papel absorba el reactivo; el papel de filtro debe estar húmedo (pero no mojado) después que ha absorbido el reactivo. b) Tome una porción de la colonia a probar de un medio no selectivo y frótela en el papel de filtro humedecido usando un asa de platino, un asa plástica, un hisopo estéril, un aplicador de madera estéril o un mondadientes estéril. (No use un asa de Nicromo.) c) Si el aislamiento es V. cholerae, en 10 segundos debe darse una reacción positiva (púrpura) en la región donde el crecimiento ha sido extendido

Método del hisopo a) Escoja con un hisopo las colonias sospechosas de una placa de cultivo no selectivo o de un crecimiento de una cuña de agar no selectivo. b) Añada una gota del reactivo de oxidasa de Kovac al hisopo usando una pipeta de Pasteur. c) Si el aislamiento es V. cholerae, en 10 segundos habrá una reacción positiva (púrpura). Si el aislamiento no se torna púrpura a los 10 segundos de haber añadido el reactivo de oxidasa de Kovac, no será considerado oxidasa positiva. Los microorganismos de los géneros

Vibrio

(cuadro

4),

Neisseria,

Campylobacter,

Aeromonas,

Plesiomonas,

Pseudomonas y Alcaligenes son todos positivos a oxidasa; todas las Enterobacteriaceae son negativas a oxidasa.

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Cuadro 4. Reacciones de Vibrio cholerae en pruebas de pesquisaje Prueba de pesquisaje

Reacciones de Vibrio cholerae

Prueba de oxidasa

Positivo

Prueba de la cuerda

Positivo

 Agar hierro de kligler (AHK)

K/A (cuña roja/fondo amarillo), no produce gas, no H2Sa [18 –24 horas]

 Agar hierro triple azúcar (AHTA)

 A/A (cuña amarilla/fondo amarillo, no produce gas, no H2Sa [18 –24 horas]

 Agar hierro lisina (AHL)

K/K (cuña púrpura/fondo púrpura), no produce gas, no H2Sa, b [18 –24 horas]

Coloración húmedo

de

Gram

Montaje

Pequeños bacilos curvos gramnegativos Pequeños bacilos curvos con motilidad rápida

a

K= alkaline; A= acid  An alkaline reaction (purple) in the butt of the medium indicates that lysine was decarboxylated.

b

 An acid reaction (yellow) in the butt indicates that lysine was not decarboxylated.

Análisis bioquímicos adicionales La reacción de la cuerda, el agar hierro de Kligler (AHK), el agar hierro triple azúcar (AHTA) o el agar hierro lisina (AHL), la coloración de Gram y una preparación húmeda de motilidad, son otras pruebas que pueden usarse para detectar los aislamientos antes de que se prueben con el antisuero (véase la Cuadro 4). Debe determinarse la utilidad de estas pruebas antes de incluirlas en la rutina; la justificación de cada prueba (por ejemplo, el uso de la prueba de la cuerda para sacar las Aeromonas) se incluye en la descripción de los métodos que figuran a continuación. La prueba de la cuerda

La prueba de la cuerda utiliza crecimiento fresco de un agar no selectivo, es útil para excluir las especies que no son Vibrio, particularmente las de Aeromonas. La prueba de la cuerda puede desarrollarse en una lámina de vidrio o en una placa plástica de Petri, suspendiendo un crecimiento de agar infusión de corazón (u otro medio no inhibidor) durante 18 –24 horas en una gota de solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Si el resultado es positivo, las células bacterianas serán lisadas por el desoxicolato de sodio, la solución perderá turbidez y el ADN se desprenderá de las células lisadas, causando la viscosidad de la mezcla. Se formará una “cuerda” mucoide cuando se introduzca lentamente un asa de inoculación en la suspensión (Figura 8). Las cepas de V. cholerae son positivas, mientras que por  lo general las cepas de Aeromonas son negativas (véase el Cuadro

FIGURA 8. Prueba de la cuerda positiva con Vibrio cholerae

4). Otras especies de Vibrio pueden dar una reacción positiva o débil a la prueba de la cuerda. 17

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 Agar hierro de Kligler y agar hierro triple azúcar

