Controle de Qualidade microbiológico de medicamentos

DANIELA CRISTINA CEZARETTO

CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE MEDICAMENTOS

CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2005

DANIELA CRISTINA CEZARETTO

CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE MEDICAMENTOS

Nome do orientador: Eliana P. Chagas Monografia apresentada como requisito da disciplina Trabalho de Conclusão de Curso, do Curso de Ciências Biológicas UniFeob – São João da Boa Vista – SP.

CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2005

DANIELA CRISTINA CEZARETTO

CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE MEDICAMENTOS

Nome do orientador: Eliana P. Chagas Monografia apresentada como requisito da disciplina Trabalho de Conclusão de Curso, do Curso de Ciências Biológicas UniFeob – São João da Boa Vista – SP.

CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2005

FOLHA DE APROVAÇÃO Nós professores abaixo assinados, declaramos que a monografia apresentada pela aluna Daniela Cristina Cezareto, apresentada no dia 04 de novembro de 2005, foi aprovada.

BANCA EXAMINADORA

Professora Pós - Doutora Eliana Pereira Chagas ORIENTADOR

Marco Marco A ntoni o Roqueto MEMBRO DA BA NCA

Professor Mestre Mauríio Mauríio José Cividi ni Matthiesen Matthiesen MEMBRO DA BA NCA

AGRADECIMENTOS Primeiramente à minha mãe, por ter me auxiliado a transpor as inúmeras dificuldades encontradas ao longo da minha graduação, pela confiança e incentivo. A toda minha família pela colaboração e participação durante a realização deste trabalho. À professora e amiga Dr. Eliana Pereira Chagas que com grande satisfação me orientou neste trabalho e a quem devoto a mais sincera e efetiva admiração e respeito. À UniFEOB e a todos os formandos da 2ª Turma do Curso de Ciências Biológicas, às minhas eternas e inseparáveis amigas de trabalho Cristiane Cipola, Natalia Gonçalves e em especial minha querida amiga Mariana Suppia, companheiras de incontáveis momentos, os quais me recordarei para o resto da minha vida... “Meninas sem vocês minha vida universitária não seria a mesma...vocês são muito especiais!!!” Um agradecimento muito especial à Professora, Ex-coordenadora do Curso e muito amiga Msc. Daniela F. C. Jacobucci e seu marido e professor Dr. Giuliano Jacobucci, que infelizmente tiveram que nos abandonar no final do curso. “Dani e Giuliano....sentimos muitas saudades”.

Aos que embora não citados, contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

SUMÁRIO 1.

RESUMO.......................................................................................................................6

2.

INTRODUÇÃO ..................................................... ............................................................................................................ ....................................................... 7

3.

CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS........................................9 3.1. A INDÚSTRIA FARMACÊUTICA E AS POLÍTICAS DE SAÚDE E DE MEDICAMENTOS..........................................................................................................12

4.

ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS 15 4.1. AMOSTRAGEM.......................................................................................................15 4.2. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA .................................................. ............................................................................ .......................... 16 4.3. MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS..................................... MICRORGANISMOS ..................................... 16

4.3.1.Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade ( pour  plate) ...........................................................................................................................16 4.3.2. Em Meio Sólido, Com Semeadura Da Amostra Em Superfície ...........17 4.3.3. Membrana Filtrante .........................................................................................17 4.4. PESQUISA DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS ....................................................... 18 4.5. MÉTODOS RÁPIDOS..............................................................................................18

5.

ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS ESTÉREIS......20 5.1. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS.........................................................................21 5.2. OBTENÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS..............................................................22 5.3. PROCESSOS ESTERILIZANTES ........................................................ .......................................................................... .................. 22 5.4. TESTE DE ESTERILIDADE ..................................................... .................................................................................. ............................. 23 5.4.1. Amostragem .......................................................................................................24 5.4.2. Preparo da Amostra .........................................................................................25 5.5. MÉTODOS DE INOCULAÇÃO ........................................................... ............................................................................. .................. 26 5.5.1. Inoculação Direta .............................................................................................26 5.5.2. Inoculação Indireta ou Filtração ...................................................................28 5.6. CONTROLE DA EFICIÊNCIA DE ESTERILIZAÇÃO ......................................... 33

6.

TESTE DE PIROGÊNIO ..................................................... .......................................................................................... ..................................... 36 6.1. ENDOTOXINAS .................................................... ..................................................................................................... ................................................. 37 6.2. NÍVEIS PIROGÊNICOS..........................................................................................38

6.3. PIROGÊNIOS DE FONTES DISTINTAS .............................................................. 39 6.4. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO ............................................................ 40 6.5. TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO ...............................................41 6.5.1. Fundamento do Método .................................................................................42 6.5.2. Modelo Animal .................................................................................................42 6.5.3. Amostra ..............................................................................................................44 6.5.4. Coelho .................................................................................................................45 6.6. DETERMINAÇÃO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS POR MÉTODO IN VITRO ...............................................................................................................................46 6.6.1. Mecanismo de Reação ....................................................................................47 6.6.2. Ponto Final de Gelificação ............................................................................47 6.7. OUTROS MÉTODOS...............................................................................................48

7.

CONCLUSÃO.............................................................................................................50

8.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 52

9.

ANEXO: ...................................................................................................................... 56

6

1. RESUMO A expressão “Controle de Qualidade de Medicamentos” abrange todos os princípios que devem ser seguidos pelos fabricantes e autoridades governamentais para garantir que a medicação que os médicos e o público recebem seja inócua e eficaz. A importância do controle de medicamentos pode ser evidenciada se pensarmos que nossa própria vida depende deles. Visando a obtenção de produtos de qualidade, toda indústria farmacêutica deve, além de seguir as boas práticas de fabricação, possuir laboratórios de controle de qualidade, onde devem ser executadas análises empregando-se processos físicos, químicos e  biológicos, com a finalidade de assegurar e confirmar a qualidade do produto fabricado. Alguns dos problemas de produção e controle de medicamentos são regulamentados por legislação especifica. A qualidade microbiana de medicamentos deve ser definida frente a diversos fatores, entre os quais, de elevada importância, o fato de ser consumido por pessoas debilitadas por vezes inclusive imunodrepimidas. Cargas microbianas muito elevadas  podem também facilmente comprometer a estabilidade do produto. O objetivo deste trabalho é compilar informações sobre o controle da qualidade microbiológica de medicamentos, e os testes que são realizados no controle da qualidade. Deve se levar em consideração o fato de haver uma grande escassez de literatura específica sobre o assunto.

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2. INTRODUÇÃO A expressão “Controle de Qualidade de Medicamentos” abrange todos os princípios que devem ser seguidos pelos fabricantes e autoridades governamentais para garantir que a medicação que os médicos e o público recebem seja inócua e eficaz. A importância do controle de medicamentos pode ser evidenciada se pensarmos que nossa própria vida depende deles (SANTORO, 1988). A preocupação relativa à qualidade, quando associada à atividade produtiva, foi sempre aspecto inerente ao ser humano, que busca aperfeiçoar, desenvolver, superar limites, independente da atividade que exerça, a fim de atender aos anseios da sociedade como consumidora (PINTO et al., 2000). O órgão responsável pela fiscalização das boas práticas de fabricação é a Secretaria  Nacional de Vigilância Sanitária, da qual fazem parte a Divisão Nacional de Alimentos (DINAL), a Divisão de Cosméticos (DICOP), a Divisão de Substâncias Domésticas (DISAD) e a Divisão de Medicamentos (DIMED). Toda a regulamentação sobre medicamentos está baseada na Lei n° 6.360, de 23 de setembro de 1976, com o Decreto n° 79.094 de 5 de janeiro de 1977. A atuação desta legislação no comércio se faz sobre o  produtor e o consumidor (ANVISA, 2005). Visando a obtenção de produtos de qualidade, toda indústria farmacêutica deve, além de seguir as boas práticas de fabricação, possuir laboratórios de controle de qualidade, onde devem ser executadas análises empregando-se processos físicos, químicos e biológicos, com a finalidade de assegurar e confirmar a qualidade do produto fabricado. Alguns dos  problemas de produção e controle de medicamentos são regulamentados por legislação específica (BPF, 1990). Os produtos submetidos à vigilância sanitária, respeitando suas particularidades, devem ser produzidos, armazenados, transportados e dispensados de forma a apresentarem segurança necessária para o uso e consumo. Considera-se neste caso, que os medicamentos, os fitoterápicos, os insumos farmacêuticos, cosméticos, saneantes e outros produtos devem respeitar limites microbianos (PINTO et al., 2000). O limite microbiano de medicamentos e seus insumos pode se constituir em ausência

8 absoluta de formas viáveis (estéreis) ou sua presença em grandezas definidas, restritas ou não a determinadas cepas microbianas para produtos não estéreis. (PINTO et al., 2000). A qualidade microbiana de medicamentos deve ser definida frente a diversos fatores, entre os quais, de elevada importância, o fato de ser consumido por pessoas debilitadas por vezes inclusive imunodrepimidas. Cargas microbianas muito elevadas podem também facilmente comprometer a estabilidade do produto. Conseqüências deste comprometimento estão associadas à perda da eficácia terapêutica, seja por degeneração do princípio ativo, seja por alteração de parâmetro físico fundamental para sua atividade, como por exemplo, o  pH. Aspecto igualmente importante consiste na alteração das propriedades físico-quimicas que podem indiretamente afetar a ação terapêutica, comprometendo a biodisponibilidade do  produto, assim como a aceitação pelo consumidor (ANSEL et al., 2000). Fatores essenciais para que se atinjam níveis adequados de qualidade microbiológica no produto terminado envolvem as fontes diretas de contaminação, acarretadas por fluidos gasosos, água, demais matérias primas e material de acondicionamento. Ainda existem fontes indiretas como decorrentes de procedimentos de limpeza, de instalações inadequadas, manipuladores não paramentados ou submetidos a exames médicos  periódicos, equipamentos com limpeza adequada, particularidade nos pontos críticos e sem  procedimentos validados (SILVA, 1997). O objetivo deste trabalho foi compilar informações sobre o controle da qualidade microbiológica de medicamentos, e sobre os testes que são realizados no controle da qualidade. Considerando-se o fato de haver uma grande escassez de literatura específica sobre o assunto.

