UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA F ARMACOGNOSIA I
Recopilado por: Cristina Lucía Mora Arango Elkin Galeano Jaramillo Edison Osorio Durango
Medellín, Septiembre de 2012
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PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA F ARMACOGNOSIA I 2012 Objetivo general: reconocer
y evaluar los parámetros de calidad aplicados a las
materias primas de origen natural con interés farmacéutico. Temas del curso:
Unidad 1. INTRODUCCIÓN. Presentación del curso, normas de seguridad en el laboratorio (3 horas).
Unidad 2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA MEDICINAL. Reconocimiento de las diferentes especies de plantas medicinales que se encuentran en el entorno del Campus Universitario o en el Huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico (3 horas).
Unidad 3. MANEJO DE LA INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA EN FARMACOGNOSIA. Búsqueda bibliográfica en bases de datos especializadas. Normas para reportar adecuadamente las referencias bibliográficas (3 horas).
Unidad 4. RECONOCIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA VEGETAL. Reconocimiento de la morfología morfología vegetal y tejidos internos en placas de colección previamente preparadas. Reconocimiento morfológico externo de plantas medicinales aprobadas en Colombia (6 horas).
Unidad 5. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERÉS EN FARMACOGNOSIA.
Reconocimiento de compuestos pertenecientes al metabolismo primario (gránulos de almidón, aleurona y aceites fijos) mediante pruebas químicas de coloración y análisis microscópico de las estructuras, de acuerdo con la información reportada en las Farmacopeas oficiales (3 horas).
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PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA F ARMACOGNOSIA I 2012 Objetivo general: reconocer
y evaluar los parámetros de calidad aplicados a las
materias primas de origen natural con interés farmacéutico. Temas del curso:
Unidad 1. INTRODUCCIÓN. Presentación del curso, normas de seguridad en el laboratorio (3 horas).
Unidad 2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA MEDICINAL. Reconocimiento de las diferentes especies de plantas medicinales que se encuentran en el entorno del Campus Universitario o en el Huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico (3 horas).
Unidad 3. MANEJO DE LA INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA EN FARMACOGNOSIA. Búsqueda bibliográfica en bases de datos especializadas. Normas para reportar adecuadamente las referencias bibliográficas (3 horas).
Unidad 4. RECONOCIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA VEGETAL. Reconocimiento de la morfología morfología vegetal y tejidos internos en placas de colección previamente preparadas. Reconocimiento morfológico externo de plantas medicinales aprobadas en Colombia (6 horas).
Unidad 5. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERÉS EN FARMACOGNOSIA.
Reconocimiento de compuestos pertenecientes al metabolismo primario (gránulos de almidón, aleurona y aceites fijos) mediante pruebas químicas de coloración y análisis microscópico de las estructuras, de acuerdo con la información reportada en las Farmacopeas oficiales (3 horas).
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Unidad 6. ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL. Reconocimiento de elementos de valor diagnóstico en el material vegetal (cristales de oxalato de calcio, gránulos de polen, pelos epidérmicos, vasos lignificados, estomas), de acuerdo con la información reportada en las Farmacopeas oficiales (3 horas).
Unidad 7. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Reconocimiento mediante pruebas químicas de compuestos fenólicos, terpénicos y nitrogenados en muestras vegetales conocidas (6 horas).
Unidad 8. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES EN EL MATERIAL VEGETAL.
Aplicación
de
ensayos
físicos
(organolépticos-macroscópicos),
análisis
microscópico (identificación de elementos de valor diagnóstico) y pruebas químicas de coloración en la identificación de adulteraciones y/o falsificaciones en el material vegetal (3 horas).
Unidad 9. IDENTIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE PLANTAS MEDICINALES. Aplicación de las técnicas básicas de cromatografía de capa fina para la identificación de plantas medicinales (3 horas).
Unidad 10. CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES DE ACUERDO CON FARMACOPEAS OFICIALES.
Pruebas de identidad general: identificación de características organolépticas, características macro y microscópicas, perfil cromatográfico. Pruebas de pureza: cuantificación de material extraño. Ensayos químicos: pruebas cualitativas (6 horas).
Unidad 11. PRÁCTICA ESPECIAL. Implementación de pruebas preliminares de actividad biológica: actividad antioxidante, actividad larvicida, actividad fitotóxica (12 horas). 3
PRESENTACIÓN El Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia I incluye la revisión y actualización de las prácticas experimentales contenidas en el Manual de Laboratorio de Farmacognosia preparado por las profesoras Luz Mariela Sorza y Gloria Amparo Valencia (2000) y en el Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia y Fitoquímica recopilado y revisado por los profesores Alejandro Martínez, Gloria Amparo Valencia, Nora Jiménez, Monica Mesa y Elkin Galeano. En la presente actualización se incluye el desarrollo de nuevas prácticas experimentales que hacen parte del programa académico de Laboratorio de Farmacognosia I y están dirigidas hacia la identificación de los diferentes factores involucrados en la producción de drogas, aplicación de técnicas para el reconocimiento de metabolitos primarios y secundarios, aplicación de pruebas específicas para el control de calidad de materia prima de origen natural y evaluación de la actividad biológica de extractos de interés farmacéutico.
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CONTENIDO Pág. Programa de laboratorio de Faramacognosia I ………………………………………………..
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Práctica No 2. Reconocimiento de la flora medicinal ………………………………………..
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Práctica No 3.
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Manejo de la información bibliográfica en farmacognosia …................................
Práctica No 4. Reconocimiento de la morfología vegetal …………………………………… 8 Práctica No 5.
Reconocimiento de metabolitos primarios de interés en farmacognosia ………......................................................................
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Práctica No 6. Análisis microscópico de material vegetal …………………………………... 25 Práctica No 7. Identificación de metabolitos secundarios …………………………………... 28 Práctica No 8.
Reconocimiento de adulteraciones y/o falsificaciones en el material vegetal ………………………………………………… 40
Práctica No 9. Identificación cromatográfica de plantas medicinales ……………………... 45 Práctica No 10.
Control de calidad de plantas medicinales de acuerdo con farmacopeas oficiales ………………………………………………
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Práctica No 2 RECONOCIMIENTO DE LA FLORA MEDICINAL OBJETIVO
Reconocimiento de los ejemplares vegetales cultivados en el huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico y/o en la flora universitaria.
METODOLOGÍA Para el desarrollo de esta práctica el estudiante en visita guiada a las instalaciones del huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico recibirá la información y capacitación brindada por parte del profesor, relacionada con las características botánicas y la actividad terapéutica de las plantas medicinales. Una vez recibida la capacitación el estudiante procederá a la presentación del respectivo informe que debe contener una tabla en la que se incluyan las plantas observadas con el nombre científico, nombre común, uso terapéutico, droga aprobada y una breve descripción botánica.
CONSULTA Consultar sobre las 10 especies de plantas medicinales de mayor comercialización en Colombia, sus condiciones de cultivo y el uso terapéutico aprobado por el INVIMA.
BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA FONNEGRA G. Ramiro, JIMÉNEZ R. Silvia Luz. Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia. Editorial Universidad de Antioquia. Segunda edición. 2006.
Ministerio de Protección Social. Vademecum Colombiano de Plantas Medicinales . Colombia. MPS. 2008. 6
Práctica No 3 MANEJO DE LA INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA EN FARMACOGNOSIA OBJETIVOS
Capacitar al estudiante el manejo de las bases de datos documentales y la información consignada en la Biblioteca Central.
Explicar de manera práctica los modelos de búsqueda de información aplicada a los temas de farmacognosia y plantas medicinales.
Aprender a reportar adecuadamente las referencias bibliográficas.
METODOLOGÍA Para el desarrollo de esta práctica el estudiante en visita guiada a las instalaciones de la biblioteca central recibirá la información y capacitación sobre manejo de bases de datos documentales por parte de los profesores encargados. Una vez recibida la capacitación el estudiante debe hacer entrega de un informe con el siguiente contenido: 1. Consultar la monografía de una planta medicinal asignada por el profesor, teniendo en cuenta los siguientes aspectos: nombre científico, descripción botánica, descripción microscópica, uso terapéutico aprobado, droga aprobada, reacciones adversas, advertencias y contraindicaciones. Esta información se encuentra en las farmacopeas oficiales y textos de referencia en farmacognosia. 2. Aplicar los conocimientos sobre la forma adecuada de reportar libros, artículos de revistas y documentos electrónicos en cada uno de los informes de laboratorio.
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Práctica No 4 RECONOCIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA VEGETAL OBJETIVOS
Identificar los tejidos internos de las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas,
realizando
observación
microscópica
sobre
cortes
histológicos previamente preparados de raíces, tallos y hojas.
Aplicar los criterios para clasificar las plantas en monocotiledóneas y dicotiledóneas a partir del análisis de las características de morfología externa de las raíces, tallos, hojas y flores.
MARCO TEÓRICO La morfología vegetal es la parte de la botánica que estudia las formas y estructuras de las diferentes partes del cuerpo de la planta teniendo en cuenta aspectos histológicos y fisiológicos en el proceso de modificación y transformación de las plantas. Para estudiar la estructura interna de un órgano, generalmente se realizan cortes transversales y se utilizan colorantes para diferenciar los tejidos.
Raíz Es el órgano generalmente subterráneo en las plantas, en general las funciones del sistema radical son: absorción y conducción de sustancias, sostén y fijación de la planta, almacenamiento de sustancias, reproducción vegetativa en algunas especies.
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Raíz de plantas dicotiledóneas: En el corte transversal de la raíz de una planta dicotiledónea a nivel de la zona pilífera, se pueden identificar los siguientes tejidos:
1. Epidermis: capa de una célula de espesor en la parte externa de la raíz, no posee cutícula.
2. Córtex: grupo de tejidos que ocupa el mayor volumen de la raíz, el cual está comformado por: exodermis, parénquima cortical y endodermis. 2.1. Exodermis: células parenquimáticas subepidérmicas que se asemejan a la
endodermis. 2.2. Parénquima cortical: células de pared celular delgada, especializadas en el
almacenamiento de sustancias. 2.3. Endodermis: capa de células prismáticas que rodean el cilindro central, se
pueden identificar las células que hacen parte de las bandas de Caspary y las células de paso.
3. Estela: corresponde al cilindro central del cuerpo primario de la raíz y está conformada por el periciclo, los tejidos vasculares primarios y el cambium vascular 3.1. Periciclo: tejido parenquimático de una o varias células de espesor ubicado
inmediatamente después de la endodermis hacia el centro de la raíz, en el proceso de diferenciación, a partir de estas células se originan las raíces laterales de la planta.
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3.2. Tejidos vasculares primarios: constituidos por células del xilema y del floema. 3.3. Cambium vascular: tejido meristemático de varias células de espesor con
paredes delgadas que bordean el xilema y lo separan del floema. En la figura 1, se presenta un corte transversal de una raíz dicotiledónea a nivel de la zona pilífera, deben identificar los diferentes tejidos de acuerdo con la información anterior.
Figura 1. Fotografía del corte transversal a nivel de la zona pilífera de la raíz de una planta dicotiledónea en la que se observa el tejido parenquimático y los diferentes tejidos que conforman el cilindro central.
Raíz de plantas monocotiledóneas: En el corte transversal de la raíz de una planta monocotiledónea a nivel de la zona pilífera, se pueden identificar los mismos tejidos presentes en las dicotiledóneas a excepción del cambium vascular. El xilema en las raíces de las plantas monocotiledóneas posee muchos brazos y en el cilindro central se puede observar una porción de tejido parenquimático que conforma la médula.
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A continuación en la figura 2, se observa el corte transversal de una raíz monocotiledónea a nivel de la zona pilífera, con el fin de que se identifiquen los tejidos correspondientes.
Figura 2. Fotografía del corte transversal a nivel de la zona pilífera de la raíz de una planta monocotiledónea. Se observan las diferencias en cuanto a la disposición del xilema y floema al interior del cilindro central.
Tallo El tallo es el órgano de la planta generalmente aéreo que desempeña las siguientes funciones: produce y sostiene ramas y flores, conduce sustancias a través del xilema y el floema.
Tallo de plantas dicotiledóneas: En el corte transversal del tallo de una planta dicotiledónea se pueden identificar los siguientes tejidos, desde la parte externa hasta la más interna:
1. Epidermis: primera capa de una sola célula de espesor cubierta por una cutícula impermeable de cutina.
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2. Córtex: está conformado por los tejidos comprendidos entre la epidermis y la parte más externa del haz vascular como colénquima, parénquima cortical, clorénquima, esclerénquima.
3. Estela: es la parte central del tallo, conformada por los tejidos vasculares, el cambium vascular y la médula. 3.1. Tejidos vasculares: estructuras ovaladas conocidas como haces vasculares
conformadas por esclerénquima, floema (elementos del tubo criboso y células compañeras), cambium vascular y xilema (elementos del vaso, traqueidas y fibras del xilema). 3.2. Médula: región central constituida por tejido parenquimático.
En la figura 3 se presenta el corte transversal del tallo de una planta dicotiledónea, en el cual se deben identificar los principales tejidos.
Figura 3. Fotografía del corte transversal del tallo de una planta dicotiledónea en la que se identifica de manera representativa el tejido colénquima, los haces vasculares y la médula.
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En el corte transversal del tallo de una planta monocotiledónea, en general se observan los mismos tejidos que en el tallo de una planta dicotiledónea, con la diferencia de que en estos tallos el tejido esclerenquimático se presenta internamente a la epidermis y los haces vasculares se encuentran dispersos en el tejido parenquimático y están rodeados por una vaina de esclerénquima que le proporciona mayor resistencia a la planta. A continuación se presenta la imagen para identificar los principales tejidos.
Figura 4. Fotografía del corte transversal del tallo de una planta monocotiledónea en la que se observa el tejido esclerénquima y la distribución de los haces vasculares.