El AHK y el AHTA sirven para excluir las especies de Pseudomonas y ciertas Enterobacteriaceae. Es importante que el agar hierro de Kligler y el agar hierro triple azúcar

sean preparados de manera que los tubos tengan un tope profundo y una cuña larga. Si el tope no es suficientemente profundo se pueden generar  reacciones engañosas en estos medios. Se considera aceptable un tubo preparado con un tope de aproximadamente 3,5 cm de profundidad y una cuña de aproximadamente 2,5 cm. Las cuñas de agar AHK o AHTA se inoculan por punción del tope y estriando la superficie del medio. Incube las cuñas a 35°C – 37°C y examínelas durante 18 –24 horas. Todas las tapas de los tubos de los medios bioquímicos deben aflojarse antes de la incubación; esto es de particular importancia para las cuñas de AHK o  AHTA. Si las tapas están muy ajustadas y existen condiciones de anaerobiosis en el tubo, ocurrirá una reacción inapropiada y las reacciones características de V. cholerae pueden no presentarse. Las reacciones de V. cholerae en AHK que contenga glucosa y lactosa son similares a aquellas de las Enterobacteriaceae no fermentadoras de la lactosa (cuña alcalina [roja], tope ácido [amarillo], no produce gas, ni HS). Sin embargo, en AHTA las cepas de V. cholerae producen una cuña ácida (amarilla), un tope ácido (amarillo), no producen gas, ni H 2S (véanse el cuadro 4 y la Figura 9). FIGURA 9. Reacciones de aislamientos de Vibrio cholerae en agar hierro de Kligler y agar hierro triple azúcar

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 Agar hierro lisina

El AHL sirve para detectar aislamientos de  Aeromonas y ciertas especies de Vibrio, las cuales, a diferencia del V. cholerae, no decarboxilan la lisina. El AHL tiene que ser preparado de manera que los tubos tengan un tope profundo (de aproximadamente 3,5 cm) y una cuña larga (de aproximadamente 2,5 cm). Si el extremo del AHK o del AHTA no es suficientemente profundo, pueden generarse reacciones engañosas en este medio. En el  AHL, la descarboxilación de la lisina ocurre solamente en condiciones de anaerobiosis y, por insuficiencia del medio en el tubo, puede ocurrir una reacción falsa negativa. Inocule el AHL puncionando el tope y estriando la cuña; después de incubar durante 18 –24 horas a 35°C – 37°C, examine la cuña del AHL para ver las reacciones típicas de V. cholerae. Los microorganismos que producen lisina descarboxilasa en AHL causan una reacción alcalina (color púrpura) en el extremo del tubo (véase la Figura 41); los microorganismos sin la enzima producen una reacción ácida (color amarillo) en el tope del tubo. La producción de H2S se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. La reacción del AHL para el V. cholerae es típica, con una cuña y un tope alcalinos (púrpura), y sin producción de gas ni

H2S (véase el cuadro 4). Las cepas de Proteus y Providencia spp. producirán con frecuencia una cuña roja causada por desaminación de la lisina. Coloración de Gram

Examinando una cuña de crecimiento de toda la noche de Vibrio cholerae en agar  infusión de corazón por la coloración de Gram, se demostrarán los típicos bacilos pequeños, en forma de curva o coma, gramnegativos (véase el cuadro 4). La tinción con cristal violeta es solamente una técnica más rápida, que demostrará también la morfología típica de las células de las especies de Vibrio. Montaje húmedo entre cubreobjetos y portaobjetos

Se ha usado microscopias de campo oscuro y por contraste de fase para detectar  aislamientos con sospecha de ser V. cholerae. Con estas técnicas, las suspensiones en solución

salina

se

examinan

microscópicamente

buscando

la

presencia

de

microorganismos, bacilos pequeños con forma típica de curva o coma y alta motilidad (“estrella fugaz”) (véase el cuadro 4). Identificación serológica de aislamientos de V. cholerae O1 y O139

Si se sigue la identificación bioquímica presuntiva de un agente como V. cholerae, es apropiado confirmarlo por serología. Si se sospecha que hay una epidemia de cólera, el agente causal más común es V. cholerae O1. Si la cepa aislada no corresponde a V. cholerae O1, habrá que probar con V. cholerae O139. Si no se aísla ninguno de estos

microorganismos, será necesario enviar las muestras de heces a un laboratorio de referencia. Los laboratorios locales y regionales tienen que enviar al laboratorio de 19

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referencia los aislamientos que requieran pruebas con el antisuero O139; si el laboratorio nacional de referencia no está capacitado para confirmar la identificación de un aislamiento de V. cholerae como O1 u O139, algún laboratorio internacional de referencia puede guiarlo. Para conservar recursos, el laboratorio puede probar primero con los antígenos somáticos O1 de V. cholerae y después, con el antisuero O139 solo en caso de que el aislamiento no dé una reacción de aglutinación positiva con el antisuero O1. Identificación presuntiva usando los antisueros O1 y O139

