UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
INFORME N°4 ENZIMOLOGIA II: DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA DE GÉRMEN DE TRIGO
CURSO INTEGRANTES
: Bioquímica : Darío Calbul Mauricio Gutiérrez PROFESORA : Alejandra Saavedra AYUDANTE : Catalina Rodríguez SECCI N : L1 FECHA DE EXPERIENCIA : 20 de noviembre de 2017 FECHA DE ENTREGA : 27 de noviembre de 2017
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima sustrato (E-S), el cual se descompone para dar el producto (P) y la enzima libre (1). Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque, aunque aumente la concentración de sustrato, la velocidad no aumenta linealmente, apareciendo un efecto de saturación, el que ocurre cuando todos los sitios activos de la enzima están ocupados por sustrato. Si se representa la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato se obtiene una hipérbola rectangular cuya expresión matemática se conoce como ecuación de Michaelis – Menten (2). La expresión matemática viene dada según:
V = VKmáx + ∙ [[SS]]
Donde:
V Vmáx K [S]
(1.1)
: Velocidad total. : Velocidad máxima de reacción. : Constante de Michaelis – Menten. : Concentración de sustrato.
La ecuación de Michaelis – Menten puede linealizarse y graficarse por medio de los dobles recíprocos, llamado Lineweaver – Burk (3):
1 = K + 1 V Vmáx ∙ [S] Vmáx
(1.2)
En el práctico se determinarán estos parámetros para la enzima Fosfatasa ácida de trigo, sin inhibir y con inhibición.
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2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 2.1. Constr ucción Curva de Calibr ación de p-nitr ofenol Se prepararon 6 tubos para la construcción de la curva de calibración, los cuales contenían: Tabla 2.1: Volúmenes de solución para cada tubo Tubo 1 2 3 4 5 6 p-NP 60 [mL] 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 NaOH 0,5 M [mL] 4,0 3,5 2,0 2,0 1,0 0,0 Posteriormente, se homogenizó y leyó la absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 405 nm. Para finalizar, se graficaron los puntos obtenidos de absorbancia y concentración de p-nitrofenol, determinando la ecuación de la recta. 2.2. Determinación de parámetros cinéticos de fosfatasa ácida de germen de trigo y efecto d el fosfato en la reacción Se prepararon 10 tubos que contenían: Tabla 2.2: Volúmenes de solución para cada tubo Tubo
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p-NPP 2,5 mM [mL]
0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0
Buffer pH 5 [mL]
1,5 1,25 1,0 0,75 0,5 2,0 1,75 1,5 1,25 1,0
KH2PO4 10 mM [mL]
0,5 0,50 0,5 0,50 0,5 0,5 0,00 0,0 0,00 0,0
El set de tubos se incubó a 37°C por 5 minutos, para posteriormente agregar 0,5 [mL] de enzima a cada uno y nuevamente incubar a la misma temperatura, pero por 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se agregó una alícuota de 0,5 [mL] a cada tubo de NaOH 0,05 M preparado con anterioridad. Finalmente, se midió la absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 405 nm.
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3. RESULTADOS 3.1.
Curva de Calibración Tabla 3.1: Concentración de p-nitrofenol en solución y su absorbancia a 405 nm Tubo Concentración pNP [M] Absorbancia 1 0,0000 0 2 0,1540 7,50∙10− 3 0,3580 1,50∙10− 4 0,5600 3,00∙10− 5 0,7880 4,50∙10− 6 0,9550 6,00∙10− 1 0,8 a i c 0,6 n a b r o s b 0,4 A
0,2 0 0,0E+00
1,0E-05
2,0E-05
3,0E-05
4,0E-05
5,0E-05
6,0E-05
pNP [M]
Figura 3.1: Curva de Calibración de p-nitrofenol Tabla 3.2: Ajuste lineal para figura 3.1 Ecuación A = 15791∙ C + 0,0 547 2 0,9830 Coeficiente r 3.2.
