Fosfatasa Fosfa tasa Acida
Las fosfatasas ácidas (FA) son enzimas hidrolíticas, de localización lisosómica, pertenecientes al grupo de las fosfomonoesterasas, que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico Pertenece a la clase de las hidrolasas teniendo se pH óptimo en 4,5 -6.Se puede detectar sola la isoenzima prostatica de la fosfatasa ácida total. Para distinguir la ACP prostática de las otras isoenzimas se utilizan inhibidores: el tartrato.
Las fosfatasas ácidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas las cantidades de estas enzimas en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Las distintas isoenzimas se diferencian entre sí por su pH óptimo, peso molecular, y requerimientos de activadores e inhibidores. La fosfatasa ácida prostática (FAcP) constituye un valioso
auxiliar en el diagnóstico precoz de cáncer prostático, una de las formas neoplásicas de mayor morbilidad. La determinación cinética de FAcP usando α-naftil fosfato como sustrato ha mostrado sensibilidad y especificidad comparables a las técnicas radioinmunológicas, con similar poder discriminatorio y evidentes ventajas de orden práctico. FUNDAMENTOS DEL METODO (E.C.3.1.3.2.) hidroliza el α-naftil fosfato a pH 5,2 La FAcP (E.C.3.1.3.2.) con liberación de fosfato y α -naftol. El naftol reacciona a
su vez con un diazorreactivo presente en el sistema 4clorotolueno1,5-diazo α-naftaléndisulfonato (4-CTD) produciendo un pigmento amarillo, de modo que el aumento de la absorbancia leído a 405 nm es proporcional a la actividad fosfatásica de la muestra. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: comprimidos conteniendo cada uno 6 umol de α-naftil fosfato (NF) y 2 umol de 4-CTD.
B. Reactivo B: buffer citrato 0,1 mol/l con 14 mmol/l de activador (1,5-pentanodiol + butanol). Concentraciones finales NF ......................................................................... 3 mmol/l 4-CTD.................................................................... 1 mmol/l buffer citrato ............................................... 0,1 mol/l, pH 5,2 INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A; preparación: para cada determinación disolver un comprimido de Reactivo A en 2 ml de Reactivo B, agitando suavemente hasta lograr disolución completa. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de
acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. La exposición prolongada a temperatura ambiente puede deteriorar el Reactivo A. Reactivo A reconstituido: estable 24 horas refrigerado (210oC) o 12 horas a temperatura ambiente. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Lecturas a 405 nm del Reactivo A reconstituido mayores de 0,250 D.O. leídas contra agua, son indicio de deterioro de los reactivos. En tal caso desechar. MUESTRA Suero a) Recolección: obtener suero libre de hemólisis. No utilizar
plasma. La fosfatasa ácida prostática es sumamente inestable “in vitro” y al pH del suero a temperatura ambiente
puede perderse hasta un 50% de actividad en pocas horas. Por lo tanto debe separarse el suero del coágulo dentro de una hora de la extracción, conservándolo refrigerado hasta el momento de usar. b) Aditivos: para evitar la inactivación durante el almacenamiento puede acidificarse la muestra agregando 20 ul de buffer acetato, 5 M, pH 5 por cada ml de suero. Este conservador se prepara agregando hidróxido de sodio concentrado a 29 ml de ácido acético glacial p.a. hasta obtener pH 5 completando a 100 ml con agua destilada. c) Sustancias interferentes conocidas:
- sueros con intensa ictericia muestran baja recuperación de la actividad enzimática por lo que su uso debe evitarse. - no usar sueros con hemólisis visibles. - los anticoagulantes interfieren en la reacción por lo que no debe emplearse plasma en la determinación. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si se emplea el conservador descripto en b) la muestra puede conservarse refrigerada (2-10oC) durante varios días sin pérdida significativa de la actividad. De no utilizarse este conservador la muestra deberá procesarse inmediatamente. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotómetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
