Aplicación del Método de Estándar Interno a la Cromatografía de Gases Prof. Jorge Castillo R, 7 / Enero / 2010 Introducción: El método del estándar interno debe su nombre a la forma como se preparan las muestras a ser analizadas. El estándar interno es una sustancia que se añade a todas las muestras y estándares en cantidad conocida y a la vez en cantidad suficiente para poder ser determinado sin problemas, Su adición no debe de causar ningún tipo de interferencia en el análisis, y debe de proporcionar una señal analítica similar al analito en el análisis pero distinguible del mismo. Además el estándar interno No debe estar presente en la matriz en estudio. Los métodos basados en la adición de un estándar interno generalmente se utilizan cuando el analista esta interesado en la concentración de uno o algunos de los componentes y el método de análisis es susceptible a errores tanto sistemáticos como al azar.
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que el área de A es igual al área de B (500 u ). Los resultados se pueden observar en la figura 1. Basándonos simplemente en las áreas de los compuestos, compuestos, sin emplear los factores de respuesta, podemos suponer que habrá igual cantidad (concentración) del compuesto A y del compuesto B en la mezcla, 50% de cada uno. Sin embargo podríamos tener un error Figura 1 relativamente grande ya que lo normal es que los factores de respuesta sean diferentes para cada uno de los compuestos.
Supongamos ahora que inyectamos 1ul de cada uno de los compuestos A y B puros, empleando las mismas condiciones El método esta basado en que cuando las señales del analito y cromatográficas que la mezcla (figura 1) y que se obtienen las áreas del estándar interno responden proporcionalmente a las fluctuaciones mostradas en la (figura 2). Empleando estas áreas calculemos ahora del método y del instrumental empleado, entonces la razón de estas los factores de respuesta: señales es independiente de tales fluctuaciones; De esta forma el método compensa por errores errores provenientes de la manipulación de la FB = CB /AB = 100/1666.7 = 0.06 muestra por analizar. FA = CA /AA = 100/714.29 = 0.14 Un ejemplo del método lo encontramos en la determinación Como podrá observar existe una espectroscópica de sodio y potasio en suero sanguíneo por emisión relación inversa entre estos factores de atómica. El estándar interno es generalmente litio el cual tiene una respuesta y el área del pico señal de emisión comparable al analito pero no se encuentra cromatográfico; Entre mas pequeño naturalmente en la sangre; La emisión de litio ocurre a diferente sea el factor mas grande será el área y longitud de onda que el sodio y potasio por lo que se puede analizar mayor la sensitividad del detector para sin problemas de interferencias espectrales; además su adición en la ese analito. analito. Por lo tanto el detector cantidad requerida no afecta la matriz en estudio (sangre) y no cromatográfico será mas sensitivo para interfiere químicamente con el analito. Al llevar a cabo el análisis de el compuesto B ya que produce la Figura 2 la muestra se determina simultáneamente la lectura de emisión de mayor señal (área) para el. sodio, potasio y litio, si en algún momento existe un error (fluctuación) en el análisis, podemos esperar que el mismo afecte de manera Empleando los factores de respuesta calculemos ahora la similar las lecturas del analito y del estándar interno y podamos verdadera concentración de los componentes en la mezcla compensar el análisis. desconocida (figura 1).
Factores de Respuesta:
CA = AA*FA = (500)*(0.14) = 70% CB = AB*FB = (500)*(0.06) = 30%
Para aplicar el método del estándar interno a la cromatografía de gases debemos primeramente emplear correctamente los factores Por tanto, los errores en la determinación son muy grandes: de de respuesta, por lo que se dará a continuación una pequeña un 66.7% para A y 28.6% para para B si se compara al 50% supuesto. introducción a la utilización y determinación de los factores de Método del Estándar Interno respuesta del detector al analito. Tanto en cromatografía como en la gran mayoría de las técnicas instrumentales de análisis, es poco frecuente que todos los componentes de una muestra tengan una misma respuesta en el detector, es por esta razón que debemos emplear la misma sustancia a analizar (analito) en forma pura para preparar los estándares en una curva de calibración, además de tratar de mantener las mismas condiciones del método y del inst rumental que serán empleados en el análisis para todas las muestras muestras (estándar y desconocido) desconocido)
En el método de estándar interno se emplea normalmente una curva de calibración (figura. 3) empleando una serie de soluciones que contienen igual cantidad del estándar interno e incrementos en la cantidad del analito. Se inyectan las soluciones y del cromatógrama obtenemos el área del analito y el área del estándar intern, se calcula la relacion entre las áreas (A analito /A /AEst.Int.) y se gráfica contra la Básicamente los factores de respuesta se obtienen de la concentración de analito en siguiente relación: cada solución. Finalmente se Ci = FiAi interpola en la gráfica obtenida el valor de la razón Así el factor de respuesta del detector (F) a una sustancia es de áreas de una muestra una constante que correlaciona el área (A) con la concentración (C). desconocida, la cual debe contener la misma cantidad Para ejemplificar los problemas que acarrearía el NO considerar de estándar interno que los los factores de respuesta en un análisis cromatográfico consideremos patrones. el siguiente ejemplo: Figura 3 Curva de Calibración (Estándar Interno) Por desgracia en el Supongamos que inyectamos 1ul de una solución desconocida experimento de laboratorio que contiene ambos disolventes A y B. Al inyectar esta mezcla en un (GC2) no tenemos el tiempo para realizar el análisis de las soluciones cromatógrafo de gases se separaron los componentes y se encontró patrón requeridas por lo que solo empleamos un solo estándar (patrón) y supondremos una relación lineal entre la razón de áreas y Laboratorio de Análisis Instrumental Instrumental / Primavera 2010/ Prof. Jorge Castillo
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la concentración de analito. El análisis se efectúa de la siguiente manera: Se prepara una solución patrón de concentración conocida tanto del estándar interno como del analito, con lo que se establecerá una relación entre sus concentraciones, en nuestro caso: CA = CEi
ˆ
AA FA = AEi FEi
ˆ
FA = (AEi FEi )/AA
Ahora asignaremos al estándar interno un factor de respuesta igual a la unidad (1.0) esto nos permitirá calcular el factor F A en función del estándar interno, de tal forma que el factor obtenido será un factor de respuesta relativo. Una vez encontrado el valor del factor de respuesta relativo del compuesto procederemos a analizar los datos del desconocido, el cual debe contener una concentración conocida del estándar interno (CEiD). Emplearemos para ello las áreas del analito (A AD) y del estándar interno (A EiD) en la muestra del desconocido, para obtener la concentración del analito en el desconocido, se procederá de la siguiente forma: CAD = FAAAD y CEiD = FEiAEiD
ˆ
CAD /CEiD = (FAAAD)/(FEiAEiD)
CAD = (FA AAD CEiD )/ (FEi AEiD) De esta forma se obtiene el valor de la concentración del analito en el desconocido (C AD). Recuerde que en el experimento GC2 se calculan los factores para cada inyección del patrón y luego estos se promedian; De igual forma, la concentración del analito se determina en cada inyección del desconocido y luego se promedian.
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