TRANSPORTE DE GLUCOSA EN LEVADURA. Hipótesis: “Si el consumo de Glucosa disminuye al agregar alguna sustancia desacoplante, entonces el mecanismo de transporte que utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae es mediado.”
Diseño experimental Para este experimento utilizamos el método del DNS para calcular la cantidad de glucosa residual, es decir la que la levadura Saccharomyces cerevisiae no consumió, que se tenía en los tubos después de que se llevó a cabo cada experimento en diferentes condiciones. Los azúcares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere la característica de poder reaccionar con otros compuestos. La determinación de estos azúcares se realizó con el objetivo de obtener la curva de calibración aplicando la técnica de Miller o DNS (3,5dinitrosalicílico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de 540 nm.
Objetivos:
Elaborar una curva de tipo de Glucosa utilizando el método del DNS. Identificar la temperatura adecuada a la cual se tendrá el transporte de glucosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Conocer qué función cumple el DNS DNS al ser adicionado a la mezcla de suspensión celular y glucosa. Determinar qué mecanismo de transporte utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae, de acuerdo a la cantidad de glucosa consumida al adicionar NEM. Para cuantificar la cantidad de Glucosa residual durante la experiencia fue necesario realizar una Curva tipo de ésta, la cual se realizó por el método del
Registro de datos
Registro de datos Para cuantificar la cantidad de Glucosa residual durante la experiencia fue necesario realizar una Curva tipo de ésta, la cual se realizó por el método del DNS a diferentes cantidades de Glucosa y leyendo absorbancia de cada una obteniendo así los siguientes datos: Tabla 1. Absorbancias a 540 nm a diferentes concentraciones de Glucosa μg de Glucosa A (540 nm)
0
0
100
0.166
200
0.405
300
0.636
400
0.891
500
1.125
Figura 1. Curva tipo de Glucosa de 0- 500 μg por el método del DNS 1.2
1
0.8
y = 0.0023x - 0.0365 R² = 0.9969
) m 0.6 n 0 4 5 ( A
0.4
0.2
0 0 -0.2
100
200
300 μg de Glucosa
400
500
600
Para obtener los g de Glucosa obtenidos utilizamos la ecuación de la curva tipo, despejamos y tenemos lo siguiente: y = 0.0023x - 0.0365 A = 0.0023[g Glucosa] - 0.0365
… (1)
La cantidad de alícuota que debemos tomar para realizar el método del DNS es importante ya que es necesario que nuestras lecturas de absorbancia caigan dentro de nuestro rango de lectura en nuestra curva tipo para poder cuantificar la Glucosa residual, para ello tomamos en cuenta la concentración de glucosa inicial así como las diluciones que se fueron realizando en cada paso de la experiencia:
Concentración de Glucosa inicial: 4 mg/ml Volumen de Glucosa adicionado: 10 ml Volumen total: 20 ml
Concentración de la solución: 2 mg/ml Vol. Alícuota tomado: 2 ml Vol. Total: 3 ml
Considerando que tomamos una alícuota de 0.2 ml nuestra cantidad de glucosa en g sería de:
Es por ello que tomamos los 0.2 ml de alícuota ya que los 266.66 entran en el rango útil de nuestra curva tipo.
g
de Glucosa
Posteriormente se realizaron 5 tubos con suspensión celular y glucosa sometidos a distintas condiciones de tiempo y temperatura y/o con algún inhibidor, para saber qué tipo de transporte efectúa el m.o., determinando la cantidad de glucosa residual por el método del DNS teniendo los siguientes datos de absorbancia:
Tabla 2. Absorbancias a 540 nm de los matraces 1-5, a diferentes tiempos. A (540 nm)
Tiempo (min) No. De Matraz
0
10
20
30
1
0.803
0.770
0.691
0.777
2
0.725
0.303
0.063
0.000
3
0.743
0.795
0.398
0.312
4
0.774
0.862
0.783
0.741
5
0.003
0.005
0.006
0.014
Utilizando la ecuación 1 así como las absorbancias de la anterior tabla 2 determinamos la cantidad de Glucosa residual para cada uno de los matraces a los tiempos correspondientes:
Debido a que la las células de nuestra levadura pueden tener Glucosa que alteraría nuestras lecturas, elaboramos una muestra (Matraz 5) que contenida únicamente la suspensión celular, sin glucosa sometida a todo el mismo proceso que los demás con el fin de ajustar los valores obtenidos en los demás matraces teniendo así:
Para saber la concentración residual de Glucosa en mg/ml tomamos en cuenta la alícuota que tomamos y realizamos la conversión de g a mg:
Tomando en cuenta que a los 0 minutos en cada uno de los matraces la concentración de Glucosa es la Glucosa inicial, restando esta para cada matraz a los 4 tiempos correspondientes (Glucosa residual) para conocer la concentración de Glucosa consumida
Tabla 3. Concentración de Glucosa residual y consumida a diferentes tiempos. mg de Glucosa/ml No. De Matraz
Residual
Consumida
Tiempo (min)
0
10
20
30
0
10
20
30
1
1.75
1.67
1.50
1.67
0.00
0.08
0.25
0.08
2
1.58
0.69
0.07
0.00
0.00
0.89
1.51
1.58
3
1.62
1.72
0.86
0.65
0.00
0.00
0.76
0.97
4
1.68
1.48
1.70
1.59
0.00
0.20
0.00
0.09
Para determinar el tipo de transporte que efectúa la levadura Saccharomyces cerevisiae es necesario construir una gráfica para observar el comportamiento de cada uno de los matraces así como el efecto que ejercen las condiciones a las que se sometieron cada uno de ellos e inhibidores que se les adicionó si fue el caso, lo podemos lograr relacionando la concentración de Glucosa consumida en función del tiempo teniendo así la siguiente gráfica:
Figura 2. Transporte de Glucosa por S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i ae en diferentes condiciones y en presencia de inhibidor. 1.8 1.6 1.4 ) l 1.2 m / g m 1 ( ] a d i 0.8 m u s n 0.6 o c u l G 0.4 [
0.2 0 0
5
10
15
-0.2
20
t (min)
Matraz 1
Matraz 2
Matraz 3
Matraz 4
25
30
Discusión: Discusión En condiciones enológicas (producción de vino), los azúcares fermentables por la levaduras son la glucosa y la fructuosa que están presentes en fuerte concentraciones. La Saccharomyces cerevisiae posee un sistema multiétnico de transporte de glucosa como lo observado en las células superiores (mamíferos) [1]. La determinación del azúcar residual por la levadura se hizo mediante el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570 nm, por lo cual se obtuvo una curva tipo (Gráfica 1) con el fin de calcular la concentración de glucosa residual en mg/mL. Según la ley de Lambert y Beer, la absorbencia es directamente proporcional a la concentración del material que absorbe la luz, es decir, a mayor cantidad de azúcar reductor mayor será la coloración, y es esta la que se detecta y cuantifica por el espectrofotómetro para determinar la cantidad de glucosa, obteniéndose un coeficiente de correlación (r) de0.9984 cumpliendo con la Ley de Lambert y Beer. Con base a la gráfica 2 se observa que el matraz (2) que estuvo a temperatura ambiente, se tomó como testigo positivo ya que tiene las condiciones ideales para el transporte de glucosa se lleve sin ninguna interferencia. Lo que corresponde a la cantidad de glucosa inicial que fue transportada completamente al interior del microorganismo. Observándose una conducta lineal al principio y después un poco curva esto puede ser por una mala medición en las alícuotas tomadas a los diferentes tiempos del experimento. El matraz (1) que se mantuvo a 4°C, se le colocaron las sustancias necesarias para que se llevara a cabo el transporte de glucosa, sin embargo, lo que varío fue la temperatura a la que se mantuvo. Como se observa en la gráfica 2 el consumo de glucosa por la levadura fue mínimo en comparación con el matraz que se mantuvo a temperatura ambiente. Esto debido a que la de Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo mesófílo, es decir, que su temperatura óptima de crecimiento son temperaturas moderadas [2]. Su temperatura óptima de crecimiento varía entre los 22 y 29 °C [3]. Por lo tanto al estar en condiciones anormales, las estructuras de los fosfolípidos y proteínas acarreadoras de la membrana de Saccharomyces cerevisiae se ven afectados. Al estar en bajas
temperatura estas tienden a contraerse y desfavorecer el transporte de glucosa, afectada la membrana citoplasmática produciendo que su fluidez y permeabilidad también disminuyeran por lo que la levadura disminuye su capacidad de tomar glucosa del medio. Así en estas condiciones se ve afectado la difusión simple de la glucosa. El matraz (3) con 2,4 dinitrofenol (DNF) el cual es un desacoplante que tiene la capacidad de que al estar protonado puede atravesar a la membrana lipídica ya que adquiere una naturaleza liposoluble, como consecuencia se verá afectado el transporte de H+ lo cual afecto la producción de ATP y por consecuencia interviniendo en la cadena respiratoria y fosforilación oxidativa, es decir afectara a los procesos de transporte que requieran energía mediada por ATP [4]. En la gráfica 2 se observa que su comportamiento es parecido al matraz testigo, pero su consumo de glucosa es menor, sin embargo este agente no influye en el tipo de transporte que realiza la levadura. El DNF al inhibir la producción de ATP se esperaba que si el transporte que llevaba a cabo Saccharomyces cerevisiae es activo se viera afectado en presencia de DNF, y si fuera pasivo que no se viera afectado. [5] Por lo tanto el tipo de transporte que realiza Saccharomyces cerevisiae es pasivo. En el matraz (4) se agregó el agente N- etilmaleimida (NEM) que nos ayudara a diferenciar si nuestro transporte es mediado o no, ya que actúa sobre las proteínas afectando el transporte mediado por proteínas acarreadoras, uniéndose al grupo sulfhidrilo de estas y evitando que cambien su conformación para introducir el sustrato, con esto se modifica la configuración de dichas proteínas y se ve afectado el transporte de glucosa. Idealmente se esperaba una curva de consumo de glucosa mínimo, sin embargo, en la gráfica 2 se observa que al tiempo de 20 min hay un registro de consumo de glucosa cero, esto pudo deberse a que la alícuota que se tomó a ese tiempo no fue la adecuada. El matraz 5 fue un control negativo, las lecturas de glucosa consumida corresponden a cero, puesto que no se agregó glucosa al medio. Las lecturas registradas por el espectrofotómetro se le resto a los demás matraces a su correspondiente tiempo., esto con la finalidad de eliminar el margen de error producido por los reactivos y tener lecturas más certeras de la glucosa transportada.