Para la prueba de aglutinación en láminas con los antisueros polivalentes O1 u O139, se debe usar crecimiento fresco con sospecha de ser V. cholerae en medio de agar no selectivo. El uso de crecimiento de agar tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa (ATCBS) puede dar una reacción falsa negativa. Después de 5 a 6 horas de incubación, el crecimiento en la superficie de la cuña es casi siempre suficiente para realizar la prueba de aglutinación en lámina con el antisuero; si no, incube por un período más largo. Si el aislamiento no aglutina con el antisuero O1, pruebe con el antisuero O139. Si la reacción con el polivalente O1 o con el antisuero O139 es positiva, el aislamiento puede ser notificado presuntamente como de V. cholerae O1 u O139. Estos aislamiento presuntivos de V. cholerae O1 pueden probarse con antisueros monovalentes de Ogawa e Inaba (métodos

que se presentarán a continuación). Una vez que una colonia de una placa ha sido identificada como V. cholerae O1 u O139, no es necesario seguir probando otras colonias de la misma placa. Confirmación de V. cholerae O1 con antisueros Inaba y Ogawa

El serogrupo O1 de V. cholerae se ha dividido en otros tres serotipos: Inaba, Ogawa y Hikojima (el cual es muy raro). La identificación de serotipos se hace por  aglutinación en antisueros monovalentes por tipo específico de antígenos O (Cuadro 5). Una reacción positiva con cualquiera de los antisueros Inaba u Ogawa es suficiente para confirmar la identificación de un aislamiento de V. cholerae O1. Los aislamientos cuya aglutinación es débil o lenta con el antisuero del serogrupo O1 y que no aglutinan con el antisuero de Inaba o Ogawa, se consideran que no pertenecen al serogrupo O1. La identificación con estos antígenos es válida solamente para los aislamientos del serogrupo O1. Por esta razón, los antisueros Inaba y Ogawa nunca deben usarse con cepas que son negativas con el antisuero polivalente O1. Con frecuencia, las cepas de un serotipo producen una aglutinación lenta o débil con el antisuero de otro serotipo, dependiendo de lo bien que hayan sido absorbidos los antisueros específicos para el serotipo. Por esta razón, se deben examinar simultáneamente las reacciones de aglutinación con los antisueros de Inaba y Ogawa; debe usarse la reacción más fuerte y más rápida para la identificación del serotipo. Con antisueros adecuadamente absorbidos, son raras, si las hay, las cepas que aglutinan muy fuerte y similarmente con ambos antisueros (Ogawa e Inaba). Si se sospechara de 20

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tales reacciones, las cepas deben ser remitidas a un laboratorio de referencia más exámenes y pueden considerarse como “posible serotipo Hikojima.” Cuadro 5. Reacciones de aglutinación en antisuero absorbido de serotipos de Vibrio cholerae serogrupo O1 antisuero Ogawa

antisuero Inaba

Ogawa

+a

-b

Inabac

-

+

Hikojima

+

+

V. c hol erae serotipo O1

a b

+ indica una reacción de aglutinación positiva en el antisuero absorbido.

 – indica una reacción de aglutinación negativa en el antisuero absorbido.

c

si existe una reacción positiva en ambos antisueros (Ogawa y Inaba) y se sospecha el serotipo Hikojima, envíe el aislamiento a un laboratorio de referencia internacional.

Procedimiento para la aglutinación en lámina

Las pruebas de aglutinación para los antígenos somáticos O para V. cholerae pueden realizarse en una placa de Petri o en una lámina de cristal limpia. a) Divida la lámina en secciones con un lápiz de cera y coloque una pequeña gota de solución salina fisiológica en cada sección de la lámina. b) Saque una porción del crecimiento de la superficie del medio de AHK, AHTA o  AIC u otro medio de agar no selectivo usando un asa de inoculación o aguja, un palillo aplicador estéril o un mondadientes. (No se deben hacer las pruebas serológicas con crecimiento de medios selectivos como agar MacConkey o agar  DXL, porque puede generar resultados serológicos falsos.) Emulsione el crecimiento en cada gota de solución salina fisiológica en la lámina y mezcle completamente para crear una suspensión moderadamente lechosa. c) Añada una pequeña gota de antisuero a una de las suspensiones; la segunda suspensión sirve como control. Para conservar antisuero, se pueden usar volúmenes muy pequeños, por ejemplo 10 µl; si no se dispone de micropipeta, se puede usar un asa curva de inoculación para dispensar pequeñas cantidades de antisuero (véase la Figura 32). Por lo regular, los volúmenes aproximadamente iguales de antisuero y de suspensión del crecimiento se mezclan, aunque el volumen de la suspensión puede llegar a ser el doble del volumen del antisuero. d) Mezcle bien la suspensión y el antisuero a modo de mecedora, mueva la lámina varias veces para observar la autoaglutinación (véase la Figura 2). Se ve mejor la aglutinación si se observa la lámina bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Si la reacción es positiva, a los 30 segundos o 1 minuto aparecerá el precipitado (véase la Figura 42). Examine la suspensión de salina cuidadosamente para estar seguro de su uniformidad y de que no muestra grumos resultantes de la autoaglutinación. Si hay autoaglutinación, el cultivo se caracteriza como “rugoso” y no puede ser serotipificado.