- Cronómetro. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 405 nm - Temperatura de reacción: 25, 30 ó 37oC. - Tiempo de reacción: 4-5 minutos - Volumen de muestra: 200 ul - Volumen final de reacción: 2,2 ml PROCEDIMIENTO En una cubeta mantenida a la temperatura seleccionada colocar: Reactivo A reconstituido 2 ml Preincubar unos minutos. Luego agregar: Muestra 200 ul Disparar simultáneamente un cronómetro. A los 4 minutos registrar la D.O. Leer posteriormente la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/minuto (ΔA/min) restando cada lectura
de la anterior y promediando los valores. Utilizar este
promedio para los cálculos. CALCULO DE LOS RESULTADOS Fosfatasa ácida prostática (U/l) = ΔA/min x 853
(405 nm; relación muestra/sustrato 1:10) VALORES DE REFERENCIA La actividad de FAcP es muy escasa en el hombre sano y casi nula en la mujer, de modo que los valores esperados se encuentran en el límite del error instrumental o muy cercanos al límite de detección del sistema. No obstante se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Temperatura 25oC 30oC 37oC FAcP (U/l) 0 - 2,6 0 - 3,0 0 - 3,5 Debe sospecharse la presencia de cáncer prostático toda vez que los valores superen en un 60% al valor superior normal. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
- Es sabido que las enzimas son sensibles a la acción de ciertos contaminantes y venenos enzimáticos (metales pesados, cianuros, tensioactivos, etc.) por lo que se recomienda extremar las precauciones en la limpieza del material empleado en la extracción de muestras y en la determinación. - Los comprimidos (Reactivo A) pueden presentar color rosado, o pequeñas manchas en su superficie que no alteran su reactividad. - Alteraciones iatrogénicas: existen algunos medicamentos que pueden afectar los valores plasmáticos de FAcP, igual que el masaje, cateterismo y otras manipulaciones prostá
La insuficiencia de Fosfatasa acida que puede causar? tengo que poner que ocurre cuando hay insuficiencia de las siguientes enzimas: - fosfatasa acida. - fibrinolisina. - transglutaminasa
ANLISIS ENZIMATICO: “FOSFATASA ÁCIDA “ Introducción Las enzimas son las proteínas de mayor especialización y poseen un elevado poder catalítico, superior al de los catalizadores inorgánicos. Funcionan en soluciones acuosas en condiciones suaves de temperatura y pH. Con excepción de un pequeño número grupo de moléculas de RNA catalítico, todas las enzimas son proteínas y su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica. Las enzimas se clasifican según las reacciones que catalizan distribuyéndose en seis clases principalmente, cada una de ellas con diferentes subclases, según la reacción catalizada, encontrándose las oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. La principal función de las enzimas es aumentar la velocidad de
la reacción; esto lo consiguen disminuyendo la energía de activación, pero no modifican los equilibrios de la reacción. Los incrementos selectivos de la velocidad de reacción se explican por la reordenación de los enlaces covalentes durante la reacción, estas interacciones enzima-sustrato disminuyen la energía de activación, acelerando por ende la velocidad de la reacción. Por otro lado la energía que proporciona un descenso de la energía de activación proviene de las interacciones débiles entre el sustrato y la enzima; al establecerse las interacciones débiles en el complejo enzima sustrato, en el estado de transición, se liberan pequeñas cantidades de energía, la cual es utilizada para disminuir la energía de activación; esta energía es llamada energía de fijación, y además de aportar la energía para el proceso catalítico, es la que le confiere especificidad a cada enzima por su sustrato. El conocimiento de la cinética de las reacciones enzimáticas ayuda a comprender los fenómenos biológicos y a precisar las condiciones adecuadas de actividad enzimática para definir sus unidades y establecer comparaciones.
