DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE GERMEN DE TRIGO Y PROPI PROPI E DADES CI NÉTI CAS DE LA FOS FOSF ATAS ATASA A ÁCI DA DEL GER MEN DE TRI GO
Profesores: Hegaly Mendoza Vilches. Nicolás Pacheco Camus. Autores: Diego Bienzobás D. Ángelo González C. Fecha de Entrega: 29/09/17
INTRODUCCIÓN Una enzima es una proteína que cataliza una reacción química específica, disminuyendo la energía de activación de las reacciones metabólicas, por lo que aumentan la velocidad y permiten que se produzcan a temperaturas, presiones y condiciones en las que normalmente estas reacciones no se producirían. Al realizar un ensayo enzimático se debe elegir el mejor método, el más adecuado para lo que se quiere obtener.
Ensayo de tiempo fijo: Se detiene la reacción en un tiempo determinado y se calcula la concentración de sustrato consumido o de producto originado. Ensayo Cinético: Se toma una serie de tiempos continuos muy próximos entre si y se miden las concentraciones de sustrato o producto.
En el siguiente práctico se realizó una curva de calibración para la formación de p-nitrofenol y se determinará la actividad de la fosfatasa ácida de germen de trigo mediante el sustrato artificial p-nitrofenil fosfato. Se cuantifica este sustrato liberado fotométricamente según el grado de hidrólisis. Se trabajará en una solución básica donde la longitud de onda de absorción corresponde a 405 nm.
Curva de calibración: Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo, la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (concentración). Rango lineal: El rango lineal de un detector cromatográfico es el intervalo de concentración o flujo másico de una sustancia en la fase móvil, dentro del cual la sensibilidad del detector es constante, con una variación determinada, Cinética de Michaelis-Menten: Describe la velocidad de reacción de una enzima Doble Reciproco: Consiste en el inverso de los valores de la curva de MichaelisMenten para así poder graficar linealmente.
MATERIALES
Amortiguador citrato de sodio 0,1 M; EDTA 0,15 M pH 5.0. Sustrato de p-nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2,5 mM. Solución de p-nitrofenil 60 M en NaOH 0.02 M. Solución de 0,02 M NaOH. Solución stock de enzima 5 mg/ml en BSA 0.1 diluida 1:20. Baño termoregulado a 37º C. Vaso precipitado de 50 ml. Tubos de ensayo. Micropipetas de 100-1000 l; 10-100 l.
METODOS A. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE GERMEN DE TRIGO. EXPERIENCIA A: 1. Prepare 6 tubos que contengan 0; 1.00; 2.00; 3.00; 4.00; 5.00 mL de una solución de p – nitrofenol 60 µM y enrase cada uno de los tubos con NaOH 0.02 M a 6.00 mL, de volumen final. 2. Transfiera a la cubeta y lea absorbancia a 405 nm. 3. Como tubo blanco utilice el tubo que no contiene p – nitrofenol y calibre el equipo. 4. Grafique A405 versus los µmoles de p – nitrofenol en cada uno de los tubos.
EXPERIENCIA B: 1. Prepare un tubo que contenga 2.0 mL de amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M, pH 5.0 y 2.0 mL de sustrato NPP 2.5 mM. 2. A continuación, preincube el tubo en un baño termoregulado a 37°C por un par de minutos y luego agregue 1.0 mL de la dilución de la enzima (1:20). 3. Mezcle e inmediatamente saque una alícuota de 0.5 mL adiciónelo a un tubo que contenga 5.5 mL de una solución de NaOH 0.1 M. (tiempo cero) 4. En paralelo prepare otros tubos que contengan la misma mezcla de reacción que el tiempo cero, agregue 1.0 mL de 27 enzima e incube respectivamente 15 y 30 min. 5. luego saque una alícuota de 0.5 mL de cada uno de los tubos y adiciónela a los tubos que contengan 5.5 mL de NaOH 0.1 M. 6. Finalmente determine la absorbancia (405nm) de cada uno de los tubos utilizando como blanco el tiempo cero.
B. PROPIEDADES CINÉTICAS DE LA FOSFATASA ÁCIDA DEL GERMEN DE TRIGO EXPERIENCIA C: 1. Prepare una serie de tubos que contengan: 0.0 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL de sustrato NPP 2.5mM. 2. Agregue 2.0 mL del amortiguador citrato de sodio 0.1 M pH 5.0 a cada tubo y enrase con agua destilada a 4.5 mL final. 3. Preincube los tubos a 37 ºC por 2 minutos y adicione 0.5 mL de la solución de enzima. 4. Mezcle bien e incube 15 minutos a 37 ºC en un baño termoregulado. 5. Luego detenga la reacción en cada tubo, sacando una alícuota de 0,5 mL y adiciónela a otro tubo que contenga 5,5 mL de NaOH 0.1 M. 6. Luego detenga la reacción en cada tubo, sacando una alícuota de 0,5 mL y adiciónela a otro tubo que contenga 5,5 mL de NaOH 0.1 M.
