Cuantificación de Adn Por Espectrofotometría de Uv 1

CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE UV-VISIBLE Y VISUALIZACIÓN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 1

Oscar Luis Gómez V. (20132150025); Miguel Ángel Fandiño. (20131150070); Manuel  Andrés Prieto S. (20131150037). (20131150037 ). 2  Heidy Narváez 1,2 Universidad Distrital Francisco José de Caldas 1  Estudiantes-Bilologia Molecular 2  Profesora-Biologia Molecular  Bogotá D.C 25-septimebre-2017

RESUMEN La técnica más común para cuantificar el ADN y evaluar su pureza es por medición de la densidad óptica o absorbancia, lo cual nos permite apreciar una longitud de onda a un máximo de absorción de luz, donde se puede cuantificar el ADN. Por otra parte la electroforesis en gel de agarosa es una técnica ampliamente utilizada para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Se reportan en este informe los datos cuantitativos de la cuantificación de 3 muestras de ADN (Genómico, plasmídico y  problema) detectados a través de la técnica de espectrofotometría de UV-visible, condicionando particularmente la respuesta espectral de 260 nm de una fuente de radiación ultravioleta, y su posterior visualización y separación electroforética en gel de agarosa. Estos primeros resultados tanto espectrales como electroforéticos permitieron la cuantificación y visualización de los niveles de ADN en cada una de las las muestras trabajadas, concluyéndose de esta manera las bajas concentraciones para el caso de ADN  plasmídico y muestra problema y alta concentración para el ADN genómico. PALABRAS CALVES Ácidos nucleicos, electroforesis en gel de agarosa, cuantificación de ADN, espectrofotometría UV, concentración de ADN, Marcador de peso molecular. ABSTRACT The most common technique for evaluate the DNA and its purity is by measuring the optical density or absorbance, allowing us to appreciate a wave length to a maximum of absorption of light, where the DNA can be quantified. On the other hand the agarose gel electrophoresis is a technique widely used for analyzing and characterizing nucleic acids of different origins. Are reported in this report quantitative data of the the quantification of 3 samples of DNA (Genomic, plasmid and problem) detected through the technique of spectrophotometers UV-visible, particularly conditioning the spectral response of 260 nm a source of ultraviolet radiation, and its subsequent visualization and separation in agarose gel electrophoretic. These first both spectral results as electrophoretic allowed the quantification and visualization of the levels of DNA in each of worked samples, concluded in this way low concentrations for the case of DNA plasmid and It shows problem and high concentration for Genomic DNA. KEY WORDS  Nucleic acids, agarose gel electrophoresis, DNA, DNA, molecular weight marker concentration, UV spectrophotometry quantification

1. Introducción TECNICAS DE CUANTIFICACION En la cuantificación de ADN se pueden utilizar diferentes técnicas como las espectrofotométricas, sin embargo, una de las técnicas más innovadoras para la cuantificación de ADN es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual se caracteriza por ser una técnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y eficiencia, que se puede llevar acabo en muy poco tiempo. Esta técnica se basa principalmente en una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN.[1] mientras que la espectrofotometría de la luz UV que se realiza principalmente en muestras puras (no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol, agarosa o incluso otros ácidos nucleicos), su medición mediante espectrofotometría de luz UV absorbida por las bases nitrogenadas es la más adecuada. Por el contrario, si la cantidad de ADN o ARN es muy pequeña, o si la muestra contiene grandes cantidades de impurezas, la estimación de los ácidos nucleicos se puede llevar a cabo por la intensidad de fluorescencia emitida (electroforesis) por compuestos como el  bromuro de etidio.[2] La electroforesis en geles de agarosa es una de las técnicas analíticas utilizadas en la caracterización de ácidos nucleicos en base a la forma y tamaño de las moléculas. La carga neta negativa, producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una migración de las moléculas hacia el ánodo cuando se aplica un campo eléctrico; sin embargo, la matriz, formada por la agarosa (un polisacárido ramificado de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidrogalactosa altamente hidrofóbico) en la sal del tampón, presenta una resistencia al movimiento (imagen 1). Las moléculas de mayor tamaño tendrán dificultad para pasar por los poros de la

matriz, quedándose en la región superior del gel, mientras que los fragmentos de menor tamaño se movilizarán con facilidad, alcanzando la parte inferior del gel.[2] Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de  pH entre 8 y 9. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo esto debido a que en pH superiores a 5 poseen carga negativa.[3]