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Confirmación de V. cholerae O139

Los aislamientos sospechosos de ser V. cholerae que reaccionan con antisuero O139 pero no con el antisuero polivalente O1 deben enviarse a un laboratorio de referencia. La confirmación de V. cholerae O139 incluye las pruebas para la producción de enterotoxina colérica y la verificación del antígeno O139 por  aglutinación en lámina con antisuero O139. No se han identificado serotipos del serogrupo O139. Los ensayos de enterotoxinas (PCR, IE y ADN) son complejos y no están comprendidos en este manual. Hay pocos laboratorios capaces de hacer  estas pruebas, por lo que principalmente se lleva a cabo en laboratorios internacionales de referencia. Después de identificado el agente, se puede comenzar con las pruebas para identificar los patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos, si es que se van a usar los últimos para el tratamiento del cólera.

Producción de la toxina del cólera para las pruebas de laboratorio Las condiciones ideales para su producción varían de acuerdo con el medio que se utilice. En general, se ha encontrado que es mejor una temperatura de incubación de 30 °C que una de 37 °C para la producción de toxina con V. cholerae de cualquier biotipo. Con las cepas EI Tor, utilizando el medio de Craig, la mejor combinación de tiempo y temperatura es 30 °C durante 48 horas sin aeración. Para las cepas del biotipo clásico, una temperatura de 30 °C con agitación vigorosa durante 48 horas permite la mejor producción de la toxina. Si se utilizan temperaturas de incubación de 37 °C se recomienda el medio AKI. Aunque este medio permite la producción de toxina del cólera a 37 °C, tiene el inconveniente de una vida corta de almacenamiento, lo que exige su preparación semanal. V. cholerae EI Tor cultivado en medio AKI debe incubarse a 37 °C durante 20 horas sin agitación. EI medio AKI no se ha evaluado con respecto a la producción de toxina por las cepas del biotipo clásico.

Producción de la toxina del cólera 1) Los cultivos que se van a someter a prueba se siembran mediante estriación en un medio de plano inclinado no selectivo (como agar de infusión de corazón) y se incuban de 18 a 24 horas a una temperatura de 35 °C a 37 °C. Se incluyen cuatro cepas testigo (dos positivas y dos negativas). 2) Se inoculan las cepas en 5 ml de medio de Craig en tubos de tapa de rosca de 16 X 125 mm. Se mantienen los tapones poco apretados y se incuban los tubos a 30 °C durante 48 horas sin agitar. 3) Se centrifugan los tubos para sedimentar las células bacterianas, y se retira el sobrenadante con una pipeta Pasteur. EI sobrenadante se almacena a 4 °C hasta utilizarse. Si el sobrenadante ha de almacenarse por más de 7 días, se congela a -70 °C.

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Detección de la toxina del cólera Resumen histórico de los métodos de valoración de la toxina del cólera 1. Biovaloraciones Mé to do s qu e u tili zan an im ales Modelo de infección en conejo adulto (1950) . Después de la exteriorización y ligadura del

intestino delgado, se inyecta un sobrenadante acelular en cada asa ilegal y se mantiene cerrado el abdomen durante 18 horas. Se realiza la eutanasia, se extirpa el intestino y las asas se miden y se pesan para determinar la cantidad de líquido acumulado en virtud de la estimulación de la toxina. Los resultados se expresan como el volumen de líquido por la longitud del asa intestinal. Modelo de infección en conejo lactante (1955) , los conejos lactantes de 7 días de edad se

infectan con el microorganismo mediante intubación o por inyección directa intragástrica o intraluminal (en el intestino delgado). Se mantienen bajo observación para detectar diarrea acuosa y muerte por deshidratación. Otra opción consiste en matarlos después de un periodo de incubación de 7 horas. La prueba en la piel del conejo, o valoración del factor de permeabilidad vascular.   En la

espalda afeitada de un conejo adulto joven se inyectan por vía intradérmica un sobrenadante acelular de un cultivo de V. cholerae y diluciones de antisueros, 18 h después se aplica una inyección intravenosa del colorante azul de Evans. El aumento de la permeabilidad capilar mediado por la actividad de la toxina del cólera conduce a la difusión del colorante en la piel (reacción de azulete), con induración localizada en los sitios de inyección. La zona de "azulete" se mide con relación a un testigo negativo. Mé to do s d e cu ltiv o d e tejid os Los cultivos de células suprarrenales Y-1 de ratón (Y-1) y de ovario de hámster chino  han

