ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA BIOQUIMICA II INFORME II
1. TITULO DE LA PRÁCTICA Dosificación de Proteínas Proteínas de la clara de huevo por Absorción Absorción Ultravioleta. 2. INTRODUCCIÓN Los métodos de dosificación de proteínas son utilizados para determinar la concentración de proteína de una muestra. Existen diferentes métodos para cuantificar la cantidad de proteína. Para la elección del mismo habrá que tener en cuenta, entre otros: cantidad total de proteína disponible, grado de pureza necesidad de conservar la muestra luego del ensayo, presencia en la muestra de compuestos que interfieran con el ensayo, rapidez con la que se necesite el resultado. Los diferentes métodos de cuantificación de proteínas utilizan la espectrofotometría como técnica de cuantificación. Los métodos de cuantificación de proteínas pueden dividirse en dos categorías: directos e indirectos.
Métodos Directos: basados en la absorción propia de las proteínas; absorción en el ultravioleta absorción debida a grupos prostéticos de las prot eínas (si los hay) Métodos Indirectos: basados en la absorción que resulta de la interacción de las proteínas con reactivos específicos: con el reactivo de Biuret con el reactivo de Lowry con el ácido bicinconínico bicinconínico (BCA) con el reactivo de Bradford.
Absorción en el ultravioleta Las proteínas contienen ciertos enlaces o aminoácidos cuyos grupos funcionales absorben luz en el ultravioleta (UV) y por lo tanto pueden ser utilizados para cuantificar la concentración de proteína por espectrofotometría. espectrofotometría. Absorbancia a 280 nm se muestran los picos de absorción en el ultravioleta de los aminoácidos aromáticos triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y fenilalanina (Phe) asi como del enlace entre cisteínas llamado también cistina (Cys-Cys). Por otra parte, el enlace peptídico en sí mismo presenta un máximo de absorbancia a 190 nm. Si observamos el espectro de absorción en ultravioleta del Trp y la Tyr podemos ver que ellos absorben en mayor o menor medida a 280 nm. (1) y (2) 3. JUSTIFICACIÓN Las proteínas son compuestos orgánicos constituídos básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, y pueden contener también azufre, fósforo y hierro. Son vitales para las funciones corporales básicas, incluyendo la regeneración celular y la reparación, mantenimiento y regulación de tejidos, producción enzimas y hormonas, equilibrio de fluidos, y el suministro de energía. La importancia del aporte de proteínas desde la alimentación radica fundamentalmente, en que no pueden ser obtenidas desde otros nutrientes, de modo, que para satisfacer sus necesidades siempre deben ser aportadas desde los alimentos. Por esta razón la importancia de cuantificar las proteínas presentes en la clara de huevo que es el alimento que más proteínas se conoce con un PER igual a 4, además es un alimento accesible a todas las condiciones sociales.(3)
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4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Encontrar la concentración de proteínas totales (mg/dL) del a clara de huevo mediante el método de absorción ultravioleta. 4.2 OBJETIVO ESPECIFICOS 4.2.1 Conocer las absorbancias de las muestras a diferentes longitudes de onda en la franja ultravioleta. 4.2.2 Encontrar el método más rápido y económico para dosificar proteínas en muestras biológicas. 4.2.3 Determinar el grado de estabilidad de las muestras a mediar en el espectrofotómetro. 5. FUNDAMENTO La absorción de los aminoácidos aromáticos en la franja del ultravioleta con un pico en 280 nm. Para descontar la interferencia de la absorción de los ácidos nucleicos que tienden a absorber radiación en una longitud de onda de 260 nm. Para lo cual se aplicara la siguiente formula específica. Proteina(mg/dL)= Abs280 – Abs260
6. REACCIONES No existes raciones ya que este método de dosificación se basa en la diferencia de absorbancias de los aminoácidos aromáticos y los ácidos nucleicos; todas estas moléculas absorben radiación a diferentes longitudes de onda. Y no reaccionan con ningún tipo de reactivos para formar complejos coloreados que estos son detectados en el campo visible.
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Materiales y Reactivos
7.2 Métodos
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Colocar la clara de huevo en un vaso de precipitacion.
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Tomar 1 ml de la clara y poner en un balon de aforo de 100ml
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Aforar el balon con agua destilada
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En un tubo de ensayo agregar 3 ml de suero fisiologico (0,9% nacl)
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En un segundo tubo tomar 1 ml de la solucion preparada y agregar 2ml de suero fisiologico.
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En un tercer tubo tomar 2ml de la solucion preparada y agregar 1ml de suero fisiologico.
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Leer las absorvancias en el espectrofotometro a 280 y 260 nm.
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Encontrar la concentracion de proteinas (mg/dl)
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MUESTRAS Clara de huevo
DILUCIÓN 1:100
8. RESULTADOS
Tubos Muestra diluida (mL) Lectura a 280 nm Lectura a 260 nm
1 0 0 0
2 1,o 0,178 0,123
3 Observaciones 2,o Muestra incolora 0,468 Muestra incolora 0.220 Muestra incolora
9. CÁLCULOS
TUBO 2
TUBO 3
Proteina(mg/dL)= Abs280 – Abs260
Proteina(mg/dL)= Abs280 – Abs260
Proteina(mg/dL)= 0.178-0.123
Proteina(mg/dL)= 0.468-0.220
Proteina(mg/dL)= 0.055
Proteina(mg/dL)= 0.248
0.055 X (3/1)= 0.165
0.248 X (3/2)= 0.372
0.165 X 100= 16.5 mg/dL
0.372 X 100= 37.20 mg/dL
10. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
DETERMINACIÓN RESULTADO Tubo 2 16.5 mg/dL Tubo 3 37.20 mg/dL
DATO BIBLIOGRÁFICO 19.40 mg/dL 19.40 mg/dL(4)
Como podemos ver no hay una gran diferencia entre el valor obtenido y el dato de bibliografía esto se puede deber a diferentes motivos entre ellos el más importante la forma de pipeteo y por la calidad del huevo.
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11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 11.1 CONCLUSIONES •
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Mediante el método de Dosificación de Proteínas por Absorción en el Ultravioleta pudimos encontrar la concentración de proteínas presentes en el huevo; la cantidad encontrada es 16.5 mg/dL. El valor de las absorbancias a diferentes longitudes de onda es de 0.178-0.123 para el tubo dos; mientras que para el tubo tres son de 0.468-0.220; para 280 y 260 nm respectivamente. Encontramos que el método más rápido y económico para dosificar proteínas en muestras biológicas es el método de Absorción Ultravioleta, ya que se puede realizar de manera rápida y no gasta reactivos; el único inconveniente es que se necesita un espectrofotómetro y no un colorímetro. Determinamos que la estabilidad de las soluciones a medir en el espectrofotómetro son altamente estables por que no forman complejos coloreados; los cuales se deterioran en presencia de la luz solar. Estas soluciones fueron medidas después de tres horas de haber realizado la práctica.
11.2
RECOMENDACIONES
Recomendamos para realizar esta práctica se mida correctamente los volúmenes de de aforo y de pipeteo por que los datos pueden variar considerablemente.
12. BIBLIOGRAFÍA (1)http://www.buenastareas.com/ensayos/Dosificaci%C3%B3n-DeProte%C3%ADnas/4215084.html (2) http://www.balancesaludybienestar.com/la-importancia-de-las-proteinas/ (3) http://mejorestilodevida.net/Temas/t_nutricion_proteinas.htm
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13. ANEXOS
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