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3. CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS Em 1962, um Congresso nos Estados Unidos começou a exigir dos fabricantes que fossem empregados métodos adequados para a boa fabricação de medicamentos. Ficou estipulado que as empresas farmacêuticas fossem instaladas em locais satisfatórios, com equipamentos adequados, pessoal bem capacitado, que cada lote de medicamento fosse  preparado de acordo com a fórmula modelo detalhada, que fossem aplicados os controles devidos durante o processo de fabricação, analisados os produtos terminados e efetuado minucioso controle em relação ao acondicionamento, embalagem e rotulação dos medicamentos (SANTORO, 1988). A qualidade é algo que se obtém como resultado da consideração de todos os fatores que, de uma maneira ou de outra, entra na concepção, desenvolvimento, produção, distribuição e uso dos fármacos. Atualmente é cada vez maior a preocupação de assegurarse a ministração de medicamentos eficazes. Dentre os conceitos de qualidade, devem ser considerados alguns parâmetros: -

Conteúdo do princípio ativo dentro dos limites experimentais;

-

Uniformidade do conteúdo em cada dose;

-

Ausência de contaminantes, incluindo a contaminação cruzada com outros

fármacos; -

Manutenção da potência, eficácia terapêutica e aspecto até o momento do uso;

-

Liberação do ingrediente ativo, de tal maneira exercida a máxima

disponibilidade biológica (SILVA, 1997). O departamento e controle de qualidade não fornecem somente laudos de análise, mas tem a competência de especificar normas e colaborar nos setores de compras, almoxarifado,  produção, formulação, acondicionamento, embalagens e vendas (SILVA, 1997).  Na década de 1960, dois movimentos ocasionaram grande influência na indústria farmacêutica. O primeiro, das ações regulatórias, agrupadas sob a denominação de “Boas Práticas de Fabricação”, introduziram a confiabilidade do processo produtivo. A adoção deste sistema de trabalho era maciça em grande parte dos países. Paralelamente, a engenharia de qualidade tomava ênfase, carregando consigo o conceito de Controle Total

10 de Qualidade, ficando explícito que a qualidade de produtos não é alcançada por inspeção, mas deve ser construída durante o processo de fabricação. O conceito de controle total de qualidade de produtos farmacêuticos e cosméticos consiste no esforço organizado de uma empresa, no sentido de projetar, produzir, manter e assegurar as características, especificadas em cada produto distribuído para comercialização (PINTO et al. 2000). O segundo movimento desta década, também de elevado impacto, foi decorrente da influência japonesa, cujo aprendizado sobre a qualidade, levado extremamente a sério,  provocou a busca do “defeito zero”, além de introduzir diferentes ferramentas auxiliares, como os cinco S: seiri (organização), seiton (arrumação), seisô (limpeza), seiketsu (asseio) e shitsuke (disciplina), sendo este último o mais difícil de atingir, caracterizando-se por ser o estágio em que a assimilação do conceito é tal que todos os “S” são aplicados de maneira automática, quase mecânica. Vale ressaltar ainda o Diagrama de Ishikawa, de espinha de  peixe ou ainda causa – efeito, em que aspectos de motivação, gerenciamento, materiais, métodos, máquinas e manpower (instrução, habilidade, treinamento, disponibilidade de  pessoal) são exaustivamente investigados no sentido de solução de problemas (CAMPOS, 1992). Pelo exposto pode-se observar que os problemas mais importantes do controle de qualidade de medicamentos são a identificação, pureza, estabilidade, legitimidade, dosagem, absorção e o aparecimento de novas substâncias ativas (SANTORO, 1988). Convém ressaltar, que a qualidade do medicamento é fator promocional para obtenção do lucro, assim como evitar ações judiciais em função de problemas decorrentes da má qualidade (SILVA, 1997). Os produtos que apresentam substâncias que possam causar danos ao consumidor sob condições normais de uso, são chamados de produtos contaminados e podem ser por microrganismos ou não. (NICOLETTI et al, 1997). Para atingir bom nível de qualidade microbiana nos produtos farmacêuticos é fundamental que se conheçam as fontes e os mecanismos responsáveis por esta contaminação. Os contaminantes microbianos presentes nas matérias primas serão invariavelmente transferidos ao produto, acrescidos dos microrganismos oriundos de equipamentos e ambientes produtivos, dos operadores envolvidos e dos materiais das embalagens (LIPTON & JEREMIAH, 1994).

11  No caso dos medicamentos, as matérias primas geralmente empregadas se constituem de pós-sintéticos, com baixa carga microbiana, porém, aquelas de origem natural podem conter elevadas cargas microbianas (FERREIRA, 2002). A multiplicação de contaminantes ocorre rapidamente em espaços como juntas e válvulas, onde a água e resíduos do produto se acumulam, ocasionando contaminação  persistente e de difícil eliminação, resultando em distintos níveis de risco na dependência do tipo de produto. A situação é preocupante pois residuais de água podem permanecer nestes espaços, propiciando o crescimento microbiano e subseqüente contaminação endotóxica causada por endotoxinas (FERREIRA, 2002). Embora a contaminação ambiental seja às vezes considerada menos importante, há evidências de que a transferência de microrganismo do ambiente para o produto ocorra quando inexistem condições adequadamente controladas. Contaminantes ambientais de  paredes secas compreendem principalmente bacilos Gram positivos, cocos e fungos. Bactérias Gram negativas são mais susceptíveis aos procedimentos de secagem, porém números reduzidos podem persistir por períodos consideráveis de tempo. Em áreas úmidas como pias e drenos, ocorre acúmulo de Pseudomonas e  Acinetobacter   que não apenas sobrevivem, mas se proliferam nestas condições. Contaminação aérea principalmente associada à poeira e às escamas da pele, se constituem em veículos de esporos bacterianos e cocos (PRISTA et al.,1995). A contaminação derivada dos operadores é normalmente significante. Durante atividades normais, a perda de escamas da pele é da ordem de 104 escamas por minuto. Os contaminantes por elas transportados são micrococos não patogênicos, e estafilococos, mas também podem se constituir de Staphylococcus aureus como parte da microbiota normal. Outras bactérias como a Salmonella e  Escherichia coli, embora não constituintes da microbiota, podem estar transitoriamente associados à pele, na dependência dos hábitos de higiene dos operadores (PRISTA et al.,1995). Os materiais de acondicionamento de matérias-primas devem ser limpos, além de adequadamente planejados, para efetivamente proteger o produto. Outro aspecto a considerar é a contaminação durante o uso ou estocagem do produto(PRISTA et al.,1995). A capacidade de um microrganismo em promover o processo de deterioração depende da sua capacidade em produzir enzimas adequadas. O risco maior no caso de

12  produtos farmacêuticos reside na extrema versatilidade de caminhos bioquímicos dos microrganismos, possibilitando a síntese de enzimas degradativas. Conseqüências que advêm da degradação enzimática podem ser a queda na potência, redução da  biodisponibilidade, formação de pigmentos e odores que tornam o produto inaceitável pelo usuário. A atividade microbiana pode também resultar na produção de toxinas ou na degradação do próprio sistema conservante (BPF, 1990). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária, através da Gerência Geral de Inspeção de Medicamentos e Controle de Produtos, vem constatando a inexistência, no país, de uma literatura técnica que sistematize os ensaios, processos e materiais utilizados por Laboratórios de Controle da Qualidade e Controle da Produção, no sentido de uniformizar as metodologias empregadas, nas análises de controle de medicamentos (ANVISA, 2005).

3.1. A INDÚSTRIA FARMACÊUTICA E AS POLÍTICAS DE SAÚDE E DE MEDICAMENTOS O processo industrial farmacêutico é complexo, vinculando-se às políticas industrial, científica tecnológica e de saúde. É um processo que exige investimentos em pesquisa e desenvolvimento na produção e no controle de qualidade dos produtos, aquisição de substâncias, armazenagem e distribuição dos produtos, entre outros fatores. Para essas ações empregam-se altas tecnologias, mão de obra qualificada em diversas funções e altos investimentos financeiros, inclusive em propaganda (PORTO & FREITAS, 1997). Por ocuparem lugar de destaque no sistema de saúde e no tratamento das doenças, tanto nos países industrializados como nos países em desenvolvimento, os medicamentos exigem uma política nacional específica. Esta política deve estruturar-se de acordo com as necessidades de cada país e é fundamental para garantir eficácia, segurança, qualidade, informação e aspectos de custos e preços dos medicamentos, além de se mostrar importante  para assegurar a utilização adequada desses produtos por parte da classe médica e farmacêutica (BONFIM & MERCUCCI, 1997). Em 1995, a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou que o Estado devesse garantir a disponibilidade de acesso eqüitativo, assim como a utilização adequada dos

13 medicamentos e preconizou para a formulação e acompanhamento de política de medicamentos de cada país, uma ampla parceria entre governos – representando o interesse  público – e os demais atores do processo: os que utilizam ou irão utilizar medicamentos, os  prescritores, os dispensadores e os que fazem, comercializam, distribuem e vendem os medicamentos. Estão ainda incluídos nessa parceria as universidades, os institutos especializados de pesquisa e instrução, as instituições que formam pessoal na área médica,  biológica, odontológica, de enfermagem e farmácia, as escolas de preparação de pessoal de nível médio e de agentes comunitários de saúde, as organizações desvinculadas do governo, como associações de profissionais, grupos de consumidores, indústria farmacêutica (preferivelmente suas representações no país ou internacionais) e as representações  jurídicas. Verifica-se, portanto, que é necessária a participação de diversos atores para o estabelecimento de uma política de medicamento mais adequada à realidade de uma determinada população (BONFIM & MERCUCCI, 1997).  Na indústria farmacêutica são detectados riscos para o meio ambiente, para o consumidor e para o profissional envolvido no processo produtivo. Para o meio ambiente, decorrem do armazenamento de grande quantidade de produtos químicos que podem ser tóxicos, explosivos e inflamáveis. Explosão ou incêndio provocados pelos produtos químicos podem gerar uma combinação de substâncias perigosas, resultando em nuvem tóxica que afetaria não só os trabalhadores de uma indústria, mas também a comunidade vizinha e, dependendo da sua extensão, atingiria dimensão catastrófica. O descarte de  produtos químicos também se constitui em um problema grave pelos riscos que podem gerar para a comunidade (BONFIM & MERCUCCI, 1997). Sobre os riscos tecnológicos ambientais, PORTO & FREITAS (1997) comentam sobre a expansão, em nível mundial, da capacidade de produção, armazenamento, circulação e consumo de substâncias químicas. Explicam que a lógica de desenvolvimento industrial e inovações tecnológicas no ramo químico vêm possibilitando um crescimento dos riscos numa velocidade bem maior do que a capacidade científica e institucional de analisá-los e gerenciá-los. Os autores acrescentam ainda que, nos países de economia semiperiférica como o Brasil, somam-se aos riscos decorrentes da própria industrialização as fragilidades sociais, institucionais e técnicas, que acentuam a vulnerabilidade dessas sociedades frente aos riscos tecnológicos ambientais.

14 Para os consumidores, os riscos resultam tanto de efeitos adversos dos produtos como da qualidade do seu preparo, indicação ou administração correta, entre outros. Podem-se ampliar esses riscos para a sociedade devido ao estímulo ao consumo de medicamentos por  parte da industria farmacêutica privada – ávida de lucros – que, para isso, investe de forma maciça em propagandas junto ao público e, em especial, ao médico (PORTO & FREITAS, 1997).

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4. ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS Produtos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização. A atenção no controle de produtos não estéreis assegura que a carga microbiana contida no  produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, não comprometa a sua qualidade final ou a segurança do paciente. O objetivo do controle de qualidade microbiológica é comprovar a ausência de microrganismos patogênicos e determinar o número de microrganismos viáveis, em função do tipo de utilização do produto (PINTO et al., 2000).

4.1. AMOSTRAGEM A amostragem a ser efetuada para investigação quanto ao atendimento aos padrões microbianos deve ser representativa, em termos de abrangência do volume contido, do número de unidades contenedoras, e das operações unitárias envolvendo risco de contaminação adicional ou de crescimento microbiano. Para que se cumpra tal meta, diferentes critérios devem ser adotados a circunstâncias específicas (ALBERT et al., 1989). Há que se efetuar a assepsia na área próxima à coleta de amostras, usar  preferencialmente recipientes com válvula de amostragem, ou na sua ausência, proceder à vedação hermética subseqüente. Os recipientes devem ser de boca larga e com capacidade  para 100 g ou 100 mL. O transporte deve se dar em condições adequadas de temperatura.  No caso de líquidos, é importante que se evite o uso de pipetas ou de tubos de vidro, com risco de quebra e liberação de fragmentos no conteúdo. Nos processos contínuos, a segmentação como início, meio e fim do processo deve estar contemplada na amostragem. Considerando o produto terminado, toma-se via de regra, uma duplicata da amostra, representando início, meio e fim do processo de enchimento, admitindo que após o fechamento do material de acondicionamento à introdução de contaminantes não exista mais (CRISTÁLIA, 2005).

