LABORATORIO DE DETERMINACIÓN DE UREA Y ÁCIDO ÚRICO Por: Catalina Marín Echeverri, Daniel Marín, Andrés Augusto Arias. Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Proyecto Curricular Química Clínica. Marzo de 2014.
Objetivos:
Reconocer la importancia clínica de la determinación de urea y ácido úrico. Describir las condiciones preanalíticas necesarias para la determinación de urea y á cido úrico. Identificar los métodos utilizados para la determinación de urea y ácido úrico. Determinar mediante espectofotometría concentración de urea y ácido úrico en el suero de muestras previamente analizadas en el Laboratorio de la Clínica León XIII. Analizar la utilidad diagnóstica de la determinación de urea y ácido úrico.
Materiales: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 14.
Bata Guantes desechables no estériles. Kit de Reactivos de Urea y ácido úrico. Sueros controles. Sueros calibradores. Muestra problema. Gradilla.
8. 9. 10. 11. 12. 13.
Tubos de ensayo. Micropipetas. Espectrofotómetro. Centrífuga. Cronómetro. Baño María.
Introducción: Una de las principales principales funciones del riñón consiste consiste en la eliminación eliminación de los productos nitrogenados del catabolismo proteico y de ácidos nucleicos: urea, creatinina, creatina y ácido
úrico. En presencia de un trastorno de la función renal se produce la disminución de la capacidad de excreción de estos compuestos nitrogenados no proteicos (CNNP), la retención de estas sustancias en plasma (azoemia) y la aparición del síndrome urémico. El número de nefronas filtrantes debe reducirse en por lo menos un tercio de su capacidad normal para que estos compuestos tóxicos comiencen a elevarse en sangre, lo que se corresponde aproximadamente con una filtración glomerular menor de 40 mL/min. Por lo anterior la determinación de los CNNP se ha usado históricamente para determinar la función renal (Dvorkin, Cardinali et al. 2010). En la presente práctica determinaremos la concentración en los niveles en sangre de los compuestos Urea y Acido Úrico. A continuación describiremos brevemente estos analitos.
Urea La Urea [CO(NH2)2] es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y representa aproximadamente el 45% del nitrógeno no proteico total en sangre. Este analito, se genera a partir del amonio por acción de varias enzimas hepáticas que participan en el ciclo de la urea y posteriormente es transportado por vía sanguínea hacia los riñones donde es filtrado en el glomérulo. Aproximadamente el 90% de la urea es excretada en la orina, aunque un poco es reabsorbida por difusión pasiva en los túbulos renales. El otro 10% se excreta en el tracto digestivo y por la piel. Aplicación clínica: la determinación de la urea en sangre se usa para evaluar la función renal, el estado de hidratación, determinar el balance de nitrógeno corporal, ayudar en el diagnóstico de la enfermedad renal y para verificar la eficacia de la diálisis en pacientes dializados (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011). La concentración de Urea en sangre es determinada en la forma de nitrógeno ureico sanguíneo o BUN (del ingles blood urea nitrogen). La concentración de urea en plasma está determinada por la función renal y la perfusión, el contenido de proteínas en la dieta y la tasa de catabolismo proteico (Bishop, Fody et al. 2010).
Ácido úrico: El acido úrico es el producto final del catabolismo de las purinas en un proceso que se realiza principalmente en el hígado. El acido úrico es transportado desde el hígado a el riñón donde es filtrado por el glomérulo y se reabsorbe en túbulos proximales y pequeñas cantidades son excretadas por los túbulos distales a la orina. La excreción se realiza alrededor del 70% por la orina y el resto se da por vía gastrointestinal (Bishop, Fody et al. 2010). Casi todo el acido úrico del plasma se encuentra en forma de urato monosódico y a pH del plasma (pH 7.3-7.4) este urato es relativamente insoluble. En concentraciones superiores a 6,8 mg/dL, el ácido úrico se encuentra saturado en el plasma, convirtiéndose en un analito potencialmente peligroso debido a que puede formar cristales de urato; estos cristales pueden precipitarse en los tejidos y articulaciones produciendo una enfermedad inflamatoria llama “gota” (Bishop, Fody et al. 2010). Aplicación clínica: la determinación de los niveles de ácido úrico se realiza para estudiar más de 20 desordenes hereditarios relacionados con el metabolismo de las purinas, para confirmar el diagnóstico de la gota y detectar daño renal. Las concentraciones mayores a 7.0 mg/dL en
hombres y 6.0 mg/dL en mujeres de denomina Hiperuricemia. Mientras que las concentraciones menores que 2.0 mg/dL se denomina Hipouricemia (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011).
