UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
LABORATORIO LABORAT ORIO DE MICROBIOLOGÍA
“TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS”
DOCENTE: Juscamaita CURSO:
Morales, Juan.
MICROBIOLOGÍA GENERAL
GRUPO: B* INTEGRANTES:
Contreras Leiva, Kenith. Mayhua Esteban, Daniela. Rodríguez antill!n, Lesly. Rom!n Ro"as, #enry. #uatuco Mendoza, Katherine.
Lima–2015 $%&'(R)D*CC&+'
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio. Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasicar en autótrofos si es el C! atmosf"rico #microorganismos que fotosintetizan$ y %eterótrofos si utilizan carbono org&nico. 'a elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. (sí, por e)emplo, el C debe estar en forma de carbono org&nico para los %eterótrofos y como C! para los autótrofos, el * en forma de *+, de *- o de *! o en forma de amino&cidos a los que se pueda tomar su grupo amino/ el 0 debe estar en forma de 0 -, el 1 procede de amino&cidos sulfurados o de 1 !, etc. (dem&s, en ciertos casos, es necesario a2adir a los medios de cultivo algunos amino&cidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. 'os medios de cultivo se pueden clasicar en denidos cuando su composición química se conoce totalmente y comple)os cuando no es el caso porque est&n compuestos por mezclas de e3tractos de materiales comple)os #e3tracto de levadura, e3tracto de carne, etc.$. 0or otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se a2ade alg4n agente solidicante que no sea consumible por los microorganismos #normalmente agar$. En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros #por e)emplo, el medio 101 para clostridios$, diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identicar las colonias de un tipo de microorganismos #por e)emplo medios con %ematíes para identicar colonias de microorganismos %emolíticos$, selectivodiferenciales cuando combinan las dos características anteriores #por e)emplo, el agar de 5acCon6ey para identicar Escherichia coli$, y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mi3ta de gran tama2o. #7al6er, !888$.
%)-JE(&) •
•
bservar características de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo líquido y sólido. 1eparar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismo utilizando t"cnicas de aislamiento.
/% RE*L(0D) A) CULTIVO: Bacillus sp.
MEDIO SOLIDO: Tubo con agar nutritivo
MEDIO LIQUIDO: Tubo con caldo nutritivo
MEDIO INCLINADO Tubo con agar nutritivo inclinado
Cantidad1 Cantidad1 Crecimiento1
Escasa.
'imitado a la línea de inoculación o picadura profunda.
03ariencia o ti3o1
(bundante.
Distribuci2n en la su3er4cie9 :rregular.
5orma de crecimiento1 Equinulado. Crece en diferentes formas, sin borde denido y compactas difundi"ndose en el medio.
Consistencia del crecimiento1 ;iscoso.
PLACA CON AA! NUT!ITIVO
PLACA CON AA! MANITOL
PLACA CON AA! MAC CON"E#
Cantidad:
Escasa (1)
Cantidad:
Escasa (1) Cantidad:
Di$tribuci%n &n $u'&r(ici&: Regular
Abundante(76) Di$tribuci%n &n $u'&r(ici&: Irregular
la
Circular
or*a d& cr&ci*i&nto:
Circular Con$i$t&ncia cr&ci*i&nto:
or*a d& cr&ci*i&nto:
Pig*&ntaci%n:
la
Di$tribuci%n &n $u'&r(ici&: Regular
la
or*a d& cr&ci*i&nto:
Circular Pig*&ntaci%n:
guinda
Fucsia d&l
Butirosa Pig*&ntaci%n:
Blanco
+) T,cnica$ d& cultivo 'or ai$la*i&nto d& *icroorgani$*o: -ugo conc&ntrado d&l .ato/
C) T,cnica d& cultivo 0u& '&r*it& obt&n&r lo$ *icroorgani$*o$ 'or diluci%n &n 'laca$ d& agar nutritivo $%lido1
+ILLETE
MANO
Descripción: Se logra observar colonias de
Descripción: Aparici$n de colonias color
diferente tipo !a" colonias circulares #escripci$n% se logra observar colonias de diferente tipo !a" colonias circulares #escripci$n% Aparici$n de colonias color blan&uecinas de for'a lobulada Con ellos pode'os de'ostrar &ue el dinero est alta'ente conta'inado
blan&uecinas de for'a entera+ esto nos indica &ue los 'icroorganis'os son cos'opolitas " se encuentran en todo lugar !asta en nuestro cuerpo
Número de colonias: *77
Número de colonias: ,,
PELO
2UO DEL .ATO/ Descripción: Se observa pocas colonias
de color blanco " for'a circular Descripción: colonia Co'probando as- &ue el refresco del gato circular Número de colonia: 1 estaba conta'inado Numero de colonias: 6
blanca de
for'a
MOSCA
#escripci$n% se logra observar colonias de diferente tipo !a" colonias circulares blancas otras de color cre'a #e acuerdo a la for'a !a" puntifor'es circulares e irregulares Número de colonias: ,,
6%D&C*&)'E Staphylococcus sp.