sido las pruebas modelo para la detección de la toxina del cólera y de la toxina termolábil, aunque también son sensibles otras Iíneas celulares como las células vero de riñón de mono. Si la toxina del cólera está presentes en los sobrenadantes de los cultivos bacterianos agregados a las células, estimularan la producción de adenilciclasa, la cual eleva la concentración intracelular de AMPc. Las cantidades aumentadas de este compuesto dan por resultado una respuesta estructural que se puede observar al microscopio (las células de ovario de hámster chino se alargan y las células Y-1 se redondean). Las reacciones positivas pueden confirmarse mediante neutralización de los efectos tóxicos en el cultivo celular con antisuero contra toxina del cólera o con gangliósido GM1. Para la prueba de la toxina, se coloca una suspensión de células Y-1 en placas de microtitulación (microplacas) de 96 pozos.

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FIGURA 10.  La fotografía de la izquierda muestra el redondeo típico de las células Y-I suprarrenales de ratón causado por la presencia de la toxina del cólera. Se muestran células Y-I normales en las fotografía de la derecha.

2. Inmunovaloración ELISA

Para realizar la prueba GM1-ELlSA, se agregan los sobrenadantes del cultivo a los pozos de la microplaca revestidos con gangliósido GM1. La toxina unida a los receptores GM1 se detecta a continuación agregando antisuero contra la toxina del cólera, seguida por anticuerpo antiglobulina conjugado con enzima. En lugar de utilizar GM1 para revestir la placa, se puede recurrir a otro anticuerpo que se una a la toxina. Si se utiliza una microplaca de 96 pozos para el estudio de la toxina, es factible probar 30 sobrenadantes por duplicado en cada microplaca.

FIGURA 11. Diagrama del ensayo GM1-ELISA para la detección de la toxina del cólera (TC).

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Cuadro 6. ELISA para la detección de la toxina del cólera (TC) Paso

Reactivo

Recubrimiento

GM1

Bloqueo

 Albumina sérica de bovino (ASB)

Muestra

Diluyente

Concentración

Volumen/pozo

Tiempo de incubación

2 µg/mla

100 µl

De un día para otro

PBS

1%

150 µl

30 minutos

Sobrenadante del cultivo

Ninguno

Sin diluir

100 µl

60 minutes

Bloqueo

 Albumina sérica de bovino (ASB)

PBS

1%

150 µl

30 minutos

 Anticuerpo

 Anticuerpo contra TC preparado en cabra

PBS con ASB al 0,1 %

1:2.000 a

100 µl

60 minutes

Conjugado

IgG anticabra marcada con fosfatasa alcalina

PBS con ASB al 0,1 %

1:5.000 a

100 µl

60 minutes

Sustrato

 p-nitrofenil fosfato disódico

 Amortiguador de dietanolamina H2O

1 mg/ml

100 µl

10 a 20 minutos

Detener la reacción

NaOH

H2O

3M

50 µl

Ninguno

PBS

La dilución óptima de cada reactivo se determinara mediante titulación.

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FIGURA 12. En el ensayo GM,-ELISA para la toxina del cólera, la aparición de un color amarillo distintivo en los pozos de la microplaca indica una reacción positiva.

Coaglutinación

La coaglutinación de la enterotoxina termolábil de E. coli se realiza de manera rápida y sencilla, y requiere poco equipo especializado y capacitación del personal de laboratorio; sin embargo, esta prueba nunca se ha usado para detectar toxina del cólera a partir de sobrenadantes de cultivo de V. cholerae O1.

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FIGURA 12. En el ensayo GM,-ELISA para la toxina del cólera, la aparición de un color amarillo distintivo en los pozos de la microplaca indica una reacción positiva.

Coaglutinación

La coaglutinación de la enterotoxina termolábil de E. coli se realiza de manera rápida y sencilla, y requiere poco equipo especializado y capacitación del personal de laboratorio; sin embargo, esta prueba nunca se ha usado para detectar toxina del cólera a partir de sobrenadantes de cultivo de V. cholerae O1.  Aglutinación de látex

En la prueba de aglutinación de látex se utilizan anticuerpos específicos contra la toxina del cólera o la termolábil de E. coli unidos a partículas de látex. Requiere antisuero de alta calidad o anticuerpos purificados, una preparación adecuada de látex y material de laboratorio de fácil adquisición.

FIGURA 13. Microplaca con resultados de la prueba VETRPLA (Oxoid Limted). La muestra 1 es negativa; las muestras 2, 3, 4, 5 Y 6 son positivas.

