DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN UN JUGO COMERCIAL POR ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA Andrés Felipe chamorro cód. 0637962, Jefferson rubio cód. 0638954. Lizeth Fernanda Holguín. cód. 0626607 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS, UNIVERSIDAD DEL VALLE, Campus Meléndez, Santiago de Cali, Valle del Cauca. __________________________________________________________________________ Resumen Se determino la concentración de ácido ascórbico en una muestra de jugo comercial, por medio de espectroscopia ultravioleta, para ello se emplearon dos métodos de calibración; una curva de calibración regular y una curva de adición estándar, utilizando una longitud de onda máxima de (242.4nm) y (239.8nm) respectivamente, para realizar las correspondientes ] medidas de absorbancia. La concentración obtenida de la muestra es [ ] y[ correspondientemente a cada curva. _________________________________________________________________________________ DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS 1.4
Absorvancia (uA)
1.2 1 0.8 0.6 0.4
A = (0,053 ± 0.002)L/mg (Ac.A) - (0,046 ± 0.027) R² =0.999
0.2 0 5
10
15
20
25
Concentración (ppm) Gráfica 2.curva de calibración de ácido ascórbico Gráfica 1. Espectro de absorción de ácido ascórbico
Concentración de ácido ascórbico en 25 ml Curva de calibración [ Tabla1. Datos de absorbancia de la curva de calibración Concentración Absorbancia (uA) (ppm) ± 0.001 5 0.216 10 0.510 15 0.736 20 1.059 25 1.289 muestra 1.269
]
[
]
[
]
[ [
]
]
[
]
Concentración de ácido ascórbico en la muestra. [
]
[
]
[ [
] ]
[
]
[
]
Realizando los cálculos correspondientes se encuentra:
Curva de adición estándar
tcal =2.3
Tabla 2. Datos de absorbancia de la curva de adición estándar Concentración (ppm) 0 5.2 10.2 15.2 20.2
2 1.8
(Ho) = la hipótesis no se rechaza, y no hay efecto de matriz.
La espectroscopia de uv-vis es utilizada tanto en el análisis cuantitativo como cualitativo de especies orgánicas e inorgánicas. A pesar de su escasa información estructural, es aplicada para la determinación de la estructura e identificación de sustancias por medio de mecanismos de reacciones químicas, control de pureza, concentración y la medición exacta de la constante de disociación de ácidos y bases. (1) La región espectral que comprende el uv cercano, se encuentra entre longitudes de onda de 185-400 nm.
1.6 1.4 1.2 0
5
10
15
20
Concentración (ppm) Gráfica 3. curva de adición estandar de ácido ascórbico
[
[
]
]
[
]
[
]
Concentración de ácido ascórbico en la muestra. [
tcal < tcrit
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
A =(0,048 ± 0.002)L/mg (Ac. A) + (1,246±0.020) R² = 0.999
2.2
Absorvancia (uA)
Absorbancia (uA) ± 0.001 1.246 1.487 1.744 2.022 2.205
tcrit = 2.45 (f=6 , 95%)
][
] [
]
[
]
[
[
] ]
Prueba t Para determinar si hay efectos de matriz en los métodos de calibración, se realiza una prueba t. Donde: (Ho) = No hay efectos de matriz
Cuando una molécula orgánica absorbe radiación, ocurren unas transiciones electrónicas (δ→ δ*, n , n δ*, → ) entre sus orbitales. Las transiciones se deben a los electrones implicados en enlaces de tipo σ o π y en pares no enlazantes n de átomos de H, C, N, O.(2) Para absorber radiación en el ultravioleta, la molécula (analito) tiene que tener un sistema cromofórico, que está compuesto por partes estructurales de la molécula responsable de una determinada absorción de radiación electromagnética, como los enlaces (C=C, C=N, N=N). (3) Cuando se determina la concentración de acido ascórbico en un jugo comercial, por medio de espectroscopia de absorción molecular uv, se debe tener una inexorable preparación de la muestra; como la eliminación de compuestos interferentes (CO2) y la adición de HCl. La industria utiliza CO2 como saborizante en los jugos comerciales y gaseosas. El CO2 debe ser eliminado de la muestra, por que posee enlaces dobles (O=C=O)
