TITULO Obtención del colorante de la semilla de achiote ( Bixa orellana) utilizando microorganismos celulolíticos Achiote (Bixa orellana) seeds colorant extraction using cellulolytic microorganisms Hernndez !onzlez "aría#$ Tirado !allegos %uan "anuel #$ Ilin Anna &$ Ló'ez Truillo amiro #$ ebolloso *adilla Oscar +o, #$ uelas -hacón .óchitl #/ esumen 0l 'resente estudio se lle1o a cabo con la 2inalidad de extraer el colorante bixina$ 'resente en la semilla del achiote$ am'liamente utilizado 'or la industria alimentaria$ mediante un tratamiento 3ue o2rezca adems de buenos rendimientos$ un 'roducto libre de com'onentes tóxicos/ 0l 'roceso se basa en el uso de microorganism microorganismos os 'roductores de celulasas$ celulasas$ ca'aces de degradar la 'ared celular celular de las semillas donde se encuentra el 'igmento 'ara 2acilitar su liberación en un medio acuoso$ acuoso$ obteni,ndose obteni,ndose rendimientos rendimientos del 4#5$ 4#5$ mayores a los o2recidos o2recidos 'or extracción acuosa y ligeramente menores 3ue los obtenidos con tratamiento cido6 base$ base$ cuesti cuestiona onados dos 'or la comunid comunidad ad 0uro'ea 0uro'ea$$ obteni, obteni,ndos ndose e una 'asta 'asta 3ue muestra 'icos en el inter1alo de los #788 cm6 # re'resentati1o de los gru'os carbonilos característicos de la estructura de la bixina/ *alabras cla1e9 :ixina$ achiote$ microorganismos celulolíticos/ Abstract This assay ;as carried out to extract bixine$ a colorant attached to achiote seeds$ ;idely used in 2ood industry$ by a method ;hich may o22er besides good yields$ a toxin 2ree 'roduct/ The 'rocess is based on the use o2 cellulolytic microorganisms able to degrade the seedey ;ords9 :ixine$ achiote$ cellulolytic microorganisms Introducción 0l color de los alimentos es un atributo 3ue tiene mucho 'eso dentro del uicio del consumidor$ consumidor$ este 'uede llegar a ser determinante 'ara 3ue un comestible sea ace'tado o rechazado/ (:adui$ #??@)/ La industria alimentaria utiliza una serie de sustancias $ meor conocidas como aditi1os 3ue tienen como 2unción 'rimordial im'art im'artir ir alguna alguna colorac coloración ión en 'articu 'articular lar o sim'le sim'lemen mente te resalta resaltarr la 3ue 'or la naturaleza tienen las materias 'rimas o$ en su caso$ de los 'rocesos tecnológicos en la coloración del 'roducto 2inal/
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Los aditi1os 3ue son utilizados como sustancias colorantes 'ueden ser JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ
Uni1ersidad Autónoma Agraria Antonio +arro $ & Uni1ersidad Autónoma de -oahuila
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obtenidos 'or síntesis 3uímica en la industria (colorantes sint,ticos) o 'ro1enir de 2uentes naturales como los 1egetales (colorantes o 'igmentos naturales)/ 0n los Bltimos tiem'os los colorantes sint,ticos han sido cuestionados debido a sus e2ectos toxicológicos$ inclusi1e algunos han sido eliminados de algunas legislaciones/ Lo anterior aunado a la tendencia 3ue tienen los consumidores$ sobre todo en los 'aíses desarrollados$ a consumir alimentos con un mínimo o nulo contenido de sustancias sint,ticas ello ha 'ro1ocado 3ue el uso de colorantes naturales 1aya en aumento y sustituyendo a los sint,ticos (Calas$ &88@)/ *ara abastecer la creciente demanda de colorantes naturales sin 'roblemas de legislación$ se 'rocede a la extracción de los 'igmentos 'resentes en los teidos 1egetales o animales 'or medio de di2erentes m,todos$ cada uno 'resenta sus limitantes y 1entaas/ 0l colorante obtenido de las semillas de achiote ( Bixa orellana), esta com'uesto en su mayoría 'or el carotenoide bixina$ 3ue se utiliza en la industria lctica$ crnica$ condimentaría$ cosm,tica$ 2armac,utica$ etc/ es un colorante natural exento de certi2icación/ La extracción ms rudimentaria se basa en un la1ado con agua en ebullición y a escala industrial se ha im'lementado un 'roceso de extracción alcalino 3ue es de 2cil a'licación$ 'ero 3ue tiene el incon1eniente de 3ue el 'roducto 2inal contiene al mximo @8 a D85 de 'igmentos (Ez3uez$ &88#)/ Las 'osibilidades de incrementar el rendimiento y la 'ureza del colorante obtenido del achiote siguen siendo tema de estudio$ se debe buscar un m,todo de extracción de 2cil a'licación$ 3ue ele1e el grado de rendimiento$ dando como resultado un extracto exento o con un mínimo de im'urezas 3uímicas$ 3ue disminuya los riesgos 3ue im'lica al consumidor el uso de sol1entes o los tratamientos cido F alcalinos/ "etodología ex'erimental Ce trabaó con semillas enteras de achiote 'rocedentes del estado de -hia'as$ ad3uiridas en un mercado del munici'io de Acala/ Las semillas 2ueron mantenidas en en1ases 'lsticos y almacenados en condiciones de oscuridad/
*ara los obeti1os de la in1estigación$ se 'rocedió a realizar anlisis de ceniza$ humedad$ grasa$ 2ibra cruda$ celulosa$ lignina y bixina/ Todas las determinaciones se realizaron en base a los m,todos establecidos 'or la AOA- en #?48$ exce'to las de celulosa$ lignina$ y 2ibra 3ue se hicieron de acuerdo a Eansoest$ et al. (#?74)$ y la de bixina se realizó de acuerdo a las normas o2iciales mexicanas/ Una 1ez e2ectuada la caracterización de la semilla se 'rocedió a seleccionar e identi2icar y seleccionar ce'as 2Bngicas con 'robada acti1idad celulolítica/ Ce e1aluaron G ce'as$ las cuales 2ueron 'ro'orcionadas 'or la acultad de -iencias uímicas de la Uni1ersidad Autónoma de -oahuila$ en 2unción a la 'roducción de celulasas/
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Los hongos 2ueron 1iabilizados en un medio lí3uido y 'osteriormente inoculados en 'lacas de agar carboximelticelulosa (-"-)/ Kes'u,s de G días de incubación a &4- se e1aluó su acti1idad sobre la celulosa a'licando la t,cnica del roo congo de acuerdo con los lineamientos 'ro'uestos 'or Ilin (&88&)/ Ke esta eta'a se logró seleccionar tres ce'as 'ara su 'osterior caracterización/ La caracterización de las ce'as se realizó obser1ando los microorganismos tanto macroscó'ica como microscó'icamente$ mediante anlisis de mor2ología$ es'orulación y asimilación de nutrientes/ Todos los anlisis 2ueron realizados de acuerdo a los lineamientos 'ro'uestos 'or :arnett et al., (#?4G) y omero (#??@)/ Una 1ez seleccionadas e identi2icadas las ce'as 2Bngicas se 'rocedió a establecer un 'roceso 2ermentati1o aeróbico en medio acuoso$ el cual contenía 8/7 g/ de +a+O @$ 8/# g/ de >H &*OD$ 8/# g/ de "gCO D$ 8/# g de >-l y 8/8& g/ de >&COD y &/8 g/ de semillas de achiote$ como Bnica 2uente de carbono en &88 ml de :u22er a 'H de M$ @ y G 're'arado de acuerdo a la t,cnica 'ro'uesta 'or Lynch et al (#?4G)/ *osteriormente se inoculó cada unidad ex'erimental con un inóculo 3ue contenía &$888$888 de es'orasNml/$ y se mantu1o en baos "aría 'ara el control de la tem'eratura a &M$ @8 y @M -$ durante #DD hrs/ Kurante este tiem'o se monitoreó la 2ormación de azBcares totales y reductores$ los 'rimeros se determinaron de acuerdo a los lineamientos 'ro'uestos 'or Kubois (#?M7) con 2enol sul2Brico$ los azBcares reductores se analizaron de acuerdo con "iller (#?M?)/ Terminado el 'roceso de biocatlisis$ cada sistema 2ue esterilizado en autocla1e$ 'ara detener el crecimiento y acti1idad 2Bngica/ Kes'u,s del 'roceso de esterilización se recu'eró el colorante mediante tratamientos en medio acuoso 'or calentamiento$ 'rensado y 2iltrado$ hasta obtener la mayor cantidad de colorante 'osible/ 0l material obtenido en las o'eraciones antes citadas$ 2ue sometido a un 'roceso 2inal de e1a'oración en horno a una tem'eratura entre 7867M- hasta la eliminación com'leta de la humedad residual/ La determinación del rendimiento se realizó 'or anlisis gra1im,trico/ Los datos arroados 'or el anlisis gra1im,trico 2ueron sometidos a un anlisis de 1arianza 2actorial con 'P8/8M$ esto$ 'ara determinar las condiciones 3ue o2recen una mayor liberación de colorante/ A 2in de determinar la 'ureza del extracto recu'erado$ se 'rocedió a a'licar un anlisis 'or es'ectrosco'ia in2rarroa (I) a los extractos obtenidos$ mediante la 're'aración de la 'astilla de >:r con la muestra del colorante en 'ol1o y se analiza en un es'ectro2otómetro *er=in F 0lmer/ esultados y discusión Los resultados arroados 'or el anlisis 3uímico e2ectuado a la semilla muestran #/D5 de bixina$ #/7#5 de humedad$ ?/GD5 de celulosa$ @/G75 de lignina$ #7/?5 de 2ibra cruda$ @/M#5 de cenizas y D/M&5 de grasa$ Ce 'uede obser1ar 3ue el menor com'onente de la semilla utilizada en la 'resente in1estigación 2ue el agua$ esto se traduce en un ele1ado contenido de materia seca 3ue se caracteriza 'or su alto contenido en 2ibras$ 'or lo cual la semilla 'ude 73
2uncionar en el 'roceso de :iocatlisis como una 2uente de carbono caracterizada 'or 2ibras 3ue 'ueden ser desdobladas 'or com'leos enzimticos 'resentes en organismos como los hongos/ Los resultados obtenidos a'licando la t,cnica del roo congo$ 'ara seleccionar la ce'a con mayor acti1idad celulolítica$ 2ueron sometidos a un anlisis de 1arianza con una 'Q8/8M esto con la 2inalidad de elegir con mayor seguridad cual o cuales microorganismo son los 3ue ms se adecuan a la in1estigación/ Los resultados del anlisis se re'ortan en el cuadro nBmero #$ como las medias analizadas 'or la 'rueba de t6Ctudent ('Q8/8M)/ -uadro #/ esultados de roo congo analizados mediante t6Ctudent ('Q8/8M)
-0*A -e'a G -e'a M -e'a & -e'a 4 -e'a # -e'a D -e'a @ -e'a ?
A : :
-
K K K 0 0
*O"0KIOC -UAKAKOC @$?8 cm/ @$D8 cm/ @$&@ cm/ @$#8 cm/ @$8M cm/ &$?# cm/ &$7@ cm/ &$D@ cm/
K0
"R+I"OC
0l anlisis de medias 'ermite concluir 3ue la ce'a con mayor 'roducción de celulasas es la ce'a G$ ya 3ue en el anlisis estadístico 2ue la meor$ existiendo di2erencia signi2icati1a con el resto/ *or otro lado$ la ce'a M y la ce'a & resultaron estadísticamente iguales$ 'resentando menor acti1idad 3ue la ce'a G$ 'ero mayor 3ue el resto de las ce'as/ Las ce'as G y M 2ueron identi2icadas como genero As'ergillus ss'/ y la & como una mezcla entre As'ergillus y *enicilium 'or lo cual solo las dos 'rimeras 2ueron 'robadas en el 'roceso de biocatlisis/ inalmente 2ue 'osible establecer 3ue las meores condiciones 'ara degradar la 'ared celular de la semilla del achiote 2ue la interacción 'resentada entre la ce'a G a 'H G y tem'eratura de @M-$ ya 3ue así se mani2estó en el monitoreo de azBcares el cual mostraba constante 2ormación y consumo de los mismos a di2erencia de las dems interacciones/ 0n la 2igura # se 'ueden obser1ar los 'esos de 'asta de achiote obtenidos des'u,s de terminado el tiem'o en cada tratamiento/ Ce obser1a 3ue la ce'a G o2rece los mayores rendimientos bao todas las condiciones de trabao/
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igura #/ *asta colorante obtenida 'ara cada tratamiento/
Ke la misma manera 3ue en el anlisis de 1arianza$ se obser1a 3ue la interacción 3ue o2rece el mayor rendimiento es ce'a G$ 'H G y tem'eratura de @M-$ 'resentando #/& g de extracto colorante$ los cuales contienen 8/8&& g de bixina total obtenidos a 'artir de una muestra de & g 'or lo 3ue se es'era 3ue de #88 g de semilla se obtengan #/#@ g de bixina lo 3ue re'resenta el 48/G 5 de extracción ya 3ue la semilla contiene #/D g de bixina 'or #88 g de semilla como se citó anteriormente/ 0n la 2igura & se muestra un es'ectro in2rarroo (I) 'ara la 'asta colorante recu'erada$ destacndose un 'ico sobresaliente cercano a #788 cm 6#$ el cual es re'resentati1o de los gru'os carbonilos$ así como un 'ico en el inter1alo de los #G88 a #448 cm6# a'roximadamente$ re'resentati1o de los dobles enlaces 'resentes en las estructuras orgnicas$ características de la bixina/ 105.2 100 715.39 1974.96 825.88
90
879.51
80
m 'b' esporas
70
2927.12 1266.98
772.05
%T 60
3271.00 1373.24
50
1598.96
40
1048.10
30 25.0 4000.0
3000
2000
1500
1000
600.0
cm-1
igura & 0s'ectro de In2rarroo 'ara 'asta obtenida/
-onclusiones 0n los resultados obtenidos se obser1ó 3ue el mayor constituyente de de la semilla de achiote ( Bixa orellana) son las 2ibras$ a las cuales se encuentra adherido el 'igmento de inter,s/ Ke las ce'as e1aluadas$ la 3ue 'resentó mayor acti1idad celulolítca$ de acuerdo a la t,cnica del roo congo$ 2ue la designada como G$ identi2icada como
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Aspergillus$ lo cual 2ue con2irmado al monitorear la 2ormación y consumo de
azBcares totales y reductores 'resentando un com'ortamiento tí'ico 'ara este ti'o de hongos excretando la enzima al medio 'ara obtener carbohidratos sim'les y asimilarlos constantemente/ ue 'osible establecer 3ue las condiciones 'ara el ó'timo desarrollo 2Bngico$ con su consecuente e2ecti1idad en la degradación de la materia en cuestión 'ara 2acilitar la liberación del 'igmento$ 2ueron de 'H G y tem'eratura de @M-$ 'ara la ce'a G identi2icada como Aspergillus spp/ Antes citado/ -om'arando los 'rocesos usando las otras ce'as estudiadas y sin inóculo$ el tratamiento con Aspergillus resultó un @85 mas e2ecti1o 3ue los antes mencionados/ Las condiciones antes citadas o2recen un rendimiento de extracción de bixina de hasta un 48 5 com'arado a lo obtenido con agua$ e in2erior al re'ortado utilizando los m,todos alcalinos$ sin contener los residuos 3uímicos tóxicos 3ue se 'resentan en dicha extracción$ cuestionados recientemente 'or la unión 0uro'ea/
Literatura citada AOA-/ #?48/ O2icial "ethods o2 Anlisis o2 the Association o2 O22icial Alytical -hemists/ Thirteenth edition/ @M@ '/ :adui$ K/ C/ #??@/ uímica de los alimentos/ Addison Sesley Longman de ",xico$ C/ A/ K0 -/ E/ ",xico K/ /$ ",xico/ Kubois$ "/$ !uilles$ >/ A/$ Hamilton$ %/ >/$ ebers$ */ A/ and Cmith$ / #?M7/ -olorimetric meted 2or determination o2 sugars and related substances/ Anal/ -hem/ &49M@8/ Ilin A/ &88&/ "anual de *rcticas de cr,dito # Introducción a la :iotecnología U/ A/ de -/ @4 '/ Lynch$ "/ %/ /$ C/ C/ "ellor$ K/ L/ C'are$ K/ */ In;ood$ H/ "/ %/ #?4G/ ",todos de Laboratorio/ &V ed/ Eol &/ 0d/ +ue1a editorial interamericana/ ",xico$ K/ / ''/ #DD76#DDG/ Calas$ !/ L/ &88@/ 0ducación Alimentaria$ manual indis'ensable en educación 'ara la salud/ 0d/ Trillas/ ",xico$ K/ / ''/ ?G/ Eansoest$ */ %/ y Sine$ / H/#?74/ Keterminación de 2ibra 'or el m,todo cido detergenteN determinación de lignina$ celulosa y silicio 'or el m,todo de 'ermanganato/ %/ Anal/ -hem/ M#9 G48 ' Ez3uez$ H/ -/ &88#/ 0studio 'reliminar de la degradación de bixina en 'ol1o en los di2erentes ti'os de em'a3ues y tem'eraturas establecidas/ Tesis I+!/ Instituto Tecnológico de Eillahermosa/ Eillahermosa$ Tabasco$ ",xico/
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