IN STITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE ÁLAMO TEMAPACHE TEMAPACHE TUXPAN-VER
NOMBRE: Angel Ricardo Blanco Blanco MATERIA: MAESTRA:
Microbiologia
IIA. Nancy Deyanira Hernandez
TRABAJO: Antología Unidad 1-7.
UNIDAD NO. 1 INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA 1.1. Conc 1.1. Concep epto to y cont conten enid ido o de la Mic Micro robi biol olo o!a !a 1.1.1. Concepto de Microbiolo!a Microbiolo!a y "#" i$plicacione" El vocabl vocablo o Microb Microbiol iologí ogía a deriva deriva de las palabr palabras as griega griegas: s: mikr mikros os (peque (pequeño) ño),, bio bios (vida) (vida) y logos (ciencia), por lo que se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debao del poder resolutivo del oo !umano. Esto !ace que el obeto de esta disciplina venga determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. "recis "recisame amente nte,, el origen origen tardío tardío de la Microb Microbiolo iología gía con relaci relaci#n #n a otras otras ciencia cienciass biol#g biol#gica icas, s, y el reconocimiento de las m$ltiples actividades desplegadas por los microorganismos, !ay que atribuirlos a la carencia, durante muc!o tiempo, tiempo, de los instrumentos y t%cnicas pertinentes. &on la invenci#n del micros microscop copio io en el siglo siglo ' ' comien* comien*a a el lento lento despeg despegue ue de una nueva rama del conoci conocimie miento nto,, ine+istente !asta entonces. urante los siguientes 1- años su progreso se limit# casi a una mera descripci#n de tipos morfol#gicos microbianos, y a los primeros intentos ta+on#micos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los /sistemas naturales0 de los einos 2nimal y egetal. El asenta asentamie miento nto de la Microb Microbiol iologí ogía a como como ciencia ciencia est3 estrec estrec!am !ament ente e ligado ligado a una serie de controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religi#n de la %poca), que se prolongaron !asta finales del siglo ''. 4a resoluci#n de estas pol%micas dependi# dependi# del desarrollo de una serie de estrategias e+perimentales fiables (esterili*aci#n, cultivos puros, perfeccionamiento de las t%cnicas microsc#picas, entre otras), que a su ve* dieron nacimiento a un cuerpo co!erente de conocimientos que constituy# el n$cleo aglutinador de la ciencia microbiol#gica. El reconocimiento del origen microbiano microbiano de las fermentaciones, fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generaci#n generaci#n espont3nea espont3nea,, y el triunfo de la teoría germinal germinal de la enfermedad enfermedad (cualquier (cualquier enfermedad enfermedad infecciosa est3 causad por g%rmenes) propuesta por "asteur y 5oc!, representan la edad de oro de la 6acteriologí 6acteriología a y las conquistas conquistas definitivas que proporcionan proporcionan la naturale*a naturale*a de la Microbiología Microbiología en los albores del siglo ''. 7ras la Edad de 8ro de la 6acteriología, inaugurada por las grandes figuras de "asteur y 5oc!, la Microbiología qued# durante cierto tiempo tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrec!amente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la 9uímica, que le aportaría varios avances metodol#gicos fundamentales. in embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudio estudioss b3sico b3sicoss centra centrados dos con ciertas ciertas bacter bacterias ias del suelo suelo poseed poseedora orass de capaci capacidad dades es metab#licas especiales, incluyendo el descubrimiento de las las que afectan a la nutrici#n de las plantas, logr# !acer ver la ubicuidad ubicuidad ecol#gica y la e+trema diversidad fisiol#gica de los microorganismos. microorganismos. e esta forma, se establecía una cabe*a de puente puente entre la Microbiología y otras ciencias biol#gicas, que lleg# a su momento decisivo cuando se comprob# la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostr#, con material y t%cnicas microbiol#gicas microbiol#gicas que la mol%cula de la !erencia era el 2;. &on ello se asiste a un íntimo y f%rtil intercambio entre la Microbiología, la
UNIDAD NO. 1 INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA 1.1. Conc 1.1. Concep epto to y cont conten enid ido o de la Mic Micro robi biol olo o!a !a 1.1.1. Concepto de Microbiolo!a Microbiolo!a y "#" i$plicacione" El vocabl vocablo o Microb Microbiol iologí ogía a deriva deriva de las palabr palabras as griega griegas: s: mikr mikros os (peque (pequeño) ño),, bio bios (vida) (vida) y logos (ciencia), por lo que se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debao del poder resolutivo del oo !umano. Esto !ace que el obeto de esta disciplina venga determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. "recis "recisame amente nte,, el origen origen tardío tardío de la Microb Microbiolo iología gía con relaci relaci#n #n a otras otras ciencia cienciass biol#g biol#gica icas, s, y el reconocimiento de las m$ltiples actividades desplegadas por los microorganismos, !ay que atribuirlos a la carencia, durante muc!o tiempo, tiempo, de los instrumentos y t%cnicas pertinentes. &on la invenci#n del micros microscop copio io en el siglo siglo ' ' comien* comien*a a el lento lento despeg despegue ue de una nueva rama del conoci conocimie miento nto,, ine+istente !asta entonces. urante los siguientes 1- años su progreso se limit# casi a una mera descripci#n de tipos morfol#gicos microbianos, y a los primeros intentos ta+on#micos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los /sistemas naturales0 de los einos 2nimal y egetal. El asenta asentamie miento nto de la Microb Microbiol iologí ogía a como como ciencia ciencia est3 estrec estrec!am !ament ente e ligado ligado a una serie de controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religi#n de la %poca), que se prolongaron !asta finales del siglo ''. 4a resoluci#n de estas pol%micas dependi# dependi# del desarrollo de una serie de estrategias e+perimentales fiables (esterili*aci#n, cultivos puros, perfeccionamiento de las t%cnicas microsc#picas, entre otras), que a su ve* dieron nacimiento a un cuerpo co!erente de conocimientos que constituy# el n$cleo aglutinador de la ciencia microbiol#gica. El reconocimiento del origen microbiano microbiano de las fermentaciones, fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generaci#n generaci#n espont3nea espont3nea,, y el triunfo de la teoría germinal germinal de la enfermedad enfermedad (cualquier (cualquier enfermedad enfermedad infecciosa est3 causad por g%rmenes) propuesta por "asteur y 5oc!, representan la edad de oro de la 6acteriologí 6acteriología a y las conquistas conquistas definitivas que proporcionan proporcionan la naturale*a naturale*a de la Microbiología Microbiología en los albores del siglo ''. 7ras la Edad de 8ro de la 6acteriología, inaugurada por las grandes figuras de "asteur y 5oc!, la Microbiología qued# durante cierto tiempo tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrec!amente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la 9uímica, que le aportaría varios avances metodol#gicos fundamentales. in embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudio estudioss b3sico b3sicoss centra centrados dos con ciertas ciertas bacter bacterias ias del suelo suelo poseed poseedora orass de capaci capacidad dades es metab#licas especiales, incluyendo el descubrimiento de las las que afectan a la nutrici#n de las plantas, logr# !acer ver la ubicuidad ubicuidad ecol#gica y la e+trema diversidad fisiol#gica de los microorganismos. microorganismos. e esta forma, se establecía una cabe*a de puente puente entre la Microbiología y otras ciencias biol#gicas, que lleg# a su momento decisivo cuando se comprob# la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostr#, con material y t%cnicas microbiol#gicas microbiol#gicas que la mol%cula de la !erencia era el 2;. &on ello se asiste a un íntimo y f%rtil intercambio entre la Microbiología, la
"or $ltimo, la vertiente vertiente aplicada que estuvo en la base base de la creaci#n de la Microbiología, Microbiología, mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigaci#n b3sica, y !oy muestra una no menos prometedora perspectiva de e+pansi#n a m$ltiples campos de la actividad !umana, desde el control de enfermedad enfermedades es infecciosas infecciosas (!igiene, (!igiene, vacunaci#n vacunaci#n,, quimioterapia quimioterapia,, antibioter antibioterapia) apia) !asta !asta el aprovec!amiento econ#mico racional de los m$ltiples procesos en los que se !allan implicados los microorganismos (biotecnologías).
1.1.=. Ob%eto de e"t#dio de la Microbiolo!a 1.1.=.1. Lo" $icroorani"$o" co$o ob%eto $aterial de la Microbiolo!a 4a Microbiología se define como la ciencia que estudia los microorganismos, esto es, aquellos organismos demasiado pequeños cuya visuali*aci#n requiere e l empleo del microscopio. 7al definici#n implica que el obeto material de la Microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres vivos que investiga, lo que supone que abarca una enorme !eterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y ta+on#micos: desde partículas no celulares como los virus, viroides y priones, !asta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los proto*oos y parte de las algas y de los !ongos. 4os microorganismos son seres vivos de tamaño microsc#pico dotados de individualidad, con una organi*aci#n biol#gica sencilla, acelular o celular, y en este $ltimo, pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos, coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciaci#n en teidos u #rganos, y que necesitan para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. 6ao esta denominaci#n se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades subcelulares. 4os microorganismos celulares comprenden todos los procariotas incluidos en el ominio Archea y ominio Bacteria , así como los microorganismos eucari#ticos incluidos en el ominio Eukarya, dentro de diferentes reinos: !ongos filamentosos o verdaderos> levaduras, algas y proto*oos. 4os virus y partículas subvir3sicas son otro tipo de obetos de estudio de la Microbiología, aunque son entidades no celulares que no poseen ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biol#gica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia. 4os &ir#" son entidades no celulares de muy pequeño tamaño (normalmente inferior al del m3s pequeño procariota), por lo que debe de recurrirse al microscopio electr#nico para su visuali*aci#n. on agentes infectivos de naturale*a obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporaci#n al protoplasma vivo para que su material gen%tico sea replicado por medio de su asociaci#n m3s o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una c%lula a otra. &ada tipo de virus consta de una sola clase de 3cido nucleico (;2 o ;2, nunca ambos), con capacidad para codificar varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones en*im3ticas, mientras que otras son estructurales, disponi%ndose %stas en cada partícula vir3sica (viri#n) alrededor del material gen%tico formando una estructura regular (c3psida)> en algunos virus e+iste, adem3s, una envuelta e+terna de tipo membranoso, derivada en parte de la c%lula en la que se desarroll# el viri#n (bicapa lipídica procedente de membranas celulares) y en parte de origen vir3sico (proteínas) En su estado e+tracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicaci#n de su 3cido nucleico y de obtenci#n de energía. Esto l es obliga a un modo de vida ( sic ) parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el viri#n pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material gen%tico, que al superponer su informaci#n a la de la c%lula !ospedadora, logra ser e+presado y replicado, produci%ndose eventualmente la formaci#n de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo. 4os &iroide" son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvir3sicas, descubiertas en 1?@A por 7.8. iener en plantas. Est3n constituidos e+clusivamente por una pequeña mol%cula circular de 2; de una sola !ebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un e+tenso, pero no total, empareamiento intracatenario de bases por *onas de !omología interna. &arecen de capacidad codificadora y muestran cierta semean*a con los intrones autocatalíticos de clase , por lo que podrían representar secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. e desconocen detalles de su modo de multiplicaci#n, aunque algunos se locali*an en el
nucleoplasma, e+istiendo pruebas de la implicaci#n de la ;2 polimerasa en su replicaci#n, por un modelo de círculo rodante que genera concat%meros lineares. Esta replicaci#n parece requerir secuencias conservadas !acia la porci#n central del viroide. 4os viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patol#gicas. El mecanismo de patogenia no est3 aclarado, pero se sabe que muc!os de ellos se asocian con el nucleolo, donde qui*3 podrían interferir> sin embargo, no e+isten indicios de que alteren la e+presi#n
g%nica (una de las !ip#tesis sugeridas)> cada mol%cula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia. 4os ;2" "at'lite" son pequeñas mol%culas de tamaño similar al de los viroides de plantas (BBCD bases), que son empaquetados en c3psidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no muestran !omologías). e replican s#lo en presencia del virus colaborador específico, modificando (aumentando o disminuyendo) los efectos pat#genos de %ste. 4os &ir#"oide" constituyen un grupo de ;2 sat%lites no infectivos, presentes en el interior de la c3psida de ciertos virus, con semean*as estructurales con los viroides, replic3ndose e+clusivamente unto a su virus colaborador. 4os prione" son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por tanley "rusiner en 1?1, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos (por eemplo, el FscrapieF o prurito de oveas y cabras, la encefalitis espongiforme bovina), incluyendo los !umanos (Guru, síndrome de
Jinalmente, la Microbiología !a de ocuparse de todas las t%cnicas y metodologías destinadas al estudio e+perimental, maneo y control de los microorganismos, es decir, de todos los aspectos relacionados con el modo de trabao de una ciencia empírica.
1.1.B. Ubicaci*n de lo" $icroorani"$o" en lo" "i"te$a" de cla"i(icaci*n En la d%cada de los K, surgi# una nueva visi#n sobre la clasificaci#n de los seres vivos y sus posibles relaciones evolutivas, provocando una verdadera revoluci#n en la 6iología moderna. "ara entender esta revoluci#n debemos primero conocer cu3l era el conocimiento que !abía entrado en crisis. El llamado paradigma clásico consideraba que la clasificaci#n natural de los seres vivos comprendía s#lo dos grandes clases de organismos (Jigura 1): "rocariontes (c%lulas sin n$cleo) y Eucariontes (c%lulas con n$cleo)> estas dos grandes clases se diferenciaban profundamente a nivel de su estructura y organi*aci#n subcelular, por lo que se les consider# siempre como grupos e+cluyentes. 2dem3s, estas clases de organismos eran agrupadas en - reinos (L!ittaGer, 1?@?), conformando los procariontes por si solos, el llamado reino Monera o Prokaryota (considerado primitivo o ancestral). 4os D reinos eucariontes restantes Protozoa, Hongo, Plantae y Animalia serían reinos derivados del reino Monera (m3s evolucionados)
Jigura 1. Esquema de los - reinos cl3sicos de LittaGer y sus relaciones evolutivas: reino Meta*oa (2nimalia), reino Metafita ("lantae), reino Jungi (ongo), reino "rotista ("roto*oo) y reino "rocariota (Monera)
En el año 1?A se descubre que las arquibacterias, !asta ese momento incluidas dentro del eino M#nera, eran un nuevo tipo de seres vivos, tan distantes evolutivamente de las bacterias como de los eucariontes. En el año 1?? Loese incorpora estos descubrimientos a un nuevo esquema sobre la evoluci#n y clasificaci#n de los seres vivos, planteando que la evoluci#n !abría ocurrido en tres líneas o linaes filogen%ticos principales, y no en dos (procariontes y eucariontes), como postulaba el paradigma cl3sico. Esta nueva visi#n se caracteri*a por considerar a las arquibacterias, actualmente denominadas arc!eas, como una tercera forma de vida, muy diferentes a los eucariontes y procariontes cl3sicos, el cambio propuesto por Loese resalta las diferencias, !asta a!ora ocultas, entre organismos procariotas. 7odos estos cambios y nuevas propuestas !an sido posibles gracias al estudio y comparaci#n de secuencias de macromol%culas conservadas en todos los seres vivos (denominadas reloes moleculares), tales como el ;2 ribosomal (especialmente el ;2r 1@) y algunas proteínas conservadas (como los factores traduccionales EJC< y EJC7u). 7ras una gran labor e+perimental, Loese se centr# en un conunto de informaci#n gen%tica en particular descubierto en el llamado +RNA $itocondrial 1,"+. Esta secuencia de c#digo gen%tico aparece en el genoma de todos los seres vivos. Es una secuencia perfectamente conservada, lo cual significa que !a evolucionado muy lentamente, por lo que puede ser utili*ada para rastrear los cambios evolutivos sucedidos a lo largo de períodos de tiempo muy largos.
El giro paradigm3tico ocurrido en las dos $ltimas d%cadas, se ve plasmado en el nuevo 3rbol filogen%tico propuesto por Loese para la evoluci#n de los seres vivos. Esta nueva clasificaci#n se basa en una visi#n tricot#mica (tres linaes principales) e incorpora un nuevo nivel o rango ta+on#mico denominado Dominio (superior a Reino). Estos tres nuevos linaes evolutivos reciben las siguientes denominaciones: dominio Bacteria , dominio Archaea y dominio Eukaya (Jigura =).
En el 3rbol filogen%tico de la vida, la distancia entre dos especies cualesquiera, tra*ada a lo largo de las líneas que las conectan, es proporcional a las diferencias entre su ;2 mitocondrial. 4as especies con secuencias pr3cticamente id%nticas est3n presumiblemente relacionadas y son representadas en el 3rbol, unas cerca de las otras> aquellas que est3n ampliamente separadas, son parientes m3s leanos, y cuando se combina cierta cantidad de datos es posible inferir linaes. &uando se emplea este m%todo con nuestras familiares plantas y animales, estos tra*os en el /3rbol de la vida0 son muy similares a los de los 3rboles evolutivos deducidos de la anatomía estructural, pero la gran sorpresa lleg# cuando se aplic# esta t%cnica al mundo microbiol#gico. entro del Dominio Bacteria e+isten varios linaes bacterianos diferentes, cada uno de ellos estrictamente debería corresponder a un reino diferente, sin embargo por ra*ones de índole !ist#rica, se les denomina ivisiones o "!yla. oy en día se describen ivisiones o "!yla en el Dominio Bacteria, siendo la gran mayoría de estas bacterias fotolitotr#ficas, quimiolitotr#ficas, ambientales y no pat#genas para el !ombre, muc!as de ellas son fundamentales en varios ciclos geoquímicos del planeta (carbono, nitr#geno, f#sforo, entre otros). El Dominio Archaea contiene al menos dos reinos (divisiones o "!yla) nuevos: Crenarchaeota y Euryarchaeota. El ominio EuGarya !ist#ricamente comprendería los einos (ominios o p!yla) ungi , Animalia, Plantae y Protozoa (llamados a veces Protista)> pero actualmente, se conserva a los B primeros, mientras que el antiguo eino Protozoa, se fragmenta en m$ltiples einos (ivisiones o "!yla) tales como: Microspori!ios, Diplomona!as, Apicomple"a, Al#eola!os, $tramenopiles, E"ca#a!os, entre otros. 2sí, los microorganismos se encuentran ubicados en los tres dominios: Archea, Bacteria y Eukarya, este $ltimo comprende a todos los linaes microbianos constituidos por c%lulas eucari#ticas.
Jigura =. Nrbol filogen%tico de la vida, Este 3rbol filogen%tico se basa en la comparaci#n de secuencias del ;2 ribosomal 1@ . 4a raí* se locali*# mediante el estudio de los factores traduccionales EJC7u y EJC< (Loese, et al., 1??).
4os virus no se incorporan a esta clasificaci#n por el !ec!o de no estar conformados por c%lulas y constituirse en seres vivos s#lo en uni#n a una c%lula viva pree+istente. us orígenes no est3n claros,
algunos investigadores opinan que derivarían de entidades celulares y por lo tanto no serían primitivos. 8tros investigadores piensan que corresponderían a remanentes de una etapa de la evoluci#n preCcelular de la vida, por lo que en este caso se considerarían entes primitivos.
ecientemente se descubri# una nueva familia de virus denominada Mimivirus, que se caracteri*a por infectar amebas y poseer un genoma de ;2 mayor que el de algunas bacterias (dos veces mayor que el genoma de la bacteria Micoplasma genitalium). 2lgunos investigadores piensan, en base al estudio de las secuencias de algunas en*imas de estos virus, que esta familia podría corresponder a virus arcaicos, anteriores incluso al origen de las c%lulas eucariontes. En todo caso, !oy en día no e+iste consenso entre los investigadores respecto al origen de los virus y no parece posible, al menos al corto pla*o, dilucidar e+perimentalmente tal cuesti#n.
1.-. De"arrollo i"t*rico de la Microbiolo!a 2unque los microorganismos se originaron !ace apro+imadamente D. millones de años, la Microbiología es relativamente una ciencia oven. 4os primeros microorganismos se observaron !ace B años y sin embargo pasaron unos = años !asta que se reconoci# su importancia. 4a Microbiología aparece a finales del siglo '' como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodol#gicos que se !abían iniciado en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisi#n de ideas y preuicios seculares sobre la din3mica del mundo vivo. e acuerdo al esquema propuesto por &ollard (l?A@), se distinguen cuatro periodos en el desarrollo de la Microbiología: "rimer periodo. "eriodo de especulaci#n que se e+tiende desde la antigHedad !asta el arribo de los primeros microscopistas. egundo periodo. 2cumulaci#n de observaciones desde l@A- con el descubrimiento de los microorganismos por 4eeuOen!oeG, !asta mediados del siglo ''. 7ercer periodo. nicia con el cultivo de microorganismos, que llega !asta finales del siglo '', donde las investigaciones de "asteur y 5oc! encabe*an el establecimiento de la Microbiología como ciencia e+perimental. &uarto periodo. 2 partir de los albores del siglo '' con los descubrimientos de LinogradsGy, 6eierincG, 5luver y van ;iel, !asta nuestros días, en el que los microorganismos se estudian desde los aspectos morfol#gicos, fisiol#gicos, bioquímicos, gen%ticos, ecol#gicos, entre otros, lo que conlleva a la Microbiología a un e+traordinario crecimiento, así como tambi%n, al surgimiento de disciplinas microbiol#gicas especiali*adas como la irología y la nmunología entre otras, y a la estrec!a imbricaci#n de las ciencias microbiol#gicas en el marco general de las &iencias 6iol#gicas.
1.=.1. /eriodo pre&io al de"c#bri$iento del $icro"copio 0periodo de e"pec#laci*n urante el periodo de especulaci#n, la !umanidad tuvo conocimiento sobre las actividades de los microorganismos, aunque %stos no pudieron ser observados. El ser !umano producía bebidas alco!#licas, productos l3cteos y pan, sin embargo, especulaban sobre la forma en que se efectuaban dic!os procesos fermentativos. "or otro lado, tambi%n se generaron especulaciones sobre el origen d e las enfermedades infecciosas. iversas fuentes escritas de la antigHedad griega y romana !ablan de g%rmenes invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. 4ucrecio (?@C-- a.&.), en su / De rerum natura0 !ace varias alusiones a /semillas de enfermedad0. En el enacimiento europeo,
1.=.=. /ri$ero" $icro"copi"ta" y el de"c#bri$iento de lo" $icroorani"$o" Pa en el siglo ', con la invenci#n de las primeras lentes para corregir la visi#n, surgi# una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los obetos. En el siglo ' surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física #ptica de las lentes de aumento, pero no encontraron una aplicaci#n inmediata. e dice que
/microsc#picas0 invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso est3 claro que no tuvieron ninguna repercusi#n. El descubrimiento de los microscopios fue obra del !oland%s 2ntony van 4eeuOen!oeG, quien fue la primera persona en describir los microorganismos en detalle. En 1@A- descubri# que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que a los cuales denomin# anim3culos. En 1@B descubre las bacterias, por lo que se considera el Fpadre de la MicrobiologíaF. us dotes de observador le llevaron asimismo a describir proto*oos (como &iar!ia,
que encontr# en sus propias !eces), la estructura estriada del m$sculo, la circulaci#n capilar, a descubrir los espermato*oides y los gl#bulos roos (por lo que tambi%n se le considera el fundador de la istología animal), así como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. imult3neamente el ingl%s obert ooGe, usando microscopios compuestos, describi# los !ongos filamentosos en 1@@A, y descubri# la estructura celular de las plantas en 1@@-, acuñando el t%rmino c%lula. in embargo, estas observaciones no condueron a ninguna investigaci#n acerca de las posibles actividades de los microorganismos, ni como agentes de fermentaciones ni de enfermedades infecciosas ya que el desarrollo de la química y de la medicina era demasiado primitivo. Qna ve* descubiertos los microorganismos por 4eeuOen!oeG se empe*# a especular sobre el origen de estos anim3culos, por lo que se formaron dos escuelas: la abiog%nesis (generaci#n espont3nea) apoyada por los preformacionistas y la biog%nesis (los anim3culos se originaban a partir de anim3culos padres). 4a doctrina de la generaci#n espont3nea fue puesta en entredic!o por los e+perimentos de edi quien acuñ# la e+presi#n F 'mne #i#um e" o#oF (1@@), tras comprobar que los gusanos encontrados en la carne provenían de los !uevos que previamente !abían depositado en la carne las moscas. 4os descubrimientos de edi tuvieron el efecto de desacreditar la teoría de la generaci#n espont3nea para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los reci%n descubiertos anim3lculos, una cosa eran los !uevos de moscas y otra los microorganismos. En 1AD- ;eed!am !irvi# tro*os de carne para destruir los organismos pree+istentes y los coloc# en un recipiente abierto, posteriormente, observ# colonias de microorganismos sobre la superficie y concluy# que se generaban espont3neamente a partir de la carne. En 1A@?, pallan*ani repiti# el e+perimento pero tapando los recipientes, no apareciendo las colonias, lo que contradecía la teoría de la generaci#n espont3nea. "ero ;eed!am argument# que el aire era esencial para la vida incluida la generaci#n espont3nea de microorganismos y este aire !abía sido e+cluido en los e+perimentos de pallan*ani. En 1B@ Jran* c!ul*e pas# el aire a trav%s de unas soluciones 3cidas fuertes !acia el interior de un recipiente con carne !ervida. 2l año siguiente 7!eodor c!Oann pas# el aire a trav%s de tubos calientes. 4os microorganismos no aparecían en ning$n caso ya que los microorganismos presentes en el aire !abían sido aniquilados. in embargo, los que apoyaban la generaci#n espont3nea comentaban que el 3cido y el calor alteraban el aire de tal manera que impedía la generaci#n espont3nea de los microorganismos. En 1@D "asteur pone fin a la controversia sobre el origen de los microorganismos al utili*ar matraces con cuello de cisne, el aire pasaba libremente a trav%s del cuello, pero los microorganismos no aparecían en la soluci#n ya que las partículas de polvo y microorganismos sedimentaban en el recodo del cuello. Estos e+perimentos de "asteur promovieron el reconocimiento de la biog%nesis, de esta forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abría la Edad de 8ro del estudio científico de las formas de vida no observables a simple vista. 4os $ltimos esc%pticos quedaron silenciados cuando en 1AA Io!n 7yndall aplic# su sistema de esterili*aci#n por calentamiento discontinuo (!oy conocida precisamente como tindali*aci#n), que evidenci# la e+istencia de formas microbianas de reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco m3s tarde por Jerdinand &o!n al descubrir las esporas bacterianas. in duda desde la "re!istoria los !ombres utili*an con provec!o las fermentaciones. 4as teorías científicas de esa %poca reconocían la presencia de levaduras en la fermentaci#n alco!#lica, pero estas levaduras eran consideradas como compuestos químicos compleos, sin vida. Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von 4iebig y LR!ler. 4uis "asteur, químico franc%s, propuso la teoría vitalística y demostr# que las c%lulas viables de levaduras causan fermentaci#n en condiciones anaer#bicas> durante dic!a fermentaci#n el a*$car presente en el mosto es convertido principalmente en etanol y &8 =. En 1@@, "asteur public# la obra titulada FEstudios sobre el vino, sus enfermedades, causas que las provocan. ;uevos procedimientos para la conservaci#n y
enveecimientoF. Entre las meoras aconseadas !abía un m%todo para aumentar la calidad de la conservaci#n de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de @S & durante 1 minutos y despu%s enfriarlos r3pidamente. Esta t%cnica !a venido a ser conocida como pasteuri*aci#n y es a!ora ampliamente utili*ada en el tratamiento de la lec!e.
En 1-D@, el virus del mosaico del tabaco pasaba los filtros que retenían a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en el laboratorio como lo !acen las bacterias, !an permitido reali*ar algunas modificaciones en los postulados de 5oc!. Este trabao sobre el carbunco conduo r3pidamente a la edad de oro de la bacteriología. En =- años la mayoría de los agentes bacterianos de las principales enfermedades !umanas !abían sido descubiertos y descritos. 2ctualmente es difícil comprender la magnitud de la miseria y devastaci#n causada por los microorganismos antes de 1?-. En Europa, durante el período de 1BDAC1B- ocurri# una epidemia de peste bub#nica, conocida como la Fmuerte negraF y causada por la bacteria (ersinia pestis, se estim# que murieron =- millones de personas. &on el conocimiento de que los microorganismos causaban enfermedades, los científicos se dedicaron a investigar la prevenci#n y el tratamiento. 4os !ospitales adoptaron la antisepsia (Iosep! 4ister. 1@) la cual previene la diseminaci#n de las enfermedades infecciosas mediante la in!ibici#n o destrucci#n de los agentes causantes. 7ambi%n se descubri# la inmuni*aci#n ("asteur, 1), proceso que estimula las defensas del cuerpo frente a la infecci#n. e empe*# a aplicar la quimioterapia ("aul E!rlic!,
1.=.B. 2l c#lti&o de lo" $icroorani"$o" 4a doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo '', mantenía que los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales. 2 estas ideas se oponían frontalmente investigadores como 5oc!, "asteur y &o!n, que estaban convencidos de la especificidad y constancia morfol#gica y fisiol#gica de cada tipo de microorganismo (monomorfismo). El pleomorfismo !abía surgido como una e+plicaci#n a la gran variedad de formas y actividades que aparecían en un simple frasco de infusi#n, pero ya "asteur, en sus estudios sobre la fermentaci#n, se !abía percatado de que los cultivos que aparecían podían considerarse como una sucesi#n de distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composici#n de la comunidad microbiana. 4a
soluci#n definitiva a esta cuesti#n dependía, de nuevo, de un desarrollo t%cnico, que a su ve* iba a suministrar una de las !erramientas características de la nueva ciencia: l os m%todos de cultivo puro. 4os primeros cultivos puros fueron obtenidos por el mic#logo 6refeld, quien logr# aislar esporas de !ongos y cultivarlas sobre medios s#lidos a base de gelatina. "or su menor tamaño, este m%todo se !acía inviable para las bacterias, por lo que se recurri# a un m%todo basado en diluciones: 4ister, en 1A reali*# diluciones secuenciales de cultivos mi+tos, !asta lograr muestras en las que e+istía una sola c%lula. "ero la t%cnica era larga y tediosa y, adem3s, normalmente s#lo se lograban aislar c%lulas
del tipo bacteriano m3s abundante en el cultivo original> sin embargo, el e+perimento sirvi# para confirmar la naturale*a /particulada0 de los agentes de las fermentaciones. "or aquella %poca 5oc! buscaba con a!ínco m%todos m3s sencillos de cultivo puro, indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias pat#genas. "rimero emple# rodaas de patata como sustrato s#lido nutritivo sobre el que se podían desarrollar colonias macrosc#picas de bacterias que presentaban morfología característica, que 5oc! interpret# como resultantes del crecimiento a partir de c%lulas individuales. "ero enseguida recurri# a compactar el típico caldo de cultivo a base de carne (diseñado por 4oeffler) añadi%ndole gelatina (11). El medio s#lido así logrado era transparente, lo que permitía visuali*ar f3cilmente los rasgos coloniales, y contenía los nutrientes adecuados para el crecimiento de una amplia gama de bacterias. Tstas eran inoculadas en la superficie del medio con un !ilo de platino pasado previamente por la llama, por la t%cnica de siembra en estría. in embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por determinados microorganismos, y de tener un bao punto de fusi#n> ambos problemas se solventaron cuando en 1= el m%dico alem3n Lalter esse, introduo el agar (polisac3rido e+traído de algas roas) como nuevo agente solidificante. El trabao de 5oc! ya citado tuvo la trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1A "etri, un ayudante de 5oc!, sustituy# las engorrosas bandeas de vidrio cubiertas con campanas, usadas !asta entonces para los cultivos s#lidos, por un sistema maneable de placas de cristal planas, que se conoce como caas de "etri. El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por 6eierincG y LinogradsGy entre 1 y los primeros años del siglo '', sobre bacterias implicadas en procesos biogeoquímicos y poseedoras de características fisiol#gicas distintivas (quimioaut#trofas, fiadoras de nitr#geno, entre otras). Estos medios, donde se aplica a pequeña escala el principio de selecci#n natural, se diseñan de forma que su composici#n química definida favore*ca s#lo el crecimiento de ciertos tipos fisiol#gicos de microorganismos, $nicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio. 8tra importante aportaci#n a este /período de cultivo0 dentro del desarrollo de la Microbiología surgi# del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta alg$n rasgo bioquímico o metab#lico, lo que contribuye a la identificaci#n microbiana. Jue LHrt* quien, en 1?=, introduo el uso de indicadores de p, incorporados en los medios, lo cual permitía revelar la producci#n de acidificaciones por fermentaci#n en ciertas bacterias.
misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambi%n para los comien*os de la quimioterapia. Estas innovaciones t%cnicas (m%todos de cultivo, microscopía y tinciones) fueron fundamentales (unto con los sistemas de esterili*aci#n abordados en el anterior apartado) para la consolidaci#n de la Microbiología como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulaci#n que !asta entonces !abían predominado.