Figura 1-caja para electroforesis

Tomado de

(http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm/Modos de disposición del soporte)

En el caso de los geles de agarosa, se le añade  bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Posterior a la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se ven las  bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado (imagen 2) y los marcadores de peso molecular .[3]

Figura 2. Tomado de ( https://askabiologist.asu.edu/agarose-gel-

electrophoresis/ Moviendo a través de la matriz}

Otra técnica ampliamente usada es la espectrofotometría de luz UV en la cual se

toma lecturas de la Densidad Óptica (D.O.) a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permite calcular la concentración del ADN en la muestra. Una D.O.260 de 1.0, corresponde aproximadamente a 50 µg-mL-1 de ADN doble cadena, a 33 µg.mL-1 de ADN cadena sencilla, a 20-30 µg-mL-1 de oligonucleótidos entre 20 a 40 bases y a 40 µg.mL-1 de RNA. La relación entre las medidas a 260 y 280 (D.O.260:D.O.280) 27  proporciona un estimado de la pureza de la muestra. Las preparaciones puras de ADN deben tener un valor (D.O.260:D.O.280) de 1,8 a 2 valores por debajo de este rango son un indicativo de contaminación con proteínas o fenol. Debido a su rapidez, simplicidad la cuantificación de ADN por espectrofotometría ha sido ampliamente utilizada, sin embargo, esta técnica es poco sensible, y para la mayoría de los espectrofotómetros se requiere una concentración de ADN de al menos 1 µg-mL1 en la muestra para poder realizar estimaciones válidas. [2] Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ADN que se presentan en el citoplasma de los procariotas, presentan las siguientes características esenciales: es  bicatenario y de forma circular, tienen un solo origen de replicación, regulan su propia replicación a través de una proteína o RNA represor, pueden aparecer uno o varios en una sola célula procariota, los genes no son siempre los mismos puesto que codifican para enzimas que les dan ventaja para poder sobrevivir como lo son la resistencia, la capacidad de degradar sustancias, la fertilidad y virulencia, esta molécula es independiente del cromosoma de ADN y está separada de este mismo. Su facilidad para la reproducción y para combinarse con otros segmentos de ADN para formar ADN recombinante que  puede generar varias copias de esta misma son una característica muy importante para que se usen como medios de clonación para segmentos de ADN.[4]

LA ESCHERICHIA COLI Es un bacilo gramnegativo, con una sola cadena espiral de DNA móvil, aerobio y aerobio facultativo, co flagelos peritricos. La mayoría forma fimbrias y pilis, muchas cepas  producen una pequeña microcapsula, y muy  pocos elaboran macrocapsulas y no fabrican esporas. En las pruebas bioquímicas es  positiva al indol, decarboxilasa de linasa, fermentación de manitol y gas a partir de la glucosa; tiene su información genética en los  plásmidos su genoma tiene un total de 5000 genes y su transcripción se encuentra el siguiente factor sigma. [5]

SACCHAROMYCES CEREVISIAE La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen, de Saccharo azúcar, myces hongo y cerevisiae cerveza) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. En su ciclo de vida alternan dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas  biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Por otro

lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilobases (kb). [6]

ESPECIFICACIONES FABRICANTES

DE

LOS

En técnicas como la electroforesis se utilizan materiales que pueden cambiar según su fabricante y tipo, por lo que a continuación se  puede encontrar la información de la sacarosa, el marcador y el map de vectores del e.coli (pET 23ª).

SeaKem LE AGAROSE 500G de Lonza SeaKem® LE Agarose es ideal para el análisis rutinario de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel y transferencia. Cada gel resuelve agudamente el ADN y  proporciona una resolución consistente de un lote a otro. Esta agarosa de grado de biología molecular no tiene actividad detectable de DNasa o RNasa y forma geles fuertes con  bajo fondo sobre bromuro de etidio, tinción SYBR® Green o GelStarTM. Debido a su  baja EEO, el ADN tendrá una alta movilidad electroforética. SeaKem® LE también se recomienda para la electroforesis en gel de  proteínas en aplicaciones tales como Ouchterlony e inmunodifusión radial (RID) Especificaciones / Características Especificaciones analíticas Temperatura de gelificación (1,5%) 36 ° C ± 1,5 ° C Temperatura de fusión (1,5%)> 90 ° C Fuerza del gel (1%)> 1,200 g /   cm². (http://www.biocompare.com/9569-Agarose-Low-EEO/1893717SeaKem-LE-AGAROSE-500G/#detallesdelproducto)

