CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA, ETANOL Y PROTEÍNAS
I.
INTRODUCCIÓN
En un proceso biotecnológico es deseable el aumento de la población de los microorganismos a los cuales se les refiere normalmente con el nombre de biomasa, así como también es deseable la obtención de un producto secundario secundario o resultante. r esultante. Para que la biomasa muestre un crecimiento en su población, es necesario que los microorganismos cuenten con condiciones ambientales óptimas para su desarrollo. Estos microorganismos microorganismos tienen un metabolismo cambiante y poco predecible, lo cual indica; que si hay cambios, aunque sean de poca magnitud en las condiciones (temperatura, pH, velocidad de agitación, etc.), y los elementos que componen el medio ambiente en el cual se encuentran, afectan de manera directa el desarrollo de los microorganismos impidiéndoles crecer. (FloresMorfin, J., 1999) La gran mayoría de métodos instrumentales requieren una calibración, proceso que relaciona la señal analítica medida con la concentración del analito. Uno de l os métodos más frecuentemente utilizados es el uso de una curva de calibración. Para realizar el método de la curva de calibración se procede a realizar una serie de soluciones de concentración conocida de analito, los cuales se introducen en el instrumento y se registra la señal instrumental. Normalmente esta señal se corrige por medio de la señal de una blanco analítico en el que se establece el cero de absorbancia, este blanco contiene todos los componentes de la matriz de análisis (ejemplo: solución de glucosa, etanol) a excepción de analito que se desea medir. (Skoog, D. A., 2001)
II.
MARCO TEÓRICO
La medida de la concentración concentración mediante un método instrumental se basa en la existencia de una relación proporcional entre dicha concentración y la señal analítica o respuesta que genera un instrumento. Generalmente esta relación es lineal, de modo que puede expresarse como: y =a+b·CA, donde CA es la concentración del analito, y la señal medida, a la ordenada en el origen y b la pendiente de la recta. La ecuación de la recta se obtiene mediante calibración con disoluciones de concentración perfectamente perfectamente conocida (disoluciones patrón) a partir de la medida de la señal analítica proporcionada por éstas. Los pares de valores concentración-señal se ajustan a una recta, a partir de la cual cual pueden obtenerse obtenerse la concentración concentración del del analito en muestras muestras desconocidas. desconocidas. La sensibilidad de calibración es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en una curva de calibrado lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a depender de la concentración, ya que para que se cumpla y =a+b·CA las concentraciones deben tener una incertidumbre insignificante.
La curva de calibración debe de presentar aspectos importantes como: Exactitud, precisión, repetitividad, reproducibilidad. En general, la etapa de calibración y la obtención de la concentración concentración de analito en una muestra constan de los siguientes pasos:
III.
Preparación de los patrones Obtención de la relación señal-concentración señal-concentración Uso de la recta de calibrado
OBJETIVOS
La práctica tuvo como objetivos principales determinar la curva de calibración de azúcares reductores usando DNS, así como también plantear la metodología de uso de este método analítico para conocer los distintos parámetros que son importantes en el rendimiento de un bioproceso.
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS
Agua destilada
Refractómetro de Abbe
Tubo con tapa rosca
Reactivo DNS
Balanza analítica
Glucosa
V.
PROCEDIMIENTO Determinación de azúcares reductores
A.1. Método de DNS: 1. Se agregó 1ml de 1 sobrenadante obtenido (que contenga 20-200mg de glucosa en 1000
2. 3. 4. 5. 6.
mL), en tubos con tapa rosca y 1ml del reactivo de DNS por las paredes del tubo. Se tapó con tapa rosca y agitarlos. Se colocó la muestra en ebullición durante 5’ Posteriormente Posteriormente se añadió 10 ml de agua destilada, agitar y dejar en reposo por 20’. Se leyó la absorbancia a 540nm contra un blanco que contiene agua destilada. La concentración se obtendrá por interpolación de la absorbancia con la curva de calibración del carbohidrato o de acuerdo de la ecuación de la recta. Se expresó el resultado en g/L de Glucosa.
A.2. Solución de DNS (25 ml) 1. Disolver 0,4 g de NaOH en 12.5 ml y agregar 7.5 g de tartrato sódico potásico, calentar hasta disolverlo. 2. Lentamente Lentamente adicionar 0,25 g de ácido 3,5-dinitrosalicilico agitando bajo calentamiento. calentamiento. 3. Aforar a 25 ml con agua destilada. Almacenar a temperatura ambiente en botellas oscuras. 4. Realizar la determinación de azucares reductores mediante a 1ml con agua destilada. 5. Elaborar una gráfica relacionando las absorbancias con las concentraciones y determinar el rango lineal.
Determinación de proteínas *El siguiente procedimiento fue planteado en práctica mas no se pudo realizar por deficiencia de reactivos, Los resultados en la parte del final del informe, fueron extraídos de prácticas realizadas anteriormente.
B.1. Método Bradford 1. Agregar 0.1ml de muestra conteniendo 10 a 100 ug de proteína, en tubos 13x100. 2. Al tubo anterior agregar 2 ml del reactivo de coloración de proteína. Mezclar por inversión o por agitación suave. 3. Leer la absorbancia a 595nm después de 5 min contra un blanco reactivo. 4. Elaborar una gráfica relacionando las absorbancias con las concentraciones y determinar el rango lineal.
VI.
RESULTADOS Curva de calibración de azucares
Tubo N°
Solución estándar de Glucosa (0.1 g. en 50 ml.) en ml.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Agua Destilada (ml.)
Concentración (g/L)
1 Blanco 0.9 0.2 0.8 0.4 0.7 0.6 0.6 0.8 0.5 1.0 0.4 1.2 0.3 1.4 0.2 1.6 0.1 1.8 0 2 Tabla 1. Resultados final de absorbancia en la Prueba DNS
Absorbancia (540 nm) 0.008 0.086 0.171 0.288 0.385 0.493 0.595 0.723 0.815 0.919 1.043
Figura 1. Muestras para la determinación de azucares en DNS y = 0.5236x - 0.0212 R² = 0.9983
Curva de Calibración de la Glucosa 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Curva de calibración de proteínas
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7
Stock / uL
H20 destilada uL
Concentración
Abs. 595nm
0 10 20 30 40 50 60
300 290 280 270 260 250 240
0 10 20 30 40 50 60
0.002 0.008 0.015 0.025 0.028 0.045 0.049
Tabla 2. Resultados final de absorbancia en prueba Bradford
y = 0.0008x + 0.0001 R² = 0.9763
Curva de calibración para Proteínas 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0
10
20
30
40
50
60
70
VII.
DISCUSIÓN
VIII.
CONCLUSIONES
Se desarrolló con eficacia un procedimiento para determinar la concentración de (azúcares reductores) por el método del ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS); la determinación de estos azúcares se realizó para obtener una curva de calibración, con este reactivo (DNS) que tiene capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de 540nm en el espectrofotómetro. Las gráficas muestran resultados satisfactorios ya que el valor de R, obtenidos tanto en la prueba de azúcares como de Proteínas fueron de 0.9983 y 0.9763 respectivamente.
IX.
Existe una relación entre intensidad de color y la concentración de la sustancia, con base en la Ley de Lambert-Beer podemos afirmar que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que es específica de cada cromóforo.
BIBLIOGRAFÍA
1. Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman Nieman (2001) Principios de Análisis Instrumental. 5 ta Edición, Editorial McGraw‐Hill. 2. Gamero-Inda, E.; Flores-Morfin, Flores-Morfin, J.; “Fuzzy control of a biotechnology process” Fuzzy Information Processing Society, 1999. NAFIPS.