carbono-oxigeno, comportándose como un sistema cromofórico. Por tanto los electrones no enlazantes del oxigeno cuando reciben radiación en el rango ultravioleta, produce una transición de n . Interfiriendo en la señal de la absorbancia del acido ascórbico, y por lo general se provoca un solapamiento de las bandas de absorción.(2) La adición de HCl a las soluciones utilizadas para los métodos de calibración, se realiza con el fin de evitar la descomposición del analito (Ac. A). como el acido ascórbico es un acido débil se disocia parcialmente, por lo tanto es necesario un exceso de concentración de iones H+, para disminuir su desprotonación (figura 1) y reacción de la muestra, si la solución se encuentra alcalina. El acido ascórbico reacciona y se obtendrá una pérdida de analito (Ac.A), lo que produce una disminución en la intensidad de la señal error en las medidas de absorción, Por lo tanto la adición de HCl garantiza un máximo de absorción a una misma longitud de onda para todas las soluciones.
las celdas es cuarzo, ya que no absorbe en la región ultravioleta.(1) El haz de radiación monocromática se divide en dos componentes con potencias radiantes similares. Un haz pasa a través de la muestra y el otro haz de radiación pasa a través del blanco. Dos espejos giratorios, los cuales se encuentran sincronizados con el sistema, permiten el paso de la radiación hacia el detector, el cual compara exactamente para la misma longitud de onda las intensidades transmitidas por los dos haces (2). El ácido ascórbico (figura 2) al recibir radiación ultravioleta, produce transiciones electrónicas de n debido a que presenta enlace doble (C=O). Esta transición es poco intensa, y es el resultado del salto de un electrón de un orbital molecular no enlazante del oxigeno a un orbital molecular antienlazante . También presenta transiciones de → , para que suceda esta transición, se requiere una cantidad mayor de energía o menor longitud de onda.(1)
Figura 2. Estructura del ácido ascórbico Figura 1. Desprotonación del acido ascórbico
Para cuantificar el acido ascórbico presente en la muestra, se utilizó un espectrofotómetro de doble haz, que utiliza una fuente de descarga de deuterio y una fuente de wolframio. La fuente emite una radiación continua, que pasa por un monocromador, el cual selecciona una longitud de onda especifica (la energía proveniente de la fuente debe realizar primero el paso por el monocromador antes de atravesar la muestra para que no se produzca una fotodescomposición de la misma). Las celdas que contiene la muestra y el disolvente, debe estar compuesta de un material que deje pasar la radiación en la región ultravioleta. El material utilizado para
Para el doble enlace (C=C), se produce transiciones de → esto se debe a la excitación de los electrones que se encuentran en el orbital molecular del doble enlace, produciendo un salto al orbital molecular . La banda de baja intensidad (transición de n ) no se puede observar debido a que es cubierta por el pico de mayor absorción (transición de → ) Normalmente una transición de este tipo proporciona una señal de longitud de onda en el rango de 200-700nm. (1) La longitud de onda de máxima absorción del ácido ascórbico (teórico) puede variar entre 243-267 nm. En la práctica se encontró un rango de absorción entre 220300 nm (grafico 1) con un máximo de absorción en 242,4 nm en la curva de calibración regular y 239.8 nm en la curva de adición estándar.
Como se puede observar en su estructura este presenta un sistema conjugado, por lo cual la nube electrónica se distribuye por lo menos en cuatro centros atómicos (figura 3) Ocasionando un desplazamiento (4) batocromicro.