dimensionamiento y la cuantificación aproximada de de amplio espectro de doble cadena de ADN en gel de agarosa. la escalera se compone de catorce cromatografía  purificada fragmentos individuales de ADN (en pares de bases): 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250. Contiene tres bandas de referencia de (6000, 3000 y 1000 pb) para una fácil orientación. La escalera se disuelve en tampón TE.(Thermo Fisher Scientific, ‘Product Information GeneRuler

1

Kb

DNA

Ladder’,

Man0013004,

2016,

1– 2

[accessed 2 October 2017])

Storage Buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA. 6X DNA Loading Dye 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.03%  bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol and 60mM EDTA. The pET-23a-d(+) vectors carry an N-terminal T7•Tag ®sequence plus an optional CterminalHis•Tag ®sequence. These vectors differ from pET-21a-d(+) by the “plain” T7

 promoter insteadof the T7 lac promoter and  by the absence of the lacI gene. Unique sites are shown on the circlemap. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression regionis reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribedby T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helperphage will produce virions containing single-stranded DNA that corresponds to the coding strand.Therefore, single-stranded sequencing should be  performed using the T7 terminator primer (Cat.No. 69337-3) (novagen/ http://www.snapgene.com/resources/plasmid__files/pet_and_duet_vect

GeneRuler 1 kb DNA Ladder

ors_(novagen)/pET-23b(+))

La Escala de ADN Thermo Scientific ™ GeneRuler ™ de 1 kb es diseñado para el

Map general de e.coli pET23

utilizada

=∗ℎ∗ =9∗1∗11  = 99 3   = .8 ∗ 99 3 (1)   = 0.792  tomado

de

http://www.snapgene.com/resources/plasmid__files/pet_and_duet_vect

Se implementó como marcador de peso molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder (figura 2), y agarosa de tipo seaKem le agorose Lonza 50009

ors_(novagen)/pET-23b(+)/

2. Metodología Tomado de la GUÍA 2 DE CUANTIFICACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE VARIOS TIPOS DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA de la profesora Heidy Narváez. [5]. 3. Resultados Se preparó la solución de gel de agarosa teniendo en cuenta el volumen de la caja electroforética, como evidencia la ecuación 1.

Figura

 scientific

4-Marcador de peso molecular de thermo

Los datos de absorbancia para cada muestra se evidencian en la tabla 2 2- Medidas de densidad óptica para la

Tabla

concentración de ADN 

A

Figura 3-caja para electroforesis empleada. Tabla 1-  Dimensiones de la caja para electroforesis

Dimensiones

Ancho 9 cm

Alto 1 cm

Largo 11cm

λ = 230 nm λ = 260 nm λ = 280 nm λ = 320 nm λ = 330 nm

Conc µg\mL Pureza

ADN las ADN eno Muestra rob 1,874 2,474 2,583 2,440 2,898 2,637 1,636 1,909 2,111 0,634 0,768 0,612 ------------90,30 106,50 101,25 100,1

103,7

75,1

Los factores de diluciones para cada muestra de ADN se encuentran consignados en la tabla 3 Tabla 3- factores de diluciones para cada una de las

Tabla

6- pureza de la relación de absorbancias

 pureza ADN

ADNplas ADNgeno Muestraprob 1,802 1,866 1,350

 A260 /A280 para cada muestra de ADN 

muestras empleadas

Factor de ADNplas ADNgeno  Muestraprob dilución µL 2/90 2/90 2/90 La concentración de ADN puede ser estimada ajustando la absorbancia de λ = 260 nm con la medición de turbidez, multiplicándolo por el factor de dilución y la relación de λ = 260 de 1,0 = 50 µg\mL de ADN puro, ecuación 2. [5].