16 A quantidade de amostra a ser coletada depende das análises, inclusive com reteste. A recomendação das principais farmacopéias, para enriquecimento na pesquisa de patógenos, é de 10,0 g ou 10,0 mL, além da contagem total em igual quantidade (CRISTÁLIA, 2005).

4.2. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA A primeira preocupação ao preparar uma amostra consiste na verificação da atividade antimicrobiana do produto devido à presença de conservantes na fórmula. Estes devem ser inativados com substâncias adequadas, conforme sua natureza química. A adição de inativantes previamente esterilizados por algum processo eficiente deve ser previamente validada. Outro cuidado importante é o ajuste do pH do produto diluído para a faixa de neutralidade, pois isso pode impedir o crescimento microbiano (BAIRD, 1986). A homogeneização da amostra é fundamental no sentido de conduzir a transferência  para etapas subseqüentes de forma representativa ainda que a mesma tenha sido diluída, empregando-se, por exemplo, solução salina peptonada (0,1%), solução tamponada (pH 7,0) ou caldo lactose. Algumas formas farmacêuticas podem exigir tratamento específico no sentido de permitir o contato íntimo da amostra com o meio diluente. Todas as operações empregadas de forma a possibilitar a contagem e pesquisa de microrganismo devem ser validadas, assegurando a confiabilidade do ensaio (BAIRD, 1986).

4.3. MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS 4.3.1.Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade ( pour  plate)

Este método consiste na transferência de 1,0 a 2,0 mL da diluição da amostra para réplicas de placas de Petri esterilizadas. O meio de cultura esterilizado fundido e resfriado a temperatura compatível com a fisiologia celular (45° – 48° C), em quantidade de cerca de 20 mL, é vertido sobre cada uma das placas contendo as amostras, seguido de homogeneização com movimentos em “S” ou “8” sobre a bancada de trabalho, os quais

17  permanecem até solidificação à temperatura ambiente. Segue-se incubação das placas, em estufa na posição invertida, 2 a 5 dias de incubação a 30° - 35° C, para bactérias e 5 a 7 dias  para fungos e leveduras. Após estes períodos as colônias são contadas como auxílio de contadores de colônia do tipo Quebec, abrangendo o crescimento tanto na superfície, quanto na profundidade. O número médio decorrente da réplica correspondente a uma determinada diluição, multiplicado pelo valor da diluição dará o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por unidade de peso ou volume da amostra. Este método é limitante para amostras que conferem opacidade ao meio, não permitindo a visualização das colônias desenvolvidas após a incubação (PINTO et al., 2000). Os meios de cultura devem ter composição completa a fim de propiciar o crescimento de contaminantes. Para a contagem total de bactérias, os meios oficialmente recomendados são principalmente ágar caseína-soja e ágar nutriente; para fungos, ágar Sabouraunddextrose e ágar batata. Os meios de cultura podem ser incorporados de antibióticos, de acido tartárico (inibidor de crescimento bacteriano) ou de outro agente seletivo (PINTO et al., 2000).

4.3.2. Em Meio Sólido, Com Semeadura Da Amostra Em Superfície O meio de cultura é preparado e distribuído previamente em placas de Petri. Empregando-se pipetas esterilizadas, volumes de 0,1 a 0,5 mL de cada diluição da amostra considerada são distribuídos na superfície do meio de cultura já solidificado, sendo o espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxilio de um bastão de vidro ou alça de Drigalski. Na dependência da densidade da amostra, haverá absorção total  pelo meio. A escolha do meio de cultura, condições de incubação e cálculos para determinação de carga contaminante viável corresponde ao método descrito acima (FISCHER et al., 1996).

4.3.3. Membrana Filtrante Alíquotas do produto sob forma líquida ou suas diluições são filtradas através de membranas apropriadas (0,45 µm ou 0,20 µm de poro e 47 mm de diâmetro) constituídas de derivados celulósicos, seguindo-se a deposição de membranas, na mesma posição, sobre

18  placas contendo meio de cultura (ARAUJO & MACEDO, 2001). Esta metodologia, vantajosa por permitir volumes elevados na amostragem e pela acuidade,

apresenta

recomendação

especial

para

amostras

contendo

agentes

antimicrobianos. O cálculo para determinação do número total de contaminantes viáveis é igual ao método Pour Plate (ARAUJO & MACEDO, 2001).

4.4. PESQUISA DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS Conforme algumas recomendações farmacopéicas e citações técnicas mais aceitas, os microrganismos a serem pesquisados, devido à presença indesejável nas formulações farmacêuticas são: • Pseudomonas

aeruginosa 

– nas preparações tópicas, principalmente naquelas

envolvendo regiões próximas aos olhos; • Staphylococcus • Escherichia

aureus – nas preparações tópicas em geral;

coli e Salmonella sp – nas preparações orais;

Pode também ser interessante a pesquisa de outras cepas ou grupos de microrganismos como coliformes (CRISTÁLIA, 2005). Os procedimentos básicos sofrem pequenas distinções entre as farmacopéias de diferentes países, entretanto, os aspectos básicos são mantidos, e a enormidade de detalhes desmotiva o detalhamento dos processos (CRISTÁLIA, 2005).

4.5. MÉTODOS RÁPIDOS A necessidade crescente de respostas que sejam simultaneamente seguras e ágeis na identificação dos microrganismos tem quebrado o conformismo com as técnicas convencionais, que várias etapas devem ser respeitadas, sempre acompanhadas de tempo de incubação compatível com o metabolismo celular para visualização de respostas. Assim, considerando passivamente o metabolismo microbiano, muito se tem trabalhado a questão da resposta de forma a torná-la visível ou de forma detectável em menos tempo (FISCHER et al., 1996).

19 Opções adicionais existem, e tendem a surgir outras, porém há que se considerar a questão do custo-benefício da aquisição do equipamento e material de consumo, frente ao  benefício real por ele permitido (FISCHER et al., 1996).

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5. ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS ESTÉREIS O conceito de esterilidade refere-se à total ausência de formas viáveis de microrganismos capazes se reproduzir. Com o conhecimento atual estatístico envolvendo a morte microbiana, há questionamentos quanto à afirmação absoluta da esterilidade dos  produtos (PINTO et al., 2000). Segundo as farmacopéias, a condição de esterilidade de um produto deve ser considerada com base no fato que o mesmo tenha sido processado em condições ótimas e que o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste, indique a ausência de microrganismos viáveis (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988, UNITED STATES PHARMACOPEIA, 1995, BRITISH PHARMACOPEIA, 1988). A característica de esterilidade foi inicialmente requerida em produtos para uso  parenteral. Mais recentemente, após inúmeros casos de infecções advindas da terapia oftálmica e posterior constatação da má qualidade destes produtos quanto ao aspecto microbiano, foi exigido também, que estes medicamentos sejam estéreis. A exigência do teste de esterilidade em pomadas oftálmicas surgiu inicialmente em países como Suécia, Austrália e Inglaterra (SAITO et al., 1985). Muito se tem escrito sobre as limitações do teste de esterilidade, conforme descrito nas diferentes farmacopéias. Para uma avaliação objetiva do seu valor, há necessidade do entendimento não apenas dos problemas microbiológicos envolvendo o próprio teste, mas também das dificuldades encontradas na obtenção de amostras representativas de um determinado lote. Embora seja ensaio limite, o teste de esterilidade pode ser adaptado para fornecer informação quantitativa sobre o número e tipos de contaminantes presentes. Tais informações são importantes ao se investigar potenciais fontes de contaminação (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2000).

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5.1. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS Há uma variedade de problemas inerentes ao próprio teste de esterilidade no que diz respeito a vislumbrar a característica de esterilidade do produto. Uma vez que a identidade de todos os potenciais contaminantes é desconhecida, há certamente um compromisso quando da escolha do meio de cultura. Na prática, apenas os meios caldo caseína-soja e caldo tioglicolato são recomendados nas edições recentes das farmacopéias britânica, européia e americana (SAITO et al., 1985). A natureza do produto sob teste pode se constituir em problema do ponto de vista da amostragem. No caso de produtos oleosos, tais como pomadas oftálmicas, as células microbianas podem estar na matriz do produto, tornando necessária a extração com um solvente adequado, como o miristato de isopropila, ou propiciar o contato do contaminante com fatores nutricionais do meio de cultura. De outro lado, o produto  pode apresentar em sua composição componentes (inclusive os conservantes) que apresentam atividade antimicrobiana, e que necessitam de inativação por técnica de diluição ou pela adição de inativador específico ao meio de cultura. Uma terceira  possibilidade, quando aplicável, consiste na separação física de células microbianas dos compostos antimicrobianos mediante técnica de filtração em membrana. Uma membrana filtrante de bordas hidrófobas é usada para esta finalidade, sendo lavada com diluente estéril, por exemplo, solução salina ou água peptonada (SAITO et al., 1985). Células microbianas expostas aos efeitos de compostos antimicrobianos são agredidas de forma sub-letal, assim como, aquelas submetidas a processos de aquecimento. O teste de esterilidade falha em não incorporar mecanismos de recuperação para estas células, porém, permite tempo para sua restauração, diferentemente dos métodos rápidos que encontram restrição na aplicabilidade (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

22

5.2. OBTENÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS Diversos aspectos no âmbito produtivo ou analítico levam a que o controle dos  produtos estéreis tenha início com a avaliação das matérias-primas, passe pelo processo  produtivo, ambiente e equipamento, de forma a permitir que se assegure condições de reduzido potencial de falha, que será então detectado num sistema analítico bem executado. Neste momento, devem ser considerados os possíveis caminhos que conduzem a produtos estéreis. Estes são definidos em função da característica termolábil dos princípios ativos ou mesmo da embalagem primária, da estabilidade química, custos, disponibilidade de sistemas pré-existentes na planta industrial entre outros (PINTO et al. , 2000).

Pode-se subdividir a produção dos estéreis em dois grandes grupos: os de manipulação asséptica e os submetidos à esterilização após envase (térmica, química ou irradiação). No caso de manipulação asséptica é sempre lembrado o processo de filtração com suas peculiaridades, embora na abrangência de itens estéreis haja outras possibilidades a se considerar (FISCHER et al., 1996).

5.3. PROCESSOS ESTERILIZANTES Para tratar dos processos de esterilização é interessante definir o conceito de morte associado aos microrganismos. Um microrganismo é definido como morto quando não mais prolifera em meios de cultura onde usualmente isto ocorria: considera-se como forma de constatação a turbidez de meios líquidos ou o surgimento de colônias em meios sólidos. Um organismo único deve ser capaz de proliferar através de muitas gerações para ser detectado, portanto um microrganismo que não possa se reproduzir, ou possa fazê-lo apenas poucas gerações, pode por este critério ser considerado morto. Na prática, não se dispõe de meio de cultura que seja ideal ao desenvolvimento de qualquer cepa microbiana. Ademais, organismos que sobreviveram a um potencial processo letal apresentam requisitos metabólicos específicos, podendo não ser recuperados em meios de cultura usuais (BLACK, 2002).

