FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD LICENCIATURA EN NUTRICIÓN Campus Marina Cuitláhuac
Materia: Biología Celular y Genética Elaboró: Mtro. Gustavo Limón Camacho
Ciencias de la Salud Primer cuatrimestre
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LICENCIATURA EN NUTRICIÓN BIOLOGIA CELULAR Y GENÉTICA 1° cuatrimestre
Índice
Página
OBJETIVO……………………………………………………………………………………………………..………..…………………… 3 PRÁCTICA 1. USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y PREPARACIÓN DE TINCIÓN SIMPLE …………………………… 4 PRÁCTICA 2. BIOMEMBRANAS ……………………………………………………………………………………………………..10 PRÁCTICA 3. EXTRACCIÓN DE ADN …………………………………………………………………………………………….…14 PRÁCTICA 4. OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS ……………………………………………………………………………...19
Fecha de elaboración: Septiembre 2011 Fecha de revisión: Junio 2012 Responsable: Dra. Paola Bernal Rosales
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Objetivo Objetivo general del curso. Al finalizar el curso el alumno será capaz de: •
•
Describir la estructura y función básica de los componentes celulares, así como los mecanismos de crecimiento, duplicación y control celular. Identificar los mecanismos de desarrollo de patologías y enfermedades hereditarias, así como analizar las alternativas y probables consecuencias de la intervención génica en enfermedades.
A continuación se mencionan las prácticas de la materia, señalando tiempo invertido por cada una y tiempo sugerido para llevarse a cabo.
A continuación se detalla el nombre de la práctica y sugerencia de semana de aplicación:
Práctica 1. 2. 3. 4.
Uso del microscopio óptico y preparación de tinción simple Biomembranas Extracción de ADN Observación de cromosomas
Semana de aplicación A partir de semana 3 A partir de semana 5 A partir de semana 9 A partir de semana 11
Es obligatorio el uso de bata
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ABORATORIO TORIO DE LABORA BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA
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Práctica No. 1
Uso del microscopio óptico y preparación de tinción simple Preparado por: Prof. Gustavo Limón C.
INTRODUCCIÓN
La observación microscópica de especímenes biológicos constituye una de las herramientas más poderosas en las ciencias biológicas. Desde sus orígenes, la microscopía ha aportado innumerables detalles sobre la estructura de virus, células y tejidos. Estas observaciones han sido importantes no sólo para conocer detalles morfológicos de los organismos, sino que revelan datos importantes sobre localización y tránsito de moléculas en el contexto celular y han permitido por tanto estudiar los cambios morfológicos que una célula experimenta durante su diferenciación y en estadios anormales tales como anomalías genéticas, infecciones, cáncer, respuestas ante estímulos del medio ambiente como presión osmótica, pH, temperatura, etc. Existen distintos tipos de microscopio (óptico, confocal, electrónico, a efecto de tunel, etc.) y cada uno ofrece distinto poder de resolución según sea le material por observar. observar.
Objetivos de aprendizaje Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
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Identificar las distintas partes del microscopio óptico. Manejar el microscopio óptico para observaciones en campo seco e inmersión. Preparar tinciones simples en células eucariónticas y procariónticas. Distinguir diferencias morfológicas entre eucariontes y procariontes.
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Materiales provistos por el laboratorio •
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1 microscopio óptico. 1 portaobjetos. 1 cubreobjetos. 1 asa bacteriológica. 1 mechero con manguera. 2 laminillas con preparación histológica. Cultivo bacteriológico en agar. Etanol-éter para limpieza de objetivos. Solución de azul de metileno. 1 gotero con agua destilada. Aceite de inmersión. Papel para limpieza de objetivos.
Anatomía del microscopio óptico
Fuentede laimagen: http://www.onepoint.es/los_seres_vivos/ud1/photos/img_12.jpg
Descripción de las partes de un microscopio óptico I. Sistema óptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del objetivo.
Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplia la imagen de dicha preparación. Condensador: Lente que concentra los rayos de luz sobre la preparación. Foco o fuente de luz: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador
I. Sistema mecánico
Soporte: Mantiene la parte óptica y consta de pie o base y el brazo. Platina: Lugar donde se coloca la preparación. Revólver: Contiene los objetivos que son intercambiables. Tornillos macro y micrométrico: Permiten acercar la platina para variar la distancia de los lentes respecto a la muestra.
Manejo del microscopio óptico 1. Manejarlo Manejarlo siempre siempre de forma forma vertical vertical sostenién sosteniéndolo dolo con con una mano bajo bajo el pie del microscopio y con otra mano sujetando el brazo. 2. Transporta Transportarlo rlo y coloca colocarlo rlo con cuidado cuidado sobre sobre la mesa mesa sin arrastrarl arrastrarlo, o, golpearlo o inclinarlo. 3. Antes Antes y después después de su uso, limpiar limpiar los objetiv objetivos os con papel papel fotográfic fotográfico o humedecido con una mezcla de alcohol-éter. 4. Una vez que que la muestra muestra se coloca coloca sobre sobre la la patina, patina, girar girar el tornillo tornillo macrométrico para acercarla hacia el objetivo. o bjetivo. Realizar esta operación observando de frente al microscopio para evitar que la muestra toque el objetivo. 5. Observando Observando a través través de los oculare oculares, s, girar girar el tornillo tornillo micromé micrométrico trico hasta lograr una imagen nítida. 6. Para observació observación n en el el rango rango de micras, micras, las muestras muestras requier requieren en observarse con un objetivo de 100x, el cual requiere de aceite de inmersión: Preparar la muestra sobre el portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el espécimen y a continuación una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos. Proseguir como en el punto 5 pero esta vez asegurándose de que la gota de inmersión entre en contacto con el objetivo. A partir de este momento se enfoca la imagen con el tornillo micrométrico.
PROCEDIMIENTO I. Preparación de célula procarióntica 1. Colocar Colocar una gota de agua agua sobre un cubreobjet cubreobjetos os limpio. Flamear Flamear el asa bacteriológica, dejar enfriar y tomar con ella una pequeña porción del cultivo bacteriano extendiéndolo sobre la gota de agua en el portaobjetos.
2. Fijar la muestra pasando rápidamente la parte inferior del portaobjetos sobre la flama. Verificar Verificar que la temperatura no sea excesiva colocando la preparación sobre el dorso de la mano. Si se siente muy caliente, es posible po sible que las células se hayan dañad, en cuyo caso se debe repetir r epetir el paso 1.
3. Colocar una gota de solución de azul de metileno sobre las bacterias fijadas en el portaobjetos y enjuagar con agua destilada vertiéndola gota a gota con el portaobjetos inclinado (no verter el agua directamente sobre la muestra).
4. Colocar un portaobjeto sobre la muestra y una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos.
5. Observar el especimen con el objetivo de 100x y dibujar lo observado.
II. Observación de especímen eucarióntico. 1. Observar las preparaciones de corte histológico en objetivo de 75x y 100x (inmersión). Dibujar lo observado y comparar los tamaños de células procariónticas vs eucariónticas.
Cuestionario para el reporte
1.
¿Cuá ¿Cuáll es es el rang rango o de de tama tamaño ño de las bact bacter eria iass y en en qué qué unidades se miden?
2.
Defin Definaa los los conc concep epto tos: s: uni unice celu lula larr, plu pluri rice celu lula larr y multicelular.
3.
Porq Porqué ué las las mue muest stra rass para para mic micro rosc scop opía ía óptic ópticaa requ requie iere ren n ser muy pequeñas o bien cortarse en e n secciones muy delgadas?
4.
¿Cuá ¿Cuáll es es el tama tamaño ño míni mínimo mo de espec especím ímen enes es que que pued pueden en observarse con un microscopio óptico y cuál para un microscopio electrónico?
5.
¿Cóm ¿Cómo o se se def defin inee el el pod poder er de de reso resolu luci ción ón de un microscopio?
LABORA ABORATORIO TORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA
m t h . B s e n a r b m
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Práctica No. 2
Biomembranas Preparado por: Prof. Gustavo Limón C.
INTRODUCCIÓN
Las
biomembranas, o membranas biológicas, son estructuras
compuestas esencialmente de fosfolípidos dispuestos en doble capa, con los extremos hidrofílicos orientados hacia el citoplasma y el exterior de la célula. Adicionalmente a los lípidos, las biomembranas tienen incrustadas numerosas moléculas de proteínas, carbohidratos y glicoproteínas, entre otras. Todos estos compuestos juegan un papel esencial en la función principal de la biomembrana que es contener y permitir el paso selectivo de materiales hacia y desde el citoplasma mediante mecanismos como la difusión y el transporte activo, regulando con ello el flujo de nutrimentos, agua, electrolitos, hormonas y un sinfín de compuestos que determinan determinan el estado fisiológico de la célula. El estudio de las biomembranas reviste gran importancia dado que constituyen el límite entre la célula y su entorno y, en el caso de los eucariontes, forman también el límite entre los organelos y el citosol.
Objetivos de aprendizaje Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
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Comprender de forma práctica el concepto de permeabilidad de membrana. Identificar las condiciones osmóticas ideales que permiten a una célula mantener su turgencia.
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Materiales provistos por el laboratorio •
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1 tramo de bolsa de diálisis (5 cms). Solución acuosa de almidón al 2% p/v. 2 clips de mariposa pequeños. 75 ml Solución de Iodo al 0.5% 1 vaso de precipitados de 100 ml. 1 lanceta estéril para toma de sangre. Algodón y etanol para desinfección. 1 microscopio óptico. 2 portaobjetos. 4 cubreobjetos. Solución de NaCl al 0.85% P/V. Solución de NaCl al 3.0% P/V. Agua destilada.
PROCEDIMIENTO I. Estudio de permeabilidad 1. Cerrar un extremo de la la bolsa de diálisis con un clip y llenarla llenarla con la la solución de almidón a ¾ de su capacidad. Eliminar el aire empujando con los dedos el extremo abierto y cerrar la bolsa con el segundo clip.
2. Enjuagar muy bien el exterior de la bolsa con agua destilada y secar sobre toalla de papel.
3. Colocar la bolsa de diálisis dentro de la solución de Iodo en el vaso de precipitados.
4. Después de 30 minutos, retirar la bolsa de diálisis, enjuagar y secar sobre papel. Anotar el color del almidón y de la solución de Iodo y explicar en el reporte las razones de los cambios que ocurran en la solución de iodo y de almidón.
II. Estudio de presión osmótica. 1. Limpiar Limpiar bien bien los los portaob portaobjetos jetos con alcohol alcohol y etiquetarlo etiquetarloss comose comose indica indica:: 1er portaobjetos: portaobjetos: Control negativo negativo y agua agua destilada. 2º portaobjetos: NaCl al 3.0% y NaCl al 0.75% 2. Colocar en cada portaobjeto las soluciones respectivas en forma de gotas separadas (el control no llevará ninguna solución).
3. Desinfectar la yema del dedo de uno de los integrantes del equipo con un algodón impregnado de alcohol y obtener sangre con la ayuda de la lanceta estéril
4. Colocar una gota de sangre en cada portaobjetos al lado de la solución respectiva (control, agua, NaCl al 3% o NaCl al 0.75%)
5. Mezclar la sangre con cada solución, cubrir con un portaobjetos y dejar así durante 4 minutos. Observar al microscopio en campo 100X (con aceite de inmersión). Dibujar lo observado y explicar las diferencias en función de la solución a la que fueron expuestas las células sanguíneas.
Cuestionario para el reporte 1.
¿Cómo ¿Cómo se define define una una célu célula la tur turgen gente te y una una célu célula la plas plasmo moliza lizada? da?
2.
¿Po ¿Porqu rqué a la solu soluci ció ón de NaCl aCl se le llama también “solución salina fisiológica?
3.
¿Cuál ¿Cuál es la diferen diferencia cia entre entre perme permeabi abilid lidad ad y permea permeabil bilida idad d selectiva?
4.
¿Porqu ¿Porquéé se se dice dice que que las las biom biomem embra branas nas son son estruct estructura urass diná dinámi micas cas y qué papel juega el colesterol en las membranas de células animales?
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Práctica No. 3
Extracción de ADN Preparado por: Prof. Gustavo Limón C.
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INTRODUCCIÓN
Existen muchas muchas técnicas que permiten aislar al ADN
a partir de de
células eucariónticas y procariónticas. Las variaciones de dichas técnicas se realizan en función del ácido nucléico por extraer: ADN nuclear, mitocondrial mitocondrial o plasmídico, ARN ARN total, mRNA, etc. Esencialmente, la extracción de ácidos nucleicos inicia con la desintegración de membranas y otras estructuras como pared celular, cápsula bacteriana, etc (según sea el organismo organismo en estudio), mediante detergentes, sales, álcalis y enzimas. A este proceso se le conoce como lisis celular. Posteriormente, el homogenizado es filtrado para eliminar restos de membrana y tejido que no alcanzó a lisarse. Finalmente, los ácidos nucleicos pueden purificarse mediante solventes orgánicos, esferas magnéticas o simplemente por precipitación con etanol frío. En esta práctica realizaremos un protocolo sencillo para extraer ADN nuclear a partir de fresas empleando sal, detergente y etanol.
Objetivos de aprendizaje Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
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Conocer los principios de la extracción físico-química de ácidos nucleicos a partir de células eucariónticas. Identificar el papel de los detergentes y sales iónicas en la disrupción de biomembranas con el fin de obtener ADN como paso elemental para análisis genómicos y biotecnológicos.
Materiales provistos por el laboratorio •
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1 pipeta graduada de 5ml. 5 ml de detergente alcalino. ½ cucharadita de sal. ½ taza de agua. 20 ml ml de etanol etanol frío (4 C). 1 vaso de precipitados de 250 ml. 1 varilla de vidrio. Papel negro (10x10 cms).
Materiales provistos por el alumno a lumno •
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•
3 fresas. 1 bolsa tipo ziplock 1 filtro para café. Papel negro (10x10 cms). “
”
PROCEDIMIENTO 1. Macerar tres fresas en una bolsa bolsa ziplock durante durante dos dos minutos. minutos.
2. Preparar la solución de lisis con 1/2 taza de agua , 5 ml de detergente alcalino y 1/2 cdita. de sal.
3. Añadir Añadir la solución de lisis li sis al puré de fresas, homogenizar con las manos y dejar reposar por 2 minutos.
4. Filtrar el homogenizado por papel filtro para café sobre el vaso de precipitados. Descartar lo que queda en el filtro.
5. Añadir Añadir al lisado lentamen lentamente te y en ángulo ángulo de 45 , 20 ml de etanol etanol frío frío (a 4 C).
6. Dejar reposar por 5 minutos. El ADN ADN precipita con el etanol formando filamentos blancos mucosos.
7. Retirar el ADN de de la interfase (zona entre el lisado y el etanol) con una varilla de vidrio y pasarlo al papel negro.
8. Tomar Tomar una fotografía del ADN extraído e incluirla en el reporte.
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1.
Cuestionario para el reporte
¿Qué ¿Qué pape papell dese desemp mpeñ eñan an la la sal sal y el el dete deterg rgen ente te en en la la extracción del ADN?
2.
¿Cuá ¿Cuánt ntas as cop copia iass del del geno genoma ma con conti tien enee la fre fresa sa (di (dipl ploi oide de,, triploide, etc)?
3.
¿Por ¿Porqu quéé el ADN ADN pre precip cipit itaa con con el eta etano nol? l? Exp Explí líqu quel elo o en términos químicos.
4.
Menc Mencio ione ne otr otros os dos dos pro proce cedi dimi mien ento toss para para extr extraer aer ADN. ADN.
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Práctica No. 4
Observación de Cromosomas Preparado por: Prof. Gustavo Limón C.
INTRODUCCIÓN / a c . p 8 1 y m o s a r t e t . w w w / / : p t t h
Los cromosomas son estructuras de Ácido Desoxirribonucléico de doble cadena y constituyen el elemento principal del genoma de un organismo (los plásmidos son también parte del genoma pero de forma circular y más pequeños en longitud). Los cromosomas procariónticos son circulares y su longitud es de algunos millares de pares de bases, mientras que los cromosomas eucariónticos son moléculas abiertas y contienen millones de pares de bases y requieren estructurarse en forma de nucleosomas y bucles para evitar que el ADN se dañe y también como mecanismo de regulación génica, silenciando así genes que no requieren expresarse en un momento dado. Adicionalmente al ADN, los cromosomas y proteínas que se asocian por sus cargas positivas al ADN (de carga negativa). Dichas proteínas varían en tipo y número según se trate de cromosomas procariónticos o eucariónticos. Para visualizar los cromosomas, se prefiere estudiarlos en fase mitótica ya que es cuando se hallan replicados presentando al menos dos cromátidas según sea la ploidía de la célula estudiada.
Objetivos de aprendizaje Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
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Preparar células eucariónticas a partir de tejido vegetal para observación de distintas fases del ciclo celular. Realizar tinción histológica para identificación de cromosomas en fase mitótica.
Materiales provistos por el laboratorio •
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1 microscopio óptico. 3 portaobjetos. 1 cubreobjetos. 1 pinzas. 1 navaja de disección. HCl 1N. 1 tubo de ensayo pequeño. Pinzas para tubo de ensayo. Vaso de precipitados de 100 ml. Mechero con manguera. Soporte para vaso de precipitado. Agua destilada en gotero. Solución de Feulgen comercial o preparada en laboratorio (ver fórmula y preparación en el apéndice.
Materiales provistos por el alumno •
3 brotes de germinado de soya
PROCEDIMIENTO 1. Con ayuda ayuda de las pinzas y la navaja, navaja, cortar la punta de dos dos germinados germinados de soya soya ( Aprox. 1 cm). 2. Colocar los cortes en un tubo de ensayo pequeño y añadir HCl 1N hasta cubrirlos. Llevar a baño de agua durante 12 minutos
3. Remover los cortes de germinado y con las pinzas transferirlos cuidadosamente a un portaobjetos y enjuagar 3 veces con agua destilada gota a gota..
4. Añadir a cada germinado una gota de tinción de Feulgen e incubar a temperatura ambiente durante 12 minutos. Las puntas del germinado pueden tornarse rojas por la incorporación del colorante a los cromosomas.
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5. Enjuagar los brotes 3-4 veces cuidadosamente con agua destilada gota a gota.
6. Transferir Transferir 2 brotes a otro portaobjetos limpio (un brote por portaobjeto) y con la navaja cortar la parte no teñida y descartarla. 7. Colocar un cubreobjetos sobre el brote y oprimir la muestra suavemente contra el portaobjetos (NO GIRAR EL CUBREOBJETOS).
8. Observar al microscopio iniciando con el objetivo 10x hasta el 100x (de inmersión), dibujando lo observado.
Fuente: http://www.marietta.edu/~ http://www.marietta.edu/~biol/introlab/Onion%20root%20mitosis.pd biol/introlab/Onion%20root%20mitosis.pdf f
Cuestionario para el reporte 1.
Expl Expliqu iquee en en tér térmi minos nos qu quím ímic icos os por porqu quéé los los cro cromo moso soma mass fija fijann a la Fuschina básica que es el colorante de la solución de Feulgen.
2.
¿Cóm ¿Cómoo influ influyye el que que un un crom cromos osom omaa sea abie abiert rtoo o cerr cerrad adoo en cua cuant ntoo
a su degradación por nucleasas? 3.
Menc Mencio ione ne dos dos agente agentess (sust (sustanc ancia ias) s) que que pueda puedann color colorear ear cro cromo mosom somas as,, distintos al empleado en esta práctica.
Apéndice
Preparación se la solución de Feulgen 1.
Pesa Pesarr 150 150 mg de de Fuch Fuchsi sina na bási básica ca y tran transf sferi erirr a un vas vasoo de precipitados de 250ml.
2.
Añad Añadir ir 30 ml ml de agua agua hir hirvi vien ente te a la Fuch Fuchsi sina na y agi agita tarr hast hastaa disolución total.
3.
Enfr Enfria iarr a 50 C y filt filtra rarr por por pape papell Whatm hatman an No. No. 1. 1.
4.
Añad Añadir ir 4.5 4.5 ml ml de de HCl HCl 1N y mez mezcl clar ar bien bien..
5.
Añad Añadir ir 0.45 0.45 g de de K2S2 K2S2O5 O5 (met (metab abis isul ulfi fito to de pot potas asio io)) a la la solución de Fuchsina-HCl.
6.
Deja Dejarr la sol soluc ució iónn en en repos reposoo y obs obscu curi rida dadd dur durant antee 24 hrs. hrs.
7.
Deca Decant ntar ar la solu soluci ción ón a un un got goter eroo ámb ámbar ar y mant manten ener er en en refrigeración.
Estructura de la Fuchsina básica
Fuente: http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/gen http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/Root_tip_chromosomes/Feulgen etics/Root_tip_chromosomes/Feulgen_Stain.htm _Stain.htm