ANTECEDENTES
Fosfatasa ácida (AcP) es el nombre dado a todas las fosfatasas que tienen actividad óptima por debajo de un
pH de 7.0. La presencia de fosfatasa ácida en suero proviene de varias fuentes que incluyen: los riñones, el hígado, el bazo, los eritrocitos, las plaquetas y la glándula prostática. Cada uno de éstos contribuye con isoenzimas de fosfatasa ácida que son específicas del órgano o células de origen. La fosfatasa ácida prostática es la de mayor interés clínico ya que pueden encontrarse concentraciones séricas elevadas de esta enzima en pacientes que padecen carcinoma prostático con metástasis. La fosfatasa ácida prostática puede diferenciarse de las otras fosfatasas ácidas mediante la adición de L-tartrato. De los muchos métodos propuestos para determinar la fosfatasa ácida, el más aceptado es el método de Hillman (1), en el cual hay una reacción de acoplamiento del α-naftilfosfato con el rojo de TR de adherencia rápida. El procedimiento de DCL para la determinación de la fosfatasa ácida se basa en este método, utilizando L-tartrato como inhibidor específico de la fracción prostática. PRINCIPIO
AcP α -naftilfosfato + H2O ——→ α-Naftol + PO4 2α-Naftol + Rojo de TR de adherencia rápida ——— → Colorante diazoico
La fosfatasa ácida hidroliza al α-naftilfosfato, formando α-naftol, el cual reacciona inmediatamente con el rojo de TR de adherencia rápida, produciendo un colorante que se absorbe a 405 nm. El índice de incremento en absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad de la fosfatasa ácida. Si se agrega L-tartrato al reactivo, la fosfatasa ácida prostática se inhibe, pero todas las demás fosfatasas ácidas en el suero reaccionan. Por tanto, la prueba se realiza tanto en presencia como en ausencia del L-tartrato. La diferencia en la actividad entre los dos análisis es igual a la actividad de la fosfatasa ácida prostática en el suero
FOSFATASA ACIDA 3.13.2 Sinonimia: SAP, Fosfatasa Acida prostática (ACP/PAP), FAc, ACP, ortofosforico-monoester-fosfo-hidrolasa
Método: Espectrofotometría Cinético a 405 nm - Método de Hillmann (Sustrato: alfa-naftilfosfato de sodio)
Método de roy modificado La isoenzima prostática de la fosfatasa ácida del suero, hidroliza específicamente almonofosfato de timolftaleína a pH ácido, liberando la timolftaleina y al ion fosfato, laadición de un ácido de un álcali paraliza la reacción enzimática y convierte a latimolftaleína liberada en su forma azul, la cual es medida en forma calorimétrica.
INMUNOLÓGICOS Análisis inmunoenzimaticos para determinar la FAP en suero o plasma:Se basa de la disponibilidad de anticuerpos específicos utilizados para la determinación deFAP en forma más precisa y específica que la lograda con los métodos colorimétricos.Fase sólida basada en el principio de la técnica de sándwich
Muestra:
Suero Oxalato y heparina inhiben la actividad de ACP.Hemólisis interfiere aumentando los valores.Debido a la liberación de ACP de las plaquetas en la formación del coágulo, losvalores en suero son ligeramente mayores. Recolección y estabilidad :Después de la venopunción la muestra de sangre se llena en un recipiente con hieloSi no se separa y se mantiene contacto con el coagulo aumenta + FAC
La prueba de la fosfatasa acida se usa principalmente para vigilar las concentraciones de lafosfatasa acida en el suero de varones que han sido diagnosticados con cáncer prostático y para vigilar cuando se encuentran en tratamiento, para evaluar la respuesta ala terapéutica.Este análisis bioquímica produce un valor de fosfatasa acida estimando mas que unamedición directa.El valor es determinado por al cantidad de cambios que se producen en uan medicionespecifica del sustrato (sustancia que puede cambiarse por al acción de la enzima).
Fosfatasa ácida prostática Definición
Es un examen de sangre que se utiliza para medir la fosfatasa ácida prostática (unaenzimaque se encuentra principalmente en los hombres en la glándula prostática y en elsemen) con el fin de determinar la salud de la glándula prostática. La disfunciónprostática ocasiona la liberación de fosfatasa ácida (FA) en el torrente sanguíneo. Nombres alternativos Prueba de fosfatasa ácida prostática masculina; prueba fosfatasa ácida prostática;fosfatasa ácida en suero Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte anterior del codo o del dorso dela mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca una bandaelástica alrededor del brazo con el fin de ejercer presión y restringir el flujo sanguíneo
através de la vena. Esto hace que las venas bajo la banda se llenen de sangre.Se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o en unajeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulación y,una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se presiona moderadamentesobre el sitio de punción para detener cualquier sangrado. Preparación para el examen Este examen generalmente no requiere preparación especial. Como en cualquier otroexamen sanguíneo, el médico puede limitar ciertos alimentos o medicamentos pocotiempo antes de realizar el examen para asegurar una muestra confiable.Los medicamentos que pueden interferir con las mediciones de FA son, entre otros:fluoruros, oxalatos, clofibratos y alcohol. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sienten sólo un pinchazo o sensación
punzante.Posteriormente, hay una sensación pulsátil en el área. Razones por las que se realiza el examen Este examen se realiza con mayor frecuencia para determinar si el paciente tiene cáncer de próstata, una anomalía de la glándula prostática, o para hacer un seguimiento de larespuesta del cáncer prostático al tratamiento.Esta prueba ya no se utiliza de manera rutinaria. La disponibilidad del ensayo PSA mássensible y más específico ha reemplazado ampliamente el uso clínico de la prueba FA
