BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS: PROCESOS INHIBITORIOS Y DESACLOPANTES Angulo, Diana; Estrada, Luis y Gutiérrez, Gustavo. Espacio de laboratorio de Bioquímica Facultad de Ciencias Naturales Universidad Icesi
1. RESULTADOS Se pretendió evaluar la actividad de dos compuestos conocidos por afectar severamente la respiración celular: el Dinitrofenol y la Azida de Sodio (Ver estructuras en la figura 1). Para tal propósito se tomaron tres soluciones de levadura, a una se le adicionó DNP, a otra Azida y se sostuvo un control sin ninguno de los dos agentes. Se observó el comportamiento del pH desde el tiempo 0 hasta el minuto 6, luego se añadió glucosa a cada una de las soluciones de levadura para potenciar el proceso de respiración celular y hacer más observable el efecto de cada uno de los agentes tóxicos. Los resultados se encuentran a continuación Tabla 1. Variación de pH respecto al tiempo para cada uno de los ensayos
Tiempo (min) 0 3 5 7 10 15 25 35
Control DNP 6,59 6,53 5,86 5,92 5,83 5,91 CON GLUCOSA 5,44 5,62 5,31 5,35 5,23 5,23 5,08 5,05 4,95 4,97
Azida 6,51 5,98 5,98 5,77 5,75 5,74 5,76 5,69
Para apreciar de mejor manera la variación en el pH respecto al tiempo, pueden observarse las gráficas en el anexo A al final del presente documento.
Figura 1. Izq. Estructura del DNP – Dcha. Estructura de la Azida de Sodio 2. ANÁLISIS DE RESULTADOS Previo al análisis de resultados propiamente dicho es conveniente definir inhibidor y desacoplante en el presente contexto. El primer término hace referencia a un agente que bloquea el proceso de respiración celular, como es el caso del grupo azida, por tener tres de tres átomos cargados es sumamente inestable y en química, inestabilidad es sinónimo inequívoco de reactividad, de acuerdo a algunos estudios [1,2,3,4] el grupo azida se une covalentemente a algunas proteínas de suma importancia como aquellas que conforman los complejos multiproteicos de la cadena de transporte de electrones[2],
bloqueando la formación del potencial redox, impidiendo así el bombeo de protones acoplado a la respiración celular. Éste argumento se respalda con la presente evidencia experimental, ya que si se observa la columna que relaciona el cambio de pH respecto al tiempo puede observarse como éste no varía significativamente si es comparado con el cambio presentado en la solución en la cual las levaduras se encontraban en presencia del DNP o incluso respecto a la solución control, la baja variación en el pH es un reflejo claro de que la actividad de bombeo de H+ está considerablemente diezmada. Por otra parte, cuando se habla de un agente desacoplante, se hace referencia a aquel que no detiene el proceso, sin embargo impide la comunicación entre procesos que ocurren por sinergia mutua, como lo son la síntesis de ATP y la creación del gradiente químico y electroquímico según el cual se impulsa la ATPasa en la teoría quimiosmótica. El DNP afecta la integridad de la membrana mitocondrial permitiendo que los protones pasen a través de ésta y no obligatoriamente por la ATPasa, tal y como se esperaría la concentración de hidrogeniones aumenta, de mano de la disminución en el pH, ya que éstos escapan indefinidamente al medio, lo que sustenta la tésis de que el DNP es un agente desacoplante. 3. CONCLUSIONES La azida es un agente inhibidor del bombeo de protones, ésta afirmación ésta respaldada por la evidencia experimental, dado que el pH varió muy poco a través del tiempo en la
solución de levadura que contenía el agente en cuestión. En la solución que contenía DNP el pH disminuyó en mayor cuantía que en las otras dos soluciones, lo que respalda la tésis de que dicho compuesto es un agente desacoplante ANEXO A: GRÁFICOS pH RESPECTO AL TIEMPO DE LOS TRES ENSAYOS
4. BIBLIOGRAFÍA 1. WEISS J.N., LAMP S.T. Glycolysis preferentially inhibits ATP-sensitive + K channels in isolated guinea pig cardiac myocytes. Science. 1987;238:67–69.
2. SHYNG S.-L., FERRIGNI T., NICHOLS C.G. Regulation of KATP channel activity by diazoxide and MgADP; Distinct functions of the two nucleotide binding folds of the sulphonylurea receptor. J. Gen. Physiol. 1997;110:643–654. 3. PENEFSKY H.S. Mechanism of inhibition of mitochondrial adenosine triphosphate by dicyclohexylcarbodiimide and oligomycin: relationship to ATP synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985;82:1589–1593. 4. ASHFORD M.L.J. Potassium channels and modulation of insulin secretion Potassium Channels: Structure, Classification, Function and Therapeutic Potential 1990. Chichester: Ellis Horwood Limited; 300–325.325Cook, N.S. (ed). pp. 5. TSUBAKI M., YOSHIKAWA S. Fouriertransform infra-red study of azide binding to the Fe3-CuB binuclear site of bovine cytochromeoxidase. Biochem. 1993;32:174 –182.