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3. Análisis basados en el DNA Sondas de DNA

Las secuencias específicas de DNA en el gen o los genes que codifican la toxina del cólera se han usado como sondas para detectar secuencias de DNA homologas en aislamientos de V. cholerae toxigénico. Primero se marca la sonda con una molécula de fácil detección, como es un radioisótopo, una enzima o un ligando, y entonces se hibrida al DNA del microorganismo de prueba. La sonda solo hibrida aquellos fragmentos de DNA de microorganismos que contengan secuencias homólogas. La sonda no hibridada se desecha, y la sonda hibridada remanente se detecta por medio de una prueba específica que la pone en evidencia.

FIGURA 14.  Resultados de la hibridación con una sonda marcada con digoxigenina para ctx  A; el color morado oscuro indica una reacción positiva.

Reacción en cadena de la polim erasa

En la PCR se utiliza la enzima DNA polimerasa para sintetizar o amplificar copias múltiples de una secuencia específica de DNA (ampliación), la cual puede entonces detectarse en un gel de agarosa o con sondas de DNA. La ampliación de DNA se define por la localización de dos oligonucleótidos cortos y específicos de DNA que señalan la secuencia de interés y son utilizados como iniciadores por la DNA polimerasa. Al igual que las sondas de DNA, el blanco de la PCR es un gen de virulencia, o una secuencia de DNA exclusivo de un microorganismo patógeno. Algunas pruebas de PCR pueden amplificar los segmentos de DNA directamente de las muestras fecales, alimentarias o ambientales; así, se puede determinar la presencia de un microorganismo en una muestra sin cultivarlo.

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Producto de PCR - 564

FIGURA 15. Localización de los iniciadores y tamaño del fragmenta de DNA amplificada en la prueba de la PCR para la detección de ctx  A

ABCDEFGHI KL

564-bp

FIGURA 16. Gel de agarosa con resultados de una prueba PCR típica de la toxina del cólera. Las bandas  A, C, D, E, F, cepas de prueba positivas; las bandas B, J, cepas de prueba negativas; bandas G, K, testigos positivos; bandas H, I, testigos negativas; banda L. escalera de ADN de 1 kb.

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EI Cuadro 7 resume las características importantes de algunas de las pruebas más comunes que se utilizan para la detección de la toxina del cólera. Cuadro 7. Métodos comunes para la detección de la toxina del cólera Prueba

Sensibilidad por ml

Tipo de prueba

Objetivo específico de la prueba

30 ng

Biovaloración

Estimular la acumulación de líquido

Sobrenadante del cultivo

Biovaloración

Estimular la acumulación de líquido

Cultivo en caldo o sobrenadante del cultivo

0,1 a 3,5 ng

Biovaloración

Factor de permeabilidad

Sobrenadante del cultivo

Células suprarrenales Y1 de ratón

10 pg

Biovaloración

Acumulación de AMPc

Sobrenadante del cultivo

Células de ovario de hámster chino

10 pg

Biovaloración

Acumulación de AMPc

Sobrenadante del cultivo

ELISA GM 1

10 pg

Inmunitaria

Subunidad B b

Sobrenadante del cultivo

50 ng

Inmunitaria

Subunidad B

b

1 a 2 ng

Inmunitaria

Subunidad B b

Sondas de DNA

Detecta el gen ctx

Genética

Gen ctx

DNA (improntas de colonias)

PCR

Detecta el gen ctx

Genética

Gen ctx

DNA (lisado de la célula en bruto)

 Asa ileal de conejo

Valoración en conejo lactante Prueba en la piel del conejo

Coaglutinación  Aglutinación inversa pasiva en látex

250 a 500 ng

a

Sensibilidad para la detección de la toxina del cólera utilizando antisuero contra la enterotoxina termolábil de E. coli

b

Subunidad 8 de la molécula de la toxina del cólera.

Muestra estudiada

Lisados del cultivo Sobrenadante del cultivo

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Inmunidad Las defensas no específicas tales como la acidez gástrica, la motilidad intestinal y la mucosa intestinal son importantes en la prevención de la colonización por V. cholerae . Por ejemplo, en las personas que carecen de acidez gástrica (gastrectomía o aclorhidria por desnutrición), la tasa de ataque del cólera es más elevada. Un ataque de cólera va seguido de inmunidad contra la reinfección, pero se desconoce la duración y el grado de inmunidad. El estado inmune se ha asociado con IgG dirigida en contra de la LPS de la pared celular y con la producción de IgA por los linfocitos en las áreas subepiteliales del tracto gastrointestinal. Después de la infección se presentan en el suero anticuerpos similares pero sólo duran algunos meses. Los anticuerpos vibriocidas en el suero (título ≥1:20) se han

relacionado con protección contra la colonización y la enfermedad. La presencia de anticuerpos antitoxina no se ha relacionado con protección.

