COLORANTES Y TECNICAS DE COLORACIÓN.docx

I.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de activida actividad d respiratoria, etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.

1.1.- Colorante Es una sustancia que tiene la propiedad de teñir ceder al cuerpo con el cual entra en contacto .Un colorante se puede definir como la sustancia o un compuesto orgánico que tiene los grupos cromoforos y auxocromos ligados a un núcleo bencénico, el grupo cromoforo comunica al cuerpo a la propiedad del color Y el grupo auxocromo les comunica la propiedad de disociación electrolítica necesaria necesaria para unirse unirse al cuerpo formando formando sales.

1.2.- Pasos Generales Para Una Coloración

a.) Preparación de un frotis Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados Pasos -

Con el el asa bacteriológica bacteriológica se va a desarrollar desarrollar un frotis en un portaobjetos portaobjetos de cristal. cristal.

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Se toma el asa bacteriológica bacteriológica se pone en la flama del mechero dejándola dejándola al rojo vivo para que se esterilice,

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Se retira del fuego se toma una pequeña gota de agua destilada y se coloca sobre el portaobjetos, portaobjet os, con esta misma asa se extrae una una cantidad muy pequeña de una de las colonias que creció en las placas petri.

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Una vez teniendo ese material en el asa de acude a ponerlo en el portaobjetos portaobjet os en la parte central desplazando de izquierda a derecha hasta que nos quede delgada, una vez teniéndola verificamos verificamos si ya está lista para el frotis de la muestra del cultivo.

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Por último, se toma el porta de forma lateral para pasarlo por la flama nunca se debe dejar de forma directa en la flama., también se puede secar a temperatura ambiente Una vez fijado el frotis queda listo para el proceso de tinción.











b.) Fijación: temperatura ambiente, mechero c.) Tinción: Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (No vivos); en estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos agrupamientos de microorganismos microorganismos

1.3 Los colorantes se pueden clasificar:

Según Su Origen: 

NATURALES: como la hematoxilina, el hematoxilina, el carmín . ARTIFICIALES: como el azul de metileno, metileno, la safranina, safranina, azul de anilina, anilina, el  SINTETICOS O ARTIFICIALES: naranja G, etc.

Según Sus Propiedades Químicas La mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables ionizables presentes en los tejidos. t ejidos. 

Colorantes ácidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidófilos, porque tienen afinidad por los colorantes ácidos. Hematoxilina Verde de malaquita  



e l azul de d e metileno, met ileno, colorante cargado Colorantes básicos: como por ejemplo el positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan basófilos, porque tienen afinidad por los colorantes básicos. Eosina Azul de metileno Cristal violeta   



Colorantes neutros: son colorantes en los que la porción ácida y la básica colorean.

Tiñen las partes básicas de una célula de un color y las partes ácidas de otro. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.  Colorantes indiferentes: tiñen aquellas estructuras o sustancias que los disuelven más fácilmente que el líquido en que están preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lípidos.

Los Colorantes Se Pueden Agrupar 

Coloración simple: En esta tinción se utiliza un solo colorante y sirve para determinar forma, tamaño y agrupación de las bacterias, una de las más comunes es la del Azul de Metileno.











Es aquella que permite distinguir dos coloraciones dependiendo de la diferente composición y estructura de las bacterias, ejemplo. La coloración de gram, que permite diferenciar diferencia r a las bacterias gram positivas y gram negativas y la coloración de Ziehl Neelsen que permite reconocer reconocer a las bacterias acido acido alcohol resistente. 

Coloraciones especiales: Son aquella que nos permite reconocer estructuras específicas de los microorganismos, ejemplo la coloración de esporas, flagelos, cápsulas, granulos meta cromáticos e inclusiones, inclusiones, etc.

d.) Lavado: Dejando correr el agua no poniendo de frente al chorro la muestra, para evitar que se desprenda la muestra

e.) Secado: Temperatura ambiente.

f.) Observación Al microscopio

II.

OBJETIVOS : Realizar una tinción gram Conocer el fundamento del a tinción gram y otras tinciones. Conocer alguna clasificación de colorantes Diferenciar formas y algunas especies bacterianas bacterianas en Gram positivas o Gram negativas negativas de acuerdo a la tinción de Gram. Aprender las técnicas técnicas más utilizadas utilizadas de tinción tinción de microorganismos microorganismos Adquirir conocimiento conocimiento teórico_ práctico

sobre la realización realización de esta técnica de











III.

MATERIALES MATER IALES :

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Laminas portaobjetos portaobjetos

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Mechero

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Fósforos

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Papel toalla

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Cultivo de bacterias

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Asa de siembra

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Microscopio

Alcohol











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Colorantes 

IV.

Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENT O:

En el laboratorio se realizo la tinción Gram y se observó las tinciones con Ziehl Neelsen y la coloración de esporas.

4.1 Coloración De Gram: La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que se debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de f orma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. 

La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas interconecta das de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano.













Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. citoplásmic a. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo. 

La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa gram-negativa es peptidoglicano. peptidoglicano.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido polisacárid o está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado Porinas para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte.  También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas

especies.











4.1.1 Formas básicas en que se se puede visualizar visualizar la morfología morfología bacteriana en una tinción GRAM: COCOS Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño

BACILOS Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos











4.1.2 Procedimiento Para Una Tinción Gram: Gram: a) Preparar la muestra Si es una colonia tomada de un placa primero debemos tomar una gota de agua agua y luego una pequeña colonia bacteriana aislada .Luego realizamos el frotis lo más delgado posible.

