LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA PENETAPAN KADAR PROTEIN SECARA BIURET
Disusun oleh: Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004) Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005) Kenny Ryan Limanto (098114006)
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2010
PERCOBAAN VI PENETAPAN KADAR PROTEIN SECARA BIURET
I.
TUJUAN Dapat menetapkan kadar protein dengan metode Biuret.
II.
DASAR TEORI
Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos artinya “yang utama”. Dari asal kata ini dapat diambil kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam kehidupan. Protein terdapat pada semua sel hidup, kira-kira 50% dari berat keringnya dan berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber energi, penyangga racun, pengatur pH, dan bahkan sebagai pembawa sifat turunan dari generasi ke generasi (Girindra, 1993). Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana hanya mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan tambahan bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat. Protein berperan pokok dalam fungsi sel. Analisis terhadap protein dan enzim darah tertentu digunakan secara luas untuk tujuan diagnostik (Harper,1995). Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari metode biuret adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa (Carprette, 2005). Reaksi biuret terdiri dari campuran protein dengan sodium hidroksida (berupa larutan), dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini. Reaksi ini positif untuk 2 atau lebih ikatan peptida (Harrow, 1954). Penyerapan cahaya oleh protein terutama disebabkan oleh ikatan peptida residu ritosil, triptofonil, dan fenilalanil. Juga turut mempengaruhi, gugus-gugus non-protein yang mempunyai sifat menyerap cahaya. Penyerapan maksimum albumin serum manusia terlihat pada panjang gelombang kira-kira 230 nm (peptida) dan dengan puncak lebar pada 280 nm karena serapan residu-residu asam amino aromatik. Spektrum absorbansi suatu larutan protein bervariasi tergantung pada pH dan sesuai dengan ionisasi residu asam amino. Jelaslah bahwa spektrum serapan suatu larutan protein peka terhadap berbagai variabel lingkungan. Tetapi dalam kondisi tertentu serapan suatu larutan pada panjang gelombang 1
tertentu berbanding lurus dengan kadar protein dan cara ini sering dipakai dalam pengujian protein (Montgomery, 1993). Kerugian dari metode ini adalah hasil penetapannya tidak murni menunjukkan kadar protein, melainkan bisa saja kadar senyawa, yang mengandung benzena, gugus fenol, gugus sulfhidrin, ikut terbaca kadarnya. Selain itu, waktu penetapan yang dipergunakan juga lama, sehingga sering kali dinilai kurang efektif (Lehninger, 1982).
III.
ALAT DAN BAHAN 1. Alat :
2.
- Tabung reaksi
- Reagen Biuret
- Gelas Beaker
CuSO4 (reagen A)
- Labu ukur
KI (reagen B)
- Pipet volume
Na-Sitrat,
- Glass firn
Na2CO3,
NaOH
(reagen C) Aquadest
- Vortex - Spektrofotometer
IV.
Bahan :
- Larutan stok albumin 10 mg/ml
CARA KERJA 1. Pembuatan reagen Biuret Reagen A : Larutkan 8,5 gram CuSO4 dalam aquades hingga 50 ml Reagen B : Larutkan 3,6 gram KI dalam aquadest hingga 50 ml Reagen C : Larutkan 81 gram Na-sitrat, 50 gram Na2CO3, dan 80 gram NaOH dalam aquades hingga volume 1000 ml Larutkan reagen C, tambahkan reagen A
Gojog, tambahkan reagen B
Encerkan dengan aquadest hingga volume 1000 ml 2. Pembuatan larutan stok albumin 10 mg/ml Ambil larutan albumin 100 mg, lalu larutkan dalam 10 ml aquadest
Gunakan beberapa tetes NaOH 3% untuk mempermudah kelarutan 2
3. Penyiapan sampel Pipet 1 ml albumin telur, masukkan dalam labu ukur 10,0 ml Encerkan dengan aquadest hingga batas
Replikasi sampel 3 kali 4. Pembuatan kurva baku dan penyiapan sampel Semua seri larutan baku dan sampel ditambahkan reagen Biuret
Vortex sampai homogen
Diamkan selama 30 menit pada suhu ruang
Ukur absorbansi pada λ 540 nm
Catat hasil pengamatan dan analisis
V.