Determinación de urea: Varios métodos han sido utilizados para la determinación de urea. Los métodos enzimáticos que se utilizan con más frecuencia en el laboratorio clínico son: Una gran mayoría de las mediciones de urea en el laboratorio clínico se realizan mediante métodos enzimáticos basados en la hidrólisis preliminar de urea con la Ureasa (EC 3.5.1.5) para generar iones de amonio, los cuales pueden ser cuantificados (Reacción 1). Este método fue introducido en el año 1913, por Marshall. Posteriormente, se desarrollaron varios métodos para dosificar este amoníaco liberado, entre ellos el test de indofenol de Berthelot (se añade ácido hipocloroso (HOCl) el cual induce la formación de un compuesto color azul) y la reacción de Nessler (se añade yoduro potásico el cual induce la formación de un compuesto color amarillo/anaranjado); la concentración de ambos compuestos puede ser determinada espectrofotométricamente (Ochei and Kolhatkar 2008; Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011). Reacción 1: Urea bicarbonato amónico [(NH4)2CO3] CO32- + 2NH4+
En el Test de Indofenol de Berthelot , la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea presente en la muestra, en amoniaco (NH 4+) y anhídrido carbónico (CO 2). Los iones amonio reaccionan con salicilato e hipoclorito sódico (ClONa), en presencia del catalizador nitroprusiato, para formar un indofenol verde (Ochei and Kolhatkar 2008) que puede ser cuantificable espectrofotométricamente a 600nm.
Reacción 2:
Otro método comúnmente utilizado es uno completamente enzimático creado en 1965 por Talke y Schubert, el cual acopla a la reacción de la ureasa una glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.3) y se mide la desaparición de NADH. Este método ha sido aceptado como un método de referencia (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011). En este tipo de ensayo enzimático, el amoniaco liberado es convertido en glutamato por acción de la glutamato deshidrogenasa, en presencia de NADH y -cetoglutarato. La concentración de la urea se determina midiendo la velocidad de desaparición del NADH a 340 ó 360 nm (Reacción 2) (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011).
Reacción 3: NH4+ -cetoglutarato + NADH NAD+ + ácido glutámico + H 2O
Otros métodos: Es posible la medición electroquímica de la urea por medio de la cuantificación del cambio de conductividad producido por la generación de amonio y bicarbonato tras la hidrólisis enzimática de la urea. También es posible la utilización de electrodos específicos para el amonio, empleando un soporte que contiene la enzima ureasa inmovilizada y sobre el que se hace pasar la muestra (Burtis, Ashwood et al. 2011). El método que se utilizara nuestra práctica para la determinación de urea será el de Indofenol de Berthelot .
Obtención de la muestra:
Tipo de muestras: La concentración de urea se puede medir en el plasma, suero u orina
de 24 horas.
Condiciones preanalíticas del paciente: Para las muestras de suero o plasma se
recomienda 8 horas de ayuno. Sin embargo, aunque el contenido de proteína de la dieta influye en la concentración de urea, el efecto de una sola comida que contenga proteína es mínimo y una muestra en ayuno no se requiere normalmente (Burtis, Ashwood et al. 2011).
Estabilidad y conservación de la muestra: o
o
La urea en suero y plasma es estable por 7 días a 2 –8ºC. Se recomienda la heparina como anticoagulante. La urea en orina es estable por 3 días a temperatura ambiente si el crecimiento microbiano es prevenido, de lo contrario es necesario refrigerar a 4º C (Burtis, Ashwood et al. 2011).
Interferentes: o
o o
Las concentraciones altas de citrato de sodio y fluoruro de sodio deben evitarse, ya que el citrato y el fluoruro pueden inhibir la ureasa. Una muestra hemolizada no es recomendable. La urea es susceptible a la descomposición bacteriana, por lo cual las muestras (particularmente la orina) que no pueden ser analizadas rápidamente se deben refrigerar (Burtis, Ashwood et al. 2011).