23 Outra consideração a ser feita é que organismos expostos a agentes letais não morrem todos simultaneamente. O seu número decresce exponencialmente com o tempo de exposição; portanto a ausência de todos os organismos viáveis irá ocorrer num tempo infinito de exposição ao agente. Esterilidade é, portanto um estado absoluto e que não  pode ser garantido. Ainda que cuidadoso planejamento do processo esterilizante seja desenvolvido, apenas aumenta a probabilidade de sucesso no sentido da esterilidade (PELCZAR & REID, 1997). A inativação de microrganismos por agentes esterilizantes envolve dano irreversível de moléculas essenciais à célula. Da mesma forma, a exposição a estes agentes pode provocar danos ao produto. Particularmente nas formas de dosagem farmacêutica em que o risco envolve redução da atividade terapêutica, ou outros danos específicos graves, é freqüentemente necessário assumir um compromisso entre o nível de garantia de esterilidade ou Sterility Assurance Levei (SAL) aceitável e o máximo efeito adverso sobre o material (PINTO et al., 2000).

5.4. TESTE DE ESTERILIDADE Embora a terapêutica parental tenha tido origem no século passado, o primeiro método oficializado do teste de esterilidade foi na Inglaterra em 1932. Este teste exigia a execução em produtos sob a forma líquida, mediante utilização do caldo peptonado e incubação a 37° C durante cinco dias, com vistas à detecção de bactérias aeróbicas (SAITO et al., 1985). Mais tarde, em 1936, a USP1 XI adotou a mesma metodologia, de maneira a aumentar a credibilidade dos resultados. Na edição seguinte, de 1942, o recurso analítico foi modificado para permitir o desenvolvimento de microrganismos aeróbicos e anaeróbicos, bem como de microaerófilos. Na USP XIII, a preocupação se estendeu  para detecção de fungos, utilizando-se de meio de cultura contendo mel, com incubação a 22°- 25° C, durante quinze dias. A inovação marcante ocorreu no fim da década de 1960, com a introdução do método de inoculação indireta da amostra, inclusive 1

 USP – UNITED STATES PHARMACOPEIA.

24 com a adoção do sistema fechado na Farmacopéia Européia em 1976 e na USP de 19 80 .  No Brasil, a metodologia da segunda edição da Farmacopéia Brasileira era explicitas nos mesmos moldes da USP, visto ser tradução integral da mesma. Na última edição foram incorporados detalhes e cuidados no que diz respeito ao procedimento, mantendo-se,  porém, o período de acordo com a edição anterior, ou seja, 7 dias no caso do método indireto (filtração) e 14 dias para o método direto (SAITO et al., 1985). Como pode ser observado, pela evolução da metodologia, a preocupação inerente à melhoria de teste de esterilidade visa verificar com mais segurança a qualidade do processo esterilizante empregado durante a fabricação de medicamentos estéreis, bem como manipulações assépticas, levando-se em consideração o aspecto probabilístico da esterilização (SAITO et al., 1985).

5.4.1. Amostragem Sendo o teste de esterilidade um ensaio limite, exige-se critério de amostragem que procure oferecer segurança no resultado final, quando extrapolado ao lote. Portanto, a retirada de amostras a serem submetidas ao teste deve estar relacionada com a fase de  processamento, visto que este ensaio complementa as informações sobre a perfeita execução de cada processo operacional esterilizante e/ou manipulação (SAITO et. al., 1985). A segurança do resultado do teste será maior quanto maior for a quantidade das amostras ensaiadas, quando outros parâmetros são obedecidos, controlados ou comprovados como eficazes. Entretanto, como existem problemas de ordem prática e econômica é interessante estabelecer, no critério de amostragem, quanto de cada lote deve ser submetido ao teste (SAITO et. al., 1985). Convém salientar que o conceito de lote ou partida é diferente do aspecto legal, devendo referir-se ao total de unidades com igual risco de contaminação. Em se tratando de matéria prima, cada embalagem deve ser submetida à amostragem. Por outro lado, a abertura de todos os frascos de matéria-prima estéril nem sempre é possível, quer sob o aspecto de segurança, quer sob o aspecto econômico e de praticidade. Segurança, porque normalmente trata-se de barricas, vidros ou outros tipos de recipientes lacrados e o fato de abrí-los

25 implicaria na possibilidade de introdução de contaminantes viáveis, ainda que com todos os cuidados de amostragem (PINTO et al., 2000). Se o teste de esterilidade for executado em produtos a granel (bulk ), oriundos de manipulação totalmente asséptica ou de filtração esterilizante, há de se efetuar amostragem de cada recipiente, visto que cada um apresenta condição particular de risco de contaminação. Esta amostragem deve ser criteriosa quando o produto for suspensão, além de tomar todos os cuidados de manipulação asséptica, no sentido de não alterar a homogeneidade da dispersão. A prova de esterilidade nesta etapa de fabricação é omitida por muitos fabricantes, preferindo correr o risco de rejeição do produto na fase final. Outros recorrem a esta omissão fundamentada num histórico anterior, cujas condições gerais de local de fabricação, bem como os procedimentos padronizados na sua manipulação foram constatados como seguros (FISCHER et al., 1996; PINTO et al., 2000). A 24ª edição da UNITED STATES PHARMACOPEIA (2000) passa a apresentar tabelas contendo valores mínimos de unidades a serem testados para distintos tamanhos de lotes de injetáveis de pequeno e grande volume, antibióticos, produtos não injetáveis, e sólidos, com particularidades para antibióticos. Também introduz tabelas indicativas de quantidades a serem amostradas dos recipientes, no caso de produtos líquidos e sólidos. A amostragem de ampolas esterilizadas em autoclave deve ser realizada após o teste de vazamento ou integridade, a fim de se evitar resultado falso-positivo. Outros cuidados devem ser observados quanto à localização do material na autoclave, visto que  pode haver zonas mortas no seu interior. Este problema torna-se muito mais crítico quando se trata de injetáveis de grande volume, pois há a probabilidade de o aquecimento não ser tão uniforme em todos os frascos de uma carga de autoclave (CRISTÁLIA, 2005).

5.4.2. Preparo da Amostra A execução do teste de esterilidade em produtos farmacêuticos deve ser precedida de preparação das amostras, de maneira a se evitar resultados falsos (CRISTÁLIA, 2005). Consiste em efetuar um tratamento, visando desinfecção da superfície externa dos frascos, ampolas, ou outros materiais de acondicionamento e ou embalagem, pelo uso de soluções anti-sépticas voláteis ou não, tais como fenol a 5%, álcool iodado,

26 formaldeído a 5%, álcool isopropílico, etc. Este tratamento, em função da natureza da substância e da concentração utilizada, exige um tempo de contato, que deve ser determinado experimentalmente frente aos contaminantes mais prováveis de estarem  presentes nestas amostras. Além disto, a eficiência dessas soluções deve ser comprovada  periodicamente (CRISTÁLIA, 2005).

5.5. MÉTODOS DE INOCULAÇÃO 5.5.1. Inoculação Direta São adotadas duas possibilidades de inoculação da amostra ao meio de cultura sendo as razões para o emprego de uma ou outra técnica decorrentes de fatores diversos como facilidade e disponibilidade circunstanciais, além da eficiência desejada ou limitações de ordem econômica(LEITE, 1998). Qualquer que seja a forma de inoculação da amostra, entretanto, é fundamental que se avalie e comprove a não interferência ocasionando falso-negativo. Para tanto, a  prática consiste em promover inóculo de 10 a 100 unidades formadoras de colônia (UFC) de cepas determinadas, em série de tubos de meio de cultura contendo amostra (condição do teste), paralelamente à série de tubos sem amostra residual (representando a capacidade promotora de crescimento do meio de cultura). A forma de comprovar a não interferência da amostra sobre o resultado analítico, etapa fundamental para a validação da metodologia é constatando após o tempo de incubação de sete ou quatorze dias nas condições definidas, equivalência de turbidez entre o tubo contendo ou não amostra (LEITE, 1998). Este foi o método utilizado desde a oficialização inicial da prova de esterilidade em 1932 e tem sido aplicado até os dias atuais. Consiste na inoculação de quantidades ou volumes pré-estabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de cultura, na forma líquida ou mediante semeadura da amostra em nutriente sólido. Portanto, com esta técnica deve haver, de cada unidade, uma tomada de ensaio, a qual será introduzida num tubo de ensaio ou frasco contendo meio de cultura previamente

27 esterilizado e controlado quanto à ausência de contaminação e comprovado quanto à capacidade promotora de crescimento (SAITO et al., 1985). Todas as farmacopéias indicam alíquotas a serem transferidas para o meio de cultura a partir de cada unidade integrante da amostra representativa do lote. Evidentemente que quando o volume é pequeno, de 0,5 a 1,0 mL, geralmente se recomenda a tomada integral desta quantidade, mas conforme aumenta-se o volume efetua-se apenas uma tomada parcial. O método de inoculação direta é simples e de fácil execução, porém, conforme a natureza da amostra exigem-se recursos intermediários, a fim de que o resultado do teste seja válido (CRISTÁLIA, 2005). Amostras semi-sólidas hidrossolúveis são facilmente testadas, mediante fluidificação das mesmas com líquidos fisiológicos. Amostras sólidas ou líquidas, constituídas por substâncias antimicrobianas devem ser testadas mediante critérios corretos, procurando-se impedir a interferência desta atividade intrínseca no crescimento dos contaminantes eventualmente presentes. Enquadram-se aqui todos os produtos contendo conservantes, por serem de dose múltipla, ou única, como nos casos dos imunobiológicos. No caso de fármacos antimicrobianos, quando existem inativadores específicos que sejam compatíveis com a fisiologia do microrganismo, estes devem ser  previamente neutralizados. Quando as substâncias ativas antimicrobianas não oferecem  possibilidades para inativação específica, deve-se recorrer a outros processos. A  possibilidade que se apresenta consiste na diluição prévia da amostra, de modo que a concentração desta substância no meio de cultura seja inferior à concentração mínima inibitória, e desta forma incorrendo na baixa representatividade de amostragem (CRISTÁLIA, 2005). Para segurança dos resultados do teste, após o período de incubação, recomenda-se a comprovação da eficiência do sistema inativador pela inoculação de microrganismos  padrão. Estes em número inferior a 100 microrganismos por tubo. Podem ser representados por Clostridium sporogenes. São ainda recomendados Sacharomyces cerevisae

e  Micrococcus luteus, tendo em vista o espectro de sensibilidade ser mais

amplo (LEITE, 1998). Quando a amostra a ser testada está sob a forma de suspensão ou se trata de pó insolúvel no meio de cultura, este aspecto pode trazer problemas na observação, não

28  permitindo distinção entre a turvação original e a resultante do crescimento microbiano. Neste caso, certifica-se da presença de contaminante viável mediante a subcultura executada entre terceiro a sétimo dia de incubação. Esta sub-cultura pode ser efetuada em meio líquido de mesma natureza ou também por semeadura em meio sólido. Como alternativa pode-se recorrer à observação microscópica da suspensão, mas é cansativa e falha (PINTO et al., 2000). A limitação do método de inoculação direta reside na probabilidade de se aprovar um lote contaminado, devido à amostragem restrita e risco de atividade inibitória exercida  pelo residual do produto. De forma resumida pode-se apontar como vantagens da inoculação direta a sua simplicidade e histórico de uso, pouca manipulação, requer pouco treinamento e caracteriza-se por baixo nível de contaminação acidental. As suas desvantagens são baixa representatividade da amostra, consumo elevado de meios de cultura e de vidraria, possibilidade de resíduos de agentes inibitórios, tempo de incubação, restrição para volumes a partir de 100 mL e interferência da turbidez do  produto,

embora

contornável

por

sub-cultura

ou

reação

físico-química

(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2000).

