BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS Annie Villegas - Luis Enrique Quinchia Universidad Icesi Facultad de Ciencias Naturales Laboratorio de Bioquímica Santiago de Cali, Colombia 7 de noviembre de 2013 Análisis de resultados: Las levaduras pertenecen al reino de los Fungí (hongos) microscópicos unicelulares. Su importancia radica en la capacidad de fermentar diversos tipos de compuestos orgánicos, en general azúcares e hidratos de carbono. A nivel estructural las levaduras poseen en su membrana plasmática una proteína que es una bomba ATPasa de H+ que consume casi el 25% del ATP que produce la célula. Esta bomba se copla por la hidrólisis del ATP por un bombeo de protones hacia a fuera de la célula, al igual que otro tipo de bombas de membrana esta inhibe concentraciones de un producto o una sustancia de un lada y lo pasa al otro. Esto produce un gradiente electroquímico que genera un trasporte de nutrientes al interior celular.
FIGURA1. Esquema de la Síntesis de ATP en la mitocondria.
No obstante como se muestra en la figura 1, en la membrana plasmática mitocondrial las levaduras al igual que muchos otros organismos, poseen una bomba llamada ATPsintetasa, que es la encargada de sintetizar ATP que al contrario de la ATPasa que con el flujo de protones rompe ATP, este paso de H+ induce a su síntesis. Según esto se puede deducir que a medida que las levaduras consumen glucosa, se observara una disminución progresiva de su concentración en el medio de cultivo con el tiempo y que sucederán cambios en el pH extracelular. Para confirmar de una manera experimental de esto se prepararon tres tubos de muestra en el laboratorio, el primero es una muestra de control, el segundo una muestra con DNP y el tercero con una muestra de Azida de sodio. Cada tubo contenía diferentes reactivos pero las mismas concentraciones de levadura. Como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Parámetros para la preparación de 3 muestras de suspensión de levadura al 20% TUBO 1: TUBO 2: TUBO 3: Reactivo Muestra Muestra con DNP Muestra con azida control Suspensión de levadura al 20% 5 5 5 (mL) Agua destilada (mL) 40 40 40 Solución de DNP 80 mM (mL) 0,2 Solución de azida de sodio 800 0,5 mM (mL) DNP 2,4-Dinitrofenol
Figura 2. Estructura química del 2,4-dinitrofenol
El 2,4-dinitrofenol, figura 2, es un desacoplante muy empleado, debido a que puede actuar cerca de la membrana interna y protonarse. Esto, se fundamenta en que al estar en una zona con un pH muy bajo, al protonarse se incrementa la hidrofobicidad del DNP y permita que se difunda en la membrana e incluso atravesarla. Al estar ya dentro de la matriz, el pH que es más alto provoca que el hidroxilo fenólico se desprotone. Por ende, el desacoplador posee el efecto de transporte de H+ de vuelta hacia la matriz, evitando el canal protónico Fo y, por tanto, evitando la síntesis de ATP, figura 3.
Figura 3. Mecanismo del DNP
Azida de sodio
Figura 4. Estructura química de la azida de sodio La azida de sodio, figura 4, es el compuesto inorgánico con la fórmula NaN3. Esta sal incolora es el componente formador de gas en muchos automóviles airbag sistemas. Además, es un sustancia iónica, altamente soluble enagua , y es muy tóxico.
Figura 1. Estructura en 3D de la azida de sodio. La toxicidad de la azida radica en su forma aniónica, pues forma un enlace irreversible con el cofactor hemo de la enzima Citocromo C oxidaxa, inhibiéndola de una manera similar de como lo hace el monóxido de carbono, este Citocromo C oxidasa es el complejo IV de la Figura 1. Además de los desacoplantes que se utilizaron en la práctica también existen diversas moléculas que actúan como inhibidores de la cadena de transporte electrónico como por ejemplo la rotenona, amital, antimicina A, cianuro y monóxido de carbono ya antes nombrado. A continuación se explicara un poco su efecto y de donde provienen. Inhibidores de la cadena transportadora de electrones Los inhibidor de la CTE son sustancias que es el caso de unirse con algún componente de esta cadena bloquean la de forma de cambiar de manera reversible desde su forma oxidada hasta su forma reducida. Debido a que en presencia de estos inhibidores no se libera energía, la síntesis de ATP también se detiene. El Amital y la Rotenona
Figura 6. Estructura química del Tiopentato de Sodio (Amital)
Figura 7. Estructura química de la Retenona