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

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Se toma el asa bacteriológica bacteriológic a se pone en la flama del mechero dejándola al rojo vivo para que se esterilice

Se retira del fuego se toma una pequeña gota de de agua destilada y se coloca sobre el portaobjetos, portaobjet os, con esta misma asa se extrae una cantidad muy pequeña de una de las colonias que creció en las placas petri. Hacemos una extensión sobre una lamina portaobjeto lo más delgada posible











b) Aplicación De Colorantes 

Cubrimos el preparado con cristal violeta por 2 minutos( colorante primario) El cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana



Eliminamos el exceso de colorante colorant e con agua corriente La decoloración debe realizarse a chorro pero no fuerte para evitar que pierdan la tinción las células bacterianas .EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios



Cubrir el preparado con lugol por 2 minutos El lugol El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) (yodo) en equilibrio con KI (yoduro ( yoduro de potasio), potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula











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Decolorar con alcohol acetona Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I 2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico abre poros y el colorante sale de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano).en el caso de las gram positivas el numero de lípidos es muy pequeña para generar que el colorante se escape el peptidoglicano se deshidrata y las porinas se cierran.



Eliminamos el exceso de colorante con agua corriente



Contrastar Contrast ar con safranina 30 segundos(coloración segundos (coloración de contraste) Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas













4.1.3 Fundamento de la tinción gram: gram: El fundamento de la técnica técnica se basa en las las diferencias diferencias entre las paredes paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas Las bacterias gramnegativas tienen una gruesa capa de péptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante mordiente (cristal (cristal violeta) violeta) .durante la decoloración con alcohol alcohol acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce a la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la célula. Las bacterias gram negativas poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante mordiente (cristal (cristal violeta) violeta) y es entonces entonces fácilmente teñida por un colorante secundario o de contraste.

4.1.4 Observacion Observaciones es con la coloración gram en el laboratorio GRAM NEGATIVOS: 

Manos de Alexander (suspensión) (suspensió n) Diplococos Diplococos y estafilococos (tipo neisseria)













Muestra de E.coli (placa petri) Bacilos













Bacilo gram negativos: Seudomona A.

GRAM POSITIVOS 

Suspensión De Puerta (Placa Petri) Estafilococos Gram Positivos:













Manos De Alexander(Tipo Alexander(Tipo Neisseria ) (Placa Petri) Diplococos Diplococos Estafilococos (Racimo)













Reja De Cintia (Placa Petri) Bacilos y Cocos



Bacilos Gram Positivos :B. Cerius















Muestra De Puerta (Suspensión) (Suspensión) Levaduras

4.2 Coloración De Ziehl Ziehl Neelsen: Neelsen: Se emplea para detectar la presencia pr esencia de BAAR (Bacilos Acido-Alcohol Resistent Resistentes). es).Las Las











4.2.2 Fundamento De La Coloración De Ziehl Neelsen Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias, contienen ácidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol _acido, después de la tinción con colorantes básicos. Por eso se denominan acido-alcohol resistentes.las micobacterias como M.tuberculosis y M.marinum y los parásitos coccidios como Cristoporidium Cristopor idium se caracterizan por sus propiedades de acido-alcohol acido-alc ohol resistentes. resistent es. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que la colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de la molécula del colorante lo cual también facilita facilita su entrada a las bacterias .las que resistenten la coloración coloración son de color rojo y la que no se ven color azul.

4.2.3 Observaciones con muestras de coloración coloración Ziehl Neelsen











4.3 Coloración De Esporas: Existen diversos tipos de esporas microbianas, pero la espora bacteriana tiene especial importancia importanc ia ya que son organelos de gran resistencia que se producen en el interior de la célula, por lo que reciben el nombre de endosporas. La endospora es una estructura estructur a compuesta, de dipicolinato de calcio en el centro, dentro de su compleja cubierta que consta de siete capas que contienen mureina Pocos géneros de bacterias son capaces de formar endosporas, siendo los principales: Bacillus y Clostridium. La esporulación de una bacteria no es debida a condiciones desfavorables del medio, sino que se forman en cierto período del desarrollo de la célula. La función de las endosporas no es la reproducción, ya que de un bacilo que forma una espora solo surge una bacteria por germinación. Tanto el tamaño, como la forma y posición de la espora en la célula bacteriana son caracteres relativamente constantes de cada especie, ya que poseen cierto valor para distinguir entre sí los diferentes tipos de bacterias esporuladas. esporuladas.













Cubrir la preparación preparación con solución de contraste, Safranina al 5%, 5%, y dejar actuar el colorante durante un minuto y medio. colorant e.  Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante.  Secar al aire o utilizando papel absorbente.  Observar al microscopio con objetivo de inmersión en aceite.

4.3.2 Fundamento De La Tinción De Esporas Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes resiste ntes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: a. Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. b. Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo coloran













Bacilos Esporulados













V.

CONCLUSIONES:



Logramos aprender la técnica más utilizada de tinción de microorganismos microorg anismos la tinción Gram



Se logro diferenciar algunas algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas. negativas.

 Se

reconoció la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación

de las bacterias. 

Comprendimos Comprendimo s la importancia de una tinción y cuál es el fundamento de la la tinción gram y otras

tinciones.

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