Figura 3. Ácido ascórbico
En una transición electrónica de tipo → , el max se encuentra en 217 nm. Pero para un sistemas conjugado como el Acido Ascórbico, se da un desplazamiento de la longitud de onda de absorción entre 15 y 45 nm hacia el rojo. Por lo tanto el máximo de absorción de un sistema conjugado de acuerdo al desplazamiento producido por los enlaces conjugados del sistema está en el rango de 232 – 262 nm. (4) Debido a los estados electrónicos vibracionales y rotacionales que presentan el ácido ascórbico, produce múltiples transiciones vibracionales y rotacionales ocasionando que las bandas discretas se derrumben por las cercanías de las señales que producen la transiciones ya mencionadas, Formando un espectro de banda continúa, Como se observa en la gráfica1. (4) Para hallar la concentración de ácido ascórbico en una muestra de jugo comercial, se realizo una curva de calibración la cual se obtuvo una concentración de (1240.50 ± 33.48) ppm y se realizo una curva de adición estándar en la cual se obtuvo una concentración de (1298.00± 0.027) ppm. La curva de calibración se realizó con el fin de determinar la cantidad de analito (Ac.A) presente en una muestra. Los patrones (concentración conocida) de calibración se miden bajo las mismas condiciones que se utiliza en la solución que contienen la muestra (concentración desconocida) donde por interpolación se puede obtener la concentración del analito.(5)
Si y solo si se tiene indicios de efecto de matriz, se debe realizar una curva de adición estándar, Porque es un método de calibración menos preciso debido que es un método de extrapolación y se necesita mayor cantidad de muestra. (5) Para comprobar que no hay efecto de matriz se realizó una prueba t, la cual demostró que la absorción de la muestra no está interferida por la matriz. Esto señala que la concentración encontrada por el método de interpolación es más precisa. La concentración de la muestra (1240.50 ± 33.48) ppm, es muy grande comparada con la reportada en la etiqueta del jugo comercial (240 ppm), este exceso de muestra no puede ser explicado por los analista, por que el método de preparación de los patrones se realizo correctamente y es respaldado por los métodos de calibración, donde se observa una buena linealidad de las curvas y la prueba t realizada demuestra que no hay efecto de matriz en la absorbancia. Solo hay un indicio de error en el procedimiento debido a los analistas, al realizar un espectro con la solución que tiene una concentración intermedia de acido ascórbico de la curva de calibración, y otro espectro con la solución intermedia de acido ascórbico para la curva de adición estándar, presentado dos longitudes de onda de máxima absorción. pero solo se debe realizar el primer espectro y con esa longitud de onda donde se encontró la máxima absorbancia se realizan todas la mediciones de absorbancia. El primer espectro presento un máximo de absorción de 242.4 nm y el segundo método 239.8 nm. Pero como se observa los valores de longitud de onda donde se presento la máxima absorción no difieren en más de 3 unidades de nm, y no pone en peligro el análisis de la muestra. Por lo tanto se puede presentar un engaño de la concentración de ácido ascórbico en el jugo comercial por parte de los fabricantes pero esto no se puede afirmar si no se hace una reproducibilidad del análisis con la misma muestra utilizada en la práctica. Un aumento en la concentración de la muestra da una interpretación de la curva