Hoja La hoja es el órgano vegetativo de la planta, generalmente en forma laminar que tiene como función principal el proceso de la fotosíntesis, respiración, transpiración y gutación.
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En el corte transversal de una hoja se observan los siguientes tejidos:
1. Epidermis: capa de células que protege la hoja ubicadas en la superficie del haz y del envés, recubierta por una cutícula impermeable. En la epidermis se pueden identificar células epidérmicas comunes, células de guarda (oclusivas) y células adyacentes (subsidiarias).
2. Mesófilo: es el tejido más abundante de la hoja, en el cual se realiza la fotosíntesis y está conformado por parénquima en empalizada y parénquima esponjoso. 2. 1. Parénquima en empalizada: una o dos capas de células cilíndricas ubicadas
en la parte superior de la hoja, presentan gran cantidad de cloroplastos. 2.2. Parénquima esponjoso: formado por células esféricas y células de forma
irregular que se distribuyen dejando espacios intercelulares denominados meatos o cámaras subestomáticas.
3. Nervaduras: son la continuación del xilema y el floema del tallo. En un corte transversal de la hoja, en cada nervadura se observa el haz vascular con el xilema hacia el haz y el floema hacia el envés.
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Figura 5. Fotografía del corte transversal de la hoja. Se observa el tejido epidérmico, las células del mesófilo y los tejidos vasculares de las nervaduras.
METODOLOGÍA Para el desarrollo de la práctica se divide el estudio en: 1. Aspectos correspondientes al análisis de la morfología interna (histología).
El profesor pondrá a disposición de los estudiantes una serie de placas previamente preparadas en las cuales deben identificar utilizando el microscopio las estructuras y tejidos internos presentes en las raíces, tallos y hojas de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. El estudiante debe identificar y dibujar las estructuras claramente diferenciadas en cada uno de los cortes observados e incluir el análisis de resultados en el informe. 2.
Aspectos
correspondientes
al
análisis
de
la
morfología
externa
(cuerpo de la planta).
De acuerdo con las características morfológicas externas observadas en las plantas asignadas, realizar la clasificación y consignar la información correspondiente en formato de tabla, incluyendo los siguientes aspectos para cada una de ellas: nombre común, nombre científico, análisis de las hojas: complejidad, filotaxia, características del peciolo y de las nervaduras; clasificación del tallo: herbáceo, leñoso; clasificación de la raíz: fibrosa, pivotante; número de verticilos florales y clasificación de acuerdo con las características externas en monocotiledóneas o dicotiledóneas.
CONSULTA Consultar la clasificación de las raíces, tallos y hojas de acuerdo con las características de su morfología externa.
BIBLIOGRAFÍA URIBE Álvarez Frank. Botánica General . Editorial Universidad de Antioquia. Segunda edición. 1991. 15
Práctica No 5 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERÉS EN FARMACOGNOSIA OBJETIVOS
Aprender a identificar microscópicamente sustancias características de plantas, formadas por moléculas pertenecientes al metabolismo primario.
Identificar la presencia de almidón en diferentes fuentes vegetales mediante reacciones químicas y pruebas microscópicas.
Identificar microscópicamente la presencia de gránulos de aleuronas en diferentes fuentes vegetales.
Identificar microscópicamente la presencia de gránulos de aceites fijos en diferentes fuentes vegetales.
MARCO TEÓRICO El metabolismo primario es el grupo de procesos metabólicos esenciales “ vitales” para los organismos vivos, estos procesos están asociados a 4 grandes grupos de reacciones anabólicas/catabólicas:
1. Metabolismo de los carbohidratos: Los carbohidratos, también llamados hidratos de carbono ó glúcidos, son un grupo de moléculas formadas principalmente por carbono, oxígeno e hidrógeno. Algunos micro-organismos tienen la capacidad de bio-sintetizar carbohidratos conteniendo azufre, fosforo y nitrógenos en sus estructuras. Clasificación de los carbohidratos: consultar y complementar el siguiente diagrama.
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El almidón: Está formado por unidades de glucosa y se encuentra en los cereales como maíz, arroz y trigo, y en tubérculos como papas, ñame y yuca. Frecuentemente se encuentra formado en un 25% por amilosa y un 75% por amilopectina. A continuación se presentan las estructuras químicas de dos polisacáridos de importancia en los vegetales: celulosa y almidón. CH2OH
H O
H H
Celulosa
OH
H
Almidón
OH
H O
H
OH
OH
H
CH2OH
OH
H
CH2OH
O H
OH
O H
H
O OH
H
O H H
R
O
OH
H
H
H
CH2OH O H
H
H
HO
H
CH2OH O H
OH H
H
CH2OH
CH2OH H
O
OH H
O
H
OH O
OH
H
H
H
H
H H
OH
H O
H
H
O
H
HO
CH2OH
OH
OH
R
H H
H
OH
Figura 6. Estructuras químicas de la celulosa y el almidón. 2. Metabolismo de los lípidos: Los lípidos, son un grupo de ácidos grasos no volátiles, químicamente se encuentran generalmente como cadenas alifáticas saturadas o insaturadas, en 17
general lineales; solubles en solventes orgánicos apolares (como cloroformo, hexano), y son casi insolubles en agua. Los mamíferos los acumulamos como grasas, los peces como ceras y en las plantas en forma de aceites. Los fosfolípidos y esteroles constituyen alrededor de la mitad de la masa de las membranas biológicas. Consultar y complementar el siguiente diagrama sobre la clasificación de los lípidos:
A continuación se presentan las estructuras químicas de compuestos lipídicos de mayor importancia a nivel biológico. O OH
Ácido graso libre
HO
Colesterol Triglecerido
O
O
O
O O
Fosfolípido
O
O
O
P
O O
HO
O
+
N
O
Figura 7. Estructuras químicas de los principales lípidos de importancia biológica. 18
3. Metabolismo de las proteínas: Las proteínas son biomóleculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas: fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden considerarse polímeros de unas de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Consultar y complementar el siguiente diagrama sobre la clasificación de las proteínas:
A continuación se encuentran las estructuras químicas de tres aminoácidos importantes en el metabolismo vegetal (Ala, Arg, His) y un modelo de la estructura secundaria de una proteína.
NH
O H C 3
OH NH
2
Alanina (Ala)
HN
2
O
O N
NH
OH NH
2
Arginina (Arg)
N H
OH NH
2
Histidina (His)
Figura 8. Estructuras químicas de algunos aminoácidos y estructura secundaria de una proteína.
Aleuronas: las aleuronas, del griego aleuron que significa harina, son un grupo de gránulos proteicos presentes principalmente en las semillas de las plantas, 19
localizado en la parte externa del endospermo y que tienen la función de ser material de reserva para el crecimiento del embrión, se encuentran principalmente en los cereales y algunas raíces.