5.5.2. Inoculação Indireta ou Filtração A técnica de inoculação indireta foi introduzida em 1957 por Holdowsky e seguida de estudos por diversos pesquisadores. Baseia-se no tratamento prévio da amostra com solubilização ou lavagem em líquidos fisiológicos, seguida de filtração esterilizante e inoculação da membrana filtrante ao meio de cultura. Com isto, o produto a ser testado não entra em contato com o meio de cultura. Em 1964, esta técnica foi introduzida como oficial, tendo sido adotada nos Estados Unidos da América do Norte, constando em USP, além de outras farmacopéias, bem como mantida nas edições subseqüentes (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 1995). Este método foi no início aplicado especificamente para substâncias antibióticas,  principalmente aquelas que não podiam ser inativadas com vistas ao teste por inoculação direta. Em 1964, muitas vantagens do método eram mencionadas, embora ainda não estivesse universalmente oficializado. Dados comparativos entre a inoculação direta e indireta de antibióticos mostravam grande eficiência na detecção de

29 contaminantes viáveis nestes produtos, quando testado pelo método de filtração (PINTO et al., 2000).

A membrana filtrante empregada é geralmente constituída de ésteres de celulose, com diâmetro de 47 mm, de borda hidrófoba e tamanho de poro de 0,45 ± 0,02 µm. Existe certa divergência na escolha de filtros para uso industrial e laboratorial de teste,  pois, no primeiro caso emprega-se, geralmente, o de 0,22 µm enquanto que em provas de esterilidade o de 0,45 µm O comparativo das características das membranas de 0,22 µ

m e 0,45 µm apontam para a primeira uma retenção "absoluta", importante na obtenção

de filtrado estéril, porém uma vazão lenta. A membrana de 0,45 µm é ainda eficaz na retenção de microrganismos, com a vantagem de ser também adequada para a preservação da viabilidade, pois compatibiliza melhor com a morfologia e fisiologia celular. Daí ser a opção de escolha para o teste de esterilidade (SAITO et al., 1985). Os sistemas filtrantes empregados no controle de qualidade de medicamentos  podem ser múltiplos ou unitários, necessitando, basicamente, de porta-filtro e recipiente  para transferência da amostra ou líquidos de lavagem. O filtrado a ser recolhido poderá ser coletado em frasco coletor único ou individualizado. O processo de filtração é efetuado sob pressão negativa, com valor máximo da ordem de 70 cm de Hg e vazão da ordem de 55 a 75 mL por minuto. Portanto, as amostras devem ser hidrossolúveis ou solúveis em solventes apropriados (FISCHER et al., 1996). As quantidades estabelecidas de amostra podem ser transferidas para recipiente contendo água peptonada 0,1% a fim de proceder à dissolução e ou diluição da mesma e submeter esta solução à filtração. A insolubilidade de alguns produtos em água peptonada exige introdução de certos recursos. Após filtração da amostra deve haver lavagem da membrana com solução peptonada contendo os inativadores específicos ou solubilizantes, a fim de que quantidade residual de antibiótico não seja transferida juntamente com a membrana, para o meio de cultura (FISCHER et al., 1996).  No caso de se empregar sistema fechado, como Steritest® ou equivalente, dispensa a preocupação do corte ou transferência da membrana, uma vez que a mesma está inserida no cartucho e permanece após a filtração do produto e lavagens, recebendo então o meio de cultura sem que tenha de ser deslocada ou manuseada.

30 Esta situação constitui-se em grande vantagem de facilidade operacional e segurança do teste (PINTO et al., 2000). A prova de esterilidade, como qualquer outro processo analítico, impõe a necessidade de controle do próprio teste, sendo neste caso através de controles negativo e positivo, além do acompanhamento das condições do ambiente durante sua execução (CRISTÁLIA, 2005). Buscando-se resumir também para o método indireto as características negativas e  positivas, deve-se dizer que como desvantagens apresenta maior nível de manipulação e  preparações prévias exigem maior treinamento técnico, impedimento de aplicação para suspensões, óleos, cremes e pomadas não solubilizáveis e aumenta o risco de falso positivos. O emprego de sistema fechado reverte à situação em alguns aspectos, trazendo facilidade operacional, reduzindo treinamento necessário, permitindo que apenas um analista execute o teste e minimizando falso-positivos. As suas vantagens consistem em maior representatividade estatística, redução de falso negativos, redução no consumo de meios de cultura e abrangência a produtos com volumes de 1,0 mL até, por exemplo, 5,0 L (CRISTÁLIA, 2005). A finalidade do teste de esterilidade consiste em detectar microrganismos contaminantes em produtos que já sofreram algum tratamento esterilizante, durante o ciclo de fabricação. A partir deste estágio deve ser manipulado assepticamente, a fim de não violar a sua esterilidade. Portanto, não é do conhecimento do analista qual é o contaminante viável residual ou agente de recontaminação do produto, antes de efetuar o ensaio. Por esta razão a escolha do meio de cultura é de vital importância no sentido de oferecer condições ideais para multiplicação de microrganismos, os mais diversos, com exigências diferentes para seu crescimento. Além disso, o contaminante foi submetido a condições adversas quando o processo esterilizante é por morte, seja de ação química ou física (FISCHER et al., 1996). Atualmente, os códigos farmacêuticos adotam métodos que requerem utilização de meios de cultura, sob a forma líquida, capazes de promover o crescimento de bactérias mesófilas e psicrófilas, além de fungos (SILVA, 1997). Desde a introdução inicial da metodologia em 1932, diversos nutrientes foram  propostos e adotados, através das revisões constantes das farmacopéias, sempre

31  procurando oferecer condições que abrangessem o crescimento de maior gama de contaminantes (UNITED STATES PHARMACOPÉIA, 1995). Estudos comparativos entre diversos meios de cultura têm demonstrado que o meio de tioglicolato pode inibir o crescimento de algumas cepas de  Ba ci ll us e Clostridium,

sugerindo sua substituição por ditionito-tioglicolato, também conhecido

como meio de Clausen. Verificou-se efeito inibitório de tioglicolato quando testado frente a 22 cepas de Clostridium, tendo sido comprovada sua ação inibitória sobre quase todas. Isto não aconteceu quando ditionito de sódio foi adicionado ao meio fluido contendo ambos os gêneros, seja o inóculo sob a forma vegetativa ou esporulada, acusando não serem afetados pela composição do meio. A toxicidade devida ao tioglicolato pode estar sendo influenciada por outros constituintes do meio, conseguindo-se eliminar tal ação no caso de associação ditionito-tioglicolato. Além disto, o ditionito age como estabilizante do tioglicolato, permitindo que o meio apresente condições ótimas para sua utilização durante dois meses, quando armazenado em refrigerador (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1998). A constatação da presença de leveduras e bolores em produtos estéreis teve início em 1942, quando a USP introduziu um meio contendo mel. Modificações posteriores foram sugeridas, aparecendo o meio de Saboraud, por sua vez com outras alterações. Posteriormente, a mesma introduziu o emprego do meio de caseína-soja como substituto de Sabouraud (UNITED STATES PHARMACOPÉIA, 2000). A Organização Mundial da Saúde, em 1972, recomendava que se revisasse melhor as especificações inerentes aos meios de cultura para teste de esterilidade, bem como se estabelecesse prova mais sensível para os fungos, sugerindo, também, que se efetuasse o ensaio prévio dos meios empregados para o teste de amostras (KOROLKOVAS, 1988). Outra preocupação inerente aos meios de cultura reside na comprovação de sua eficácia ou capacidade promotora de crescimento, o que deve ser verificado, pelo menos para cada lote do mesmo. Ainda, como o nosso país depende da sua importação, há que se pensar na possibilidade de condições distintas entre diferentes embalagens do mesmo lote, ocasionadas por transporte e ou armazenamento em condições adversas (KOROLKOVAS, 1988).

32 De modo geral, as farmacopéias recomendam inoculação de 10 a 100 unidades formadoras de colônias (UFC) microrganismos viáveis podendo ser de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Bacteroides vulgatus, Plectridium sphenoide,

entre outros. Incubar todos os tubos nas condições

idênticas do teste propriamente dito e observar o aparecimento de turvação até o sétimo dia para um controle positivo (CRISTÁLIA, 2005). O tempo de incubação de cinco dias, conforme o primeiro método oficial de 1932,  persistiu durante outras revisões. Entretanto em 1927, já se dava ênfase para necessidade de sete dias para incubação a 37 °C. No decorrer das revisões farmacopéicas houve mudanças, passando a se adotar período de sete, dez e quatorze dias de incubação. Entretanto, a USP de 2000 amplia o tempo de incubação para 14 dias para casos de inoculação indireta, exceto quando a esterilização térmica tenha sido empregada no  produto terminado (SAITO et al., 1985). O resultado do teste de esterilidade, desde a época de sua oficialização, foi fundamentado em observação macroscópica do crescimento microbiano, manifestado sob a forma de turvação do meio líquido ou aparecimento de colônias no meio sólido. A decisão da FDA2 é de que se um tubo apresentar contaminação deve-se proceder o reteste, usando 40 unidades do produto. Se acusar algum crescimento deve-se efetuar o segundo reteste, sendo que para aprovação do lote não deve haver crescimento nos tubos deste reteste (SAITO et al., 1985). Em se tratando de prova de esterilidade com auxílio do processo filtrante da amostra, o controle negativo efetuado pelo menos para cada dia de trabalho, abrangendo o ciclo de esterilização de todo material empregado no teste, tem grande importância na interpretação do resultado. O aparecimento de turvação em qualquer dos meios de cultura contendo a membrana deve ser motivo para novo teste. Os mesmos critérios discutidos para caso de inoculação direta são válidos na decisão que aprova ou rejeita um lote quanto ao teste de esterilidade (CRISTÁLIA, 2005). Outros tipos de métodos rápidos têm sido considerados, permanecendo, entretanto como preocupação a questão de tempo de recuperação envolvido para proliferação de microrganismos submetidos a danos ou estresses decorrentes do próprio processo 2

 FDA – Foog and Drugs Administration

33 industrial, prejudicando a manifestação da viabilidade e dessa forma conduzindo a resultados falso-negativos (CRISTÁLIA, 2005).

5.6. CONTROLE DA EFICIÊNCIA DE ESTERILIZAÇÃO Com o intuito de cada vez mais se assegurar a eficiência dos processos esterilizantes, visto que o próprio teste de esterilidade numa amostra representativa não tem condição absoluta de informação sobre a esterilidade do conjunto das unidades submetidas ao processo, foi introduzido o uso de indicadores de esterilização (ALBERT et al., 1989).