1.=.D. A#e de la Microbiolo!a 03inorad"4y5 Bei%erinc45 6l#y&er y &an Niel de este modo lograron una brillante síntesis de las observaciones microbiol#gicas y químicas. El mismo año de 1 6eierincG logr# el cultivo puro in #itro de las bacterias nodulares (a las que bauti*# como Bacillus ra!icicola), observando
que no reducían nitr#geno en vida libre> m3s tarde (1?) aport# la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiri%ndose de esta forma la facultad de fiar nitr#geno en su asociaci#n con la raí* de la planta. r#nicamente el nombre definitivo para las bacterias de los n#dulos de leguminosas ( Rhizobium) fue propuesto por JranG, quien durante muc!o tiempo se !abía negado a reconocer los resultados de
ellriegel y Lillfa!rt, y que !abía oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fiaci#n de nitr#geno era un rasgo general de las plantas, !asta creer que las estructuras intranodulares observadas a microcopio (bacteroides) eran gr3nulos de reserva (incluidas las que %l mismo observ# en plantas no leguminosas de los g%neros Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bauti*ada en su !onor Crankia)> incluso cuando se convenci# de que los simbiontes eran bacterias (y no !ongos o mi+omicetes), pensaba que %stas s#lo estimulaban a que las plantas fiaran nitr#geno en sus !oas> su /conversi#n0 (y a$n así incompleta y con reticencias) no lleg# !asta 1?=. El aislamiento de los bacteroides intranodulares ("ra*moOsGi, 1?), y la relaci#n entre su formaci#n y la fiaci#n de nitr#geno (;obbe y iltner, 1?B) complet# esta primera oleada de investigaci#n sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la 2gronomía. Estos estudios est3n en la base de todos los ulteriores trabaos de Microbiología 2grícola, de modo que esta especiliadad fue incorporada tempranamente a los laboratorios científicos y estaciones e+perimentales. 4as obras trascendentales de LinogradsGy y 6eierincG abrieron un nuevo !ori*onte para el estudio de la diversidad microbiana. 4a escuela de 6eierincG, en la Qniversidad 7%cnica de elft, fue continuada por 2.I. 5luyver y &.6. van ;iel, siendo este $ltimo el /padre0 de la escuela norteamericana desde su establecimiento en &alifornia, ya que form# a figuras tan importantes como .P. tanier, .E. ungate o M. oudoroff. 4a escuela !olandesa fundada por 6eierincG tuvo asimismo otra fructífera /colonia0 en la ciudad alemana de 5onstan*, donde ;. "fennig continu# el trabao emprendido unto a van ;iel en elft. 7odos estos autores, y sus colaboradores, fueron reali*ando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosint%ticas, los tipos de organismos litotr#ficos, y profundi*ando en multitud de aspectos estructurales y fisiol#gicos de las bacterias reci%n descubiertas. &omo dice 7.. 6rocG en una recensi#n de 5luyver (1?@1) /los !ombres de la escuela de elft de Microbiología
1.B. Relacione" de la Microbiolo!a con otra" ciencia" El auge de la microbiología desde finales del siglo '' se plasm#, entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que suministr# un enorme volumen de nuevo material biol#gico sobre el que trabaar, aplic3ndose una serie de enfoques que eran ya !abituales en las ciencias naturales m3s antiguas> así, !abía que crear un marco ta+on#mico (con sus normas de nomenclatura) para encuadrar a los organismos reci%n descubiertos, era factible desarrollar trabaos sobre morfología y fisiología comparadas, sobre variabilidad y !erencia, evoluci#n, ecología, etc. e este modo la oven Microbiología fue obeto, en pocos años, de la utili*aci#n, a un ritmo acelerado, de los m%todos ta+on#micos y e+perimentales que !abían ido surgiendo y madurando desde el siglo ' en los 3mbitos de la /istoria ;atural0 cl3sica. 4os esfuer*os tempranos para lograr un clasificaci#n bacteriana por parte de &o!n (1A-) y Migula (1?D), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres morfol#gicos, pero !acia 1? era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores !icieron uso de caracteres bioquímicos (8rma Iensen, 1??), o de una me*cla de rasgos morfol#gicos, bioquímicos, patog%nicos y de tinci#n (6uc!anan, 1?1-). El sistema de ta+onomía bacteriana adquiri# un nuevo impulso a partir de la 1V edici#n del / Bergey+s Manual o Determinati#e Bacteriology% (1?=B), y de las propuestas de 5luyver y van ;iel (/ Prospects or a natural system o classiication o bacteria% , 1?B@). En cuanto a la nomenclatura, no fue !asta 1?- en que se gener# un &#digo nternacional de ;omenclatura 6acteriol#gica, aunque ya se venía aplicando desde !acía tiempo el procedimiento tipol#gico para los microorganismos, con criterios similares a los de la Uoología y la 6ot3nica. El establecimiento de relaciones ta+on#micas precis# el recurso a m%todos cada ve* m3s amplios y afinados de an3lisis gen%tico, estructural o fisiol#gico. En un apartado anterior ya vimos las cone+iones tempranas entre la 6ioquímica y la Microbiología a prop#sito del descubrimiento de la base en*im3tica de las fermentaciones, lo cual abri# el camino para dilucidar el metabolismo energ%tico microbiano, y para demostrar su similitud química con rutas metab#licas de organismos superiores. 8tro paso importante en la percepci#n de la unidad bioquímica del mundo vivo deriva del descubrimiento de las vitaminas (t%rmino acuñado por JunG en 1?11), al establecerse que determinados factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran químicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de compuestos representa precursores biosint%ticos de coen*imas del metabolismo celular. 2sí pues, este tipo de investigaciones sent# claramente la idea de la unidad química de los seres vivos, independientemente de su encuadre ta+on#mico, y encau*# una buena parte de los trabaos bioquímicos !acia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de maneo y cultivo en laboratorio. En cuanto a las cone+iones de la Microbiología con la este $ltimo, propugnador de la /teoría de los genes0 (1?=@), confiaba desde !acía años en ampliar sus %+itos, logrados en Drosophila, !acia el estudio de la gen%tica microbiana. En 1?D1, otros dos discípulos de Morgan, 6eadle y 7atum, aislan mutantes au+otr#ficos de
eurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioquímica de la !erencia, y convierten a este
!ongo en una valiosa !erramienta de trabao en esta línea de investigaci#n. 4as estrategias diseñadas por 6eadle y 7atum fueron aplicadas por 4uria y elb rHcG (1?DB) a cultivos bacterianos, investigando la aparici#n de mutaciones espont3neas resitentes a fagos o estreptomicina. 4a cone+i#n de estos e+perimentos con las observaciones previas de
bioquímicamente la transmisi#n gen%tica mediante 2; en Escherichia coli , y en 1?-= 2lfred ers!ey y Mart!a &!ase, en e+perimentos con componentes marcados de fagos, ponen un elegante colof#n a la confirmaci#n de la funci#n del 2;, con lo que se derribaba el antiguo y asentado /paradigma de las proteínas0 que !asta mediados de siglo intentaba e+plicar la base de la !erencia. e esta forma, la Microbiología e+perimental se sit$a en pleno centro del nacimiento de la
1.D. I$portancia de la Microbiolo!a 4a Microbiología es una de las &iencias que tiene m3s que ofrecer a los países en desarrollo, por su trascendencia en la salu! p.blica, me!icina, agricultura e in!ustria, siendo las colecciones de microorganismos el epicentro que la sostiene, debido a que las e+igencias de la investigaci#n son cada ve* m3s firmes en el empleo de cultivos de procedencia conocida y garanti*ados en pure*a y conservaci#n. in cultivos microbianos sus constituyentes celulares o en*im3ticos no puede e+istir la Microbiología aplicada y por consiguiente, la 6iotecnología que se encarga de transformar los resultados obtenidos de la ciencia b3sica (Microbiología, 6iología Molecular. 6ioquímica, entre otras) en productos y procesos de valor comercial. 4a Microbiología muestra una prometedora perspectiva de e+pansi#n a m$ltiples campos de la actividad !umana, desde el control de enfermedades infecciosas (!igiene, vacunaci#n, quimioterapia, antibioterapia) !asta el aprovec!amiento econ#mico y racional de los m$ltiples procesos en los que se !allan implicados los microorganismos (biotecnologías). 4a industria alimentaria utili*a microorganismos en la producci#n de vinagre, bebidas alco!#licas, aceitunas, mantequilla, queso, yogurt, pan, entre otros. 2dem3s, las bacterias y otros microorganismos a!ora pueden ser manipulados para producir sustancias que ellos normalmente no sinteti*an> el impacto de las nuevas tecnologías est3 determinando notables cambios en la Microbiología. Entre los avances de mayor trascendencia en los $ltimos años, se encuentran: la secuenciaci#n completa de genomas bacterianos> la identificaci#n de microorganismos por t%cnicas genotípicas> el desarrollo de la microbiología clínica> el reconocimiento y las posibilidades de la aplicaci#n de la biodiversidad microbiana. E+isten ca*adores de microbios modernos que en ambientes e+#ticos, aíslan bacterias nuevas, no descritas, si se considera que se desconoce m3s del ?-W de las bacterias, el describir bacterias nuevas parecería una actividad sin fin. En este sentido, resulta interesante investigar si e+isten microorganismos en e+tinci#n y cu3les serían las causas. e desconoce los efectos que la actividad !umana tiene sobre los microorganismos> la devastaci#n de selvas y bosques probablemente tienen efectos dr3sticos sobre los microorganismos> los fertili*antes químicos alteran las poblaciones de bacterias fiadoras de nitr#geno, y el uso de antibi#ticos !a favorecido la proliferaci#n de las resistentes. "or otra parte, se est3n reali*ando investigaciones sobre la obtenci#n de genes del ambiente, donde no importa el microorganismo del que provenga el gen, ya que la meta es e+presarlo en alguna bacteria conocida y obtener un producto novedoso que pueda probarse como f3rmaco, insecticida o promotor del crecimiento. 4a secuenciaci#n de genomas completos !a mostrado la e+istencia de enormes cantidades de genes potenciales, cuya funci#n se desconoce> una manera de descifrar su funci#n es eliminarla de las c%lulas por mutaci#n. e puede prever que el futuro de la investigaci#n en microbiología, requerir3 de la generaci#n de un enorme n$mero de mutantes en muc!os genes potenciales de diferentes especies. Esta tarea parece tit3nica, sin embargo, es factible. 8tro enfoque ingenioso con perspectivas a futuro es de la Fevoluci#n in vitroF, aquí se me*clan genes de diferentes vías inclusive de vías metab#licas no relacionadas y tambi%n se pueden incluir genes mutados al a*ar o por recombinaci#n. El obetivo es obtener síntesis de en*imas, proteínas, compuestos novedosos> esta estrategia !a sido utili*ada con %+ito en la síntesis de nuevos carotenoides. Mediante manipulaciones gen%ticas m3s tradicionales de ingeniería gen%tica se !an logrado microorganismos productores de diferentes compuestos, e+isten bacterias que producen cantidades prodigiosas de riboflavina (vitamina 6=), o se !a cambiado la especificidad de una en*ima en otra, la en*ima lactato des!idrogenasa se convirti# en la en*ima malato des!idrogenasa.
En Microbiología se !an seleccionado modelos de estudio y algunos de %stos se !an anali*ado con gran profundidad, ello se ve refleado en el n$mero de publicaciones por microorganismo> por eemplo, E) coli es la bacteria en la que m3s investigaci#n se !ace y entre los !ongos m3s estudiados se encuentra $accharomyces. in embargo, una ve* que se detecta un microorganismo de inter%s se puede avan*ar muy r3pido en su conocimiento basado en lo que se sabe en otros microorganismos, este !a sido el caso del virus del 2 y en Helicobacter pylori , de este $ltimo, por su importancia m%dica, se secuenciaron dos cepas, se !an secuenciado las islas de patogenicidad de muc!as cepas y se !an implementado e+perimentos de cito+icidad en diferentes líneas celulares de !umano.
4a identificaci#n de los organismos causantes de brotes infecciosos es posible gracias al uso de t%cnicas moleculares que permiten rastrear, a manera de detectives, la fuente de la contaminaci#n, así por eemplo, muy recientemente las diarreas de unas pocas personas en ciudades aleadas en Estados Qnidos, se atribuyeron a que el pereil que fue adquirido por algunos restaurantes llevaba $higella sonnei por !aber sido regado con agua contaminada> la rapide* en la detecci#n evit# que otras personas enfermasen, se estima que si se !ubiera podido reali*ar este tipo de rastreo en años anteriores, como en 1??B, se !ubieran podido prevenir algunos de los decesos causados por las E) coli enteropat#genas de las !amburguesas.
UNIDAD NO. 1 M7TODO8 9 T7CNICA8 MICROBIOLÓGICA8 B:8ICA8.
2.1 Aisl!i"#$% & S"l"''i(# )" Mi'*%%*+#is!% -.1.1 R282R;ORIO D2 MICROORGANI8MO8 -.1.1.1 A#a5 8#elo y Aire Diversidad en Abientes Raraente !odeos encontrar a los icroorganisos coo c"ltivos !"ros. #ada es!ecie de cada icroorganiso se enc"entra en di$erentes abientes donde e%isten las condiciones necesarias !ara s" creciiento& ag"a' s"elo y aire' !or lo ("e tabi)n las t)cnicas de aislaiento ser* di$erente !ara cada abiente y !ara cada es!ecie de icroorganiso. Ag"a +l ag"a es "n aiente donde e%isten di$erentes icroorganisos y cada "no de ellos realizan di$erentes actividades en el abiente. ,abi)n' los icroorganisos $oran !arte esencial en la cadena alienticia' así iso' tabi)n son instr"entos en el !roceso de reciclae de eleentos !resentes en el ag"a. laareos !or ag"a a los abientes ac"*ticos a todas las e%tensiones de ag"a !resentes en el globo terr*("eo& ares' ríos' arroyos' ag"as do)sticas' ag"as resid"ales' etc. Distrib"ci/n de los Microorganisos Plancton
+s "na $ora de vida 0otante y a la deriva en e%tensiones de ag"a. on /viles debido a las características de 0otaci/n ("e !resentas' alg"nas de ellas est*n c"biertas !or gotas de aceite o si!leente !or la estr"ct"ra ("e !resenta. +%isten dos gr"!os !rinci!ales& 2to!lancton' ("e son todas las algas3 y el zoo!lancton' lo constit"yen los !rotozoos y los aniales vivos diin"tos. Microorganismos Bentónicos
+sta clase de icroorganisos 4abitan en el $ondo de "na asa grande de ag"a y )sta a s" vez es la regi/n *s rica en icroorganisos de "n est"ario arino !"esto ("e contiene illones de icroorganisos !or grao de ag"a. +l 5a!el de los Microorganisos Algas& on !rod"ctores !riarios
5redoinan en el 2to!lancton
5or $otosíntesis cabian energía radiante en co!"estos ("íicos.
5rotozoos& X X
5lancton&
e alienta del 2to!lancton +vita la l"z y 4ace igraciones di"rnas 5resentes en la regi/n del zoo!lancton
›
5lancton& 6"ente de aliento de !eces' ballenas' calaares.
›
#a!acidad de !rod"cir ateria org*nica$ertilidad delos oc)anos. ›
›
#reciiento de!endiente de energía radiante' #89' N9 org*nico y de co!"estos de $/s$oro.
5rod"cen color característico de alg"nos ares.
"elo +l s"elo es otro de los abientes donde ab"ndan los icroorganisos. Debido a ("e en este edio se de!ositan diversos resid"os' oc"rren cabios en la nat"raleza y abiente' todos estos cabios' sin ebargo' son od"lados y controlados !or di$erentes clases de icroorganisos. Bacterias' 4ongos' algas' !rotozoos y vir"s son ab"ndantes y se !resentan en cantidades de iles de illones de organisos !or grao de s"elo. Debido a la gran diversidad de icroorganisos' al realizar "n c"ltivo "estra s/lo se !"ede rec"!erar "n !e("e:o sector de todos los iles de icroorganisos !resentes. +s !or ello ("e se re("iere de "c4os est"dios !ara conocer y clasi2car a los icroorganisos. +sta es "na labor e%ten"ante !or("e' coo ya encionaos' e%iste "n gran n;ero de icroorganisos !or cada grao de s"elo.
os icroorganisos !rinci!alente realizan los cabios de ateria ediante
os icroorganisos !rinci!alente realizan los cabios de ateria ediante "n !roceso bio("íico& cabios ("íicos de co!"estos org*nicos e inorg*nicos y los !rocesos cíclicos del ciclo del nitr/geno y la 2aci/n del nitr/geno.
6iaci/n de Nitr/geno ,rans$oraci/n del N9 atos$)rico en nitr/geno de "n co!"esto.
Microorganisos no sibi/ticos&
Microorganisos no sibi/ticos& raíz? =
› ›
6iaci/n ibi/tica del Nitr/geno #)l"las a"entan taa:o $orando n/d"los
eg"inosas' bacterias y n/d"los@ sistea de 2aci/n.
Bacterias 4acen el nitr/geno a!rovec4able !or la !lanta
Bacterias "tilizan n"trientes de los teidos de la !lanta.
C
Aire +ste abiente es distinto de los anteriores. Ac* los icroorganisos no c"entan con las condiciones necesarias !ara s" creciiento ni re!rod"cci/n sino s/lo servir* coo ve4íc"lo o edio de trans!orte ("e las es!arcir* !or los di$erentes abientes' ya sea en $ora de gotitas o aco!a:adas de !olvo. a cantidad de icroorganisos !resentes en el aire est* en $"nci/n de las $"entes de containaci/n y la sobrevivencia de los icroorganisos est* de2nida !or las condiciones atos$)ricas' 4"edad' l"z solar y te!erat"ra. #ontenido icrobiol/gico del Aire Dentro de los edi2cios
C
+st* in0"ido !or las corrientes de ventilaci/n' generalente los icroorganisos son de!ositados en el aire en !e("e:as gotitas ("e 0"yen de la nariz y la boca' estas !artíc"las icro)tricas ("edan en el aire ("e !osteriorente se des!lazar*n !or la !resencia de corrientes de aire y las !artíc"las *s grandes ("edar*n 2adas en el. ,abi)n de!ender* del n;ero de !ersonas dentro del edi2cio' !oco n;ero de !ersonas indica ("e tabi)n 4abr* !oco n;ero de icroorganisos' a ayor n;ero de !ersonar la cantidad de icroorganisos tabi)n a"entar*. At/s$era +l contenido icrobiano estar* de2nido !or !artíc"la de !olvo !roveniente del s"elo' gotas de ag"a !rovenientes de asas de ag"a' agentes containantes generados !or actividades ind"striales' agrícolas y do)sticas. as es!oras de 4ongos son las *s ab"ndantes en este abiente. 9.1.9 Aniales y 5lantas
Aniales +n los aniales tabi)n !odeos encontrar di$erentes icroorganisos' alg"nos son da:inos !ara la sal"d !rod"ciendo en$eredades' alg"na c"rables y otras no' !ero tabi)n encontraos a los ("e est*n relacionados o (") la sobrevivencia de!ende de la relaci/n icroorganiso-anial. Debido a la alientaci/n de cada anial' se dice ("e estos no !"eden sobrevivir con !reses !e("e:as en relaci/n a s" taa:o& icroorganisos. os
icroorganisos ("e 4abitan en los aniales generalente son 4os!edadores
icroorganisos ("e 4abitan en los aniales generalente son 4os!edadores de los tractos intestinales donde estos icroorganisos contrib"yen a la digesti/n y alg"nos a la !rod"cci/n de vitainas y los desec4os de los aniales $oran !arte del ciclo del nitr/geno donde n"evaente los icroorganisos dese!e:an "n !a!el i!ortante.
No todos los icroorganisos son ben)2cos !ara los aniales' alg"nos tienen interacciones negativas. +%isten las de!redaciones !or 4ongos y neatodos3 las ("e alteran el 4abitad& +"tro2caci/n& agota el o%ígeno dis"elto y !"ede !rovocar la "erte de los !eces' alteraciones en los alientos >bioac""laci/n?' la !rod"cci/n de to%inas y las ("e ca"san in$ecciones. 5lantas as !lantas son "n 4abitad icrobiano ("e varia de!endiendo de la te!erat"ra de las !lantas a lo largo del día coo del a:o. os icroorganisos no se trans2eren $*cilente de !lanta a !lanta y )stos se 4os!edan !rinci!alente en las raíces de la isa donde realizan las $"nciones sibi/ticas. os icroorganisos satis$acen s"s re("eriientos b*sicos !ara s" creciiento y re!rod"cci/n3 así coo los icroorganisos se bene2cian con las !lantas' las !lantas tabi)n tienen in0"encia de los icroorganisos& el reciclado y la sol"bilizaci/n de los n"trientes inerales3 síntesis de vitainas' aino*cidos' a"%inas' cito("inas y giberelinas3 síntesis de s"stancias alelo!*ticas >antag/nicas? in4iben creciiento de otras !lantas.
No todos los icroorganisos son ben)2cos !ara los aniales' alg"nos tienen interacciones negativas. +%isten las de!redaciones !or 4ongos y neatodos3 las ("e alteran el 4abitad& +"tro2caci/n& agota el o%ígeno dis"elto y !"ede !rovocar la "erte de los !eces' alteraciones en los alientos >bioac""laci/n?' la !rod"cci/n de to%inas y las ("e ca"san in$ecciones. 5lantas as !lantas son "n 4abitad icrobiano ("e varia de!endiendo de la te!erat"ra de las !lantas a lo largo del día coo del a:o. os icroorganisos no se trans2eren $*cilente de !lanta a !lanta y )stos se 4os!edan !rinci!alente en las raíces de la isa donde realizan las $"nciones sibi/ticas. os icroorganisos satis$acen s"s re("eriientos b*sicos !ara s" creciiento y re!rod"cci/n3 así coo los icroorganisos se bene2cian con las !lantas' las !lantas tabi)n tienen in0"encia de los icroorganisos& el reciclado y la sol"bilizaci/n de los n"trientes inerales3 síntesis de vitainas' aino*cidos' a"%inas' cito("inas y giberelinas3 síntesis de s"stancias alelo!*ticas >antag/nicas? in4iben creciiento de otras !lantas.
2.1.2 M,TODOS T,CNICAS DE AISLAMIENTO SELECCIÓN Una vez conocidos los 4abitad de los icroorganisos' !odeos e%traer alg"nos de ellos !ara s" est"dio' al aislaiento de "n icroorganisos en "n edio de c"ltivo se le conoce coo c"ltivo !"ro. os c"ltivos !"ros se !"eden lograr !or di$erentes t)cnicas de "estreo y aislaiento. ,abi)n es enester encionar ("e se debe tener c"idado en contar con las condiciones adec"adas !ara el
creciiento de las bacterias& !H' n"trientes re("eridos' te!erat"ra !ara el creciiento y re!rod"cci/n' etc.
2.1.2.1 Es$* "# Pl'. +l in/c"lo se siebra sobre la s"!er2cie de "n edio del ti!o del agar n"tritivo' en "na caa 5etri' 4aciendo estrías con "na ag"a enangada o con "na asa bacteriol/gica. +l )todo *s "tilizado es !or c"adrantes >ya sea !or dil"ci/n o conservaci/n?.
2.1.2.2 V"*$i)% "# Pl' +l in/c"lo se de!osita en ezclas de agar $"ndido' !osteriorente son vaciadas en caas !etri. Alg"nas de las colonias crecer*n en la s"!er2cie del edio des!")s del !eriodo de inc"baci/n.
2.1.2./ E0$"#si(# "# Pl' '%# V*ill )" Vi)*i% e coloca "na gota de in/c"lo en el centro de "na caa !etri con "n edio del ti!o agar n"tritivo y "tilizando "n t"bo de vidrio doblado o con "n asa Diralsy se e%tiende el in/c"lo sobre la s"!er2cie del edio. 5"ede "tilizarse la isa varilla de vidrio !ara inoc"lar "na seg"nda !laca !ara aseg"rar "na adec"ada dis!ersi/n de las c)l"las. +n alg"nas caas a!arecer*n colonias aisladas.
2.1.2. E#*i3"'i!i"#$% P%4l'i%#l 5ara eorar la !robabilidad de aislar "n organiso ("e !osee "na característica 2siol/gica o bio("íica ;nica' se !"ede sebrar !or estría' !or e%tensi/n en !laca o en asa' !asando el in/c"lo a trav)s de "na serie de trans$erencias' a "n edio de "na co!osici/n >y condiciones de inc"baci/n? ("e $avorezcan el desarrollo del icroorganiso deseado. +l !rocediiento de enri("eciiento a"enta en e$ecto la !ro!orci/n del organiso deseado en relaci/n con la ("e estaba !resente en el in/c"lo inicial.
2.1.2.5 Dil3'i%#"s "# S"*i" +st) )todo !erite red"cir la concentraci/n de los icroorganisos c"ando )ste crezca deasiado. +ste es "no de los )todos *s sencillo y barato y se !"eden obtener "n n;ero de2nido de colonias.
2.1.2.6 Mi'*%!#i73l'i(# Mediante "n icroani!"lador se !"ede "sar "na icro!i!eta !ara obtener "n solo icroorganiso de "na s"s!ensi/n de c)l"las en "n lí("ido' ientras se e%aina la !re!araci/n con el icrosco!io. a c)l"la aislada es l"ego trans$erida a "n edio est)ril.
Micro$anip#lador
2.1./ SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTER, INDUSTRIAL: SCREENING etecci#n y aislamiento de microorganismos de inter%s industrial de entre una poblaci#n complea de organismos utili*ando procedimientos selectivos. creening "rimario: etecci#n y aislamiento de microorganismos potencialmente $tiles. •
•
creening ecundario: Estudio de los microorganismos aislados en el screening primario para separar los que tienen inter%s potencial de los que tienen inter%s real y meorar estas cepas seleccionadas.
"ara llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una poblaci#n mi+ta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde e+iste tanto una gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente $tiles que debemos seleccionar. "ara ello lo primero que !acemos es utili*ar medios selectivos donde cre*ca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. 2 este medio se le pueden añadir in!ibidores para eliminar los que no nos interesan. "or eemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceríamos en presencia de 8 = con lo que los anaerobios no crecerían> o bien si queremos seleccionar !ongos, añadiríamos cloranfenicol, antibi#tico que act$a frente a bacterias pero que no afecta a los !ongos. 4os par3metros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de nitr#geno, aireaci#n, temperatura, p e in!ibidores. "osteriormente se reaíslan en cultivo puro aquellos microorganismos que !emos aislado para su posterior estudio.
2.2 C3l$i8% )" !i'*%%*+#is!%s. 2.2.1 Clsi9''i(# )" l%s !i'*%%*+#is!%s '%# 4s" s3s *"3"*i!i"#$%s #3$*i'i%#l"s 4a nutrici#n es el proceso por el cual los seres vivos toman del medio donde !abitan, los compuestos químicos que necesitan para llevar a cabo sus procesos energ%ticos y biosint%ticos que les permiten crecer y reproducirse. 4os requerimientos nutricionales de cada grupo microbiano est3n dados por la composici#n química de las c%lulas que los constituyen y por sus características gen%ticas las que determinan sus propiedades fisiol#gicas y su capacidad para utili*ar y transformar los compuestos que se encuentran en el ambiente en que se desarrollan. En general los requerimientos nutricionales de los microorganismos reflean el ambiente natural en que viven> este conocimiento y el uso de medios de cultivo de composici#n química definida, son de primordial importancia en el estudio de la nutrici#n microbiana cuyas características varían ampliamente entre los microorganismos. 2lgunos tienen requerimientos nutricionales muy simples, obtienen su energía de compuestos inorg3nicos y utili*an &8= o carbonatos como fuente de carbono, en tanto que otros requieren de compuestos org3nicos con diferentes grados de compleidad. 4a fuente de nitr#geno, la obtienen a partir de amino3cidos o nitr#geno inorg3nico en diferentes estados de o+idaci#n incluyendo el nitr#geno molecular. especto a los requerimientos de o+ígeno, los microorganismos pueden vivir con diferentes concentraciones de este elemento. En el siguiente e+perimento se pondr3n de manifiesto el tipo de nutrici#n y necesidades de o+ígeno de diferentes microorganismos, para ello, estos se inocular3n en dos medios de cultivo, en el primero se variar3n las fuentes de carbono y de nitr#geno y en el segundo la tensi#n de o+ígeno y se relacionar3n sus características nutricionales con el desarrollo y las transformaciones químicas microbianas obtenidas en los diferentes medios de cultivo,
e acuerdo con estos criterios, los microorganismos se ubican en cuatro clases nutricionales las que se describen en el cuadro 1. ;o obstante, la versatilidad fisiol#gica de los microorganismos determina que la clasificaci#n e+puesta no sea de ninguna manera estricta, como lo demuestran los siguientes eemplos: algunos microorganismos fotoaut#trofos crecen tambi%n en la oscuridad comport3ndose como quimio!eter#trofos. Esta versatilidad se conoce con el t%rmino de facultativo. 2simismo, algunas bacterias y algas fotoautotr#ficas son incapaces de sinteti*ar alguno de sus constituyentes celulares a partir de &8=, por lo que generalmente viven asociadas con otros microorganismos que le proporcionan este componente y cuando se les cultiva en medios artificiales es necesario suministrar ese compuesto org3nico. Es importante recalcar que aun cuando el grupo bacteriano es, desde el punto de vista estructural, el m3s simple de los microorganismos (procariotes)> fisiol#gicamente es el m3s compleo y el $nico en el que se encuentran todos los tipos nutricionales descritos.