Intervalos de referencia: Nitrógeno ureico* Plasma o suero
6-20 mg/dL
Orina 24 hr
12-20 g/día
*Adaptado de (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011).
Nota: para la determinación del nitrógeno contenido en la urea se debe dividir la concentración de la urea sobre 2.14. El valor 2.14 resulta de dividir el peso molecular de la
urea (60 g/mol), sobre el peso del nitrógeno en la urea, la cual contiene dos moléculas de nitrógeno (peso molecular del nitrógeno 14 g/mol).
Interpretación de resultados: Causas de alteración de la concentración de la urea* Incremento de la concentración en sangre (BUN/Creatinina):
Prerenal: hemorragia, deshidratación, incremento del catabolismo de proteínas, aumento de proteínas en la dieta. Renal: Insuficiencia renal crónica y aguda incluyendo gromerulonefritis y nefritis tubular. Postrenal: Obstrucción del tracto urinario.
Disminución de la concentración en sangre:
Consumo bajo de proteínas, vómito, diarrea, embarazo y enfermedad hepática
*Adaptado de (Bishop, Fody et al. 2010).
Determinación de ácido úrico: El método químico clásico para la determinación de ácido úrico se basa en la reducción del ácido fosfotúngstico por el ácido úrico para formar un complejo de fosfotungstato azul. El método no es específico para ácido úrico debido a que otros agentes reductores presentes en el suero o plasma también producen un complejo de fosfotungstato azul (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011). Método uricasa: Este es el método más específico y utiliza la uricasa (urato oxidasa, EC 1.7.3.3) para catalizar la oxidación del ácido úrico a alantoína (reacción 4). El más simple de estos métodos mide la diferencia de absorción del ácido úrico y la alantoína a 293 nm. Es así como, la diferencia de absorbancia antes y después de la incubación es proporcional a la concentración de ácido úrico (Ochei and Kolhatkar 2008; Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011). Reacción 4:
En la reacción mediada por la uricasa se produce peróxido de hidrógeno a partir de ácido úrico. Posteriormente, por intermedio de una peroxidasa se genera la quinoneimina que puede medirse espectrofotométricamente en el rango visible. El procedimiento es más específico y el compuesto fenólico sulfonato de 3,5-dicloro-2-hidroxibenceno (DHBS) aumenta la sensibilidad debido al alto coeficiente de absorbancia del colorante quinoneimina producido (Reacción 5) Reacción 5:
El peróxido de hidrógeno formado por la acción de la uricasa sobre el ácido úrico ocasiona un acoplamiento oxidativo de DHBS y 4-aminoantipirina, en presencia de peroxidasa, formando el complejo rojo quinoneimina (Reacción 4). La intensidad del color producido es directamente proporcional a la concentración de ácido úrico en la muestra, con una absorbancia máxima a 520 nm (Burtis, Ashwood et al. 2011).
Obtención de la muestra:
Tipo de muestra: suero, plasma con heparina ó EDTA, orina. Condiciones preanalíticas del paciente: para las muestras de suero o plasma se recomienda 8 horas de ayuno. Sin embargo, aunque la dieta puede afectar a la concentración de ácido úrico, una comida reciente no tiene ningún efecto significativo y una muestra de ayuno es innecesario (Bishop, Fody et al. 2010). Estabilidad y conservación de la muestra: El ácido úrico en orina es estable 4 días a temperatura ambiente si se ajusta el o pH a > 8 con NaOH. No refrigerar. El ácido úrico en suero o plasma es estable 7 días a 2-8ºC. o El suero debe separarse de las células lo más rápidamente posible para evitar o la dilución por el contenido intracelular (Bishop, Fody et al. 2010). Interferentes: La lipemia debe ser evitada. o La alta concentración de bilirrubina puede disminuir falsamente los resultados o obtenidos por los métodos de peroxidasa. La hemólisis significativa, con la concomitante liberación de glutatión, puede o dar lugar a valores bajos. Los medicamentos como los salicilatos y las tiazidas han demostrado o aumentar los valores de ácido úrico. El ácido úrico es estable en el plasma o suero después de los glóbulos rojos se o han eliminado.