O emprego de indicadores físicos, químicos e biológicos é citado como recurso de controle do processo esterilizante. Indicadores físicos baseiam-se em temperatura de fusão dos mesmos, com alteração de cor, quando a autoclave ou o forno atinge uma determinada temperatura. O inconveniente destes casos pode estar no fato de não indicarem por quanto tempo o material interno esteve submetido àquela temperatura de fusão, embora já se tenha chegado a indicadores com gradientes de coloração em função desse tempo (BAIRD, 1986). Evidentemente, os indicadores mais aconselhados são os biológicos. Estes são esporos de cepas de microrganismos devidamente selecionados quanto à resistência ao  processo esterilizante. Portanto, devem ser espécies menos susceptíveis a um determinado processo, seja físico ou químico. A utilização destes microrganismos, na forma viável, concomitantemente à operação industrial esterilizante, dá provas mais seguras sobre a eficácia do tratamento. Esta comprovação é verificada quando são oferecidas aos indicadores condições adequadas para seu crescimento (BAIRD, 1986; PINTO et al., 2000). A ausência de crescimento é indicação de que o processo foi eficiente sobre os microrganismos, podendo-se considerar tal fato abrangente aos contaminantes normais do produto. Permite-se, então, afirmar que houve eficiência esterilizante do processo empregado (BLACK, 2002). A eficiência de um processo esterilizante pode ser medida de três maneiras: pelo histórico do processo contendo diversos dados, pelos estudos de inativação de uma série

34 de microrganismos e pelo uso de indicadores biológicos. O primeiro método é aplicável quando todos os parâmetros são conhecidos e estabelecidos, como ocorre na esterilização por calor úmido. Evidentemente que estes parâmetros devem ser estabelecidos para cada processo, mediante estudo de cinética, sendo uma das maneiras mais indicadas a de construir curvas de inativação de diversos microrganismos,  particularmente dos mais resistentes a este processo escolhido, em função da compatibilidade do material a ser esterilizado. Esta é a situação de maior aplicabilidade para a liberação paramétrica dos produtos (CRI STÁLIA, 2005). A utilização de indicadores biológicos deve ser criteriosa, inoculando-se o próprio  produto com os mesmos, de modo a assemelhar-se ao máximo à condição em que se encontra o contaminante natural frente ao processo. É por isto que se deve conhecer o estado de contaminação em que se encontra o produto, antes de ser submetido à esterilização, de modo que o indicador seja, em número e resistência, superior ao viável natural. Convém frisar que quanto maior o número de inóculos, tanto maior será a confiabilidade do resultado (CRISTÁLIA, 2005). A validação do método deve ser estabelecida e documentada, demonstrando inclusive as características de exatidão, sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade. Inclui etapas de qualificação da instalação, operacional, do desempenho e do método de teste (LEITE, 1998). Quando se discutem diversos aspectos analíticos do teste de esterilidade, observa-se que no decorrer das últimas décadas houve uma evolução na metodologia. Entretanto, existem ainda pontos fundamentais que constituem a limitação do método, no que diz respeito à segurança de informações. A falta de certeza absoluta quanto ao estado de esterilidade do total de unidades pertencentes ao lote é uma questão de inferência estatística, razão pela qual o critério de amostragem é importante (LEITE, 1998). A probabilidade de rejeição ou aprovação de um lote industrial, fundamentada em amostragem de 20 recipientes, apresenta chance de 67% em considerar como estéril um lote cuja contaminação é de 2%. Por outro lado, um lote com 10% de unidades contaminadas

será

seguramente

100 itens (PINTO et al., 2000).

rejeitado

quando

a

amostragem

abranger

35 Em outras palavras, pode-se afirmar que com este número de amostras, a  probabilidade de aceitar o lote como isento de contaminação será zero. Logo, com menor número de unidades tem-se pequena probabilidade de rejeição como lote contaminado

e

maior

possibilidade

em

aceitá-lo

como

estéril.

Outras limitações de ordem prática e econômica persistem, pois a própria metodologia, empregada para evidenciar a presença de contaminante viável é falha, por não propiciar abrangência necessária quanto ao crescimento de todos os tipos microbianos (PINTO et al ., 2000).

 No que diz respeito ao reteste, por vezes executado sem a necessidade real, existem sempre envolvimentos do custo do mesmo, da revisão da documentação, além do desgaste oral e de relacionamento, e atraso nas vendas, podendo ser esta repassada a concorrentes (CRISTÁLIA, 2005). Devido às possíveis graves conseqüências para a empresa, mas também à questão ética, a tomada de decisão da liberação e do reteste, deve ser feita pelo gerente da área de controle ou garantia de qualidade, conforme o organograma da empresa, mas sempre com ciência e compartilhando responsabilidade com o farmacêutico responsável e a alta administração da empresa (ANSEL et al., 2000).

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6. TESTE DE PIROGÊNIO Embora o conhecimento científico que se tem sobre pirogênio tenha sido adquirido nos últimos 50 anos, o estudo sobre a febre, especulações sobre suas causas, mecanismos e efeitos são tão antigos quanto a medicina, datando de mais de 2.000 anos atrás. Os primeiros médicos gregos visualizavam a febre mais como mecanismo terapêutico que patofisiológico. A idéia de que a febre pudesse ter valor terapêutico sobreviveu por séculos, sendo que inicialmente injeções intravenosas de material  pútrido eram administradas a animais em caráter experimental. Em etapa subseqüente,  preparações altamente pirogênicas preparadas de células mortas de Salmonella typhosa foram empregadas como vacinas(PINTO et al., 2000).  Nem todos os autores viram a febre como benéfica; no início do século XIX dois farmacêuticos franceses, Pelletier e Caventue isolaram um antipirético, a quinina. Como resultado, estudos em animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e antitérmicos (FARMACOPEIA BRASIELIRA, 1998). Durante a última década do século XIX, Centanni conduziu estudos significantes quanto aos agentes responsáveis pela febre. Entre outros, ele descreveu um procedimento  para isolar a toxina bacteriana responsável pela ação febril. Mantendo culturas de bactérias Gram negativas sob autólise durante longos períodos, procedendo a filtração esterilizante e então submetendo a fracionamento em álcool, ele obteve pó branco altamente  pirogênico, a partir de larga variedade de bactérias. Centanni foi o primeiro a reconhecer a relação causa-efeito entre endotoxina (pirotoxina) e a febre. Ele foi também o primeiro a demonstrar o "terceiro tipo de imunidade", posteriormente chamada de tolerância  pirogênica, evidenciada após injeções repetidas de endotoxina. (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1998). Os microbiologistas demonstraram a seguir que as endotoxinas eram encontradas em muitas bactérias. Este trabalho foi grandemente facilitado pela descoberta de Gram em 1884, quanto a processo de coloração que recebeu seu nome. Os investigadores rapidamente aprenderam que endotoxinas estavam associadas exclusivamente a Gram negativas. Na passagem do século, vários pesquisadores estavam preocupados com febres que às vezes acompanhavam injeções, bem como outros efeitos colaterais

37 associados à administração parenteral de agentes terapêuticos. Porém a eliminação de  bactérias por esterilização térmica ou filtração não eliminava a pirogenicidade destas  preparações. O primeiro entendimento da assim chamada "febre das injeções" decorreu das investigações relatadas por Hort e Penfold em 1912 (FARMACOPEIA BRASIELEIRA, 1998). Estes pesquisadores foram os primeiros a planejar e padronizar o teste de pirogênio em coelhos. Com este teste, foram capazes de classificar bactérias em pirogênicas e não  pirogênicas, o que as correlacionava com o esquema Gram de classificação bacteriana. Culturas mortas foram comparáveis às viáveis quanto à indução de febre. Também, estes  pesquisadores demonstraram que a pirogenicidade de água destilada era relacionada à concentração bacteriana. Eles concluíram que uma substância termoestável era a  provável causa das febres de injeção (FARMACOPEIA BRASIELEIRA, 1998). Os pirogênios são divididos em duas classes. Exógenos são aqueles que se originam fora do corpo e induzem elevações térmicas quando injetados em animais e no homem. Embora o lipopolissacarídeo (endotoxina) seja o mais significativo, há outros produtos, de constituição química diversa, que também produzem elevação de temperatura quando injetados sob condições apropriadas. Como fonte de pirogênio exógeno menciona-se grande variedade de origens, desde bacteriana, de fungos e vírus, bem como componentes de bactérias Gram negativas e de bactérias Gram positivas, assim como  pirogênios não microbianos, como alguns fármacos, esteróides, frações do plasma, e o adjuvante sintético muramil dipéptide (PINTO et al., 2000). O pirogênio endógeno (PE), entretanto é produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênios exógenos. O pirogênio endógeno consiste de substância homogênea, sintetizada por diferentes células do hospedeiro após exposição ao  pirogênio exógeno, sendo considerado o mediador primário da febre (PINTO et al., 2000).

6.1. ENDOTOXINAS As endotoxinas são complexos de alta massa molecular associados à membrana externa de bactérias Gram negativas, e se constituem na mais significante fonte

38 de pirogênio para a indústria farmacêutica. Endotoxinas não purificadas podem conter lípideos, carboidratos e proteínas, porém quando purificadas são denominadas de lipopolissacarídeos (LPS) para enfatizar sua natureza química. Por isso, como nos  produtos farmacêuticos podem ser encontradas unidades não purificadas nas fases em  processo ou nos produtos terminados, prefere-se a terminologia de endotoxinas (BLACK, 2002). Suas características de universalidade, relativa estabilidade térmica, e capacidade de  provocar profundas alterações fisiológicas quando administrada via parenteral tornam sua detecção e eliminação um considerável desafio ao produtor de parenterais, de artigos vinculados à sua administração ou de próteses (PINTO et al., 2000).

6.2. NÍVEIS PIROGÊNICOS A questão de níveis pirogênicos torna-se crucial ao considerar os limites de liberação para os produtos farmacêuticos. Em 18 de janeiro de 1980, o Bureau of Drugs  publicou um ensaio cujo título era Guidelines for Validation of the Limulus Amebocyte  Lysate Test as an End-Product Test for Human and Veterinary Injectable Drugs and  Medicai Devices.

Este documento estabeleceu 50,0 pg/mL (0,5 ng/Kg) como limite

final de liberação de produtos farmacêuticos não intratecais. Posteriormente, foi  proposta redução para 35,0 pg/mL (PEARSON, 1985). Quando considerado sob evidência científica, 100,0 pg/mL é um limite de liberação aceitável para parenterais de grande volume e proporciona um significante fator de segurança sobre o teste de pirogênio em coelhos, segundo a USP. Conseqüentemente, foi sugerida a reavaliação do  Bureau of Drugs no sentido do estabelecimento de 100,0 pg/mL (1,0 ng/Kg) como limite final de liberação para endotoxinas em parenterais de grande volume (PEARSON, 1985). É importante ter em mente que, quando o teste oficial em coelhos foi desenvolvido, não houve tentativas no sentido de definir os níveis de endotoxina que fossem  pirogênicos a coelhos ou humanos. Em 1956, Westphal obteve resultados indicando que a dose pirogênica mínima de endotoxina purificada de Salmonella abortus equi  por kilograma foi comparável em humanos e coelhos. Estes resultados foram confirmados por

39  pesquisadores que reconheceram a importância de determinar a sensibilidade relativa de coelhos e humanos a várias endotoxinas, uma vez que o teste de pirogenicidade era feito objetivando segurança no uso de medicamento parenteral em humanos (PEARSON, 1985). Um trabalho do Limulus Amebocyte Lysate Task Force, desenvolvido pela Parenteral  Drug Association (PDA)

permitiu obter dados importantes para a confirmação e ampliação

dos estudos anteriores, e inclusive inferir que, sob condições ótimas, a sensibilidade do teste de pirogênio em coelhos USP se aproximava de 1,0 ng da endotoxina comercial E. coli,  podendo

este valor ser tomado como ponto de referência para limites de endotoxina

em parenterais de pequeno volume. Infelizmente o trabalho não se estendeu a parenterais de grande volume (DABBAH et al., 1980). Os limites atualmente considerados aceitáveis para endotoxina bacteriana são: para  produtos farmacêuticos e biológicos 5 UE/Kg; radiomarcadores 2,5 UE/Kg; parenterais de grande volume 0,5 UE/mL; água para injeção 0,25 UE/mL; drogas intratecais 0,2 UE/mL; correlatos até 200 UE/unidade e correlatos intratecais 0,06 UE/unidade (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

6.3. PIROGÊNIOS DE FONTES DISTINTAS Adicionalmente às endotoxinas de bactérias Gram negativas, uma variedade de outras substâncias produzem reações pirogênicas. A maioria das cepas de estreptococos grupo A  produz toxinas eritrogênicas que causam avermelhamento da pele. Esta exotoxina é comprovadamente uma potente fonte de pirogênios. Adicionalmente à produção de febre, a exotoxina estreptocócica também desenvolve suscetibilidade ao choque endotóxico letal, entre outros efeitos (PEARSON, 1985).  Mycobacterium tuberculosis

é também produtora de duas substâncias pirogênicas,

além de ser a principal causa de tuberculose em humanos. Esta bactéria pode produzir febre  pela interação com fagócitos, granulomas reativos ou via reação sistêmica (PEARSON, 1985).

