GUIA DE LABORATORIOS ����������
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 1. OBJETIVOS 1.1.
Reconocer la importancia de las enzimas como catalizadores de reacciones químicas.
1.2.
Comparar los tiempos de coagulación en muestras de leche preparadas bajo diferentes tratamientos.
1.3.
Evidenciar actividad proteolítica entre la enzima renina y la proteína de la leche (caseína), mediante la determinación de la fuerza de cuajo.
2. INTRODUCCIÓN Las reacciones químicas se realizan en los seres vivos a gran velocidad, en condiciones muy moderadas de temperatura, pH, presión, etc., gracias a la existencia de catalizadores denominados enzimas. enzimas. Las enzimas se caracterizan por su notable eficiencia y su extraordinaria especificidad. La gran mayoría de las enzimas son proteínas, también existe ARN con actividad catalítica (ribozimas). Algunas enzimas son proteínas simples y otras, proteínas conjugadas asociadas con otra molécula no proteica, de pequeño tamaño, la coenzima o cofactor. En función de su naturaleza se denominan:
1.
Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas. (Cofactores).
Algunos cofactores entran a formar parte del sitio activo y son integrantes de la proteína enzima (metaloproteínas); otros al parecer, establecen un enlace entre la enzima y el sustrato.
2.
Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Aquí se puede puede señalar, que
muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente realm ente las deficiencias producidas Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
1
GUIA DE LABORATORIOS ����������
por la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar una determinada enzima en el que la vitamina es la coenzima.
3. MARCO TEÓRICO Características de la acción enzimática La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: 1. Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica. 2. Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por una enzima específica. La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.
Factores que regulan la cinética enzimática 1.
Efecto del pH. Al comprobar experimentalmente la influencia del pH en la
velocidad de las reacciones enzimáticas se obtienen curvas que indican que las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras: •
El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH.
•
La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede provocar modificaciones en la conformación de la enzima.
•
El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.
Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago, presenta un pH óptimo de 2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH óptimo de 12.
Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
2
GUIA DE LABORATORIOS ����������
2.
La temperatura. Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de
actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rígidas" y cuando se supera un valor considerable (mayor de 50) la actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.
3.
La concentración de enzima: Existe una relación lineal entre la velocidad de la
reacción y la concentración de la enzima.
4. La concentración de sustrato: Para una determinada cantidad de enzima, la velocidad de la reacción aumenta al aumentar la concentración de sustrato. Al principio esta relación es casi lineal, pero luego la curva de la reacción asume una forma hiperbólica, se alcanza una meseta en la cual la velocidad es constante, esto ocurre a concentraciones de sustrato tales que posteriores incrementos no afectan la velocidad aparente. Aquí todas las moléculas de enzima están saturadas de sustrato y por lo tanto existe el complejo [ES].
El sustrato se une a la enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar específico, el centro activo. Este centro es una pequeña porción de la enzima, constituida por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. (Mecanismo de acción).
Renina El cuajo natural, llamado renina, es una enzima proteolítica segregada por la mucosa gástrica del cuarto estómago (cuajar) de los terneros, cabritos y corderos antes del destete. Esta secreción se produce en forma de un precursor inactivo, la pro-renina, que en medio neutro no tiene actividad enzimática pero que en medio ácido se transforma rápidamente en renina activa. El cuajo contiene dos enzimas: la quimiosina, que es el componente principal y la pepsina. Después del destete, disminuye la producción de quimiosina y la pepsina pasa a ser el componente mayoritario. Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
3
GUIA DE LABORATORIOS ����������
El cuajo se extrae de los cuajares manteniéndolos a remojo en salmuera. Para el uso comercial, se preparan soluciones purificadas de fuerza estandarizada en las que se ajusta el pH, la sal y el color y a las que se añade agentes conservantes.
La actividad proteolítica del cuajo se ejerce sobre la caseína, principalmente, y otras proteínas. Por lo tanto realiza dos acciones fundamentales. La primera acción es la de provocar la desestabilización de las micelas de caseína rompiendo las caseína k en un punto determinado de su molécula: el enlace peptídico entre el aminoácido fenilalanina y su vecino, que es una metionina. Generalmente la fuerza del cuajo se mide por la eficacia al romper este enlace, acción que produce la coagulación de la leche. En la caseína k hay unos 164 enlaces peptídicos que pueden ser atacados, además de los que hay en las otras fracciones de las micelas. El segundo papel del cuajo es el de hidrolizar estos enlaces siguiendo un orden específico que es característico de la enzima empleada. Esta acción secundaria sobre las proteínas comienza lentamente después de la coagulación y continúa durante la maduración del queso. Esta acción, junto con la de las proteasas nativas de la leche, las proteasas de la flora original y las del fermento, contribuye al desarrollo de algunas de las características de textura y sabor del queso.