-.-.- Tipo" de n#triente". -.-.-.1 Macron#triente". -.-.-.- Micron#triente". 4a nutrici#n microbiana consiste en suministrar a las c%lulas los ingredientes químicos que necesitan para !acer mon#meros, ya que recordemos las c%lulas est3n compuestas fundamentalmente por agua y macromol%culas, y estas est3n estructuradas o formadas precisamente por los mon#meros
antes mencionados. P los nutrientes como vimos anteriormente son esos famosos compuestos químicos que la c%lula necesita para vivir. 4as distintas especies bacterianas tienen diferentes requerimientos nutricionales (a veces específicos) y condiciones fisicoquímicas que les permiten permanecer viables. 4os nutrientes requeridos en grandes cantidades son denominados macronutrientes mientras que los micronutrientes son necesarios en cantidades tra*as. Entre los primeros se encuentran &, , 8, ; (los m3s abundantes), ", , 5, &a, Je y ;a, y entre los segundos podemos citar &r, &o, &u, Mn, Mo, ;i, e, L, , Un. 2lgunos organismos, adem3s de los minerales, necesitan muy pequeñas cantidades de nutrientes de naturale*a org3nica llamados factores de crecimiento. Tstos son vitaminas, amino3cidos, purinas y pirimidinas. 4os organismos que tienen tales requerimientos se denominan au+#trofos para diferenciarse de los prot#trofos que son independientes de tales factores.
MACRONUTRI2NT28 amos a comen*ar !ablando de los macronutrientes, como diimos anteriormente estos son los que la c%lula requiere o consume en mayor cantidad, precisamente por ser suministro de la mayor parte de energía metab#lica, o de funcionamiento en la c%lula, a continuaci#n mostraremos una tabla en la que se detalla los principales macronutrientes, su fuente natural en el ambiente, y su forma suministrada en los medios de cultivo:
2!ora anali*aremos cada uno de ellos, con sus respectivas funciones en el medio de cultivo y por lo tanto en el requerimiento nutricional de los microorganismos. X &arbono: Muc!as procariotas necesitan alg$n tipo de compuesto org3nico como fuente de carbono. 4os estudios nutricionales !an demostrado que las bacterias pueden asimilar varios compuestos org3nicos carbonados y usarlos para !acer nuevo material celular. 4os amino3cidos, los 3cidos grasos, los 3cidos org3nicos, los a*ucares, las bases nitrogenadas, los compuestos arom3ticos y sin fin de compuestos org3nicos de otro tipo pueden ser por una u otra bacteria. 2lgunos procariotas son aut#trofos, capaces de construir todas sus estructuras org3nicas a partir del di#+ido de carbono con la energía obtenida de la lu* o de compuestos inorg3nicos. En peso seco, una c%lula típica contiene un -W de carbono> el carbono es el principal elemento de todas las clases de macromol%culas. 4a m3s utili*ada es la glucosa (una pentosa). X ;itr#geno: espu%s del carbono, el siguiente elemento m3s abundante en la c%lula es el nitr#geno. En una bacteria típica alrededor del 1= W de su peso es nitr#geno, este elemento es importante en las proteínas, en los 3cidos nucleicos y en otros constituyentes celulares. En la naturale*a el nitr#geno se encuentra en forma inorg3nica y org3nica. in embargo la mayor parte del
nitr#geno natural disponible esta en forma inorg3nica, como el amoniaco (;B), nitratos (;8B) o ;=. 4a mayoría de las bacterias son capaces de utili*ar amoniaco como $nica fuente de nitr#geno, y muc!as pueden utili*ar nitratos. El nitr#geno gaseoso puede ser usado como fuente de nitr#geno en algunas bacterias, las bacterias fiadoras de nitr#geno. X J#sforo: El f#sforo se presenta en la naturale*a en forma de fosfatos org3nicos e inorg3nicos, y la c%lula lo necesita fundamentalmente para la síntesis de 3cidos nucleicos y fosfolípidos. ecordemos que el 2; se encuentra formado por nucle#tidos, los cuales se constituyen por una base nitrogenada, una pentosa (a*$car), y por supuesto un grupo fosfato que sirve como uni#n o enlace entre los nucle#tidos, es por esto que la presencia de fosforo es muy importante. X 2*ufre: El a*ufre se lo necesita o se lo requiere porque es un componente estructural de los amino3cidos cisteína y metionina, y aparte de eso porque se presenta en ciertas vitaminas, como la tiamina, la biotina, y el acido lipoíco, así como en la coen*ima 2. Es muy importante señalar tambi%n que en las proteínas se depende de los enlaces de a*ufre para que esta se mantenga compacta y no se desnaturalice, ra*#n por la cual este elemento es indispensable en muc!os de los microorganismos. El a*ufre sufre una serie de transformaciones químicas en la naturale*a, muc!as de las cuales son llevadas a cabos e+clusivamente por microorganismos, y es utili*ado por ellos en varias formas químicas. 4a mayoría del a*ufre celular procede de fuentes inorg3nicas, ya sean sulfatos (8D) =C, sulfuros ()C. X "otasio: El potasio es necesario en todos los organismos. Qna gran diversidad de en*imas lo requiere específicamente, como por eemplo algunas implicadas en la síntesis de proteínas. X Magnesio: El magnesio funciona como estabili*ador de los ribosomas, las membranas celulares, y los 3cidos nucleicos, y tambi%n se necesita para la actividad de varias en*imas. X &alcio: El calcio, que no es un nutriente esencial para el crecimiento de muc!os microorganismos, ayuda a estabili*ar la pared celular bacteriana y tiene una funci#n importante en la termorresistencia en las endoesporas. X odio: El sodio es requerido, por algunos microorganismos, aunque no todos, y su necesidad suele ser un refleo del !3bitat del microorganismo. "or eemplo el agua de mar tiene un elevado contenido de sodio y los microorganismos marinos normalmente lo requieren para su crecimiento> en cambio, otras especies muy relacionadas, pero de agua dulce, crecen bien en ausencia de este elemento. X ierro: El !ierro es fundamental en la respiraci#n celular y es tambi%n un elemento clave para los citocromos y para las proteínas que contienen !ierro y a*ufre implicados en el transporte de electrones. En condiciones anaer#bicas, el !ierro se encuentra por lo general en estado de o+idaci#n Y= y por lo tanto es soluble. in embargo, bao condiciones aer#bicas suele estar en el estado de o+idaci#n YB y formar varios minerales no solubles. "ara obtener el !ierro de tales minerales, las c%lulas producen agentes quelantes de !ierro llamados sider#foros, que solubili*an el !ierro y lo transportan dentro de la c%lula. Qn grupo importante de sider#foros derivan del 3cido !idro+3mico y quelan el !ierro f%rrico YB fuertemente. Qna ve* que el compleo !ierro Z !idro+amato pasa a la c%lula, el !ierro se libera y el !idro+amato puede salir y ser reutili*ado de nuevo para el transporte de !ierro. 4as bacterias como el Esc!eric!ia coli y almonella 7yp!imutium producen sider#foros fen#licos, estructuralmente compleos, llamados entereobactinas. Estos sider#foros derivan del compuesto arom3tico catecol y tienen una elevada afinidad de uni#n de !ierro. in tales agentes quelantes de !ierro muc!as bacterias pat#genas serían incapaces de iniciar la infecci#n debido a la limitaci#n de !ierro. En las aguas marinas, el !ierro pr3cticamente es indetectable (las aguas oce3nicas superficiales típicamente solo unos cuantos picogramos de !ierro por milímetro y se !an encontrado bacterias marinas que producen sider#foros estructuralmente compleos capaces de secuestrar el !ierro presente en concentraciones tan baas. Estos sider#foros poseen una regi#n peptídica que complea el fe YB y una regi#n lipídica que se asocia con la membrana celular. &ompuestos como la aquac!elina, unen el !ierro, se agregan en micelas, y luego transportan el !ierro a la c%lula
2lgunos procariotas pueden crecer en ausencia total de !ierro. "or eemplo las bacterias 4actobacillus plantarum y 6orrelia burgdorferii no contienen !ierro. El Mn =Y sustituye en estas bacterias al !ierro como componente met3lico de las en*imas que normalmente contienen JeY=.
MICRONUTRI2NT28 4os micronutrientes como diimos anteriormente son los que la c%lula consume en menos cantidades, pero eso no quiere decir que son menos importantes que los macronutrientes, para nada, en realidad son igual de importantes que los que se consumen en grandes cantidades. 4os micronutrientes son metales, muc!os de los cuales tienen una funci#n estructural en varias en*imas. 4a tabla presentada a continuaci#n resume los principales micronutrientes en los sistemas vivos y en*imas que los contienen. ebido a que la necesidad de estos elementos tra*as es muy pequeña en cuanto a su concentraci#n, con frecuencia no es necesario añadirlos a los medios de cultivo para cultivar microorganismos en el laboratorio. ;o obstante, si un medio de cultivo contiene compuestos muy puros, disueltos en agua destilada de elevada pure*a, puede darse una deficiencia en alg$n elemento tra*a. En tales casos, se añade al medio una pequeña cantidad de una soluci#n de metales tra*a a fin de suministrar los metales necesarios. Es importante recalcar que el !ierro como vemos se encuentra dentro de los micronutrientes pero generalmente se lo considera como uno macro, ya que en realidad dentro de todos los metales señalados, es el que m3s es utili*ado por ciertas c%lulas, se la lleg# a considerar micro por su naturale*a met3lica, pero por su importancia y requerimiento elevado en las c%lulas se lo considera como un macronutriente.
-.-.-.< =actore" de creci$iento. equerimientos de ;itr#geno El nitr#geno en los compuestos org3nicos de las c%lulas se presenta en estado reducido como grupo amino. 4a gran mayoría de los organismos fotosint%ticos asimilan el nitr#geno en estado inorg3nico como nitratos, que posteriormente son reducidos. Muc!os organismos no fotosint%ticos como bacterias y !ongos tambi%n pueden asimilar el nitr#geno como nitrato, otros microorganismos son incapaces de llevar a cabo esta reducci#n y utili*an como fuente de nitr#geno formas reducidas de este. 4as necesidades de nitr#geno se cubren frecuentemente con materiales org3nicos que contienen nitr#geno en estado reducido.
Re)#eri$iento" de A>#(re El a*ufre en los compuestos org3nicos de las c%lulas se presenta en estado reducido como grupo sulf!idrilo. 4a mayoría de los organismos fotosint%ticos asimilan el a*ufre en estado inorg3nico como sulfatos que posteriormente son reducidos. 6acterias y !ongos tambi%n pueden asimilar el a*ufre como sulfato. 4as necesidades de a*ufre, se cubren frecuentemente con materiales org3nicos que contienen a*ufre en estado reducido. Re)#eri$iento" de O?!eno En los organismos superiores, el o+ígeno es un componente universal de las c%lulas y gran parte de este elemento lo proporciona el agua. ;o obstante, los organismos superiores y muc!os microorganismos necesitan adem3s o+ígeno molecular, ya que dependen de la respiraci#n aerobia como mecanismo generador de energía, donde el o+ígeno act$a como o+idante terminal. 2 estos organismos que requieren o+ígeno molecular se les denomina aerobios obligados. entro de esta
categoría, !ay algunos grupos que crecen meor a presiones parciales de o+ígeno m3s baas (,= atm#sferas) que las del aire y se les denomina microaer#filos.
8tros microorganismos, obtienen energía por la vía fermentativa o por respiraci#n anaerobia, que no implica la necesidad de o+ígeno como o+idante terminal. En muc!os casos el o+ígeno puede actuar como una sustancia t#+ica o bien in!ibir el crecimiento. 2 estos microorganismos se les denomina anaerobios obligados. 8tros microorganismos pueden crecer tanto en ausencia como en presencia de o+ígeno molecular, alternando la respiraci#n con la fermentaci#n, a estos se les denomina anaerobios facultativos. Qn caso particular son las bacterias del 3cido l3ctico, que no son sensibles al o+ígeno molecular y en presencia de %ste, contin$an la fermentaci#n.
2.2.5 Es$"*ili'i(# & s"7si 2"terili>aci*n por calor@ El calor es el m%todo de elecci#n para esterili*ar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. 4a temperatura y el tiempo requeridos para esterili*ar un material dependende que se est% utili*ando calor seco o calor !$medo. Esterilización con calor seco: 4a acci#n bactericida del calor seco se debe a la o+idaci#n física de
•
•
un procedimiento lento o coagulaci#n de la proteína bacteriana por quemadura. En ausencia de !umedad se necesita una temperatura m3s alta,ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el calor. "ueden ser dos tipos: irecta: flameado o incineraci#n m3s utili*ada enlaboratorios y en algunos !ospitales pequeños. ndirecto: aire caliente u !orno de "asteur con temperatura de 1@[& a 1[& por 1 a = !oras siendoel m3s efica* y seguro el el%ctrico. Esterilización con calor húmedo:El calor !$medo es la forma de vapor saturado a presi#n es efica*
para la destrucci#n de todas las formas microbianas, incluso espora. 4a muerte de las bacterias es causada por la desnaturali*aci#n y coagulaci#n de su proteína o su sistema intercelular en*imaC proteína. Estas reacciones son catoli*adas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos: •
•
&alor !$medo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbo!idratos como lagelatina, lec!e, etc. no soportan temperaturas elevadas. apor a presi#n: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables comogrados de temperatura y tiempo de e+posici#n, que unto con el tamaño del autoclave y el fluo delvapor, la densidad y el tamaño de la carga en la c3mara aumentan la tasa se muerte de losmicroorganismos, en una temperatura de 1=1[& Z 1B=[& durante 1- minutos o m3s.
2"terili>aci*n por radiaci*n@ 4a ioni*aci#n por radiaci#n genera iones al liberar electrones de los3tomos, estos se desprenden violentamente con 3tomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo 3tomo. 4a energía liberada se transforma en energía t%rmica o química la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la mol%cula del 2; e impide la divisi#n molecular y la propagaci#n de la vida. 4as principales fuentes de radiaci#n ioni*ante son las partículas 6eta y rayos gamma. 2"terili>aci*n por a" *?ido de etileno@ Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes comunes, se emplea para esterili*ar obetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder bactericida depende de la concentraci#n del mismo gas, temperatura, !umedad y tiempo de e+posici#n. 4a actividad esporicida se produce por aniquilaci#n de los grupos terminales !idro+ilo,carbo+ilo, amino y sulfridrilo.
2"terili>aci*n por l#taraldeido@ 4a soluci#n acuosa de glutaralde!ido activado y amortiguado al =W,destruye a los microorganismos por desnaturali*aci#n de la proteína. Es preferida para esterili*ar instrumentos que no pueden esterili*arse al vapor o no se cuenta con otro m%todo de esterili*aci#n. =iltraci*n@ 4as c%lulas microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtraci#n. 4a filtraci#n es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada ve*)> por esta ra*#n, se utili*a s#lo para los líquidos termol3biles, que no se pueden esterili*ar en el autoclave. 4os s#lidos termol3biles tambi%n se pueden esterili*ar por filtraci#n, si previamente se disuelven en un líquido. 7%cnicamente, la filtraci#n no esterili*a porque los virus pueden pasar a trav%s de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.
-.< Criterio" #tili>ado" en la identi(icaci*n de $icroorani"$o" 1. M'todo" ba"ado" en criterio" $or(ol*ico" 4os rasgos morfol#gicos (estructurales) !an ayudado a los ta+onomistas por muc!os años a clasificar organismos. 4os organismos superiores tienen rasgos anat#micos tan diferentes que pueden ser f3cilmente utili*ados en su clasificaci#n, pero con respecto a los microorganismos, %stos lucen bao el microC coscopio tan similares que se dificulta su clasificaC ci#n. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bao un microscopio, pueden diC ferir en propiedades bioquímicas, fisiol#gicas y\o serol#gicas. in embargo, aun cuando la morfoloC gía celular dice poco sobre las relaciones filogen%C ticas, sigue siendo $til para la identificaci#n bacteC riana. "or eemplo: la presencia de endosporas y su locali*aci#n resulta de muc!a utilidad en la identificaci#n de bacilos esporulados.
=. M'todo" ba"ado" en tinci*n di(erencial Es posible sacar conclusiones en relaci#n con la morfología de una bacteria, e+aminando una l3mina que fue sometida a un proceso de tinci#n diferenC cial. Estos criterios morfol#gicos encabe*an las primeras etapas del proceso de identificaci#n bacteC riana. 4a mayor parte de las bacterias, teñidas con
<. . M'todo" ba"ado" en pr#eba" bio)#!$ica" 4as pruebas bioquímicas !an sido ampliamente utili*adas para diferenciar bacterias. Estas prueC bas se fundamentan en demostrar si el microorC ganismo es capa* de fermentar a*$cares, la presencia de en*imas, la degradaci#n de comC puestos, la producci#n de compuestos coloreaC dos, etc. 2un bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. "or eemplo, las bacterias ent%ricas gram negativas, forman un grupo muy grande y !eterog%neo cuyo !3bitat natural es el tracto gastrointestinal de !umanos y otros animales. Esta familia, En- terobacteriaceae , incluye a varios pat#genos que causan síndromes diarreicos. Qn gran n$mero de ensayos !an sido desarrollados de manera de identificar r3pidamente al pat#C geno, para que posteriormente el m%dico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los epidemi#logos puedan locali*ar la fuente de la infecci#n. E+isten fluogramas, como el que se describe a continuaci#n riana, mediante pruebas bioquímicas de microorganismos. "or coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, la presencia de una enterobacteria, para determinar su g%nero esquema.
para la identificaci#n bacteC eemplo, la presencia de un o+idasa negativo, nos indica podemos seguir el siguiente
Jermenta
No
i
]"ueden utili*ar
;o
$higella: produce lisina
i
"ueden utili*ar
;o
i
alonella& Ceneralente !rod"ce H9 5rod"ce acetoína
ecarbo+ilasa
+sc4eric4ia ;o
i +nterobacter
4os g%neros clínicamente m3s importantes de la familia Enterobacteriaceae son: Escherichia, $almonella, $higella, Citrobacter y Enterobacter . El g%nero Escherichia, Enterobacter y Citrobacter fermentan la lactosa con producci#n de 3cido y gas, a diferencia de los g%neros $almonella y $higella que no fermentan la lactosa. "or otra parte, los medicamentos no est%riles y\o productos cosm%ticos deben estar e+C entos de microorganismos pat#genos tales como: Pseu!omonas aeruginosa, Escherichia coli, $almonella spp) $taphylococcus aureus) Estos productos deben ser controlados paC ra verificar la ausencia de estos microorganismos. En la Q" se describen los procediC mientos a seguir para la identificaci#n de estas bacterias, que se resumen en procediC mientos de enriquecimiento, aislamiento y pruebas bioquímicas para su identificaci#n fiC nal. El tiempo necesario para la identificaci#n de bacterias puede reducirse considerablemenC te con el uso de "i"te$a" $iniat#ri>ado" basados en pruebas bioquímicas. Estas !erramientas que permiten reducir el tiempo del reporte, en primer lugar fueron elaboraC dos para bacterias de importancia m%dica, tales como las enterobacterias. Estos sisteC mas !an sido diseñados para reali*ar varias pruebas bioquímicas simult3neamente y permitir la identificaci#n en un tiempo m3s corto. &ada uno de los ensayos, consta de tuC bos miniaturi*ados que contienen el medio de cultivo que se !idratan al inocularlos con la suspensi#n bacteriana pura. 4as pruebas se clasifican en grupos> a cada uno de resultaC dos positivos de los ensayos de se le asigna un determinado valor num%rico, obteni%ndoC se un c#digo que corresponder3 a un determinado g%nero o especie en un te+to de la base de datos.
&on fines de control microbiol#gico, la Q" indica cuales son las pruebas bioquímicas mínimas que se requieren para la identificaci#n de los microorganismos obetables, pero no descarta que se utilicen sistemas miniaturi*ados donde se reali*an un n$mero mayor de pruebas bioquímicas. E+isten muc!as casas comerciales que producen sistemas miniaturi*ados para diferenC tes tipos de microorganismos adem3s de las enterobacterias. &ada casa fabricante tiene su propia presentaci#n, c3lculos, manuales, etc. Qna limitaci#n de este tipo de m%todo de identificaci#n es la aparici#n de cepas mutantes y la adquisici#n de plasmidios que pueden dar origen a cepas con características diferenC tes. Este tipo de m%todo de identificaci#n tambi%n !a sido desarrollado para la identificaC ci#n de levaduras y de otros !ongos.
D. M'todo" ba"ado" en tipi(icaci*n con (ao" 4a interacci#n entre un virus bacteriano (fago) y su c%luC la bacteriana sensible es sumamente específica, ya que el proceso de adsorci#n se encuentra mediado por reC ceptores específicos tanto en el virus como en la c%lula bacteriana. 2 una placa con medio de cultivo s#lido inoC culado con un cultivo puro de una determinada bacteria, se le añade una alícuota de un fago específico> %ste puede ocasionar la lisis de las bacterias, !ec!o que se evidencia en el cultivo como *onas claras definidas, deC nominadas placas, que indican que !ubo infecci#n y lisis celular. El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.
-. M'todo" ba"ado" en en"ayo" "erol*ico" 4os m%todos serol#gicos, implican la utili*aci#n de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificaci#n microbiana en muestras puras o en muestras biol#gicas. &ada uno de los m%todos tiene su fundamento particular, pero en líneas generales, todos se basan en la reacci#n de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo corresponC diente. 4a soluci#n que contiene los anticuerpos se denomina antisuero. Estos m%todos son muy $tiles en diversas situaciones: •
•
i a trav%s de un sistema miniaturi*ado basaC do en pruebas bioquímicas se determin# que la bacteria causante de la infecci#n es un miembro del g%nero Salmonella, utili*ando una batería de antisueros contra el antígeno 8 presente en el lipopolisacarido de las bacterias gram negativas, es posible identificar a la $al- monella aislada !asta el nivel de serotipo (poli 8, 2, 6, &, , etc.). 4a inmunofluorescencia !a resultado ser sumamente $til en casos de infecciones de diC ferente origen. "uede utili*arse para la identifiC caci#n del microorganismo aislado o presente en una muestra biol#gica. En el m%todo directo se fia la muestra problema a una l3mina y se pone en contacto con el antisuero específico marcado con una sustancia fluorescente (roC damina o fluoresceína). Qna ve* transcurrido el tiempo para que tenga lugar la reacC ci#n antígeno anticuerpo, se e+pone la l3mina a la radiaci#n ultravioleta para visualiC *ar la reacci#n. 7ambi%n e+iste la t%cnica indirecta, donde en primer lugar se utili*a el anticuerpo específico no marcado y posteriormente se utili*a un anti anticuerpo marC cado.
•
En caso de una infecci#n viral, los virus no pueden ser identifiC cados mediante pruebas bioC químicas, pero si pueden ser identificados en diferentes fluiC dos biol#gicos utili*ando inmuC noensayos, tales como el E4C 2 (En*ymeClinGed immunoabC sorbent assay), el cual, a maneC ra general, utili*a anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno a identificar, marcaC dos con una en*ima. En un ensayo de E42 tipo sandOic!, los anticuerpos espeC cíficos para el antígeno, se coC locan sobre los po*os de una microplaca, posteriormente se añade la muestra donde se quiere determinar la presencia del agente (bacteria, virus, proC to*oario). i el agente est3 preC sente ocurre la reacci#n antígeC noCanticuerpo> luego del lavado se añade el anticuerpo específiC co marcado con la en*ima. Qna ve* transcurrido el tiempo de inC cubaci#n y reali*ado el lavado correspondiente, se añade el sustrato. i se desarrolla un coC lor se trata de un resultado positivo. Estos ensayos, al igual que otros, involucran el uso de controles positivos y negativos.
nmunoensayos tipo E42 !an sido desarrollados para la detecci#n e identificaci#n de varios tipos de agentes microbianos. Eemplos: , virus de la epatitis 2,6,&, Chlamy!ea trachomatis, /egionella pneumophili , Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli , Entamoeba hystoliticum, Haemophilus inluenzae, eisseria. @. M'todo" ba"ado" en biolo!a $olec#lar Modernamente adquiere m3s importancia el uso de m%todos basados en biología molecular donde, a trav%s de procedimientos y reactivos, se pueden detectar deterC minadas secuencias de 2; que son propias de un determinado agente microbiano. El m%todo que se est3 utili*ando ampliamente en los laboratorios de diagn#stico es el /CR ("olymerase &!ain eaction), que se aplica generalmente para la identificaci#n deC microorganismos que no pueden ser cultivados por los m%todos convencionales. 2 trav%s de este m%todo, puede aumentarse la cantidad de 2; !asta niveles detecC tables mediante electroforesis o mediante sondas de 2;.
El proceso de "&, puede resumirse en D etapas, que se repiten un n n$mero de veC ces:
1. eparaci#n de las cadenas de 2;, ello se reali*a aumentando la temperatura, la cual rompe los enlaces de !idr#geno que mantiene unidos a las cadenas de 2;. =. 2dici#n de cadenas cortas de polinucle#tidos, denominados cebadore", que se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento de 2; que se desee amplificar. Qno se une a la cadena -^ CCCB^ y otro a la cadeC na B^_-^. B. isminuci#n de la temperatura para permitir que los cebadores !ibridicen con las cadenas de 2; de la muestra problema, por complementariedad de bases. D. 2dici#n de la 2; polimerasa, los cuatro nucle#tidos (27", <7", 77", &7") y dem3s cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la cadena complementaria. -. epetici#n de las etapas 1 a D. Este proceso se caracteri*a por ser e+ponencial. En cada ciclo se duplica la regi#n de 2; ubicada entre los cebadores.
Este procedimiento se reali*a en un equipo denominado termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se requieren para cada uno de los pasos. 2 continuaci#n se enumeran eemplos de agentes microbianos subclasificados en bacterias, virus y proto*oario, que !an sido identificados mediante "&.
Bacteria"0 Borrelia burgh!oeri, 1ibrio cholerae, Helicobacter pylori, $tahylococcus aureus, Chlamy!ea trachomatis, $higella !ysenteriae, *reponema palli!um, Escherichia coli enteroto+inog%nica , Mycobacterium tuberculosis y /egionella pneumonophilia, Cam pylobacter 2e2uni)
;ir#": "arvovirus, erpesCsimple+ virus, otavirus, "apillomavirus, irus del dengue, irus aricellaCUoster, irus de la ub%ola, 2denovirus, !inovirus.
/roto>oario": Plasmo!ium alciparium, *o"oplasma gon!ii, Entamoeba histolyticum, Pneumocystis carinii, *rypnanosoma cruzi)
8tro m%todo que tambi%n !a sido ampliamente utili*ado y que se fundamenta en complementariedad de bases de 3cidos nucleicos, son aquellos que utili*an "onda" de ADN5 que se definen como secuencias de oligonucleotidos de 2; marcados, con un B= 1=Belemento radioactivo ( ", , ) o con una proteína unida a una en*ima coC mo la fosfatasa alcalina. Estas sondas se utili*an para la detecci#n de una secuencia complementaria de 2; o 2;, presente en el agente que se desea identificar. 4a muestra, que se supone que contiene un agente microbiano con una secuencia complementaria que se desea identificar, se coloca en un filtro, se trata de manera tal de liberar al 3cido nucleico, se calienta para que las cadena s complementarias
se separen. "osteriormente se añade la sonda, y se dea transcurrir un periodo para que tenga lugar la !ibridaci#n si e+iste la cadena complementaria. 4a uni#n de la sonda a la secuencia complementaria se detecta mediante la señal radiactiva que emite la sonda o mediante m%todos en*im3ticos.
2 continuaci#n se presentan una lista con eemplos de bacterias que !an sido detecC tadas e identificadas por medio de sondas de 2;: •
Bacteria"
ra$ neati&a": eisseria gonorrhoeae, Campylobacter
2e2uni, Campylobacter coli, Haemophilus inluenzae) •
Bacteria" ra$ po"iti&a"0 $treptococcus &rupo A, $treptococcus &rupo B, $treptococcus pneumoniae, $taphylococcus aureus, /isteria monocytogenes)
•
Micobacteria"0 Mycobacterium tuberculosis, M) A#ium, M) 3ntracelulare)
•
ono"0 Histoplasma capsulatum, Blastomyces !ermatitis, Cryptococcus neo- ormans, Cocci!io!es immitis)
iempre que sea posible se debe utili*ar el m%todo m3s eficiente y m3s barato. 4as identificaciones utili*ando "& son muy costosas debido a los equipos, los reactivos y los materiales de laboratorio que se deben utili*ar. El 3rea donde se reali*a una parte del ensayo s#lo puede utili*arse para un determinado agente.
-. /re"er&aci*n de $icroorani"$o". 4os tres obetivos que !ay que alcan*ar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son: que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produ*can contaminaciones durante el proceso de conservaci#n> que durante el tiempo de conservaci#n sobrevivan al menos el ACW de las c%lulas, y por $ltimo, que estas c%lulas permane*can gen%ticamente estables. 4os dos primeros obetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la t%cnica microbiol#gica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual e+isten varios m%todos de conservaci#n para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utili*aci#n general. amos a resumir estos m%todos agrup3ndolos en tres apartados, que son: M%todos de elecci#n o de conservaci#n a largo pla*o, m%todos alternativos y m%todos restringidos.