El primero es un barbitúrico (figura 6), y el segundo (figura 7) es un producto vegetal obtenido de las plantas que se usa como insecticida y pesticida. Ambos, bloquean la cadena de transporte electrónico entre la NADH deshidrogenasa (Complejo I) y la CoQ. Como consecuencia, ellos evitan la utilización del NADH como donante de equivalentes de reducción a la cadena respiratoria. Sin embargo, el flujo de electrones que resulta de la reduccion-oxidacion del Complejo II no es afectado, ya que los electrones entran en un punto posterior al bloqueo, a través de la Coenzima Q. El efecto del Amital ha sido observado in vitro, ya que la intoxicación con amital y otros barbituratos afecta principalmente alSistema Nervioso Central al actuar sobre los canales de iones sensibles al GABA, un efecto no relacionado con la acción del amital sobre el Complejo I. Por otra parte, cabe destacar que la Rotenona y el MPTP (una neurotoxina), que también afecta al Complejo Respiratorio I, cuando se administran de forma intravenosa, causan síntomas y signos muy parecidos a la enfermedad de Parkinson. Estas substancias afectan primariamente a las neuronas de la substancia nigra. Aparentemente la secuencia de eventos es: afectación del Complejo I, afectación del metabolismo mitocondrial, acumulación de radicales libres, muerte celular, liberación de substancias toxicas y destrucción de otras células. Antimicina A La Antimicina A es un antibiótico producido por Streptomyces griseous que ha sido usado como veneno para controlar alguna especies de peces. La Antymicina A interfiere con el flujo de electrones desde el citocromo bH en el Complejo III (Qcytochromo coxidoreductasa). En presencia de esta sustancia, el citocromo bH puede ser reducido pero no oxidado, y consecuentemente, el citocromo c permanece oxidado, al igual que los citocromos a y a3 del Complejo IV. Monóxido de carbono El monóxido de carbono (CO) es responsable a nivel mundial por más del 50 % de las muertes por año. La intoxicación por monóxido de carbono causa trastornos en la entrega de oxígeno a los tejidos y en su utilización celular. La afinidad de la Hemoglobina por el monóxido de carbono es casi 300 superiores a la que tiene por el oxígeno. Un ambiente en el cual hay apenas 100 ppm de CO es suficiente para que la formación de Hemoglobina llegue a 16 %.
La situación empeora además ya que la unión de CO a uno de los grupos Hemos de la Hemoglobina aumenta la afinidad por el oxígeno de los otros tres grupos Hemos de la molécula, por lo cual la entrega o liberación del oxígeno a los tejidos está muy afectada. Debido a su alto consumo de oxígeno, el cerebro y el corazón son los órganosmás afectados. La mioglobina tiene más afinidad aun por el CO que la Hemoglobina, por lo que el musculo cardiaco está severamente afectado y el paciente presenta una marcada hipotensión. Como ya fue descrito anteriormente, la intoxicación por CO es una importante causa de muerte en todo el mundo.
Figura 8. Efecto del monóxido de carbono en los hematíes. El CO se une a la forma reducida del hierro (Fe ++) de los grupos Hemos de la Citocromo Oxidasa como se muestra en la figura 8. Cianuro
Figura 9.Estructura química del cianuro La intoxicación por cianuro (figura 9) es frecuente por inhalación de fuegos industriales residenciales o en personas que profesionalmente trabajan con el y con sus derivados. Este afecta a todas las metal enzimas, pero su principal efecto toxico es la unión al Fe++ en los grupos Hemos de la Citocormo C oxidasa.
Azidas Retomando el tema de las azidas, como ya se indagó, se puede inferir que afectan a la cadena respiratoria de una forma muy similar al cianuro, ya que inhiben a los grupos Hemos de los citocromos en la Citocromo Oxidasa (Complejo IV). Las azidas son usadas en los “airbags”, en la produccion de detonantes (explosivos) y como preservativo del suero y de algunos reactivos quimicos y biologicos. Se han reportado casos de intoxicacion por azida en humanos. Para terminar, podemos decir que la acción de cualquiera de estos inhibidores, puede detener las reacciones redox de la cadena respiratoria. En estas, no se libera energía, las bombas de protones no funcionan, por lo que no hay protones que regresen a través del complejo V, y la producción de ATP cesa. Con los tubos preparados se procedió a evaluar el pH de cada una de las muestras en intervalos de 3 minutos durante 6 minutos obteniendo los siguientes resultados: Tabla 2. Determinación del pH en las muestras de levadura control, con un desacoplante (DNP) y un inhibidor (Azida) Tiempo (min) TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 0 5,36 5,26 5,70 3 5,46 5,38 5,72 6 5,45 5,37 5,73 Después de dejar en reposo cada muestra se adiciono 5mL de glucosa al 10% y se volvió a determinar el pH, esta vez en intervalos de 5 minutos durante un cuarto de hora y luego de 20 minutos más en intervalos de 10. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 3. Tabla 3. Determinación del pH con la adición de glucosa al 10% Tiempo (min) TUBO 1 TUBO 2 0 5,45 5,37 5 4,94 5,21 10 4,61 5,06 15 4,45 4,99 25 4,48 5,02 35 4,41 4,97
TUBO 3 5,74 5,70 5,61 5,57 5,59 5,56
Gráfica 1 5.8 5.7
pH
5.6 5.5
control
5.4
DNP
5.3
Azida
5.2 0
2
4
6
8
Tiempo (min) Grafica 1. pH en función de tiempo de solución control , DNP 80Mm y azida de sodio 800Mm.
