microbiologia

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA, RAMA DE FITOPATOLOGÍA

NOTAS DEL CURSO DE:

BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA PARASITOLOGIA

7mo. SEMESTRE ING. FIERRO CORRALES DAGOBERTO ING. MENA ADRIANO JORGE DANIEL Profesor

JUAN JOSÉ RÍOS, SINALOA.

AGOSTO DE 2009

UNIDAD I.- INTRODUCCIÓN. 1.1.- CONCEPTOS FITOPATOLÓGICOS. LA MICROBIOLOGÍA: Es un área de la biología que se encarga del estudio de los microorganismos en forma general. Esta ciencia empieza a desarrollarse a fines del siglo XVII, la razón de esto es que hasta esta fecha se contó con la ayuda de un instrumento óptico (microscopio) y además que en esta época prevalecía “LA TEORÍA DE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA” y otra razón es que se desconocían las técnicas apropiadas para estudiar aspectos sobre estos microorganismos. LA FITOPATOLOGÍA: Es una ciencia de síntesis: toma datos y técnicas de campos diversos como lo es la Agricultura, Microbiología, Anatomía Vegetal y Ciencias del Suelo; sin embargo, la Fitopatología es una ciencia aplicada que comprende el estudio de las enfermedades de las plantas y pretende dar soluciones prácticas para solucionar el problema. Las enfermedades de las plantas se pueden clasificar en varias formas, tomándose en cuenta diversos aspectos. Uno de los métodos más comunes de clasificación es el tipo de agente y de esta manera se clasifican en: enfermedades infecciosas (todas aquellas provocadas por parásitos como: hongos, bacterias, virus, nemátodos, fitoplasmas, espiroplasmas, viroides, rikettsias, plantas parásitas, etc.) y enfermedades no infecciosas (provocadas por efectos del medio ambiente). FITOBACTERIOLOGÍA: Ciencia que se encarga del estudio de las bacterias que inducen enfermedades a los vegetales. ¿QUÉ SON LAS BACTERIAS?: Son microorganismos unicelulares procariontes, que carecen de clorofila y se reproducen principalmente por fisión binaria. Las bacterias fitopatógenas se definen como microorganismos unicelulares en forma de bastón, que carecen de clorofila, presentan pared celular y no tienen núcleo definido. La palabra BACTERIA proviene de las letras griegas: BACTERIE, que significa varita o bastón.

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1.2.- HISTORIA DE LA FITOBACTERIOLOGÍA. Investigadores que hicieron aporte al campo de la Bacteriología:

ROBERTO HOOKE (1665): Fue el primero en observar protozoarios, utilizando lentes de 14 – 42 aumentos, analizando una gota de agua sucia, pero pasó a ser pura observación, ya que no describió y/o publicó nada. ANTON VAN LEEUWENHOECK (1675): Se interesó en el pulido de lentes y fue el primero en construir un microscopio simple (200 aumentos), reconoció a las bacterias y a otros microorganismos, se entusiasmó tanto con sus observaciones que escribió una serie de cartas a la REAL SOCIEDAD DE LONDRES, donde fue ignorado debido a la creencia en esa época sobre “LA TEORÍA DE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA”. LUIS PASTEUR (1860): Experimentó en un frasco con caldo nutritivo en su interior, el cual permitía la entrada de aire libre pero filtrado, siendo con este experimento tan sencillo, lo que dio la pauta para refutar “LA TEORÍA DE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA”. Además estudió la fermentación, producción de ácido láctico vía aerobiosis, estudia la enfermedad de la rabia en animales, ántrax del ganado, el cólera y la producción de vacunas y antisépticos. Considerando todas las aportaciones de este investigador, se le considera como “EL PADRE DE LA BACTERIOLOGÍA”. En el año de 1892 se le otorga el premio de la Soborna de París y en dicho reconocimiento menciona esta frase: “El hombre debe de tener un mejor modo de vida, tiene que buscar la verdad, no tener dudas, tener determinación aún en condiciones adversas, preguntarse que he hecho para mi persona y que he hecho para mi pueblo. Vivan felices por todo lo que han hecho para la humanidad”. ROBERTO KOCH (1876).- Trabajando en el laboratorio de PASTEUR, demuestra que el ántrax del ganado es ocasionado por una bacteria, al igual que la tuberculosis en humanos. Fue el primero en utilizar medios de cultivos de microorganismos en cultivos mixtos. Además estableció los criterios para determinar la patogenicidad de microorganismos parásitos, a lo que actualmente conocemos como POSTULADOS DE KOCH. TOMÁS BURRIL (1880).- Investigador que relacionó por primera vez a las bacterias como fitopatógenas, siendo la bacteria Micrococus amylovorus, hoy conocida como Erwinia amylovora, causante del “tizón de fuego” del peral y del manzano.

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WAKER (1883).- Trabajando en el laboratorio de DE Bary, aisló y comprobó la patogenicidad de Xanthomonas hyacinty la cual ocasiona la enfermedad del “amarillamiento del jacinto”. ARTHUR (1886).- Trabajando en Nueva York, comprueba y afirma los resultados de BURRIL y WAKER. QUAITE (1891).- Asistente de BURRIL, estudió la epidemiología de Erwinia amylovora, además de la distribución o dispersión por medio de vectores. SAVASTANOI (1887).- Observó y describió las agallas de las ramas de olivo ocasionadas por Pseudomonas savastanoi. ERWIN F. SMITH (1887).- Estudia enfermedades de mucha importancia en América Latina, como la marchitez de las cucurbitáceas y la venación negra de las crucíferas. Dedicó aproximadamente 40 años al estudio de las bacterias fitopatógenas, por lo que en su honor, se le da el nombre al género Erwinia. 1.3.IMPORTANCIA FITOPATÓGENAS.

Y

DISTRIBUCIÓN

DE

LAS

BACTERIAS

En la actualidad el hombre por obtener productos vegetales diversos que satisfagan sus necesidades de alimentación, vestido y otras de menor importancia, se encuentran factores que disminuyen y en casos extremos aniquilan los rendimientos de los cultivos. Entre otros factores y en orden de importancia tenemos los insectos, ENFERMEDADES, malas hierbas y roedores. Las bacterias son importantes por varios puntos de vista: 1. 2. 3. 4.

Son importantes en la ciencia de la biotecnología. Son importantes en la ciencia de la geomicrobiología. Son importantes en la genética microbiana. Son importantes porque forman parte de los ciclos constructivos y destructivos.

1.- Importancia en la ciencia de la biotecnología. Se utilizan bacterias fitopatógenas para la producción y recombinación de algunos productos, ejemplo: a. Escherichia coli: produce ÍNDIGO (teñir mezclilla). b. Clavibacter sp.: se utiliza para producir tomates secos, (CAMBELL) absorbe agua. c. Xanthomonas campestris: capaz de endulzar chiles sin calorías. d. Erwinia: la utiliza la Renault para filtrar los aceites (devoran impurezas). e. Xanthomonas sp.: produce cervezas sin calorías (Alemania). f. Erwinia: destapa caños en (Francia). 4

g. Pseudomonas: se utiliza para evitar que se encienda la lana. 2.- Importancia de las bacterias en la geomicrobiología. Se han utilizado principalmente en Noruega, bacterias capaces de producir gas, también descomponen derivados del petróleo para su utilización en la industria, ejemplo: con la ayuda de las bacterias se disminuye el costo para la obtención de vaselina. 3.- Utilidades de las bacterias en genética microbiana. Se refiere al intercambio de genes o bien a las bacterias como portadoras de genes. Estos experimentos se iniciaron en Bélgica y en la actualidad se usan en Suecia Y E.U. utilizando el género Agrobacterium y Bacillus para el intercambio o traspaso de genes. 4.- Debido a que forman parte de los ciclos constructivos y destructivos. Intervienen en los ciclos del Carbono, Nitrógeno y Azufre. En el ciclo del Carbono: algunos géneros de bacterias descomponen a los vegetales. En le ciclo del Nitrógeno: están involucradas bacterias del género: Nitrobacter: descomponen el amoniaco a nitritos. Nitrosomonas: degradan los nitratos a nitritos. Las bacterias fitopatógenas juegan un papel muy importante en el ciclo destructivo de los vegetales debido a que ocasionan daños de suma importancia en la agricultura. De las 1800 especies de bacterias que se conocen, aproximadamente 200 se comportan como fitopatógenas, ejemplos: Pseudomonas solanacearum: ataca diversos cultivos de importancia en el mundo. En el año de 1903 en Florida ocasionó pérdidas entre el 25-100% en el cultivo del tabaco. En México en el año de 1975 ocasionó pérdidas del 10-100% en el cultivo de la papa. En la isla de Java en el año de 1978, causó el 25% de pérdidas en el cultivo de cacahuate; en Chiapas se han abandonado plataneras por los daños ocasionados por esta bacteria. Erwinia amylovora: (Tizón de fuego del peral y manzano). Es una bacteria de mucha importancia en el mundo. En el año de 1901 a 1904, se presentó una epifitia en el valle de San Joaquín, California, destruyendo aproximadamente 150,000 (95%) árboles de manzano y peral por lo que el cultivo se desplazó al Valle de Sacramento, California. Agrobacterium tumefaciens: (Agallas de la corona). En 1963 en California, fue la enfermedad más seria en 14 frutales de importancia. Para el año de 1971 ocasionó pérdidas de 7 millones de dólares. Pseudomonas corrugata: Reportada en E.U. y recientemente un problema potencial para el cultivo de tomate y chile en el estado de Sinaloa.

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1.4.- SINTOMATOLOGÍA BACTERIANA. Las funciones principales de los fitopatólogos son el diagnóstico de las enfermedades de las plantas, la determinación de su causa y el desarrollo de métodos de control. Siendo una herramienta más la sintomatología inducida por las bacterias. Son muy pocas las especies de plantas cultivadas que no están propensas al ataque de los agentes fitopatógenos; sin embargo, existen bacterias o especies que son compatibles a una sola especie de planta, aunque también existen especies de plantas que son susceptibles a más de una especie de bacterias a la vez. Los síntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son en sí la enfermedad, estos son utilizados como guías para diagnosticar la naturaleza o causa de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos variados tipos de síntomas, los cuales son divididos en cuatro categorías: 1.- Cambios de color.- Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o cloroplastos dando como consecuencia: Clorosis: retardamiento o disminución de la clorofila por anormalidades en los cloroplastos. Amarillamiento. Disminución de clorofila e incremento de carotenos y xantofilas. Antocianocencia: coloración púrpura como resultado del incremento del pigmento antocianina. 2.- desintegración de tejidos: Son ocasionados por la acción enzimática o toxinas que producen los patógenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma celular. Pudrición: áreas muertas debido a la maceración de tejidos con presencia de exudados bacterianos. Esta pudrición puede ser de consistencia seca o húmeda. Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raíz con crecimiento secundario, usualmente delimitado por tejido sano. Necrosis: Áreas donde las células sufren primeramente plasmólisis, colapso y la muerte. En ocasiones éstas áreas presentan una coloración oscura o castaña debido a la producción de melaninas. Tizón: Desintegración rápida de los tejidos seguida por la muerte celular, esta puede ser parcial o total del hospedante (producción de toxinas) también definida como lesiones de crecimiento indeterminado. Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta. 6

3.- Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las sustancias reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su concentración. Agalla: desarrollo anormal donde las células dañadas sufren el fenómeno de Hiperplasia (multiplicación excesiva de las células) o Hipertrofia (aumento de tamaño de las células). Fasciación: proliferación excesiva de brotes como consecuencia de la Hipoplasia (poca división celular), presentándose la planta como arrosetada. 4.- Daños al sistema vascular Marchitez: Flacidez o pérdida de turgencia de la planta debido al taponamiento de los vasos que conforman este sistema, ya sea por estructuras del patógeno, sustancias que las bacterias producen o estructura del tejido vegetal. 1.5.- SEROLOGÍA Y PRODUCCIÓN DE ANTISUEROS. Los métodos serológicos, a juzgar por la cantidad de trabajos que se han realizado y los resultados que se han obtenido, son de un valor incalculable para la identificación y diagnosis de rutina, así como un método cuantitativo para el estudio de algunos microorganismos. Por lo anterior, es indispensable conocer las ventajas y limitaciones de la serología. Con las técnicas serológicas se detectan microorganismos en bajas concentraciones en tejidos vegetales, pero para esto se requiere contar con el antisuero específico y la obtención de este es minuciosa y lleva tiempo. Si un animal de sangre caliente es infectado con un agente que causa enfermedad, como una bacteria o virus, en respuesta a la infección aparecen en su sangre proteínas del grupo de las globulinas que se les llama anticuerpos. Se puede demostrar la presencia de anticuerpos en el suero de la sangre del animal inoculado, por la propiedad que tienen de combinarse “IN VITRO”, produciendo una reacción visible con la bacteria o virus que causó la infección. Este acto de combinación, que se puede demostrar de muchas maneras, constituye la base de las pruebas serológicas. Un animal puede producir anticuerpos no solamente en respuesta a la infección con un agente causante de enfermedad, sino también con una gran cantidad de materiales extraños, generalmente proteínas y polisacáridos. Cualquier sustancia que estimula la producción de anticuerpos y que además puede combinarse con ellos “IN VITRO” se denomina antígeno. Al suero que contiene anticuerpos se le llama antisuero, mientras que al suero proveniente de un animal al que nunca se le ha eyectado un material antigénico se le nombra suero normal. Con el fin de producir antisueros específicos para una determinada bacteria, dicha especie de bacteria completamente purificada e inactivada se debe de inyectar a un animal, de preferencia a un conejo. Para obtener antisueros bien concentrados (títulos altos), por lo general se emplean procedimientos que hayan sido exitosos en otras ocasiones. Después de un tiempo prudencial, en el cual se considera (se detecta) que se ha formado la mayor 7

cantidad posible de anticuerpos, se extrae la sangre del animal inmunizado y se separa la fracción suero. Este antisuero es valorado seguidamente para determinar su título. Para preparar un antisuero para una bacteria específica se sigue el siguiente procedimiento: 1. Preparación del antígeno: se prepara una suspensión bacteriana con concentración aproximada de 3 x 109 células por mL, en solución salina al 0.85% esterilizada y utilizando una cepa purificada en un cultivo de 48 hr de edad. Posteriormente, las bacterias se colocan en baño maría, a 60° C durante 2 horas para inactivarlas, aunque también se pueden matar con cloroformo, glutaraldehido o con otros métodos. Para tener la certeza de que las bacterias murieron al ser expuestas a esta temperatura, se toma una muestra de la suspensión tratada y se siembra en una placa de medio artificial. 2. Inmunización del conejo: Para la inmunización se selecciona un conejo macho, joven, sano, de color blanco y se mantiene con alimento balanceado. Cuatro días antes de inyectarlo por primera vez y con un día de ayuno, se le extraen 10 mL de sangre para obtención de suero normal; el suero normal se utiliza para pruebas de aglutinación o de titulación del antisuero. Para el sangrado del conejo, manualmente se le quita el pelo de una oreja hasta descubrir una vena; a esta vena, con una navaja de afeitar nueva y flameada, en la región más alejada de la cabeza se le practica una pequeña herida longitudinal. La sangre se recoge con cuidado en un vaso de precipitado, tratando de que las gotas escurran por la pared interna del recipiente con el fin de que no golpeen y se rompan los glóbulos rojos. Esta sangre obtenida se deja en reposo durante 1 hr, 20 min y después, con una espátula se separa el coágulo de las paredes del vaso; después de una noche de refrigeración, por decantación se obtiene el suero, que se debe de observar de color amarillo, ya que si se observa rojo, significa que se rompieron glóbulos rojos y entonces es necesario centrifugar para clarificar el suero. El suero obtenido se conserva en congelación hasta el momento en que es utilizado. La inyección del antígeno en el cuerpo del conejo se realiza bajo un programa calendarizado, como se muestra en el cuadro siguiente:

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Programa para la inmunización del conejo en contra de una bacteria específica. Fecha ------------------A los 3 días A los 2 días A los 2 días A los 3 días A los 8 días A los 5 días

Volumen del antígeno a inyectar 0.1 mL 0.2 mL 0.3 mL 0.5 mL 0.5 mL 1.0 mL 2.0 mL

observaciones Intravenosa en la oreja Intravenosa en la oreja Intravenosa en la oreja Intravenosa en la oreja Músculo de la pata Músculo de la pata Músculo de la pata

Cuando se inyecta 1.0 mL en el músculo de la pata, el antígeno se puede mezclar con un coadyuvante (sustancia a base de aceite, más compuestos con fuerte capacidad antigénica, que puede ser de bacilos tuberculosos muertos o atenuados). PRUEBA DE AGLUTINAMIENTO O TÍTULO DEL ANTISUERO Los conejos, al igual que otros animales, producen anticuerpos en contra de sustancias o microorganismos extraños que penetran a su cuerpo. Para demostrar la presencia de anticuerpos en la sangre. Al conjugarse el antígeno con el anticuerpo se forman agregados de alto peso molecular que se precipitan y se agregan en el fondo de tubos de ensayo. Después de tres días de la última inyección, al conejo se le extrae una pequeña cantidad de sangre, como se describió anteriormente. De esta sangre se obtiene antisuero y se realiza la titulación de la manera siguiente: Se preparan 10 tubos de ensayo con solución salina al 0.85% (dos con 0.9 mL y el resto con 0.5 mL) y se esteriliza con presión y calor húmedo. A un tubo con 0.9 mL con solución salina se le agrega 0.1 mL de antisuero, para que la dilución quede 1:10. Después de agitar perfectamente, de esta primera dilución se toma 0.5 mL y se vacían en otro tubo de ensayo con 0.5 mL de solución salina, para que quede una dilución 1:20 en este segundo tubo y así se prosigue diluyendo hasta llegar al 1:2560. Del tubo con la última dilución se desechan 0.5 mL para que todos los tubos queden con 0.5 mL de la mezcla. A cada tubo se le adicionan 0.5 mL de antígeno para aforar a 1.0 mL y se dejan en reposo en una gradilla. Nota: A otro tubo de ensayo con 0.9 mL de solución salina biológica, se le adiciona 0.1 mL del suero normal; se desechan 0.5 mL y después se le adicionan 0.5 mL del antígeno. Este es el tubo que se utilizará como testigo.

