CLONACIÓN ACELULAR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA, PCR BIOTECNOLOGÍA MÉDICA BIOTECNOLOGÍA Ing. Cinthia Córdov Córdova a Barrios Barrios
Introducción general general a la l a clonación
Conjunto de elementos genéticamente genétic amente idénticos entre sí y a su s u precursor. precursor. Clonación es una amplificación genética
Clonación CLONACIÓN DE MOLÉCULAS CELULAR: Con células, es la amplificación de un inserto, asistida por vectores en células anfitrionas en cultivo. Tecnología del DNA recombinante
ACELULAR: Clonación de moléculas sin la intervención de célula alguna, amplificación in vitro de moléculas de DNA y RNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
PCR
Amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA o cDNA, presentes en mezclas de muy diversas fuentes.
Amplificación
Detección
Aplicaciones
Clonación acelular de fragmentos de DNA. Detección de secuencias. Secuenciación de ácidos nucleicos. Establecimiento de polimorfismos de secuencia. Rastreo de mutaciones. Tipificación de DNA para trasplante. Diagnóstico de enfermedades genéticas. Resolución de problemas forenses. Resolución de problemas arqueológicos. Estudios evolutivos. Detección de células tumorales. Detección de microorganismos infecciosos.
PCR: Requerimientos Termociclador g Sustratos para la M síntesis de las y innumerables copias s P de DNA y el cofactor T (Mg de 1-4 mM) N d
s Oligonucleótidos r e sintéticos de cadena m sencilla de 18 a 30 nt. i r Sus secuencias son p o complementarias a s los dos extremos 3’ e de la región diana. La r o d posición donde a hibridan los b e cebadores define la C longitud del
fragmento.
a Termoestable y activa s a a temperaturas r e relativamente altas m (95 C). i l o Polimerasa taq p (Thermus aquaticus) A N D °
PCR: Etapas del proceso n ó i c a z i l a r u t a n s e D
Calentamiento para la separación de las dos hebras del DNA. Tiempo: Incubación (30-120 s). Temperatura: 68-97 C °
n ó i c a d i r b i h o o d a l p m e T
Enfriamiento rápidos por debajo de Tm. Hibridación de las hebras sencillas del DNA con los cebadores. Tiempo:10-120 s. Temperatura: 37-65 C °
n ó i c a g n o l E
Amplificación, DNA pol elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales Tiempo: Incubación (1-3 min). Temperatura: 72-75 C °
S e añade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. Previa antes de la desnaturalización para inactivar proteasas y nucleasas Última, prolongación de la última elongación, que permita que se completen todos los fragmentos.
PCR: Etapas del proceso
PCR: Etapas del proceso
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
PCR: Amplificación global N°
de ciclos realizados
1 2 3 4 5 10 20 40 X
N°
total de copias
2 4 8 16 32 1024 106 1012 2X
~
~
N°
de copias largas
2 4 6 8 10 20 40 80 2X
N°
de copias dianas
0 0 2 8 22 1004 106 1012 2X- 2X ~
~
Dianas/total
0 0 25% 50% 69% 98% 99.996% 100%
Características del proceso o t n e i m i d n e R
Los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulación de copias es exponencial.
n ó i c a r u D
De cada etapa, debe optimizarse dependiendo de la secuencia concreta que se quiera amplificar
d a d i c i f i c e p s E
Elevada, determinada por la secuencia de los cebadores y las condiciones del templado.
n ó i c c e t e d e d d a d i c a p a C
Alta, puede detectar una única molécula de DNA
N= número de copias. N0= número de moléculas iniciales. R= rendimiento de cada ciclo (0.7 o 0.8) X= número de ciclos
d a d i l e d i F
Capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones
Automatización de la PCR
Se utiliza termocicladores, para programar los cambios de temperatura según el carácter cíclico del proceso. Permite la realización de un número elevado de ciclos. Se aumenta la precisión del proceso.
Variantes del método: PCR “larga” o
L-PCR
• Supera los límites de la PCR convencional • Amplifica con fidelidad regiones diana de gran tamaño • Se añade otra enzima.
• Realizar una segunda reacción de PCR con dos
PCR “anidada”
cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par
• Clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en
PCR inversa
posición vecinal a secuencias diana conocidas. • Amplificar la región externa que flanquea a los cebadores.
Variantes del método: pcr anidada
Variantes del método: PCR inversa
Variantes del método: PCR inversa
Variantes del método: PCR con adaptadores.
PCR asimétrica
RT-PCR
•
Puede amplificarse una región de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restricción unos adaptadores.
• Se generan copias de hebra sencilla de un DNA. • Se añaden cantidades muy diferentes de ambos
cebadores.
•
Amplificación de RNA a través de la síntesis previa de su cDNA, que después se amplifica por PCR.
Variantes del método: PCR con adaptadores
Variantes del método: RT-PCR
Variantes del método: RT-PCR
Variantes del método: PCR real time o qPCR
Amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto.
Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa termoestable y fluoróforo
Se requiere de un termociclador termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.