1eg4n 0a%issa #!88=$, el medio selectivo m&s empleado para identicar 1tap%ylococcus sp es el agar sal manitol #medio C%apman$, que por su elevado contenido en sal in%ibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias gramnegativas. Escherichia coli sp
1eg4n #0etrera, !8>$ 'as colonias de la bacteria Escherichia coli sp. varían seg4n el medio de cultivo donde crezcan, en este caso el medio de cultivo es (gar Eosina (zul de 5etlileno abreviado E5?, podemos observar en la imagen que las colonias tienen en demasía una coloración verde metalico, lo cual es característico de E. coli, aunque %ay otras bacterias que logran producir este color es muy tenue y escaso. 1e logran ver colonias aisladas, son colonias medianas, circulares, conve3as, moradas, contorno verdemetalico, bordes redondeados. Bacillus sp.
la apariencia de estar secas, una protuberancia en el centro les da una apariencia de %uevo estrellado. #0etrera, !8>$
(.Colonias medianas, conve3as, blanquecinas como cera, forma fusiforme y circular, bordes redondeados. ?. Colonias @randes, planas, blanquecinas, forma irregular, bordes lobulados, dan tambi"n se observa de las colonias lo cual
7%C)'CL*&)'E Se logr$ observar las colonias de Bacillus sp. en 'edios de caldo agar inclinado " agar vertical nutritivo Se logr$ separa las colonias por los '.todos de las estr-as en los 'edios e cultivo en placas /etri (/etrera *01) E2E!CICIO 3: CUESTIONARIO 1:
314 Por 0u, alguno$ *icroorgani$*o$ d&$arrollan &n caldo un caract&r5$tico cr&ci*i&nto d& '&l5cula1 Qu, (actor&$ a*bi&ntal&$ 'odr5an alt&rar la (or*aci%n d& una '&l5cula $u'&r(icial6
/or&ue para obtener el creci'iento $pti'o de los 'icroorganis'os no s$lo son indispensables los re&ueri'ientos nutricionales sino otros factores a'bientales tanto f-sicos co'o &u-'icos 2n agente f-sico es la !u'edad te'peratura presi$n os'$tica el p3 las radiaciones " los filtros Este creci'iento se ve 'odificado por el ca'bio en los factores a'bientales El conoci'iento de estos factores li'itantes del creci'iento 'icrobiano se puede utili4ar para su control sobre todo en el caso de organis'o &ue son pat$genos &ue causan deterioro en los ali'entos o &ue dan lugar a p.rdidas econ$'icas en diferentes for'as ( Roberto Alarc$n 5 *001) 714 Cuando utili8a tubo$ d& agar inclinado 'ara &l &$tudio d& la$ caract&r5$tica$ d& cr&ci*i&nto &$ 'r&(&ribl& inocular con agu-a d& 9oll& no con a$a ;Por 0u,6
Al reali4ar la inoculaci$n del cultivo por la t.cnica de estr-as la calidad del ra"ado depender de la cantidad de bacterias &ue se to'en en el in$culo " ello depende de la concentraci$n de bacteria en la 'uestra original Siendo usual'ente el principal proble'a el in$culo ecesivo &ue no per'ite separa colonias (Rodr-gue4 *00,) /or lo cual fue necesario usar el agua de 8olle en ve4 de la asa de 8olle "a &ue la pri'era per'ite to'ar una 'uestra 'enos concentrada de bacterias <14 ;Qu, (actor&$ in(lu&nciar=n &n la abundancia d&l cr&ci*i&nto &n caldo> agar inclinado agar v&rtical6
9
Condiciones generales para el cultivo de 'icroorganis'os% (/etrera *01) Di$'onibilidad d& nutri&nt&$ ad&cuado$:
2n 'edio de cultivo adecuado para la investigaci$n 'icrobiol$gica !a de contener co'o '-ni'o carbono nitr$geno a4ufre f$sforo " sales inorgnicas En 'uc!os casos sern necesarias ciertas vita'inas " otras sustancias inductoras del creci'iento Sie'pre !an de estar presentes las sustancias adecuadas para eercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones &u-'icas &ue tengan lugar :odas estas sustancias se su'inistraban original'ente en for'a de infusiones de carne etractos de carne o etractos de levadura Sin e'bargo la preparaci$n de estas sustancias para su aplicaci$n a los 'edios de cultivo provocaba la p.rdida de los factores nutritivos lbiles Actual'ente la for'a 's etendida de aportar estas sustancias a los 'edios es utili4ar peptona &ue ade's representa una fuente fcil'ente ase&uible de nitr$geno " carb$n "a &ue la 'a"or-a de los 'icroorganis'os &ue no suelen utili4ar directa'ente las prote-nas naturales tienen capacidad de atacar los a'inocidos " otros co'puestos 's si'ples de nitr$geno presentes en la peptona Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas espec-ficas por lo &ue se a;ade a 'uc!os 'edios sustancias co'o suero sangre l-&uido asc-tico etc Igual'ente pueden ser necesarios ciertos carbo!idratos " sales 'inerales co'o las de calcio 'agnesio 'anganeso sodio o potasio " sustancias pro'otoras del creci'iento general'ente de naturale4a vita'-nica
/artiendo de un 'edio l-&uido pode'os 'odificar su consistencia a;adiendo productos co'o alb='ina gelatina o agar con lo &ue obtendr-a'os 'edios en estado se'is$lido o s$lido 5os 'edios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de &ue 'uc!os 'icroorganis'os no se desarrollan adecuada'ente a te'peraturas inferiores al punto de fusi$n de este solidificante " de &ue otros tienen la capacidad de licuarla
Actual'ente los 'edios s$lidos son de uso universal por su versatilidad " co'odidad pero !a" ta'bi.n gran cantidad de 'edios l-&uidos cu"o uso est a'plia'ente etendido en el laboratorio Pr&$&ncia ?o au$&ncia) d& o@5g&no otro$ ga$&$:
>ran cantidad de bacterias pueden crecer en una at'$sfera con tensi$n de o-geno nor'al Algunas pueden obtener el o-geno directa'ente de variados sustratos /ero los 'icroorganis'os anaerobios estrictos s$lo se desarrollarn adecuada'ente en una at'$sfera sin o-geno a'biental En un punto inter'edio los 'icroorganis'os 'icroaer$filos crecen 'eor en condiciones at'osf.ricas parcial'ente anaerobias (tensi$n de o-geno 'u" reducida) 'ientras los anaerobios facultativos tienen un 'etabolis'o capa4 de adaptarse a cual&uiera de las citadas condiciones Condicion&$ ad&cuada$ d& u*&dad:
2n nivel '-ni'o de !u'edad tanto en el 'edio co'o en la at'$sfera es i'prescindible para un buen desarrollo de las c.lulas vegetativas 'icrobianas en los cultivos 3a" &ue prever el 'anteni'iento de estas condiciones '-ni'as en las estufas de cultivo a ?,9?7@C proporcionando una fuente adecuada de agua &ue 'antenga la !u'edad necesaria para el creci'iento de los cultivos " evitar as- &ue se dese&ue el 'edio
Lu8 a*bi&ntal:
5a 'a"or-a de los 'icroorganis'os crecen 'uc!o 'eor en la oscuridad &ue en presencia de lu4 solar 3a" ecepciones evidentes co'o ser-a el caso de los 'icroorganis'os fotosint.ticos ':
5a concentraci$n de iones !idr$geno es 'u" i'portante para el creci'iento de los 'icroorganis'os 5a 'a"or-a de ellos se desarrollan 'eor en 'edios con un p3 neutro aun&ue los !a" &ue re&uieren 'edios 's o 'enos cidos o se debe olvidar &ue la presencia de cidos o bases en cantidades &ue no i'piden el creci'iento bacteriano pueden sin e'bargo in!ibirlo o incluso alterar sus procesos 'etab$licos nor'ales T&*'&ratura:
5os 'icroorganis'os 'es$filos crecen de for'a $pti'a a te'peraturas entre 1, " ?@C tros co'o los psicr$filos crecen a 0@C " los ter'$filos a 0@C o incluso a te'peraturas superiores (!iperte'$filos) En l-neas generales los pat$genos !u'anos crecen en rangos de te'peratura 'uc!o 's cortos alrededor de ?7@C " los saprofitos tienen rangos 's a'plios E$t&rilidad d&l *&dio:
:odos los 'edios de cultivo !an de estar perfecta'ente est.riles para evitar la aparici$n de for'as de vida &ue puedan alterar en'ascarar o incluso i'pedir el creci'iento 'icrobiano nor'al del o de los espec-'enes inoculados en dic!os 'edios El siste'a clsico para esterili4ar los 'edios de cultivo es el autoclave (&ue utili4a vapor de agua a presi$n co'o agente esterili4ante) E2E!CICIO 7: CUESTIONARIO 2:
314 ;Qu, 'roc&di*i&nto $&guir5a a continuaci%n d&l d&$arrollo &n &$to$ &-&rcicio$ 'ara obt&n&r &l cultivo 'uro d& cada c&'a cont&nida &n la *&8cla61 ;C%*o 'odr5a*o$ co*'robar 0u& &$ta$ c&'a$ obt&nida$ (inal*&nt& corr&$'ond&n a la$ colonia$ ai$lada$6
En pri'er lugar se debe !acer un proceso de aisla'iento de colonias el cual consiste en dise'inar estos 'icroorganis'os en una placa de 'uestra de tal 'anera &ue puedan desarrollarse de for'a separada 5uego se proceder a trasportar con a"uda de un asa de Dlle una 'uestra del 'icroorganis'o a un tubo con agar nutritivo para el creci'iento del 'is'o /ara deter'inar la pure4a de los 'icroorganis'os antes cultivados se deber reali4ar el proceso antes 'encionado una o dos veces 's as- se podr obtener un cultivo puro ade's se podr co'probar si las colonias presentes al final del procedi'iento tienen las 'is'as caracter-sticas entre s- (/E#RI2E < " >2:IGRREH S)
714 ;Qu, (actor&$ li*itan &l ta*aBo d& la$ colonia$ &n una 'laca d& cultivo6
Eisten diferentes factores &ue afectan el ta'a;o de las colonias en los factores f-sicos " &u-'icos tene'os a la te'peratura la cual es i'portante pues los 'icroorganis'os tienen una te'peratura de creci'iento deter'inada " si esta no es la correcta la velocidad de creci'iento obtendr una variaci$n a la nor'al "a sea au'entado o dis'inu"endo 5a actividad de agua es otro factor "a &ue los 'icroorganis'os general'ente necesitan un alto valor de actividad de agua para su $pti'o creci'iento 2n tercer factor &ue pode'os 'encionar es el p3 pues las bacterias tienen un rango estrec!o de p3 en el cual pueden desarrollar sino ellos 'orirn /or otro lado se puede clasificar a un factor co'o orgnico "a &ue los 'icroorganis'os necesitan de nutrientes los cuales lo obtienen de vita'inas a'inocidos purinas " piri'idinas+ sin ellas el creci'iento puede ser afectado (Stanier 1*) <14 Su'onga 0u& r&cib& una *u&$tra d& l&c& &n 'olvo $& l& 'id& d&t&r*inar &l n*&ro total d& colonia$ 'or gra*o1 Plant&& una *&todolog5a cuantitativa ba$ada &n dilucion&$ $uc&$iva$ 'ara r&$olv&r &l 'robl&*a1
#ado &ue la 'uestra es s$lida debe licuarse 10 g de 'uestra con 0 'l de agua destilada /ara luego transferir con una pipeta 1 'l (con una incertidu'bre de 'edici$n de J , K) de la suspensi$n inicial en un tubo con 'l del dilu"ente est.ril /ara una $pti'a precisi$n no introducir la pipeta 's de 1 c' en la suspensi$n inicial " evitar el contacto entre la pipeta &ue contiene el in$culo " el dilu"ente est.ril (Renaloa *01)
Este '.todo se basa en la presunci$n de &ue las bacterias se !allan unifor'e'ente distribuidas en un 'edio l-&uido o sea &ue las 'uestras del 'is'o ta'a;o de un 'is'o producto tendr-an el 'is'o n='ero de 'icroorganis'os atural'ente las 'uestras contienen algunos g.r'enes 's o 'enos Entonces la cifra 'edia es el n='ero 's probable (5$pe4 :eve4 5 L :orres C *006)
5as bacterias rara ve4 estn separadas de sus vecinas Ellas se agrupan en raci'os en especial cuando se reproducen activa'ente Ade's la agitaci$n puede des!acer o inducir a la for'aci$n de raci'os /or lo tanto carecen de valor las pruebas &ue se obtienen de una prueba aislada (5$pe4 :eve4 5 L :orres C *006) Si el n='ero de g.r'enes es grande la diferencia entre las 'uestras ser pe&ue;a pero si son pe&ue;as las diferencias relativa'ente sern 'a"ores Esta t.cnica se usa principal'ente para la esti'aci$n de bacilos colifor'es en caldo