  µ\ =     ∗   ∗   (2)

Tabla

7 -pureza de la relación de absorbancias

 A260 /A230 para cada muestra de ADN 

 pureza ADN

ADNplas ADNgeno Muestraprob 1,456 1,248 1,027

Para realizar la electroforesis se contó con 6 grupos donde se dividió el proceso electroforético de la siguiente manera

Tabla 4-concentraciones de ADN para cada una de las

Ubicación de las muestras de ADN trabajadas  por el grupo 6

muestras

Concentración ADN

ADNplas ADNgeno Muestraprob 2,006 2,366 2,25

Para determinar el rendimiento tola de ADN se implementa la ecuación 3.

   µ =  ∗    

(3)

Tabla 5- Rendimiento de ADN para cada una de las

muestras

Rendimiento ADN

ADNplas ADNgeno Muestraprob 0,180 0,212 0,202

La pureza de la muestra se obtiene mediante la relación A260/A280, después de ajustar el valor de turbidez, ecuación 4

 6  3   (   ) =   8  3 −       = − 

(4)

2-Ubicacion de las muestras de ADN trabajadas por cada grupo de laboratorio Figura

Acético, EDTA), este buffer proporciona el medio para la migración a través de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza la corrida. Para solubilizar la agarosa hay dos soluciones tampón muy usadas para separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis, son el buffer TBE y buffer TAE, que sólo se diferencian en un compuesto, ácido  bórico y ácido acético respectivamente. Los diferentes componentes de estos  buffers se describen a continuación: Tabla 8- Comparación entre los dos buffer utilizados

Figura 3-electroforesis de ADN para cada muestra de

 ADN 

4. Análisis de Resultados En la preparación del gel de agarosa hay que tener en cuenta que la concentración de esta, depende del tamaño del ADN que se encuentre en la muestra; ya que a mayor concentración en el gel de agarosa menores serán los poros por donde migrara el ADN y si este se encuentra en menor tamaño se le facilitara migrar por el gel, y de manera análoga si la concentración de agarosa es menor, los  poros de este gel serán más grandes por lo tanto se debe usar un ADN que contenga una considerable concentración. En este caso se realizó una concentración de 0,8 %, la cual tiene un estimado de pesos molecular de 500 pb a 15 kb debido a la concentración de ADN contenido. Determinando la concentración de agarosa que se debe usar, la solubilización de la agarosa se realiza con una solución buffer TAE (Tris, Ácido

Tris (Tris(hidroximetil)aminometano) Buffer TBE Molécula

Ácido Bórico/Ácido Acético:

Contribuye a responsable del ajustar el pH e taponamiento. deseado Regulación del igual que el Buffer  pH. anterior, a TAE mantenerlo.

EDTA Quelante de cationes divalentes, cuya función es secuestrar Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden el ADN de la muestra

 para electroforesis.

Al igual que similitudes, estas dos soluciones puedes ser distinguibles por; la migración, la capacidad de taponamiento, reciclaje y la recuperación del ADN. En la migración se tiene que El TAE es mejor para el análisis electroforético de fragmentos grandes de ADN (900  –  2000bp y el TBE para fragmentos  pequeños de ADN (100 –   500bp) ya que, corren más rápido y tiene mayor capacidad de discriminación en gel de agarosa más concentrada. En la capacidad de taponamiento El TBE es más estable y tiene una capacidad de

taponamiento más alta que el TAE, lo que hace que pierda sus propiedades después de 3 o 4 dias, mientras que el TAE lo hace en 3 corridas electroforéticas, lo que influye bastante en la capacidad de reciclaje de estos dos buffers. Y por último se tiene la facilidad con que el ADN puede ser recuperado del gel, el TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa, lo que provoca una recuperación  baja del ADN. Otra de las sustancias que ayuda a solubilizar la agarosa, o más bien que se adiciona en este gel es el Bromuro de etidio, que es un agente mutagénico y su función se limita a indicar la presencia del ADN. Este compuesto emite una fluorescencia cuando se expone a radiación UV, y al estar intercalándose en las bases de la doble hélice del ADN por su estructura plana puede indicar la  presencia del ADN. A la hora de tener listo el gel de agarosa se procede a sembrar las muestras de ADN en los pozos determinados, esto se debe realizar con mucho cuidado ya que no se debe pinchar el gel, si esto ocurre las muestras pueden salir del gel y  perderse el corrido. Para la siembra, se emplea un buffer de carga, el cual tiene como finalidad brindar peso, densidad y color a la muestra lo que facilita la deposición en el pozo y evita la salida del gel, este buffer de carga o loading buffer contiene Tris-HCl, de pH 8, azul de  bromofenol o azul de xileno y glicerol. Ya se empieza la electroforesis asegurando un voltaje de 100 voltios durante una hora. La visualización del corrimiento del azul de bromofenol asegura que en efecto la electroforesis se esté llevando a cabo perfectamente, hay que tener en cuenta que el marcados de

 peso se debe sembrar en lugares estratégicos para después poder comparar este con las muestras de ADN.