Tratamiento El desenlace del cólera depende de equilibrar el líquido diarreico y las pérdidas iónicas con un adecuado reemplazo de líquidos y electrólitos. Esto se logra mediante la administración oral, intravenosa, o ambas, de soluciones con glucosa con concentraciones casi fisiológicas de sodio y cloro y concentraciones mayores a las fisiológicas de potasio y bicarbonato. Hay disponibilidad de las formulaciones exactas en forma de paquetes secos a los que se añade

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Inmunidad Las defensas no específicas tales como la acidez gástrica, la motilidad intestinal y la mucosa intestinal son importantes en la prevención de la colonización por V. cholerae . Por ejemplo, en las personas que carecen de acidez gástrica (gastrectomía o aclorhidria por desnutrición), la tasa de ataque del cólera es más elevada. Un ataque de cólera va seguido de inmunidad contra la reinfección, pero se desconoce la duración y el grado de inmunidad. El estado inmune se ha asociado con IgG dirigida en contra de la LPS de la pared celular y con la producción de IgA por los linfocitos en las áreas subepiteliales del tracto gastrointestinal. Después de la infección se presentan en el suero anticuerpos similares pero sólo duran algunos meses. Los anticuerpos vibriocidas en el suero (título ≥1:20) se han

relacionado con protección contra la colonización y la enfermedad. La presencia de anticuerpos antitoxina no se ha relacionado con protección.

Tratamiento El desenlace del cólera depende de equilibrar el líquido diarreico y las pérdidas iónicas con un adecuado reemplazo de líquidos y electrólitos. Esto se logra mediante la administración oral, intravenosa, o ambas, de soluciones con glucosa con concentraciones casi fisiológicas de sodio y cloro y concentraciones mayores a las fisiológicas de potasio y bicarbonato. Hay disponibilidad de las formulaciones exactas en forma de paquetes secos a los que se añade un volumen especificad de agua. El reemplazo oral, en especial si se inicia de manera puntual, es suficiente para todos los casos, a excepción de los más graves, y ha reducido la mortalidad del cólera en forma sustancial. La terapia antimicrobiana representa un papel secundario al del reemplazo de líquidos. La doxiciclina reduce la duración de la diarrea y la magnitud de la pérdida de líquidos. El trimetoprim-sulfametoxazol, eritromicina y ciprofloxacino son alternativas para uso en niños y mujeres embarazadas. Los antimicrobianos tienen un rol secundario en el tratamiento del cólera, ayudan a reducir el volumen de las deposiciones, acortan el período de síntomas y excreción bacteriana. La cepa causante del actual brote en Haití ha demostrado ser susceptible a doxiciclina y también a ciprofloxacino y macrólidos. Cuadro 8. Tratamientos Farmacológicos para el cólera Tratamiento de elección: Adultos: Doxiciclina 300 mg. oral por una vez. Niños menores de 8 años:  Azitromicina 10 mg/Kg. por vía oral por 3 días Niños mayores de 8 años: Doxiciclina 4 mg/ kg (máx 300 mg) por vía oral por 1 vez Embarazadas:  Azitromicina 500 mg. por vía oral por 3 días Tratamiento alternativo: Adultos: Ciprofloxacino 1 gr. por vía oral por una vez  Azitromicina 500 mg. por vía oral por 3 días Niños: Ciprofloxacino en dosis única de 20mg/Kg de peso

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Epidemiología, prevención y control Ocurrieron seis pandemias (epidemias en todo el mundo) de cólera entre 1817 y 1923, causadas muy posiblemente por V. cholerae O1 del biotipo clásico y en gran parte se originaron en Asia, por lo general en el subcontinente indio. La séptima pandemia comenzó en 1961 en las Islas Célebes de Indonesia, con diseminación a Asia, Medio Oriente, y África. Esta pandemia fue causada por V. cholerae biotipo El Tor. La séptima pandemia, que comenzó en 1991, se propagó a Perú y luego a otros países de Sudamérica y Centroamérica. También se presentaron casos en África. En esta pandemia millones de personas han padecido cólera. Hay quienes consideran que el cólera causado por la cepa de serotipo O139 es la octava pandemia que comenzó en el subcontinente Indio en 1992 a 1993 con propagación a Asia. La enfermedad ha sido infrecuente en Norteamérica desde mediados de 1800, pero existe un foco endémico en la costa del Golfo de Louisiana y Texas. El cólera es endémico en India y en el sureste de Asia. Desde estos centros, es transportado por las vías de embarque, rutas de comercio y rutas de migración de peregrinos. La enfermedad se disemina por el contacto de individuos con la enfermedad leve o inicial y por el agua, los alimentos y las moscas. En muchos casos, sólo 1 a 5% de las personas susceptibles expuestas presentan la enfermedad. El estado de portador pocas veces dura más de tres a cuatro semanas y no está clara la importancia de los portadores en la transmisión de la enfermedad. Los vibrios sobreviven en agua hasta por tres semanas. V. cholerae vive en medios acuáticos y tales ambientes son el reservorio natural de los vibrios. V. cholerae vive adherido a algas, copépodos y conchas de crustáceos. Puede sobrevivir por años y multiplicarse, pero cuando las condiciones no son adecuadas para su multiplicación puede volverse latente. El control se basa en la educación y en la mejora de las condiciones sanitarias, sobre todo del alimento y del agua. Se debe aislar a los pacientes, desinfectar sus excretas y realizar seguimiento a los contactos. La quimioprofilaxis con fármacos antimicrobianos puede ser útil. La inyección repetida de una vacuna que contenga lipopolisacáridos extraídos de vibrios o suspensiones densas de Vibrio puede conferir una protección limitada a las personas con una exposición intensa (p. ej., contactos familiares) pero no es una medida eficaz de control epidémico.