40 Embora enterotoxinas estafilocócicas estejam mais associadas com envenenamento agudo por alimentos, são também potentes pirogênios com atividade em coelhos, a partir de 1 mg/Kg. Em adição a enterotoxina estafilocócica, outras exotoxinas pirogênicas têm sido isoladas de Staphylococcus aureus (PEARSON, 1985). Vírus são provavelmente responsáveis por mais episódios pirogênicos em humanos que qualquer outro agente isolado. Leucócitos de coelhos têm sido incubados na presença de vírus, mas os mecanismos envolvidos permanecem não esclarecidos. Injeção intravenosa de vários tipos de vírus em animais induz a produção concomitante de pirogênio endógeno e interferon, que eventualmente sejam coincidentes (PEARSON, 1985). Quanto aos fungos, também têm se mostrado altamente pirogênicos quando injetados via intravenosa em animais experimentais, permanecendo não claro o mecanismo indutor.Devem adicionalmente ser consideradas as fontes não microbianas de pirogênio,  particularmente a indução por fármacos como alguns antibióticos e esteróides, e  polinucleotídeos como o ácido polinosinico-policitidílico (PEARSON, 1985).

6.4. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO A despirogenização pode ser obtida de duas formas, seja pela inativação ou remoção das endotoxinas. A inativação pode ser obtida pela detoxificação da molécula material de acondicionamento, os demais são extremamente específicos ou apenas se justificam em medicamentos ou produtos biológicos de altíssimo valor agregado (PELCZAR & REID, 1997). Deve permanecer muito fortemente sedimentada a importância de trabalhar todo o  processo produtivo em condições adequadas de higiene, dos operadores e ambiente, além de empregar matérias primas com baixas cargas microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado. Em suma, aplicar todos os conceitos de Boas Práticas de Fabricação, de forma que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, dispensando  preocupações quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais (ABIFARMA, 1978).

41 Todas as etapas críticas devem ser monitoradas, por exemplo, com controles  periódicos de águas armazenadas, ainda que na condição ideal de temperatura mínima de 80 °C, sob agitação, ao menos três vezes ao dia. No caso da água recém destilada, nunca utilizá-la sem um teste prévio quanto a endotoxinas. Da mesma forma, validar  periodicamente estufas ou túneis de despirogenização, respeitando atendimento de um mínimo de três reduções decimais na concentração de endotoxinas (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000). Todas as monitorações de processo, assim como testes de matérias-primas, com  particular atenção às de origem natural, e do produto terminado, devem empregar técnicas analíticas validadas, seja com a metodologia clássica empregando coelhos ou diferentes métodos empregando a técnica in vitro do LAL3 (CRISTÁLIA, 2005).

6.5. TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO Desde 1954, tem havido congressos e simpósios em que se discutem as questões inerentes à metodologia oficial para detecção de substâncias pirogênicas. Nestes últimos anos a preocupação está se voltando, cada vez mais, a derivações, detalhamentos e ampliação do método alternativo in vitro, que já ganhou confiabilidade, mas enfrenta ainda limitações, sejam reais ou derivadas do desconhecimento. Dentro de perspectivas realísticas, o teste de pirogênio em coelhos, apesar de delegado apenas a situações às quais não é aplicável a metodologia alternativa, deve ser mantido. Terá sempre a seu favor a situação privilegiada do envolvimento de toda a reação fisiológica do animal, constituindose não apenas em teste de pureza para substâncias pirogênicas, mas também em teste de segurança para os produtos injetáveis, líquidos para infusão e perfusão, materiais cirúrgicos e descartáveis em geral (EUROPEAN PHARMACOPEIA, 1997).

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 LAL – Limulus Amebocyte Lysate

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6.5.1. Fundamento do Método Apesar de algumas modificações, o fundamento do método permanece o mesmo desde sua oficialização. Alterações mais consistentes estão relacionadas com o número de animais, a chance de reteste antes da decisão final de rejeição, melhorias nas condições analíticas para condução do teste e outros, procurando minimizar a variação biológica e com isto aumentando a segurança do ensaio. É um ensaio limite, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra, mediante informações obtidas de um grupo de coelhos, e que devem atender a um nível padrão de estado febril. Cada grupo de animais recebe a injeção intravenosa da amostra e é observado durante um período, geralmente de 3 horas (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1998). Diferentes métodos oficiais farmacopeicos são semelhantes entre si, visto que consideram o número de animais com elevação térmica acima de um valor limite, normalmente estipulado para igual ou maior que 0,6 °C, ou a somatória de elevação térmica individual de todos os animais testados. Portanto, a elevação térmica de pelo menos 0,6 °C é considerada como decorrência da inoculação de dose pirogênica de material estranho. Sendo assim, quanto maior o número de animais, tanto mais segura será a decisão, por diminuir a variabilidade do reagente biológico. Porém, há que considerar os pontos referentes à praticidade e custos do ensaio (CRISTÁLIA, 2005). Quando se analisa critérios de interpretação necessária se faz à conceituação exata sobre a elevação térmica individual dos coelhos. As farmacopéias definem este valor como sendo a diferença entre a temperatura máxima após a injeção e a de controle, devendo ser valor positivo, e nos casos negativos considera-se zero.

6.5.2. Modelo Animal Entre os mamíferos experimentados como substrato biológico para a detecção de substância pirogênicas, o coelho foi considerado animal de escolha por diversas razões. Evidentemente que quando se pensa em utilizar a resposta hipertermizante como parâmetro deste ensaio, será de se esperar que o sistema termoregulador da espécie animal tenha as

43 mesmas características do ser humano. Além da semelhança qualitativa será necessária, também, a constatação da magnitude da resposta frente ao material pirogênico injetado (PEARSON, 1985).  No que diz respeito à sensibilidade das espécies, as informações iniciais são de que existe equivalência, desde que os coelhos sejam adultos. Por tais razões surgiu a limitação do peso corporal mínimo, geralmente de 1,5 kg, embora a primeira metodologia tivesse estipulado 1,0 kg. Este fato não está relacionado com a sensibilidade, mas com a  praticidade analítica. Se para injetáveis de grande volume a dose recomendada é de 10,0 mL/kg, a injeção de volumes maiores que 30,0 mL consome tempo maior que 4 minutos, necessitando de um tempo muito grande para a inoculação de 3 a 5 animais. Por isto, algumas raças de porte menor como a holandesa, Himalaia e polaca são preferidas. Apesar de não atender a este requisito, utilizam-se raças albinas, com orelha bem desenvolvida, como a neozelandesa (PEARSON, 1985). Cuidados devem ser tomados com a colônia de coelhos que esteja recebendo, constantemente, doses sub-pirogênicas de endotoxinas, e gradativamente tornando-se refratária a níveis de contaminação realmente pirogênicos. Em casos de dúvida deste tipo será aconselhável a constatação da reatividade, pelo menos de alguns deles, mediante injeção de padrão de endotoxina, de resposta conhecida. Ou, quando possível pela inclusão em cada grupo, de ao menos um animal não anteriormente utilizado em teste, a caráter rotineiro (PEARSON, 1985). As condições ecológicas do biotério de coelhos devem respeitar as exigências quanto à faixa de neutralidade térmica da espécie, com variação inferior a ± 3 °C, com instalações que permitam renovação de ar, além de barreiras acústicas, bem como para insetos e roedores estranhos. No caso de se dispor de biotério de manutenção, é importante a quarentena, para posterior introdução de animais externos à colônia para os testes. Toda vidraria empregada para o preparo das amostras, bem como para injeção intravenosa das amostras deve ser despirogenizada previamente, por tratamento térmico. As monografias recomendam 30 minutos a 250 °C ou 1 hora a 200 °C. Outra opção consiste em trabalhar com material apirogênico descartável, ao invés do convencional (CRISTÁLIA, 2005). Em vista das informações muitas vezes conflitantes, o importante é que os animais empregados em teste sejam sadios, e que apresentem facilidade de condicionamento para o

44 teste. Os animais permanecem presos em contendores, nos quais a imobilização se faz pela região cervical, permitindo que cada um assuma posição sentada e cômoda, pois, a imobilização total dos mesmos poderia induzir hipotermia ou mesmo hipertemia. A contenção dos animais surgiu em decorrência da massificação dos testes bem como da automatização no registro de temperatura retal, mediante inserção de par termoelétrico no reto do animal (PINTO et al., 2000). São sugeridos valores de oscilação térmica individual de 0,3 °C, sendo que animais que normalmente apresentam variação maior entre duas determinações consecutivas podem dar falso-positivo. O valor médio das determinações, para cada um, com dispersão de 0,2 °C será o limite de oscilação térmica fisiológica. Este limite será referência para o dia do teste, pois, nesta ocasião à temperatura de controle de cada animal deverá estar compreendida entre estes valores (PINTO et al., 2000).

6.5.3. Amostra Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetáveis, bem como os equipamentos de transfusão, infusão e todos os dispositivos implantáveis ou descartáveis empregados na terapia parenteral devem oferecer segurança ao paciente, sob o ponto de vista de contaminantes pirogênicos. Este aspecto engloba, além da contaminação tipo endotóxica, todo e qualquer contaminante estranho, capaz de ser detectado, pelo menos com o teste animal. Logo, tanto injetáveis de grande e de pequeno volume devem ser testados. Recentemente, produtos em forma de aerossol, para uso respiratório, estão sendo testados, podendo ser englobados na mesma exigência (BPF, 1990). Sabe-se, entretanto, que o potencial de periculosidade é maior quando se trata de injetáveis de grande volume, ou mesmo de pequeno volume, com uso exclusivo por via intravenosa. A diferença conceitual entre ambos varia conforme o país, sendo para alguns a  partir de 15,0 mL, enquanto que para outros de 50,0 mL. Produtos que contêm fármacos que atuam sobre o sistema termo-regulador, inibindo o estado febril, não permitem detectar a presença de contaminantes termogênicos. Se a reação biológica fosse apenas neste aspecto não haveria problemas, mas devido a outras reações tóxicas desencadeadas por  pirogênio, há que estar atento para a segurança do usuário, também nesses produtos (LACASA & VEGA, 1989).

45 Outros produtos incompatíveis com a metodologia animal são aqueles que contêm hipnóticos, anestésicos, gluconato de cálcio, alguns antibióticos como anfotericina e vancomicina, entre outros. Incluem-se também radiofármacos que naturalmente provocam aumento na temperatura corporal. Nestes casos, o teste em diluentes será importante. Da mesma forma, em radiofármacos de meia vida muito curta, o teste poderá ser realizado no  produto após o prazo de validade, a fim de obter informações de caráter preventivo para novos lotes a serem fabricados (CRISTÁLIA, 2005).