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Algunas pruebas serológicas son la aglutinación, doble difusión en agar, inmunofluorescencia, látex y ELISA. II. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS FITOPATÓGENAS. 2.1.- MORFOLOGÍA 2.1.1.- Forma.- el cuerpo de la mayoría de las especies de bacterias está constituido por una sola célula que puede variar su forma, de acuerdo con la especie: así pues, hay esféricas (cocos), elipsoidales (espirilos), bacilares (bacilos) y las de forma de coma; todas las fitopatógenas poseen su cuerpo en forma bacilar o bastón. Un grupo especial de microorganismos posee un cuerpo multicelular y filamentoso, como el de los hongos. 2.1.2.- Tamaño.- el tamaño de las células de las bacterias fitopatógenas varía de 0.6 a 4.5 micras de longitud por 0.5 a 1.0 micras de diámetro. 2.2.- ESTRUCTURA El examen microscópico de una célula bacteriana revela ciertas estructuras como: pared celular, cápsula, flagelos, pilis, membrana plasmática, citoplasma y organelos o estructuras citoplasmáticas. 2.2.1.- Pared celular.- Es la envoltura de las células procarióticas, es una estructura que le confiere rigidez a la célula, le da forma y sirve de soporte a la presión interna, la cual generalmente es de 5 a 20 atmósferas; además forma parte en la división celular y le da especialidad antigénica para la identificación. La pared celular representa el 20% del peso seco de la célula bacteriana y sus componentes químicos son: aminas, aminoácidos, ácidos teitoicos, azúcares y lípidos. 2.2.2.- Membrana citoplasmática (MC).- Situada inmediatamente después de la pared celular. Esta juega un papel importante en los procesos de biosíntesis basándose en el número de enzimas que se encuentran en su nivel; en la excreción de enzimas hidrolíticas. Además juegan un papel importantísimo en la respiración y transferencia de sustancias. Es una estructura que esta formada por capas de proteínas, lípidos y enzimas. Las bacterias Gram + tienen dos capas y las Gram – tienen cuatro. 2.2.3.- Mesosomas.- Se encuentran en la membrana citoplasmática y es un retículo que se encuentra entre la MC que limita el contenido citoplasmático y aparecen como expansiones de la misma membrana. Están relacionados directamente con el aparato nuclear de la célula bacteriana y se les atribuye que tienen función directa en la síntesis del septum transversal, o sea el que divide la célula al momento de la reproducción asexual.

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2.2.4.- Citoplasma. Está definido como un HIDROGEL COLOIDAL, es un fluido que contiene sustancias disueltas y partículas en suspensión como los ribosomas. El 80% del citoplasma corresponde a agua y el resto lo componen ácidos nucleicos (AN), proteínas, carbohidratos, lípidos, iones orgánicos, compuestos de bajo peso molecular y partículas diversas. En este fluido espeso ocurren muchas reacciones químicas tales como la síntesis del material celular a partir de los nutrientes (anabolismo). El pH del citoplasma es de 7.0 y 7.5 (neutro). Además de los ribosomas, el citoplasma contiene: el material nuclear (núcleo), sustancias de reserva (gránulos) y pequeños órganos especializados. 2.2.5.- Ribosomas.- Son partículas o pequeñas granulaciones esféricas que se encuentran libres en el citoplasma o bien asociados a la parte interna de la MC. Los ribosomas están compuestos aproximadamente en un 60% de ARN y un 40% de proteínas. En los ribosomas se lleva a cabo la biosíntesis de proteínas. 2.2.6.- Granulaciones o sustancias de reserva del citoplasma.- Las bacterias pueden acumular materiales orgánicos e inorgánicos en el citoplasma y constituyen reserva de energía; cuando estas sustancias llegan a acumularse en una cantidad suficiente, forman lo que se llama granulaciones. Cada grupo o especie de bacteria sintetiza una sola categoría de sustancias y ésta puede ser: almidón, glucógeno, sustancias carbonatadas y Nitrógeno.

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ESTRUCTURA CELULAR DE UNA BACTERIA FITOPATÓGENA 2.2.7.- Material nuclear (Nucleoide).- Las células procarióticas (bacterias) no poseen una membrana que englobe al núcleo. El material nuclear ocupa la zona central de la célula y parece estar unido a los mesosomas. Este material nuclear llamado nucleoide esta formado por un único cromosoma circular. Es el portador del material genético (herencia). Como se mencionó anteriormente el aparato nuclear tiene un solo cromosoma y este cuerpo cromosomático tiene una estructura fibrilar que está constituida exclusivamente de ADN y, el mensajero del ADN es transmitido bajo formas de ARN mensajero, que luego va a transformarse en secuencias polipéctidas que formarán las proteínas de estructura o bien las enzimas. 2.2.8.- Plásmidos.- Son fragmentos extracromosomáticos de ADN. Son portadores de la variación genética (resistencia). 2.2.9.- Elementos inconstantes en las bacterias.- Existen estructuras que solo están presentes en ciertos grupos o especies de bacterias como lo son: 2.2.9.1.- Cápsula.- es un material mucilaginoso que rodea a la pared celular, protege a las células contra la desecación (deshidratación) y fagocitosis; también se cree

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que está involucrada con la patogenicidad, ya que algunos mutantes avirulentos carecen de este mucílago; además le da adherencia a la célula y sirve de reserva de carbohidratos 2.2.9.2.- Flagelos.- Son estructuras en forma filamentosa compuestas por proteínas (flagelina) y 14 aminoácidos (queratomicina del flagelo). Miden aproximadamente tres veces la longitud de la célula bacteriana. Su función es darle movimiento a la célula y funcionar como estructuras quimiorreceptoras. 2.2.9.3.- Pilis o fimbrias.- Son estructuras que se encuentran distribuidas en gran cantidad alrededor de la célula bacteriana. A diferencia de los flagelos, son cortas, quebradizas y contienen una proteína que se llama “pilina”. Generalmente se encuentran con mayor frecuencia en las bacterias Gram – y son más raras en las Gram +. Se consideran de importancia en la fusión, al momento de la conjugación bacteriana (paso de plásmidos a través del pili de una célula a otra) y le da adherencia a la célula.

III. FISIOLOGÍA BACTERIANA. 3.1.- NUTRICIÓN BACTERIANA. Una de las características que hace importante a las bacterias es su rápida reproducción y por esto LA NUTRICIÓN BACTERIANA debe de estar completada con dos tipos de sustancias: Sustancias elementales.- Es decir, los materiales constitutivos de la célula, como son: C, N, O, H y en menor proporción sustancias minerales y sustancias orgánicas (Ca, K, Mg y P). Estos constituyentes permiten a las células bacterianas elaborar sus propios alimentos. Para estudiar la nutrición de las bacterias es necesario analizar las necesidades elementales y energéticas necesarias para su crecimiento, al igual que los factores físicos y químicos que la condicionan, ya que las bacterias se multiplican a partir de los alimentos o nutrientes presentes en los medios de cultivo. Las bacterias siempre tienen un número de necesidades comunes, como son las necesidades elementales (N, H2O, fuentes de energía) y otros que son capaces de utilizar ciertos elementos, requieren de sustancias orgánicas que son capaces de sintetizar, por ejemplo, los aminoácidos, vitaminas, bases puricas y pirimídicas y éstos son los que conocemos como FACTORES DE CRECIMIENTO. Entre los aminoácidos están: lisina, ácido glutámico, arginina y el triptofano, mientras que en las vitaminas están: riboflavina y el ácido pantoténico. Intervienen también en la nutrición y el crecimiento de los FACTORES FÍSICOS, los cuales pueden impedir, inhibir o bien acelerar la nutrición y dentro de estos factores tenemos: temperatura, pH y O2.

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Temperatura.- Ya que el proceso de desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas y la velocidad con que se efectúan estas reacciones es influida por la temperatura, el patrón de desarrollo bacteriano puede ser influido profundamente por esta condición. La temperatura puede, en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microorganismos. Las variaciones en la temperatura también pueden influir en los procesos metabólicos y en la morfología celular. Cada especie de bacterias crece a temperaturas que están dentro de ciertos límites. De acuerdo a las necesidades de temperatura para la nutrición y crecimiento las bacterias se pueden dividir en los siguientes grupos: Psicrófilas: Capaces de desarrollarse a 0° C o menos, aunque crecen mejor a temperaturas superiores, cercanas a 15 o 20° C. Mesófilas: Crecen mejor en límites de temperatura que va de 25 a 40° C. Termófilas: Crecen mejor entre 45 y 60° C. Los límites de desarrollo de algunas bacterias termófilas se extienden a la región mesofílica. A estas especies se les conoce como termófilas facultativas o euritermófilas. Otras que pertenecen a las termófilas crecen mejor a temperaturas superiores a los 60° C y no se desarrollan a temperaturas que están en la región mesofílica. Estas especies se denominan termófilas verdaderas, termófilas obligatorias o estenotermófilas. La temperatura de incubación que permite a las bacterias el desarrollo bacteriano en un período corto (12 a 24 hrs) se llama temperatura óptima de crecimiento. Aunque cabe señalar que la temperatura óptima de crecimiento así definida, puede no serlo para otras actividades celulares. Gases.- Los gases principales que afectan el desarrollo bacteriano, son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre, y sobre esta base se dividen en cuatro grupos: Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre. Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñísimas cantidades de oxígeno libre. pH.- En la mayor parte de las bacterias el pH óptimo de crecimiento está entre 6.5 y 7.5, aunque algunas bacterias pueden desarrollarse a pH extremo, en la mayor parte de las especies los límites mínimos y máximos corresponden a cualquier punto entre pH 4 y 9, en cuanto a necesidades de pH hay bacterias: Acidófilas: se desarrollan en pH ácido (< 7). Basófilas: se desarrollan en pH alcalino (> 7.5). Neutrófilas: se desarrollan en pH neutro (7).

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IV.- PROCESOS FITOBACTERIAS.

DE

COMPATIBILIDAD

E

INFECCIÓN

DE

LAS

Los agentes cambiantes de enfermedad son muy cambiantes porque sus poblaciones genéticamente no son estables ni uniformes, de ahí que cultivos de plantas resistentes a una raza de un patógeno, con el tiempo llegan a perder su resistencia. La mayoría de las plantas son resistentes al ataque de la mayoría de los patógenos vegetales. En la naturaleza es muy frecuente que las plantas sean atacadas por parásitos y aún así la mayoría de éstas permanecen sanas, o sea que los microorganismos no llegan a inducirles enfermedad; lo anterior indica que la resistencia es la regla o la generalidad y la enfermedad es la excepción. Aún cuando muchos microorganismos potencialmente fitoparásitos llegan a estar en contacto con su hospedante, no le pueden inducir enfermedad, porque para que esto suceda debe de existir una relación genética, fisiológica y específica entre los dos, que le permita al patógeno ser aceptado por las células hospedantes. Lo anterior se da siempre y cuando las condiciones del ambiente favorezcan esa relación. Las plantas influyen sobre los parásitos en forma física y química. Cuando en las hojas existe mucha cera y esta es de calidad, el agua de rocío o de lluvia resbala impidiendo que se presente una película de humedad que favorezca el establecimiento preintroductorio del parásito; lo anterior es un ejemplo de influencia física. La influencia química se da de muchas formas, como ejemplo se puede mencionar la producción y exudado de sustancias (aminoácidos, azúcares, vitaminas, toxinas, etc.) ya sea por las raíces o partes aéreas de las plantas que favorecen o desfavorecen al microorganismo; en ocasiones estos exudados son tóxicos para algunos microorganismos y para otros no, otras veces inhiben la germinación de estructuras de resistencia del parásito o actúan como atrayentes o repelentes de los mismos. Las células bacterianas individuales son muy frágiles y están desprotegidas, por lo tanto deben de encontrar con rapidez un ambiente propicio para su proliferación y así evitar la muerte. Los requerimientos inmediatos son alta humedad relativa y un sustrato nutricional adecuado; aunque una nutrición mínima y alta humedad relativa con frecuencia son suficientes para establecer la infección, la temperatura óptima y la presencia de ciertos factores de crecimiento aumentan la velocidad de proliferación. Los procesos de infección incluyen: Migración de la bacteria desde el lugar de multiplicación o sobrevivencia hasta el hospedante. Reconocimiento y contacto de la bacteria con su hospedante. Penetración y establecimiento de la bacteria en los tejidos hospedantes. Ya que el patógeno se ha establecido en el hospedante, los procesos de infección terminan y a este momento se le considera como el tiempo en que se inicia la fase logarítmica de la división celular.

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4.1.- INOCULACIÓN. La inoculación es el proceso mediante el cual entran en contacto, el patógeno (en este caso una especie de bacteria) con la planta hospedante. Las bacterias pueden migrar desde el sitio de hibernación o desde su fuente de multiplicación por medios propios o auxiliada por otros agentes como el agua, los insectos, el hombre, el viento, entre otros. Las bacterias en el suelo se pueden tener en contacto accidentalmente con las raíces como consecuencia del crecimiento radical, sin embargo el contacto se da más bien como resultado de la locomoción del microorganismo en suelos microcapilares; la migración no es un movimiento al azar, sino una respuesta a estímulos que se originan en el hospedante. Los flagelos, además de proporcionar locomoción a las células bacterianas, capacitan al patógeno para recibir el estímulo y tomar contacto con su hospedante para causarle infección. Las bacterias fitopatógenas son capaces de seguir un gradiente de concentración químico. La atracción de los patógenos es hacia sustancias o soluciones aminoácidos, azúcares, nucleótidos y vitaminas. Los fluidos que emanan de aberturas naturales (gutación) de las plantas presentan altos contenidos de aminoácidos (arginina y metonina) y carbohidratos (ribosa, arabinosa, glucosa), por lo que ejercen fuerte atracción hacia las células bacterianas. El reconocimiento es un requisito universal de sobrevivencia y se da entre los dos organismos participantes. En este caso particular el patógeno reconoce los estímulos o las sustancias y la topografía del hospedante. Según Sequéira, el reconocimiento es un evento temprano específico que (induce) dispara una rápida respuesta en el hospedante, ya sea facilitando o impidiendo el crecimiento del patógeno. El reconocimiento se establece mediante superficie de dos organismos que se ponen en contacto (esto último es la Teoría de Moléculas Complementaria), en la pared celular o en la membrana citoplasmática de las células del hospedante pueden estar presentes proteínas o glicoproteínas que se reconocen con los carbohidratos del patógeno. Esta complementariedad manda una señal que llega a los organelos de la célula hospedante y se da una respuesta (reacciones) que puede ser positiva (se acepta el patógeno y la enfermedad se desarrolla) o negativa (opuesta al patógeno y se disparan los mecanismos de defensa) y se forman barreras estructurales o barreras químicas. 4.2.- PENETRACIÓN. Para que las bacterias causen infección en plantas hospedantes susceptibles, se requiere que primero penetren a los tejidos y tomen contacto con las sustancias que ellas necesitan para su desarrollo y multiplicación. En casos excepcionales, algunas bacterias no necesitan penetrar para llegar a causar indirectamente daño en plantas, esto es cuando el microorganismo se desarrolla y produce sustancias como desecho de su metabolismo cerca de órganos vegetales como la raíz, dichas sustancias son absorbidas por las planta y entonces le pueden provocar toxicidad. Se requiere de una película de agua sobre los órganos del vegetal para que las bacterias puedan nadar y llegar a los sitios específicos de penetración. Esta humedad se 16

proporciona por lluvia, rocío, riego, liberación natural de agua por las aberturas naturales de las plantas y por el escape de agua por heridas producidas por agentes extraños. Además de la humedad, también el sustrato nutricional adecuado y una temperatura apropiada favorecen la penetración de las bacterias. Las bacterias tienen que penetrar rápidamente en sus hospedantes por que al no tener capacidad de producir estructuras de resistencia, las células bacterianas se desecan con facilidad y en poco tiempo, en la superficie de los órganos de las plantas. Las bacterias no desarrollan órganos o estructuras especiales para romper las barreras estructurales de las plantas y así penetrar directamente, como lo hacen la mayoría de los hongos, las plantas superiores parásitas de otras plantas y los nemátodos; tampoco producen sustancias que lleguen a desdoblar las ceras cuticulares y las cutinas presentes en la cutícula de las plantas. Por tales razones las bacterias utilizan las aberturas naturales que tienen las plantas y las heridas que se producen por diversos factores o agentes para introducirse en los tejidos hospedantes. 4.2.1.- PENETRACIÓN POR ABERTURAS NATURALES. Las plantas presentan una variedad de aberturas naturales para realizar algunas de sus funciones esenciales como es la transpiración, intercambio de gases, eliminación de exceso de agua o de sustancias nocivas, secreción de néctar, entre otras. Estas aberturas son los estomas, que se localizan en las hojas, tallos, raíces y tubérculos en sustitución de los estomas: axilas de hojas, pecíolos, etc.; y los hidátodos, que están presentes en los bordes o ápices de las hojas o lóbulos, o bien en las puntas de prolongaciones piliformes. Penetración por estomas.- Los estomas son diminutas aberturas que se localizan en la epidermis de los órganos verdes de las plantas, regulan la transpiración y el intercambio de gases con el ambiente. Al ser las hojas los órganos más expuestos de las plantas, los estomas son orificios que las bacterias utilizan con frecuencia para penetrar a los tejidos vegetales, principalmente cuando se presentan lluvias o rocío que elevan la humedad relativa del ambiente. La bacteria Pseudomonas syringae pv. tabaci (P. tabaci) que causa la enfermedad conocida como “quemazón” o “fuego silvestre” del tabaco y soya, penetra por estomas aunque también puede penetrar por hidátodos y por heridas producidas por insectos y otros agentes. Otras bacterias que pueden penetrar por estomas son: Xanthomonas campestris pv. citri (X. citri), cáncer bacteriano de los cítricos; P. syringae pv. phaseolicola (P. phaseolicola), tizón del halo del Frijol; X. campestris pv. phaseoli (X. phaseoli), tizón común del Frijol; X. campestris pv. vesicatoria (X. vesicatoria), mancha bacteriana del tomate y chile, y muchas otras especies más. Penetración por lenticelas.- Las lenticelas son protuberancias visibles a simple vista, tienen una abertura en forma de lenteja y se localizan en la corteza de las plantas leñosas para reemplazar a los estomas de la desaparecida epidermis. Las plantas utilizan las lenticelas para el intercambio de gases. Durante el desarrollo de las lenticelas en la corteza 17

se producen grietas o fisuras que son invadidas por algunas bacterias, antes de presentarse la suberización, para así introducirse en los tejidos de las plantas. Aun cuando las siguientes bacterias y otras muchas pueden penetrar de otra forma, aprovechan las lenticelas para introducirse a tallo y tubérculos: P. syringae pv. tabaci (P. tabaci); Erwinia carotovora pv. carotovora (E. carotovora), pudriciones blandas de órganos carnosos; Erwinia carotovora pv. atroseptica (E. atroseptica), pudriciones blandas y pierna negra o pié negro de la papa; E. amylovora, tizón del fuego del peral y manzano. Penetración por nectarios.- Los nectarios son órganos con abertura que secretan néctar y pueden ser florales o extraflorales. Algunas bacterias como Erwinia amylovora, P. syringae pv. syringae (P. syringae), cáncer bacteriano y gomosis de árboles de fruto de hueso respectivamente, utilizan los nectarios para introducirse a las plantas y causar infección. Penetración por hidátodos.- Los hidátodos son órganos secretores foliares que segregan soluciones acuosas muy diluidas. Se localizan en el ápice de algunas vellosidades o de las nervaduras de las hojas. Por los hidátodos se realiza la gutación. Por la mañana cuando sale el sol, el agua expulsada por gutación puede ser absorbida por los hidátodos y si en estas gotas de agua se han depositado algunas células bacterianas, también son introducidas a las plantas. Xanthomonas campestris pv. oryzae (X. oryzae), tizón bacteriano del arroz; y Xanthomonas campestris pv. campestris (X. campestris), pudrición negra de las crucíferas, se introduce a las plantas por los hidátodos. Penetración por la base de los pelos glandulares.- Los tricomas son proyecciones epidermales de diferente forma y función, uni o multicelulares, muy frágiles y que pueden secretar algunas sustancias o humedad, factores que favorecen la sobrevivencia de algunas bacterias durante condiciones secas. Clavibacter michiganense pv. michiganense, cancer bacteriano del tomate; y P. syringae pv. tomato (P. tomato), peca bacteriana del tomate, son favorecidas por las secreciones de tricomas y probablemente penetran por la base de los mismos. 4.2.2.- PENETRACIÓN POR HERIDAS. Algunas bacterias dependen de heridas practicadas por diferentes agentes como el granizo, tormentas de polvo, lluvias, descargas eléctricas, implementos agrícolas, desarrollo de raíces secundarias, insectos, etc., para poder penetrar a los tejidos hospedantes. Después de que se practica una herida en la planta, ésta se suberiza con rapidez; las bacterias deben de coincidir con la herida antes de que se realice la suberización para llegar a penetrar. Agrobacterium tumefaciens, agallas de la corona de muchas plantas, solo penetran por heridas y después de que se presentan reacciones de acondicionamiento del tejido hospedante que favorecen a la bacteria, esto es normalmente después de ocho horas de que se practica la herida.

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Las Erwinias del grupo carotovora, pudriciones blandas, penetran por heridas, lo mismo que Clavibacter sepedonicum, pudrición anular de la papa; X. campestris pv. campestris (X. campestris), pudrición negra de las crucíferas; P. syringae pv. syringae (P. syringae), cáncer bacteriano y gomosis de árboles de fruto de hueso; y Clavibacter michiganense pv. michiganense, cancer bacteriano del tomate. Erwinia tracheiphila, marchitez bacteriana de las cucurbitáceas; y Erwinia stewartii, marchitez bacteriana del maíz; se introducen por las heridas practicadas por los insectos vectores como Acalymma vittata (escarabajo rayado de las cucurbitáceas) y Diabrotica undecimpunctata (diabrótica) para la primer bacteria y Chaetocnema pulicularia (pulga saltona del maíz) para la segunda. Rhizobium spp., la bacteria vive en simbiosis con las leguminosas, penetra a la raíz a través de las heridas que se practican cuando se están desarrollando raíces secundarias. 4.3.- INVASIÓN, INFECCIÓN Y PATOGÉNESIS. 4.3.1.- INVASIÓN. Después de que se ha presentado la penetración en el hospedante, a las bacterias se les puede localizar intercelular, intravascular o intracelularmente. Los patógenos invaden a sus hospedantes de manera distinta y a diferentes niveles; las bacterias que invaden intercelularmente los tejidos, también se pueden desarrollar intracelularmente al disolver los constituyentes de la pared celular, mientras que las bacterias que ocasionan marchitamiento vascular (invasión del floema) también pueden invadir a los vasos del xilema. Muchas infecciones causadas por bacterias son locales, o sea que comprenden a una sola célula, a unas cuantas células o a una pequeña zona de la planta y se mantienen localizadas durante toda la estación de crecimiento, aunque a veces se pueden extender ligeramente y a un ritmo también lento. Otras infecciones se propagan más o menos con cierta rapidez y se pueden extender a todo un órgano de la planta (flor, hoja, fruto, etc.) o incluso llegar a infectar a la planta completa. 4.3.2.- INFECCIÓN Y PATOGÉNESIS. Patogenicidad es la habilidad de un agente para generar una enfermedad; mientras que virulencia es el grado de patogenicidad que presenta el mismo agente. La infección se entiende como el establecimiento de la asociación entre el patógeno y las células y tejidos de la planta hospedante. La infestación es la introducción del patógeno en el ambiente hospedante. La patogénesis es el proceso de inducción de la enfermedad, o sea una serie de eventos que van desde la infección hasta el desarrollo del patógeno dentro de la planta y subsecuente producción de síntomas; la patogénesis trata del proceso de la enfermedad donde se estudian los mecanismos que utilizan la bacterias para causar infecciones y las reacciones fisiológicas, bioquímicas y estructurales que una planta lleva a cabo en respuesta al daño que le causa un agente extraño.

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En primeros estadíos de la enfermedad es raro que las bacterias lleguen al interior de las células vivas, ya que primero tienen que atravesar las paredes celulares que funcionan como una barrera física; por esta razón las bacterias fitopatógenas primero son intercelulares y después intracelulares. Aparentemente existen tipos específicos donde se une la bacteria con la planta; las bacterias aparentemente, reconocen estos sitios específicos para la unión, que se localizan en la pared celular (si los sitios específicos de reconocimiento llegaran a ser ocupados por cepas avirulentas de bacterias, después las cepas virulentas ya no pueden establecerse y por lo tanto la infección tampoco se realiza). El número de células bacterianas que se requieren para que una infección se inicie es variable y depende de la especie de bacteria que se trate, por ejemplo, si se introduce una sola célula de Agrobacterium tumefaciens en una planta, se forma un pequeño tumorcito, pero si se introducen 100 células el tumor es mucho mayor; para que se desarrolle una infección sistemática y se cause un daño severo en manzano por E. amylovora, se requieren de 150 a 200 células bacterianas, pero si el número es menor sólo se producen daños localizados. Para penetrar las paredes celulares y causar infección las bacterias producen enzimas, toxinas, polisacáridos y sustancias hormonales. Estas sustancias son las responsables directas de las alteraciones de los procesos fisiológicos del hospedante y que resultan en la manifestación de la enfermedad. Influyen en la germinación de las semillas, interfieren en el desarrollo de la raíz y en la absorción de agua y nutrientes, en el transporte de agua y translocación de alimentos, reducen la fotosíntesis, alteran los procesos de reproducción de las plantas, destruyen el material de reserva y alteran la integridad estructural de los tejidos. 4.3.2.1.- Enzimas.- Son sustancias (proteínas) que catalizan las reacciones bioquímicas de las células vivas. La actividad enzimática está asociada con la patogenicidad de los microorganismos. Las bacterias producen gran variedad de enzimas, tanto in vitro como in vivo y el establecimiento de la infección parece depender de la compatibilidad del hospedante con la bacteria, lo cual induce la producción de enzimas por parte del patógeno. Aunque las cepas virulentas como avirulentas de bacterias tienen la capacidad de producir enzimas, la actividad enzimática de las primeras es mucho mayor. Se ha demostrado que las bacterias fitopatógenas pueden producir enzimas pectolíticas, celulolíticas, proteolíticas y/o amilolíticas. Enzimas pectolíticas o pécticas.- La lámina media de las células de plantas está constituida por pectinas y sustancias relacionadas, además la pared celular primaria de dichos tejidos también contiene porcentaje alto de estas sustancias. Existen especies de bacterias fitopatógenas (especies de Xanthomonas, Pseudomonas y Erwinia) que actúan sobre las sustancias pécticas degradándolas; esto ocasiona desintegración de tejidos que se manifiesta como pudrición blanda o acuosa. Las primeras células bacterianas que penetran a los tejidos se alimentan de azúcares, sales y agua presentes en los espacios intercelulares; durante este proceso son producidas enzimas pectolíticas que degradan la lámina media y la pared celular de células colindantes que se destruyen, plasmolizan y mueren sirviendo de alimento para las bacterias que así sucesivamente se siguen multiplicando; como resultado de esta actividad se presenta el aspecto húmedo y la pérdida de turgencia de los órganos atacados. 20

En los marchitamientos vasculares inducidos por bacterias se presentan varios elementos responsables del taponamiento y degradación de los tejidos de conducción. En estos casos las enzimas pectolíticas ocasionan disociación de los tejidos de conducción o de las células que rodean estos tejidos y por lo tanto están íntimamente involucradas con este tipo de enfermedades. Algunas especies de bacterias que producen enzimas pectolíticas son: Erwinia carotovora, E. amylovora, E. stewartii, Pseudomonas syringae, P. solanacearum, Clavibacter michiganense y Xanthomonas campestris. Enzimas celulolíticas o celulasas.- La celulosa es el principal componente y la base estructural de la pared celular de las plantas superiores. Las enzimas producidas por microorganismos llegan a hidrolizar la celulosa ocasionando ruptura de la pared celular y muerte de la célula. Se ha comprobado que P. solanacearum, C. michiganense, y algunas Erwinias y Xanthomonas llegan a producir este tipo de enzimas. Enzimas proteolíticas o proteasas.- las proteínas celulares son sustancias muy importantes puesto que catalizan todas las reacciones químicas que se llevan a cavo en todas las células vivas, además de que son componentes estructurales de las membranas de organelos celulares. Se ha comprobado que E. carotovora produce, además de las enzimas ya mencionadas, proteasa que son las responsables de la degradación de proteínas y del mal olor de los órganos carnosos en descomposición. Enzimas amilolíticas o amilasas.- El almidón es un polisacárido de reserva presente en algunos órganos vegetales. La mayoría de las especies de Xanthomonas tiene capacidad de producir amilasas para desdoblar el almidón y así poderlo utilizar en sus funciones metabólicas. 4.3.2.2.- Toxinas.- son productos muy tóxicos secretados por organismos. Las fitotoxinas bacterianas son compuestos de bajo peso molecular (aunque no siempre) que afectan adversamente el metabolismo y función de la planta, ya sea hidrolizando proteínas, bloqueando sistemas enzimáticos o siendo antagónico a algunos metabolitos esenciales, lo cual repercute en la muerte de células (pueden actuar directamente sobre el protoplasma o alterar el metabolismo del citoplasma o del núcleo); no son enzimas, ni hormonas o ácido nucleico, ni afectan la integridad estructural de la pared celular; son móviles en la planta y activas en concentraciones muy bajas. Considerando el rango de hospedantes, existen dos tipos de toxinas: las toxinas de hospedantes específicos y las toxinas de amplio rango de hospedantes o de hospedantes no específicos. Toxinas de hospedantes específicos.- Compuestos tóxicos sólo para el hospedante del patógeno que las produce. Al ser determinantes primarios de patogenicidad, la virulencia del patógeno varía de acuerdo a la capacidad que tiene para producir la toxina. El patógeno produce la toxina en el hospedante susceptible y los síntomas inducidos por ésta son los característicos de la enfermedad. E. amylovora produce Amilovorina, la cual al ser inyectada sólo llega a inducir marchitez y plasmólisis.

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Toxinas de hospedantes no específicos.- Son compuestos tóxicos para el hospedante de la bacteria y para otras plantas no hospedantes de la bacteria, aunque en algunos hospedantes la bacteria no produce la toxina. Son determinantes secundarios de patogenicidad, por lo que no provocan la totalidad de los síntomas que el patógeno llega a inducir en el hospedante, o sea que la toxina no influye en el establecimiento del patógeno, aunque induce algunos síntomas del síndrome total de la enfermedad. Se dividen en exotoxinas, son toxinas extracelulares o sea que son liberadas fuera de la pared celular de la bacteria, y en endotoxinas, son toxinas que se liberan de la célula bacteriana hasta que esta muere o es dañada. Las toxinas de hospedantes no específicos pueden producir manchas cloróticas, halos cloróticos y marchitez. Algunos ejemplos de este tipo de toxinas son: Tabtoxina producida por P. tabaci (halo clorótico); Faseolotoxina producida por P. phaseolicola (halo clorótico); Tagetitoxina producida por P. tagetis (evita la formación de cloroplastos); Siringomicina SR producida por P. syringae (cancro en órganos frutales y provoca tiro de munición aún sin estar presente la bacteria). 4.3.2.3.- Polisacáridos.- Los polisacáridos son sustancias complejas o combinaciones orgánicas del tipo de la glucosa y que por hidrólisis dan glucosas; también se incluyen en este grupo los polialcoholes relacionados con la glucosa. Las células bacterianas producen polisacáridos extracelulares que quedan libres o se acumulan alrededor de su pared formando su cápsula. Estos polisacáridos aparentemente juegan un importante papel en la patogenicidad; algunas evidencias claras que respaldan lo anterior son ciertas cepas de E. amylovora (patógeno de tizón de fuego del peral y manzano) y de P. solanacearum (patógeno de marchitez o vaquita de la papa) encontradas por algunos investigadores, los cuales no presentan polisacáridos extracelulares (cápsula) y son completamente avirulentas. Aparentemente los polisacáridos son supresores de los mecanismos de defensa del hospedante, aunque también ocasionan daños físicos al participar en el taponamiento de tejidos de conducción. E. amylovora produce un polisacárido que por si solo causa marchitamiento y plasmólisis de células del parénquima del xilema. Otras especies que producen polisacáridos asociados con la patogenicidad son: Clavibacter sepedonicum (pudrición anular de la papa), C. insidiosum (marchitez de ramas de alfalfa), C. michiganense, P. solanacearum, X. phaseoli, entre otras. 4.3.2.4.- Reguladores de crecimiento.- Los reguladores de crecimiento (RC) son compuestos hormonales comunes que controlan el crecimiento de las plantas. Los más importantes son las auxinas, las giberalinas y las citocininas, aunque el etileno y los inhibidores de crecimiento también realizan importantes funciones de control durante el desarrollo de una planta. Los RC actúan a concentraciones muy bajas por lo que también variaciones pequeñas de concentración normal desencadenan anormalidades en el crecimiento de las plantas. Los microorganismos fitopatógenos pueden producir RC, sustancias que inhiben o estimulan la producción de RC en la planta y sustancias que actúan de manera similar a los RC. Con esto los patógenos inducen desequilibrios en el sistema hormonal de las plantas produciéndose crecimientos anormales como achaparramiento, crecimiento excesivo, arrocetado, deformación de tallos, epinastia de hojas, defoliación, inhibición del desarrollo o crecimiento de yemas, etc.

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A).- Auxinas.- (Ácido indol acético – AIA-).- Actúan en la elongación celular, diferenciación celular, afectan la impermeabilidad de la membrana celular, aumentan la respiración de los tejidos y promueven la síntesis de ARN mensajero y así la síntesis de enzimas y proteínas estructurales. Los microorganismos patógenos pueden aumentar los niveles de AIA, aunque algunos los disminuyen. Pseudomonas solanacearum induce el aumento del 100% de AIA en plantas atacadas por lo que se afecta la permeabilidad de las membranas celulares y por consiguiente se aumenta la transpiración y se presenta marchitamiento. Agrobacterium tumefaciens (agalla de la corona de muchas plantas) provoca un estímulo conocido como principio de inducción al tumor (PIT) que transforma a las células vegetales normales en tumorales; las células tumorales tienen alta cantidad de AIA y citocininas producidas por ellas mismas y por las células bacterianas. B).- Citocininas.- Son necesarias para la diferenciación y crecimiento celular, promueven la inhibición de la senescencia y dirigen el flujo de aminoácidos y otros nutrientes por toda la planta. La actividad de las citocininas aumenta en las células de la agalla de la corona y la fascinación o agalla foliar ocasionada por Clavibacter fascinas, en muchas plantas se debe parte de una citosina. Entre los efectos del etileno en las plantas se incluye la abscisión de las hojas, la epinastia y la maduración de los frutos. Especies de los géneros de Pseudomonas, Xanthomonas y Erwinia producen etileno. Se ha comprobado que el contenido de etileno aumenta en plantas de plátano cuando son atacadas por P. solanacearum y esto se manifiesta en el amarillamiento prematuro de frutos. 4.4.- REPRODUCCIÓN. Aunque en las bacterias se pueden dar procesos primitivos de reproducción sexual (conjugación e intercambio de material genético entre células), realmente la única forma de multiplicación de estos organismos es asexualmente por “fisión binaria” o “bipartición”. Durante el proceso de división de la célula, primero se presenta crecimiento de la membrana citoplasmática de las orillas hacia el centro para dividir el citoplasma en dos. Después se produce la pared celular y finalmente se separan dos células hijas. Bajo condiciones favorables la multiplicación es muy rápida y las divisiones se realizan cada 20 minutos; sin embargo la velocidad de reproducción no es constante y con el paso del tiempo se va haciendo más lenta, hasta que finalmente se detiene. Lo anterior se presenta porque disminuye el alimento, se acumulan entre las colonias desechos de la actividad metabólica de las mismas células y porque se presentan otros factores limitantes. 4.5.- DISEMINACIÓN. La dispersión de las bacterias puede ser a distancias muy cortas, en donde se desplazan por si solas con la ayuda de sus flagelos, o a distancias mayores, para lo cual requieren la participación de otros agentes como el agua de riego, lluvia, brisa, rocíos, viento, el hombre, insectos, entre otros. La lluvia distribuye las bacterias de una planta a otra, de un órgano a otro, o del suelo a los órganos del vegetal con su efecto de salpique; el agua de riego o lluvia, también acarrea bacterias de un área a otra a través del suelo. Los 23