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OTROS VIBRIOS 1. Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus es una bacteria halófila produce gastroenteritis aguda tras la ingestión de mariscos contaminados como pescado crudo o crustáceos como las ostras. Es la causa principal de diarrea en Japón, donde el pescado crudo se come en grandes cantidades, pero es un patógeno poco frecuente en Estados Unidos, aunque ha habido varios brotes en cruceros por el Caribe. No se conoce demasiado su patogenia, excepto que secreta una enterotoxina similar al colerágeno y, a veces, se da una invasión limitada. Tras un periodo de incubación de 12 a 24 horas, se presentan náusea y vómito, cólicos abdominales, fiebre y diarrea líquida a sanguinolenta. A menudo se detectan leucocitos fecales. La enteritis tiende a desaparecer en forma espontánea en un lapso de uno a cuatro días sin otro tratamiento que no sea el restablecimiento del equilibrio hidroelectrolítico. La enfermedad es autolimitada y dura unos 3 días. Vibrio parahaemolyticus se distingue del V. cholerae principalmente por el crecimiento en NaCl: Vibrio parahaemolyticus crece en una solución de NaCl al 8 % (la que corresponde a un microorganismo marino), mientras que el V. cholerae no puede crecer. No existe un tratamiento específico indicado, porque la enfermedad es relativamente leve y autolimitada. La enfermedad puede evitarse con una buena refrigeración y con la cocción de los mariscos.

FIGURA 17. Vibrio parahaemolyticus

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2. Vibrio Vulnificus Vibrio vulnificus puede causar infecciones graves de

heridas,

bacteriemia

y

probablemente

gastroenteritis. Es una bacteria de estuarios, de vida libre que existe en Estados Unidos en el  Atlántico y las costas del Pacífico y sobre todo en la costa del Golfo. Se han comunicado infecciones en Corea y el microorganismo puede tener una distribución mundial. Es muy posible que V. vulnificus se encuentre en ostiones, sobre todo en los meses cálidos. La bacteriemia sin un

FIGURA 6. Vibrio Vulnificus

foco infeccioso ocurre en personas que han consumido ostiones infectados o en alcohólicos o hepatópatas. Las heridas pueden infectarse en personas normales o en inmunodeprimido s que entran en contacto con agua donde está presente la bacteria. La infección suele evolucionar con rapidez, con la aparición de una enfermedad grave. Casi 50% de los pacientes con bacteriemia fallece. Las infecciones de las heridas pueden ser leves pero a menudo evolucionan con rapidez (en el curso de algunas horas) presentándose lesiones cutáneas ampollosas, celulitis y miositis con necrosis. Varios de los primeros decesos en Louisiana y Texas después del huracán Catrina fueron ocasionados por Vibrio vulnificus. Dado el avance rápido de la infección, a menudo es necesario tratarla con antibióticos apropiados antes que se confirme la causa mediante cultivo. El diagnóstico se establece con el cultivo del microorganismo en medios estándares de laboratorio; TCBS es el medio preferido para los coprocultivos, donde la mayor parte de las cepas produce colonias color verde-azuloso (sacarosas negativas). La tetraciclina al parecer es el antimicrobiano de elección para la infección por V. vulnificus. Ciprofloxacina también puede ser eficaz basándose en la actividad in vitro.

3. Otros vibrios Otros vibrios diversos también producen enfermedad en el ser humano: Vibrio mimicus produce diarrea tras la ingestión de mariscos mal cocidos, sobre todo ostiones crudos. Vibrio hollisae y Vibrio fluvialis también producen diarrea. Vibrio alginolyticus es causa de infecciones oculares, óticas o de heridas tras la exposición al agua de mar. Vibrio damsela también produce infecciones de heridas. Otros vibrios son causas muy infrecuentes de enfermedad en el ser humano.

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