A M'todo" de elecci*n o de con"er&aci*n a laro pla>o. on los meores porque en ellos se parali*a el crecimiento de las c%lulas microbianas, pero %stas no !an muerto. 2sí se garanti*a al m3+imo la estabilidad gen%tica, por evitarse la aparici#n de generaciones sucesivas. 2$n así no se puede descartar alg$n cambio originado por el m%todo preparatorio en si mismo. 4os m%todos de conservaci#n pertenecientes a este grupo son dos: &ongelaci#n y liofili*aci#n. a
&onservaci#n por congelaci#n.
e congelan las c%lulas en suspensi#n en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. e esta forma, al no disponer las c%lulas de agua en forma líquida, no !ay crecimiento. &uando se quiere trabaar con las c%lulas así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el meor m%todo de conservaci#n desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y adem3s e+iste el peligro de que alg$n fallo del sistema produ*ca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. 7ambi%n resulta ser el m%todo m3s molesto para reali*ar el envío de las cepas. 4os cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las c%lulas conservadas por este m%todo son los siguientes: 1 Edad de las c%lulas: En la mayoría de los casos conviene utili*ar c%lulas maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital alg$n estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcan*ar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleom#rficos e incluso en algunos m3s sencillos. =
elocidad en la congelaci#n y descongelaci#n: 2unque !ay programas de congelaci#n bien estandari*ados para determinados casos o circunstancias, en general es meor que las variaciones de la temperatura sean r3pidas, tanto para la congelaci#n como para la descongelaci#n, por lo que para descongelar conviene poner las c%lulas a BA[&.
B
7emperatura de almacenamiento: ebe ser lo m3s baa posible. 4o meor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las c%lulas microbianas, sumergidos en nitr#geno líquido, que tiene una temperatura de Z1?-[&, o bien en la fase gaseosa del nitr#geno líquido, con una temperatura de
Z1D[&.
En el mercado e+isten variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los m3s aconseables son los que alcan*an temperaturas por debao de ZA[&. 2quellos que s#lo alcan*an temperaturas entre Z=[& y ZD[&, como ocurre con la mayoría, no son aconseables, entre otras cosas porque debido a la gran concentraci#n de solutos que e+isten en la suspensi#n celular, su punto de congelaci#n baa. El daño que se produce en las c%lulas es debido a que a estas temperaturas !ay frecuentes congelaciones y descongelaciones. i se añade un crioprotector no i#nico, como por eemplo el glicerol, se reduce la cantidad de !ielo que se produce y se evita el aumento de la concentraci#n i#nica. "ara la conservaci#n en armarios congeladores, las c%lulas se almacenan en criotubos (tubos de pl3stico esterili*ables resistentes a la congelaci#n que cierran !erm%ticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utili*ando en su totalidad un tubo para cada ocasi#n. e esta manera se evita que
las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto tambi%n se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la soluci#n celular a congelar), ya que para tomar una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto. Este m%todo no se debe emplear para la conservaci#n de microorganismos anaerobios, como por eemplo el g%nero bacteriano Clostri!ium, ya que al estar las c%lulas en una superficie !ay un mayor contacto con el o+ígeno y puede afectarse la viabilidad. D
Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las c%lulas microbianas en el momento de la congelaci#n. E+isten muc!os compuestos que se pueden utili*ar como crioprotectores, pero el que se utili*a con m3s frecuencia es el glicerol, a una concentraci#n del 1- al =W. 7ambi%n se pueden utili*ar el dimetilsulf#+ido, la lec!e descremada y carbo!idratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elecci#n influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.
b
&onservaci#n por liofili*aci#n.
7ampoco se da crecimiento en las c%lulas conservadas por este m%todo, puesto que se les !a quitado el agua mediante la liofili*aci#n, que es un proceso suave. &on ello la estabilidad gen%tica es alta, pero a veces no tanto como en la congelaci#n, porque la liofili*aci#n se consigue por sublimaci#n del !ielo de las c%lulas. "or lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las c%lulas y despu%s eliminarla mediante el vacío, sin que !aya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. "ara este proceso se emplean los aparatos denominados liofili*adores, de los que !ay muc!os modelos en el mercado. 4as c%lulas microbianas así conservadas se someten a un tratamiento m3s compleo que en el caso de la congelaci#n, pues la liofili*aci#n se !ace en dos etapas y se añade la sublimaci#n del agua a la congelaci#n previa. in embargo, este es un m%todo muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una ve* conseguidos los li#filos pueden almacenarse a temperatura ambiente (1[&C=[&), con lo cual su envío es muy c#modo. 4os factores que !ay que tener en cuenta para !acer una buena liofili*aci#n son l#gicamente los mismos que influyen en la congelaci#n, a los que !abr3 que añadir otros que surgen como consecuencia de la des!idrataci#n. in embargo, antes de pasar a e+plicar %stos, tenemos que !acer unas breves consideraciones sobre los que antes !emos mencionado para el caso de la congelaci#n. 4a congelaci#n puede !acerse r3pida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en nitr#geno líquido. especto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utili*ar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofili*ar no se debe utili*ar glicerol, debido a su elevado punto de evaporaci#n y a su !igroscopicidad, que provoca que los li#filos queden muy viscosos. 7ampoco es conveniente utili*ar el dimetilsulf#+ido, porque es algo t#+ico, y al concentrarse por la evaporaci#n del agua puede dañar a las c%lulas microbianas. "or lo tanto, para la liofili*aci#n se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la lec!e descremada para !ongos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser m3s convenientes otros crioprotectores, como por eemplo el glut3micoCglutamato para las bacterias l3cticas, me*clas de glucosa con caldo !ígado o c!opped meat (sin carne) para bacterias anaerobias, etc. 4os nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofili*aci#n como medio de conservaci#n son: 1 7ipo de microorganismo. ay algunos microbios que no resisten la liofili*aci#n y l#gicamente ser3n aquellos que contengan m3s agua en su interior. 2lgunos !ongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofili*ados y !ay que recurrir a otros m%todos.
=
&oncentraci#n celular. 4o meor es liofili*ar suspensiones celulares con una concentraci#n del orden de 1 C1? c%lulas\ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de !ongos filamentosos y levaduras.
B
7emperatura durante la sublimaci#n. ebe ser lo m3s baa posible, sin subir por encima de Z-[&.
D
-
2tm#sfera de o+ígeno en el tubo. 4as c%lulas liofili*adas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la re!idrataci#n como la presencia de alg$n gas dentro del tubo, como el o+ígeno que puede dañar a las c%lulas.
@
&ondiciones de almacenamiento. 4a temperatura debe ser constante, preferentemente a 1[& y sin baar de los [&. 4os li#filos se deben guardar en la oscuridad.
B M'todo" alternati&o". on los que se utili*an cuando no se pueden emplear los m%todos de elecci#n, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservaci#n por estos m%todos. &onviene tener en cuenta que nunca se debe usar un $nico m%todo alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos m%todos. a
&onservaci#n por transferencia peri#dica.
4a cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que !a crecido. in embargo, estas c%lulas no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas e+cretan productos t#+icos del metabolismo que se acumulan, provocando el enveecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor m%todo para conseguir la estabilidad gen%tica, puesto que al estar las c%lulas creciendo !ay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las c%lulas que se est3n guardando ser3n descendientes leanas de las c%lulas iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características. i se va a utili*ar este m%todo es aconseable retardar el enveecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por eemplo: disminuyendo la cantidad de in#culo> rebaando la proporci#n de algunos nutrientes en el medio de cultivo> inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de o+ígeno es m3s r3pido y origina productos generalmente t#+icos> y almacenando los cultivos a D[&C[&. 2 veces tambi%n se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral est%ril. &on esto se consigue tambi%n evitar en la medida de lo posible la desecaci#n del medio de cultivo, que podría ser t#+ico para las c%lulas al aumentar su concentraci#n. ay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por eemplo los !ongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. "or $ltimo, otro inconveniente que tiene la transferencia peri#dica es que la contaminaci#n de los cultivos resulta m3s f3cil al tener que manear los tubos a lo largo del tiempo y tambi%n por la posibilidad de entrada de 3caros en los mismos. b
&onservaci#n por suspensi#n en agua destilada o en agua de mar est%ril.
Es un m%todo alternativo muy utili*ado y que da altos porcentaes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto !ongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. &onsiste en suspender en agua est%ril unas cuantas c%lulas del cultivo que se quiere conservar. e pueden preparar en criotubos de los a nteriormente mencionados. En este caso la concentraci#n celular no debe ser superior a 1 DC1- c%lulas\ml en el caso de bacterias y levaduras. "ara los !ongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensi#n
trocitos de agar con el crecimiento del !ongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensi#n se !ace en agua de mar diluida. 4os resultados obtenidos por la &E&7 en la conservaci#n de microorganismos por este m%todo muestran altos porcentaes de viabilidad en periodos a veces superiores a - años. 4a estabilidad para caracteres morfol#gicos y fisiol#gicos es buena, pero no se !a comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder fermentativo, etc.
C M'todo" re"trinido". En este grupo se engloban m%todos no empleados !abitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la !ora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofili*aci#n o la congelaci#n, como por eemplo los g%neros bacterianos $pirillum, Rho!ospirillum , etc. 4os cuatro m%todos que vamos a citar se basan en la parali*aci#n del crecimiento por eliminaci#n del agua disponible para las c%lulas. a esecaci#n en papel de filtro. e utili*a un papel bastante absorbente (L!atmann n[ B) que se impregna con una soluci#n muy densa de c%lulas y se dea secar al aire (en condiciones est%riles). 7ambi%n es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecaci#n líquida (4Cry) porque se utili*a para ello el liofili*ador, pero sin que !aya !abido congelaci#n previa de las c%lulas. El vacío producido por el liofili*ador deseca las c%lulas, pero !ay que evitar que un vacío e+cesivo provoque evaporaci#n brusca con ebullici#n o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelaci#n incontrolada de las c%lulas. b
esecaci#n en suelo, arena, silicagel, etc.
e añaden las c%lulas a estos sustratos que las proteger3n al desecar. 4os microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este m%todo. c
esecaci#n en bolitas de alginato.
Tste es un procedimiento bastante efica*. 4as c%lulas se encuentran en una matri* de alginato y la eliminaci#n del agua se !ace por tratamiento con soluciones !ipert#nicas sucesivas y posterior desecaci#n al aire !asta que se pierde un AW de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados !erm%ticamente y a temperaturas de entre D[& y 1[&, pudi%ndose guardar incluso a Z[& debido al bao contenido en agua de las c%lulas y la protecci#n que suministra el soporte de alginato. Este es un m%todo que se est3 utili*ando incluso para la conservaci#n de algas y c%lulas vegetales. d
esecaci#n en sal gorda para !alobacterias.
"ara su conservaci#n por este m%todo se me*clan las c%lulas con sal y se dean desecar espont3neamente. ebido a la !igroscopicidad de la sal, la desecaci#n no es total, pero las c%lulas dean de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible. "or $ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. &ualquiera que !aya sido el m%todo empleado en la conservaci#n de las cepas microbianas, cuando %stas se recuperan para !acer nuevos lotes para su conservaci#n o para trabaar con ellas, se recomienda no utili*ar directamente las c%lulas que se !an estado guardando, porque %stas vienen de una situaci#n de estress m3s o menos fuerte (sobre todo cuando se !an conservado por liofili*aci#n) y por lo tanto no son adecuadas para ning$n tipo de prueba. "rimero !abría que revitali*arlas o reuvenecerlas sembr3ndolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo m3s posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabaar con ellas, cultiv3ndolas en medios selectivos cuando sea necesario. gualmente !emos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportar3 determinados m%todos de conservaci#n meor que otros, o ser3 necesario tomar precauciones especiales en su conservaci#n. &omo ya diimos al comien*o, no e+iste un m%todo general de conservaci#n de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el m3s aconseable en cada caso. 4a mayoría de microorganismos de inter%s sanitario pueden conservarse a largo pla*o con los m%todos generales de congelaci#n y\o liofili*aci#n, y para periodos cortos pueden
mantenerse vivos por alguno de los m%todos alternativos si se !ace en las condiciones adecuadas y bien controlados por un microbi#logo.
Unidad < Microrani"$o" procariota" <.1 Bacteria 02#bacteria. MOR=OLOGÍA D2 LA8 BACT2RIA8. 4a morfología bacteriana debe considerarse desde dos puntos de vista: 1) como c%lulas individuales observables s#lo al microscopio y =) como colonias bacterianas apreciables a simple vista despu%s de desarrollarse en la superficie de medios de cultivo s#lidos. 4as diferencias en el tamaño, forma y ciertos detalles estructurales son característicos de los principales grupos de bacterias, y proporcionan las bases fundamentales para su estudio sistem3tico e identificaci#n. e la misma forma, las colonias bacterianas, compuestas por masas de c%lulas individuales, tienen características de tamaño, consistencia, te+tura y color que poseen un valor sistem3tico, pero no tienen la importancia fundamental de la morfología celular.
Ta$ao de la" bacteria". El tamaño de las c%lulas bacterianas se mide !abitualmente en micr#metros, oscilando entre los 1 + 1 `m de los bacilos grandes como 6acillus ant!racis, y los ,= + ,A `m de Jrancisella tularensis. E+isten ligeras variaciones de tamaño de las c%lulas bacterianas dentro de algunas especies, siendo mayores las fluctuaciones entre las formas bacilares que entre las formas esf%ricas. 4os límites de tamaño entre las c%lulas bacterianas y los virus no tienen una frontera bien definida, pues curiosamente e+isten virus m3s grandes que ciertas bacterias.
=or$a" de la" bacteria". esde el punto de vista microsc#pico, la diferencia m3s importante entre las bacterias es su forma, e+istiendo tres tipos morfol#gicos claramente distinguibles: Jormas esf%ricas o cocos. Jormas alargadas o bacilos. Jormas curvadas, comas o espirilos
Coco" 4as bacterias esf%ricas son las m3s !omog%neas con respecto al tamaño, presentando un di3metro medio de ,@ a 1, `m. 4a forma no siempre es e+actamente esf%rica, observ3ndose como m3s comunes las siguientes variaciones: Jormas lanceoladas. Jormas en grano de caf%. Jormas cocobacilares (ac!atadas) 4as diferencias entre los subtipos de cocos se basan en los agrupamientos celulares. Estos aparecen como consecuencia de dos factores: el plano o planos de divisi#n celular y la tendencia de las c%lulas !ias a permanecer unidas entre sí, una ve* que se completa la divisi#n. 4os cocos que se separan completamente despu%s de la divisi#n aparecen individualmente, y a esta forma se le llama coco. &uando !ay una ligera tendencia a que las c%lulas !ias permane*can unidas y la divisi#n celular ocurre en un solo plano, los cocos se agrupan predominantemente en pares, llamados diplococos. i la uni#n es m3s marcada, se ven largas cadenas de cuatro cocos o m3s> estos agrupamientos se conocen como estreptococos. &uando los cocos se dividen en varios planos, y !ay una elevada tendencia a que permane*can unidos, aparecen racimos irregulares de cocos, semeantes a racimos de uvas> estos agrupamientos se denominan estafilococos. in embargo, la separaci#n de subtipos morfol#gicos no es absolutamente nítida, y en una misma colonia pueden observarse cadenas o racimos unto con formas aisladas o en pareas. 2 pesar de todo esto, los grupos morfol#gicos tienen muc!o valor pr3ctico en la identificaci#n y clasificaci#n de cocos.
Bacilo" 4as formas alargadas o bacilares agrupan una gran cantidad de subtipos morfol#gicos. 4as diferencias en anc!ura, longitud y forma de los e+tremos de la c%lula proporcionan una considerable !eterogeneidad a la forma bacilar. En funci#n de la tendencia de las c%lulas !ias a permanecer unidas, los bacilos presentan tambi%n agrupaciones celulares características, citando como eemplo las formas en empali*ada ( \\\\\ ) o en ( ) o en letras c!inas. 2unque son !asta cierto punto característicos, los agrupamientos de c%lulas bacilares no tienen la misma importancia morfol#gica que el agrupamiento de cocos. 2"pirilo"@ El tercer tipo morfol#gico es la forma espirilar, que puede considerarse como un bacilo que se !a torcido adoptando la forma de !%lice. 2unque la curvatura se observa ocasionalmente en muc!as formas bacilares, en el g%nero ibrio es suficientemente constante como para tener importancia diferencial. 4os vibrios pueden presentar una forma espirilar si las c%lulas permanecen unidas por sus e+tremos. 4as verdaderas bacterias espirilares pueden ser de dos tipos: con espira rígida o con espira fle+ible. 2l conunto de las formas espirilares fle+ibles se le conoce como espiroquetas. 4a clasificaci#n y diferenciaci#n de las espiroquetas pat#genas se basa en criterios morfol#gicos tales como la longitud de vuelta, el 3ngulo en los e+tremos de la c%lula, la presencia de una envuelta e+terna y la composici#n del filamento a+ial. Caracter!"tica" de la" colonia" bacteriana". &uando las bacterias crecen en la superficie de un medio de cultivo s#lido, las c%lulas en divisi#n permanecen apro+imadamente fias en su posici#n y forman masas de muc!os millones de c%lulas visibles a simple vista. 4as colonias así formadas varían desde un tamaño diminuto, apenas visible, !asta masas de varios milímetros de di3metro. u tamaño, forma, te+tura, olor y en algunos casos color son, a veces, muy orientativos para la identificaci#n de las bacterias que la componen. 2unque estas características dependen a menudo de la naturale*a del medio de cultivo y de las condiciones de incubaci#n, cuando %stas se controlan cuidadosamente, son muy constantes y, en muc!as ocasiones, tienen un valor diferencial considerable. 4a morfología de las colonias es una de las características b3sicas de las bacterias y es indispensable su estudio para comen*ar correctamente una identificaci#n preliminar. 4as características morfol#gicas m3s importantes de una colonia bacteriana aislada sobre un medio de cultivo s#lido son:
Ta$ao@ El tamaño de las colonias bacterianas es, en condiciones de cultivo favorables, bastante uniforme para cada especie o tipo. 4a visuali*aci#n del tamaño se suele !acer a simple vista, aunque a veces es preferible utili*ar lupas o estereoscopios para poder discernir con mayor claridad las características morfol#gicas a observar. 4as colonias de estreptococos, por e., son relativamente pequeñas (menos de 1 mm de di3metro), mientras que las de estafilococos o las de algunos bacilos pueden alcan*ar !asta 1 cm de di3metro. Es importante destacar que las características de una colonia deben estudiarse siempre sobre el mismo tipo de medio de cultivo, para evitar las diferencias surgidas por la diferente composici#n de los mismos. El tamaño de las colonias bacterianas podemos e+presarlo en las siguientes categorías: C "equeñas o puntiformes: 1 mm de di3metro o menor C Medianas: !asta D mm de di3metro C
C C C
semiesf%rica o conve+a plana o en disco acuminada
C C C
cerebroide plana con bordes elevados (en cr3ter). plana con centro elevado (en !uevo frito)
8#per(icie@ 4a superficie de la colonia, e+aminada mediante lu* refleada, puede mostrar un aspecto liso y brillante a la lu* o, por el contrario, una te+tura irregular, rugosa y mate, sin brillo. "uede mostrar un aspecto filamentoso o cerebroide. 4a utili*aci#n de una lupa estereosc#pica permite la observaci#n de esta característica mediante la detecci#n del refleo del filamento de la l3mpara en la superficie de la colonia. Con"i"tencia@ 4as colonias bacterianas pueden tener una consistencia variable, desde seca y fr3gil a grasienta y cremosa o viscosa y pegaosa. Esta característica s#lo se aprecia cuando tocamos las colonias con el asa de siembra. "odremos observar colonias FdurasF que se desli*an f3cilmente por la superficie del medio, siendo difícil manipularlas con el asa. 2 menudo estas colonias se fragmentan al intentar cogerlas. 8tras colonias tienen apariencia cremosa, con superficie brillante generalmente y f3ciles de manipular con el asa. 4a mayoría de las colonias tienes consistencia mantecosa, siendo muy f3cil obtener pequeñas porciones de la misma, que quedan bien ad!eridas al asa de siembra. En algunas ocasiones las colonias son e+tremadamente viscosas y tienden a formar filamentos mucosos cuando intentamos retirarlas con el asa. /i$entaci*n@ Es característico s#lo de unas pocas especies bacterianas. 4a pigmentaci#n s#lo se observa en colonias, y nunca en c%lulas individuales. entro de las bacterias pat#genas, una de las formas pigmentadas m3s importantes es tap!ilococcus aureus, cuyas colonias son normalmente de color amarillo dorado. En ocasiones, el pigmento difunde al medio, dando a %ste una tonalidad característica en algunas especies. "seudomonas, por eemplo, produce un pigmento verdoso que puede ser f3cilmente reconocido en medios incoloros como el MuellerCinton. ay que tener especial precauci#n para no atribuir una falsa pigmentaci#n a colonias que se !an desarrollado en medios con determinadas sustancias nutritivas (a*$cares) e indicadores de cambio de p. "or eemplo, los g%rmenes que utili*an la lactosa para su metabolismo dar3n colonias de color amarillo en un medio que contenga este a*$car y un indicador de p adecuado.
e$*li"i"@ 2lgunas bacterias, fundamentalmente los cocos, pueden ser capaces de !emoli*ar los !ematies de un medio nutritivo s#lido como el agar sangre. Esto es debido a la liberaci#n de unas sustancias denominadas !emolisinas. 4a !em#lisis de los !ematies adyacentes a la colonia puede ser intensa o ligera y se observa como un !alo verdoso m3s o menos claro alrededor de la colonia. 4a !em#lisis intensa se denomina eta !em#lisis> la !em#lisis parcial se conoce como alfa !em#lisis y la ausencia de %sta se define como gamma !em#lisis. 4a producci#n de !em#lisis en una placa de agar sangre es una de las características que ayudan a diferenciar los diferentes tipos de estreptococos. Olor@ &iertos tipos de bacterias descomponen los sustratos que utili*an para su metabolismo desprendiendo sustancias vol3tiles que proporcionan un olor característico a los cultivos puros de dic!as bacterias. &omo intentar definir un olor es tan difícil como subetivo, s#lo os dir% que
ser3 $nicamente la pr3ctica diaria la que os permita un reconocimiento adecuado de esta característica. "uesto que estas características aparecen en grados y combinaciones variables de unas bacterias a otras, el aspecto de las colonias es a menudo bastante característico, permitiendo distinguir distintas clases de bacterias en cultivos mi+tos o contaminados. 4a diferenciaci#n en base a un criterio morfol#gico de las colonias es s#lo orientativa, y para poder identificar una bacteria se necesita un estudio detallado de sus características fisiol#gicas e inmunol#gicas.
28TRUCTURA BACT2RIANA. 4a primera apro+imaci#n que vamos a efectuar al mundo de las bacterias comen*ar3 por un detallado an3lisis de su anatomía, la cual s#lo !a sido posible desde la utili*aci#n del microscopio electr#nico. 7ras estudiar con detalle las estructuras de que est3n compuestas las bacterias, abordaremos su estudio morfol#gico como entidades individuales, consider3ndolas seg$n la morfología celular y su forma de agrupamiento. "or $ltimo veremos como se agrupan las bacterias en gigantescos ac$mulos (comparados con su tamaño) y podremos observarlas a simple vista en forma de colonias, cuyas características tambi%n estudiaremos. 2unque las bacterias son unidades funcionales que act$an como un solo individuo, reali*aremos una divisi#n de sus estructuras v3lida solo desde un punto de vista did3ctico. amos a considerar las estructuras seg$n la posici#n que ocupan en relaci#n con la envuelta celular, que consideraremos el límite normal de cualquier c% lula: C Estructuras de la envuelta celular, C Estructuras e+ternas, C Estructuras internas.
2"tr#ct#ra" de la en&#elta cel#lar. 4a c%lula bacteriana propiamente dic!a est3 limitada por una estructura integrada, la envuelta celular, de compleidad variable. En la mayor parte de las c%lulas, la envuelta celular consta de pared celular y de membrana citoplasm3tica subyacente. 4a e+istencia de bacterias con formas distintas a la esf%rica demuestra que esta estructura tiene la suficiente rigide* como para soportar la presi#n superficial y la presi#n interna de la c%lula. 2lgunas bacterias poseen una pared celular muy delgada, casi confundida con la membrana citoplasm3tica> otras en cambio presentan una tercera capa o membrana e+terna adosada a la pared celular. 4a pared celular es la responsable de la diferente impregnaci#n tintorial de las bacterias al ser teñidas mediante la tinci#n de
Me$brana citopla"$tica@ 4a membrana citoplasm3tica es una estructura indispensable para todas las c%lulas bacterianas. Est3 situada en la superficie interna de la pared celular y rodea totalmente al citoplasma. 4as membranas citoplasm3ticas bacterianas son similares, en cuanto a composici#n y estructura, al resto de las membranas biol#gicas. 4as membranas citoplasm3ticas de las c%lulas eucariotas poseen esteroles entre la bicapa fosfolipídica, mientras que las bacterias poseen un componente diferente: los !opanoides. 4a membrana citoplasm3tica tiene escasa resistencia mec3nica y no contribuye significativamente al mantenimiento de la forma de la bacteria, ya que las formas alargadas tienden a adoptar formas esf%ricas cuando se elimina la pared celular. 2unque la membrana es una estructura diferente de la pared celular, ambas est3n unidas por algo m3s que la co!esi#n lateral, y !ay evidencias que sugieren la e+istencia de alg$n tipo de enlace entre las dos estructuras. 4a membrana puede invaginarse para formar org3nulos conocidos como mesosomas, que adoptan diversas formas. u funci#n principal parece centrarse en su participaci#n como iniciador de la divisi#n celular. /ared cel#lar 4a forma y rigide* de las bacterias se debe casi por completo a la presencia de una estructura polim%rica grande que sirve de apoyo y se e+tiende por el e+terior de la membrana citoplasm3tica, formada por una me*cla de a*$cares y p%ptidos: el peptidoglucano. El 3cido mur3mico parece ser característico de los peptidoglucanos de las paredes celulares bacterianas. "ara un estudio m3s detallado sobre la composici#n y estructura de la pared
celular y para la observaci#n de abundantes dibuos y esquemas, os remito a la p3gina Oeb del 7odar^s, 7e+booG on Zline of 6acteriology, o al cap. D del libro 6iología de Microorganismos (6rocG).
Me$brana e?terna 4a membrana e+terna tiene una forma y una constituci#n similar a la de otras membranas biol#gicas. e comporta como una barrera !idrof#bica para difusi#n de una gran cantidad de sustancias, participa en la conugaci#n y en la divisi#n celular y contiene proteínas especiales, las porinas, que intervienen en la toma de nutrientes y la difusi#n pasiva de pequeñas mol%culas !acia el espacio peripl3smico. 7ambi%n contiene lipopolisac3ridos que son los principales componentes antig%nicos de superficie. 4a funci#n de la envuelta celular es la de una barrera osm#tica y de un sistema regulador que separa el citoplasma del medio, y proporciona a la bacteria el entorno relativamente aislado que necesitan los organismos vivos.
2"tr#ct#ra" e?terna". En el e+terior de las c%lulas bacterianas podemos encontrar tres clases de estructuras: los flagelos, u org3nulos relacionados con la locomoci#n y quimiota+is> las fimbrias o pilli, y la c3psula, o capa mucosa que rodea a la c%lula. ;inguna de ellas resulta esencial para la e+istencia de la c%lula, pudiendo eliminarse por diversos medios y sin que e+ista in!ibici#n del crecimiento bacteriano o alteraci#n de su funci#n metab#lica.
=laelo" 4os flagelos bacterianos son prolongaciones filamentosas largas que se e+tienden m3s all3 de la superficie celular. on los responsables de la locomoci#n de las bacterias y se !allan implicados en la quimiota+is y en la percepci#n bacteriana. ebido a su delgade*, son difíciles de ver en las preparaciones en fresco, siendo necesario teñirlos mediante t%cnicas especiales para ponerlos de manifiesto. 4os flagelos aparecen sobre todo en los bacilos. u n$mero es relativamente constante dentro de cada especie bacteriana. 4os flagelos pueden estar locali*ados solo en los e+tremos de la bacteria o estar repartidos a lo largo de la superficie celular. 4as bacterias flageladas se clasifican seg$n el n$mero y locali*aci#n de los flagelos: las bacterias que tienen un $nico flagelo se denominan mon#tricas> las que tienen dos o mas flagelos en uno de los e+tremos de la c%lula son lof#tricas> aquellas que tienen penac!os en ambos e+tremos son anfítricas, y si los flagelos est3n dispuestos por toda la superficie celular se denominan perítricas. 4os flagelos se componen de tres porciones claramente diferenciadas: filamento, codo o manguito y cuerpo basal. El filamento tiene una longitud media de 1- a =- `m y se !alla unido al cuerpo basal a trav%s del manguito. 4a composici#n proteica del filamento !ace que este posea características antig%nicas que a veces son $tiles para la identificaci#n bacteriana. El manguito flagelar es una especie de Farticulaci#n universalF que permite la transmisi#n del movimiento desde el cuerpo basal !asta el filamento. El cuerpo basal es la porci#n m3s complea, encontr3ndose dentro de la envuelta celular y actuando como un verdadero motor. e observan dos tipos de movimiento flagelar: de desli*amiento y de rotaci#n. 4os primeros son los encargados de dirigir a las bacterias !acia sitios concretos. Qna bacteria con movimiento de traslaci#n puede llegar a alcan*ar !asta los -- `m por segundo. 4os movimientos de rotaci#n provocaran despla*amientos aleatorios conoci%ndose tambi%n como volteretas o vuelcos. un aleamiento de una fuente luminosa seria una fotofobia. =i$bria" o pilli" Estas estructuras solo pudieron ser descubiertas gracias a la utili*aci#n del microscopio electr#nico, pues su longitud varia entre ,B y 1 `m. "ueden aparecer en los e+tremos de las
c%lulas o pueden estar distribuidas por toda la superficie en n$mero que oscila desde uno a varios centenares por c%lula. 4as fimbrias pueden ser de dos tipos diferentes, tanto desde el punto de vista morfol#gico como funcional: los pilli se+uales est3n implicados en la formaci#n de pareas específicas durante la conugaci#n bacteriana, y sirven para iniciar el contacto entre dos c%lulas, uni%ndolas y facilitando la transferencia de material gen%tico. 4os pilli se+uales se distinguen de las otras fimbrias por su mayor longitud y su menor n$mero (de uno a die* por c%lula). 8tras fimbrias parecen tener propiedades ad!erentes que facilitan la uni#n a otros tipos de c%lulas> p. e. Eritrocitos o leucocitos. 4a ad!erencia es fundamental para la coloni*aci#n bacteriana en el !u%sped animal.
