Universidad de Oriente
Núcleo de Sucre
Escuela de Ciencias
Departamento de Biología
Bioquímica I
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODOS DE BIURET Y LOWRY
Alvarado, Antonio C.I: 22.671.645
Pérez, Paola Katerine C.I: 22.921.793
Vera, María C.I: 24.873.420
Sección: 04
Cumaná, noviembre de 2014
INTRODUCCION
Las proteínas son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones. Las proteínas como un grupo de biomoléculas, desempeñan una gran variedad de funciones, algunas participan en la contracción muscular y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan moléculas pequeñas.
Los anticuerpos (moléculas que sirven para como protección inmunológica) son proteínas al igual que las enzimas (catalizadores biológicos) y algunas hormonas. Las proteínas pueden llevar a cavo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de combinaciones en la composición y secuencia de aminoácidos.
Las proteínas también se clasifican según su composición, las que se forman solo de residuos de aminoácidos y no tienen otras biomoléculas son PROTEÍNAS SIMPLES; no odas las proteínas son solubles en agua , de hecho las proteínas insolubles son esenciales para dar soporte y mantener la integridad estructural de las células y organismos.
La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes.
Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteínas presente en muestras biológicas, basados específicamente en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Los métodos más usuales son: Compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) al reaccionar con el reactivo de Biuret (sulfato de cobre alcalino) se forma un complejo de color púrpura. Este color es el resultado de la coordinación de los átomos de nitrógeno del enlace peptídico con el Cu+2. La intensidad del color y la cantidad de producto depende de la concentración de proteínas. Este método es reproducible pero poco sensible. El rango de sensibilidad de este método es de 0,25 – 200 mg de proteínas por mL de solución, y el tiempo que toma realizar la prueba es de aprox 20-30 min y el método de lowry que es un método más sensible que el de Biuret pudiendo detectar muy bajas concentraciones (hasta 5 ug). El principio de la detección es el mismo que el de Biuret con la diferencia en que se utiliza un segundo reactivo: la solución de Folin– Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. Este incremento en la intensidad se debe a la reducción del reactivo Folin– Ciocalteau por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas. El producto coloreado de la reacción es leída en un espectrofotómetro a 750 nm.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.- Aplicar los principales métodos de valoración de las proteínas.
2.- Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero bovino (proteína patrón) para cada una de los métodos colorimétricos de Biuret y Lowry.
3.-Comparar la sensibilidad de los métodos evaluados
METODOLOGIA
Recta de calibración de la reacción del Biuret.
Se colocaron en una gradilla ocho tubos de ensayo que estaban limpios y secos.
Se enumeraron del 1 al 6 con un rotulador permanente al agua y tantos tubos adicionales como muestras problemas existan (bien rotulados).
Con las pipetas adecuadas se adicionó cada uno de los volúmenes de la disolución patrón de albúmina de suero bovino al 10 mg/mL (BSA) y de agua destilada que se indicó en la siguiente tabla: agregue los reactivos en el siguiente orden: albúmina, agua destilada, soluciona alcalina o Biuret.
Se agitó suavemente cada uno de los tubos y se dejó reposar a los tubos durante 20 min. Se procedió a medir en el espectrofotómetro, ajustándose el mando de selección de la longitud de onda del espectrofotómetro a 540 nm. Se ajustó el cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína (tubo 1).
Se midieron las absorbancias de los tubos 2 a 6. Siempre que se realizaron las medidas desde la solución menos concentrada (tubo 2) a la más concentrada (tubo 6), se cometerá el mismo error de medida, por lo que no será necesario enjuagar y secar la cubeta después de cada medición. Luego se procedió a medir las concentraciones problemas tubos 7 y 8.
Método de Lowry
La determinación de proteínas de acuerdo al reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu´s es muy sensible. La cantidad de color, sin embargo, varío con las diferentes proteínas y el color no es estrictamente proporcional a la concentración. Este método pudo determinar concentraciones de proteínas en el orden de 5-200 µg/ml.
Recta de calibración del método de Lowry:
Puesto que el método de Lowry es más sensible que la reacción del Biuret, lo primero que hay que se realizó es la preparación de una solución de proteína patrón más diluido (1 mg/ml). Para obtener la recta de calibración del método de Lowry se siguen los siguientes pasos:
Se colocó en una gradilla siete tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 7 con un rotulador permanente al agua. Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adicionó a cada uno de ellos los volúmenes de la solución patrón de BSA 1 mg/ml y de agua destilada.
Luego de esperar 30 min, Se procedió a medir en el espectrofotómetro siguiendo las normas expresadas anteriormente Se ajusta el mando de selección de la longitud de onda del espectrofotómetro a 650 nm y se procede a medir como se indicó para el reactivo de Biuret. Una vez que se determinó los valores de absorbancia para cada concentración de proteína patrón para los métodos establecidos de Biuret y Lowry, el desarrollo de los mismos pasa por optimizar una serie de parámetros, tales como, linealidad, sensibilidad, precisión, rango, selectividad y robustez, mediante el uso de herramientas estadísticas
Curvas de calibración
Para comparar dos curvas de calibración, se requiere medir la bondad del ajuste de los patrones, De los valores estadísticos el coeficiente de correlación es el más popular. Un valor de +1 indica una relación lineal perfecta entre la absorbancia y la concentración.