insectos pueden llevar bacterias de unas plantas a otras incluso introducirlas en el vegetal; en algunos casos, las bacterias dependen de los insectos para sobrevivir y diseminarse. Se conocen 77 insectos que pueden transmitir bacterias. Algunos solo las transportan externamente, otros lo hacen internamente, mientras que en otros puede presentarse multiplicación del patógeno en su interior, o incluso manifestarse cierta alteración del insecto, como es el caso de la mosca Dacus oleae, que transmite a P. savastanoi (agalla del olivo) la cual le induce tumores en el tracto digestivo y vagina. E. tracheiphila y E. stewartii son diseminadas por el escarabajo rayado de las cucurbitáceas (Acalyma vittata) y diabróticas (Diabrotica undecimpunctata), la primer bacteria y por la pulga saltona del maíz (Chaetocnema pulicularia), la segunda. Tambien E. amylovora se dispersa por las abejas que visitan las flores de las plantas enfermas. E. chrysanthemi cuando hay daños mecánicos en frutos de piña, ocasiona pudrición blanda; las hormigas son agentes importantes en la dispersión de esta bacteria. El hombre disemina todo tipo de patógenos a distancias variables y de muchas formas; disemina bacterias cuando manipula plantas enfermas y sanas, las transporta en tierra que arrastra en sus pies, herramientas e implementos agrícolas, las dispersa en semillas, plántulas de viveros, yemas, estacas, tubérculos, etc. El viento arrastra polvo y en ocasiones restos de plantas los cuales pueden transportar células de bacterias fitopatógenas para así dispersarlas en una región. Otra forma de dispersión de las bacterias puede ser el polen. 4.6.- SUPERVIVENCIA. Las bacterias fitopatógenas, con la excepción de las especies de bacterias que atacan plantas perennes, permanecen parte de su vida en la planta como parásitas y parte en el suelo o restos vegetales como saprófitas. El suelo les proporciona protección y nutrientes cuando el hospedante está ausente; sin embargo muchas especies reducen sus poblaciones cuando se encuentran en estas condiciones. La mayoría de las bacterias fitopatógenas no producen estructuras de resistencia, así es que sobreviven en los órganos afectados del vegetal o en forma libre o saprófitas, o cubiertas con un mucílago natural que las protege de factores adversos, o en el interior de insectos. A las bacterias se les encuentra en una amplia variedad de sitios en la proximidad de sus hospedantes. Aunque están cubiertas por la cápsula, no están protegidas por una pared tan resistente como las de las esporas, por lo tanto son sensibles a los rayos actínicos (luminosos) del sol y para sobrevivir necesitan encontrar un ambiente propicio que incluya alta humedad (cercana al 100%), nutrición adecuada y temperatura entre 24 a 30 °C. Las bacterias que infectan plantas perennes sobreviven en tiempos favorables en el interior de sus hospedantes. Las bacterias fitopatógenas en las plantas hospedantes se desarrollan como parásitos y en el suelo sobreviven como saprófitos. El suelo sirve como reservorio de bacterias, sin embargo la persistencia de las mismas en ellos depende de la velocidad a la que son descompuestos los rastrojos del cultivo en los que se encuentran. Algunas bacterias como E. amylovora incrementan su población en sus hospedantes, pero en el suelo disminuye con 24

rapidez por que han perdido capacidad de sobrevivencia en el suelo. X. phaseoli var. fuscans en el suelo su población desaparece en cuatro semanas. Otras, como A. tumefaciens, que también incrementa su población en la planta hospedante, al llegar al suelo, dicha población también disminuye aunque en forma gradual y se ha determinado que llega a permanecer en el suelo hasta 40 años en ausencia de las plantas que sean hospedantes. Las Erwinias y Pseudomonas causantes de pudriciones blandas, pueden incrementar su población en el suelo. E. chrysanthemi no llega a sobrevivir por fuera de los tejidos de su hospedante más de 14 días en condiciones tropicales, en cambio inverna en el tracto digestivo de las hormigas que la diseminan, dentro de las plantas y en el suelo. P. syringae pv. tomato (peca bacteriana del tomate) puede sobrevivir en ambientes calientes y secos como residente de las hojas hasta que se presenta humedad y temperatura que le favorezcan, entonces la población bacteriana se multiplica y la infección se desarrolla. Algunas especies de Clavibacter pueden mantenerse vivas en semillas entre 8 a 24 años. P. solanacearum sobrevive en el suelo en la superficie externa de tubérculos y en semillas de tabaco. X. vesicatoria sobrevive en el suelo y en la semilla. V. DESCRIPCIÓN DE LOS PRINCIPALES GÉNEROS DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS Y SUS ESPECIES DE IMPORTANCIA ECONÓMICA. La taxonomía de los organismos se basa principalmente en las características morfológicas que presentan. En las bacterias es difícil utilizar este criterio porque presentan un tamaño reducido, carecen de diferenciación y existen muy pocos registros fósiles. La taxonomía de las bacterias se basa en datos morfológicos y fisiológicos, utilizando de preferencia estos últimos. En el pasado las bacterias se clasificaban como plantas debido a que coinciden en algunos caracteres como el requerimiento de alimento en forma soluble y a la presencia de pared celular. Sin embargo en la actualidad, las bacterias están clasificadas en un nuevo reino, el PROKARIOTAE (algunos le llaman MONERA), que incluye a los organismos que carecen de membrana nucleoplásmica. De Bergey (Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology) aceptado por los especialistas en el ramo para la clasificación de las bacterias. La separación inicial de los taxones más altos se basa en la morfología y reacción a la Tinción de Gram. Los grupos en los que se incluye a los procariontes fitopatógenos conocidos, primero se clasifican por una combinación de características morfológicas y fisiológicas; con mayor énfasis en morfología, requerimiento de oxígeno y utilización de carbohidratos para el nivel Género, mientras que la clasificación a taxones más bajos involucra características fisiológicas y bioquímicas adicionales. Las bacterias en general están clasificadas en 19 GRUPOS O PARTES, que a su vez incluyen familias, que es la Taxa más alta en la DIVISIÓN III (bacterias) del REINO PROKARIOTAE. Las bacterias fitopatógenas están incluidas en los grupos 7, 8, 17, y 19.

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Parte 7. Bacilos y cocos aerobios, Gram negativo. Familia Pseudomonadaceae Género Pseudomonas y Xanthomonas Familia Rhizobiaceae Género Rhizobium y Agrobacterium Parte 8. Bacilos anaerobias facultativas, Gram negativo Familia Enterobacteriaceae Género Erwinia Parte 15. Bacilos Gram positivo que producen endosporas. Familia Género Bacillus Parte 17. Actinomycetes y organismos relacionados, Gram positivo. Grupo Coryneforme de bacterias (Clavibacter, Streptomyces) Parte 19. Los micoplasmas (fitoplasmas) y géneros de afiliación incierta y organismos semejantes a micoplasmas (Spiroplasma). No han sido clasificadas las bacterias fastidiosas, habitantes vasculares, como la enfermedad de Pierce y la bacteria falsa del duraznero. Lista de nombres de las especies de bacterias que se han aprobado y fueron publicadas en 1980 en la octava edición del manual de De Bergey.

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LISTA APROBADA DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS GRUPO

FAMILIA

GÉNERO

ESPECIES

Gram negativo, varillas y cocos

Pseudomonadaceae

Pseudomonas

agarici, andropogonis, avenae, caricapapaya, caryophylli, cichorii, cissicola, gladioli, glumae, marginales, pseudoalcaligenes subs. cityrulli, rubrilineans, rubrisubalbicans, syringae, solanacearum, tolaasii, viridiflava albilineans, ampelina, axonopodis, campestris, fragaria. rhizogenes, rubi, tumefaciens amylovora, ananas, cancerogena, carnegieana, carotovora subs. carotovora, chrysantemi, cypripedii, carotovora subs atroseptica, dissolvens, herbicola, mallotivora, milletiae, nigrifluens, nimipressuralis, quercina, rhaponctici, rubrifaciens, salicis, stewartii, tracheiphila, uredovora. betae, beticola, fascinas, flaccumaciens, ilicis, insidiosum, michiganense, nebraskense, oortii, poinsettiae, sepedonicum. ipomeae, scabies. vaccinii citri

Xanthomonas

Gram negativo, varillas anaeróbicas facultativas

Enterobactereaceae

Agrobacterium Erwinia

Gram positivo, actinopmycetes y organismos relacionados

Ninguna

Clavibacter

Streptomycetaceae Nocardiaceae

Streptomyces Nocardia Spiroplasma

Micoplasmas y géneros de afiliación incierta

a.- Incluye muchos patovares previamente reconocidos como especies. Todas las otras especies no están incluidas debido a descripciones inadecuadas. b.- Streptomyces scabies esta listado como “especies incertae sedis” (especies no reconocidas) La mayoria de las especies de Xanthomonas y Pseudomonas se degradó a patovares (pv), designación intra específica que no requiere fundamentos de soporte, aunque muchos patovares son especies legítimas. La mencionada lista contiene solo tres especies fitopatogénicas de Pseudomonas fluorescentes, P. syringae Van Hall, P. cichorii (Swingle) Stapp y P. viridiflava (Burkholder) Dowson. Las otras Pseudomonas que aparecían en la séptima edición del manual de Bergey, están invalidadas debido a la carencia de fundamentos y se consideran patovares de P. syringae.

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GÉNEROS DE BACTERIAS RELACIONADAS CON LAS PLANTAS 5.1.- GÉNERO Erwinia Las especies del género Erwinia en plantas inducen amplio rango de síntomas, como son: marchitamientos, tizones, cancros, muerte regresiva, manchas foliares, manchas de frutos, pudriciones blandas y decoloración de tejidos de conducción. Los miembros del género Erwinia son varillas rectas de 0.5 a 1.0 x 1.0 a 3.0 micras, se les encuentra como células simples, en pares u ocasionalmente en cadenas cortas; son Gram negativo (-), mótiles (con flagelación perítrica, con excepción de E. stewartii que es átrica) y anaerobias facultativas, aunque el crecimiento anaeróbico en algunas especies es débil. La temperatura para el crecimiento óptimo es de 27 a 30 °C, y el máximo está entre 32 a arriba de 40 °C. Son fermentativas, oxidasa negativo y catalasa positivo; producen ácido de fructuosa, galactosa, glucosa y sucrosa. Sus colonias son cremosas, amarillas o crema blanquecino. La taxonomía y nomenclatura de especies de este género se ha complicado por la heterogeneidad de la población incluida en el taxón. Las Erwinias fitopatógenas se acomodan en tres grupos: Grupo “HERBÍCOLA”.- Producen un pigmento amarillo insoluble en agua y son patógenos oportunistas de plantas, animales u hombre o son epífitos no fitopatógenos. E. herbicola pv. herbicola E. herbicola pv. milletiae E. ananas py. ananas E. ananas pv. uredovora E. stewartii Grupo “CAROTOVORA”.- Comprende a las especies de Erwinia con intensa actividad pectolítica en plantas. E. carotovora pv. carotovora E. carotovora pv.atroseptica E. chrysanthemi Grupo “AMYLOVORA”.- Son bacterias sistemáticas que pueden causar marchitamiento y necrosis seca de plantas, no forman enzimas pectolíticas ni pigmentos amarillos. E. amylovora E. rhapontici E: mallotivora E. dissolvens E. salisis E. carnegieana

E. cancerogena E. pulsifaciens E. tracheiphila E. cypripedii E. quercina E. nigrifluens 28

Carácter / Grupo Pigmento amarillo soluble en agua Licuefacción de pectatos (enzimas pécticas) Ácido de lactosa Cuerpos biconvexos Simplasmata (agrupaciones en forma de salchicha)

Herbicola +

Amylovora -

Carotovora -

+

-

+ + -

5.2.- GÉNERO Pseudomonas Las especies de este grupo ocasionan enfermedades que se manifiestan con síntomas como marchitamiento, tizones, estriados y manchas foliares, pudriciones, cancros y agallas. Las células del género Pseudomonas son varillas rectas o curvas que miden 0.5 a 1.0 x 1.5 a 4.0 micras. Son aerobias, oxidativas, Gram negativo y presentan uno o más flagelos polares (monótricas, y lofótricas en su mayoría). El número de especies de Pseudomonas fitopatógenas que anteriormente se manejaban (100) fueron reducidas a 23. Las especies de Pseudomonas se dividen en dos grupos: Pseudomonas fluorescentes (Stutzeri) Pseudomonas no fluorescentes 5.2.1.- Pseudomonas fluorescentes (a su vez se dividen en dos grupos) Fluorescentes Syringae Fluorescentes P. fluorescens P. marginales P. putida P. aeruginosa P. agarici P. carica papaya P. cichorii

+ + + -

Syringae P. syringae P. toloasii P. viridiflava P. coronofaciens P. glycinea P. lachrymans P. mori P. morsorunorum P. phaseolicola P. tabaci P. tomato P. savastanoi + ++*

L= Levana O= Oxidasa P= Pudrición en Papa A= D. de Arginina T= Hipersen. En Tabaco

*Excepto P. tabaci y P. glycinea

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5.2.2.- Pseudomonas no fluorescentes. Causan pudriciones, manchas foliares, nunca marchitez. P. cissicola P. gladioli P. cepacia P. avenae (alvoprecipitans) P. amygdali P. solanacearum* P. corrugata

P. pseudoalcaligenes P. caryophylli P. rubrilineans P. woodsii P. andropogonis P. cattleyae

* Pseudomonas solanacearum no fluorescentes, pero algunos autores tampoco la incluyen en las no fluorescentes y la consideran como un grupo especial. Causa marchitez de plantas y según su hospedante se clasifica en: Raza 1.- ataca papa, tomate, chile, cacahuate y tabaco. Raza 2.- ataca plátano. Raza 3.- ataca a papa, a veces tomate. Raza 4.- ataca hierba de pollo. Raza 5.- ataca mora. Las dos últimas se han encontrado recientemente en China y no se conoce gran cosa de ellas. Produce poli-beta-hidrolibutirato, es sistémica, en medio Kelman (CPG + cloruro de tretrazolio) las colonias pueden tener diferente coloración; la bacteria al atacar el tetrazodio produce farzán (pigmento rojizo). Si toda la colonia se observa rojiza, la cepa es avirulenta, si la coloración rojiza es en forma de caracol, la cepa es virulenta. No produce pudrición en papa, causa marchitez. Las colonias al crecer forman como un desplazamiento. 5.3.- GÉNERO Xanthomonas La mayoría de las especies de Xanthomonas son patógenas de plantas. Actualmente se tienen cinco especies válidas que causan diferentes enfermedades cuyos síntomas son: estrías y manchas foliares, marchitamiento, pudrición blanda, cánceres y tizones. En la especie X. campestris se han acomodado 123 patovares. Las Xanthomonas son de forma de varilla, Gram negativo, mótiles con un flagelo polar simple (tres a cinco veces más largo que la célula bacteriana), producen un pigmento amarillo (excepto X. maniotis –colonias blancas-) insoluble en agua, son oxidativas, nunca fermentativas; produce un polisacárido chicloso extracelular en medios a partir de glucosa. A veces las Erwinias se comportan igual; usualmente son de hospedantes específicos y muchas crecen lentamente en los medios artificiales.

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Las especies de Xanthomonas son: X. campestris. En esta se incluyen como patovares (pv.) el resto de las 200 especies X. ampelina X. axonopodis X. fragariae X. albilineans Para diferenciar a los cinco grupos (octavo manual de Bergey), el pigmento es muy específico – en análisis espectroscópicos como lo son los polisacáridos producidos por otras bacterias. 5.4.- GÉNERO Clavibacter Fue creado en 1896 para poder acomodar al bacilo de la difteria. Algunas especies de este género causan diversas enfermedades en las plantas cultivadas y pueden ser de mucha importancia económica. Los síntomas que llegan a inducir son marchitamiento, cánceres, pudrición, manchas de frutos y fasciación. Normalmente a cada especie se le encuentra asociada con un solo tipo de hospedante. Su morfología es muy curiosa ya que en un mismo cultivo se pueden encontrar diversas formas como varillas irregulares que incluyen formas rectas, curvas, triangulares y en forma de mazo, cocos “V” o en empalizada /////. Las dimensiones de los bastones rectos son de 0.4 a 0.5 x 0.7 a 1.0 micras; normalmente son inmóviles aunque algunas especies son móviles con uno o dos flagelos polares. Son Gram positivo. Las colonias pueden ser desde amarillo, crema oscuro o color rosado. En el octavo manual de Bergey se le denomina corineformes; son bacterias aeróbicas, oxidativas, de crecimiento lento, poca y lenta producción de ácidos en medios con carbohidratos, todas son catalasa positivo, pero no todas oxidasa positivo, todas hidrolizan gelatina. Las especies de Clavibacter son: C. michiganense subsp. michiganense C. michiganense subsp. sepedonicum C. michiganense subsp. nebraskense C. michiganense subsp. insidiosum C. flaccumfaciens subsp. flaccumfaciens C. flaccumfaciens subsp. betae C. fascians subsp. poinsettia

C. rathayi C. tritici C. fascians C. iranicum C. ilicis C. xyli

La especie C. fascians es la única que produce fasciación (muchas hojitas se aglomeran produciendo una especie de agalla en la raíz “crece superficialmente”). 5.5.- GÉNERO Agrobacterium Este género de bacterias tiene muy pocas especies fitopatógenas, aunque algunas infecciones llegan a ser de mucha importancia, principalmente en plantas por las especies patógenas de Agrobacterium; induce proliferación anormal de células (hiperplasia) que 31

resultan en formación de tumores o en producción excesiva de raíces adventicias. Usualmente son habitantes del suelo y rizósfera. Los miembros de este grupo son aerobias obligadas, Gram negativo, tienen forma de varilla y miden de 0.6 a 1.0 x 1.5 a 3.0 micras y son mótiles con 1 a 6 flagelos perítricos (cuando tienen uno solo éste es más lateral que polar). Las colonias son blancas, lisas y mucosas. En medios que contienen carbohidratos, producen gran cantidad de polisacáridos extracelulares mucilaginosos. Las especies reconocidas de Agrobacterium son: A. radiobacter (saprófito) A. tumefaciens (tumores o agallas) A. rhizogenes (raíces secundarias) A. rubi. La literatura dice que es igual a tumefaciens. Agalla en frambuesa. A. tumefaciens produce la agalla de la corona de muchas plantas leñosas, principalmente durazno, zarzamora, sauce, vid, mango, aguacate, frambuesa (en zarzamora y frambuesa puede causar agalla de tallo y a la especie algunos la llaman A. rubi). De A. tumefaciens se conocen tres biotipos: el primero puede atacar vid y frutales de hueso; el segundo se le encuentra en frutales de hueso y el tercero afecta vid. 5.6.- GÉNERO Streptomyces Son Gram positivo, de crecimiento lento. En medio artificial producen un tipo de micelio muy fino (el grosor es menor al de una célula bacteriana). La colonia crece hacia abajo, como que se enriza por lo que es difícil de levantar; el micelio aéreo es gris cenizo y con ramificaciones monopódicas con cadenas de esporas en espiral. S. scabies, roña superficial de tubérculos y otras partes subterráneas de la papa, aunque tales infecciones no se han reportado que causen pérdidas económicas; únicamente daña el aspecto (calidad). S. cratirefer S. intermedius S. ipomoeae

S. setoii S. tumuli S. viridogenes

5.7.- GÉNERO Bacillus Aunque normalmente no se reconocen como patógenos de plantas, se ha descubierto que algunas especies inducen enfermedades en vegetales. B. megaterium pv. cerealis induce la mancha blanca del arroz y B. circullans se ha encontrado que induce una enfermedad de plántulas de cultivo de tejidos de palma datilera. B. megaterium y B. cereus se han encontrado en óvulos, semillas y tubérculos de papa, pero sin efectos perceptibles.

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Son Gram positivo o Gram variable y en los últimos años se ha comprobado que hay Gram negativo; en rebanadas de papa crecen hacia arriba y las colonias son arrugadas. Son aerobias, facultativas, perítricas, pudren tejidos, producen una endospora en la célula y producen una gran cantidad de antibióticos. Son problema en almacén. Los bacillus se dividen en tres grupos: Grupo I. Esporas ovales o cilíndricas, centrales, subterminales o terminales. Célula con espora ligeramente hinchada o no hinchada del todo. Grupo II. Esporas ovales, raramente cilíndricas, subterminales o terminales. Célula notablemente hinchada. Grupo III. Esporas esféricas, subterminales o terminales. Células hinchadas. 5.8.- Bdellovibrio bacteriovorus Devora bacterias. Son más pequeñas que las otras bacterias; se introducen entre la pared celular y la membrana celular, donde crecen para posteriormente pasar al protoplasma. Son Gram negativo. Mótiles (con un flagelo polar), oxidativas. 5.9.- MICROORGANISMOS AFINES A BACTERIAS. 5.9.1.- Organismos semejantes a Micoplasmas (Clase Mollicutes). Desde 1967 a la fecha se ha demostrado que 75 enfermedades de las plantas, que anteriormente se creían causadas por virus, son producidas por microorganismos con características morfológicas semejantes a los micoplasmas, pero que difieren de éstos en que no se han podido cultivar en medios artificiales. Los micoplasmas son organismos unicelulares procarióticos que carecen de pared celular; sus células son pequeñas, a veces ultramicroscópicas y tienen citoplasma, ribosomas y cordones de material nuclear. Miden de 175 a 200 nanómetros de diámetro durante su reproducción. Su forma varía de cocoide a ligeramente ovoide a filamentosa. Se pueden reproducir por gemación y por fisión binaria. No tienen flagelos, no producen esporas y son Gram negativos, son resistentes a la Penicilina, pero sensibles a Tetraciclina, Cloranfenicol y algunos a Eritromicina. Se les encuentra en la savia de algunos cuantos tubos cribosos del floema. Son transmitidos por chicharritas, aunque algunos también por otros insectos como Psílidos, periquitos, fulgóridos y posiblemente áfidos y ácaros. La clase Mollicutes tiene un orden, Mycoplasmatales, que se divide en tres familias: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae y Spiroplasmataceae. La familia Mycoplasmataceae tiene un solo género, Micoplasma. Éste requiere esterol para su crecimiento y es sensitivo a digitonina. 33

La familia Acholeplasmataceae también tiene un solo género, Acholeplasma. No requiere esterol para su crecimiento y es resistente a la digitonina. También la familia Spiroplasmataceae tiene un solo género, Spiroplasma. Los espiroplasmas son células pleomórficas de forma esférica a ligeramente ovoide, con diámetro de 100 a 250 nanómetros o más, hasta filamentos helicoidales ramificados que miden de 120 nm x 2 a 4 micras. A diferencia de los grupos anteriores, los espiroplasmas se pueden cultivar en medios nutritivos y dan colonias pequeñas (0.2 mm) de forma de huevo frito. Son Gram positivo o Gram variable; los filamentos helicoidales son móviles, aunque carecen de flagelos, se desplazan mediante ondulaciones lentas del filamento. Requieren de esterol para desarrollarse. Son resistentes a penicilina y se inhiben con eritromicina, tetraciclina, neomicina y anfotericina. Algunas enfermedades causadas por Micoplasmas y Spiroplasma son: amarillamiento del áster que ataca a muchas hortalizas, plantas de ornato y malas hierbas; amarillamiento letal del cocotero; necrosis del floema del olmo; enfermedad X del duraznero; decaimiento del peral; enfermedad persistente de los cítricos (S. citri); y achaparramiento del maíz (espiroplasma). A los micoplasmas, espiroplasmas y rickettsias casi no se les ha dado atención. Son importantes patógenos responsables de declinación, enfermedades del tipo amarillamiento, virescencias, falta de crecimiento y otros desórdenes de proliferación. A estos organismos se les localiza en los tejidos del floema y xilema y se transmiten por chicharritas, psílidos, injerto y cúscuta. Son sensibles a los tratamientos con calor y tetraciclinas. Pocos se han cultivado y su identidad se ha basado en la especialidad del vector, rango de hospedantes y síntomas en el hospedante. 5.9.2.- Organismos semejantes a Rickettsias. Las rickettsias son organismos procarióticos, parásitos intracelulares obligados de células de organismos superiores. Son pleomórficos o tienen forma de cocos o bacilo, con pared celular normalmente ondulada, sin flagelos, Gram negativos y se multiplican solo en el interior de las células hospedantes. Tienen un tamaño que va de 0.2 a 0.8 a 2.0 micras, aunque algunas llegan a alcanzar hasta 4.0 micras de longitud poco antes de dividirse. Se desarrollan mejor a 32 y 35 °C. Desde 1972 se han observado algunas plantas con ciertas anormalidades y que en su interior se localizan organismos que se asemejan a rickettsias en la forma, tamaño, posesión de una pared generalmente ondulada, ausencia de flagelos, crecimiento intracelular y en la incapacidad de crecer en medios nutritivos artificiales. Estos organismos tienen como vectores a las chicharritas. Algunos se localizan en los vasos xilémicos del hospedante, mientras que otros se limitan a los elementos cribosos del floema. Los síntomas disminuyen cuando las plantas dañadas se tratan con penicilina, clorhidrato de tetraciclina u oxitetraciclina. Algunas enfermedades en donde se involucran a estos patógenos son: Pierce de la vid, enanismo de la alfalfa, enfermedad falsa del duraznero, enanismo de la soca de la caña de azúcar, enverdecimiento de los cítricos y el chamusco foliar del almendro. 34

ÍNDICE UNIDAD I. 1. 2. 3. 4. II 1. 2. 3. 3.1. 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.2. 3.3. 3.4. 4. III 1. 2. 3. IV 1. 2. 3. 4. 5. 6.

PAG ASPECTOS GENERALES DE LOS VIRUS......................................

1

INTRODUCCIÓN............................................................................... IMPORTANCIA DE LOS VIRUS...................................................... FORMA Y ESTRUCTURA QUÍMICA VIRAL ................................. SÍNTOMAS CAUSADOS POR VIRUS FITOPATÓGENOS ............

1 1 2 3

TRANSMISIÓN DE VIRUS ..............................................................

6

TRANSMISIÓN MECANICA ........................................................... TRANSMISIÓN POR INJERTO......................................................... BIOTRANSMISORES ....................................................................... INSECTOS ........................................................................................ AFIDOS ............................................................................................. MOSCA BLANCA (MB).................................................................... CHICHARRITAS ............................................................................... COLEÓPTEROS ................................................................................ TRIPS ................................................................................................ ÁCAROS ........................................................................................... NEMÁTODOS ................................................................................... HONGOS ........................................................................................... TRANSMISIÓN POR SEMILLA .......................................................

6 7 7 7 7 9 10 10 10 11 11 12 12

RELACIONES VIRUS – PLANTA ...................................................

14

PENETRACIÓN ................................................................................ INFECCIÓN Y SÍNTESIS VIRAL .................................................... TRANSLOCACIÓN ...........................................................................

14 14 15

IDENTIFICACIÓN DE VIRUS .........................................................

16

ASPECTOS GENERALES ................................................................ COMPROBAR LA NATURALEZA INFECCIOSA DE LA ENFERMEDAD................................................................................. DETERMINAR TAMAÑO Y FORMA DE LA PARTICULA ........... PROPIEDADES FÍSICAS DEL VIRUS ............................................. MECANISMOS DE TRANSMISIÓN………………………………... RANGO DE HOSPEDANTES............................................................

16 17 17 17 18 18

35

V

7. SEROLOGÍA ........................................................................................ 7.1. BASES DE LA SEROLOGÍA ............................................................ 7.2. PRODUCCIÓN DE ANTISUEROS ................................................... 7.3. REACCIONES SEROLÓGICAS ....................................................... 7.4. ELISA ................................................................................................ 8. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN .......................................... 8.1. NOMENCLATURA ........................................................................... 8.2. CLASIFICACIÓN ..............................................................................

18 19 19 20 20 22 22 23

CONTROL DE ENFERMEDADES VIRALES ...................................

25

1. ELIMINACIÓN DE EVASIÓN DE FUENTES DE INÓCULO .........

25

1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8.

26 26 26 26 27 27 27

SANEAMIENTO ............................................................................... EVITAR TRASLAPE DE CULTIVOS .............................................. SELECCIÓN DEL SITIO DE SIEMBRA .......................................... HIGIENE DEL CULTIVO ................................................................. SELECCIÓN DE LA ÉPOCA DE SIEMBRA .................................... USO DE SEMILLA SANA ................................................................ ÁRBOLES DE VIVEROS SANOS ....................................................

2. CONTROL QUÍMICO DE VECTORES .............................................

27

3. CONTROL FÍSICO ...............................................................................

28

3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6.

BARRERAS BIOLÓGICAS ............................................................... SUPERFICIES REFLEJANTES ......................................................... FRANJAS AMARILLAS ................................................................... CUBIERTAS DE PLÁSTICO ............................................................ ACEITES ........................................................................................... TERMOTERAPIA .............................................................................

28 29 29 29 29 29

4.

PROTECCIÓN CRUZADA ...............................................................

30

5.

RESISTENCIA ..................................................................................

30

. 5.1. CONCEPTOS Y PRINCIPIOS GENERALES ................................... 5.2. TIPOS DE RESISTENCIA................................................................. 5.3. 1FUENTES DE RESISTENCIA .......................................................... UNIDAD 5.4. VARIACIÓN PATOGÉNICA DE LOS VIRUS .................................

30 31 31 31

ASPECTOS GENERALES DE LOS VIRUS

36

Unidad 1.

ASPECTOS GENERALES DE LOS VIRUS

1.- INTRODUCCIÓN.

La virología es una ciencia microbiológica que estudia a los virus. Los virus son agentes infecciosos causantes de enfermedades de diversos organismos vivos. La palabra virus es de origen latino y significa pus o veneno. Los virus son partículas compuestas por ácido nucleico (AN) y proteína, de tamaño submicroscópico, son parásitos obligados que solo se multiplican en el interior de las células del hospedante. Los virus no son células ni están constituidos por ellas, pero se propagan al obligar a la célula vegetal a que los multiplique utilizando su propia energía y maquinaria biosintética. A consecuencia de lo anterior el metabolismo de las células vegetales se altera a tal grado que las plantas se enferman. Los virus no matan a las plantas directamente mediante toxinas ni enzimas. En cambio desvían el metabolismo y se generan substancias extrañas y se alteran diversas funciones vitales que inducen el desarrollo de síntomas, que pueden variar desde simples cambios de color hasta necrosis severa o muerte súbita de la planta. En otros el efecto es casi imperceptible como en el caso de los hospedantes asintomáticos.

2.- IMPORTANCIA DE LOS VIRUS.

Los virus son importantes porque:

1. Causan enfermedades en el hombre (sida, cáncer, poliomielitis, rabia, gripe y hepatitis viral, etc), animales domésticos y silvestres. 2. Afectan a otros microorganismos (bacteriófagos, micovirus) por lo que contribuyen al equilibrio microbiano de la naturaleza. 3. Causan enfermedades de plantas. Se han caracterizado más de 1000 virus, de los cuales más de 500 son patógenos de plantas. Al alterar el funcionamiento normal de la planta llegan a provocar pérdidas hasta de 100%. Los daños no son únicamente

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en la cantidad sino en la calidad de la producción; por ejemplo frutos deformes y manchados pierden valor comercial.

Prácticamente cualquier planta puede ser atacada por virus y es común encontrar a mas de dos virus afectando al mismo tiempo a la misma planta. Algunos como el virus Mosaico del Tabaco tiene un rango de hospedantes muy amplio; puede atacar más de 300 especies de plantas herbáceas y leñosas distribuidas en 50 géneros. A consecuencia de las enfermedades virales (o virosis) se derivan también una serie de gastos adicionales para lograr el control: aplicaciones de insecticidas contra vectores, cubiertas de agribón, trampas amarillas, etc.

3. FORMA Y ESTRUCTURA DE LA PARTÍCULA VIRAL.

A diferencia de otros patógenos de las plantas, los virus no están constituidos por células. Además de estar entre los patógenos mas pequeños, los virus también se constituyen uno de los grupos mas simples. Están formados por partículas (solo visibles al microscopio electrónico de transmisión) que miden menos de 2000 nanómetros (nm +); están formados por una cadena simple o doble de ARN o ADN, cubiertas por una cápsula de proteína. Mediante el microscopio electrónico de transmisión se ha determinando que los virus presentan las siguientes formas:

1. Varilla rígida. Virus Mosaico del Tabaco (VMT) 2. Varilla flexible. Virus Y de la papa (VYP) 3. Isométrica (poliédrica). Virus Mosaico del Pepino (VMP) 4. Bacilo. Virus Amarillamiento Necrótico de la Lechuga (VANL)

El ácido nucleico (genoma) es responsable de la infección y la cubierta de proteína le sirve de protección y también funciona en el reconocimiento del hospedante. El ácido nucleico (ARN en la mayoría de los virus; ADN en los geminivirus y caulimovirus) porta la información genética necesaria para la replicación del virus. Tanto el ADN como el ARN pueden ser de cadena simple o de doble cadena. 38

La cápsula protéica (cápside) esta compuesta por subunidades (CAPSÓMEROS). A la partícula completa (ácido mas proteína se le denomina virión. El ácido nucleico se ubica en la parte central de la partícula. En el caso de virus de varilla el ARN esta organizado como una hélice larga.

El tamaño de los virus isométricos varía de 17-70 nanómetros (nm1) de diámetro; los baciliformes alcanzan 300 nm de longitud x 95 nm de ancho; los de varilla rígida miden 114-215 nm de largos por23 nm de ancho; las dimensiones de los virus de varilla flexible alcanzan hasta 2000 nm de longitud por 10 nm de ancho.

La cantidad relativa de AN y proteína, varía según el virus; las partículas de los isométricos contienen entre 15-45% de ácido, mientras que los de varilla contienen aproximadamente 5%. Además de la proteína y del AN algunos virus contienen otros constituyentes químicos tales como algunos cationes, poliaminas y enzimas; también contienen agua, que puede alcanzar hasta 50% del peso del virus.

+ Un nanómetro (=1 milimicra) = 0.000 000 001 m; o 0.000 001 mm; o 0.001 micras

4. SÍNTOMAS CAUSADOS POR VIRUS FITOPATÓGENOS

Sin negar la importancia de los síntomas para identificar enfermedades virales, el diagnóstico de estas en base a los síntomas, es con frecuencia de baja precisión. Los síntomas son útiles para el diagnóstico preliminar y solo en el caso de enfermedades muy conocidas se puede afirmar con total certeza que el agente causal de tal o cual enfermedad es determinado virus. Lo anterior se debe a que:

-

Síntomas similares pueden ser producidos por diferentes virus.

-

El mismo virus puede producir un amplio rango de síntomas, dependiendo de la variante del propio virus, del ambiente y genotipo del hospedante.

-

Otros patógenos o factores abióticos también producen síntomas similares.

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-

La falta de síntomas no necesariamente significa que la planta no esté infectada. Puede suceder simplemente que la infección esté latente.

En general los síntomas inducidos por virus se pueden agrupar en tres grandes categorías: cambios de coloración, malformaciones y síntomas diversos.

4.1. Cambios en la coloración.

Se observan en hojas, flores, frutos y raíces.

4.1.1. Hojas.

Clorosis. El color verde se debilita progresivamente. Amarillamiento. Clorosis y aparecen pigmentos amarillos. Albinismo (bleaching). Tejidos de color blanco. Enrojecimiento. Debido a la formación anormal de antocianinas. Obscurecimiento. Debido a la síntesis de color café oscuro, semejantes a las melaninas. Necrosis. Las células se colapsan y se tornan de color oscuro. A veces hay tonalidades bronceadas (bronceamiento). Mosaico. Áreas irregulares de color verde pálido, alternadas con zonas de amarillentas o cloróticas; el límite entre estas dos tonalidades generalmente está determinado por las nervaduras. Moteado. Áreas decoloradas mas o menos redondeadas, con el borde difuso. Lesiones locales. Áreas cloróticas o necróticas de forma variable. Miden mm. Manchas anulares. Manchas redondeadas o de borde irregular, que presentan patrones de líneas en forma de anillos o huella digital. Pueden ser necróticas. Estrías. Lesiones alargadas, paralelas a lo largo de las nervaduras (gramíneas). con el borde bien definido Amarillamiento de nervaduras. Nervaduras de color amarillo o verde pálido. Aclaramiento de nervaduras. Nervaduras translúcidas.

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Necrosis de nervaduras. Necrosis por muerte del sistema vascular.

4.1.2. Flores.

Virescencia. Enverdecimiento general de los pétalos. "Breaking". Pecas, estrías o sectores de colores anormales en los pétalos (variegado). Cambios de color. (Intensificación, debilitamiento o cambio de pigmentos).

4.1.3. Frutos.

Todo el fruto puede cambiar de tamaño y color. Puede haber moteado, manchas angulares.

4.1.4. Raíces.

Puede haber necrosis.

4.2. Malformación.

Se observan en hojas, flores, frutos y raíces.

4.2.1. Hojas.

Distorsión. Hay encurvamientos, rizamientos, Epinastia. Curvamiento del ángulo del pecíolo de las hojas hacia abajo "Angostamiento". Reducción en la superficie de la lámina de la hoja; las venas permanecen casi normales. Reducción de tamaño. Todas o solo parte del follaje. Engrosamiento. Parte o toda la lámina foliar; de las nervaduras. Enaciones. Crecimiento de la lámina foliar hacia la superficie adaxial de la lamina de la hoja, resultando en el curvamiento de las hojas hacia el dorso.

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4.2.2. Flores.

Varios tipos de distorsión. Fillodia. Partes de la flor se desarrollan con apariencia de hojas.

4.2.3. Frutos.

Deformación y forma irregular. Tumores Semillas abortivas.

4.2.4. Tallos.

Distorsión Acortamiento de entrenudos.

4.2.5. Raíces.

Decaimiento y muerte regresiva Tumores. Deformación o agallas

4.3. Otros síntomas.

Marchitez. Flacidez de parte del follaje o de toda la planta. Defoliación. Caída prematura de las hojas o súbito desprendimiento de estas. Alteración en la cantidad de flores Floración prematura o retardada Sabor anormal de frutos. Frutos desabridos. Secreciones anormales. Gomosis Concavidades en la madera

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Engrosamiento de yemas Incompatibilidad en el injerto. Los injertos no prenden o no desarrollan

4.4. Factores causantes de síntomas semejantes a los inducidos por los virus

-

Anormalidades genéticas

-

Deficiencias nutrimentales

-

Daño por herbicidas

-

Daño por insectos o ácaros

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Daño por poluantes o pesticidas

-

Otros fitopatógenos

Los síntomas causados por estos últimos agentes no son de naturaleza infecciosa; es decir, que no se transmiten mediante injerto. Además, al paso de los días la recuperación puede ser común.

Agentes infecciosos también pueden causar síntomas similares a los ya descritos: por ejemplo el tizón tardío llega a ser confundido con el virus de la marchites manchada, por productores y técnicos inexpertos.

El uso de los síntomas para la diagnosis de campo es una guía valiosa pero imprecisa, sobre todo para los técnicos no familiarizados con las enfermedades comunes en un cultivo en una región determinada. Aún el especialista debe ser humilde antes de poder afirmar que un virus particular está involucrado en determinada enfermedad.

Lo anterior no significa que cada vez que detectemos síntomas presuntamente virales, se tendrá que acudir a un experto. Dependiendo de la experiencia del investigador y de los antecedentes del problema, los diagnósticos de campo pueden ser relativamente precisos. El patrón de dispersión de la enfermedad puede dar indicios del virus o grupo de virus que se trate. Por ejemplo en el caso de geminivirus en tomate, los síntomas mas notables son de enchinamiento y reducción en el crecimiento; su presencia en la región está relacionada con

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las poblaciones de mosca blanca y generalmente al inicio de las epidemias se aprecia un gradiente en dónde las plantas de las orillas son las primeras en ser infectadas, especialmente si hay maleza cercana en los drenes. En base a lo anterior en sentido estricto, solo se puede afirmar que tenemos problemas de virosis, cuyos síntomas coinciden con los descritos para geminivirus, pero en ningún momento podemos decir con precisión de que geminivirus se trata; tampoco podemos negar que posiblemente haya plantas infectadas por otros virus.

El apoyo del laboratorio puede ser indispensable para determinar con certeza a los patógenos involucrados, sobre todo cuando se presentan síntomas que antes no se habían observado en el cultivo en la región.

Unidad 2.

TRANSMISIÓN DE VIRUS

Dada su condición como parásitos obligados los virus no se pueden desarrollar en materia orgánica muerta; requieren del albergue en tejido vivo, ya sea en estado de reposo o de multiplicación activa. El Virus Mosaico del Tabaco (VMT) constituye una de las pocas excepciones, ya que puede sobrevivir en restos de tejidos infectados que quedan en el campo después de la cosecha, de tal manera que estos materiales sirven como fuente de inóculo primario en el siguiente ciclo. Los virus requieren pasar constantemente de un hospedante infectado a otro sano, para poder sobrevivir en cualquier región.

Los virus no penetran a las plantas de manera directa, ni salen de estas por sus propios medios. La dispersión no es activa; es pasiva y se da mediante los siguientes mecanismos:

1. Transmisión mecánica.

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Este fenómeno sucede comúnmente en el campo o en los invernaderos, mediante el rozamiento natural entre plantas (VMT), pero principalmente a través de las heridas causadas por las prácticas de cultivo, tales como: podas, desbrotes, acomodo de guías, cosecha, etc. Afortunadamente la mayoría de los virus no se dispersan eficientemente de esta manera. Sin embargo hay que valorar la enorme importancia de las prácticas causantes de heridas en cultivos sujetos a manipuleo frecuente (hortalizas), o en aquellos casos en que por necesidad hay que causar heridas (partición de tubérculos en papa o podas en frutales).

Por otra parte, la transmisión mecánica artificial es uno de los aspectos a estudiar para la identificación de virus. Este aspecto se verá en el capítulo correspondiente.

2. Transmisión por injerto.

En la práctica agrícola este factor es de gran importancia especialmente en el caso de árboles frutales. El sitio de unión del injerto con el patrón permite el contacto de la savia infectiva con la savia de plantas sanas. Todos los virus se pueden transmitir potencialmente por injerto, propiedad que se utiliza a nivel experimental para determinar la naturaleza infecciosa de las enfermedades.

3. Biotransmisores.

Se aplica este término a cualquier agente vivo (excluyendo semilla y polen) capaz de portar o transmitir un virus fitopatógeno de una planta enferma a una planta sana. En sentido estricto la palabra vector no es sinónimo de biotransmisor, aunque en el lenguaje común se usan de manera indistinta. Siendo más común el primer término. El ser vector implica que el virus es ingerido y se halla en contacto íntimo con el transmisor. Un ejemplo útil de vector es el del mosco Anopheles, que transmite al protozoario causante del paludismo; el microorganismo ingerido se multiplica y sufre transformaciones en el interior del cuerpo del insecto, antes de poder ser transmitido. En muchos casos de biotransmisores de virus, el patógeno si se multiplica en el insecto pero hay abundantes excepciones en las

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que no sucede así. Entre los biotransmisores de virus fitopatógenos se hallan los insectos, ácaros, nemátodos y hongos.

3.1. Insectos

Según Harris (1981) los insectos constituyen el grupo más importante; de las 391 especies de animales vectores de virus en plantas, 94% son artrópodos y 6% son nemátodos; del total de artrópodos vectores, el 99% son insectos; el 70% de los insectos capaces de transmitir virus son homópteros.

En general, durante la transmisión por insectos se pueden distinguir tres fases:

-

Período de adquisición. Es el tiempo mínimo que requiere el insecto para adquirir el virus.

-

Período de látencia. Tiempo transcurrido desde que el insecto adquiere el virus hasta que es capaz de transmitirlo.

-

Período de inoculación. Tiempo mínimo requerido por el insecto para poder trasmitir el virus adquirido, una vez que empieza a alimentarse de una planta sana.

Hay otro término importante denominado período de retención, que se refiere al tiempo durante el cual el insecto permanece infectivo.

Los principales grupos de insectos vectores de virus son: áfidos, mosca blanca. trips. chicharritas y coleópteros.

3. 1. 1. Afidos.

Existen más de 190 especies de áfidos vectores de virus. Entre los géneros más comunes se encuentran: Aphis, Myzus, Brevicoryne, Macrosiphum, Rophalosiphum, Toxoptera, etc. Se han reportado más de 160 virus trasmitidos por áfidos. La mayoría de los

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virus transmitidos por áfidos son de forma poliédrica o de varilla flexible. Cuyo síntomas más notable es el de mosaico, aunque algunos también inducen amarillamientos. Los virus raras veces son transmitidos transovarialmente (a través del huevo); así, los áfidos recién eclosionados casi siempre están libres del virus. La transmisión por áfidos pueden ser de tres tipos; No persistente (circulativa) que es la más común, o persistente (circulativa). Hay una tercera categoría que incluye a virus que presentan características intermedias entre las dos anteriores (cuadro 1).

Cuadro 1. Características diferenciales de los virus transmitidos por áfidos.

No persistentes El virus se adquiere durante piquetes superficiales de prueba; es portando en el estilete y retenido en el mismo por menos de una hora y usualmente no es ingerido El insecto puede adquirir al virus en segundos a pocos minutos. No hay un período latente y el virus puede ser transmitido de inmediato después de adquirirse

Los virus generalmente tienen amplio rango de hospedantes Se transmiten mecánicamente mediante frotado de savia Ejemplos: Virus Mosaico común del Frijol, “Y” de la papa, jaspeado del Tabaco, Mosaico del pepino y, Mosaico de la Sandía.

Semipersistentes El virus es ingerido, y se ocupan de varios minutos a 1-2 horas de alimentación para que se adquiera

Persistentes El virus es ingerido, pasa a los ductos alimenticios y hemolinfa. Invade las glándulas salivales. Tarda en adquirirse de 30 minutos a varias horas.

No hay período de latencia en el vector. Para transmitirlo en una planta sana se tarda de varios minutos a pocas horas

Hay un período de latencia antes de que el áfido pueda transmitirlo. La transmisión es eficiente en función de la cantidad de virus ingerido. El virus persiste en el vector durante toda su vida y a menudo se multiplica en este. Rango estrecho de hospedantes

Se transmiten difícilmente No se transmiten por frotis por frotis de savia de savia Ejemplos: Virus Tristeza de los Cítricos, Amarillamiento de la Remolacha y Amarillamiento del Trébol.

Ejemplo: Virus Mosaico del Maíz, Enrollamiento de la papa, Amarillamiento Necrótico de la Lechuga y Enanismo estriado del Trigo.

Los áfidos presentan formas ápteras y aladas; estas últimas son las más importantes como vectores dada su alta movilidad. Son insectos partenogenéticos y vivíparos que pasan

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por cinco estadios ninfales. Algunos son específicos a uno o pocos hospedantes, pero muchas especies son polífagas, En ausencia del hospedantes cultivable los áfidos sobreviven en maleza ubicada dentro del lote (arvenses) o en los montes o drenes cercanos (maleza ruderal)

Con frecuencia la maleza que alberga a los áfidos, es también susceptibles y funcionan como fuentes de inóculo primario; a veces estas plantas infectadas son asintomáticas. Otra posibilidad común es que el áfido adquiera al virus durante el trayecto hacia el cultivo, a partir de plantas infectadas de las que se alimente. Al llegar a los lotes de cultivo los áfidos se alimentan de los brotes más tiernos.

Hay que distinguir dos cosas importantes relacionadas con la transmisión no persistente. Por un lado señalar que no todos los áfidos colonizan al hospedante, pero esto no es obstáculo para que los virus no persistentes sean transmitidos. Es común que antes de fijar su estilete de manera definitiva, realice piquetes de prueba ("tientas"), que le permitirán decidir si la planta escogida le conviene como hospedante. Este comportamiento es de mucha importancia epidemiológica ya que bastan estas tientas realizadas en segundos, para que pueda adquirir el virus o para depositarlo en las plantas sanas.

El otro factor se refiere a que no se debe visualizar a los áfidos vectores de virus bajo la misma óptica de los insectos plaga. Teóricamente basta con que una planta sea picada con un solo áfido infectivo para transmitir al virus; por lo anterior no podemos hablar de umbrales de control para el control químico de áfidos vectores. Este tipo de transmisión no persistente se facilita porque algunos virus se hallan muy concentrados en las células del parénquima, y durante la tienta se adhieren fácilmente al estilete.

Una vez que la planta es infectada los síntomas aparecen pocos días después, estas se presentan inicialmente en forma aislada, pero después se generaliza la epidemia.

El control de enfermedades virales de transmisión no persistente es difícil de lograr mediante aplicaciones de insecticidas. Antes de que el insecto alado muera por el efecto del

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insecticida, puede potencialmente (bajo la excitación nerviosa derivada del tóxico) picar otras plantas sanas cercanas, de tal manera que la transmisión no se evita.

3. 1. 2. Mosca blanca (MB)

Transmiten virus cuyos síntomas generalmente son de amarillamiento, enrollamiento ("enchinamiento") y a veces mosaicos. Estas enfermedades se presentan generalmente en zonas tropicales y subtropicales.

Las especies mas importantes son: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum. Transmiten principalmente geminivirus (partícula formada por dos virus poliédricos unidos). La transmisión es de tipo persistente (excepto en el Virus de la Vena Amarillo del Pepino). El virus alcanza la hemolinfa. El período de adquisición es de 1-2 días y el de latencia de 4-20 horas. La mosca permanece infectiva hasta por 35 días o más.

El virus puede ser adquirido por las ninfas, persiste durante la "pupación" y es inmediatamente transmisible por el adulto recién emergido. No hay evidencia de que el virus pase al huevo. Las moscas se alimentan del floema, prefieren tejidos jóvenes o en el envés de las hojas. Al ser arrastradas por el viento llegan a diseminar virus a grandes distancias. Son atraídas por la luz azul y colores amarillos.

La mayoría de los virus transmitidos por mosca no se transmiten por frotis. Ejemplos de virus transmitidos por MB son: Virus Mosaico Dorado del Fríjol, Virus del Enrollamiento de la Hoja de la Calabaza y el Virus del Enchinamiento del Tomate.

3. 1. 3. Chicharritas

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1. Las especies más comunes como vectores de virus pertenecen a géneros como: Empoasca, Dalbulus, Circullifer, Macrosteles, Agallia y otros. Son insectos de hábitos picador-chupador. 2. Transmisten virus asociados al floema, tejido del cual se alimentan. 3. Estos virus no se transmisten mecánicamente por frótis (excepto El Virus Enanismo Amarillo de la Papa) 4. La transmisión es generalmente del tipo persistente (circulativa). El período de adquisición es de 30 minutos o más. Hay un período de latencia en el vector. El período de inoculación es de varias horas. 5. El virus es retenido por el insecto durante toda su vida (excepto en el Virus tungro del arroz). El virus pasa del intestino a la hemolinfa y se multiplican en el vector (excepto el Virus curly top de la remolacha). En algunos casos hay transmisión transovarial del virus, es decir que los huevecillos quedan infectados y la progenie puede ser infectiva. 6. Hay una alta especificidad virus-vector y los virus tienen un limitado rango de hospedante. 7. Los síntomas mas comunes son amarillamiento síntomas de distorsión y proliferación anormal de hojas y yemas ("escoba de bruja"). 8. Ejemplos de virus transmitidos por chicharras son: Curly Top del Tomate, Rayado Fino del Maíz, Mosaico Estriado de la Cebada, y Estriado del Maíz.

3. 1. 4. Coleópteros

1. Las especies más comunes de estos vectores en México son Acalymma spp.y Diabrotica spp. 2. Período de adquisición de aproximadamente 5 minutos. 3. El insecto permanece infectivo por al menos un día después de que se alimenta de una planta enferma 4. Los virus se transmiten fácilmente mecánicamente.

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5. Ejemplos de virus transmitidos por coleópteros son: Virus Mosaico de la Calabaza, Virus Mosaico Rugoso del Frijol, Virus Mosaico de la Berenjena y el Virus del Mosaico del Rábano.

3. 1. 5. Trips

1. Los trips son insectos de hábito raspador-chupador que usualmente se alimentan de tejido joven. Las especies reportadas como vectores son Frankiniella occidentalis, F. fusca, F. schultzei,Thrips tabaci, T. setosus, T. palmi y Scirtothrips dorsalis. 2. Transmiten a virus pertenecientes al grupo de los ToSpoVirus (témino derivado de Tomato Spotted Wilt Virus. Este grupo se distribuye en casi todo el mundo y ataca mas de 500 hospedantes, ubicados en mas de 50 familias, que incluyen hortalizas de gran importancia. 3. Del grupo de los Tospovirus, él más importante es el Virus de la Marchitez Manchada del Tomate (VMMT o TSWV.) 4. Los' insectos adquieren el virus solamente durante los estados ninfales. Las larvas infectadas pueden transmitir al virus; los adultos infectados lo pueden transmitir durante toda su vida. Bastan 15 minutos de alimentación para que el trips adquiera el virus. Entre mayor sea el período de adquisición, habrá mayor eficiencia en la transmisión. La savia ingerida pasa al intestino y los virus atraviesa la pared intestinal, y alcanzan la hemolinfa. El virus alcanza las glándulas salivales y es depositado junto con la saliva cuando el insecto se alimenta de plantas sanas, efectuando la transmisión. 5. Aparentemente bastan pocos minutos para que el virus pueda ser inoculado por los insectos en las plantas susceptibles. Evidencias recientes indican que los trips también realizan "piquetes de prueba" de manera similar a los áfidos y que durante estos puede ocurrir una transmisión exitosa, ya que depositan el virus en células que pueden sobrevivir al daño físico del insecto, permitiendo la multiplicación del mismo.

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6. Existen evidencias que el virus se logra multiplicar en el cuerpo del vector y que el ciclo de vida de este se puede acortar considerablemente por el efecto del virus.

3. 2. Ácaros

De la clase arácnida, los eriófidos son los vectores de virus más importantes, pero algunos tetranichidos también los pueden transmitir. Los ácaros son artrópodos de hábito chupador. Se conocen al menos seis virus transmitidos por ácaros y en todos los caos la transmisión es de tipo persistente, el virus persiste también durante la muda. No existe transmisión transovárica. Algunos vectores son; Eriohystulipae, que transmite al Virus Estriado del Trigo y E. ficus, vector del Virus del Mosaico del Higo.

3. 3. Nemátodos.

Se conocen al menos 12 virus transmitidos por nemátodos y todos los vectores se ubican en el Orden Dorylaimida y cuyos géneros son: Xiphinema, Longidorus y Trichodorus. La mayoría de los virus transmitidos por nemátodos se transmiten también mecánicamente, son específicos al hospedante y el virus es desechado durante la muda del nemátodo vector. El período de adquisición es de 48 hrs.

La transmisión de virus por nemátodos no es de tipo persistente, ni existe evidencia de que estos se multipliquen en el vector. En cierta manera el mecanismo de transmisión es similar al tipo no persistente de los áfidos, ya que entra por el estilete junto con el alimento y se adhiere a la pared del esófago. Cuando el nemátodo se aleja y pica otra planta el virus es inyectado junto con la saliva, la cual despega al virus del estilete y este es inyectado en la planta sana.

El patrón de dispersión de estas enfermedades es en manchones, lo cual es típico del patrón de dispersión del vector. En nepovirus la transmisión por semilla es más importante

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a largas distancias. En base al tipo de partícula viral transmitida, los patógenos se clasifican en:

Nepovirus. Son virus poliédricos que también se transmiten por semilla y polen. Ejemplos de vectores son: Xiphinema index y X. americana que transmiten al Virus de la Hoja de Abanico de la Vid y el Virus de la Mancha Anular del Tabaco, respectivamente. Éste nemátodo es muy longevo en ausencia de hospedante y el virus dura hasta 8 meses en el nemátodo. Longidorus sp. Transmite al Virus del Anillo Negro del Tomate.