6.5.4. Coelho O manuseio dos animais durante o teste é fundamental para que estímulos adversos não acarretem, principalmente, a hipersensibilidade. No dia do teste deve-se suspender o fornecimento da alimentação, ou pelo menos durante o teste, mas o acesso à água pode ser livre, embora geralmente isto não seja efetuado em função das restrições encontradas nas instalações. Quando o animal é devolvido à gaiola, durante o tempo de observação, este  pode tomar água livremente. A preferência para não fornecimento da dieta desde a noite anterior ou pela manhã, nos casos de utilizar os animais pela manhã ou pela tarde, respectivamente, está relacionada com questões de ordem prática, pois, nos casos de manter o par termoelétrico no reto, este pode ser expulso juntamente com a eliminação das fezes (KOROLKOVAS, 1988). Quanto ao horário para execução do teste, se de manhã, tarde ou noite, não existem  pesquisas neste sentido, ficando a escolha do período ideal, na dependência da demanda e organização interna de cada laboratório. Cada animal, respeitado o período de descanso, deve ser pesado, colocado em contendor seguindo-se a introdução do par termoelétrico. Procede-se então a seleção dos coelhos, que consiste em determinar a temperatura corporal, de 40 a 90 minutos antes da injeção. Conforme a monografia, este valor resulta de uma única tomada de temperatura, ou é representado pela média de 3 determinações, a cada 30 minutos. Por sua vez, a diferença entre duas determinações consecutivas, no mesmo animal, não deve exceder de 0,2 °C. Outra exigência é que a dispersão da temperatura de controle, entre os animais de cada grupo, não deve ser maior que 1,0 °C, embora sejam valores compreendidos entre 38,0 e 39,8 °C. Outras monografias exigem, simplesmente, que a

46 temperatura de controle seja inferior a 39,8 °C. Se a tomada de temperatura for contínua, com registros gráficos durante o tempo que antecede a injeção da amostra, este recurso dará um referencial muito mais seguro do que a determinação única ou múltipla (CRISTÁLIA, 2005). A solução-teste deve ser injetada na veia marginal da orelha e registrar a temperatura corporal durante pelo menos 3 horas. As determinações, no caso descontínuo, ao menos 3, a intervalos de uma hora após a inoculação da amostra, ou em maior número, a intervalos de tempo menor. O ideal será o registro gráfico contínuo, cujo perfil da curva oferecerá melhores condições para a decisão final. Interpretam-se os dados experimentais, em confronto com a monografia adotada, possibilitando a disposição final como apirogênico,  pirogênico ou duvidoso (CRISTÁLIA, 2005).

6.6. DETERMINAÇÃO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS POR MÉTODO IN VITRO Desde 1885, observou-se que o sangue do  Limulus polyphemus, o caranguejo em forma de ferradura de cavalo, formava um coágulo em gel sólido quando removido do animal. Vários aspectos da coagulação foram estudados, com particular referência aos amebócitos, a única célula circulante encontrada no sangue do Limulus. Subseqüentemente, tomou-se conhecimento que bactérias marinhas, Gram negativas, provocavam uma doença fulminante nos caranguejos, caracterizada por extensiva coagulação intravascular e morte. Um derivado termoestável destas bactérias era responsável por esta coagulação (PEARSON, 1985). Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos que permitiram as seguintes conclusões: os amebócitos eram necessários para a reação, e sua lise acelerava a reação; quantidades de endotoxina eram inativadas na reação. Inicialmente, foi desenvolvido um ensaio sensível para endotoxinas no plasma humano usando o material lisado do amebócito do Limulus (PEARSON, 1985).

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6.6.1. Mecanismo de Reação Após Levin e Bang (apud   PEARSON, 1985) demonstrarem que a atividade de coagulação da hemolinfa do  Limulus residia no amebócito, trabalho de Young (apud  PEARSON, 1985) e colaboradores estabeleceram a natureza enzimática da reação induzida  pela endotoxina. Eles concluíram que a reação é dependente da ativação de enzima de alta massa molar pela endotoxina, que por sua vez gelifica proteínas coaguláveis de baixa massa molar. Esta reação é crítica na definição de um ponto final no teste LAL. A enzima de coagulação, de elevada massa molar, foi isolada a partir de lisado ativado pela endotoxina. Estudos posteriores demonstraram que a ativação depende também de Ca2+, e outros íons  bivalentes. A proteína coagulante de baixa massa molar, estudada por Solum, foi denominada de coagulogênio. Incluindo coagulogênio à enzima de coagulação ativada obtida do sangue de Tuchypleus tridentatus, outra espécie de caranguejo em forma de ferradura de cavalo, era produzido um gel protéico. As características das seqüências de aminoácidos levam a crer que coagulogênio e fibrinogênio derivem de um ancestral comum, sendo o primeiro um protótipo do fibrinogênio dos primatas (PEARSON, 1985).

6.6.2. Ponto Final de Gelificação O mais simples e amplamente usado dos procedimentos para detecção de endotoxinas  baseia-se na gelificação. Volumes iguais de reagente de lisado e solução-teste (0,1 mL de cada) são transferidos aos tubos-teste de vidro despirogenizado de 10 x 75 mm. A mistura é então suavemente homogeneizada e a seguir incumbada em banho de água a 37 ºC por uma hora, durante a qual os tubos não devem ser manuseados, a fim de não interferir na gelificação. O ponto final da reação é facilmente constatado pela remoção cuidadosa e individual dos tubos e sua inversão a 180 ºC. Se houver a presença de gel que se mantém sólido durante a inversão, a amostra é considerada positiva para endotoxinas. Quando conduzido desta forma, através da transformação do sistema sol em gel, o ensaio se constitui em teste limite, levando em consideração a sensibilidade do LAL empregado. Apresenta sensibilidade na faixa de 0,25 a 0,015 UE/mL (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

48 O ensaio pode ser usado para definir o nível de endotoxina de uma solução particular do produto. Diversas diluições 1:2 em duplicata são preparadas e o ponto final determinado. O nível de endotoxina é calculado multiplicando a recíproca da mais alta diluição da solução com ponto final positivo pela sensibilidade do LAL. Exemplificando, se a sensibilidade do reagente for de 0,010 ng/mL e a diluição do ponto final for 1:16, então a concentração de endotoxina será de 0,16 ng/mL. Este critério é particularmente útil na monitoração em processo, de materiais e da água. Permanece o método de escolha para testes em número reduzido ou não freqüentes, para que turvem ou com expectativa de resultado negativo (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

6.7. OUTROS MÉTODOS Outras técnicas têm também sido propostas, como ensaio da microdiluição, ensaio de LAL radiomarcado e fluorescente, todos provocando menor impacto, ao mesmo até o momento. A automação tem sido bastante estudada, permitindo ensaios de maior reprodutibilidade e rapidez. Interessante é a aplicação de sistema semi-automático cinético, (o teste emprega placas, leitor tipo Elisa e Software específico) que determina alterações seqüenciais na densidade óptica a intervalos de tempo de um minuto, permitindo o ensaio de 176 preparações de amostras no período convencional de uma hora. São comercialmente disponíveis preparações de reagente para esta técnica assim como equipamento, aumentando a sensibilidade de 60 a 250 vezes com relação ao método da formação de gel. O software automaticamente produz uma relação logarítmica entre o onset time  de cada  padrão e a concentração de endotoxina correspondente (PINTO et al., 2000). Também métodos distintos empregando LAL permitem a determinação de endotoxinas, como por exemplo, a espectrometria de massa e radioimunoensaio. Com a conscientização cada vez maior das indústrias farmacêuticas sobre as Boas Práticas de Fabricação de produtos injetáveis, está se prevenindo a contaminação indevida do produto  por substâncias termogênicas. Evidentemente que dentro deste espírito consideram-se,  principal e diretamente, as fontes de contaminação microbiana. Por estas razões, diversos estudos tentaram obter uma correlação entre pirogenicidade do produto terminado e o nível

49 de contaminação viável do produto no instante imediatamente anterior à esterilização,  porém com resultados conflitantes (PINTO et al., 2000). Outro fator importante que deve ser levado em consideração, procurando evitar a contaminação por pirogênio, é o tempo de manipulação e a fase de esterilização do produto, a fim de evitar altas contagens de microrganismos viáveis, que irão acarretar concentrações  pirogênicas, em função da termoestabilidade da endotoxina. Logo, outra preocupação deve estar voltada para a qualidade das matérias-primas, em particular aquela que esteja em maior proporção, muitas vezes a água. Neste caso, referindo-se à água para injeções, é muito mais fácil obtê-la apirogênica do que tentar a descontaminação do produto (CRISTÁLIA, 2005). Em vista dos fatos discutidos, o produtor de medicamentos deve estar atento aos  problemas que podem decorrer da qualidade inadequada dos mesmos, procurando por à venda aqueles comprovadamente eficazes e seguros ao paciente. Por outro lado, grande foi a evolução observada durante os últimos anos no âmbito bioanalitico, de forma a permitir metodologia in vitro que, exceto em raras exceções, é aplicável inclusive a produtos terminado (PINTO et al., 2000).

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7. CONCLUSÃO Pelo exposto pode-se observar que os problemas mais importantes do controle de qualidade de medicamentos são a identificação, pureza, estabilidade, legitimidade, dosagem, absorção e o aparecimento de novas substancias ativas. O controle de medicamentos, não é, sem duvida alguma, um processo estacionário; evolui sempre, de acordo com os problemas que vão surgindo. A analise microbiológica de medicamentos é um fator fundamental dentro da industria, pois com ela, os produtos comercializados estarão sempre isentos de microrganismos patogênicos. Somente deverão ser liberados ao mercado, os medicamentos que atendam aos limites máximos de microrganismos permitidos, sendo estes não prejudiciais. Segundo CORREIA (2003) a qualidade microbiana dos produtos farmacêuticos é afetada não apenas pelos tipos e grandeza de microrganismos introduzidos durante a fabricação, estocagem e uso, mas também depende da interação dos mesmos com a formulação. Muitos fatores físico-químicos são fundamentais, assim como o sistema conservante pode atuar minimizando os contaminantes a níveis não detectáveis durante a estocagem do produto. Como os microrganismos apresentam absoluta exigência quanto à  presença de água, a atividade de água exerce efeito fundamental, embora também formulas sólidas possam se deteriorar em decorrência de contaminantes. Há bem pouco tempo, o controle de qualidade de medicamentos tinha a função de avaliar a qualidade das matérias-primas e dos produtos terminados, como visto nos estudos de SANTORO (1988). Atualmente, tem função mais ampla na industria, isto é, orienta, discute, sugere e normaliza todos os problemas referentes à produção farmacêutica. Dentre os objetivos do controle de qualidade está a obtenção de medicamentos cada vez melhores, mais eficazes e seguros, menos tóxicos e mais estáveis. Assim, deve-se ter sempre em mente que um controle da qualidade microbiológica efetivo e atuante é extremamente necessário dentro de uma indústria, sempre priorizando a prevenção. As análises e os métodos citados neste trabalho apenas exemplificam alguns dos procedimentos analíticos de um controle de qualidade microbiológica de

51 medicamentos, sendo, portanto, de grande importância à utilização destes métodos  padronizados e sua realização feita por profissionais treinados e com experiência nesta área.

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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABIFARMA, Controle de Qualidade e Boas Normas de Fabricação , 1a edição. 1978.

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9. ANEXO: