COLORANTES Y TECNICAS DE COLORACION FUNDAMENTO TEORICO Colorantes Los colorantes son sustancias de origen
quíico o !iol"gico# quíico o generalente tintes# $igentos# reacti%os u otros co$uestos# e$leados en la coloraci"n de te&idos icroorganisos $ara e'(enes icrosc"$icos# de!iendo tener al enos# un gru$o cro")oro que le l e $ro$orcione la $ro$iedad de te*ir+ La coloraci"n es el $roceso de te*ir arti)icialente los icroorganisos con colorantes o reacti%os reacti%os $ara )acilitar su su estudio icrosc"$ico icrosc"$ico )ora# agru$aci"n , estructurasUn colorante es un co$uesto org(nico que consta de anillos !enc.nicos , gru$os cro")oros /agru$aci"n de (toos que da color a ciertos co$uestos, au'ocroos /sustitu,entes coo el gru$o o'idrilo o el aino que e&oran las características de a!sorci"n del cro")oroEn el la!oratorio de icro!iología se $ueden usar los colorantes de %arias )oras coo0 a- 1ara te*ir te*ir !acterias !acterias , 2acerlas 2acerlas %isi!les %isi!les al icrosco$ icrosco$io io !- 1ara ostra ostrarr estructura estructurass del organiso organiso estud estudiado+ iado+ c- 1ara la identi)ica identi)icaci"n ci"n de icroorga icroorganiso nisoss en !ase a sus caracterís características ticas de tinci"n# $or e&e$lo# si son o no alco2ol3(cido resistentes# si son 4ra $ositi%as o 4ra negati%as+ d- En los edios edios de culti%o culti%o $ara $ara in2i!ir in2i!ir el desarrollo desarrollo de alguna algunass !acterias !acterias , así $oder estudiar selecti%aente a los icroorganisos que si crecen+
CLASIFICACION DE LOS COLORANTES O TINTES
Colorante ácido0 Sucede todo lo contrario# la
sustancia colorante est( a cargo del ani"n# ientras que el cati"n no tiene $ro$iedad# $or e&e$lo0 eosinato3 de sodio5 Colorantes básicos0 La acci"n colorante est( a
cargo del cati"n# ientras que el ani"n no tiene esa $ro$iedad# $or e&e$lo0 3 cloruro de a6ul de etileno5+ Colorantes neutros0 Est(n )orados
siult(neaente $or soluciones acuosas de colorantes (cido , !(sicos# donde el $reci$itado resultante# solu!le e'clusi%aente en alco2ol# constitu,e el colorante neutro# que tiene la $ro$iedad tintorial de sus co$onentes (cidos , !(sicos# $or e&e$lo0 l a giesa+
Colorantes naturales. Los
colorantes naturales son !(sicaente 2istol"gicos# encontr(ndose entre los e$leados con a,or )recuencia# los siguientes0
7ndigo0 Se o!tiene de di%ersas es$ecie de $lantas del genero indig")era que contiene indican# el cual se )erenta $ara $roducir el colorante+ Carín0 Se $roduce# ediante el trataiento con alu!re , otras sales et(licas a 2e!ras del insecto coc2inilla 8Coccus castis8+ Orceína , Tornasol0 Se o!tiene ediante el $rocesaiento industrial de líquenes de los g.neros0 Le canora tinctoria , Rosella tinctoria+ 9eato'ilina0 Este colorante se e'trae con .ter de la adera de un (r!ol oriundo de M.'ico , de algunos $aises suraericanos denoinados 9eato'iliu ca$ec2ianu+
Colorantes sintéticos. Se o!tiene de la
anilina# o es (s e'actaente del alquitr(n de 2ulla siendo todos deri%ados del !enceno+ TECNICAS DE COLORACION
coloracion si$le0 En la coloraci"n si$le se utili6a un solo colorante con el que se ti*e r($idaente el icroorganiso# utili6(ndose )undaentalente $ara o!ser%ar su or)ología , taa*o+ Los colorantes e$leados con a,or )recuencia $ara este ti$o de tinci"n son los siguientes0 a6ul de etileno# %ioleta cristal , )uscina )enicada# entre otros+ coloracion co$uesta0 En este ti$o de coloraci"n# se utili6a (s de una sustancia tint"rea+ Los colorantes se a$lican# a la $re$araci"n# se$arados o &untos# )orando $arte de una soluci"n+ En consecuencia se $uede deterinar algunas características $ro$ias de di%ersos g.neros que $eriten di)erenciarlo de los de(s# $or lo que reci!en ta!i.n el no!re de coloraciones di)erenciales+ Entre los .todos (s utili6ados se encuentran0 La coloraci"n de 4ra+ , la de :ie2l Neelsen+
COLORACION GRAM
Dado que las !acterias no tienen color , $or lo general in%isi!le $ara la icrosco$ía de lu6# di)erentes t.cnicas de tinci"n se 2an desarrollado $ara %isuali6arlas+ La (s ;til es la tinci"n de 4ra# que se$ara los organisos en < grandes gru$os0 gra3$ositi%os , gra3negati%as+ Esta tinci"n ta!i.n $erite que el clínico $ueda deterinar si el organiso es redondo o en )ora de %arilla# etc+ A!os organisos# gra3$ositi%as , gra3negati%as tienen (s que una ca$a de $rotecci"n de su cito$lasa , n;cleo desde el edio e'tracelular# a di)erencia de las c.lulas aniales# que tienen una sola e!rana cito$las(tica co$one de una !ica$a de )os)olí$idos+ La ca$a e'terna de la e!rana cito$las(tica !acteriana es el $e$tidoglicano o $ared celular+ Est(
$resente en a!os organisos gra3$ositi%os , gra3negati%as+ La ca$a de $e$tidoglicano o $ared celular est( co$uesta de re$etidos disac(ridos con = aino(cidos en una cadena lateral que se e'tiende desde cada disac(rido+ Las cadenas de aino3(cidos del $e$tidoglicano se unen co%alenteente a otros aino(cidos de las cadenas %ecinas+ Esto resulta en una esta!le estructura reticulada+ La en6ia que catali6a la )oraci"n de esta uni"n Se llaa trans$e$tidasa , est( situado en el interior cito$l(sica e!rana+ El anti!i"tico se une a la $enicilina in2i!e esta en6ia+ 1or esta ra6"n# la en6ia es ta!i.n llaada $roteína de uni"n a la $enicilina+ La tinci"n de gra es la t.cnica $rinci$al utili6ada $ara el e'aen icrosc"$ico de las !acterias+ Casi todas las !acterias de i$ortancia clínica $ueden detectarse con este .todo+ Las ;nicas e'ce$ciones son0 Los icroorganisos que se 2allan casi con e'clusi%idad dentro de las c.lulas 2u.s$ed /$+ e&+# claidias-+ Los que carecen de $ared celular /$+ e&+# ico$lasas , ureo$lasas-+ Los que tienen un taa*o insu)iciente $ara ser o!ser%ados $or el icrosco$io "$tico /$+ e&+# es$iroquetas-+ Los que tienen una di)erente co$osici"n en su $ared , no ca$tan los colorantes /$+ e&+# ,co!acterias-+ •
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ROCEDIMIENTO! •
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El $rocediiento cl(sico de la tinci"n de 4ra consiste en )i&ar el aterial org(nico a la su$er)icie del $ortao!&etos del icrosco$io ,a $or calor o con etanol+ Des$u.s de la )i&aci"n el $rier $aso en la tinci"n de 4ra es la a$licaci"n del colorante $rinci$al cristal %ioleta /etil rosanilina o %ioleta de genciana-+ Luego se a$lica un ordiente# el ,odo de 4ra /lugol-# $ara que el colorante alcalino se una a la $ared celular a tra%.s de enlaces quíicos+ La decoloraci"n distingue las !acterias gra$ositi%as de las granegati%as+ Des$u.s de la decoloraci"n los icroorganisos a$arecen coo gra$ositi%os retienen el cristal %ioleta , los granegati%os lo $ierden+ El agregado colorante de contraste sa)ranina /Contratinci"n- te*ir( de color rosa o ro&o las !acterias granegati%as claras+
O"SER#ACION DE LA TINCION DE GRAM.
Una %e6 te*ido el )rotis se o!ser%a con el o!&eti%o de inersi"n />+???'-+ Cuando el aterial org(nico se ti*e con 4ra /$+ e&+# )rotis directo- el $ortao!&etos se e%al;a en !usca de la $resencia de c.lulas !acterianas así coo de las reacciones 4ra# /Fig+ @- En el an(lisis de uestras clínicas suele ser un estudio )undaental $or cu$lir %arias )unciones0 Identi)icaci"n $reliinar de la !acteria causal de la in)ecci"n+ Utilidad coo control calidad del aislaiento !acteriano+ Los or)oti$os !acterianos identi)icados en la tinci"n de 4ra se de!en de corres$onder con aislaientos !acterianos reali6ados en los culti%os+ Si se o!ser%an a,or n;ero de )oras !acterianas que las aisladas 2a, • •
que reconsiderar los edios de culti%os e$leados así coo la at"s)era de incu!aci"n+
COLORACION DE $IE%L&NEELSEN
La tinci"n de :ie2l3Neelsen es una t.cnica de tinci"n di)erencial que se !asa en que las $aredes celulares de ciertas !acterias contienen (cidos grasos /(cidos ic"licos- de cadena larga /? a B? (toos de car!ono- que les con)ieren la $ro$iedad de resistir la decoloraci"n con alco2ol3acido# des$u.s de la tinci"n con colorantes !(sicos+ Las ico!acterias a!sor!en los colorantes solo u, lentaente de!ido a la ele%ada $ro$orci"n de ceras , lí$idos en la $ared celular+ 1ara acelerar la a!sorci"n del colorante )uscina , así la )oraci"n del co$le&o icolato)usina en la $ared celular# se calienta la soluci"n de )uscina )enicada a$licada so!re el $re$arado noralente 2asta la )oraci"n de %a$ores+ Una %e6 que las ico!acterias 2an a!sor!ido el colorante# di)ícilente lo ceden a $esar del trataiento con soluci"n decolorante alco2ol3(cido clor2ídrico+ 1or esto se denoinan !acilos alco2ol acido resistente o AAR , a$arecen en el $re$arado icrosc"$ico te*idas de ro&o# ientras que todos los icroorganisos no resistentes a los (cidos se ti*en de acuerdo con la contratinci"n+> Esta tinci"n tiene inter.s desde el $unto de %ista del diagn"stico clínico $uesto que algunos icroorganisos $at"genos (cido3alco2ol resistentes# tales coo M,co!acteriu tu!erculosis son $at"genos u, i$ortantes $ara los 2uanos+ Las ico!acterias no constitu,en el ;nico gru$o que tienen $ro$iedades alco2ol3acido resistentes+ Las es$ecies de Nocardia y Rhodococcus $oseen una alco2ol3acido resistencia $arcial así coo Legionella micdadei causante de neuonía+ Los quistes de los g.neros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia de)inida a las tinciones con acido alco2ol
"I"LIOGRAF'A
>+onean# E+ Diagnostico icro!iol"gico# Editorial .dico $anaericana# <+aet6 Ernest# Micro!iología .dica# >GH edici"n en es$a*ol# Manual oderno# M.'ico# M.'ico >H edici"n# Editorial 1anaericana# uenos Aires J Argentina# < ??=+ =+Sala6ar Kilson# 4uías de $r(ctica de La!oratorio de Micro!iología# De$art+ de $u!licaciones de la Facultad de Ciencias M.dicas# uito J Ecuador# >? >>>+ Mandell# ennett# Dolin0 1rinci$les and 1ractice o) In)ectious Diseases t2 ed+ GCo$,rig2t