Cp"#la 4a c3psula es una estructura de naturale*a polisac3rida que rodea completamente a la c%lula. El tamaño aparente de la c3psula varia ampliamente, siendo con frecuencia mayor que el di3metro de la bacteria. u funci#n es a$n obeto de estudio, consider3ndose que desempeña un importante papel en la protecci#n de la bacteria frente a agentes e+ternos tales como la desecaci#n, los bacteri#fagos o los metales t#+icos. 9ui*3s tenga mayor importancia la ad!erencia de las bacterias encapsuladas a superficies inertes de su entorno natural y a c%lulas adecuadas para su crecimiento y supervivencia. 4as c3psulas bacterianas no se tiñen con los procedimientos !abituales, pues no retienen colorantes con facilidad. e pueden !acer visibles al microscopio #ptico suspendiendo las c%lulas en tinta c!ina diluida> este m%todo se conoce como tinci#n negativa. 4a c3psula despla*a las partículas de carb#n coloidal y las c%lulas parecen !allarse en lagunas, que representan las c3psulas, situadas sobre un fondo oscuro. in embargo, no todas las c3psulas impiden la penetraci#n de las partículas de carb#n, y algunas no pueden ser observadas de este modo. 4a c3psula es !abitualmente inmunog%nica, y los anticuerpos inducidos reaccionan con ella. 4os anticuerpos se fian a la c3psula favoreciendo su fagocitosis o penetrando en la matri* capsular y reaccionando con los polisac3ridos. Esta reacci#n altera el índice de refracci#n de la c3psula, de manera que, en preparaciones !$medas no teñidas observadas microsc#picamente, aparecen meor definidas y m3s grandes. En 1?=, ;eufeld aplic# este abultamiento capsular, o reacci#n de 9uellung, a la identificaci#n serol#gica de neumococos, y desde entonces se !a utili*ado para la identificaci#n serol#gica de diversas bacterias encapsuladas. 2"tr#ct#ra" interna". 2l n#cleoide bacteriano 7odo el material gen%tico de la c%lula est3 contenido en una $nica mol%cula de 2; que mide de 1 a 1D `m de longitud cuando est3 totalmente e+tendida.
El tamaño y locali*aci#n de las esporas son relativamente constantes dentro de cada especie. En funci#n de su locali*aci#n la espora puede ser central, subterminal (entre el centro y el e+tremo), y terminal. En ocasiones, su tamaño y locali*aci#n pueden dar lugar a una morfología característica, como en el caso del bacilo del t%tanos, cuya espora terminal grande confiere a la c%lula vegetativa que la contiene forma de palillo de tambor. 4a espora es un estado e+tremadamente resistente en el desarrollo de la c%lula. ;o s#lo es relativamente impermeable a los colorantes, sino que tambi%n es muc!o m3s resistente que las c%lulas vegetativas a los efectos perudiciales del calor, la desecaci#n, presi#n !idrost3tica y muc!os agentes químicos. 2lgunas esporas son e+tremadamente resistentes a los procedimientos !abituales de esterili*aci#n, necesit3ndose un periodo de casi tres !oras en autoclave para asegurar su destrucci#n. ;ormalmente la iniciaci#n de la esporog%nesis en c%lulas que est3n creciendo activamente es inducida por deplecci#n de nutrientes. En cada c%lula s#lo se forma una espora. &uando la espora se encuentra en un medio favorable para el crecimiento de las c%lulas vegetativas, germina y la c%lula comien*a un nuevo ciclo vegetativo.
<.1.- Reprod#cci*n bacteriana. 4a vida de una c%lula bacteriana comien*a con su nacimiento y acaba con la formaci#n, por fisi#n binaria, de dos c%lulas nuevas. Entre estos dos procesos, nacimiento y divisi#n celular, la c%lula crece de manera que en el momento de la divisi#n todos los elementos celulares presentes en el nacimiento se !an duplicado para dar lugar a dos c%lulas esencialmente id%nticas. 4as etapas necesarias para llevar a cabo la multiplicaci#n de las c%lulas bacterianas constituyen el ciclo celular bacteriano. El ciclo celular bacteriano, al igual que el de otros organismos, agrupa la progresi#n de varias etapas que incluyen (@B, 1DB): el crecimiento celular, la duplicaci#n del genoma o replicaci#n (periodo & en bacterias y fase en eucariontes), la separaci#n de los cromosomas replicados (partici#n en bacterias y mitosis en eucariontes) y la divisi#n celular. 4a mayor diferencia entre el ciclo celular de eucariontes y el bacteriano es que en eucariontes el tiempo requerido para la replicaci#n del cromosoma, fase , es siempre menor que el del ciclo celular completo, mientras que en bacterias el periodo & puede ser mayor. En las c%lulas bacterianas los procesos que constituyen el ciclo celular est3n cuidadosamente controlados y coordinados unos con otros para, en un amplio rango de condiciones ambientales, conseguir la producci#n del m3+imo n$mero de c%lulas viables por biomasa en el menor tiempo posible. &iclo &elular engloba la secuencia •
crecimiento
•
duplicaci#n del 2;
•
nuevo proceso de crecimiento
&omen*ando a partir de la citocin%sis, la c%lula !ia resulta pequeña y posee un bao contenido de 27" resultante del gasto e+perimentado en el ciclo anterior. 4a acumulaci#n del 27" necesario y el incremento de tamaño acontecen durante el intervalo <1 de la interfase. &uando adquiere el tamaño suficiente y el 27" necesario comien*a la fase , la c%lula sinteti*a 2; (replicaci#n del 2;) proceso que da como resultado final F un original y una copiaF del 2;, destinadas a las dos c%lulas que se originan del proceso. ado que el proceso de síntesis consume una gran cantidad de energía la c%lula entra nuevamente en un proceso de crecimiento y adquisici#n de 27": la fase <=. 4a energía adquirida durante la fase <= se utili*a para el proceso de mitosis.
Mito"i"
4a mitosis es el proceso de formaci#n de dos c%lulas (generalmente) id%nticas por replicaci#n y divisi#n de los cromosomas de la original que da como resultado una FcopiaF de la misma. 4as c%lulas eucariota poseen un mayor n$mero de cromosomas que por otra parte son muc!o mas grandes que los de los procariotas. 4a estructura de los cromosomas replicados y condensados tiene varios aspectos de inter%s. El cinetocoro es el punto donde FanclanF los microt$bulos del !uso. 4os cromosomas replicados consisten en dos mol%culas de 2; ( unto con sus proteínas asociadas: las !istonas) que se conocen con el nombre de crom3tides. El 3rea donde ambas crom3tides se encuentran en contacto se conoce como centr#mero, cinetocoro se encuentra en la parte e+terna del centr#mero. e debe !acer !incapi% en que los cromosomas son cromatina (2; m3s !istonas) y señalar la particularidad de que en los e+tremos del cromosoma (que toman el nombre de tel#mero) se encuentran secuencias repetidas de 2;. urante la mitosis los cromosomas replicados se posicionan cerca de la mitad de la c%lula y luego se segregan en manera tal que cada c%lula resultante recibe una copia de cada cromosoma original (si se comien*a con D@ cromosomas en la c%lula original se termina con D@ cromosomas en las c%lulas resultantes). "ara reali*ar esto las c%lulas utili*an microt$bulos (que en este caso en conunto forman el !uso mit#tico) que FtiranF de los cromosomas para llevarlos a cada futura c%lula. 4as c%lulas animales (e+cepto un grupo de gusanos conocidos con el nombre de nematodos) poseen centríolos. 4as plantas y la mayor parte de los otros eucariotas no poseen centríolos y los procariotas, por supuesto, carecen de !uso y centríolos> en procariotas la membrana celular suple esta funci#n al traccionar los cromosomas a ella pegados durante la citocinesis de la fisi#n binaria. 4as c%lulas que contienen centríolos tambien poseen una FcoronaF de pequeños microt$bulos, el aster, que se e+tienden desde los centríolos a la membrana nuclear.
Control del ciclo cel#lar e lo anterior se deduce que debe de e+istir alg$n tipo de acoplamiento entre las ondas de replicaci#n y la divisi#n celular. Este es un campo de investigaci#n a$n oven, del que no conocemos todavía todos los detalles. 4as copias de cromosomas reci%n replicadas se encuentran en principio adyacentes de la membrana citopl3smica (]unidas a sendos mesosomas) probablemente unidas a trav%s de sus respectivos orígenes de replicaci#n ( oriC ). ;o se sabe muy bien c#mo esas copias se van separando de modo que cada una va a parar a una c%lula !ia. e sabe que en este reparto o partici#n de los cromosomas intervienen varias proteínas, entre ellas "ar2 y "ar6, que en las c%lulas a punto de dividirse se sit$an en los dos polos opuestos. Es posible que e+ista alg$n mecanismo /activo0 para separar estos cromosomas, pero parece ser que tambi%n intervienen los mecanismos /pasivos0 de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique transversal en crecimiento. 7ambi%n se sabe !oy que e+isten dos secuencias paralelas e independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular: un control es sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicaci#n del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral (en el caso de los bacilos) para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formaci#n del tabique. • •
El comien*o de la replicaci#n del cromosoma se indica mediante la uni#n de muc!as unidades de la proteína na2 (unida a 27") al origen de replicaci#n ( oriC ). Qna ve* que se !a iniciado una ronda de replicaci#n en oriC , esta regi#n queda !emimetilada, pero en ve* de ser metilada inmediatamente, queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa am y de la maquinaria de replicaci#n. e sugiere que en este fen#meno est3 implicada una proteína (eq2), que a su ve* ayudaría a esconder aoriC en la membrana. #lo m3s tarde (y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la proporci#n entre sitios de inicio y alg$n
par3metro celular como masa o volumen), vuelven a quedar secuencias oriC disponibles para su metalici#n y uso en una nueva ronda.
•
las
El comien*o de la tabicaci#n parece que requiere dos señales: • •
por un lado, el cromosoma !a debido terminar su replicaci#n y las copias !ias deben de estar separadas en e+tremos opuestos
• •
por otro lado, la c%lula debe !aber alcan*ado una longitud umbral
&omo ya vimos en el cap4tulo 5 , llegado el momento, la proteína JtsU (que !asta entonces estaba diseminada por toda la c%lula), se concentra a!ora en la parte central, señalando el plano de la tabicaci#n: se forma un /anillo citocin%tico0 o divisoma, en el que la JtsU se va /contrayendo0 !acia el interior (!idroli*ando <7" !asta <"). 2 continuaci#n se van ensamblando en el divisoma varias proteínas Jts, entre ellas la "6"B, que como vimos es una transglucosidasaCtranspeptidasa específica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal. 4a terminaci#n del tabique señala el final del ciclo celular.
<.1.< Metaboli"$o bacteriano. 788 los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. 2 este conunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran n$mero de reacciones químicas destinadas a transformar las mol%culas nutritivas en elementos que posteriormente ser3n utili*ados para la síntesis de los componentes estructurales> como pueden ser las proteínas. 8tra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energía que est3 contenida en una reacci#n química en alg$n proceso que requiera de energía, como puede ser el trabao o el movimiento. Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en ning$n caso el alimento contiene todas las mol%culas que una c%lula requiere. Esto se vio con claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que s#lo contenía glucosa como $nica fuente de energía. 2sí pues, se pens# que la síntesis de todos los componentes celulares se llevaba a cabo en el interior de las levaduras. oy sabemos que las transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario, se forman varios productos intermedios que en muc!as ocasiones no tienen una funci#n específica a no ser la de formar parte de lo que se conoce como vía metab#lica. 4a transformaci#n de los nutrientes en compuestos $tiles para la subsistencia de un organismo se lleva a cabo por medio de las reacciones químicas que reali*an unas proteínas conocidas como en*imas. e tal forma que no podemos !ablar del metabolismo si no describimos brevemente qu% son y c#mo funcionan las en*imas.
2 pesar de la gran diversidad metab#lica mostrada por los microorganismos, la mayoría de ellos pueden ser considerados en uno de los cuatro tipos nutricionales de acuerdo a su fuente primaria de obtenci#n de energía, fuente de carb#n y de eC \ Y.
e acuerdo al Nrbol de la ida de Loese, microbi#logo creador de la nueva ta+onomía molecular basada en la comparaci#n entre especies de la fracci#n 1@s del 2; ribosomal, se proponen B dominios 2rc!aea, 6acteria y Eucarya, en los que se incluye a todos los seres vivos, aunque e+isten controversias.
1
28/IROEU2TA8.
6acilos fle+uosos en forma de espiral con movilidad debida a un filamento a+ial y semeante a un sacacorc!os. on
=
4E"78"2
B) Recurrentis
BACT2RIA8 GRAM N2GATI;A8 A2ROBIA8 O MICROA2RO=ILA8 0;IBRIOID28@
<%nero &2M"P4862&7E: 6acilos espirales curvados y m#viles "ar3sitos del !ombre y animales. Especies: C) etus, C) 2e2uni y C) coli <%nero E4&862&7E. Especie: H pylori , agente productor del 6lcus pepticum. B BACILO8 9 COCO8 GRAM Jamilia "Q8M8;22&E2E.
N2GATI;O8 A2ROBIO8@
<. "EQ8M8;2. Especie Pseu!omonas auruginosa) 6acilos gram negativos con flagelos polares. "roducen citocromo Z o+idasa. Jamilia M82'E42&E2E. < M82'E442. Especies: M) lacunate, M catharralis . < 2&;E7862&7E. Especie: A baunannii . Jamilia '2;78M8;22&E2E < 7E;878"8M8;2. Especie: $) maltophilia. Jamilia 6Q584E2 < 6Q584E2. Especie B) cepacea Jamilia 4E<8;E442&E2E.
<. 4E<8;E442. 6acilos m#viles de vida libre. "at#genos para el !ombre. Especie: /) pneumophila)
Jamilia ;EE2&E2E. <. ;EE2. &ocos agrupados en pareas con las *onas adyacentes planas. Especies pat#genas: ) meningiti!is, ) gonorrhoeae) <. 5;
Jamilia 62PU862&E2E < 2J"2. Especie: A) elis 8tros g%neros de inter%s: <. J42862&7EQM: ) meningosepticum) <. 24&24
D
BACILO8 GRAM N2GATI;O8 ANA2ROBIO8 =ACULTATI;O8@ J E;7E862&7E2&E2E: 6acilos gram negativos no esporulados. Jermentan la glucosa con formaci#n de 3cido o 3cido y gas. educen los nitratos a nitritos y no poseen citocromoo+idasa.
"rincipales g%neros y especies tipo: < E&E&2. E) coli <.
BACT2RIA8 ANA2ROBIA8 GRAM N2GATI;A8@
Est3n formadas por bacilos gram negativos anaerobios estrictos, no esporulados. <. JQ862&7EQM. ) nucleatum <. 62&7E8E. B) ragilis <. "E87E442 y < "8"P8M8;2: antiguos Bacteroi!es pigmentados @ COCO8 ANA2ROBIO8 on inm#viles. ;o esporulados. J E448;E442&E2E.
GRAM N2GATI;O8@
< E448;E442. 1eillonella par#ula A
RIC62TT8IA8 9 CLAMIDIA8@
Microorganismos pleom#rficos que necesitan para su cultivo c%lulas vivas donde originan corp$sculos de inclusi#n. <. &5E772. R) pro8azecki, R) connori <. &8'E442. &. burnetti J &42MP2&E2E. < &42MP2. C) trachomatis) C) psittaci, C) pneumoniae 1. M9CO/LA8MA8 &arecen de pared celular. on los menores microorganismos cultivables en medios sint%ticos. J. MP&8"42M272&E2E. <.MP&8"42M2. M) pneumoniae, M) hominis <. QE2"42M2. 6) urealyticum =.
COCO8 GRAM /O8ITI;O8@ Aerobio" F anaerobio" (ac#ltati&o". <. M&8&8&&Q. M) luteus) <. 72"48&8&&Q. $) aureus, $) epi!ermi!is, $) saprophyticus <. 7E"78&8&&Q. $) pyogenes, $) pneumoniae <. E;7E8&8&&Q. E) aecalis) 8tros E7E"78&8&8.
Anaerobio" e"tricto"@ <. "E"78&8&&Q. P) niger) <. "E"787E"78&8&&Q. P) anaerobius <. 2&;2 B.
BACILO8 GRAM /O8ITI;O8 28/ORULADO8@ <. 62&44Q. B) anthracis <. &487QM. C) tetani, C) boatulinum, C) perringens
D.
OTRO8 BACILO8 GRAM /O8ITI;O8@ <. 47E2. /) monocytogenes <. &8P;E62&7EQM. 6acilos gram positivos. 7endencia a agruparse en letras c!inas. C) !iphtheriae <. 2&7P;8MP&E. Jorman !ifas o micelios rudimentarios. A) israelii <. ;8&22. ) Asteroi!es J. MP&862&7E2&E2E. 6acilos 2cidoC2lco!olCresistentes. <.MP&862&7EQM. M) tuberculosis, M) leprae
<.1. I$portancia de la" e#bacteria". on usadas para la producci#n de quesos, mantequilla, vinagre, lec!e fermentada o yogur. 2quí principalmente se utili*an /actobacillus y $treptococcus en conunto con levaduras y mo!os. 7ienen una gran importancia ecol#gica, ya que son ellas las que descomponen grandes cantidades de la materia org3nica de plantas y animales que mueren. 2dem3s que intervienen en muc!os ciclos biol#gicos como el ciclo del nitr#geno y del carbono y en el metabolismo del a*ufre, del fosforo y del !ierro. on usadas en la industria para producir alco!ol y acetona (&lostridium acetobutylicum). 2lgunas otras bacterias son utili*adas para la elaboraci#n de antibi#ticos (streptomyces y bacillus). 8tras bacterias son utili*adas para producir 3cido ac%tico (gluconobacter y acetobacter)2lgunas son pat#genas, es decir que causan enfermedades. "or mencionar algunas se encuentra: E. &oli y almonela.
Unidad .H Microorani"$o" e#cariota" .1 ono" pl#ricel#lare" y #nicel#lare". 4os !ongos son unos seres vivos que tienen una serie de características propias que !ace que est%n incluidos en un reino aparte, el eino Jungi. on organismos tanto unicelulares como pluricelulares !eter#trofos y con organi*aci#n celular eucariota. e caracteri*an por no formar teidos teniendo su cuerpo una estructura talofítica estando formado por una serie de filas o !ileras de c%lulas denominadas !ifas que en conunto constituyen el micelio. us c%lulas presentan una pared celular que en muc!os casos no est3 formada de celulosa sino de quitina. 4os !ongos tienen digesti#n e+terna. "ara ello, secretan en*imas digestivas al medio que act$an degradando la materia org3nica y produciendo mol%culas sencillas que son absorbidas como nutrientes a trav%s de la pared y membrana celular.
Lo" ono" p#eden "er@
H apr#fitos: egradan la materia org3nica muerta. C "ar3sitos: egradan materia org3nica de uno organismo vivo sobre el que se asientan. C imbiontes: iven en simbiosis con otro organismo. ;ormalmente con algas dando lugar a los llamados líquenes que destacan por su papel como indicadores de la contaminaci#n atmosf%rica. C epredadores: e alimentan de otro organismo al que matan.
uelen vivir en lugares !$medos y oscuros pero pueden encontrarse en cualquier lugar en el que !aya materia org3nica. ;ecesitan !umedad para desarrollarse.
Lo" ono" "e p#eden di&idir en@ Qnicelulares: levaduras. X X "luricelulares: mo!os u !ongos filamentosos. Est3n formados por filamentos llamados !ifas, muy ramificadas y rodeadas de pared rígida.
Metaboli"$o de lo" ono" 4os !ongos son típicamente organismos !eter#trofos quimiosint%ticos teniendo escasas necesidades nutricionales, por lo que pueden crecer con gran facilidad. El lugar m3s frecuente en el que se desarrollan es el suelo, a una temperatura que oscila entre 1 y - [& (dependiendo de la especie) aunque tambi%n es com$n encontrarlos en medios acu3ticos, en piel de animales, en alimentos (pan, mermelada, fruta) , en bebidas (cerve*a, vino) , en medios de cultivo microbianos a los que !an contaminado, etc. "or otra parte, su p varía entre D,- y y se ven favorecidos por cierto grado de !umedad. on las c%lulas #venes quienes desarrollan la mayoría de la actividad metab#lica del !ongo, liberando en*imas al medio y absorbiendo los nutrientes. 4a *ona central, por otra parte, tiene c%lulas en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio colonice nuevas *onas.
1.-
Mecani"$o" de reprod#cci*n
Muc!os !ongos tienen la posibilidad de reproducirse se+ualmente y todos ellos lo !acen mediante esporas ase+uales.
Reprod#cci*n "e?#al@
4os que la poseen se denominan !ongos perfectos. ;o suele ser un tipo de reproducci#n frecuente en los !ongos que producen patologías al !ombre. 7iene lugar cuando el medio es deficiente e n materias nutritivas. Entonces el microorganismo se defiende formando c%lulas especiales muy resistentes (esporas). 4a producci#n de esporas se reali*a por la fusi#n de dos n$cleos !aploides gen%ticamente diferentes. 2sí se forma una c%lula diploide llamada *igoto que tras divisi#n mei#tica origina D c%lulas !aploides las cuales se rodean de una cubierta formando las esporas. E+isten varios tipos de esporas se+uales:
Jio"pora"@ e producen por la fusi#n de dos gametos similares que se encuentran en el e+tremo de las !ifas.
Oo"pora"@ e forman por la uni#n de dos gametos desiguales en cuanto a tamaño.
A"co"pora"@ e producen por la uni#n de dos !ifas, desapareciendo la pared celular que las separa. "osteriormente ocurre la fecundaci#n, originando de D a esporas dentro de un saco denominado asco.
Ba"idio"pora"@ e forman por la fusi#n de dos n$cleos de una !ifa. "osteriormente los D n$cleos !aploides se dirigen !acia fuera y se rodean de citoplasma dando lugar a las basidiosporas.
Reprod#cci*n a"e?#al@ 4os que s#lo poseen reproducci#n ase+ual se denominan !ongos imperfectos. 7iene lugar cuando el medio es rico en sustancias nutritivas. E+isten varios tipos de reproducci#n ase+ual:
/or e$aci*n. En este tipo de reproducci#n la c%lula !ia se origina a partir de una yema de la c%lula madre. "rimero, la c%lula madre emite una yema al mismo tiempo que divide su n$cleo por estrangulaci#n. 4a yema aumenta de tamaño y se provee de los elementos constituyentes de la c%lula madre y finalmente se estrangula y se separa de la c%lula madre dando lugar a la c%lula !ia o blastosporo. Este proceso es característico en levaduras del g%nero acc!aromyces. "or bipartici#n. &uando una c%lula est3 en condiciones de reporducirse, comien*a por dividir su n$cleo en dos n$cleos !ios, cada uno de los cuales se rodea de una porci#n de protoplasma. 4uego aparece un tabique por el ecuador de la c%lula, separ3ndola en dos c%lulas !ias. Este proceso es característico en las levaduras del g%nero c!i*osacc!aromyces.
/or e"por#laci*n. e forman esporas que germinan posteriormente.i se desarrollan directamente de la c%lula vegetativa se denominan talosporas. E+isten tres tipos: 2rtrosporas: aparecen por segmentaci#n de las !ifas. 6lastosporas: se forman por gemaci#n, sin separaci#n entre ellas, originando las pseudo!ifas y pseudomicelios. &lamidosporas: son esporas grandes rodeadas de una pared gruesa.
ay otras esporas ase+uales que se originan de estructuras especiali*adas: Esporangiosporas: se forman dentro de estructuras saculares que se encuentran en los e+tremos de las !ifas no tabicadas. &onidias: se originan a partir de !ifas por un mecanismo de gemaci#n, separ3ndose posteriormente de ellas. 2leurispora: similares a las anteriores pero se separan por ruptura del septo.
Reprod#cci*n para"e?#al@
Es una forma de reproducci#n muy rara, que consiste en la uni#n de una o varias !ifas pero sin e+istir fusi#n nuclear, dando unas estructuras con n$cleos !aploides.
Utilidade" de lo" ono" 4os !ongos tienen muc!as utilidades. Entre ellas tenemos:
Ali$entaci*n@
ay muc!os !ongos comestibles pero tambi%n !ay muc!os venenosos. e los comestibles muc!os se cultivan como el c!ampiñ#n, la trufa o el níscalo. "ero la seta que m3s destaca por su e+quisito sabor es la 2manita caesarea, que fue conside rada como el manar de los c%sares. "ero a la !ora de su recolecci#n !ay que tener muc!o cuidado y saber distinguirla y determinarla bien ya que se parece muc!o a otra seta tambi%n del g%nero 2manita que es sumamente peligrosa, llegando a ser mortal. 7ambi%n !ay que destacar el uso de las levaduras para reali*ar la fermentaci#n alco!#lica en la producci#n del vino, la sidra y la cerve*a. 8tros !ongos son utili*ados para reali*ar la fermentaci#n l3ctica que da lugar a la producci#n de quesos y yogures, y otros son utili*ados para la fabricaci#n del pan.
Medicina@
En el campo de la medicina cabe destacar la utilidad de !ongos como el "enicillum del que se obtiene la penicilina.
In&e"tiaci*n@
Lo" ono" "e #tili>an $#co en la in&e"tiaci*n en'tica y bio)#!$ica. 2"to "e debe a la" caracter!"tica" )#e pre"entan ya )#e "on "ere" &i&o" $#y "encillo" )#e ade$" "e p#eden c#lti&ar en rande" cantidade" nece"itando para ello poco" re)#eri$iento".
2col*ica@
4os !ongos al descomponer la materia org3nica act$an contribuyendo al reciclado de la materia en el ecosistema. 7ambi%n contribuyen al mantenimiento de otros organismos como bacterias y proto*oos del suelo. 2 su ve*, tambi%n pueden alterar los ecosistemas la causar graves enfermedades en plantas y en animales.
I!7%*$#'i s#i$*i & !4i"#$l. ono" $edicinale"@ El !ombre utili*a algunas especies de !ongos en la fabricaci#n de productos farmac%uticos y en la industria. Entre los !ongos de uso medicinal se encuentran el "enicillum notatun, del cual se e+trae la penicilina que es un antibi#tico, el &laviceps purpurea, produce una sustancia llamada ergotina, que se utili*a para controlar las !emorragias, de este !ongo tambi%n se e+trae el 3cido lis%rgico, que es una droga que se conoce como 4... ono" &eneno"o"@ En la naturale*a, s#lo ciertas variedades de !ongos son comestibles, el resto son t#+icos por ingesti#n pudiendo causar severos daños e incluso la muerte. Especies como la 2manita p!alloides, &ortinarius orellanus, 2manita muscaria, &!lorop!yllum molybdites,
Unida .H ;ir#" y part!c#la" "#b&ira"ica". 4a irología !a sido la ciencia microbiol#gica de origen m3s tardío, !abiendo surgido como resultado del !alla*go de enfermedades infecciosas en las que la demostraci#n de implicaci#n de microorganismos se demostraba esquiva con los medios !abituales disponibles a finales del siglo ''. 4a euforia que se vivía en los 3mbitos científicos y m%dicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias pat#genas, se plasm# en el preuicio de que la incapacidad de !acer crecer los agentes causantes de ciertas enfermedades se debía a una t%cnica inapropida o mal aplicada. El bot3nico ruso imitri OanovsGi !abía observado (1?=) que la enfermedad del mosaico del tabaco podía ser reproducida e+perimentalmente usando el fluido que atravesaba los filtros de
porcelana que normalmente retenían a las bacterias, pero siendo incapa* de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandon# la investigaci#n. "ocos años m3s tarde (1?), y probablemente sin tener noticias del trabao de OanovsGi, 6eierinG reali*# e+perimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrent3ndose a los conceptos de la %poca, avan*# la idea de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, seg$n su e+presi#n), debía de incorporarse al protoplasma vivo del !ospedador para lograr su reproducci#n. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en principio /virus filtrables0, quedando m3s tarde su denominaci#n simplemente como virus. 2quel mismo año de 1? 4oeffler y Jrosc! descubren los virus animales al comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1?1 eed descubre el primer virus !umano, el de la fiebre amarilla, y en 1?? 4andsteiner y "ope detectan el de la poliomielitis. 2 comien*os de siglo &opeman desarrolla su t%cnica de multiplicaci#n de virus animales en embriones de pollo, con la que ". ous aisla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1?11). 4os virus bacterianos fueron descubiertos en 1?1- por J.L. 7Oort, si bien su trabao no alcan*# la elegancia y claridad del desarrollado poco m3s tarde por el canadiense J%li+ d%relle (1?1A)> fue %ste quien acuñ# el t%rmino bacteri#fago, y supuso correctamente que el fen#meno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre las bacterias. 2unque su esperan*a en la aplicaci#n de los fagos como elementos bactericidas para uso m%dico no pudo satisfacerse, la contribuci#n de los virus bacterianos al avance de la gen%tica y biología moleculares !a sido decisiva: de !ec!o, los primeros estudios cuantitativos sobre replicaci#n vir3sica se reali*aron sobre fagos de Esc!eric!ia coli, lo que suministr# modelos aplicables a otros virus, incluidos los de animales. En 1?=- 6ordet y 6al describen por primera ve* el fen#meno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos lítico y lisog%nico de los fagos no fueron aclaradas !asta los estudios de 2ndr% 4Ooff (1?-). 4a primera visuali*aci#n de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del bacteri#logo ingl%s 6arnard (1?=-), y en 1?B? se reali*a la primera fotografía de un virus a microscopio electr#nico. "ero los avances m3s significativos en el estudio de la composici#n y estructura de los virus se inician con la purificaci#n y cristali*aci#n, por Lendell M. tanley, del virus del mosaico del tabaco C7MC (1?B-), aplicando procedimientos típicos de la cristali*aci#n de en*imas. nicialmente tanley comprob# que el 7M contenía gran proporci#n de proteína, pero poco m3s tarde detecta, adem3s, la presencia de 3cido nucleico. 2 partir de aquí, la irología entra en una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y genetistas, en un esfuer*o interdisciplinar que da origen a la moderna 6iología Molecular. Qn importante avance metodol#gico para el estudio de los virus animales se debi# a Enders, Leller y obbins (1?D?), al desarrollar por primera ve* un m%todo para la multiplicaci#n vir3sica sobre cultivos de teidos de mamíferos, t%cnica que fue perfeccionada m3s tarde por el equipo de enato ulbecco. 4os recientes progresos en las numerosas t%cnicas de biología molecular !an propiciado una aut%ntica e+plosi#n de descubrimientos sobre la biología de los virus y de sus c%lulas !ospedadoras> baste citar la replicaci#n del genomio de 2; de los retrovirus por reversotranscripci#n a 2;, los fen#menos de transformaci#n oncog%nica vir3sica y su aplicaci#n a los estudios generales del c3ncer, el diseño de vacunas recombinantes por manipulaci#n in vitro de genomios vir3sicos, la pr#+ima aplicaci#n clínica de la primeras terapias g%nicas en !umanos recurriendo a vectores vir3sicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología e+istente !a permitido la r3pida identificaci#n y caracteri*aci#n del virus de la inmunodeficiencia !umana, lo que se est3 traduciendo en una intensa y racional b$squeda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de 2. En años recientes !an sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas, subvir3sicas: 7.8. iener describi# en 1?@A la e+istencia de 2; desnudos infectivos en plantas, a los que llam# viroides, y en 1?1 "rusiner puso de manifiesto que determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas aparentemente desprovistas de material gen%tico, a las que bauti*# como priones. 8tro tipo de obetos de estudio de la microbiología son las entidades no celulares, que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biol#gica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia.