Netuvirus. También llamados Tobravirus. Incluyen virus en forma de varilla. Un ejemplo es Trichodorus sp que transmite al Virus Sonajero del Tabaco.

3. 4. Hongos.

Se conocen cinco especies de hongos vectores, todos ellos son ficomycetes. Forman zoosporas en esporangios. Las zoosporas tienen cierta autonomía de movimiento gracias a los flagelos. El hongo adquiere al virus al atacar a una planta enferma por este último. La reproducción del hongo da origen a esporangios y zoosporas infectadas por partículas de virus. Las zoosporas se desplazan por el agua, al infectar raíces de plantas sanas también inoculan al virus. Ejemplos son:

Cuadro 2. Hongos vectores de virus y virus transmitidos. Hongo fitopatógeno Olpidium brassicae Synchytrium endobioticum Spongospera subterranea Polymixa graminis Pythium ultimum

Virus transmitido Vistus Várice de la Lechuga Virus x de la Papa Virus Mop Top de la Papa Virus Mosaico del Trigo Virus Falso Enrollamiento del Chícharo

4. Transmisión por Semilla En 1982 se conocían 230 virus fitopatógenos, de los cuales al menos 62 pueden ser transmitidos por semilla en cuando menos uno de sus hospedantes. El porcentaje de semilla

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infectada depende del virus y de la variante del mismo, así como de la variedad del hospedante y de la etapa de su desarrollo al momento de la infección viral.

La transmisión por semilla constituye uno de los factores más importantes en el desarrollo epidémico de algunos virus. Las semillas infectadas dan origen a plántulas que representan una fuente de inóculo inicial temprana, que además se halla uniformemente distribuido. Las plántulas infectadas constituyen reservorios a partir de los cuales ocurre la dispersión secundaria del virus, lo cual sucede por transmisión mecánica o mediante vectores.

En el campo es raro que ocurran incidencias del 100% de plantas infectadas y además no todas las semillas de una planta resultan infectadas. En consecuencia, la proporción de plantas con semillas infectadas generalmente es baja en la mayoría de los virus; una de las excepciones quizá sea el Virus Mosaico Común del Fríjol. Sin embargo bastan incidencias muy bajas de semilla infectada para que se inicien epidemias severas. Por ejemplo en California se determinó que basta con que 0.1% de la semilla tenga al virus del Mosaico de la Lechuga para que las pérdidas sean cuantiosas. El papel del inóculo portado en la semilla es mayor cuando el virus no tiene muchos hospedantes alternativos. La transmisión por semilla tiene también mucha importancia de la dispersión de virus de un país o continente a otro; en este caso puede ser el medio mediante el cual se introduce al patógeno por vez primera a una nueva región. Debe también visualizarse su papel como sitio de supervivencia de los virus.

La mayoría de los virus que se transmiten por semilla se ubican en su interior, generalmente en el embrión. La infección de la semilla va precedida de infecciones en la planta antes de la floración. Virus tales como el VMT constituyen casos especiales, ya que el virus puede ir en el embrión y en la testa de la semilla. El VMT puede ser eliminado fácilmente de la testa con substancias químicas, no así del interior de la semilla. Hay varias hipótesis que intentan explicar la ausencia de la transmisión por semilla. Se supone que aunque algunos virus alcancen la semilla en desarrollo, estos sean inactivados por substancias inhibidoras de la propia planta. En otros casos el aborto de flores podría evitar

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la transmisión. En algunos casos ciertos virus se transmiten por semilla solo en algunos hospedantes; la eficiencia de transmisión (% de semilla afectada) es también variable según la especie y variedad.

Las plantas infectadas pueden también producir polen infectado, el cual al fertilizar flores de plantas sanas transmite también el virus. Este fenómeno aumenta también la proporción de semillas infectadas. En otros casos el virus induce esterilidad en el polen.

Son diversos los factores que determinan la proporción de semillas infectadas o inclusive el éxito de la propia transmisión. Así, infecciones antes de la floración o durante floración, contribuyen a que el virus alcance el embrión. La temperatura es determinante, pues por ejemplo, en el Virus Mosaico Sureño del Fríjol, hay una transmisión de 95% cuando la temperatura es de 16-20ºC; sin embargo la transmisión es de solo 55% a 2830ºC.

En otros casos algunos virus se transmiten por semilla solo en algunos hospedantes. Así por ejemplo el Virus Mosaico Amarillo del Fríjol se transmite por semilla en lupino, pero no en fríjol. Las diferencias en la proporción de semilla infectadas también se expresan según el cultivar. Así, al estudiar la transmisión del VMCF en 51 cultivares de fríjol, la transmisión varió desde 1-75%. Esta variación también es distinta según la planta individual de la misma variedad; por ejemplo en lechuga de misma variedad, la transmisión de semillas contaminadas varió de 0.2-14.2% plantas. Es obvio que la propia extirpe o variante del virus también difiere en su capacidad de transmisión; tal es el caso del Virus Mosaico Estriado de la Cebada, cuya transmisión por semilla varió del 0-53%.

Un caso aparte es el de la transmisión de virus mediante partes vegetativas. En este caso todos los virus de determinado cultivo pueden ser transmitidos de manera vegetativa, aunque no todas las partes vegetativas de la misma planta puedan estar contaminadas. En cultivos ornamentales y comestibles como la papa y el camote, es de enorme importancia la utilización de semilla libre de virus.

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Unidad 3.

RELACIONES VIRUS-PLANTA

Las plantas mantienen una relación íntima con sus parásitos virales y salvo pocas excepciones los virus generalmente están en el interior de las células vivas, ya sea en etapa de multiplicación o en reposo. Esta relación parasítica inicia cuando el virus ingresa a tejido sano.

1. Penetración.

Los virus son “parásitos de heridas” frescas y requieren de estas para introducirse a la planta mecánicamente ya que son capaces de introducirse en el hospedante por sí solos. Puede suceder que el virus ya esté en la semilla, pero en plantas sanas las partículas iniciales son inoculadas mecánicamente mediante prácticas de cultivo, injerto y mediante el roce entre plantas. En el caso de la transmisión por polen, también ocurren heridas mecánicas, durante la germinación de este grano y la formación posterior del tubo polínico. Los vectores también causan heridas con su aparato bucal (artrópodos o nemátodos) durante su alimentación en la que se adquiere o se inocula el virus.

2. Infección y síntesis viral.

La infección viral en función de la síntesis de nuevas partículas. La síntesis de nuevas partículas se da a costa de las substancias del propio hospedante. El fenómeno de la replicación y de la inducción de la enfermedad es complejo, pero haciendo una simplificación se puede escribir de la siguiente manera:

1. Una vez que las partículas han penetrado (inmersas en la savia infectiva) y hacen Contacto estrecho con el citoplasma de la planta sana, la partícula viral pierde la cápside protéica. El ácido nucleico (AN) libre es el responsable de la infección y de los síntomas, al interferir con el metabolismo normal de la planta. Los fragmentos

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de la cápside quedan libres en la célula y aparentemente son incorporados en las reacciones metabólicas de la célula infectada. 2. La partícula de AN viaja al núcleo y logra inducir a la célula para que sintetice enzimas ARN-polimeras y ARN-sintetazas. 3. En presencia del ARN viral que sirve como molde, se sintetizan nuevas partículas virales. El ARN original que sirve de molde para producir una copia que actúa como una especie de "negativo"I que sirve para que se produzcan múltiples copias exactamente iguales al molde original. 4. Tan pronto como se sintetizan las nuevas partículas virales, a partir de las propias células del hospedante (bajo las ordenes del ARN viral) se sintetizan también cada una de las cápsides correspondientes. 5. El proceso anterior se completa en aproximadamente 10 hrs. Al final los nuevos virus quedan formados a imagen y semejanza de las partículas originales y se comportaran de manera similar al padre original; a menos que ocurra alguna alteración (mutación) durante la síntesis y ensamblaje de las moléculas del AN o de la cápside.

El proceso antes descrito ha sido determinado en el VMT, uno de los virus más estudiados. En plantas susceptibles es posible hallar hasta 10 millones de virus por cada célula. Hay que enfatizar que los virus no poseen un sistema metabólico propio y que todas las actividades se efectúan a costa de consumir las substancias de la planta y de alterar las funciones de la planta. El virus utiliza los ribosomas y el ARN de la planta. La planta deja de sintetizar algunas substancias y las sintetiza en mayor o menor grado. Otro evento común es la síntesis de proteínas extrañas y de nuevas substancias. La concentraciones de algunas substancias son también alteradas, incluyendo la de algunas hormonas. Todas estas anomalías en el funcionamiento de la planta constituyen el proceso de enfermedad (patogénesis), que desemboca en la el desarrollo de los síntomas en cada hospedante.

Cabe agregar que una vez formadas las nuevas partículas en algunos virus se ha observado que forman agregados de partículas virales conocidos como inclusiones, cuya forma y tamaño es variable, así como su localización en el interior de la célula.

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3. Translocación.

Los virus tienen que desplazarse de las células inicialmente infectadas a las células sanas vecinas o aún desplazarse a distancias de varios cm o metros (árboles) para poder generalizar la infección en la planta atacada. El desplazamiento entre 15 células vecinas se da vía de los plasmodesmos. Los plasmodesmos son proyecciones del citoplasma que conectan una célula con otra y que permiten el transporte intercelular, lo que también permite el flujo de los virus en suspensión acuosa.

Se ha estimado que este mecanismo de transporte es demasiado lento ya que los virus se desplazan 8-10 células por día. El desplazamiento más rápido y a grandes distancias (entre órganos) a través de los tubos cribosos del floema; se menciona que pueden desplazarse hasta 15 cm en tan solo 6 minutos. Del floema los virus pueden invadir nuevas células también vía plasmodesmos. El transporte por el floema ocurre en sentido descendente y por lo tanto los virus se desplazan inicialmente a la raíz y posteriormente invaden otros órganos de las plantas

Unidad 4.

IDENTIFICACION DE VIRUS

1. Aspectos generales.

La identificación completa de enfermedades virales en base a síntomas conlleva un alto riesgo de equivocación, y más en el caso de personal no entrenado, que no conoce ni siquiera el desarrollo normal de un cultivo particular en una región. También se mencionó que las virosis pueden ser confundidas fácilmente con problemas de tipo nutrimental, fitotoxicidad por plaguicidas u otros patógenos; en este último caso la confusión se puede dar principalmente con enfermedades causadas por fitoplasmas (mycoplasmas).

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Sin embargo, la observación de síntomas a nivel de campo nos da una idea de la posible causa y diseminación de las enfermedades virales. La identificación puede ser con fines de diagnóstico ante problemas prácticos concretos y en este caso los resultados deben ser rápidos y oportunos. Diagnósticos erróneos conducen invariablemente a la toma de decisiones equivocadas en cuanto al manejo de la enfermedad. Por ejemplo al confundir a una virosis con un problema nutrimental puede conducir a gastar en fertilizantes innecesarios; la confusión con enfermedades fungosas puede inducir al productor a aplicar infructuosamente en fungicidas. Es común que algunos técnicos bajo el supuesto de que hay que prevenir contra mycoplasmas, aplican antibióticos en cultivos que solamente son afectados por virosis.

Sin embargo hay que reconocer que los fitopatólogos experimentados en determinados cultivos, con certeza relativa diagnostican enfermedades virales en base a los síntomas y revisión de literatura; inclusive ese diagnóstico llega incluso a nivel de especie con cierta precisión. Sin embargo en estos casos hay que contar con información sobre los virus previamente detectados en la región. Desde el punto de vista práctico no siempre es posible acudir a un laboratorio para que se determinen los virus presentes en una plantación. De hecho una vez, familiarizados con la sintomatología, no hay necesidad de acudir a técnicos mas experimentados. La sintomatología sigue siendo la herramienta más importante en el campo para identificar virosis, con todas las limitaciones que este método tiene. Sin embargo no hay que despreciar la utilidad del trabajo de laboratorio, sobre todo cuando se trata de síntomas no observados con anterioridad en una región.

En una investigación formal, las fases a seguir para identificar a el o los agentes causales de una virosis desconocida son los siguientes:

2. Comprobar la naturaleza infecciosa de la enfermedad.

Antes que nada debe de determinarse que la enfermedad se puede transmitir de una planta enferma a una sana, ya que solo las enfermedades de naturaleza biótica son infecciosas. Este aspecto se prueba haciendo injertos de brotes de plantas enfermas en

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plantas sanas cultivadas en invernadero. Es obvio que el invernadero deberá estar protegido para evitar el acceso de vectores.

3. Determinar tamaño y forma de la partícula.

Este factor se determina realizando observaciones en el microscopio electrónico de transmisión. Se observa la forma de la partícula y se miden sus dimensiones. Recuerde que las formas de los virus son en su mayoría de tipo poliedro (esféricas o isométricas), de varilla flexible y varilla recta.

Muchos virus forman inclusiones y estas se pueden observar al microscopio biológico compuesto, para lo cual se hacen preparaciones de tiras epidermales sobre un portaobjetos. Las inclusiones son agregados de partículas y su presencia sirve solamente como indicador de la presencia de algunos virus; existen inclusiones amorfas, piramidales, etc. Cabe aclarar que estas técnicas requieren de mucho entrenamiento, especialmente la de microscopía electrónica, pues no cualquier persona lo puede hacer eficientemente. Se requiere previamente purificar al virus al menos parcialmente, lo cual a veces no es sencillo, pues el uso de solventes u otras substancias pueden destruir al virus.

Para purificar virus se requiere de centrífugas y ultracentrífugas, que solo se encuentran en los centros de investigación más importantes del país. De hecho este proceso es realizado por especialistas.

4. Propiedades físicas del virus.

Son varias las propiedades que se han utilizado y entre las más importantes se hallan:

Punto de inactivación térmica (PIT). Se refiere a la temperatura requerida para identificar virus en la savia cruda recién extraída del tejido infectado, con el auxilio de una solución amortiguadora. Esta savia se coloca en tubos, que se colocan en baño María por períodos de exposición de 10 minutos; se evalúan temperaturas que varían de 30 a 1000 C.

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Los tubos se retiran de inmediato del agua caliente y se pasan a agua con hielo. Enseguida se inocula savia de cada tubo por separado en plantas indicadoras, que den origen a lesiones locales. El PIT será aquella temperatura más baja en la cual los síntomas ya no se produzcan después de inocular las plantas indicadoras.

Longevidad "in vitro". Se refiere al tiempo durante el cual el virus permanece infectivo en la savia cruda expuesta al ambiente de laboratorio (20-22°C). Se extrae la savia y se en tubos de ensayo (como en el PIT) y se le agrega 0.01% de estreptomycina (para evitar contaminación bacteriana). Se extrae savia a los 1, 3, 6, 9, 12. 15, 30, 60, 90 y 150 días (según sea necesario), que se usa para inocular a plantas diferenciales que den lesiones locales. La longevidad in vitro se determina considerando la última fecha de extracción en la cual se obtiene aún desarrollo de síntomas en las plantas inoculadas. Si por ejemplo se tuvieron síntomas a los 6 días, pero no a los 9, se repite el ensayo evaluando períodos intermedios entre 6 y nueve días.

Punto final de dilución (PFD). Es la más alta dilución de la savia en la cual el virus aún es capaz de causar infección. Se maceran 10 g de tejido en solución buffer y a partir de esta se inoculan plantas indicadoras que den reacción local, con diluciones de 10-1 a 10-9 El punto final de dilución será aquel que corresponda a la más alta dilución en la que aún fue posible reproducir síntomas en las indicadoras inoculadas.

5. Mecanismos de transmisión.

Desde un principio debe intentarse la transmisión mecánica ya que este aspecto permite hacer diversos estudios y da una idea del posible grupo de virus al que pertenece el patógeno en estudio.

Independientemente de que se transmita o no de manera mecánica el agente infeccioso, se debe probar la transmisión por insectos y de ser necesario, la posible transmisión por hongos, nemátodos y otros agentes sospechosos de actuar como vector.

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6. Rango de hospedantes

Se prueba la susceptibilidad de hospedantes de distintas especies pertenecientes a la misma familia y a otras distintas a las que pertenece el hospedante principal. En el caso de virus que se transmiten mecánicamente, el virus se inocula mediante frotis; si no se transmite de esta manera, se procede a evaluar la transmisión por insecto, o a hacer transmisión por injerto. Esta fase del estudio requiere de un amplio conocimiento de la biología de los vectores y de las técnicas de cría, ya que se requiere tener colonias limpias de virus y de un manejo cuidadoso para evitar contaminaciones.

7. Serología.

Todas las técnicas anteriores forman parte del protocolo formal para identificar virus desconocidos en una región. Sin embargo, en los diagnósticos de rutina su uso es cada día menor, ya que otras técnicas mas rápidas y eficaces, como la serología presentan amplias ventajas (y algunas desventajas).

La serología constituye una de las herramientas más importantes en estudios tales como: -Diagnósticos rápidos y precisos -Estudios epidemiológicos -Relaciones entre virus y entre sus variantes

8. Bases de la serología.

La técnica se fundamenta en el conocimiento que se tiene sobre la reacción (producción de anticuerpos) que ocurre en los animales de sangre caliente cuando son invadidos por un agente extraño (antígeno; en este caso el virus).

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Los antígenos son moléculas o partículas constituidas por polisacáridos y/o proteínas de elevado peso molecular, ajenas al animal inoculado. De hecho un proceso similar ocurre diariamente en la naturaleza cuando los animales señalados se defienden del ataque de microorganismos potencialmente patógenos. En contraparte los anticuerpos son macromoléculas producidas por el animal inoculado natural o artificial mente. Las reacciones antígeno anticuerpo se caracterizan por ser relativamente específicas. Así un antígeno "A" dará origen a un anticuerpo "A" y un antígeno "B" inducirá la síntesis de un anticuerpo "B"; pero ni "A" dará origen a "B" y viceversa; tampoco "A" ni "B" producirán anticuerpos C, D...ni N.

Los anticuerpos son proteínas del tipo de las gamaglobulinas específicas. Los anticuerpos funcionan como un sistema de defensa específica contra el antígeno que indujo su formación. Partículas de nucleoproteínas, tales como los virus, funcionan como antígenos; en este caso, la cápside (cubierta de proteína) determina el tipo de antígeno, (según el arreglo de sus aminoácidos) que será producido.

Este fenómeno que ocurre de manera natural también puede ser inducido inoculando animales con virus conocidos, con el fin de aprovechar los anticuerpos producidos en estudios de identificación y diagnóstico de virus. La producción controlada de antisueros (anticuerpos presentes en SL suero sanguíneo) se lleva al cabo en algunos centros de investigación y en los últimos años constituye un próspero negocio de algunos laboratorios que se encargan de producir los a nivel comercial. Ejemplos de estas compañías internacionales son Agdia y Sanofi.