Figura

corrida.

5- Electroforesis después de media hora

Figura 6- Electroforesis. Mp: marcador de peso;  PLAS:ADN plasmídico; GENO: ADN genómico; MUE  P; Muestra problema.

Terminada la electroforesis el gel es revelado por medio de una cámara de UV la cual excita las moléculas que emiten la fluorescencia para así poder observarlas como lo vemos en la figura 8. Por otro lado en la figura 8 también  podemos ver que el ADN plasmidico no se pueden observar las tres bandas características de dicho ADN, las cuales corresponden a plásmidos en estructura relajada (open circle), estructura lineal y supercorled. Sino al contrario se observa una única banda con una intensidad considerable estancada en el poso. Por lo anterior este no puede ser comparado con el marcador de peso para estimar su concentración en pares de bases ni confirmar el vector bacteriano. Mediante la figura 8 se puede determinar que la muestra problema se encuentra entre 1000bp y 1500bp, lo que nos muestra un estimado en su concentración, al igual que en las demás muestras no se  presentan más líneas lo que determinaría un nivel de pureza alto junto con una alta selectividad en su PCR, pero al compararlo con el nivel de pureza obtenido por el espectro se encuentra que es bajo con relación al punto de referencia (1.8). También se puede observar en la imagen como el ADN plasmidico,  presenta una barra tenue y continua durante parte del gel, lo que evidencia que su extracción no se realizó correctamente, (se recomienda repetir este proceso) mencionando también, que por su bajo nivel de brillo su concentración de ADN fue mínima, este ADN también se puede determinar que se encuentra en la región de 1000bp y de 1500bp, esto porque hasta ahí llega el desplazamiento. Lo anterior nos brinda una nueva idea de que la muestra problema es un DNA plasmidico.

Teniendo en cuenta que de acuerdo al método Molecular Cloning y Maniatis los valores esperados en la pureza del ADN es de 1,8 y comparándolos con los datos que se reportan en la tabla 6, es posible observar una pureza óptima del ADN  plasmidico y genómico, pues muestran valores cercanos al 1,8 lo que se demuestra una correcta extracción y  purificación de ADN, logrando que este quede libre de proteínas asociadas y sales Implicadas en este proceso. Sin embargo, la muestra problema presenta una pureza muy baja lo que se asocia a la presencia de proteína y fenol (si este se usó para la extracción). Por otra parte, con base en la tabla 7, donde se tuvo en cuenta la absorbancia a 230 hace referencia a la  presencia de compuestos aromáticos, ácidos hidroxamicos, carbohidratos y  péptidos , Edta y fenol Se observa una  pureza más baja en comparación a la que se obtuvo teniendo presenta la absorbancia a 280 Siendo nuevamente la muestra problema la que menor pureza tenía CONCLUSIONES Fue posible determinar tanto la concentración como la pureza de la muestra problema a partir de espectrofotometría y electroforesis. Para el primer caso se partió de las absorbancias a diferentes longitudes de onda de muestra de ADN genómico y  plasmidico. Para obtener DNA plasmídico este debe ser replicado en una célula anfitriona. Con frecuencia se utilizan cepas de E. coli  por las facilidades que esta presenta aun que si el procedimiento no realiza con los cuidados necesarios, su extracción será mínima y con posibles contaminantes.

El ADN plamidico que se tenía no es de gran utilidad para más procesos, esto debido al poco contenido genético que se apreció en la electroforesis. Realiza la electroforesis resulta esencial  para comprobar si el DNA aislado es de alto peso molecular y valorar la posible degradación de la muestra. También confirma las estimaciones de la concentración de DNA realizadas con el espectrofotómetro. BIBLIOGRAFIA [1] Puerta, B. C. J., & Uruena, P. C. P. (2005). Practicas de biologia molecular. Bogot: Pontificia Universidad Javeriana.

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