de calibración y la curva de adición estándar, ya que no se obtuvo la señal de absorción en el rango esperado de a cuerdo a los cálculos realizados antes de la práctica, para poder realizar una comparación ideal y especifica entre las dos curvas. Si no que se produjo un rango de absorción encima del otro, por que la curva de adición estándar necesita mayor cantidad de muestra y la misma aumenta la concentración del analito y por lo tanto la señal de la absorbancia. PREGUNTAS 1. Describa de manera concreta y suficiente los componentes del espectrofotómetro. Un espectrofotómetro de uv-vis está constituido de: 1. Fuente de radiación 2. Selector de longitudes de onda. 3. Fotodetector. Fuente de radiación La fuente de radiación consta de dos condiciones básicas, la primera es proporcionar suficiente energía radiante en un rango de longitud de onda en la que se medirá la absorción y segundo debe mantener una intensidad constante.(6) La fuente que usa el espectrofotómetro (Uv-1700 Pharmaspec) de absorción en la región uv-vis, es una Lámpara de wolframio de 20W y lámpara de deuterio con cambio automático. La lámpara de descarga de deuterio trabaja a baja presión (aproximadas de 0,2 a 0,5 torr) y bajo voltaje (aproximado a de 40 V). (6)(8) La lámpara de descarga de deuterio consiste de dos electrodos. Un ánodo que generalmente es una placa de molibdeno, y un cátodo, que es un filamento de óxidos metálicos que emite electrones. Los electrodos se encuentran Inmersos en una atmósfera de D2 que se encuentra cubierta en una pantalla de cuarzo, ya que el vidrio presenta absorción en longitudes de onda menores a 320 nm. (1)
Al hacer pasar corriente entre los electrodos, se produce una descarga, que crea un arco intenso en el orificio situado cerca al ánodo liberando electrones. Las moléculas de D2 al ser bombardeadas por los electrones, se disocian con emisión de fotones. (1)
Donde es la molécula de deuterio excitada, que produce fotones con longitudes de onda que emiten continuamente en un rango espectral de 160 a 500 nm. (1) La lámpara de filamento de wolframio es bastante eficaz, dependiendo de la temperatura, por que la distribución de la energía de esta fuente se aproxima a la del cuerpo negro, la cual es útil para la región de longitud de onda comprendida entre 350 y 2.500 nm. La lámpara de wolframio contiene una pequeña cantidad de yodo en la envoltura de cuarzo que rodea al filamento de wolframio. El uso del cuarzo es necesario debido a la alta temperatura de trabajo ( 3500 k), el tiempo de vida media de la lámpara de wolframio es el doble comparada con una lámpara normal, esto se debe a la reacción del yodo con el wolframio gaseoso que se forma por sublimación limitando la vida del Filamento. (1)
Selector de longitudes de onda Para seleccionar la longitud de onda deseada se usan filtros o monocromadores como selectores de longitudes de onda. (6) Un monocromador consiste generalmente de una rendija de entrada, un colimador de la radiación procedente de la rendija de entrada, una red o prisma para dispersar la radiación, un colimador para enviar la radiación hacia la rendija de salida y una rendija de salida. (6) La función principal del monocromador es proporcionar un haz de energía radiante con una longitud de onda nominal y una anchura de banda dada. (6)
El monocromador debe tener un diseño simple, buena resolución, gama espectral, pureza de radiación de salida y dispersión. Las rendijas tanto de entrada como de salida son orificios por el cual pasa la radiación. Los colimadores son espejos cóncavos que reflejan la radiación hacia la red de dispersión y el otro hacia la rendija de salida. (6)
Una red de dispersión consiste en un gran número de estrías paralelas y equidistantes que se marcan con una herramienta rayadora de diamante sobre una superficie perfectamente pulida. (6) Las estrías deben de tener la misma forma y dimensión desde la primera hasta la última. Todas las rejillas son duplicados de una rejilla maestra que por lo general llega a tener hasta 3600 estrías/mm o más para las regiones del uv-vis. (6) La radiación que proviene de la muestra entra por una rendija al monocromador y es reflejada por un espejo cóncavo hacia la red de dispersión. Cuando la radiación incide sobre la red es difractada en varias longitudes de onda, que se dirigen a un segundo espejo que está ubicado de tal forma que refleje la longitud de onda seleccionada sobre la rendija de salida. (6)