Evidencia de actividad enzimática: coagulación de la leche La coagulación ácida o láctica suele ser utilizada para la elaboración de quesos frescos mientras que la enzimática es la empleada de forma mayoritaria en quesos madurados. Los coagulantes enzimáticos utilizados, conocidos comúnmente como cuajos, son proteasas ácidas que tienen su pH óptimo de actuación en la zona ácida y presentan un origen variado: animal, vegetal o microbiano. La fuerza del cuajo se expresa como una relación entre una unidad de peso y/o de volumen del cuajo capaz de coagular un número de unidades correspondientes de leche en unas condiciones definidas de
Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
4
GUIA DE LABORATORIOS ����������
temperatura y de tiempo; siendo estas condiciones consideradas en la presente práctica. Un método ampliamente usado para determinar la actividad enzimática en el proceso de coagulación de la leche es el método de Berridge ( Rhone Poulenc Colombia Ltda.,1997) y las modificaciones sugeridas por Rand y Ernstrom (Ernstrom, 1958; Rand et al, 1964). Consiste en tomar el tiempo que tarda en coagular una muestra de 5.0 ml de leche, 0.01 M
en cloruro de calcio, al adicionarle 0.5 ml de extracto
enzimático. Esta determinación se logra haciendo rotar las muestras en un baño María a una temperatura de 37ºC, a una velocidad de aproximadamente 25 rpm. La lectura del tiempo de coagulación se hace justo cuando el aspecto de la película interna del frasco con la muestra, cambia de fluido laminar a viscoso y se ve como esta se rompe en pequeños cuajos.
Fuerza de cuajo Se define como la cantidad de leche en mililitros a 37ºC que es cuajada, por un gramo o mililitro de cuajo en 40 minutos. Este es un parámetro muy importante porque es un indicativo del potencial coagulante de la enzima y se calcula mediante la siguiente ecuación (Keating, 1986):
F
=
L × 2400 t
Dónde: L: cantidad de leche, ml. 2400: Tiempo en que normalmente cuaja la leche a 37ºC con un cuajo estándar, s. t: Tiempo de coagulación de la muestra, s.
4. EQUIPO Baño maría 1 vidrio de reloj Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
5
GUIA DE LABORATORIOS ����������
Gradillas Tubos de ensayo largos con tapa 1 beaker de 500 mL 4 balones volumétricos de 100 mL 1 Embudo de vidrio. 1 Pipeta graduada de 5 mL 1 Pipetas graduadas de 10 mL 2 balones volumétricos de 10 mL Pipetas Pasteur Agitadores Cronómetro
5. REACTIVOS Agua destilada Renina comercial Leche Cloruro de calcio
6. PROCEDIMIENTO 1. Realizar los cálculos para preparar 100 mL de solución enzimática 0,2 % en peso y 100 mL de leche al 0,01 M en cloruro de calcio. 2. Realizar los cálculos para preparar las siguientes diluciones: •
100 ml de solución enzimática 0,1 % en peso
•
100 ml se solución enzimática 0,05 % en peso
•
100 ml de solución enzimática 0,02 % en peso
•
100 ml de solución enzimática 0,01 % en peso
3. Determinación de la actividad enzimática: a. Monte un baño María a una temperatura de 37 C. Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
6
GUIA DE LABORATORIOS ����������
b. Tome 5 tubos de ensayo largos y márquelos. c. Adicione a cada uno, una muestra de 5,0 ml de leche, 0,01 M en cloruro de calcio. d. Adicione en el primer tubo, 0,5 mL de solución enzimática al 0,2%. e. Inmediatamente sumerja el tubo horizontalmente (inicie el cronómetro) y comience a hacerlos rotar a una velocidad de aproximadamente 25 rpm. f.
Inmediatamente el aspecto de la película interna del frasco con la muestra, cambie de fluido laminar a viscoso y se vea como ésta se rompe en pequeños cuajos. Detenga el cronómetro y tome este tiempo.
g. Repita los pasos d. hasta f. para los tubos restantes, pero agregando 0,5 mL de las diluciones enzimáticas restantes que tiene preparadas adiferentes concentraciones.
7. DATOS Tabla 1. Cantidades para la solución madre y la adecuación de la leche Peso enzima (g)
Volumen agua (mL)
Concentración (%p/p)
Peso cloruro de calcio (g)
Volumen de leche (mL)
Concentración (M)
Tabla 2. Cantidades para la preparación de las diluciones Concentración dilución (%p/p)
Volumen solución madre (mL)
Volumen de agua (mL)
Volumen final
8. CÁLCULOS Determine la fuerza de cuajo para cada una de las muestras
9. PREGUNTAS 1. Explique cuáles son los principales factores que afectan a la actividad enzimática. 2. ¿Qué es un inhibidor y de cuántos tipos puede ser la acción que realizan? Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
7
GUIA DE LABORATORIOS ����������
3. ¿Cuál es la diferencia entre cofactor y coenzima. 4. ¿Cómo se define la velocidad de un proceso enzimático? ¿Qué efecto tiene sobre ella la cantidad de sustrato presente en el medio de reacción? 5. Cite tres propiedades por las que podamos considerar a los enzimas como catalizadores. ¿Qué es el centro activo?
10. INFORME El informe debe realizarse en formato tipo artículo, de acuerdo a la plantilla anexa.
Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar
8
