Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
PRACTICA Nº6 CARACTERIZACIÓN CARACTERIZACIÓN DE COLORANTES DE ACHIOTE Y COCHINILLA COCHINILLA I.-OBJETIVO •
Identificar los colorantes por medio de espectrometría y cromatografía
II.-INTRODUCCIÓN El conocimiento sobre los parámetros de extracción nos permite optimizar la obtención de colorantes colorantes de diverso origen. La caracterizació caracterización n de los colorantes se va mas hacia el conocimiento de las propiedades físico- químicas de estos compuestos, independientemente de la cantidad que se obtenga a partir del uso de una tecnología apropiada. apropiada. La cara caract cter eriza izaci ción ón de colo colora rant ntes es es una una de las las etap etapas as impo import rtan ante tes s en el reconocimiento de aquellas características que debe cumplir un colorante de calidad. Por ello, la presente práctica tiene por finalidad ayudar al estudiante a recon reconoc ocer er las técnic técnicas as mas mas adecua adecuadas das aplica aplicadas das ala verifi verifica cació ción n de tales tales características.
III.-FUNDAMENTO TEÓRICO COLORANTE
NATURAL
Colorante orgánico natural, pigmento o sustancia que se obtiene a partir de materia vegetal o animal, con un limitado proceso químico o
sin
él y sometidos posteriormente posteriormente a pruebas de identidad y pureza que
les
permita permita ser utilizad utilizados os en alimento alimentos, s, productos productos de perfumerí perfumería a
y
belleza, en alguna parte de éstos o en todo y que directamente o a través de su reacción con otras sustancias, es capaz de impartir el color que le caracteriza.
LA CROMATOGRAFÍA La
crom cromat atog ogra rafía fía es una una técn técnic ica a que que se emple emplea a en el frac fracci cion onam amie ient nto o de
proteínas. Consiste en la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través través de la colum columna. na. Las Las difer diferent entes es proteí proteínas nas se van van retra retrasa sando ndo de maner manera a distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz esco escogi gida da,, las las pro proteína ínas se pued puede en separ parar de acue cuerdo rdo a su car carga, ga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. particulares. 1
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida. En toda cromatografía hablaremos de los siguientes términos: •
matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna.
•
longitud de la columna . Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
•
volumen de la columna . Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatografía.
•
volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.
•
'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando.
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar : peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc... En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna:
Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel 2
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
(las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto matrices isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas L en la columna. La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido.
Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín, y deja pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico, variando la fuerza iónica del solvente, etc...) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a l as bolas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. 3
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido
específico ). La cromatografía es usada para separar mezclas de sustancias en sus respectivos componentes. Todas las formas de cromatografía trabajan bajo el mismo principio. Hacer una capa fina con el papel cromatografito. Aplicar una pequeña cantidad de la muestra con la ayuda de un capilar. A su lado, aplicar soluciones acuosas estándares de colorantes. Utilizar la mezcla de disolventes n y avanzar la cromatografía. Es un método rápido y eficaz para la identificación y separación de mezclas de colorantes. La técnica descripta a continuación sirve para la identificación rápida de los colorantes permitidos por el Código Alimentario. El esquema general de trabajo comprende las siguientes etapas:
•
Preparación de la muestra.
•
Elección de las condiciones de corrida. Papel Solvente de desarrollo Técnica cromatografía
•
Selección de patrones
•
Siembra de la muestra
•
Desarrollo del cromatograma
•
Comparación de las manchas con las de los patrones (Rf y forma).
ESPECTROMETRÍA El espectrómetro, o espectrógrafo, es un aparato capaz de analizar el espectro característico de un movimiento ondulatorio. Se aplica a variados instrumentos que operan sobre un amplio campo de longitudes de onda. Los métodos espectro métricos son métodos instrumentales empleados en química analítica basados en la interacción de la radiación electromagnética, u otras partículas, con un analito para identificarlo o determinar su concentración. Tabla Nº 1. Colores De La Luz Visible Longitud de onda de la Color absorbido
Color observado
4
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial absorción máxima(nm) 380-420 420-440 440-470 470-500 500-520 520-550 550-580 580-620 620-680 680-780
Violeta Azul violeta Azul Verde azuloso Verde Verde amarillento Amarillo Naranja Rojo Púrpura
Amarillo verdoso Amarillo Naranja Rojo Púrpura Violeta Azul violeta Azul Verde azuloso Verde
Tabla Nº 2 principales colorantes λ n m
Naturaleza quimica Tetrapiroles
ejemplos Ficobilinas
Color predominante Azul – verde
610-650
(lineales y cíclicos)
Clorofilas
Amarillo – rojo
(ficocianidinas)
Carotenoides
Carotenoides
Verde
540-570
(tetraterpenoides)
Flavonas
Amarillo – anaranjado
(ficoeritrinas)
Flavonoides
Flavonoles
640-660 Blanco-crema
Chalconasçauronas
400-500 Amarillo-blanco
Antocianinas
310-350 Amarillo 330-360 340-390 Amarillo
Xantonas
Xantonas
380-340 Rajo-azul
Quinonas
Naftoquinonas
480-550 Amarillo
Antraquinonas
340-400 Rojo-azul-verde
Derivados indigoides e índoles
Indigo
420-460 Rojo-purpura
Betelainas Pirimidas
470-485 Azul-rosado
Uterinas sustituidas
(betaxantinas) Amarillo-rojo
Flavinas
530-554 Blanco-amarillo
Fenoxazinas
(betacianinas) Amarillo
fenazinas Amarillo-rojo Amarillo-purpura
5
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial Fuente: Lock Sing O. 1997
IV.-MÉTODO En esta práctica se desarrolla la caracterización de colorantes a partir de dos métodos que son los siguientes: •
Método de Cromatografía de Absorción, este método esta basado en la determinación de la longitud de onda de máxima absorción de una solución diluida de achiote Método de Cromatografía de
•
papel ,
este
método
esta
basado en la separación cromatografía de las especies colorantes.
V.-MATERIALES •
muestra de colorantes (achiote)
•
muestra de colorantes (cochinilla)
•
vaso de precipitado de 250ml.
•
Fiola de 25ml
•
Papel filtro
•
Capilar de vidrio
•
Espectrofotómetro
•
Regla
•
Alcohol etílico(96º)
VI.-PROCEDIMIENTO Para la cromatografía de absorción •
Pesamos dos muestras de exactamente 0.5gr. de colorante.
•
Se Coloca el colorante en una fiola de 25ml.
•
Enrasamos (96º)
con hasta
alcohol
etílico
disolverlo
completamente. •
Se realizo una homogenización
•
De la solución coloreada (naranja palido), tomar una alícuota de 3ml con ayuda de una pipeta y vertimos el contenido en otra fiola de 25ml. 6
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
•
Volvimos a enrasar con alcohol (96º) y agitamos hasta conseguir homogeneidad.
•
Luego, verter el contenido en una de las celdas del espectrofotómetro para realizar la medición de longitud de ondas de 420 hasta500nm, haciendo la medición cada 5nm.
•
Preparamos la muestra patrón (alcohol 96º)
•
Hacemos la medición en blanco.
•
Realizamos las rectificaciones de los valores para que sena mas exactos, para ello tomamos los como referencia los valores mas altos.
Para cromatografía en papel •
En un vaso de precipitado vertimos más o menos 10ml de eluente (alcohol etílico 96º).
•
•
Preparamos una tira rectangular de papel filtro, aun centímetro del
borde del lado menor, trazamos una línea con ayuda de una regla y un lápiz. •
Luego, preparamos las soluciones de colo rante, estas deben ser muy concentradas.
•
Con ayuda de un capilar de vidrio, colocamos las muestras en forma de pequeños puntos sobre la línea trazada con lápiz en el papel.
•
Identifique los puntos de muestra colocados.
•
Luego, colocamos el papel en el vaso de precipitado y dejamos que el eluente separe las especies colorantes.
VII.-RESULTADOS 1.- Los datos tomados son de la muestras de achiote: absorbanc ia longitud de onda 600 0,003 595 0,001 590 0,005
500 495 490
0,551 0,723 0,894 7
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
585 580 575 570 565 560 555 550 545 540 535 530 525 520 515 510 505
0,002 0,004 0,007 0,003 0,009 0,011 0,014 0,017 0,024 0,03 0,046 0,062 0,086 0,136 0,193 0,284 0,392
485 480 475 470 465 460 455 450 445 440 435 430 425 420 415 410 405
absorbocion (A) longitud de onda(nm) 630 0,064 625 0,064 620 0,063 615 0,067 610 0,068
0,986 0,997 0,994 1,018 1,244 1,173 1,144 1,06 0,994 0,954 0,919 0,871 0,8 0,709 0,643 0,59 0,525
560 555 550 545 540
0,105 0,106 0,103 0,102 0,102 8
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
605 600 595 590 585 580 575 570 565
0,072 0,071 0,08 0,086 0,089 0,091 0,098 0,099 0,097
535 530 525 520 515 510 505 500 495 490 485 480
0,104 0,105 0,106 0,103 0,109 0,102 0,104 0,099 0,101 0,086 0,094 0,093
2.- muestra obtenida de la cochinilla
De la segunda parte: determinando el factor de retención (Rf) Rf =Ls/Le
1.-Del análisis de achiote Ls = 4cm Le = 4.2cm Rf =Ls/Le Rf = 4/4.2 =0.9523
2.-Del análisis de cochinilla Ls = 8.2cm Le = 8.4cm Rf =Ls/Le Rf = 8.2/8.4 =0.9761 9
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
Por lo tanto el: Rf = 4/4.2 =0.9523 de achiote Rf = 8.2/8.4 =0.9761 de cochinilla
VI. DISCUCIONES: •
Los datos que se obtuvieron en la práctica fueron bastante practico en el caso de la cromatografía fue algo fácil por que solo utilizamos el equipos y la dos muestras ( el colorante(achiote y cochinilla) y caso de
una muestra blanco) y en el
factor de retención también las muestras fueron eficientes ya que
obtuvieron resultados óptimos. •
Los resultados de cada de las muestras fueron los siguientes:
Longitud de onda Para achiote = 1.244nm Para cochinilla = 0.109nm
Factor de retención Rf = 4/4.2 =0.9523 de achiote Rf = 8.2/8.4 =0.9761 de cochinilla
VIII.-CONCLUSIONES •
Se puede decir que
la cromatografía de absorción, a una longitud de
465nm (1.244nm) la absorbencia alcanza el pico más alto, es decir la absorbancia máxima de la achiote y en la
bibliografía
el rango
permisibles es entre (600 A-405º) •
Se puede decir que
la cromatografía de absorción, a una longitud de
515nm (10.109nm) la absorbencia alcanza el pico más alto, es decir la absorbancia máxima de la cochinilla y en la
bibliografía
el rango
permisibles es entre (630-480A) •
De la misma forma se puede decir que en la cromatografía en papel la retención es de 0.9523 para el achiote y esto esta en el rango de un color naranja y a una longitud de honda entre 450-470
•
De la misma forma se puede decir que en la cromatografía en papel la retención es de 0.9761 para el achiote y esto esta en el rango de un color naranja y a una longitud de honda entre 450-470
•
El mejor resultado de la retención de agua fue de cochinilla tuvo mayor distancia de recurrido desde el punto de inicio.
10
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial IX.- CUESTIONARIO 1,- Haga un listado de los colorantes más empleados en la agroindustria, indicando el color, nombre comercial y su origen.
La FDA los define como: “Es cualquier colorante, pigmento u otra sustancia obtenida por síntesis o artificio similar o extraída, aislada o derivada, con o sin intermediarios del cambio final de identidad a partir de un vegetal, animal o mineral u otra fuente y que cuando es añadida o aplicada a los alimentos, medicamentos o cosméticos, al cuerpo humano o a cualquier parte, por si misma es capaz de impartir color”
A) Naturales Provienen de elementos vegetales, animales o minerales Son permitidos Son inocuos Son obtenidos de material biológico No necesitan certificación E100 – Curcumina – Amarillo natural 3 Fuente: rizoma de la cúrcuma Color: amarillo intenso Utilidad: curry, caramelos, mermeladas, embutidos, mostazas, sopas, caldos, conservas de pescado, conservas vegetales, yogur y queso fresco Toxicidad: minima, 0 a 3 mg/kg (JEFCA) E101 – Riboflavina Fuentes: lácteos, hígado y pescados Color: amarillo Utilidad: suero de leche, leche entera y enriquecer alimentos Toxicidad: IDA: 0 a 0.5 mg/kg E120 – Cochinilla – Rojo natural 4 Fuente: hembras dactylopus coccus Color: rojo Utilidad: conservas vegetales, mermeladas, helados, productos cárnicos, yogur,queso fresco, bebidas alcohólicas y bebidas no alcohólicas Toxicidad: no se conocen efectos adversos para la salud E140 – Clorofila Fuentes: algas, césped, alfalfa Color: verde Utilidad: gomas, chicles, helados y bebidas refrescantes Toxicidad: no se ha establecido un límite máximo a la ingestión diaria E150 - Caramelo Fuentes: calentamiento de sacarosa y otros azucares Color: dorado oscuro Utilidad: Panadería, pastelería, helados, gaseosas y bebidas alcohólicas Clases: I Obtenido calentando el azúcar sin más adiciones o bien añadiendo también ácido acético, cítrico, fosfórico o sulfúrico, o hidróxido o carbonato sódico o potásico. II Obtenido calentando el azúcar con anhídrido sulfuroso o sulfito sódico o potásico. III Obtenido calentando el azúcar con amoniaco o con una de sus sales (sulfato, carbonato o fosfato amónico) IV Obtenido calentando el azúcar con sulfito amónico o con una mezcla de anhídrido sulfuroso y amoniaco.
11
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial Toxicidad: FAO/OMS para aditivos alimentarios fija la ingestión diaria admisible en 200 mg/Kg de la clase III y IV. E153 – Carbón medicinal vegetal Fuentes: carbonización de materias vegetales. Color: verde Utilidad: decolorar parcialmente mostos, vinos, vinagres y desodorizar aceites. Toxicidad: no se ha establecido un límite máximo a la ingestión diaria. E160 – Carotenoides E160a – Alfa, beta y gamma caroteno E160b – Bixina, nobixina E160c – Capsantina, capsorrubina E160d – Licopeno Fuentes: Beta caroteno: papaya, camote, ají, hojas verdes Capsantina: pimiento rojo, pimentón Bixina, norbixina o achiote: Semilla bixa orellana Licopeno: tomate Color: amarillo, naranja y rojo Utilidad: mantequilla, margarina, yogur, queso, bebidas refrescantes, helados y productos cárnicos Toxicidad: piel naranja Xantofilas E–161a FlavoxantinaE – 161b LuteínaE – 161c CriptoxantinaE – 161d RubixantinaE – 161e VioloxantinaE – 161f RodoxantinaE – 161g Cantaxantina Fuentes: vegetales, yema de huevo, salmón y crustáceos Color: amarillo y anaranjado Utilidad: píldoras, alimento de animales Toxicidad: piel naranja E–162 Rojo de remolacha – Betania – betalaína Fuentes: beta vulgaris: beterraga Color: rojo Utilidad: helados, yogurt, repostería, bebidas refrescantes, conservas vegetales, mermeladas y conservas de pescado Toxicidad: no se conocen efectos nocivos de este colorante y la OMS no ha fijado un límit e a la dosis diaria admisible. E - 163 Antocianos Fuentes: frutas y flores Color: rojos, azulados o violetas Utilidad: vino, derivados lácteos, helados, caramelos, productos de pastelería, conservas vegetales, cárnicos, sopas y bebidas refrescantes Toxicidad: IDA: 0 a 200 mg/kg
X.-BIBLIOGRAFÍA 12
Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial
•
Salvador Badui Dergal, cuarta edición,”química de los alimentos” Pág.409.
•
Matissek, Schnepel y Steiner “análisis de alimentos” fundamentosmétodos-aplicación Pág.291.
•
GIBAJA S. 1998. Pigmentos Naturales Quínonicos. Primera Edición. Editorial Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
•
LOCK O. 1997.
Colorantes Naturales. Primera Edición. Pontificia
Universidad Católica del Perú. Lima, Perú. pp. 137-163.p
13