METODOLOGÍA Material vegetal:
Maíz: _____________________ (nombre científico)
Yuca: _____________________
Arroz: _____________________
Papa: _____________________
ANÁLISIS QUÍMICO: Cortar o rallar 15 g de material vegetal sin cáscara y extraer con 10 ml de agua (sin calentar). Filtrar y realizar las siguientes reacciones por separado en tubos de ensayo: 2 ml almidón + lugol
_____________________________________________
2 ml almidón + 6 ml H 20: Medir pH ____________________________________
ANÁLISIS MICROSCÓPICO: Tomar 1 gota de la solución filtrada para los análisis químicos y observar al microscopio cada una de las muestras de almidón preparada (maíz, yuca, papa y arroz).
Almidón de papa: Se observa como gránulos pequeños circulares con hilum céntrico y gránulos grandes de forma elípticas con hilum excéntrico. El tamaño promedio de los gránulos es de 15 μm con una desviación estándar de ±10 μm;
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Almidón de maíz: Se observa como gránulos irregulares y poligonales con hilum concéntrico de forma mixta: se puede observar como un punto en forma de asterisco, una línea o una cruz. El tamaño promedio de los gránulos es de 12 μm con una desviación estándar de ±6 μm.
Almidón de yuca: Se observa como gránulos elípticos o redondeados, con hilum concéntrico de forma puntual. El tamaño promedio de los gránulos es de 10 μm con una desviación estándar de ±5 μm.
Almidón de arroz: Se observa como gránulos poliédricos y poligonales pequeños, en algunos casos formando agregados entre 2-150 unidades, con hilum concéntrico de forma puntual difícil de observa al microscópio convencional. El tamaño promedio de los gránulos es de 5 μm con una desviación estándar de ±4 μ
m.
Muestras de plantas medicinales que contienen almidón: canela, ruibarbo, valeriana, ginseng, jengibre, regaliz.
RESULTADOS Almidón Análisis
papa
maíz
arroz
yuca
Muestra
Color Textura Olor Sabor pH Tamaño de los gránulos Hilum
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1. Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solución de cloruro de zinc yodado (Disolver 20 g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 ml de agua), dejar reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuto, remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H2SO4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se observan en colores desde el azul al violeta.
Muestras vegetales donde se pueden evidenciar las paredes de celulosa : eucalipto, canela, lino, sen, entre otras. A continuación se presentan las fotografías de las placas microscópicas de los montajes correspondientes para la observación de celulosa en semillas de lino molidas.
Figura 9. Fotografía de las paredes de celulosa presentes en las semillas de lino. 2. Detección de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de yodo/etanol. Los gránulos de aleurona se observan de color amarillo-café o café con un tamaño promedio entre 10-20 μm. Agregar luego unas 2 ó 3 gotas de trinitrofenol en etanol y los granúlos se tornarán amarillos.
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Muestras de plantas medicinales que presentan gránulos de aleurona: lino, nuez moscada, anís estrellado. A continuación se presentan las fotografías de las placas microscópicas de los montajes correspondientes para la observación de celulosa de gránulos de aleurona presentes en semillas de lino molidas:
Figura 10. Fotografía de los gránulos de aleurona presentes en las semillas de lino.
Detección de lípidos y aceites esenciales: mezclar bien la muestra en polvo, colocar 2 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos. Escurrir el líquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio con los objetivos de 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo.
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Muestras vegetales para la detección de lípidos y aceites esenciales: lino, canela, eucalipto, jengibre. A continuación se presentan las fotografías de las placas microscópicas de los montajes correspondientes para la observación de aceites fijos presentes en semillas de lino molidas:
Figura 11. Fotografía de las gotas de aceite fijo presentes en las semillas de lino. Consulta 1. Funciones biológicas en la célula vegetal de los carbohidratos, lípidos y proteínas. 2. Aplicaciones en Farmacognosia de los carbohidratos, lípidos y proteínas. 3. Esquema de las reacciones realizadas en el laboratorio.
BIBLIOGRAFÍA Evans, W.C. Trease & Evans Pharmacognosy. Ed. Saunders. 16 o Edición. China. 2009. HEINRICH M., BARNES J. Gibbons S., WILLIAMSON E. Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotherapy. Ed. Churchill Livingstone. Spain. 2004. 24
Práctica No 6 ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL OBJETIVO
Reconocer elementos de valor diagnóstico en el material vegetal: cristales de oxalato de calcio, gránulos de polen, pelos epidérmicos, vasos lignificados, estomas, de acuerdo con las monografías de plantas medicinales textos de referencia y farmacopeas oficiales.
MARCO TEÓRICO El planteamiento sistemático de la identificación de drogas en polvo puede realizarse por varios caminos, sin embargo cuando se trata de drogas organizadas, todos los métodos dependen del reconocimiento microscópico de los tipos celulares característicos: fibras tabicadas, pelos epidérmicos, tricomas; así como de los contenidos de las células: almidón, cristales de oxalato de calcio, gránulos de aleurona. Estas estructuras pueden considerarse como elementos de valor diagnóstico porque resultan de gran valor para la identificación del material vegetal como materia prima. Existen reactivos específicos que permiten destacar cada una de las estructuras, para la observación de los gránulos de almidón se realiza el montaje en agua y en solución de lugol, los cristales de oxalato de calcio se observan con mayor facilidad en las placas de hidrato de cloral, mientras que el montaje con fluoroglucina y ácido clorhídrico facilita la observación de los tejidos lignificados. Cuando se trata de una mezcla de drogas es imprescindible una mayor experiencia y práctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificación deben llevarse a cabo posteriores observaciones y ensayos químicos confirmativos, la mayoría de las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su reconocimiento mediante cromatografía de capa fina (CCF). 25
METODOLOGÍA Bajo la orientación del profesor el estudiante procederá a realizar las siguientes actividades: 1. Ensayos preliminares para la identificación de las características organolépticas del material vegetal para identificar el color, el olor y el sabor. Color: es importante analizar el color del material vegetal, cuando se trata de
raíces el color va desde blanco amarillento hasta pardo, en el caso de las cortezas, en general el color es castaño y en el caso de hojas y flores, el color depende de la especie. Olor: el olor se puede expresar como aromático, cítrico, mentolado y cuando no es
posible establecer comparacion, se describe como característico. Sabor: los sabores se pueden describir como: auténticos (amargo, dulce, ácido,
salado) o insípidos. 2. Preparación de placas o montajes respectivos de las plantas medicinales secas y en polvo sobre porta objetos, utilizando según el caso agua, hidrato de cloral y floroglucina. Recuerde colocar el cubreobjetos antes de la observación. Observacion de almidon: montar placa en agua, observar los diferentes gránulos y
ensayar si se trata de almidón mediante la adición de agua de yodo (Lugol), colocando 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos, verter 2 ó 3 gotas de Solución de Lugol diluida (1:5) en agua. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidón se colorean de azulvioláceo intenso. Observación de tricomas epidermicos y oxalato de calcio : una solución de hidrato
de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20 ml de agua) se utiliza como agente 26
clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material vegetal y calentar suavemente.