Intervalos de referencia Ácido úrico (Método uricasa) * Plasma o Suero
Orina
Hombres adultos
3.5-7.2 mg/dL
Mujeres adultas
2.6-6.0 mg/dL
Adultos
250-750 mg/día
*Adaptado de (Bishop, Fody et al. 2010; Burtis, Ashwood et al. 2011). Interpretación de los resultados CAUSAS DE ALTERACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ÁCIDO ÚRICO EN SANGRE*
Incremento de la concentración:
o o o o o o o
o o
Deficiencias enzimáticas. Acidosis láctica. Hemolisis y procesos proliferativos. Enfermedad renal crónica. Tratamiento de enfermedad mielo-proliferativa con drogas citotóxicas. Toxemia del embarazo. Dieta rica en purinas (carnes rojas, vísceras de animales, embutidos, mariscos, frutos secos). Incremento tisular del catabolismo. Intolerancia a la fructosa.
Disminución de la concentración: o o o o o
Enfermedad hepática. Dietas baja en purinas (proteínas). Deficiencia de reabsorción tubular (Síndrome de Fanconi). Quimioterapia con azatioprina. Tratamiento con Alopurinol.
*Adaptado de (Bishop, Fody et al. 2010). Intervalos biológicos de referencia en población infantil
Ácido úrico Edad
Hombres
Mujeres
1-30 días
(1.2-3.9)mg/dL
(1.0-4.6) mg/dL
31- 365 días
(1.2-5.6)mg/dL
(1.1-5-4)mg/dL
1-3 años
(2.1-5.6)mg/dL
(1.8-5-0)mg/dL
4-9 años
(1.8-5-5)mg/dL
(1.8-5.5)mg/dL
10-12 años
(2.2-5.8)mg/dL
(2.5-5.9)mg/dL
Adaptado: Pediatric reference intervals 2011 (6)
Caso clínico *: Una mujer de 80 años de edad fue admitida en el hospital con un diagnóstico de hipertensión, falla cardiaca congestiva, anemia, posible diabetes y falla renal crónica. Después de que la mujer se trató con diuréticos y fluidos intravenosos se le dio de alta después de 4 días. Los resultados de laboratorio se muestran en la siguiente tabla:
(* indica test no realizado)
Primera admisión
Segunda admisión
(mes/día)
(mes/día)
2/11
2/15
7/26
7/28
BUN, mg/dL
58
*
*
61
Creatinina, mg/dL
6.2
6.2
6.4
6
Acido úrico, mg/dL
10
*
*
9.2
BUN/creatinina
9.4
*
*
10.1
Glucosa, mg/dL
86
80
113
*
Cinco meses más tarde la paciente volvió al hospital manifestando tener episodios de dipnea. La paciente se sometió a una dieta especial y se trató con medicamentos para controlar su hipertensión; posteriormente se le dio de alta. Los doctores creen que ella no esta tomando los medicamentos de manera correcta y le recuerdan la importancia de tomarse los medicamentos según la prescripción. Preguntas: ¿Cuál es la causa más probable de la elevada concentración del nitrógeno ureico en la paciente? ¿Qué datos soportan su conclusión? Note que la paciente fue admitida con diagnóstico “posible de diabetes”. ¿Si la paciente hubiera sido
verdaderamente diabética con unos niveles elevados de glucosa en sangre y cetosis, cuál cree usted que seria el efecto en la determinación de la concentración de creatinina en sangre? Explique. *Caso clínico adaptado de (Bishop, Fody et al. 2010).
BIBLIOGRAFÍA Bishop, M. L., E. P. Fody, et al. (2010). Clinical Chemistry: Techniques, Principles, Correlations. USA, Lippincott Williams & Wilkins. Burtis, C. A., E. R. Ashwood, et al. (2011). Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, Elsevier. Dvorkin, M. A., D. P. Cardinali, et al. (2010). Best &Taylor. Bases Fisiológicas de la Práctica Médica. Argentina, Editorial Médica Panamericana. Ochei, J. and A. Kolhatkar (2008). Medical Laboratory Science:Theory And Practice, Tata Mcgraw Hill Education.