4os virus son entidades no celulares de muy pequeño tamaño (normalmente inferior al del m3s pequeño procariota), por lo que debe de recurrirse al microscopio electr#nico para su visuali*aci#n. on agentes infectivos de naturale*a obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporaci#n al protoplasma vivo para que su material gen%tico sea replicado por medio de su asociaci#n m3s o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una c%lula a otra. &ada tipo de virus consta de una sola clase de 3cido nucleico (2; o 2;, nunca ambos), con capacidad para codificar varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones en*im3ticas, mientras que otras son estructurales, disponi%ndose %stas en cada partícula vir3sica (viri#n) alrededor del material gen%tico formando una estructura regular (c3psida)> en algunos virus e+iste, adem3s, una envuelta e+terna de tipo membranoso, derivada en parte de la c%lula en la que se desarroll# el viri#n (bicapa lipídica procedente de membranas celulares) y en parte de origen vir3sico (proteínas). En su estado e+tracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicaci#n de su 3cido nucleico y de obtenci#n de energía. Esto les obliga a un modo de vida (sic) parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el viri#n pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material gen%tico, que al superponer su informaci#n a la de la c%lula !ospedadora, logra ser e+presado y replicado, produci%ndose eventualmente la formaci#n de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo. 4os viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvir3sicas, descubiertas en 1?@A por 7.8. iener en plantas. Est3n constituidos e+clusivamente por una pequeña mol%cula circular de 2; de una sola !ebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un e+tenso, pero no total, empareamiento intracatenario de bases por *onas de !omología interna. &arecen de capacidad codificadora y muestran cierta semean*a con los intrones autocatalíticos de clase , por lo que podrían representar secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. e desconocen detalles de su modo de multiplicaci#n, aunque algunos se locali*an en el nucleoplasma, e+istiendo pruebas de la implicaci#n de la 2; polimerasa en su replicaci#n, por un modelo de círculo rodante que genera concat%meros lineares. Esta replicaci#n parece requerir secuencias conservadas !acia la porci#n central del viroide. 4os viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patol#gicas. El mecanismo de patogenia no est3 aclarado, pero se sabe que muc!os de ellos se asocian con el nucleolo, donde qui*3 podrían interferir> sin embargo, no e+isten indicios de que alteren la e+presi#n g%nica (una de las !ip#tesis sugeridas)> cada mol%cula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia. En 1?@ se descubri# que el agente de la !epatitis delta !umana posee un genomio de 2; de tipo viroide, aunque requiere para su transmisi#n (pero no para su replicaci#n) la colaboraci#n del virus de la !epatitis 6, empaquet3ndose en partículas similares a las de este virus. 2 diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad codificadora de algunas proteínas. 4os 2;s sat%lites son pequeñas mol%culas de tamaño similar al de los viroides de plantas (BBCD bases), que son empaquetados en c3psidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no muestran !omologías). e replican s#lo en presencia del virus colaborador específico, modificando (aumentando o disminuyendo) los efectos pat#genos de %ste. 4os virusoides constituyen un grupo de 2;s sat%lites no infectivos, presentes en el interior de la c3psida de ciertos virus, con semean*as estructurales con los viroides, replic3ndose e+clusivamente unto a su virus colaborador. 4os priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por tanley "rusiner en 1?1, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos (por eemplo, el /scrapie0 o prurito de oveas y cabras), incluyendo los !umanos (Guru, síndrome de
distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosac3ridos que adquieren por procesamiento postCtraduccional. 2 diferencia de los virus, los priones no contienen 3cido nucleico y est3n codificados por un gen celular. 2unque se multiplican, los priones de nueva síntesis poseen mol%culas de "r" que reflean el gen del !ospedador y no necesariamente la secuencia de la mol%cula del "r" que caus# la infecci#n previa. e desconoce su mecanismo de multiplicaci#n, y para discernir entre las diversas !ip#tesis propuestas qui*3 !aya que dilucidar la funci#n del producto normal y su posible conversi#n a la isoforma pat#gena infectiva. ecientemente se !a comprobado que, al menos algunas de las enfermedades por priones son simult3neamente infectivas y gen%ticas, una situaci#n ins#lita en la "atología !umana, !abi%ndose demostrado una relaci#n entre un alelo dominante del "r" y la enfermedad de &reut*feldtCIaGob. El gen del pri#n ("rnCp) est3 ligado gen%ticamente a un gen autos#mico ("rnCi) que condiciona en parte los largos tiempos de incubaci#n !asta el desarrollo del síndrome.
Cp"ide" 4a c3pside es una cubierta proteica e+terna que encierra y protege al genoma viral de la acci#n de nucleasas y otros factores adversos del medio e+terior. 2dem3s, en los virus desnudos carentes de envoltura, la c3pside es la encargada de establecer a trav%s de alguna de sus proteínas la uni#n con la c%lula que ser3 parasitada por el virus. 2simismo, las proteínas de la c3pside contienen los determinantes antig%nicos contra los que el sistema inmune del !u%sped elaborar3 la respuesta de anticuerpos en defensa del organismo. ay dos tipos b3sicos de estructura que pueden presentar las c3psides virales: simetríaicosaédrica , observ3ndose el viri#n al microscopio de forma apro+imadamente esf%rica, osimetría helicoidal , resultando nucleoc3psides filamentosas tubulares pero que pueden estar encerradas dentro de una envoltura que confiere a la partícula forma esf%rica o de bast#n.
imetría icosa%drica: El icosaedro es un poliedro de = caras triangulares equil3teras con 1= v%rtices. "resenta simetría rotacional -.B.=, por lo que tiene @ ees de simetría quíntuple que pasan a trav%s de pares de v%rtices opuestos> 1 ees de simetría triple que pasan a trav%s del centro de las caras, y 1- ees de simetría binaria, a trav%s de los puntos medios de las aristas.
2n&olt#ra" 4a envoltura de un virus es una membrana constituida por una doble capa lipídica asociada a glicoproteínas que pueden proyectarse en forma de espículas desde la superficie de la partícula viral !acia el e+terior. 4os virus adquieren su estructura mediante un proceso de brotaci#n a trav%s de alguna membrana celular. El n$mero de glicoproteínas que presentan los virus animales es muy variable. 4as glicoproteínas virales que forman las espículas son proteínas integrales de membrana que atraviesan la bicapa de lípidos presentando tres dominios topol#gicamente diferenciables: 1) un gran dominio !idrofílico !acia el e+terior de la membrana> =) un pequeño dominio !idrof#bico formado por =C=A amino3cidos que atraviesa la capa lipídica y ancla la glicoproteína a la membrana> B) un pequeño dominio !idrofílico !acia el interior de la partícula viral. Este $ltimo dominio interact$a con las proteínas de la nucleoc3pside, ya sea directamente o a trav%s de una proteína viral no glicosilada denominada M (de matri*), que se encuentra en algunos virus animales por debao de la bicapa. 4as glicoproteínas virales cumplen diversas funciones biol#gicas durante el ciclo de vida de un virus, siendo esenciales para la infectividad, ya que act$an: 1) en la adsorci#n a la c%lula !u%sped> =) en el proceso de fusi#n que permite la entrada de la nucleoc3pside viral al citoplasma> B) en la brotaci#n, que permite la salida del virus envuelto a partir de la c%lula infectada. 2dem3s las glicoproteínas son el blanco de reacci#n para el sistema inmune tanto en la respuesta !umoral como celular.
:cido" n#cleico" &irale"
4os virus se caracteri*an, a diferencia de los otros organismos, por presentar una $nica especie de 3cido nucleico constitutiva que puede ser 2; o 2;, monocatenario o bicatenario con estructura de doble !%lice.
Tipo" de ADN &irale" 4a mayoría de los virus 2; presentan un genoma bicatenario, con e+cepci#n de los parvovirus, constituidos por 2; monocatenario. 2dem3s las mol%culas de 2; viral pueden ser lineales o circulares. 4a conformaci#n circular que presentan los "apovaviridae y epadnaviridae, confiere una serie de ventaas al 3cido nucleico respecto de la estructura lineal, otorg3ndole protecci#n frente al ataque de e+onucleasas, facilitando la replicaci#n completa de la mol%cula y su posible integraci#n al 2; celular. En el caso de los papovavirus, el 2; puede presentar tres conformaciones: la forma corresponde a la mol%cula circular covalentemente cerrada y superenrollada sobre sí misma. i se produce una ruptura en una uni#n en una de las cadenas, la doble !%lice se desenrolla y resulta una mol%cula circular relaada (forma ). "or $ltimo, la forma es el resultado de una ruptura en la otra cadena que origina una mol%cula bicatenaria lineal. El 2; circular de los !epadnavirus tiene una estructura muy peculiar y de características $nicas dentro de los 2; virales: una de las cadenas (, corta) es incompleta, de manera que el 1-C-W de la mol%cula es monocatenaria> la otra cadena (4, larga) presenta ruptura en un $nico punto de la mol%cula y adem3s tiene una proteína unida covalentemente en el e+tremo -.
Tipo" de ARN &irale" 4os 2; de los virus animales son en su gran mayoría de cadena simple, siendo eoviridae y 6irnaviridae las $nicas familias que presentan como genoma 2; bicatenario. En algunos grupos de virus, el 2; gen#mico est3 segmentado en varios fragmentos, cuyo n$mero es característico de cada familia. 2dem3s de las características físicas y químicas mencionadas, la polaridad o sentido de la cadena de 2; es una propiedad fundamental utili*ada para definir los distintos tipos de 2; viral. e parte de definir como polaridad positiva la secuencia de bases correspondiente al 2;m y polaridad negativa a la secuencia complementaria a la del 2;m. Qn virus es de cadena positiva cuando su 2; gen#mico tiene la polaridad que le permite actuar como 2;m, o sea ser traducido en proteínas, inmediatamente despu%s de !aber entrado a la c%lula. "or el contrario, en los virus de polaridad negativa el 2; gen#mico tiene la secuencia complementaria al 2;m viral> por lo tanto, cuando se produce la infecci#n y el 2; viral entra en la c%lula debe sinteti*ar la cadena complementaria que ser3 el 2;m. "ara ello, los virus de polaridad negativa llevan en el viri#n asociada a su genoma una 2; polimerasa dependiente de 2;, en*ima denominada transcriptasa, que efect$a la transcripci#n del 2; mensaero a partir del 2; gen#mico.
2"trateia" de replicaci*n de lo" &ir#" 7odos los virus, sin importar cu3l sea su genoma, resultan por diferentes mecanismos de transcripci#n en la producci#n a nivel intracelular en la formaci#n de m;2 para la traducci#n final a proteínas virales (figura 1.D). 4os virus requieren de un sustrato de c%lulas vivas para su multiplicaci#n, dado que son par3sitos intracelulares obligados. "ara que un virus se replique, debe infectar una c%lula o individuo susceptible> recordemos que cada virus posee un rango estrec!o de c%lulas a las que puede infectar y que la susceptibilidad se refiere a la condici#n que tiene una especie, individuo o c%lula para infectarse con un agente determinado. 7ambi%n se debe tener en cuenta que la infecci#n de una c%lula susceptible no garanti*a que la replicaci#n viral se lleve a cabo, como tampoco el !ec!o de que un individuo se infecte, garanti*a que %ste sufra la enfermedad.
Ciclo l!tico e denomina así porque la c%lula infectada muere por rotura al liberarse las nuevas copias virales. &onsta de las siguientes fases: •
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Jase de adsorci#n o fiaci#n: El virus se une a la c%lula !ospedadora de forma estable. 4a uni#n es específica ya que el virus reconoce compleos moleculares de tipo proteico, lipoproteico o glucoproteico, presentes en las membranas celulares. Jase de penetraci#n o inyecci#n: el 3cido nucleico viral entra en la c%lula mediante una perforaci#n que el virus reali*a en la pared bacteriana. Jase de eclipse: en esta fase no se observan copias del virus en la c%lula, pero se est3 produciendo la síntesis de 2;, necesario para generar las copias de proteínas de la c3psida. 7ambi%n se produce la continua formaci#n de 3cidos nucleicos virales y en*imas destructoras del 2; bacteriano. Jase de ensamblae: en esta fase se produce la uni#n de los caps#meros para formar la c3psida y el empaquetamiento del 3cido nucleico viral dentro de ella. Jase de lisis o ruptura: conlleva la muerte celular. 4os viriones salen de la c%lula, mediante la rotura en*im3tica de la pared bacteriana. Estos nuevos virus se encuentran en situaci#n de infectar una nueva c%lula.
Ciclo li"o'nico 4as dos primeras fases de este ciclo son iguales a las descritas en el ciclo anterior. En la fase de eclipse el 3cido nucleico viral en forma de 2; bicatenario recombina con el 2; bacteriano, introduci%ndose en %ste como un gen m3s. Esta forma viral se denomina profago, o virus atenuado, mientras que la c%lula infectada se denomina c%lula lisog%nica. En este estado el profago puede mantenerse durante un tiempo indeterminado, pudiendo incluso, reproducirse la c%lula, generando nuevas c%lulas !ias lisog%nicas. El profago se mantendr3 latente !asta producirse un cambio en el medio ambiente celular que provoque un cambio celular, por eemplo, por variaciones bruscas de temperatura, o desecaci#n, o disminuci#n en la concentraci#n de o+ígeno. Este cambio induce a la liberaci#n del profago, transform3ndose en un virus activo que contin$a el ciclo de infecci#n !asta producir la muerte celular y la liberaci#n de nuevos virus.
M"$%)%l%+ 7* "l "s$3)i% )" l%s 8i*3s. 4os m%todos utili*ados para reconocer las infecciones por virus !umanos pueden clasificarse en E&78 e ;E&78, seg$n persigan demostrar la presencia del virus o de alguno
de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del !u%sped en el curso de la infecci#n.
Ai"la$iento ;iral H C#lti&o" Cel#lare" 4a base del diagn#stico viral es la detecci#n del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la t%cnica standard de oro sobre la cual se medían todas las otras pruebas de diagn#stico viral, pero !oy en día con el desarrollo de las nuevas t%cnicas de 6iología Molecular ya no es la m3s sensible. e igual forma el aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. ebido a que s#lo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. in embargo, e+isten algunas desventaas en el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda días a semanas para la identificaci#n, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atenci#n del paciente. 2dem3s, es un proceso laborioso y caro. "or otra parte requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por eemplo, se necesitan varias líneas celulares para la detecci#n #ptima de virus. 4os cultivos celulares son, pues, los biosubstratos m3s corrientemente empleados para la propagaci#n de los virus. Qn cultivo celular es obtenido, de e+plantes de #rganos o de embriones de animales. Estas c%lulas obtenidas as%pticamente se disocian trat3ndolas con una en*ima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. 4a suspenci#n de celulas libres así obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o pl3stico en donde las c%lulas se ad!ieren y multiplican formando una fina capa de c%lulas que se llama M8;8&2"2 &E4Q42. Esta monocapa de c%lulas crece en un medio de cultivo compleo que contiene alb$mina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. e previene la contaminaci#n bacteriana adicion3ndole a los medios antibi#ticos adecuados. 4os cultivos celulares en monocapa son los m3s usados, aunque !ay otros sistemas (cultivos en suspensi#n, e+plantos, cultivos de #rganos, cultivos en microcarriers, etc.). 4os cultivos celulares se dividen en:
C#lti&o" /ri$ario": e obtienen a partir de c%lulas, teidos u #rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.
L!nea" Cel#lare" Diploide"@ on aquellas que crecen en pasaes sucesivos !asta apro+imadamente - subcultivos y que conservan por lo menos en un A-W el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. L!nea" Cel#lare" Contin#a"@ "ermite un n$mero finito de subcultivos y son !eteroploides. "ara considerar que se !a logrado establecer una línea continua, esta debe de !aber sido subcultivada por lo menos A veces. 4as líneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventaas: •
• •
isponibilidad para todos los investigadores de stocGs de c%lulas id%nticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Jacilidad relativa del pasae y mantenimiento en todos los laboratorios. 4ibre de contaminaci#n con agentes e+traños.
4os distintos cultivos celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que e+iste una relaci#n específica !u%spedCvirus, y es en funci#n de los datos clínicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para inocular el material. 4uego de inoculado el cultivo celular, se incuba a B-CBA[ & por un período de !asta 1D días promedio, esperando la aparici#n de efecto citop3tico, to+icidad o degeneraci#n celular, observando el cultivo al microscopio a las =D, D, A=!s y luego = veces por semana. e usan cultivos celulares no inoculados para control y comparaci#n con cualquier cambio morfol#gico observado en los cultivos inoculados. El efecto citop3tico es la visuali*aci#n de cambios morfol#gicos m3s o menos característicos en las c%lulas inoculadas producidas por la acci#n del virus sobre el cultivo celular. &uando los virus no producen efecto citop3tico, se puede recurrir a t%cnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. 4as m3s usadas son: !emadsorci#n, !emaglutinaci#n y tinciones con anticuerpos m onoclonales. (er =)
e$ad"orci*n@ ay virus que durante su multiplicaci#n intracelular, e+presan en la membrana de la c%lula !u%sped elementos estructurales virales llamados !emaglutininas, glicoproteínas capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de gl#bulos roos de diferentes especies animales. e modo que si se agregan gl#bulos roos a un cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infecci#n de esas c%lulas a trav%s de la uni#n de los gl#bulos roos a la superficie celular. e$al#tinaci*n@ 4as !emaglutininas pueden ponerse en evidencia en el sobrenadante de los cultivos utili*ando el mismo fundamento que para la !emadsorci#n.
Detecci*n de Ant!eno" H T'cnica" In$#nol*ica" 4as siguientes t%cnicas inmunol#gicas pueden utili*arse tanto para la detecci#n de antígenos (m%todos directos), como de anticuerpos (m%todos indirectos). En el caso de detecci#n de antígenos, se utili*a un anticuerpo específico antiviral (por lo general g<) a cuya fracci#n Jc se !a conugado una mol%cula marcada, que puede ser isotiocianato de fluoresceína (nmunofluorecencia), un is#topo radioactivo 1=- o 1B1 (2), o una en*ima: pero+idasa, fosfatasa alcalina, o biotinaCavidina (E2), para obetivar la reacci#n. "ara el procedimiento indirecto (detecci#n de anticuerpos), se emplea un antiCanticuerpo marcado y la reacci#n se reali*a sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio.
INMUNO=LUOR28C2NCIA DIR2CTA 0ID Es una de las t%cnicas m3s antiguas y de uso m3s difundido en el laboratorio clínico. El principio b3sico de la inmunofluorescencia directa . Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobetos donde se dean secar y fiar. 4uego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a trav%s de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las c%lulas. 4a reacci#n antígeno anticuerpo se visuali*a con el microscopio de fluorescencia, por la aparici#n de fluorescencia de color verde man*ana.
Esta t%cnica se puede utili*ar para una identificaci#n r3pida del virus directamente sobre la muestra (por eemplo: c%lulas eluidas de un lavado nasal, o de un !isopado nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmaci#n del efecto citop3tico observado en cultivos celulares. in embargo la reali*aci#n de la reacci#n es laboriosa, depende muc!o de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con e+periencia para llegar a un diagn#stico certero, así como una recolecci#n y preparaci#n de la muestra adecuada. 2un así, el m%todo, en manos de una persona con e+periencia resulta $til para la identificaci#n r3pida de ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagn#stico etiol#gico en el curso de una ornada de trabao. 2dem3s puede estudiar varias muestras simult3neamente. El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, !a incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Esta t%cnica requiere s#lo =CD!s, y se !a reportado una sensibilidad del AC W comparada con cultivos celulares para la identificaci#n de virus erpes imple, C?-W para y A1W para nfluen*a 2. 4a tinci#n con inmunopero+idasa es similar a la de la inmunofluorescencia y es la t%cnica de elecci#n en algunos laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el anticuerpo monoclonal est3 marcado con una en*ima que requiere la adici#n de un substrato para evidenciar la reacci#n por un cambio de color que es visible micro y macrosc#picamente.
T28T D2 AGLUTINACION El test de aglutinaci#n es un m%todo simple, de un solo paso, que a veces se usa para la detecci#n de antígenos virales en muestras clínicas. 4os ensayos de aglutinaci#n, dependen de la fiaci#n inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de l3te+. 4uego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentae de reacciones inespecíficas. El test de aglutinaci#n !a sido usado para detectar antígeno de otavirus en !eces (el m3s importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el E2 para otavirus. 2dem3s es una t%cnica r3pida y barata. 7ambi%n se la !a usado para detectar antígenos de 2denovirus.
RADIOINMUNO2N8A9O 0RIA Jue originalmente aplicado para identificar el antígeno de superficie de la epatitis 6 (6s2g) y el anticuerpo antiC6s2g. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad, pero la aparici#n de un m%todo como el ensayo inmunoen*im3tico (E2) con su mayor tiempo de conservaci#n de los reactivos, su costo relativamente m3s bao y la ausencia de residuos radioactivos, !a reempla*ado las t%cnicas de 2 en la mayor parte de los casos de detecci#n de antígeno viral.
2NJIMOINMUNOANALI8I8 02IA 4os E2 para la detecci#n de antígeno se basan !abitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase s#lida, en general el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de pl3stico. El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fiado a la fase s#lida y el antígeno viral se detecta mediante la adici#n de otro anticuerpo específico conugado a una en*ima. 4a en*ima conugada suele ser pero+idasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas en*imas varía. En la reacci#n con la pero+idasa el substrato es un per#+ido capa* de o+idar un compuesto químico incoloro que en su forma o+idada tiene un color característico. En el caso de la fosfatasa la desfosforili*aci#n es la responsable directa de la aparici#n del color. "or esta t%cnica se puede procesar gran n$mero de muestras en forma r3pida y automati*ada, no requiriendo de un observador e+perimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofot#metros especialmente diseñados, siendo entonces una t%cnica m3s obetiva
Cla"i(icaci*n de &ir#"
4os virus se clasifican en base a su morfología, composici#n química y modo de replicaci#n. 4os virus que infectan a !umanos frecuentemente se agrupan en =1 familias, refleando s#lo una pequeña parte del espectro de la multitud de diferentes virus cuyo rango de !u%spedes van desde los vertebrados a los proto*oos y desde las plantas y !ongos a las bacterias.
No$enclat#ra El nombre de los virus obedece a distintas consideraciones. 2lgunas veces se debe a la enfermedad que ellos producen, por eemplo el virus polio se llama así porque produce la poliomielitis. 7ambi%n puede deberse al nombre de los descubridores como el virus del EpsteinC 6arr, o a características estructurales de los mismos como los coronavirus. 2lgunos poseen un nombre derivado del lugar donde se los !all# por primera ve*, tal es el caso del virus &o+sacGie o ;orOalG. El &7 (nternational &ommittee on ta+onomy of viruses) !a propuesto un sistema universal de clasificaci#n viral. El sistema utili*a una serie de ta+ones como se indica a continuaci#n:
Orden 0H&irale" =a$ilia 0H&iridae 8#b(a$ilia 0H&irinae G'nero 0H&ir#" 2"pecie 0
VIRUS ADN ;!ili
G<#"*%
E="!7l%
C%!"#$*i%
H"*7"s8i*i)"
Al7>>"*7"s -8i*i#"
Her!es si!le% vir"s ty!e 1 (aka HHV-1)
+nce$alitis' estoatitis ag"da' llaga labial del res$ríado.
Her!es si!le% vir"s ti!o 9 (aka
Her!es genital' ence$alitis
HHV-2)
3)
G!!>"*7 "s-8i*i#"
+!stein Barr vir"s (aka HHV)
Monon"cleosis 4e!atitis' t"ores >B' N5#?
arcoa de Fa!osi' asociado al 4er!esvir"s' FH< (aka Human her!es"irus #)
B"$>"*7"s8i*i#"
#ytoegalovir" s H"ano (aka HHV-$)
5robableente& t"ores' inc. arcoa de Fa!osi >F? y alg"nos lin$oas de c)l"las B Monon"cleosis' 4e!atitis' !ne"onitis' cong)nitas
H"an 4er!esvir"s G
Ros)ola >aa +. s"bit"?' !ne"onitis
H"an 4er!esvir"s 7
Alg"nos casos de reseola
A)"#%8i*i)"
Ms$)"#%8i*3s
Adenovir"s H"ano
seroti!os >es!ecies?3 in$ecciones res!iratorias.
P7%88i*i)"
P7ill%!8i*3s
5a!illoavir"s H"ano
7J es!ecies3 verr"gas y t"ores
P%l&%!8i*3s
K#' BF vir"ses
"s"alente !oco graves3 K# ca"sa 5M en IDA
H"7)#8i*i) "
H"7)#8i*3s
He!atitis >cr/nica?' cirrosis' t"ores 4e!*ticos.
P%08i*i)"
O*$>%7%08i*3s
He!atitis B
vir"ela Money!o% vir"s +n$eredad coo la vir"ela' zoonosis "y rara >"n brote reciente en el #ongo3 9 cases desde 9LG 9L7?
P*8%8i*i)"
P*7%08i*3s
8r$ vir"s
esiones d)ricas >!ocs?
P*8%-8i*3s
B1 !arvovir"s
+%antea. In$ecciosa. >O en$eredad?' crisis a!l*stica' !)rdida $etal.
D"7"#)%8i*3s
Ptil !ara tera!ia g)nica3 se integra en el croosoa
VIRUS ARN ;!ili
G<#"*%
E="!7l%
C%!"#$*i%
Pi'%*#8i*i)"
E#$"*%8i*3s
5oliovir"ses
Q ti!os3 eningitis as)!tica' !olioielitis !aralítica
+c4ovir"ses
Q9 ti!os3 Ase!tic eningitis' ras4es
#o%sac4ievir"se 9 ty!es3 eningitis
s
as)!tica' io!ericarditis
He!atitis ag"da >!ro!agaci/n $ecaloral?
R>i#%8i*3s
H"an r4inovir"ses
11 ti!os3 Res$ríado co;n
Cli'i8i*3s
Noral vir"s
+n$eredad gastrointestinal.
H"7"8i*3s
He!atitis ag"da >!ro!agaci/n $ecaloral?
H"7$%8i*3s
Cli'i8i*i)"
P*!&0%8i*i) "
O*$>%!&0%8i*i )"
He!atitis +
P*!&0% -8i*3s
5arain0"enza vir"ses
ti!os3 Res$ríado co;n' bron("iolitis' ne"onía
R343l8i*3s
5a!eras& !arotitis' eningitis as)!tica >raro& or("itis' ence$alitis?
M%*4illi8i*3s
ara!i/n& 2ebre' e%antea >raro& ence$alitis' 5+?
P#"3!%8i*3s
Res$ríado co;n>ad"ltos?' bron("iolitis' ne"onia >ni:os?
I#?3"#8i*3s A
In0"enza vir"s A
6l"& 2ebre' ialgias' alestar general' tos' ne"onia
I#?3"#8i*3s B
In0"enza vir"s B
6l"& 2ebre' ialgias' alestar general' tos' ne"onia
R>4)%8i*i)"
L&ss8i*3s
Rabia& inc"baci/n larga y des!")s en$eredad del N# y "erte.
;il%8i*i)"
;il%-8i*3s
6iebre 4eorr*gica' "erte
+bola and Marb"rg
B%*#8i*i)"
B%*#8i*3s
Borna disease vir"s
No "y claro3 relacionado con en$eredades ti!o&ez("izo$renia ti!o&ez("izo$r enia en alg"nos aniales.
R"$*%8i*i)"
O#'%8i*i#"
H"an ,ly!4otro!ic vir"s ty!e-1
e"ceia de c)l"las , del ad"lto. >A,?' >A,?' !ara!aresia es!*stica tro!ical >,5?
S73!8i*i#"
H"an $oay vir"ses
No se conoce !atología
L"#$i8i*i#"
IDA' en$eredad del N#
R34i-8i*3s
+%antea3 al$oraciones cong)nitas.
Al7>8i*3s
,ransitida , ransitida !or os("itos'
T%+8i*i)"
;l8i8i*i)"
;l8i-8i*3s
H"7'i8i*3s
R"%8i*i)"
B3#&8i*i)"
e("ina >S++' +++' <++?
ence$alitis
Mos("ito-born3 $ever' 4e!atitis >yello $everT?
,ransitida , ransitida !or os("itos3 4eorr4agic 4eorr 4agic $ever
,ransitida , ransitida !or os("itos3 ence!4alitis
He!atitis >con $rec"encia& cr/nica?' c*ncer 4e!*tico
He!atitis #
R%$-8i*3s
Rotavir"ses H"ano
G ti!os3 Diarrea
C%l$i-8i*3s
,ransitido !or ,ransitido garra!atas3 2ebre
O*$>%*"%8i*3s
Reovir"ses H"anos
+n$eredad leve
H#$8i*3s
índroe 5"lonar !or Hantavir"s
5ro!agado !or roedores3 en$eredad !"lonar >!"ede ser letal' + brote de las es("inas?
Hantaan vir"s
5ro!agado !or roedores3 2ebre
4eorr*gica con 4eorr*gica síndroe renal.