El hidrato de clorar disuelve contenido celular y sustancias
extracelular (granos de almidón, granos de aleurona) y permite una mejor visualización de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen. Observación de lignina: colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos y humedecer este material vegetal con una solución alcohólica de floroglucina (1% en etanol del 90%) y dejarlo secar a temperatura ambiente. Agregar 1 gota de HCl concentrado, poner el cubreobjetos y observar los vasos lignificados en colores desde el rosado hasta el color rojo carmín. Observar la presencia de fibras, parénquima, esclereidas, pelos. La información de los montajes anteriores puede complementarse mediante la aplicación de otros ensayos que permiten la observación de otros tejidos y estructuras como paredes de celulosa, granulos de aleurona y oleorresinas. 3. Observar las estructuras presentes en los ejemplares seleccionados de las plantas medicinales, identificar los elementos de valor diagnóstico en cada una de las plantas y realizar el dibujo correspondiente.
CONSULTA El estudiante debe consultar las estructuras internas a nivel microscópico de las siguientes drogas en polvo: canela, ruibarbo, jengibre, regaliz, sen, digital, caléndula y sauco.
BIBLIOGRAFÍA Gattuso M.A.,Gattuso S.J. “Manual de procedimientos para el análisis de drogas en polvo”. Cooperación Iberoamericana Ciencia y Tecnología para el desarrollo.
Universidad Nacional del Rosario. Argentina. 1999. 27
Práctica No 7 IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS OBJETIVO
Realizar pruebas químicas rápidas de coloración y precipitación para la identificación de compuestos fenólicos, terpénicos y nitrogenados en muestras vegetales conocidas.
MARCO TEÓRICO Los compuestos denominados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos, depredadores, cambios térmicos o lumínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El
metabolismo
secundario
es
una
característica
fundamental
de
la
especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la célula
pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos
secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo.
Algunos metabolitos secundarios son
“residuos bioquímicos”, es decir, productos de activ idad enzimática de sustratos
no apropiados o productos de destoxificación o de desecho que pueden ser de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides.
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Reconocimiento de metabolitos: el reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba cualitativa de caracterización consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un aducto o un complejo, lo cual genera como resultado una manifestación sensible como el cambio de coloración, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, lo cual indica la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.
1. Alcaloides: los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un ácido orgánico.
Figura 11. Estructura química de la nicotina Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en ácidos minerales diluidos.
2. Flavonoides: los flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos de carbono, cuya estructura química consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El núcleo de los flavonoides se representa por el sistema C6 – C3 – C6.
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Figura 12. Estructura química de una catequina. 3. Cardiotónicos: las agliconas cardiotónicas químicamente estan constituidas por el sistema esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos en las posiciones C –18 y C-19, 7, un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactónico
α-β insaturado de cuatro carbonos unido al carbono 17 del núcleo
esteroidal, como se observa en la estructura química de la digoxina que aparece a continuación.
Figura 13. Estructura química de la digoxina. Estos compuestos han presentado actividad estimulante sobre el músculo cardiaco, cuando están en forma de glicósidos.
4. Saponinas: las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua que tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial del
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agua formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis dan origen a las llamadas sapogeninas.
Figura 14. Estructura química de la diosgenina. La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El enlace glicosídico siempre se forma con el oxigeno del carbono 3.
5. Cumarinas: las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenólicos y tienen en común la estructura química de 1-benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.
Figura 15. Núcleo químico de las cumarinas. Estructuralmente se clasifican en cumarinas simples, furanocumarinas y pironacumarinas.
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6. Taninos: los taninos son polímeros de polifenoles, sustancias con alto peso molecular, comprendido entre 500 a 3000 g/mol. Se consideran productos de excreción de muchas plantas, involucrados como mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parásitos. Se clasifican en: Taninos hidrosolubles o pirogálicos: son ésteres fácilmente hidrolizables formados
por una molécula de azúcar (glucosa) unida a un número variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido elágico). Son comunes en plantas dicotiledóneas.
Figura 16. Estructura química de los taninos hidrolizables. Taninos no hidrosolubles ó condensados: tienen una estructura química similar a
la de los flavonoides. Por hidrólisis generan azúcar y ácido elágico, algunos taninos condensados son conocidos como pro-antocianidinas porque por hidrólisis ácida producen antocianidinas y leucoantocinidinas.
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Figura 17. Estructura química de los taninos no hidrolizables o proantocianidinas. 7. Esteroides: los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el núcleo ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17.
Figura 18. Estructura química del ergosterol. Los esteroides son compuestos fundamentales en la estructura celular de animales, vegetales, hongos y bacterias.
8. Quinonas y antraquinonas: las quinonas son dicetonas cíclicas insaturadas que por reducción se convierten en polifenoles, siendo reversible esta reacción. Las quinonas derivan su nombre del miembro más simple de la serie: la pbenzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidación
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del ácido quínico. Las quinonas se pueden clasificar en benzoquinonas, naftoquinonas y antraquinonas (las más numerosas).
Figura 19. Núcleo químico de las antraquinonas. 9. Antocianinas: las antocianinas son pigmentos flavonoides que se comportan como indicadores ácido – base debido a la reacción:
Figura 20. Reacciones químicas de las antocianinas en diferente pH. Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucósidos, lo que explica su solubilidad en agua y la fácil extracción con solventes acuosos. Se encuentran en la savia de las plantas, y a menudo en forma de sólidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leñoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado por otros pigmentos vegetales como la clorofila.
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METODOLOGÍA Sobre el extracto de la planta seleccionada, el estudiante realizara pruebas químicas de coloración y/o precipitación, para identificar la presencia del metabolito respectivo. 1. Reconoc imiento d e alcaloides
Los alcaloides son bases nitrogenadas, las cuales pueden convertirse en sus respectivas sales mediante la adición de un ácido diluido y formar precipitados al reaccionar con los reactivos específicos para alcaloides. En esta práctica utilizaremos los reactivos de: Mayer y Dragendorff. Obtención del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco
macerar en un mortero y adicionar un volumen suficiente de ácido clorhídrico al 5%, calentar al baño maría durante 10 minutos, enfriar y filtrar. Prueba cualitativa: colocar en dos tubos de ensayo aproximadamente 0.5 ml del
filtrado ácido y agregar a uno de los tubos 2 gotas del reactivo de Dragendorff y al otro tubo 2 gotas del reactivo de Mayer. Si se observa turbidez o precipitado en ambos tubos se considera como prueba presuntiva de la presencia de alcaloides. 2. Reconoc imiento d e esteroides y/o triterpenoides
Obtención del extracto: en un beaker limpio y seco, tomar una pequeña cantidad
de material vegetal seco y molido, adicionar diclorometano en cantidad suficiente hasta que cubra la muestra (realice esta prueba bajo campana extractora de gases) agitar con varilla de vidrio para realizar una mejor extracción, posteriormente filtrar sobre sulfato de sodio anhidro. Prueba cualitativa (Ensayo de Lieberman Burchard): en un tubo de ensayo limpio y
seco tomar 1 ml del filtrado orgánico y agregar por la pared del tubo 1 ml de anhídrido acético y con precaución 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La
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aparición de coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva para esteroides y/o triterpenoides en la muestra.
