[EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO] MICROBIANO]
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Práctica. Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
1. OBJETIVOS y
Que el estudiante conozca el efecto del pH y la temperatura como parámetros de control del crecimiento microbiano.
2. INTRODUCCIÓN El
ambiente donde se desarrolla un microorganismo tiene una gran influencia sobre su crecimiento, al igual que las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasificar en tres grupos:
a) Físicos: temperatura, presiones externas, humedad. b) Químicos: pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de productos tóxicos. c) Biológicos: las interacciones microbianas entre las especies coexistentes. Algunos microorganismos están adaptados a los hábitats extremos, donde otros definitivamente no pueden sobrevivir. Pero hay factores ambientales que se controlan en condiciones de l aboratorio aboratorio con mayor frecuencia, además de los factores nutrimentales son los fisicoquímicos como: la temperatura y el pH. Todos los microorganismos tienen una temperatura óptima de crecimiento crecimiento que los caracteriza, en l a cual muestran su tasa más alta de crecimiento. También hay límites de temperatura, como la temperatura mínima a la cual son inactivos y la temperatura máxima, máxima, donde el crecimiento ya no es posible. De acuerdo a la temperatura microorganismos se clasifican en: y
óptima
de
crecimiento,
los
Psicrófilos: Cuando su crecimiento es a temperaturas entre 0-20 °C. Por ejemplo, Polar omonas vacuolata, hallado en el océano Antártico, siendo su temperatura óptima es de 4 °C. INGENIERÍA DE BIORREACTORES | 1
[EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO] y
y
y
Mesófilos:
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Cuando su crecimiento es a temperaturas entre 20-40
°C. Termófilos: Cuando su crecimiento es a temperaturas entre 40-80 °C. Hipermófilos: Cuando su crecimiento es a temperaturas entre 80100 °C. La mayoría de estos microorganismos son arqueas como Methanococcus igneus.
La concentración de iones hidrógeno del medio afecta directamente a los microorganismos y las enzimas, e influye también en la disociación y solubilidad de moléculas que requieren. Dependiendo del pH en el cual se desarrollen los microorganismos se clasifican en: y
y
Acidófilos: Crecen a pH menores de 5. Por ejemplo, Sulfolobus y Thiobacillus que crece a pH 1-2 oxidando minerales de sulfuro para producir ácido sulfúrico. Alcalófilos: Crecen a pH mayores a 9, como algunas especies de Rhizobium, bacill us y algunas bacterias entéricas.
Cada microorganismo tiene un pH y temperatura óptimos, por lo cual al modificar estos factores la velocidad de crecimiento se puede alterar y causar la muerte de los mismos, por lo que se pueden emplear como factores de control de crecimiento microbiano.
3.
y y y y
y
y
y
y
y
MATERIALES 2 Cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa ajustado a pH 5. 2 Cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa ajustado a pH 7. 2 Cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa ajustado a pH 9. 9 tubos con 7 mL de caldo de microinoculación ajustado sin amortiguar. 3 tubos con 7 mL de caldo de microinoculación ajustado sin amortiguar. 3 tubos con 7 mL de caldo de microinoculación ajustado sin amortiguar. 3 tubos con 7 mL de caldo de microinoculación ajustado con amortiguador. 3 tubos con 7 mL de caldo de microinoculación ajustado con amortiguador. 3 tubos con 7 mL de caldo de microinoculación ajustado con amortiguador.
a pH 7 a pH 5 a pH 9 a pH 7 a pH 5 a pH 9
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y
1 asa de inoculación. 3 pipetas estériles. 1 mechero Fisher. Espectrofotómetro. Microscopio Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10.
4.
PROCEDIMIENTO
y y y y y
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Se
proporcionará a los alumnos, cultivos líquidos de bacterias: E scherichia coli y Lact obacillus sp. Y una suspensión de esporas de los hongos: Aspergillus niger y Penicillium r oquefo rti. Etiquetando cada uno de las cajas y tubos para su correcta identificación.
4.1.
EFECTO DE LA TEMPERATURA 1.
2.
3.
4. 5.
4.2.
En 3
cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa divididas en 2 secciones, inocular 0.1 mL de la suspensión de esporas de hongos en cada sección. Incubar una caja de Petri a 15 °C, otra a 30 °C y la última a 45 °C en forma invertida durante 72 horas y posteriormente hacer las observaciones macroscópicas y microscópicas. En 6 tubos de caldo de microinoculación ajustado a pH 7, inocular 3 con cada una de las cepas bacterianas. Incubar 2 tubos de diferente cepa a 15 °C, otros 2 tubos a 30 °C y los últimos 2 tubos a 45 °C durante 24-48 horas. Medir la D.O.
EFECTO DEL pH 1. Preparar tres series de tres tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de pH (5, 7 y 9) con solución de HCl 1 M o NaOH 1 M. 2. Preparar otra tres series de tres tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando soluciones amortiguadoras, véase tabla siguiente:
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pH
K2HPO4 0.2 M (mL)
4.4
0.9 1.9 ----
7.6
10 3.
4. 5.
6. 7.
5.
Ácido Ácido NaOH cítrico bórico 0.2 M (mL) 0.1 M (mL) 0.2 M (mL) 1.1 0.1 ----
------1
------1
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Caldo nutritivo (mL) 8 8 8
Inocular 0.1 mL de cada una de las cepas bacterianas en la serie de 4 tubos de caldo de microinoculación ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando 1 sin inocular como testigo. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas y medir la D.O. Inocular tres cajas de Petri con medio Agar Papa Dextrosa ajustado a 3 pH diferentes con cada una de las cepas de hongos. Incubar las cajas de Petri por 72 horas. Realizar observaciones macroscópicas y microscópicas.
RESUTADOS A. Reportar los resultados en los siguientes cuadros de acuerdo al convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (+++). B. Comparar los resultados obtenidos con la bibliografía correspondiente.
CUADRO 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN EL CRECIMEINTO MICROBIANO (Agar Papa Dextrosa)
Aspergillus niger
Morfología
Temperatura
de la colonia
Penicillium roqueforti
Morfología
Morfología
Morfología
microscópica
de la colonia
microscópica
15 °C INGENIERÍA DE BIORREACTORES | 4
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30
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°C
45 °C
CUADRO 2. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN EL CRECIMEINTO MICROBIANO (Cultivo de Microinoculación) Escherichia coli Morfología
Temperatura
de la colonia
Morfología
microscópica
Lactobacillus sp. Morfología D.O.
de la colonia
Morfología
microscópica
D.O.
15 °C
30
°C
45 °C
CUADRO 3. EFECTO DEL pH EN EL CRECIMEINTO MICROBIANO (Agar Papa Dextrosa)
Aspergillus niger
Morfología
pH
de la colonia
Penicillium roqueforti
Morfología
Morfología
Morfología
microscópica
de la colonia
microscópica
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7
9
CUADRO 4a. EFECTO DEL pH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO (Cultivo de Microinoculación sin amortiguador) Escherichia coli Morfología
pH
de la colonia
Morfología
microscópica
Lactobacillus sp. Morfología D.O.
de la colonia
Morfología
microscópica
D.O.
5
7
9
CUADRO 4 b. EFECTO DEL pH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO (Cultivo de Microinoculación con amortiguador) Escherichia coli Morfología
pH
de la colonia
Morfología
microscópica
Lactobacillus sp. Morfología D.O.
de la colonia
Morfología
microscópica
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D.O.
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7
9
6. CUESTIONARIO 1. 2.
3.
4. 5.
Según
los resultados obtenidos por el efecto de temperatura, ¿dentro de que clasificación entra E. coli y Lactobacillus sp.? ¿Cómo influyó el pH en el crecimiento de hongos y bacterias? ¿Qué diferencias se observaron en los medios de cultivo amortiguados y sin amortiguar? E xplique brevemente cuales son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos extremos y psicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH? Mencione el nombre de 2 microorganismos psicrófilos, 2 mesófilos, 2 termófilos, 2 Acidófilos y 2 alcalófilos. Reporte la bibliografía consultada.
6. REFERENCIAS y
y
Aquiahuatl R., María de los Angeles. (2005). Manual de prácticas de microbiología general. Iztapalapa. E xtraido de: http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/ AQUIAHUATL_RAMOS _ MARIA_DE _LOS _ANGELES _ M anual_de_pract icas_de.pdf Ramírez , N., Serrano, J. A. y SandovaL, H. (2006). Microorganismo extremófilos, actinomicetos en México. Revista mexicana de ciencias.Vol. 3. Num. 37. E xtradido de: http://redalyc.uaemex.mx/pdf/579/579 37307.pdf
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