P>l"4%8i*3s
I!7%*$#'i 7li') )" l%s 8i*3s & 7*$'3ls s348i*l"s os vir"s 4an re!resentado re!resentado 4ist/ricaente 4ist/ricaente "n !roblea !roblea "y grave !ara la sal"d de los 4"anos. Des!")s del reconociiento de estos agentes coo ca"santes de en$eredad' en$eredad' la virología 4a evol"cionado evol"cionado "y r*!ido' incl"so los vir"s $"eron de los !rieros odelos !ara el est"dio del $"ncionaiento del genoa' conociiento indis!ensable 4oy en día !ara el trabao de investigaci/n en ciencias biol/gicas. +n general' la !alabra vir"s inediataente re2ere a en$eredad' y no es !ara enos& en 11 "na !andeia de gri!e >in0"enza? ocasion/ la "erte de *s de QJ illon illones es de !erson !ersonas as alrede alrededo dorr del del "nd "ndo' o' !oste !osterio rior rent ente e este este vir"s vir"s 4a ocasionado e!ideias de enor intensidad !ero ig"alente teidas. +ntre 17 y 1G se estia ("e' s/lo en +stados Unidos' los vir"s de la in0"enza ocasionaron *s de 1J JJJ "ertes. a $aa de los vir"s es erecida en el caso del IDA !or ee!lo' act"alente "na de las ca"sas *s i!ortantes de ortalidad en el "ndo' o bien' en el caso de la vir"ela' ("e en el !asado !rovoc/ iles de "ertes. os casos *s recientes de en$er en$ered edad ades es altae altaent nte e contag contagios iosas as son son los 4eorr 4eorr*g *gico icoss y letale letaless 2lovir 2lovir"s "s >Marb"rg y Vbola? y' !or s"!"esto' el síndroe res!iratorio ag"do severo >AR' !or s"s siglas en ingl)s?. +n el ;lti ;ltio o c"art c"arto o del del siglo siglo WW' los vir"s vir"s cobrar cobraron on "na "na i!o i!orta rtanc ncia ia ) )dic dica a in"sitada !or la a!arici/n de en$eredades 4asta entonces desconocidas coo las anteriorente anteriorente encionadas' así coo el res"rgiiento res"rgiiento con ayor vir"lencia de en$eredades ya conocidas' coo el sara!i/n' el deng"e o la in0"enza. +n 1 4"bo "na gran e!ideia en +"ro!a ocasionada !or el vir"s de la in0"enza ("e ocasion/ la 4os!italizaci/n de iles de !ersonas y la "erte de varias decenas de ellas3 dos a:os antes' en Hong Fong se t"vieron ("e sacri2car casi diez illones de !ollos !or "na e!ideia de in0"enza aviar ("e ya aenazaba con e%!andirse a regio regiones nes vecina vecinas. s. D"ran D"rante te esta esta ;lti ;ltia a tabi) tabi)n n se regis registra traro ron n "ert "ertes es entre entre !ersonas ("e t"vieron contacto con los aniales in$ectados. +n los ;ltios a:os se detectaron alg"nos vir"s n"evos' coo el de Hendra y el de Ni!a4 >abos en Malasia' 1?' los c"ales inicialente ocasionaron !robleas en ganado e("ino y !orcino res!ectivaente. in ebargo' !ersonas ("e t"vieron contacto con los aniales en$eros tabi)n $"eron in$ectados' alg"nas de ellas incl"so "rieron. "rieron. +stos casos 4acen destacar la i!ortancia del est"dio de los vir"s ("e ("e in$ect in$ectan an ania aniales les'' no s/l s/lo o !or !or c"esti c"estion ones es ecol/g ecol/gica icass o coer coercia ciales les'' sino sino tabi)n !or s" in0"encia sobre la sal"d 4"ana. El surgimiento y resurgimiento de los virus se deben en parte a su relativo bao nivel de compleidad, por lo que pequeños cambios en su informaci#n gen%tica ocasionan grandes cambio cambioss en su estruct estructura ura y funcio funcionami namient ento o general general,, lo cual cual permit permite e evadir evadir la respues respuesta ta inmunol#gica de los organismos, variar sus comportamientos dentro de las c%lulas !ospederas y perder su sensibilidad a tratamientos comunes para esas enferC medades. Qn caso típico son los virus virus de la inmuno inmunodefi deficie cienci ncia a !umana !umana (causan (causantes tes de 2) 2) cuyos cuyos tratami tratamiento entoss son general generalment mente e limita limitados dos porque porque los virus virus que infect infectan an al pacien paciente te son sustanci sustancialm alment ente e diferentes de los que evolucionan en su organismo en un determinado intervalo de tiempo.
Esta variabilidad de los virus, sin embargo, aparte de causarnos los problemas mencionados, se convierte en una !erramienta muy $til en el estudio de la evoluci#n de los organismos en el nivel molecular. El estudio de la variabilidad de los virus !a producido conocimientos en el 3mbito de la evoluci#n, lo cual puede ser aplicado !asta cierto punto y en diferentes formas a la generalidad de la biología. 2ctualmente se considera a los virus no s#lo como causantes de enfermedades sino tambi%n como agentes muy importantes que colaboran en el mantenimiento del equilibrio ecol#gico. 4os virus, adem3s de producir la disminuci#n de poblaciones animales o vegetales en un determinado !3bitat, sirven como mediadores en el intercambio gen%tico entre individuos de una misma o de diferentes especies, cooperando en la variabilidad de los organismos que son susceptibles de ser infectados. Este fen#meno !a sido bastante estudiado en las bacterias que pueden ser infectadas por los virus denominados bacteri#fagos (o simplemente fagos) y de esta manera poder intercambiar informaci#n entre unas cepas bacterianas y otras, los fagos pueden contener informaci#n $til para que la c%lula bacteriana realice ciertas funciones que en otras condiciones no podría reali*ar. En los animales, de modo an3logo, los retrovirus y los adenovirus, entre otros, pueden introducir informaci#n nueva a la c%lula infectada y posteriormente llevarse informaci#n a una c%lula diferente logrando así una comunicaci#n gen%tica entre diferentes poblaciones celulares o individuos. e esta manera, algunas especies de virus revisten !oy una importancia clave en la medicina porque pueden servir como ve!ículo para introducir informaci#n a c%lulas con alg$n defecto gen%tico o adquirido que les permita alcan*ar un funcionamiento normal. Esta 3rea de la biomedicina es actualmente una de las m3s apoyadas ya que representa una esperan*a en la cura de enfermedades gen%ticas como la fibrosis quística y el c3ncer. Es imposible dear de ver a los virus como peligrosos agentes causales de enfermedad, pero a esto !ay que agregar, por una lado, que tambi%n contribuyen al mantenimiento del equilibrio ecol#gico y, por otro, que en pocos años pueden ser de gran utilidad en el tratamiento de muc!os problemas que aquean a los !umanos, incluyendo las enfermedades causadas por los virus mismos.
U#i)) 6.- C*"'i!i"#$% & 7*%7+'i(# )" !i'*%%*+#is!%s. 4a c%lula bacteriana es esencialmente una maquinaria de síntesis capa* de duplicarse a sí misma. El proceso de síntesis para el crecimiento bacteriano involucra unas = reacciones químicas de una amplia variedad. Qna ve* sinteti*ados los polímeros, el crecimiento contin$a con el ensamblae y formaci#n de nuevas estructuras celulares que finali*an con la divisi#n en dos c%lulas !ias. En una medio apropiada física y nutricionalmente, un cultivo se reproduce continuamente como c%lulas vegetativas, los nutrientes absorbidos y metaboli*ados permiten crecer al microorganismo. Creci$iento indi&id#al Es el incremento en el tamaño y peso y es usualmente un preludio a la divisi#n celular Creci$iento poblacional Es el incremento en el n$mero de c%lulas como una consecuencia del crecimiento y divisi#n celular Ta"a de creci$iento Es el cambio del n$mero de c%lulas o masa por unidad de tiempo Generaci*n ntervalo para la formaci#n de dos c%lulas provenientes de una. 7iempo de generaci#n 7iempo que tarda una poblaci#n en duplicarse. e puede definir tambi%n como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de divisi#n. Qn e+perimento de crecimiento !ipot%tico empe*ando con una simple c%lula, teniendo un tiempo de generaci#n de BK se presenta en la siguiente tabla:
=actore" e?terno" &ondiciones ambientales o culturales: p, 7S, 2O, 8=, &8= &ondiciones nutricionales: 7asa &\; 1:1, 1=:1 =actore" interno" &apacidad metab#lica
MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO e ide !or cabios s"cesivos en el n;ero de c)l"las o !or el !eso de la asa de las c)l"las. +%isten varios )todos !ara contar las c)l"las o estiar la asa de )stas.
A@ R"'3"#$% )" '
2@ C%#$"% )" 'siebra en !laca !or e%tensi/n?.e as"e ("e cada colonia s"rgi/ de "na si!le c)l"la' contando el n;ero de colonias "no !"ede calc"lar el n;ero de c)l"las viables en la "estra. M)todo de vaciado en !laca.-
B@ M")i) )" l !s '"l3l* +n "c4os est"dios es necesario deterinar el !eso de las c)l"las *s ("e el n;ero. 1@ P"s% s"'% e deterina el !eso seco o !eso 4;edo de "na alíc"ota de la !oblaci/n se!arada !or centri$"gaci/n. +l !eso seco es !or lo general el 9J-9 Y del !eso 4;edo.
9? T3*4i)i!"$* A trav)s de "n coloríetro o es!ectro$ot/etro idiendo la t"rbidez en "nidades de absorbancia. Debe !re!ararse c"rva est*ndar !ara cada organiso est"diado. CICLO DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL i analizaos el creciiento icrobiano en el tie!o' )ste describe "na tí!ica c"rva de creciiento ("e !"ede ser dividida en $ases disting"ibles. a c"rva de creciiento !"ede dividirse en diversas $ases& $ase lag' $ase e%!onencial' $ase estacionaria y $ase de "erte.
@ ;s" l+ % )" *"$*s% #"ando "na !oblaci/n icrobiana es inoc"lada en edio $resco' el creciiento generalente no !rinci!ia de inediato sino des!")s de "n cierto tie!o' llaado $ase lag ("e !"ede ser breve o largo' de!endiendo de las condiciones. i "n c"ltivo ("e crece e%!onencialente es inoc"lado al iso edio bao las isas condiciones de creciiento no se observa la $ase lag y el creciiento e%!onencial contin;a a la isa velocidad. in ebargo' si el in/c"lo se toa de "n c"ltivo vieo >$ase estacionaria? y se inoc"la en el iso edio' generalente se !resenta la $ase lag' a"n c"ando las c)l"las del in/c"lo est)n vivas. +sto se debe a ("e las c)l"las generalente agotan di$erentes coenzias esenciales " otros constit"yentes cel"lares y se re("iere de cierto tie!o !ara s" resíntesis. Un retraso tabi)n se !resenta c"ando el in/c"lo est* $orado !or c)l"las da:adas >!ero' no "ertas? !or trataientos con calor' radiaci/n o s"stancias ("íicas' debido al tie!o necesario !ara ("e las c)l"las !"edan re!arar dic4o da:o. ,abi)n se observa c"ando "na !oblaci/n se trans2ere de "n edio de c"ltivo rico a "no !obre. +sto s"cede debido a ("e !ara ("e contin;e el creciiento en "n edio de c"ltivo en !artic"lar' es necesario ("e las c)l"las tengan "n co!leento íntegro de enzias !ara la síntesis de los etabolitos esenciales ("e no est*n !resentes en dic4o edio. #"ando se les trans2ere a "n edio di$erente' se re("iere cierto tie!o !ara la síntesis de n"evas enzias +s "na $ase de !re!araci/n y ada!taci/n al edio' s" d"raci/n de!ende del edio de c"ltivo y el estado 2siol/gico de las c)l"las vivas 4@ ;s" "07%#"#'il +s "na consec"encia del 4ec4o de ("e cada c)l"la se divide !ara $orar dos c)l"las' cada "na de las c"ales tabi)n se divide !ara $orar dos c)l"las *s y así s"cesivaente. a ayor !arte de los organisos "nicel"lares crecen e%!onencialente. a velocidad de creciiento e%!onencial varía "c4o de "n organiso a otro. 5or ee!lo& alonella ty!4i crece "y r*!idaente en c"ltivo' con "n tie!o de generaci/n de 9J Z QJ [' Mycobacteri" t"berc"losis' crece "y lentaente' con s/lo "na o dos d"!licaciones !or día. as condiciones abientales' ,\' co!osici/n del edio de c"ltivo' a$ectan a la velocidad de creciiento e%!onencial así coo las características del icroorganiso.
+n general' las bacterias crecen con ayor ra!idez ("e los organisos e"cariotas y los e"cariotas !e("e:os se desarrollan *s a!risa ("e los grandes #ada c)l"la ("e se divide en dos. a tasa de creciiento es e%!onencial. '@ ;s" "s$'i%#*i +l creciiento e%!onencial se detiene' los n"trientes indis!ensables se agotan' no 4ay increento o decreento en el n;ero de c)l"las o asa' 4ay liitaci/n de n"trientes y ac""laci/n de s"stancias t/%icas. os icroorganisos son 2siol/gicaente activos y viables. +n "n sistea cerrado no se !"ede llevar a cabo inde2nidaente el creciiento e%!onencial )@ ;s" )" !3"*$" i la inc"baci/n contin;a des!")s ("e "na !oblaci/n alcanza la $ase estacionaria' las c)l"las !"eden seg"ir vivas y contin"ar etabolizando' !ero lo *s !robable es ("e "eran. i esto ;ltio s"cede' la !oblaci/n se enc"entra en la $ase de "erte. D"rante esta $ase' el conteo icrosc/!ico directo !"ede !eranecer constante !ero la viabilidad disin"ye lentaente. +n alg"nos casos' la "erte se aco!a:a !or lisis cel"lar' dando l"gar a "na disin"ci/n del conteo de viabilidad. 2=2CTO D2 LA CONC2NTRACIÓN D2 NUTRI2NT28 4a concentraci#n de nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento como al rendimiento del crecimiento de un microorganismo. 2 concentraciones muy baas de nutrientes, la velocidad de crecimiento se reduce, mientras que a niveles moderados y altos de nutrientes llega a ser m3+ima. i la concentraci#n aumenta a$n m3s la tasa de crecimiento no se modifica 4a dependencia de la tasa de crecimiento con la concentraci#n de nutrientes fue descrita por I. Monod en 1?- y recuerda la cin%tica en*im3tica establecida por la ecuaci#n de Mic!aelis Menten. 4a concentraci#n de nutrientes afecta la tasa de crecimiento microbiano y el rendimiento en masa de los microorganismos. 2 una tasa m3+ima de crecimiento, el incremento en la concentraci#n de nutrientes da lugar a un aumento en la biomasa total a cosec!ar.
M2DIO8 D2 CULTI;O Qn microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. ependiendo de la fuente de carbono que utili*an, los microorganismos se pueden clasificar en aut#trofos si es el &8= atmosf%rico (microorganismos que fotosinteti*an) y !eter#trofos si utili*an carbono org3nico. Medios de cultivo: #lido y 4íquido Qna forma muy $til de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por "asteur (que como ya sabemos se considera el padre de la microbiología), quien se dio cuenta que los microorganismos podían crecer en soluciones que tuvieran a*$car y una fuente de nitr#geno. Medios semis#lidos e preparan a partir de los medios líquidos, agregando a %stos un agente solidificante en una proporci#n menor que para preparar medios s#lidos. Qno de sus usos es la investigaci#n de la movilidad de las bacterias.
=ACTOR28 =Í8ICO8 9 EUÍMICO8 EU2 IN=LU92N 2N 2L CR2CIMI2NTO BACT2RIANO. •
Te$perat#ra@ &ada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. i consideramos la variaci#n de la velocidad de crecimiento en funci#n de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debao de la cual no !ay crecimiento> a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo !asta que se alcan*a la temperatura #ptima a la que la velocidad es m3+ima. "or encima de esta temperatura #ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.
El aumento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generali*ado de la velocidad de las reacciones en*im3ticas con la temperatura. e denomina coeficiente de temperatura a la relaci#n entre el incremento de la velocidad de reacci#n y el de temperatura. En t%rminos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1.- y =.- veces al aumentar 1[& la temperatura a la que tienen lugar. 4a falta de crecimiento a temperaturas baas se debe a la reducci#n de la velocidad de las reacciones bioquímicas y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. 4a muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturali*aci#n de proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas baas, el metabolismo celular es lento y las c%lulas paran de crecer> aunque suelen morir. in embargo, cuando la temperatura es superior a la #ptima, se produce la muerte celular r3pidamente y las c%lulas no pueden recuperar su capacidad de divisi#n si baa posteriormente la temperatura. Esto permite esterili*ar por calor y no por frío. ay varios tipo" de $icroorani"$o" en funci#n de sus temperaturas de crecimiento mínima, m3+ima y #ptima.
Tipo de $icroorani"$o
Mes#filo
"sicr#filo
"sicr#trofo
7erm#filo
4os microorganismos psicr#trofos son mes#filos que pueden crecer a temperaturas baas. "or tanto, se les puede considerar como psicr#filos facultativos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeraci#n (D C [&) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (B C B- [&). esde el punto de vista clínico, los microorganismos capaces de producir infecciones en pacientes son los mes#filos y algunos psicr#trofos ya que sus temperaturas #ptimas de crecimiento coinciden con las corporales. •
Acti&idad de a#a 0aK: e denomina actividad de agua a la relaci#n entre la presi#n de vapor de agua del substrato de cultivo (") y la presi#n de vapor de agua del agua
pura ("). El valor de la actividad de agua est3 relacionado con el de la !umedad relativa (). El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metab#licamente. "or eemplo: comparemos el agua pura donde todas las mol%culas de agua est3n libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disoluci#n saturada de sal com$n (;a&l) donde una parte importante de las mol%culas de agua participa en la solvataci#n de los iones de la sal disuelta. En este $ltimo caso, la actividad de agua muc!o menor que en el primero. &onforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. El agua es un substrato en muc!as reacciones bioquímicas (proteasas y lipasas, por eemplo). &uando no !ay agua disponible, estas reacciones se detienen y el metabolismo se para. Esta falta de agua tambi%n detiene muc!as de las en*imas que podrían degradar las estructuras biol#gicas. "or ello, las c%lulas que no crecen por falta de agua no mueren r3pidamente: los sistemas de degradaci#n tampoco funcionan y no las degradan. Es decir: cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detenci#n del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que %ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo m3s o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada pr3cticamente ilimitada. 4a gran mayoría de los microorganismos requiere valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. 4os valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aO.?, levaduras aO.-, !ongos filamentosos aO.. &omo puede verse, los !ongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con actividad de agua menor (m3s secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. "or esta ra*#n se puede producir deterioro de alimentos de baa actividad de agua (por eemplo, el queso o almíbares) por mo!os (!ongos filamentosos) y no por bacterias. En funci#n de su tolerancia a ambientes con baa a8 , los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en !alotolerantes, !al#filos y +er#filos seg$n toleren o requieran condiciones salinas o !ipersalinas, respectivamente. 4a reducci#n de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. 4a utili*aci#n de almíbares, salmueras y sala*ones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. •
p: Es un par3metro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo tiene un rango de p en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este rango muere.
El p intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las c%lulas ya que, en muc!os casos, la obtenci#n de energía metab#lica depende de la e+istencia de una diferencia en la concentraci#n de protones a ambos lados de la membrana citoplasma. El p interno en la mayoría del microorganismo est3 en el rango de @, a ,. 4os rangos de p tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambi%n, distintos. ay $icroorani"$o" acid*(ilo" que pueden vivir a ph1. y otros alcal*(ilo" que toleran ph1.. ay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el p del medio de crecimiento suele tender a baar durante el cultivo. "or otra parte, la baada del p del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una &enta%a "electi&a frente a otros competidores. 2sí, por eemplo, las bacterias l3cticas que producen grandes cantidades de 3cido l3ctico como
consecuencia de su metabolismo primario reducen el p del medio a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a baar el p del medio !asta D.-). e esta forma, las bacterias competidoras mueren y las l3cticas se convierten en la poblaci#n dominante. 4a baada del p se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberaci#n de 3cidos org3nicos de cadena corta (f#rmico, ac%tico, l3ctico) por ciertas bacterias.
U#i)) .- G"#<$i' !i'*%4i#. 2l eno$a $icrobiano.
El genoma microbiano comprende la secuencia completa de los genes de un microorganismo. u conocimiento permite una meor comprensi#n de la patogenia, con aplicaciones en la prevenci#n, en el diagn#stico y en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. &onocidas la din3mica de los mecanismos de invasi#n, producci#n de to+inas, capacidad de adaptaci#n a ecosistemas adversos y otras m$ltiples posibilidades de variaci#n, pueden diseñarse nuevas vacunas m3s específicas, así como establecer combinaciones interespecies, o utili*arse bacterias a virulentas de muy f3cil cultivo para producir en forma industrial antígenos de g%rmenes de crecimiento fastidioso. En el campo de los antibi#ticos, se abren perspectivas !acia líneas absolutamente distintas, con drogas capaces de bloquear determinados pasos en cadenas metab#licas vitales. Pa e+isten m$ltiples aplicaciones de la gen%tica en diagn#stico microbiol#gico, con t%cnicas que indudablemente se ir3n simplificando y perfeccionando con el conocimiento de la entera secuencia del genoma bacteriano: !ibridaci#n, reacci#n de polimeras en cadena, etc. "or $ltimo, el conocimiento del genoma tambi%n permitir3 la utili*aci#n ben%fica, a escala industrial, de alg$n microorganismo en la producci#n de !ormonas, vitaminas, amino3cidos y antibi#ticos.
Orani>aci*n de lo" ene" di(erencia" entre procariota" y e#cariota". 4os procesos de detecci#n y modelado de genes son aquellos mediante los que se identifican, en el 2;, regiones codificantes y elementos reguladores asociados,, con los obetivos de deducir la organi*aci#n o estructura de los genes y predecir la secuencia de los productos g%nicos correspondientes, sean 2;s o proteínas, y los mecanismos controladores de su e+presi#n. Caracter!"tica" de lo" ene" /rocariota" X&romosoma circular. X1-C1@ pb. Xaploide. X2pro+imadamente ?W codifica para proteínas y el 1W para regulaci#n. X8perones polig%nicos o policistr#nicos (que tienen muc!os genes estructurales) y operones monocistr#nicos.
Caracter!"tica" de lo" ene" 2#cariota"
&romosoma lineal X1AC1? pb Xaploide y diploide X4a codificaci#n a proteínas varia entre el BW en !umanos y AW en levaduras. X"resencia de intrones (regiones no codificantes) y e+ones (regiones codificantes).
Di(erente" e"trateia" detectar y $odelar ene" en /rocariota" y 2#cariota" arios factores !acen que las estrategias para identificar y modelar genes procariotas y eucariotas tengan que ser diferentes: 4a organi*aci#n de los genes es m3s complea en los organismos eucariotas, fundamentalmente por la presencia de intrones. 2lgunos genes tienen m3s de - intrones. El procesamiento de los 2; primarios puede ocurrir de varias maneras alternativas (alternative splicing). 4a proporci#n de secuencias codificantes frente a secuencias no codificantes es muy diferente> s#lo un 1.-W del material gen%tico en !umanos y otros eucariotas superiores, frente a un -W en bacterias, en las que las secuencias codificantes solapan a menudo. 4os genomas eucariotas son ricos en secuencias repetidas, que dificultan el an3lisis. El n$mero de genomas eucariotas secuenciados es muc!o menor que el de procariotas, lo que impone ciertos límites t%cnicos a la !ora de aplicar m%todos de predicci#n tanto ntrínsecos como E+trínsecos. /l"$ido"@ tipo" y (#ncione". 4os pl3smidos, vectores o tambi%n llamados plasmidios, son mol%culas de 2; e+tracromos#mico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del 2; cromos#mico. Est3n presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. u tamaño varía desde 1 a =- Gb. El n$mero de pl3smidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia !asta algunos cientos por c%lula. El t%rmino pl3smido fue presentado por primera ve* por el bi#logo molecular norteamericano Ios!ua 4ederberg en 1?-=. 4as mol%culas de 2; pl3smidico, adoptan una conformaci#n tipo doble !%lice al igual que el 2; de los cromosomas, aunque, por definici#n, se encuentran fuera de los mismos. e !an encontrado pl3smidos en casi todas las bacterias. 2 diferencia del 2; cromosomal, los pl3smidos no tienen proteínas asociadas. En la mayoría de los casos se considera gen%tico dispensable. in embargo, posee informaci#n gen%tica importante para las bacterias. "or eemplo, los genes que codifican para las proteínas que las !acen resistentes a los antibi#ticos est3n, frecuentemente, en los pl3smidos. ay algunos pl3smidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen moment3neamente el cromosoma y se sit$an en su interior, con lo cual, autom3ticamente la maquinaria celular tambi%n reproduce el pl3smido. &uando ese pl3smido se !a insertado se les da el nombre de episoma. 4os pl3smidos se utili*an en ingeniería gen%tica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del 2; cromosomal como así tambi%n porque es relativamente f3cil manipularlos e insertar nuevas secuencias gen%ticas. 4os pl3smidos usados en ngeniería
Tipo" Qna forma de agrupar pl3smidos es por su !abilidad de transferirse a otra bacteria. 4os pl3smidos conugativos contienen /traCgenes0, los cuales eecutan compleos procesos de conugaci#n, como la transferencia se+ual de pl3smidos a otra bacteria. 4os pl3smidos noC
conugativos, son incapaces de iniciar una conugaci#n, de allí que ellos pueden transferirse $nicamente con la asistencia de los pl3smidos conugativos y lo !acen /por accidente0. Qna clase intermedia de pl3smidos son los /movili*ables0 los cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden /parasitar0 un pl3smido conugativo, transfiri%ndose a una alta frecuencia solo en su presencia. Es posible para pl3smidos de diferentes tipos el coe+istir en una celular simple. iete tipos diferentes de pl3smidos !an sido encontrados en la E.&oli. "ero normalmente pl3smidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive en la línea celular, debido a la regulaci#n de las funciones vitales de los pl3smidos. "or lo tanto, los pl3smidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad. 8tra forma de clasificar pl3smidos es por funci#n. ay - clases principales: "l3smidos de fertilidad: los cuales contienen traCgenes, son capaces de conugarse. "l3smidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir resistencia contra antibi#ticos o venenos. ist#ricamente conocidos como Jactores , antes de que se entendiera la naturale*a de los pl3smidos. ColHpl"$ido"@ los cuales contienen genes que codifican (determinan la producci#n de) colinas y proteínas que pueden matar a otra bacteria. "l3smidos degradativos: los cuales !abilitan la digesti#n de sustancias inusuales como tolueno o 3cido salicílico. /l"$ido" &ir#lento"@ los cuales convierten la bacteria en un pat#geno. 4os pl3smidos pueden pertenecer a m3s de uno de estos grupos funcionales. 4os pl3smidos solo pueden coe+istir como una o m3s copias en cada bacteria, debido a la divisi#n celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas. 2lgunos pl3smidos incluyen un sistema de adici#n o /istema de Muerte "ostsegregacional0 ("5: "ostsegregational 5illing ystem). Ellos producen en conunto un veneno de larga vida y un antídoto de vida corta. 4as c%lulas !ia que retienen una copia del pl3smido sobreviven, mientras que una c%lula !ia que falla al integrar el pl3smido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la c%lula padre. Este es un eemplo de pl3smidos como el 2; replicante.
;ariabilidad en'tica en $icroorani"$o". 4a recombinaci#n me*cla elementos gen%ticos (genoma o partes de un genoma) de dos c%lulas diferentes en una misma c%lula, dando lugar a un nuevo genotipo. 7iene como consecuencia la dispersi#n de la variabilidad gen%tica entre organismos de una poblaci#n, y la transmisi#n de caracteres gen%ticos entre individuos de un poblaci#n. En la recombinaci#n tiene lugar el apareamiento de mol%culas de 2;, que son !om#logos y el intercambio de estas cadenas de 2;. e forma un genotipo recombinante: En eucariotas, la recombinaci#n tiene lugar durante la reproducci#n se+ual. En ella se forman gametos !aploides y durante la fecundaci#n, se fusionan y forman un cigoto diploide. En bacterias no e+iste la reproducci#n se+ual, pero si tenemos recombinaci#n, tiene lugar mediante la transferencia de una porci#n del genoma de una bacteria dadora denominada e+ogenote a una bacteria aceptora o endogenote. &omo consecuencia, se forma un merocigoto (*igoto parcial). Este merocigoto contiene el genoma entero de lac%lula aceptora y s#lo una parte de la c%lula dadora. En bacterias, la recombinaci#n es ocasional (s#lo de ve* en cuando), fragmentaria (s#lo se recombina parte del genoma) y no es necesaria para completar el ciclo de vida de las bacterias. 4o que sí es beneficioso es para la poblaci#n. M2CANI8MO8 D2 R2COMBINACIÓN ay tres tipos: TRAN8=ORMACIÓN@ la c%lula aceptora toma genes de una mol%cula de 2; (de la c%lula dadora) que se encuentra en el medio que rodea a la c%lula aceptora. 4a c%lula dadora se fragmenta, y tambi%n lo !ace la mol%cula de 2;. Qno de estos fragmentos es captado por la c%lula aceptora, si !ay segmentos !om#logos tiene lugar el intercambio de cadenas de 2; E&8M6;2&j; propiamente dic!a. El descubrimiento de la transformaci#n fue muy importante, ya que permiti# conocer cu3l era la naturale*a del material gen%tico, se conoci# que era el 2;. Qna primera parte del descubrimiento fue reali*ado por
TRAN8DUCCIÓN@ es un mecanismo de recombinaci#n gen%tica en bacterias, que est3 mediado por un virus bacteriano denominado bacteri#fagohfago. En este proceso, la c%lula dadora es en primer lugar infectada por un fago. e forma así una partícula viral que est3 defectuosa, y que contiene parte del 2; del fago y parte del 2; de la bacteria. 2!ora, esta partícula viral se llama partícula transductora y es capa* de infectar a una bacteria receptora. e esta manera !ay una transmisi#n de 2; de una bacteria dadora a una bacteria aceptora, a trav%s de un fago. CONUGACIÓN@ es un mecanismo de recombinaci#n en bacterias que requiere el contacto directo entre dos bacterias. Es un proceso polari*ado, es decir, siempre va en la misma direcci#n, por lo que !ay c%lulas dentro de una poblaci#n de bacterias que siempre act$an como dadora, J Y o Jertilidad Y, y luego !ay otras que act$an siempre como aceptoras, J C o JertilidadC. #lo las c%lulas J Y contienen un pl3smido llamado factor J. urante la conugaci#n, tiene lugar la copia y transferencia del factor J desde la c%lula J Y a la J C. 2sí, al final de la conugaci#n se obtienen dos bacterias J Y, la que era J Y sigue conservando el pl3smido y la J C se transforma porque adquiere el factor J. Este mecanismo de recombinaci#n en bacterias es muy importante porque tambi%n se van a transferir los caracteres gen%ticos que est3n codificados en el factor J. Entre los caracteres puede !aber en un factor J, se encuentran por eemplo, los que confieren resistencia a los antibi#ticos. 2sí, si un individuo de la poblaci#n presenta resistencia a los antibi#ticos, esta proporci#n se va a e+tender a toda la poblaci#n. 4as etapas de la conugaci#n son: •
•
&ontactos entre bacterias J Y y J C a trav%s de las fimbrias. 4os genes para la formaci#n de estas fimbrias, est3 en el factor J, por lo que s#lo van a poder tener estas estructuras las J Y. Movili*aci#n del pl3smido, que consiste en la rotura de una de las dos cadenas del factor J, en una secuencia determinada. 4a en*ima que corta el 2; es una endonucleasa que tambi%n est3 codificada por el factor J. Qna ve* que tiene lugar la rotura de la cadena, se da la replicaci#n o duplicaci#n de la cadena que permanece cerrada. Esto causa el despla*amiento de la cadena abierta y que es transferida a la c%lula receptora a trav%s de la fimbria. &uando se acaba esto, tenemos que la c%lula que era J Y conserva el factor J completo y la J C !a recibido una cadena del pl3smido. eplicaci#n de la cadena transferida. e rompe el contacto entre las c%lulas y al final las bacterias son J Y. El factor J tiene una propiedad, se puede integrar en el cromosoma de la bacteria. 2sí, una bacteria que tiene el factor J integrado en el cromosoma, se dice que es una bacteria fr (alta frecuencia de recombinaci#n).