3. Reconocim iento de sapon inas Obtención del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco y
macerar en un mortero, adicionar suficiente cantidad de agua que cubra la muestra, filtrar a través de gasa. Prueba cualitativa: pasar 4 ml del filtrado a un tubo de ensayo y agitar
vigorosamente durante un minuto, si se forma abundante espuma que permanece estable durante 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. 4. Reconocim iento d e compu estos fenólicos y taninos
Obtención del extracto : tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco,
macerar en un mortero hidratando la muestra para facilitar el rompimiento de los tejidos, pasar la muestra completamente macerada a un beaker y adicionar cantidad suficiente de agua para cubrir la muestra, calentar en baño maría de 10 minutos y filtrar en caliente. Prueba cualitativa: tomar 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo y adicionar 2 gotas
de solución de tricloruro férrico (FeCl 3 al 1%). La aparición de un color verde, azul o negro es prueba positiva para compuestos fenólicos. En un segundo tubo de ensayo tomar 1 ml del filtrado y agregar unas gotas de la solución de gelatina-sal, si se presenta turbidez o formación de precipitado es prueba presuntiva de la presencia de taninos en la muestra.
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5. Reconocim iento de flavonoides, leuco antocianidinas y cardiotónicos:
Obtención del extracto : macerar en un mortero aproximadamente 10 g del material
vegetal finamente picado, adicionar suficiente cantidad de etanol, calentar al baño maría durante 5 minutos, enfriar y filtrar. Prueba cualitativa para flavonoides (Ensayo de Shinoda): tomar un 1 ml del filtrado
etanólico en un tubo de ensayo, agregar varias limaduras de magnesio y por la pared del tubo dejar caer lentamente HCl concentrado (37%). La aparición de colores: naranja, rojo, violeta ó rosado, indican es prueba presuntiva de la presencia de flavonoides en el material vegetal. Prueba cualitativa para leucoantocianidinas: tomar 2 ml del filtrado en un tubo de
ensayo y adicionar 1 ml de ácido clorhídrico concentrado (37%). Calentar en baño maría durante 15 minutos. La aparición de coloraciones rojas es prueba presuntiva de la presencia de leucoantocianidinas en la muestra. Pr ueba para la detección de cardiotónicos y lactonas α, β insaturadas: adicionar 1
ml de filtrado en un tubo de ensayo y agregar 0.5 ml de reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo antes de usarlo). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba presuntiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra.
6. Reconocim iento de quinonas
Obtención del extracto : pesar 0,5 g de material vegetal en polvo en un beaker de
100 ml, adicionar 20 ml de etanol al 95% y calentar en baño maría durante 5 minutos hasta ebullición, filtrar en caliente, Hidrólisis: tomar 5 ml del filtrado y adicionar 3 ml de H 2SO4 al 10%, calentar en
baño maría durante 15 minutos hasta ebullición, enfriar la muestra.
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Extracción con tolueno: adicionar 5 ml de tolueno al extracto previamente
hidrolizado, agitar suavemente sin emulsionar, utilizando la cabina de extracción. Prueba cualitativa: tomar 2 ml de la fase orgánica en un segundo tubo de ensayo,
adicionar 1 ml de la solución previamente preparada de hidróxido de sodio al 5% en amoníaco al 2%. La aparición de un color rojo cereza en la capa acuosa indica presencia de quinonas en la muestra. 7. Reconoc imiento de antoc ianinas
Obtención del extracto: en un erlenmeyer colocar 100 g de muestra fresca
finamente desmenuzada, añadir 200 ml de agua, calentar a ebullición durante 5 minutos y filtrar. Prueba cualitativa: adicionar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo y añadir 1 ml
de NaOH diluido. Observar la coloración formada. En otro tubo de ensayo adicionar 2 ml del filtrado y añadir 6 gotas de algún ácido mineral diluido (HCl ó H 2SO4 al 10%). Observar la coloración formada. Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH. 8. Reconocim iento d e cumarinas
En un tubo de ensayo grande adicionar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial hasta cubrir la muestra. Con un trozo de papel filtro blanco cubrir la boca del tubo de ensayo y sujetarlo con pinzas o una banda elástica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro y calentar hasta ebullición durante 5 minutos, posteriormente enfriar y retirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente que puede ser: verde, amarilla o roja.
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CONSULTA Consultar las reacciones químicas que se presentan en cada una de las pruebas de identificación de metabolitos secundarios.
BIBLIOGRAFÍA DOMÍNGUEZ X.A. Métodos de investigación Fitoquímica . Ed.Limusa. México. 1973. Arango A. Gabriel J., Quijano T. Jairo. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Marcha Fitoquímica Semicuantitativa. Universidad de Antioquia. Medellín.
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Práctica No 8 RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES EN EL MATERIAL VEGETAL
OBJETIVO
Aplicar los ensayos físicos (organolépticos-macroscópicos), análisis microscópico (identificación de elementos de valor diagnóstico) y pruebas químicas de coloración en la identificación de adulteraciones y/o falsificaciones en el material vegetal.
Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus características organolépticas, macro y microscópicas y pruebas químicas.
MARCO TEÓRICO El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus características sensoriales, macroscópicas y microscópicas. Un examen para determinar estas características es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para después llevarse a cabo posteriores análisis. Siempre que sea posible, patrones del material o muestras de calidad farmacopéica debe de estar disponible como referencia. Una inspección visual provee una simple y rápida medida para identificar el material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser significativamente diferente, en términos de color, consistencia, olor o textura, de las especificaciones, se considera una no conformidad de los requerimientos. Sin embargo, los juicios deben ser cautelosos con relación al olor y la textura, debido a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la experiencia. La identificación macroscópica de una planta medicinal está basada en la forma, 40
tamaño, color, características superficiales y textura. Sin embargo, mientras esas cualidades son juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden ser muy parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en análisis microscópicos y/o fisicoquímicos. La inspección microscópica del material vegetal es indispensable por la identificación del material en polvo, el material debe de ser tratado con reactivos químicos. Los ensayos microscópicos se deben asociar con otros métodos analíticos para garantizar una completa identificación, en los casos en los que la comparación con material de referencia revela algunas características no descritas en los requerimientos, estos pueden ser atribuidos a material extraño, antes que un a un constituyente normal.
METODOLOGÍA 1. Ensayos preliminares para la identificación de las características organolépticas del material vegetal para identificar el color, el olor y el sabor. 2. Detección histoquímica de tejido vegetal y su contenido. Realizar las placas para la detección de celulosa, aleuronas, lípidos y aceites esenciales, las cuales se describieron en la práctica No 4 y las pruebas para la detección de almidón, oxalato de calcio y lignina descritas en la práctica No 6, complementar esta información si es necesario con el montaje de las siguientes placas: Detección de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de oxalato de calcio: colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.