Detector
El detector es un dispositivo que convierte la radiación electromagnética en un flujo de electrones y posteriormente en una corriente o voltaje. El detector más utilizado es el tubo fotomultiplicador. Es un dispositivo que combina un cátodo fotoemisivo, dinodos (recubiertos de una sustancia que expulsa electrones como resultado del impacto de un electrón de alta energía) y un ánodo. (6) La radiación que llega al detector viene en fotones los cuales inciden sobre el cátodo que desprende electrones. Estos electrones que se desprenden del cátodo se dirigen hacia el primer dinodo que lo impactan desprendiendo una relación de
aproximadamente 4 veces más electrones que los que incidieron sobre el dinodo. El dinodo tiene un potencial 90 V más positivo que el cátodo para asegurar que los electrones se dirijan hacia él. . (6)
Los electrones que se desprenden del primer dinodo se dirigen hacia el segundo dinodo que tiene la diferencia de potencial 90 V más positiva que el dinodo anterior y desprendiendo mas electrones y así sucesivamente hasta el noveno dinodo y luego al ánodo llega una cascada de electrones y esta es la señal que se mide. . (6)
El espectrofotómetro (Uv-1700 Pharmaspec) utiliza un detector de fotodiodo de silicio, el cual está situado en el plano focal del monocromador, y el espectro se puede obtener mediante un barrido electrónico, tomado en simultaneo todos los datos puntuales y necesarios para definir el espectro. (1)(8) El detector es una serie de diodos de silicio, como el sistema no contiene partes en movimiento, la reproducibilidad de la longitud de onda es alta. (1) La excitación térmica de un electrón origina una región cargada positivamente, llamada hueco, que, como el electrón, es también móvil. El mecanismo del movimiento del hueco es a saltos, y se produce al mismo tiempo que un electrón de un átomo de silicio vecino salta a una región deficiente de electrones (el hueco), creando así otro hueco positivo a su paso. La conducción en un semiconductor implica el movimiento de electrones y huecos en direcciones opuestas. (7)
Un diodo de silicio polarizado de forma inversa puede servir como detector de radiación, porque los fotones de la región ultravioleta y visible tienen suficiente energía para crear electrones y huecos adicionales cuando incides sobre la capa vacía de la unión pn. Un detector de diodo de silicio es más sensible que un simple fototubo de vacío, pero menos sensible que un fotomultiplicador. (7)
CONCLUSIONES
La curva de adición de estándar se realiza con el fin de observar si hay efectos de matriz en la absorbancia de la muestra.
La curva de calibración es un método mucho más preciso que el de adición de estándar sí se ha comprobado que no hay efecto de matriz por medio de una prueba t.
Los sistemas cromofórico son los grupos responsable de la absorción de la radiación electromagnética en la región ultravioleta.
Un sistema conjugado al absorber radiación electromagnética, presenta un desplazamiento batocromico. BIBLIOGRAFÍA
1. SKOOG, D. A.; LEARY, J. J. Análisis instrumental. 4ed. Madrid: McGraw Hill, 1994. 142 – 170, 173-179 pp. 2. ROUESSAC, F.; ROUESSAC, A. métodos y técnicas instrumentales modernas. 5ed.Madrid: McGraw Hill,140-141, 150pp 3. ZULUAGA C, F.; INSUASTY O, B.; YATES B. Análisis orgánico clásico y espectral. Universidad del Valle facultad de ciencias – departamento de química, 1999. 60-64pp. 4. QUIROGA P, J.; INSUASTY O, B.; BOUCHARD, A.; Uso de la espectroscopia ultravioleta e infrarroja en análisis orgánico. Universidad del Valle - facultad de ciencias – departamento de química, 1993. 18-19, 43, 46-47pp. 5. MILLER, J. N.; MILLER J. C. Estadística y Quimiometría para Química Analítica. 4ed Madrid: Prentice Hall., 2002. 113 pp.
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7. SKOOG,D.A; WEST D. N.; WEST, D. M.; HOLLER F . J.; fundamentos de química analítica. 4 ed. Editorial reverte.1999 549-550pp 8. http://www.jenck.com/uv-1700.htm.; 2006