DATA DAN ANALISIS DATA Stok
Aquadest
Reagen
Konsentrasi
(mL)
(mL)
(mL)
(mg/mL)
Blanko
-
1,0
4,0
-
-
Standar 1
0,1
0,9
4,0
0,2
0,078
Standar 2
0,3
0,7
4,0
0,6
0,133
Standar 3
0,4
0,6
4,0
0,8
0,152
Standar 4
0,5
0,5
4,0
1
0,197
Standar 5
0,7
0,3
4,0
1,4
0,276
Absorbansi
Persamaan kurva baku : A = 3,56 x 10-2 B = 0,1645 r = 0,99011 y = Bx + A y = 0,1645x + 3,56 x 10-2 3
Absorbansi sampel
Konsentrasi sampel ̅
No. (y)
(x)
1.
0,378
2,081*
2.
0,382
3.
− ̅
|
− ̅|
-0,408
0,166
2,106*
-0,383
0,147
0,464
2,604
0,115
0,013
4.
0,467
2,622
0,133
0,018
5.
0,467
2,622
0,133
0,018
6.
0,451
2,525
0,036
1,296 x 10-3
7.
0,448
2,507
0,018
3,24 x 10-4
8.
0,464
2,604
0,115
0,013
9.
0,484
2,726*
0,237
0,056
2,489
* = kadar sampel yang tidak masuk range
∑|
= = ̅
− ̅| = −1
100% =
0,43262 = 0,2325 9−1
∑|
− ̅| =
0,43262
/
0,2325 100% = 9,341% 2,489
Range kadar : x ± SD
2,489 ± 0,2325 mg mg 2,2565 dL − 2,7125 dL
4
VI.
PEMBAHASAN Pada percobaan kali ini, praktikan melakukan penetapan kadar protein secara Biuret dengan
menggunakan spektrofotometer. Prinsipnya adalah pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Reaksi Biuret menggunakan 3 macam reagen, yaitu reagen A, B, dan C. Reagen A terdiri dari CuSO4 dalam aquadest. CuSO4 ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen B mengandung KI dalam aquadest. KI ini berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Sedangkan pada reagen C terdiri dari Na-sitrat, Na2CO3, dan NaOH. Na-sitrat dan Na2CO3 berfungsi sebagai buffer dan NaOH berfungsi untuk menyediakan suasana basa. Suasana basa akan membantu membentuk Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Pada saat sampel di-vortex, tidak boleh sampai menimbulkan buih agar tidak mempengaruhi pengukuran absorbansi. Penetapan kadar protein dengan reaksi Biuret tidak spesifik karena metode ini didasarkan pada ikatan peptida bukan pada senyawa kompleks warna seperti Lowry. Setelah ditetesi Biuret, sampel didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan OT (operating time), yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/ protein bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 30 menit, maka sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm menggunakan spektrofotometer. Panjang gelombang 540 nm ini merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu. Reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein secara Biuret adalah : CuSO4.5H2O + 2NaOH
Cu(OH)2 + Na2SO4 + 5H2O Cu2+ + 2OH-
Cu(OH)2
Larutan standar dibuat dari serum albumin murni yang dilarutkan dalam aquadest dan diperoleh konsentrasi 10
mg
/mL. Dalam percobaan didapatkan persamaan kurva baku y = 0,1645 x +
-2
3,56 x 10 . Rentang/ range kadar yang diperoleh dari percobaan ini adalah 2,2565 mg/mL – 2,7125 mg/mL, yang tidak masuk rentang kadar sampel adalah sampel 1 (2,081 mg/mL), sampel 2 (2,106 5
mg/mL), dan sampel 9 (2,726 mg/mL). Keadaan yang tidak sesuai dengan rentang kadar larutan baku dapat dipengaruhi beberapa faktor antara lain : 1. Partikel Besar kecilnya partikel dapat menyebabkan pemantulan. Pemantulan ini akan mempengaruhi besarnya absorbansi. Makin besar partikel, absorbansi makin besar juga. 2. Ada tidaknya gelembung Saat pengukuran absorbansi tidak boleh ada gelembung. Gelembung yang ada akan menimbulkan pembiasan cahaya. Pembiasan ini akan mempengaruhi besarnya absorbansi. Semakin banyak gelembung, absorbansi akan semakin besar. 3. Tidak adanya pengadukan untuk menghomogenkan larutan. Tidak adanya pengadukan mengakibatkan adanya sampel yang tidak bereaksi dengan CuSO4. Adanya CuSO4 (berwarna biru) yang juga menangkap cahaya, akan menghasilkan nilai absorbansi tertentu sehingga terjadi penyimpangan pengukuran. 4. Proses pipeting Proses pipeting yang tidak tepat, menyebabkan nilai absorbansi yang terukur pada alat spektrofotometer mengalami penyimpangan. 5. Pencucian alat Pencucian alat yang tidak bersih, memungkinkan masih adanya zat pengotor yang terdapat dalam tabung reaksi. Adanya zat pengotor ini membuat nilai absorbansi yang terukur pada spektrofotometer mengalami penyimpangan. Dalam perhitungan, nilai r harus ± 1 sehingga nilai kadar dan nilai absorbansi sebanding. Bila kadarnya meningkat maka absorbansi juga akan meningkat, karena r merupakan koefisien relasi yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi/kadar dengan serapan/absorbansi. Karena sampel tidak masuk dalam rentang kadar, maka dilakukan ekstrapolasi, yaitu pemanjangan kurva baku agar sampel bisa masuk dalam kurva baku tersebut. Kelebihan dari metode Biuret ini adalah mudah dan cepat dalam pengerjaannya, langsung dapat dilihat hasilnya dan sensitif sehingga dalam jumlah kecil sudah dapat dihitung. Kekurangan dari metode ini adalah tidak spesifik terhadap protein karena semua ion Cu2+ dapat berikatan dengan amida tidak hanya dalam protein.
6
VII.
KESIMPULAN 1. Kadar protein dapat ditentukan dengan metode Biuret. 2. Prinsip metode Biuret adalah reaksi protein dengan ion Cu2+ pada suasana basa yang menghasilkan warna ungu dan absorbansinya diukur pada λ 540nm. 3. Didapatkan persamaan kurva baku y = 0,1645 x + 3,56 x 10-2 dari standar yang telah dibuat. 4. Larutan standar dibuat dari serum albumin murni yang dilarutkan dalam aquadest dan diperoleh konsentrasi 10 mg/mL. 5. Rentang/ range kadar yang diperoleh dari percobaan ini adalah 2,2565 mg/mL – 2,7125 mg/mL, yang tidak masuk rentang kadar sampel adalah sampel 1 (2,081 mg/mL), sampel 2 (2,106 mg/mL), dan sampel 9 (2,726 mg/mL).
VIII.
DAFTAR PUSTAKA
Carpette, 2005, An Introduction to Practical Biochemistry, 100-101, Mc Graw Hill Book Company, Great Britany Girindra, A., 1993, Biokimia I, 66-73, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta Harper, M., 1995, Biokimia Harper, 47-50, EGC, Jakarta
Harrow, 1954, Textbook of Biochemistry 6th Edition, 48, 108, Saunders Company, U.S.A Lehninger, 1982, Dasar-dasar Biokimia, 137-157, Erlangga, Jakarta
Montgomery, R., 1993, Biokimia Berorientasi pada Kasus-Klinis, 77, 90, Binarupa Aksara, Jakarta
7
0,6
(sampel 4 dan5) (sampel 6)
0,5
(sampel 9) (sampel 2)
Absorbansi (abs)
0,4
(sampel 3 dan 8) (sampel 7)
(sampel 1) 0,3
(standar 5)
y = 0,1645x + 3,56 x 10-2 r = 0,99011
0,2
(standar 4) (standar 2)
0,1
(standar 3)
(standar 1)
0 0
0,5
1
1,5 Kadar Protein (mg/mL)
2
2,5
3