Verter 2 ó 3 gotas de ácido clorhídrico 2M, con la precaución de que el reactivo esté en contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de calcio está indicada por la aparición de burbujas. Los cristales de oxalato de calcio, que en general tardan más tiempo en disolverse, no desprenden burbujas. 41
Detección de lípidos y aceites esenciales: colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo
sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III (0.5 g Sudan III calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos. Escurrir el líquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo. Detección de taninos: colocar 2 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y
verter 2 ó 3 gotas de solución de cloruro férrico al 5 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se evidencia por la aparición de masas oscuras de color pardo, azul o negro. Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solución de cloruro de zinc yodado (disolver 20 g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/l), dejar reposar 1 minutos, remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H2SO4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se observan en colores desde el azul al violeta. Procedimiento: combinar la solución A, solución B y la Solución C y agregar 2.5 ml de HCl con agitación (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y adicionar 2 ó 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir con el cubreobjetos y observar los elementos lignificados de amarillo, súber de marrón, lípidos de color rojo y almidón de color azul -violeta.
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3. Pruebas químicas rápidas Solubilidad en agua: tomar en un tubo de ensayo aproximadamente un gramo de
muestra, adicionar agua en cantidad suficiente para cubrir la muestra; mezclar y dejar en reposo durante 15 minutos. Al cabo de este tiempo observar concluir. Los extractos acuosos y jugos concentrados se disuelven casi completamente, y drogas como la goma arábiga, tragacanto y semillas de lino, ponen de manifiesto su naturaleza gomosa o mucilaginosa. Presencia de carbonato de calcio: tomar en un tubo de ensayo una pequeña
cantidad de la muestra y adicionar unas gotas de ácido sulfúrico diluido, si hay presencia de carbonato de calcio como adulterante, tiene lugar una efervescencia seguida de disolución. Presencia de aceites fijos y/o aceites esenciales: para la prueba de aceites fijos se
debe comprimir una pequeña cantidad de muestra en un pequeño trozo de papel kraft, si aparece una mancha oleosa que persiste luego de someterla a calentamiento a una temperatura de 50°C, la muestra contiene aceite fijo. Ejemplo: semillas de lino y maní. Los aceites esenciales se reconocen por su olor aromático y a la temperatura de 50°C desaparece la mancha oleosa, la detección del aroma también se puede apreciar al calentar la muestra en el baño maría. Prueba para saponinas, taninos y antraquinonas : en un tubo de ensayo tomar
aproximadamente 0,5 g de muestra, adicionar aproximadamente 15 ml de agua, agitar durante un minuto. Si aparece espuma abundante sospechar la presencia de drogas que contienen saponinas, hervir suavemente y anotar si aparece desprendimiento de aceite esencial (por su olor aromático). Filtrar y dividir el filtrado en tres tubos de ensayo, dos para la prueba de taninos y uno para la
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prueba de antraquinonas (5 ml). Realizar las pruebas de identificación correspondientes de acuerdo con el procedimiento descrito en la práctica No. 7.
BIBLIOGRAFÍA WHO. Quality control methods for medicinal plant material. Geneva: WHO. 1998. ISBN 92 4 154510 0. TREASE G.E., EVANS W.C. Tratado de Farmacognosia. Editorial Bailliere Tindall. 12a Edición. Mexico. 1989.
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Práctica No 9 IDENTIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE PLANTAS MEDICINALES OBJETIVO
Aplicar las técnicas básicas de separación cromatográfica para la identificación de compuestos que sirvan como indicadores o marcadores que permitan corroborar la autenticidad de plantas medicinales.
MARCO TEÓRICO La cromatografía ( Chromo= color y Graphie=escritura, escribir en colores) fue desarrollada en el año de 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswett, posteriormente Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales y en 1956 Egon Stahl estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes y le dio el nombre de cromatografía de capa fina a esta técnica de separación de mezclas complejas que ha resultado ser simple, económica y eficiente. En la cromatografía en capa fina, la muestra se aplica en la fase estacionaria y es adsorbida en la superficie del material y la fase móvil asciende por capilaridad a través de la placa, de modo que la separación ocurre de acuerdo con la constante de afinidad de los componentes de la muestra por la fase móvil. Los componentes del sistema cromatográfico que se describirán a continuación son: fase estacionaria y fase móvil.
Fase Estacionaria (Adsorbente): es una de las dos fases que conforman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. En el caso de cromatografía en capa fina lo más común es utilizar las placas de sílica gel 60 GF254.
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Fase Móvil (eluente): es el fluido que se filtra a través de la fase estacionaria, en una dirección definida, en el caso de la cromatografía en capa fina se utiliza un solvente o mezcla de solventes.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) Es la técnica de separación en la que la fase estacionaria está sobre un plano formando una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio o aluminio (Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser eluída dentro de un tanque cromatográfico como se ilustra en la figura.
Figura 21. Representación gráfica del proceso de cromatografía en capa fina.
Si los componentes de la muestra no son coloreados, se requiere de métodos que permitan visualizarlos, este procedimiento se conoce como revelado de la placa. Existen dos tipos de reveladores: Reveladores químicos: a través de inmersión o aspersión de reactivos específicos
se obtienen derivados coloreados o fluorescentes de los componentes de la muestra. Reveladores físicos (ópticos): se utiliza la irradiación de la placa cromatográfica
con luz ultravioleta en longitudes de onda de 254 nm y 365 nm. La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo requiere contar con un estándar de referencia para comparar su valor de factor de retardo 46
(Rf) y el color de la banda del estándar al ser revelada con agentes químicos específicos. El factor de retardo o factor de retención (Rf) es un valor relativo para cada sustancia y depende de las condiciones cromatográficas experimentales (fase móvil, fase estacionaria, eluente y tiempo de saturación de la cámara). Se define como el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la banda y la distancia re corrida simultáneamente por la fase móvil como se ilustra en la figura.
Figura 22. Esquema para ilustrar el cálculo del factor de retención (Rf) cromatográfico. Rf para la mancha 1 = a / X Rf para la mancha 2 = b / X Rf para la mancha 3 = c / X Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).
METODOLOGÍA 1. Reconocimiento cromatográfico del flavonoide Rutina. Muestras propuestas: flores de pensamiento ( Viola tricolor ), flores de caléndula
(Calendula officinalis ), flores de sauco ( Sambucus nigra).
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Obtención de los extractos: pesar 1 g del material vegetal seco y molido y extraer
con etanol durante 10 minutos sobre un baño de agua a 60°C. Filtrar y rotaevaporar. Fase estacionaria: Silica Gel GF-254. Fase móvil: Acetato de etilo: Acido fórmico: Acido acético: Agua (100 : 11 : 11 : 26). Revelador
químico:
revelador de productos naturales (NP-PEG), ácido
difenilbórico (solución 1) y polietilenglicol (solución 2). Revelador físico: luz UV 365nm. Procedimiento experimental: el extracto concentrado se aplica en las placas
cromatográficas correspondientes, se puede utilizar el flavonoide rutina como estándar de referencia. Posteriormente se introduce la placa en la cámara que contiene la fase móvil y se deja eluir hasta alcanzar el frente del solvente, para finalizar se observa con luz ultravioleta a 365 nm y se miden los Rf de cada uno de los componentes.
2. Reconocimiento cromatográfico del fenilpropano Anetol. Muestras propuestas: Anis estrellado, hinojo, eneldo. Obtención de los extractos: pesar 1 g del material vegetal seco y molido y extraer
con 10 ml de diclorometano durante 15 minutos en la campana de extracción. Filtrar y rotaevaporar. Fase estacionaria: Silica Gel GF-254. Fase móvil: Tolueno: Acetato de etilo (93 : 7). Revelador químico : Vainillina- Acido sulfúrico Revelador físico: luz UV 365nm. Procedimiento experimental: el extracto concentrado se aplica en las placas
cromatográficas correspondientes, se puede utilizar el fenilpropano anetol como estándar de referencia. Posteriormente se introduce la placa en la cámara que contiene la fase móvil y se deja eluir hasta alcanzar el frente del solvente, para finalizar se observa con luz ultravioleta a 365 nm y se miden los Rf de cada uno de los componentes.
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3. Reconocimiento cromatográfico del alcaloide Boldina. Muestra propuesta: Hojas de Boldo Obtención del extracto: pesar 1 g del material vegetal seco y molido y extraer durante
15 minutos con 15 ml H 2SO4 0.1 N en la campana de extracción, filtrar y lavar el filtrado hasta obtener un volumen final de 20 ml, adicionar 1 ml de NH 4OH. Realizar dos extracciones cada una con 10 ml de éter dietílico, recoger esta fase orgánica y secarla sobre sulfato de sodio anhidro, filtrar y rotaevaporar. Redisolver en 0.5 ml de metanol. Fase estacionaria: Silica Gel GF-254. Fase móvil: Tolueno: Acetato de etilo: Dietilamina (70 : 20 : 10). Revelador químico : solución spray del reactivo de Dragendorff. Revelador físico: luz UV 365nm. Procedimiento experimental: el extracto concentrado se aplica en las placas
cromatográficas correspondientes, se puede utilizar el alcaloide boldina como estándar de referencia. Posteriormente se introduce la placa en la cámara que contiene la fase móvil y se deja eluir hasta alcanzar el frente del solvente, para finalizar se observa con luz ultravioleta a 365 nm y se miden los Rf de cada uno de los componentes.
CONSULTA Consultar sobre los valores de Rf correspondientes a cada uno de los compuestos presentes en las plantas medicinales propuestas: rutina, boldina y anetol.
BIBLIOGRAFÍA WAGNER H., BLADT S., ZGAINSKI M. Plant Drug Analysis . Springer Verlag. 1984.
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Práctica No 10 CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES DE ACUERDO CON FARMACOPEAS OFICIALES OBJETIVO
Realizar las principales pruebas de identidad general, pruebas de pureza y ensayos químicos para el aseguramiento de la calidad de diferentes plantas medicinales.
MARCO TEÓRICO Cada planta medicinal y específicamente la parte utilizada (droga) contiene principios activos o principales constituyentes con un perfil característico que puede ser usado para el control de calidad desde el punto de vista químico y para el aseguramiento de la calidad de los productos fitoterapéuticos. La monografía de una planta medicinal es aquel documento en el que se especifican de manera detallada las características del material vegetal y los límites de aceptación para el aseguramiento de la calidad en cada una de las pruebas, las cuales se pueden clasificar en: pruebas de identidad general, pruebas de pureza y ensayos químicos. Las pruebas de identidad general están constituidas por los ensayos que permiten la determinación de las características macro y microscópicas de las plantas medicinales y las que representan el perfil cromatográfico y los compuestos mayoritarios en cada droga vegetal. Los ensayos fisicoquímicos o pruebas de pureza se realizan de acuerdo con la legislación y los requerimientos nacionales e incluyen una amplia gama de pruebas como: pruebas microbiológicas (de acuerdo con la guía WHO) determinación de cenizas totales, cenizas insolubles en ácido, determinación de 50
sustancias extractivas acuosolubles y solubles en alcohol, residuos de pesticidas metales pesados, residuos radioactivos, cuantificación de material extraño y cenizas sulfatadas. Dentro de los análisis químicos se establecen los límites inferiores en el porcentaje de los principales compuestos de acuerdo con las técnicas instrumentales, al igual que los métodos cromatográficos que permiten la cuantificación de los diferentes compuestos y como resultado se presentan los principales compuestos y los rangos de porcentajes en los que están presentes en el material vegetal. En la presente práctica el estudiante consultará la monografía oficial de una planta medicinal asignada y realizará las pruebas de control de calidad correspondientes.
METODOLOGÍA Plantas medicinales propuestas: alcachofa (Cynara scolymus L.), eucalipto
(Eucalyptus globulus St. Lag.), hinojo ( Foeniculum vulgare Mill.), manzanilla (Chamomilla recutita L.), quina ( Cinchona succirubra Pavon), romero ( Rosmarinus officinalis L.).
1. Pruebas de identidad general. Reconocimiento macroscópico: realizar la descripción completa de la morfología
externa de la planta medicinal asignada y verificar si cumple con los parámetros farmacopéicos. Reconocimiento microscópico: identificar a nivel microscópico los principales
elementos de valor diagnóstico presentes en el material vegetal: gránulos de almidón, cristales de oxalato de calcio, pelos epidérmicos y tricomas para comparar con la descripción reportada en las farmacopeas oficiales.
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Perfil cromatográfico: reproducir las condiciones de cromatografía en capa fina con
el fin de identificar los principales compuestos presentes en el material vegetal objeto de análisis.
2. Pruebas fisicoquímicas. Porcentaje de materia extraña: en el caso de drogas completas una cantidad
pesada (100-500 g, acorde con el tipo de droga) de una muestra tomada cuidadosamente es esparcida en forma de capa fina en un papel. Esta es examinada a una magnificación de 6X y la materia extraña es sacada y pesada para calcular su porcentaje. Consultar la metodología detallada en la BP 2003, apéndice XID.
3. Identificación de metabolitos secundarios. A partir del extracto de la planta medicinal, realizar las pruebas cualitativas de coloración para la identificación de compuestos fenólicos, terpénicos y nitrogenados, de acuerdo con el procedimiento indicado en la práctica No 7 para cada uno de los metabolitos.
CONSULTA Consultar el procedimiento detallado para realizar las siguientes pruebas fisicoquímicas en el material vegetal: determinación de cenizas, determinación de sustancias extraíbles, determinación de humedad y pérdida por secado.
BIBLIOGRAFÍA WHO. Quality control methods for medicinal plant material. Geneva: WHO. 1998. ISBN 92 4 154510 0. WHO. Monographs on Selected Medicinal Plants. Volume 1-4. 1999. WAGNER H., BLADT S., ZGAINSKI M. Plant Drug Analysis . Springer Verlag. 1984.
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