Parámetros Cinéticos Fosfatasa Ácida de Germen de Trigo y efecto en la reacción Tabla 3.3: Absorbancia a 405 nm de p-NPP en solución y su concentración Absorbancia Concentraci ón [µM] 0,000 0,00 2,99 0,102 0,330 1,74∙10 0,342 1,82∙10 0,418 2,30∙10
3
a) Presencia de Fosfato 8000 7000 6000 ] 5000 M m4000 / 1 [ ] 3000 S [ / 1 2000
1000 0 0
500
1000
1500
2000
1/Vo [min/umol)
2500
3000
3500
4000
Figura 3.2: Gráfica de Linewever-Burk Tabla 3.3: Ajuste lineal para figura 2.2
1 = 2,0313 ∙ 1 +601,78 [S] V
Ecuación Coeficiente r 2
0,9385
Gracias a la ecuación obtenida en la tabla 3.2, es posible obtener: Tabla 3.4: Parámetros Cinéticos K m []
2,8674∙10−
Vmáx
5,6590∙10−
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b) Ausenci a de Fosfato 3500 3000 ] 1
2500
-
M 2000 μ [ ] S 1500 [ / 1
1000 500 0 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
1/Vo [min/μmol]
Figura 3.3: Gráfica de Linewever-Burk Tabla 3.5: Ajuste lineal para figura 2.3
1 = 0,5913 ∙ 1 +1210,8 [S] V
Ecuación Coeficiente r 2
0,9782
Gracias a la ecuación obtenida en la tabla 3.5, es posible obtener: Tabla 3.6: Parámetros Cinéticos K m []
4,8836∙10−
Vmáx
8,2590∙10−
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4. DISCUSIÓN 4.1. Parámetros en cinéticos en presencia y ausencia de fosfato Se observa en las tablas 3.4 y 3.6 que el parámetro cinético Vmáx es mayor en ausencia de fosfato. Podemos deducir a priori que la presencia de fosfato ayuda que se reduzca la velocidad de reacción. Por otra parte, la constante de Michaelis – Menten es menor en ausencia de fosfato, esto indica que existe una mayor afinidad de la enzima con el sustrato y, por consiguiente, se esperaría una mayor velocidad de reacción, lo que se corrobora con las tablas 3.4 y 3.6, mencionadas anteriormente. Desde el punto de vista de la saturación, la constante de Michaelis – Menten nos permite deducir que existe una rápida saturación en ausencia de fosfato, esto quiere decir que la concentración de sustrato para que la enzima presente una saturación será menor en comparación a la presencia de fosfato. Si analizamos la inhibición que presenta la enzima es competitiva, en el que el fosfato y sustrato compiten por el sitio de unión enzimático, lo que se ve contrarrestado solo si la concentración de sustrato aumenta. Si observamos las tablas 3.4 y 3.6 la velocidad máxima no varía significativamente, mientras que la K presenta variaciones notorias, características propias de una inhibición competitiva.
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5. CONCLUSIÓN 5.1. En presencia de fosfato se obtiene un K = 2,8674 ∙ 10− [μM] y un Vmáx = , mientras que en ausencia de fosfato se obtiene un K = 4,8836 ∙ 5,6590∙10− min
. 10−[μM] y un Vmáx = 8,2590 ∙ 10− min
5.2. Se observa que la presencia de fosfato inhibe la actividad enzimática de la fosfatasa ácida. Se presenta una inhibición del tipo competitiva, en el cual tanto el inhibidor como el sustrato actúan compitiendo por el sitio de unión activo de la enzima.
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6. REFERENCIAS (1)
de Pablo de Olavide. [Línea]. . Visitado el día 25 de noviembre de 2017. “Cinética
Enzimática”.
Universidad
(2) Huerta, S. “Reacciones enzimáticas”. Universidad Autónoma Metropolitana. [Línea]. . Visitado el día 25 de noviembre de 2017. (3)
Universidad Nacional Autónoma de México. [Línea]. . Visitado el día 25 de noviembre de 2017. Rivera E. “Cinética Enzimática”.
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