Tran"$i"i*n de caractere" en'tico" entre bacteria". Tran"(erencia" en'tica". Estos procesos son reali*ados mediante la transmisi#n de caracteres !ereditarios de una bacteria dadora a una receptora. E+isten varios mecanismos de transferencia gen%tica. 2 lo largo de la transformaci#n, la bacteria receptora adquiere una serie de caracteres gen%ticos en forma de fragmento de 2;. Esta adquisici#n es !ereditaria. Este fen#meno fue descubierto en los pneumecocos en 1?=. En la conugaci#n, el intercambio de material gen%tico necesita de un contacto entre la bacteria dadora y la bacteria receptora. 4a cualidad de dador est3 unida a un factor de fertilidad (J) que puede ser perdido. 4a transferencia cromos#mica se reali*a generalmente con baa frecuencia. ;o obstante, en las poblaciones JY, e+isten mutantes capaces de transferir los genes cromos#micos a muy alta frecuencia. 4a duraci#n del contacto entre bacteria dadora y bacteria receptora condiciona la importancia del fragmento cromos#mico transmitido. El estudio de la conugaci#n !a permitido establecer los mapas cromos#micos de ciertas bacterias. &iertamente, la conugaci#n uega un papel en la aparici#n en las bacterias de resistencia a los antibi#ticos. 4a transducci#n es una transferencia gen%tica obtenida mediante introducci#n en una bacteria receptora de genes bacterianos inyectados por un bacteri#fago. e trata de un virus que infecta ciertas bacterias sin destruirlas y cuyo 2; se integra en el cromosoma bacteriano. 4a partícula f3gica transducida a menudo !a perdido una parte de su genoma
que es sustituida por un fragmento de gene de la bacteria !u%sped, parte que es así inyectada a la bacteria receptora. eg$n el tipo de transducci#n, todo gen podr3 ser transferido o, por el contrario, lo ser3n un grupo de genes determinados.
Re"tricci*n y $odi(icaci*n del DNA. istemas de restricci#nCmodificaci#n (MC) El sistema de restricci#nCmodificaci#n (MC) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de ;2 +#genos (normalmente víricos) que ingresen en la bacteria, distingui%ndolo del 2; propio, an3logo a un sistema inmune. El 2; propio no es reconocido por sus en*imas de restricci#n, puesto que previamente lo !a modificado por metilaci#n a trav%s de la acci#n de una metiltransferasa, en*ima que transfiere grupos metilo desde CadenosilCmetionina (2M) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1?@, a resultas de una serie de estudios sobre la infecci#n del fago l en dos cepas diferentes de Esc!eric!ia coli (las llamadas cepas /51=0 y /60). Este sistema consta de dos partes: Re"tricci*n@ Este sistema le permite a la bacteria protegerse de ;2 e+#genos para evitar la /promiscuidad0 en los intercambios gen%ticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad gen%tica o incluso la vida de la bacteria, lo que se reali*a a trav%s de cortes mediante endonucleasas de restricci#n a los ;2 e+#genos que ingresen a la bacteria. Modi(icaci*n@ &onsiste en la introducci#n de grupos metilo (&BC) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del 2;, lo cual est3 catali*ado por una metilasa específica. E+isten varios mecanismos de acci#n generales de estos sistemas, de los cuales destacan el tipo y el tipo : MHR tipo I@ Jueron los primeros en ser descritos. 4o característico de los sistemas MC de tipo es que las actividades de modificaci#n y las de restricci#n est3n producidas por un compleo multiproteico, que reali*a los dos tipos de actividades.
Tran"d#cci*n@ enerali>ada y e"peciali>ada. 4a transducci#n es la transferencia de informaci#n gen%tica desde un donador a un receptor y est3 mediada por un bacteri#fago (fago). 4a cubierta del fago protege al ;2 del medio ambiente, así es que la transducci#n, a diferencia de la transformaci#n, no se ve afectada por las nucleasas en el medio ambiente. ;o todos los fagos pueden mediar la transducci#n. En la mayoría de los casos la transferencia gen%tica se reali*a entre miembros de las mismas especies bacterianas. in embargo, si un fago en particular posee un amplio rango de !u%spedes que %l es capa* de infectar, entonces la transferencia entre las especies puede ocurrir. 4a capacidad del fago para mediar la transducci#n, est3 relacionada con el ciclo de vida del mismo.
Tipo" de Tran"d#cci*n Tran"d#cci*n Generali>ada H 4a transducci#n generali*ada es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier gene bacteriano de la donadora puede ser transferido a la c%lula receptora. El mecanismo de la transducci#n generali*ada se ilustra en la Jigura B. 4os fagos que median la transducci#n generali*ada, normalmente cortan el ;2 de la c%lula !u%sped en pequeñas pie*as y empacan ambos ;2s al interior de la partícula f3gica mediante un mecanismo llamado /!ead full0 o llenado de las cabe*as del fago. 8casionalmente una de las pie*as del ;2 de la bacteria !u%sped resulta empacada al a*ar dentro de una cubierta de fago. "or lo tanto cualquier gene de la bacteria donadora puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferir3 tanto ;2 como pueda caber en una sola c3pside. &uando la c%lula receptora se infecta con un fago que contiene ;2 de una donadora, el ;2 de la donadora puede entrar a la receptora. Pa dentro de la c%lula receptora puede ocurrir el evento de la recombinaci#n generali*ada, en el cual se substituye el ;2 de la c%lula donadora por el de la receptora. Tran"d#cci*n e"peciali>ada F 4a transducci#n especiali*ada es la transducci#n en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor. iferentes fagos pueden
transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos genes. 4a transducci#n especiali*ada est3 mediada por fagos lisog%nicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir depender3n del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma. urante la escisi#n (separaci#n) del profago, un error llega a ocurrir ocasionalmente en el cual un poco del ;2 del !u%sped escinde (se separa del cromosoma) unto con el ;2 del fago. olo puede ser transferido el ;2 del !u%sped que est% flanqueando cada lado del sitio donde el profago se !a insertado, (e. transducci#n especiali*ada). espu%s de la replicaci#n y la liberaci#n del fago y a trav%s de la infecci#n de la c%lula receptora, puede ocurrir una lisogeni*aci#n de la receptora dando como resultado la transferencia estable de los genes de la donadora. 4a receptora a!ora tendr3 dos copias de los genes que le fueron transferidos. 7ambi%n es posible que se lleve a cabo una recombinaci#n legítima entre los genes de la donadora y de la receptora. I$portancia F 4a conversi#n lisog%nica (mediada por fago) ocurre en la naturale*a y es la
fuente de donde proceden las cepas virulentas.
Con%#aci*n bacteriana@ pl"$ido" con%#ati&o" y tran"(erencia de ene" cro$o"*$ico". Con%#aci*n "ara conugar tiene que e+istir contacto físico entre la bacteria donadora de 2; y la eceptora. 4a capacidad de donar la proporciona el poseer un pl3smido conugativo que tambi%n se denomina factor de fertilidad o pl3smido se+ual. &onugaci#n de dos bacterias
Manip#laci*n en'tica de microorganismos y meora de cepas industriales. En general los organismos aislados de la naturale*a productores de metabolitos de inter%s industrial producen a los mismos en niveles muy baos, por lo tanto se !ace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Qna forma de meorar el rendimiento es mediante la optimi*aci#n del medio de cultivo y de las condiciones de operaci#n, pero esto est3 limitado por la capacidad de síntesis m3+ima del producto deseado que tiene el organismo. 4a otra posibilidades el meoramiento gen%tico de la cepa. &omo ya se dio, la productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. &on el organismo modificado, se ree+aminan las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la m3+ima productividad. "or lo tanto los programas de desarrollo involucran una continua modificaci#n gen%tica del microorganismo, seguida por una readaptaci#n del medio de cultivo a los nuevos requerimientos, meoras de las condiciones de operaci#n y tambi%n de los procesos de e+tracci#n y purificaci#n. 4a obtenci#n de cepas modificadas gen%ticamente se puede reali*ar por 1. elecci#n natural de variantes, =. Mutaci#n inducida, y B. ecombinaci#n gen%tica. 1. elecci#n natural e debe tener en cuenta que en cada divisi#n celular !ay una pequeña probabilidad de que ocurra un cambio gen%tico, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la poblaci#n sea !eterog%nea. Esta distribuci#n puede presentar problemas de rendimientos debido a que en general las variantes tienen menores niveles de producci#n que la poblaci#n parental. Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotípicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las c%lulas de la poblaci#n que e+presan la misma modificaci#n fisiol#gica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones espont3neas el elemento responsable de la mutaci#n no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutag%nico se conoce) son estables y !ereditarias y tienen una frecuencia estadísticamente medible (tasa de mutaci#n). 4a frecuencia de mutaciones espont3neas varía entre 1C@ a 1C? mutaciones por genoma y por generaci#n. "or lo tanto si se considera un valor de 1 CA se deber3n estudiar un gran n$mero de organismos ( 1 A ) en la b$squeda del tipo deseado. En la selecci#n de variantes naturales, una pr3ctica que todavía es utili*ada se refiere a la observaci#n de las características morfol#gicas de las colonias, las cuales, en manos de un operador ave*ado, se asocian con mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados. Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluaci#n del producto. En estos casos es m3s adecuado reali*ar las e+periencias en Erlenmeyer de !asta - ml, ya que si bien demanda una considerable mano de obra, los resultados de ensayos en tubos o pequeños frascos son menos confiables. 2 veces es posible el diseño de un procedimiento simple de FscreeningF selectivo para un tipo particular de mutantes. "or eemplo, c%lulas no mutadas que mueren en un plaqueo por selecci#n de mutantes resistentes a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aíslan mutantes con un esfuer*o mínimo a$n de poblaciones donde la tasa de mutaci#n es menor a 1 + 1@. &uando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un agente tal como la lu* ultravioleta se observa, en general, que con agentes como el mencionado los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mutaci#n. -. M#taci*n ind#cida. El procedimiento de mutaci#n mediante el empleo de un agente determinado implica dos etapas, el tratamiento de la poblaci#n con el mut3geno elegido y luego el aislamiento de los mutantes para su posterior ensayo y selecci#n.
Empíricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento de distintos FespectrosF de mutantes. 4a elecci#n de un agente mutag%nico depende en general de consideraciones pr3cticas. En algunos de los casos es m3s conveniente el empleo de m3s de uno en lugar del uso masivo de uno solo. 4a t%cnica a emplear puede producir una alta tasa de mutaci#n o puede favorecer la separaci#n de un n$mero reducido de tipos deseables de un gran n$mero de productores mediocres. asta donde sea posible el aislamiento del mutante debería utili*ar la característica meorada del mismo como factor de selecci#n. El incremento de su productividad podría ser el resultado de una modificaci#n en los mecanismos de control que limitan el nivel de producci#n y\o de una variaci#n en los precursores que llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las rutas y mecanismos de control de la biosíntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir en el aislamiento. Es importante en los programas de b$squeda y selecci#n, tener una alta proporci#n de mutantes entre la poblaci#n sobreviviente al tratamiento, debido a que s#lo estos individuos son los estudiados. &on el aumento de la dosis del mut3geno en general se incrementa esta proporci#n, aunque para cada mut3geno y cada organismo !ay una dosis #ptima. 4os agentes mutag#nicos pueden ser agrupados en: 1) Jísicos, como la lu* ultravioleta, que es un mut3geno muy conveniente. 4a longitud de onda puede variar de = a B nm y el tiempo de e+posici#n entre .- y = minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lograr un porcentae de muerte entre el ? y ??.?W. 8tros agentes como rayos ' y rayos v son actualmente poco utili*ados. =) 9uímicos: Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de .- M con e+posiciones de .- a 1= !oras. &omo muc!os de ellos son no t#+icos, el grado de mortandad no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento se reali*a adicionando el mut3geno a una suspensi#n de c%lulas, la cual es incubada a temperatura constante un determinado tiempo. Estas manipulaciones requieren personal con e+periencia debido a las lesiones que pueden ocasionar. Entre estos agentes se destacan los siguientes: a. 2cido nitroso. Este agente induce transiciones 2C7 CCC
cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradaci#n o biocat3lisis, los cuales est3n protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentae de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en laboratorios. E+isten en el mundo un gran n$mero de colecciones depositarias de cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan: F2merican 7ype &ulture &ollectionF, Q2, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas, actinomycetes, mo!os, proto*oos, virus y líneas celulares> F&olletion ;ationale de &ultures de MicroorganismesF del nstituto "asteur, Jrancia> F;ort!ern egional esearc! 4aboratoryF (;4), de "eoria, Q2, y F;ational &ollection of 7ype &ulturesF, 4ondres, nglaterra. i el organismo a utili*ar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desec!os, la elecci#n del material de partida puede !acerse teniendo en cuenta que el organismo e+prese en ese ambiente las propiedades que son de inter%s. "or eemplo, en suelos tratados con pesticidas se podrían encontrar organismos adaptados a la degradaci#n de estos productos químicos> o en larvas de insectos muertos agentes causales de la muerte.
M'todo" cl"ico". Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de %+ito dependen de la t%cnica elegida para el mismo> en este caso las alternativas son: a. aislamiento directo, o b. enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra. Qna ve* efectuado el muestreo y selecci#n (screening) para el aislamiento de una cepa de inter%s, la misma deber3 ser caracteri*ada. En este procedimiento se debe tener en cuenta que la composici#n química del material a partir del cual se va a reali*ar el aislamiento comien*a a variar a partir del momento en que es tomada la muestra, por lo tanto %sta se debe procesar r3pidamente, tratando de evitar alteraciones que afecten a la poblaci#n de inter%s. a) 2islamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utili*a para el aislamiento permita la m3+ima e+presi#n del material gen%tico del organismo. i se busca por eemplo un organismo con acci#n antimicrobiana, se puede crecer al potencial productor, en una caa de "etri en presencia del o los organismos contra los cuales se requiere la acci#n antimicrobiana, observ3ndose la producci#n del in!ibidor por las *onas de in!ibici#n de crecimiento. "ara la detecci#n de productores de factores de crecimiento tales como amino3cidos y nucle#tidos se utili*a la estimulaci#n del desarrollo de bacterias au+#trofas por un lisado del organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios s#lidos. En este caso se debe tener una Fr%plicaF de la caa a ensayar. Qna ve* obtenido el crecimiento en la primera caa, se replica a una segunda, antes de FmatarF las colonias con lu*. Q.., por eemplo. Esta caa es luego cargada con agar conteniendo una suspensi#n del organismo au+#trofo al producto buscado. espu%s de un período de incubaci#n se observa crecimiento en forma de !alo alrededor de las colonias productoras, lo que permite el aislamiento de este organismo de la placa r%plica. b) Enriquecimiento del cultivo: esta t%cnica consiste en incrementar en una poblaci#n mi+ta el n$mero de organismos de inter%s en relaci#n al resto. e esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos específicos o ciertos in!ibidores. "ara mantener la fuer*a selectiva del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se reali*an subcultivos peri#dicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de inter%s sea el dominante de la poblaci#n, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio s#lido. e debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad específica de crecimiento (m). 4a selecci#n de un organismo por este procedimiento depende de su valor de m comparado con los de los otros organismos. Evidentemente el dominante de la poblaci#n ser3 el que posea el mayor valor de m para las condiciones de cultivo empleadas. in embargo no necesariamente ser3 m3s $til un organismo de mm m3s alto> puede ser deseable uno con mayor afinidad por el sustrato. El problema de selecci#n puede ser superado empleando el sistema de cultivo continuo, tema que se trata en el capítulo A, donde la fuer*a de selecci#n se mantiene a un nivel constante y el organismo dominante ser3 seleccionado por su afinidad por el sustrato, m3s que por su u m3+ima. En la Jig. B se muestra un modelo de competici#n entre dos organismos capaces de crecer en un cultivo continuo enriquecido. k k
En cultivo continuo el valor de mm est3 determinado por la concentraci#n de sustrato y es igual en estado estacionario a la velocidad de diluci#n (). 2 valores de mm h m* se tiene que mm 2 mm6 y por lo tanto el organismo 2 podr3 ser seleccionado a pesar de que mm2 mm6 (m* h valor de m a partir del cual mm 6 mm 2).
M#ta'ne"i"@ ai"la$iento de $#tante". 4as cepas utili*adas industrialmente est3n peor caracteri*adas gen%ticamente que los organismos que se utili*an normalmente en investigaci#n b3sica no e+istiendo pr3cticamente, en la actualidad, procesos aplicables diferentes a la mutag%nesis por radiaci#n o con agentes químicos. "or lo tanto, a continuaci#n mencionamos otras posibilidades que en un futuro pueden tener claras aplicaciones. 2. Mutag%nesis por elementos transponibles i se produce la inserci#n de un elemento transponible dentro de un gen se pierde, en general, la funci#n del gen ya que se altera la secuencia codificadora del gen en el que se inserta. 4os elementos transponibles se usan con profusi#n por los gen%ticos microbianos como agentes mutag%nicos ya que pueden integrarse en el cromosoma en varias locali*aciones. ay tres tipos de elementos transponibles: secuencias de inserci#n (), transposones (7n) y algunos virus especiales (Mu). En los procariotas, las secuencias de inserci#n () son el tipo m3s simple ya que no llevan otra informaci#n gen%tica que la requerida para despla*arse a nuevos lugares. 4os transposones (7n) son m3s largos que las secuencias de inserci#n () y llevan otros genes, algunos de los cuales confieren importantes propiedades al organismo que los porta (marcadores de resistencia a f3rmacos y otros genes f3cilmente seleccionables). 6. Mutag%nesis dirigida 4os m%todos de mutag%nesis que !an sido discutidos !asta este momento son completamente al a*ar. 4a tecnología del ;2 recombinante y el uso de ;2 sint%tico !acen que sea posible inducir mutaciones específicas en genes específicos. &uando se aísla y se determina la secuencia de un fragmento de ;2 que contiene un gen específico, es posible construir una forma modificada de este gen cambiando una base o una serie de bases. Este ;2 modificado puede luego insertarse en una c%lula receptora y seleccionar mutantes que se diferenciar3n del tipo silvestre por el cambio introducido en ese sitio específico. 4a mutag%nesis dirigida tiene muc!os usos en gen%tica microbiana y en biología molecular y resulta especialmente $til en estudios sobre estructura y funci#n de en*imas y otras proteínas.
Inenier!a Gen'tica. 7odo organismo, a$n el m3s simple, contiene una enorme cantidad de informaci#n. Esta informaci#n se encuentra almacenada en una macromol%cula que se !alla en todas las c%lulas: el 2;. Este 2; est3 dividido en gran cantidad de subCunidades (la cantidad varía de acuerdo con la especie) llamadas genes. &ada gen contiene la informaci#n necesaria para que la c%lula sintetice una proteína. 2sí, el genoma (y por consecuencia el proteoma), va a ser la responsable de las características del individuo. 4os genes controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo, incluyendo metabolismo, forma, desarrollo y reproducci#n. "or eemplo, la síntesis una proteína ' !ar3 que en el individuo se manifieste el rasgo Fpelo oscuroF, mientras que la proteína P determinar3 el rasgo Fpelo claroF. emos entonces que la carga gen%tica de un determinado organismo no puede ser id%ntica a la de otro, aunque se trate de la misma especie. in embargo, debe ser en rasgos generales similar para que la reproducci#n se pueda concretar. P es que una de las propiedades m3s importantes del 2;, y gracias a la cual fue posible la evoluci#n, es la de dividirse y fusionarse con el 2; de otro individuo de la misma especie pa ra lograr descendencia diversificada. 8tra particularidad de esta mol%cula es su universalidad. ;o importa cu3n diferente sean dos especies: el 2; que contengan ser3 de la misma naturale*a: 3cido nucleico. iguiendo este ra*onamiento, y teniendo en cuenta el concepto de gen, surgen algunas inc#gnitas: ]on compatibles las cargas gen%ticas de especies distintas ]"uede el gen de una especie funcionar y manifestarse en otra completamente distinta ]e puede aislar y manipular el 2;
4a respuesta a todas estas preguntas se resume en dos palabras: ngeniería
2n>i$a" de re"tricci*n. &omo ya se dio, la < consiste la manipulaci#n del 2;. En este proceso son muy importantes las llamadas en*imas de restricci#n, producidas por varias bacterias. Estas en*imas tienen la capacidad de reconocer una secuencia determinada de nucle#tidos y e+traerla del resto de la cadena. Esta secuencia, que se denomina estriction Jragment 4eng!t "olymop!ism o 4"M, puede volver a colocarse con la ayuda de otra clase de en*imas, las ligasas. 2n3logamente, la en*ima de restricci#n se convierte en una Ftiera de 2;F, y la ligasa en el FpegamentoF. "or lo tanto, es posible quitar un gen de la cadena principal y en su lugar colocar otro.
;ectore". En el proceso de manipulaci#n tambi%n son importantes los vectores: partes de 2; que se pueden autorreplicar con independencia del 2; de la c%lula !u%sped donde crecen. Estos vectores permiten obtener m$ltiples copias de un tro*o específico de 2;, lo que proporciona una gran cantidad de material fiable con el que trabaar. El proceso de transformaci#n de una porci#n de 2; en un vector se denomina clonaci#n. "ero el concepto de clonaci#n que FcirculaF y est3 en boca de todos es m3s amplio: se trata de FfabricarF, por medios naturales o artificiales, individuos gen%ticamente id%nticos.
ADN poli$era"a. 8tro m%todo para la producci#n de r%plicas de 2; descubierto recientemente es el de la utili*aci#n de la en*ima polimerasa. Tste m%todo, que consiste en una verdadera reacci#n en cadena, es m3s r3pido, f3cil de reali*ar y econ#mico que la t%cnica de vectores.
La reacci*n en cadena de la poli$era"a 0/CR 4a eacci#n en &adena de la "olimerasa ("&) es una t%cnica Fin vitroF que imita la !abilidad natural de la c%lula de duplicar el 2;. e trata de una t%cnica usada para crear un gran n$mero de copias de un segmento de 2;, que utili*a ciclos de desnaturali*aci#n, apareamiento con cebadores y e+tensi#n por una 2; polimerasa termoresistente. asta la d%cada de 1?, el $nico m%todo para obtener grandes cantidades de un fragmento de 2; era clon3ndolo en vectores adecuados e introduci%ndolo y multiplic3ndolo en bacterias. En el año 1?-, un investigador norteamericano, 5ary Mullis (acreedor del "remio ;obel en 9uímica 1??B por este aporte), desarroll# un m%todo que permite, a partir de una muestra muy pequeña de 2;, obtener millones de copias de 2; in vitro, en unas pocas !oras y sin necesidad de usar c%lulas vivas. Esta t%cnica, llamada reacci#n en cadena de la polimerasa ("&), requiere conocer la secuencia de nucle#tidos de los e+tremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar dos oligonucle#tidos sint%ticos de 2; complementarios a una porci#n de cada una de las dos cadenas de la doble !%lice. 1. 4a me*cla de reacci#n contiene la secuencia de ;2 que se quiere amplificar, dos oligonucle#tidos sint%ticos ("1 y "=) que servir3n como cebadores, una ;2 polimerasa termoestable (7aq) y los cuatro deso+irribonucle#tidos trifosfato Zd27", d<7", d&7" y d77"Z. =. "roceso:
4a me*cla de reacci#n se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturali*aci#n, una de !ibridaci#n o alineaci#n y una de elongaci#n. a) urante la desnaturali*aci#n, que se reali*a por calentamiento de la me*cla a ?-[&, se separan las dos cadenas del 2; molde.b) urante la !ibridaci#n, la temperatura de incubaci#n se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria. c) urante la fase de elongaci#n, la me*cla se calienta a A=[& y la en*ima 7aq 2; polimerasa se usa para replicar las !ebras de ;2. 4a 7aq polimerasa comien*a el proceso de e+tensi#n de la cadena complementaria a partir del e+tremo B^ de los cebadores. 2l finali*ar cada ciclo, la cantidad de 2; molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble. Entre muc!as de las aplicaciones que la "& pone a disposici#n se encuentran la detecci#n preco* o prenatal de enfermedades gen%ticas, la detecci#n de infecciones virales latentes o la producci#n de grandes cantidades de fragmentos de 2; !umano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros m%todos. Esta t%cnica tambi%n se aplica para estudios de identidad y filiaci#n.
Lei"laci*n "obre la $anip#laci*n en'tica y la #tili>aci*n de Microorani"$o" $odi(icado". D2 L29 D2 BIO82GURIDAD5 A CARGO D2L C. DI/UTADO =2RNANDO CA8T2LLANO8 /AC2CO5 D2L GRU/O /ARLAM2NTARIO D2L /ARTIDO ACCIÓN NACIONAL &on fundamento en los artículos D, =-, A1, fracci#n , y AB fracci#n '''CJ y ''', y ? de la &onstituci#n "olítica de los Estados Qnidos Me+icanos, del artículo - de la 4ey 8rg3nica del &ongreso
correctamente el organismo modificado tendr3 entonces un nuevo gene y !ar3 algo diferente, crear3 una nueva proteína. e convertir3 en otro organismo vivo y transmitir3 a su progenie sus nuevas características. El desarrollo de estas t%cnicas a principios de los años setenta impuls# a nivel internacional un debate sobre la seguridad en biotecnología moderna y en el verano de 1?A- en 2silomar, &alifornia, se dio lugar a una reuni#n para tratar estas cuestiones. 4a &onferencia de 2silomar aport# una cierta cautela en forma de llevar a cabo las investigaciones de ingeniería gen%tica y con el pasar de los años se !a obtenido una mayor onfian*a. in embargo, es necesario recordar que el nuevo organismo modificado es capa* de producir proteínas distintas del organismo natural y por lo tanto su posible impacto en el medio ambiente y en la salud !umana puede tener giros inesperados que no necesariamente se pueden observar en el laboratorio o en e+perimentos en los que se mantienen confinados. 4a utili*aci#n de estos organismos en gran escala y completamente libre en el medio ambiente es relativamente nueva. ;o se cuenta con la e+periencia suficiente en el uso de dic!os organismos, sobre todo en *onas en las que !ay parientes silvestres u organismos nativos que puedan recibir la informaci#n gen%tica novedosa y por lo tanto es de vital importancia estudiar los posibles impactos que ese nuevo gene introducido en alg$n organismo pudiera tener en las poblaciones no modificadas por t%cnicas de ingeniería gen%tica. Este es precisamente el caso de M%+ico, en cuyo territorio se originaron el maí* y algunos otros cultivos de importancia comercial a nivel global como el friol, el tomate, el cacao, el c!ile, las calaba*as, entre otros. Es gracias a la domesticaci#n y cultivo milenario que en M%+ico se !a reali*ado de estas especies, que nuestro país es considerado tambi%n centro de diversidad ya que muc!as variedades m3s, se encuentran en nuestro territorio en forma $nica y e+isten muc!as otras especies que son propias de una regi#n geogr3fica dentro del territorio nacional consideradas especies end%micas. &abe recordar que M%+ico particip# activamente durante la &onferencia de las ;aciones Qnidas sobre Medio 2mbiente y esarrollo (&;QM2) celebrada en ío de Ianeiro n unio de 1??=, durante la cual se aprob# el "rograma =1 el cual en su capítulo 1@ establece una Fgesti#n racional de la biotecnologíaF. En dic!o documento se reconoce que, aun cuando la biotecnología no puede resolver todos los problemas fundamentales del medio ambiente y el desarrollo, cabe esperar, no obstante que aporte una importante contribuci#n al desarrollo sustentable. El capítulo 1@ del programa =1 reconoce asimismo que la comunidad en general se podr3 beneficiar al m3+imo de la biotecnología si se desarrolla y aplica de forma racional y uiciosamente. 2simismo, en la misma &onferencia se firm# por parte de nuestro país el &onvenio sobre iversidad 6iol#gica el 1B de unio de 1??=, el cual fue ratificado por el enado de la ep$blica el B de noviembre de 1??B y publicado en el iario 8ficial de la Jederaci#n el A de mayo de 1??B. El &onvenio dispone en su artículo g, que cada país signatario establecer3 la legislaci#n y dem3s reglamentaci#n para administrar o controlar los posibles riesgos derivados de la utili*aci#n y la liberaci#n de organismos modificados gen%ticamente resultantes de la biotecnología moderna y que sea probable que tuvieran repercusiones ambientales adversas que pudieran afectar a la conservaci#n y a la utili*aci#n sustentable de la diversidad biol#gica, tomando tambi%n en cuenta los riesgos a la salud !umana. "or su parte, en el artículo 1? p3rrafo B, se estipula que las "artes del &onvenio estudiar3n la necesidad y las modalidades de un protocolo para la transferencia, manipulaci#n y utili*aci#n seguras de cualesquiera organismos vivos modificados resultantes de la biotecnología que puedan tener efectos para el medio ambiente o la salud !umana. En el p3rrafo DS de ese mismo artículo se estipula que cada "arte &ontratante proporcionar3, directamente o e+igi%ndoselo a toda persona física o moral bao su urisdicci#n, que suministre toda la informaci#n disponible acerca de las reglamentaciones relativas al uso y la seguridad para la manipulaci#n de dic!os organismos, así como toda la informaci#n disponible sobre los posibles efectos adversos de los organismos vivos modificados de que se trate. 4a implementaci#n de dic!os artículos llev# a la comunidad internacional a partir del mes de noviembre de 1??- a establecer un