Seg=n >arc-a (*006) Métodos de elección o de conservación a largo plazo:
Son los 'eores por&ue en ellos se parali4a el creci'iento de las c.lulas 'icrobianas pero .stas no !an 'uerto As- se garanti4a al 'i'o la estabilidad gen.tica por evitarse la aparici$n de generaciones sucesivas A=n as- no se puede descartar alg=n ca'bio originado por el '.todo preparatorio en s- 'is'o 5os '.todos de conservaci$n pertenecientes a este grupo son dos% Congelaci$n " liofili4aci$n <.todos alternativos% Son los &ue se utili4an cuando no se pueden e'plear los '.todos de elecci$n bien por carecer de los e&uipos necesarios o bien por&ue la cepa 'icrobiana no resiste los trata'ientos de la conservaci$n por estos '.todos Conviene tener en cuenta &ue nunca se debe usar un =nico '.todo alternativo sino &ue se reco'ienda conservar el 'icroorganis'o e'pleando varios de estos '.todos% a) Con$&rvaci%n 'or tran$(&r&ncia '&ri%dica1
5a cepa 'icrobiana se guarda en for'a de cultivo activo en el 'edio de cultivo en el &ue !a crecido b) Con$&rvaci%n 'or $u$'&n$i%n &n agua d&$tilada o &n agua d& *ar &$t,ril1
Es un '.todo alternativo 'u" utili4ado " &ue da altos porcentaes de viabilidad en diversos tipos de 'icroorganis'os tanto !ongos fila'entosos co'o levaduras " algunas bacterias <.todos restringidos% En este grupo se engloban '.todos no e'pleados !abitual'ente pero a los &ue es necesario recurrir a la !ora de conservar grupos de 'icroorganis'os 'u" deter'inados &ue no resisten bien la liofili4aci$n o la congelaci$n co'o por ee'plo los g.neros bacterianos Spirillu' R!odospirillu' etc 5os cuatro '.todos &ue va'os a citar se basan en la parali4aci$n del creci'iento por eli'inaci$n del agua disponible para las c.lulas% a) #esecaci$n en papel de filtro b) #esecaci$n en suelo arena silicagel etc c) #esecaci$n en bolitas de alginato d) #esecaci$n en sal gorda para !alobacterias F14 ;Qu, t,cnica$ d& cultivo $& &*'l&an 'ara ai$lar *icroorgani$*o$ ana&r%bico$6
MED&)DE C*L(&) 80R0 0'0ER)-&). 9*, :$7%. 0gar sangre 3ara anaerobios con L;cistina, hemina y vitamina K1 5edio no selectivo de uso general.
0gar chocolate1 Utilizado principalmente para aislar especies de Neisseria y haemophilus,
sin embargo se puede requerir para el aislamiento de anaerobios e3igentes.
0gar alcohol
0gar Columbia con colistina y !cido nalidí=ico 9C'0%1 aislamiento de anaerobios
obligados @ram positivos.
0gar KL- 9>anamicna, vancomicina, sangre lacada%1 (islamiento selectivo de @ram
negativos anaerobios.
Caldo trioglicolato 9enri?uecido con L;cistina, hemina y vitamina K%. Caldo de carne 3icada1 caldos de enriquecimiento que se pueden usar como suplemento de medios solidos particularmente si la muestra escasa #se pueden a2adir unas gotas de parana líquida para mantener me)or la atmosfera anaerobia$. 1ubcultivar en medio de anaerobios.
F)
+I+LIO!AIA: >ARCMA 5N/EH 2R2B2R2 FERO#EH *006 5a conservaci$n de cepas 'icrobianas Colecci$n Espa;ola de Cultivos :ipo (CEC:) 2niversitat de PalQncia 6100 Burassot (Palencia) 5N/EH :EPEH 5ER L :RRES CAR5A *006 Estudio cuantitativo de bacterias enera 2niversidad acional del ordeste Consultado el * de ctubre del *01, #isponible en% !ttp%biologiaeduar'icrogeneraltp,pdf /E#RI2E < " >2:IGRREH S :rabao /rctico T btenci$n de Cultivos /uros Uen l-neaV W!ttp%ucvvefilead'inuserXuploadfacultadXfar'aciacatedra
REA5A (Red acional de 5aboratorios ficiales de Anlisis de ali'entos *01 Anlisis 'icrobiol$gico de los ali'entos 0ClB2C]!l\es
R#RM>2EH CAPA55II EPE5L >AARCMA 3I#A5> ZR>E*00, Bacteriolog-a general principios " prcticas de laboratorio /ri'era edici$n Editorial 2niversidad de Costa Rica Costa Rica S:AIER 1* ra93ill Intera'ericana Editores SA de CP <.ico #F