Gráfica 2 6.0
pH
5.5 5.0
Control DNP
4.5
Azida
4.0 0
10
20
30
Tiempo (minutos) Grafica 2. pH en función de tiempo de solución control , DNP 80Mm y azida de sodio 800Mm. Después de 5 minutos
Como se observa en la gráfica 1, la muestra con el 2,4 dinitrofelnol (DNP), se encuentra a un pH más bajo con respecto al control y la azida, esto se da porque este compuesto es un transportador de protones, soluble en lípidos y con un pKa de 4,1 que se reparte entre sus formas acidas y básicas, ambas pueden difundir fácilmente por la membrana y disipan el
gradiente de protones, el resultado de esto es un menor flujo de protones por la ATP sintasa y por lo tanto la disminución de la producción de ATP, sin que se detenga el paso de protones a través de la membrana. El mecanismo por el cual funciona este compuesto se muestro en la figura 3 anteriormente. Si observamos nuevamente la gráfica 1, el comportamiento de la muestra que contenía azida es totalmente diferente a la muestra control y a la muestra con DNP, esto se debe a que la azida actua como un inhibidor, por lo tanto se unen al complejo IV de la cadena de transporte electrónico y bloquean el transporte electrónico, por ello estos compuestos reducidos se acumulan antes del punto de bloqueo y compuestos oxidados después del bloqueo, por eso no se puede bar el bombeo de protones y no se forma el gradiente de protones y el pH permanecerá casi constante durante el tiempo, lo que conllevara a que no se de la producción de ATP . El mecanismo por el cual inhibe consiste en formar un enlace covalente con el cofactor Hemo a3, este se da la acumulación de especies reducidas y oxidadas y no se produce la fuerza proton motriz para la síntesis de ATP. Otra característica importante es que la azida en su forma anionica tiene un caracter básico, lo que explica porque el pH experimental fue mayor en comparación con la muestra control y con la muestra con DNP. Posteriormente, se realizó una prueba con glucosa y cada una de las sustancias inhibidoras. En la grafica 2 se observa el cambio de pH a medida que pasa el tiempo en cada muestra, para la muestra de control que no contiene ningún tipo de inhibidor el pH disminuye, es decir que la concentración de hidrogeniones (H+) aumenta. El proceso de glicolisis esta activo por la concentración alta de glucosa, que después pasa al ciclo de kreps en donde la concentración de NADH y FADH2 aumenta, luego estas moléculas pasan a la cadena de trasporte (fosforilacion oxidativa) activando los complejos de los cuales los 1,3 y 4 ayudan a general el gradiente de protones, con lo cual aumenta la concentración de H+ en la zona intermembranal de la mitocondria. Al igual que lo ocurrido en la grafica 1, el DNP y la azida tienden a que la cadena de transporte no ocurra, con lo cual la concentración de H+ no aumenta. Teniendo en cuenta que debido al bombeo de protones, el espacio intermembrana de la mitocondria tiene una diferencia de H+ de 1,4 y es 0,14 veces más positivo con respecto a la matriz, se puede cuantificar la energía asociada a un gradiente de protones. Para esto se debe recordar que el incremento de energía libre asociado al movimiento de una sustancia de un lado de la membrana esta dado por la Ecuacion 1. ΔG= RTln (1)
) + ZFΔV
Donde R vale 8,32 x 10 -3kJ/ (mol)K), T es la temperatura en kelvin (310 k), es la carga de la sustancia transportada (1), F es la constante de Faraday (96,48 Kj/ molv) y ΔG es el potencial a través de la membrana en voltios. ΔG= (8,32 x 10 -33kJ/ mol K) (310 K)(1.4)=(1) (96,48 kJ/mol V) (0,14 V) ΔG= 21,8 kJ/mol Este valor de energía libre nos quiere decir que por cada protón transportado desde la matriz al lado citoplasmico representa una energía libre de 21,8 Kj/mol. Por consiguiente la cantidad de ATP generado por el ADP y el Pi a partir del gradiente de protones, es de 30 moléculas netas de ATP.
Conclusiones
Se identificó la variación en el pH en el tiempo de acuerda al consumo de la glucosa. Se identificó la importancia del bombeo de protones en los organismos biológicos para mantener la homeostasis equilibrando en nivel de pH. Se identifico la diferencia por medio de graficas del comportamiento de un desacoplante y un inhibidor, con respecto a un control.
Bibliografía. 1. MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO. Facultad de medicina. Universidad UNAM. http://www.facmed.unam.mx/fm/pa/2010/practicas/practicas_bioquimica.pdf. Consultado el 7 de noviembre de 2013. 2. Ming Yeong L.; Lo esencial en metabolismo y nutrición: 1ra Edición 2010; Editorial Elsevier Mosby, España; paginas 30-35. 3. BERG. M. Jeremy; TYMOCZCO. L. John; STRYER Lubert. BIOQUÍMICA; 6ta edición; Editorial Reverte 2007; Capitulo 18. 4. http://www.ciencias.unal.edu.co/unciencias/web/grupoinv/index.php?op_=7 visitada el 7 noviembre de 2013.