RESULTADOS
TUBOS
1
2
3
4
5
6
t
0
75
59
46,5
37
31
Abs
0
0,12
0,23
0,33
0,43
0,51
Abs=2-log t
Abs=2-log 75
Abs=0,12
Abs=2-log 59
Abs=0,23
Abs=2-log 46,5
Abs=0,33
Abs=2-log 37
Abs=0,43
Abs=2-log 31
Abs=0,51
0,1 mg 1 ml X = 0,02 mg
X 0,2 ml
0,1 mg 1 ml X = 0,04 mg
X 0,4 ml
0,1 mg 1 ml X = 0,06 mg
X 0,6 ml
0,1 mg 1 ml X = 0,08 mg
X 0,8 ml
0,1 mg 1 ml X = 0,1 mg
X 1 ml
X
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
Y
0,12
0,23
0,33
0,43
0,51
m= Y2- Y1X2- X1
m= 0,33- 0,230,06 - 0,04= 0,10,02 =5
Abs DEL TEJIDO DE PROTEÍNA
Abs=2-log 63
Abs=0,20
0
Y = mx + b mg= Abs-0m
mg= 0,20-05=0,04 mg
g masa de humedad 1 g 9 ml de NaCL X = 0,022 g
X 0,2 ml
PROTEÍNA=mg de Proteínasmasa de humedad
PROTEÍNA=0,04 mg0,022 g=1,82
DISCUSION
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. La reacción del Biuret se da si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma un complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm. Las características más importantes de la reacción son:
La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas.
Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composición de aminoácidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción. Violeta-púrpura Complejo proteína-Cu (II)
La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos ureas (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción.
Una muestra acuosa se trata con un volumen igual de 1% de base fuerte seguido de unas gotas de sulfato de cobre acuoso. Si la solución se torna púrpura, la proteína está presente, 5-160 mg/ml se pueden determinar. Un péptido de una longitud de cadena de al menos 3 aminoácidos es necesaria para un cambio de color medible significativa con estos reactivos.
(Peter Atkins y Loretta Jones, 2006)
Grafica N° 1 "Curva de Calibración"
Como se puede ver a medida que aumentan los mg de proteínas aumenta la absorbancia, debido a que los resultados obtenidos se debe a que en el espectrofotómetro simple, leído a 540 nm de ondas un haz de luz reflejada en un espejo atraviesa un tubito con determinada solución para medir las proteínas concentradas y entre menos luz pase más proteínas estarán presentes en la solución pero este debe de estar previamente calibrado por la respectiva muestra blanco.
CONCLUSION
Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema. El método de Biuret es el más utilizado para la cuantificación de proteínas, es un método rápido, sencillo y eficiente, y sobre todo didáctico. Es importante conocerlo puesto que en la vida profesional puede ser útil, ya que como una carrera de investigación, es posible enfrentarse a trabajar con la presencia de soluciones de concentraciones desconocidas y para saber cómo se deben manejar. Una manera fácil y concisa para conocer la concentración de la proteína es por medio de análisis como éste. En el método de Biuret, con el uso de la espectrofotometría es posible conocer las concentraciones de la muestra problema, esto comparando con la gráfica que se construye a partir de las absorbancias leídas, entonces se reforzó la construcción de curvas de calibración relacionando la absorbancia y la concentración, y a partir de esto se pudo identificar por medio de la interpolación, la concentración de la muestra problema.
El método de Lowry es poco preciso de acuerdo a las determinaciones realizadas. Existen interferencias en la cuantificación de proteínas por el método de Lowry, las principales se basan en la similitud estructural entre la sustancia que interfiere y los aminoácidos que son detectados por este método (compuestos con grupos aromáticos), otras interferencias pueden serlos agentes que desnaturalizan o que precipitan proteínas.
Pese a que muchas proteínas tienen aminoácidos con grupos aromáticos, la abundancia de estos en la proteína puede crear resultados poco confiables para este ensayo.
El objetivo planteado al inicio de la práctica se cumplió correctamente ya que logramos conocer la concentración de la muestra de proteína preparada a partir de una solución patrón de concentración conocida.
BIBLIOGRAFIA
Moore, J.; R. Langley. 2008. Biochemistry for dumies. Wiley Publishing, inc. Indianapolis, Indiana.
Voet, D.; J.G. Voet. 2004. Biochemistry. 3a ed. Wiley international edition. USA.
González-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damián-Matzumura; F. Díaz de León- Sánchez; E. Cortés-Barberena; L.J. Pérez-Flores. (2009) Manual de bioquímica 1. 3ª ed. México.
Nelson, D.L.; M.M. Cox; 2007.Lehninger Principles of Biochemistry. 4a ed.