9. Producción de antisueros.

Aunque en si la producción de antisueros no es una taréa complicada, para lograr una alta calidad si se requiere de personal altamente capacitado. En términos generales el proceso consiste en inocular plantas susceptibles con el virus específico. Posteriormente el tejido infectado se macera y se somete a proceso de extracción con solventes, agentes de

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precipitación y otras substancias, auxiliándose también con el uso de centrífugas y ultracentrífugas hasta obtener al virus con la mayor pureza posible.

El virus purificado se inyecta mediante un programa calendarizado en algún animal de sangre caliente, tales como conejos de Nueva Zelanda, caballos, borregos u otros. El virus tiene que combinarse con substancias coadyuvantes antes de inyectarse, para que el virus sea liberado lentamente y no cause un shock en el animal.

Después de cierto número de inyecciones y 5-10 días después de la última, se puede hacer un sangrado previo para checar la concentración de los anticuerpos en la sangre del animal. Una vez determinada la concentración óptima, el animal se puede sangrar parcialmente o se sacrifica (aplicando antes un anticoagulante), tratando de obtener la mayor cantidad de sangre posible. Se deja la sangre en reposo y una vez que esta se coagula, se separa el suero que contendrá los anticuerpos (antisuero), el cual se guarda congelado (-15 a - 25° C) en pequeñas ampolletas cerradas herméticamente, previa incorporación de un microbicida. Este antisuero esta listo para su uso, previa dilución del mismo a las concentraciones adecuadas.

10. Reacciones serológicas.

Es posible aprovechar la capacidad de los anticuerpos para reconocer y acoplarse con el antígeno específico que indujo su formación con fines de identificación de virus. Es decir si tenemos una muestra de una planta infectada con un virus "X" desconocido, podemos utilizar nuestro banco de antisueros para tratar de identificar al patógeno en estudio. Si al hacer reaccionar por separado cada antisuero disponible, y entre nuestros antisueros está un antígeno "X", habrá un reconocimiento y una reacción entre antígeno "X" y los antisueros conteniendo al anticuerpo "X" , pero no con los antisueros "Y", o "Z"; estos últimos darían reacción positiva solo en el caso de que en la muestra hubiera los antígenos (virus) específicos correspondientes.

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Existen diversidad de técnicas disponibles, cada una con ventajas y desventajas, entre las más usuales: Doble Difusión en Agar, Latex, Elisa, Dot Blot, etc. La técnica doble difusión ya se explicó con anterioridad. Aquí se explicará solamente la técnica ELlSA, la cual es la más usada en la mayoría de los laboratorios.

11. ELlSA.

Las técnicas serológicas convencionales (aglutinación, doble difusión en agar) tenían numerosos inconvenientes, tales como una baja sensibilidad, o el efecto de la forma la forma de la partícula, presencia de inhibidores de la reacción presentes en la savia. Estas desventajas quedaron superadas con la técnica ELlSA, la cual revolucionó la serología. Esta técnica desarrollada inicialmente en patología clínica e inmunología, fue adaptada en 1976 para utilizarse en la detección de virus fitopatógenos. Desde entonces ha sido una de las técnicas más utilizadas, junto con las técnicas moleculares como PCR, que fueron desarrolladas poster. El término ELlSA se deriva de "Enzyme-Lynked-I,mmuno-SorbentAssay" que puede traducirse como "Ensayo de inmunoabsorbencia con enzimas conjugadas". La ELlSA es ampliamente usada en investigación por su alta sensibilidad y especificidad, por su carácter práctico y versátil en su metodología, lo que permite trabajar gran cantidad de muestras con pequeñas cantidades de tejido vegetal. Es posible detectar virus aún en plantas con síntomas muy tenues o asintomáticas y permite cuantificar concentraciones del virus. También permite detectar virus en semillas e incluso en insectos vectores. También se pueden detectar hongos y bacterias con ELlSA.

El método ELlSA consiste básicamente de cuatro fases principales:

1. La adsorción de un antisuero específico a la pared de un pozo de plástico (fig. A). 2. Se agrega un extracto de la planta infestada. Las partículas virales se adhieren a los anticuerpos portadas en el antisuero, que previamente se adhirió a las paredes del pozo (fig. B).

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3. De nuevo se agrega el antisuero usado inicialmente, pero conjugado previamente con una enzima (por ejemplo la fosfatasa alcalina). Este conjugado se adhiere al virus (fig. C), de tal forma que este queda atrapado entre el conjugado y el anticuerpo agregado inicialmente (se forma un "sandwich" con el virus en medio). 4. Se agrega un substrato sobre la cual pueda actuar la enzima conjugada (Fig. D). Al combinarse la enzima con el substrato se registra un cambio de coloración a simple vista, cuya intensidad será proporcional a la concentración.

Cabe señalar que entre cada paso el pozo se lava con una solución especial que contiene detergente y se desecha el lavado, de tal manera que si la muestra de savia no tenía al virus correspondiente al antisuero utilizado, en el primer lavado (después del punto 1) los anticuerpos no atraparán ninguna partícula viral (dada su especificidad). Si esto ocurre el conjugado (enzima-anticuerpo) tampoco se pegará y será eliminado por el segundo lavado. Después al agregar el substrato, este no será afectado porque la enzima ya fue eliminada. En consecuencia no habrá cambio de coloración. Esta técnica descrita es la que se usa con mayor frecuencia y se conoce como "ELlSA Sandwich doble anticuerpo". Existen variantes de ELlSA, que se usan en situaciones especiales.

Es claro que la técnica es fácil de llevar al cabo, pero para que su utilización sea confiable se requiere de experiencia, ya que pequeños detalles a veces son la diferencia entre un diagnóstico adecuado y uno errático. La técnica se facilita con el uso de equipo apropiado y en algunos laboratorios bien equipados el procedimiento es semiautomático. Las placas con los pozos se pueden "leer" en un espectrofotómetro especial, para cuantificar la concentración del virus. Un aspecto muy importante es la cantidad de antisueros que se tengan disponibles y la calidad de los mismos. Algunas compañías como Agdia y Sanofi son proveedores de equipo, reactivos y antisueros de alta calidad.

Cabe mencionar que desde la década pasada inició el desarrollo de las técnicas moleculares, las cuales hoy en día han alcanzado un alto desarrollo y su avance es vertiginoso. Técnicas como la de Reacción de la Polimerasa en Cadena (Polymerase Chain

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Reaction = PCR), tienen una sensibilidad mucho mayor que ELlSA, de tal manera que muestras registradas como sanas mediante EllSA (porque el virus está poco concentrado) en realidad si están infectadas. Estas nuevas técnicas tienen una gran importancia en la detección de virus en frutales, semillas, etc. Su utilidad práctica es grande en diversos casos: por ejemplo en la certificación de sanidad de semilla, material propagativo, etc.

Técnicas moleculares.

En este caso se usan técnicas mas sofisticadas, que requieren de equipo especial, que por su alto costo solo se tiene en aquellos laboratorios mas avanzados en la investigación en virológica. Las técnicas moleculares incluyen diversos aspectos del análisis bioquímico de los virus, entre ellas el análisis del genoma vira!. Ejemplos de estas son la Reacción de la Polimerasa en Cadena también llamada PCR, o la Hibridación de Ácidos Nucléicos. Se caracterizan porque son muy sensibles y más precisas que otras técnicas. Regularmente estas pruebas se ejecutan, en casos especiales de diagnóstico o con fines más específicos. Sin embargo, en la medida que los reactivos y el equipo utilizado sea mas barato y cuando exista personas mas capacitado, estas técnicas aparentemente se volverán tan rutinarias como ELISA.

7. Nomenclatura y clasificación

7. 1. Nomenclatura.

A través del tiempo se han seguido varios sistemas de nomenclatura de virus incluyendo el uso de sistemas binomiales, el cual se encuentra solamente en la literatura antigua. Actualmente el nombre particular de cada virus se adopta en base a los síntomas los mas característicos de la enfermedad (a juicio del descubridor del patógeno), en hospedante en el que se observó por vez primera al virus. Así por ejemplo, el Virus Mosaico del Pepino lleva este nombre porque fue descubierto en pepino y uno de los síntomas principales es el mosaico.

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En virología es común el uso de siglas para designar de manera abreviada a los virus, lo cual resulta práctico. Así se utiliza VMP para el Virus Mosaico del Pepino, VMT para el Virus Mosaico del Tabaco o VMAT para el Virus Mancha Anular del Tabaco. Es necesario aclarar que estas abreviaturas se usan de manera uniforme por la mayoría de los investigadores, con el fin de facilitar la comunicación oral o escrita.

Es pertinente señalar que en el idioma inglés también se usan abreviaturas, aunque estas no sean las mismas que en español; en lugar del VMP se usa CMV(Cucumber Mosaic Virus) y en lugar del VMT la abreviatura es TMV (Tobaco Mosaic Virus). En esta época de globalización es muy común el uso de las siglas en inglés para referirse a los virus y algunos investigadores latinos hasta se olvidaron de las siglas en español, para referirse a talo cual virus; por ejemplo todo mundo habla de TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus), en lugar de VMMT para referirse al Virus de la Marchitez Manchada del Tomate. Este fenómeno no es deseable desde el punto de vista idiomático o nacionalista, pero que a veces facilita la comunicación. Resulta evidente que el sistema de nomenclatura en uso resulta inapropiado, ya que los síntomas pueden variar incluso en el mismo hospedante y con el mismo virus. Los síntomas también pueden ser diferentes de acuerdo a la variante del virus y por el efecto del ambiente. Sin embargo el uso del sistema binmial, tan útil en hongos y bacterias, no es aceptado por los virólogos, entre otras razones porque no se acepta que los virus son seres vivos, en sentido estricto. A finales de los años 60 algunos virologo desarrollaron, además del nombre común, un sistema de criptogramas que no es muy utilizado por los fitopatólogos en la práctica. Con fines ilustrativos a continuación se anota el criptograma específico que corresponde al VMT:

R/1: 2/5: E/E: S/O

En el criptograma anterior el significado de cada componente es:

R/1= La R significa que el virus está compuesto por ARM; el número 1 indica que la cadena del ARN es de una sola banda.

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2/5= El 2 representa el peso molecular del ácido nucleico, expresado en millones. El 5 representa la proporción (%) de ARN que posee la partícula. E/E= Se representa aquí la forma de la partícula que recubre al ARN (envoltura / elohagada o varilla). S/O= Describe el tipo de hospedante (en este caso plantas de semilla o angiosperma). El 0 (cero) indica el tipo de vector que en este caso no existe).

7.2. Clasificación.

Hasta 1985 (Walkey, 1985) los virus de las plantas se hallaban clasificados en 27 grupos de los cuales se estructuraron en base a las propiedades físicas, químicas y biológicas; es decir según la forma de la partícula, tipo de ácido nucleico (ARN o ADN), número de cadenas o bandas de ácido (1 o 2 bandas) en las partículas de cada virus, así como el mecanismo de transmisión conocido.

Características principales de los grupos de virus fitopatógenos. Transmisión Tamaño de partícula Grupo ARN 1 Cadena 1. Poliédricos Luteovirus Enanismo clorótico Maíz Sobemovirus Necrosis del Tabaco Tombushvirus Tymovirus Comovirus Dianthovirus Nepovirus Mosaico Ena. Chicharo Mosaico de la Alfalfa Bromovirus Cucumovirus Llarvirus

25 30

Rango de hospedantes

Semilla

A,E E

28 26-28 30 28-30 24 31-34 28 30

E A A E E

+

A E

+

18-58x28 26 28 26-35

A E A A

+ + +

Mecánica

Vector

-

A –p CH –sp

+ + + + + + + +

Co Ho Co Co –p Ne A –p

+ + + +

A –np Co, Ne A –np T

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Moteado “Velvet del 30 Tabaco” 180-215 y 162. Varillas 114x22 Tobravirus 300x18 Tobamovirus 100-150x13 Potexvirus 470-580x13 Carlabirus 620-7200x13 Potyvirus 680-900x11 Closterovirus 600-2000x10 3. Envueltos Rhadovirus 160-380x5095 Tospovirusa 85 ARN 2 cadenas Phytoreovirus 70 (poliédricos) Fijivirus 70 (poliédricos) ADN 1 cadena Geminivirus 18-20 (poliédricos) ADN 2 cadenas Caulimovirus 50 (poliédricos)

E

+

Co

+ + + + +

Ne, Co A- np A- np A- sp –p A , Ch –p

+ -

T –p Ch –p Ch –p

-

Ch –p

-

Ch –p, Mb–p

+ A A E E, A E A, E A

+ +

+

A

E

A, E

-

A –np

E

*Cuadro elaborado en base a información de Wakley, 1985. Rango amplio (A) o estrecho (E) de hospedantes. Vectores: A= afidos, Ch = Chicharras, Co = Coleópteros, Ho = hongos, Mb = Mosca Blanca, Ne = Nemátodos, T = Trips. Tipo de transmisión: p = persistente, np = no persistente, y sp = semipersistente. *Los Rhabdovirus son de forma baliforme y los tospovirus de forma poliédrica; ambos están recubiertos por una capa de lípidos * Espacios en blanco significa que no se tuvo información disponible. *Geminivirus están compuestos por dos partículas unidas. Cuadro. Algunos ejemplos de virus importantes en México. Grupo

Virus

Luteovirus

Enrollamiento de la Hoja de la Papa

Nepovirus

Mancha Anular del Tabaco

Sobemovirus

Mosaico Sureño del Frijol

Mosaico de la alfalfa

Mosaico de la Alfalfa

Cucumovirus

Mosaico del Pepino

Tobamovirus

Mosaico del Tabaco, Mosaico del Tomate

Potexvirus

“X” de la papa

Potyvirus

“Y” de la papa, Mosaico Común del Frijol, Mancha anular de la

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Papaya, Mosaico de la Sandía, Jaspeado del Tabaco Closterovirus

Tristeza de los Cítricos

Tospovirus

Marchitez Manchada del Tomate

Geminivirus

Chino del Tomate, Mosaico dorado del Fríjol, Enrrollamiento de la Hoja de la Calabaza.

Unidad 5 CONTROL DE ENFERMEDADES VIRALES Desde el punto de vista práctico el principal objetivob de la virología es obtener control de las enfermedades causadas por estos agentes. Para lograr lo anterior es necesario:

a) La identificación de los agentes involucrados b) Tener conocimientos básicos sobre la epidemiología del patógeno: fuentes de inóculo primario y secundario, transmisión mecánica, y por semilla, vectores y tipo de transmisión, etc.

A diferencia de hongos y bacterias, los virus no pueden ser controlados con substancias químicas específicas. Una vez que el virus ha infectado a una planta resulta sumamente difícil su eliminación. Sin embargo existen diversas medidas preventivas que permiten evitar disminuir la incidencia de plantas enfermas. Generalmente se requiere de mas de una medida de control, que aplicada de manera integrada con otras prácticas, permiten lograr un manejo de la enfermedad. Entre las medidas más importantes se hallan:

1. Eliminación o evasión de fuentes de inóculo.

El inóculo (partículas de virus) se puede hallar en diversos lugares (fuentes de inóculo), tales como plantas de maleza o de cultivo, semillas y en insectos vectores. El virus puede estar activo o latente. La fuente de inóculo primario se refiere a aquellos lugares u organismos en los que se albergan los virus que causan las primeras infecciones de la temporada en el cultivo. Las plantas infectadas con el inóculo primario multiplican al

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virus y así se constituyen en fuentes de inóculo secundario. La eliminación del inóculo primario se puede lograr mediante:

1.1 Eliminación de hospedantes alternativos.

La mayoría de los virus atacan a otros hospedantes distintos al principal, tales como maleza o plantas silvestres que desarrollan dentro o fuera del terreno de cultivo. Estos pueden actuar como reservóreos de inóculo y entre, mas cerca se hallen, la influencia puede ser mayor del cultivo. la dispersión del virus de estas fuentes de inóculo se da principalmente mediante insectos vectores. Por lo anterior la eliminación de maleza dentro y por las orillas del lote, así como en drenes o canales cercanos deberá hacerse varios días antes de establecer el cultivo. Con este fin se pueden usar herbicidas o medios mecánicos y manuales.

1.2.Saneamiento.

Comprende el arranque o destrucción en su sirio, de las primeras plantas que resulten infectadas. Es una práctica útil en las primeras etapas de desarrollo del cultivo y/o de las epidemias; es decir cuando existan pocas plantas enfermas. Es importante que antes de hacer el saneamiento se efectúe una aplicación “fuerte” (de productos de acción rápida) contra los insectos, ya que si no se hace, los insectos presentes en las plantas enfermas volarán a las sanas, aumentando la gravedad del problema. El saneamiento también debe incluir a las plantas mostrencas (“voluntarias”) que crecen fuera del ciclo de cultivo.

En ocasiones resulta difícil confirmar visualmente (en base a síntomas) la ausencia de virus en una planta, ya que los síntomas podrían estar enmascarados. Este factor es de especial interés en árboles frutales, ya que la detección oportuna de plantas enfermas asintomáticas permitiría su erradicación oportuna y/o al menos evitar su uso de los materiales a usa en propagación se puede hacer uso de las técnicas serológicas como ELISA o de métodos moleculares como la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR).

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1.3. Evitar traslape de cultivos.

Se pretende romper el ciclo; es decir, evitar la continuidad de la enfermedad en el espacio y en el tiempo. Este principio se puede aplicar evitando siembras secuenciadas de especies de ciclo corto en el mismo terreno. Por ejemplo, es común que en suelos con acolchado se arranquen plantas viejas de calabaza (a veces con incidencias superiores a 50% de virósis) y se siembra de nuevo sin arar el terreno. Al destruir las plantas viejas, los insectos se albergan en el suelo, en maleza o en cultivos vecinos. Una vez establecido el nuevo cultivo, epidemia desarrolla en forma temprana a partir de abundantes fuentes de inóculo primario.

1.4. Selección del sitio de siembra.

Se debe evitar el establecimiento de cultivos nuevos en lotes cercanos o colindantes a plantaciones viejas. Los vectores prefieren generalmente las plantas nuevas, por lo que tienden a emigrar de los plantíos en senescencia. Se debe rastrear dichos lotes abandonados antes d establecer un nuevo cultivo, e inclusive de debe valorar una posible aplicación previa de insecticidas "fuertes" antes del rastreo, sobre todo se va a establecer una plantación de la misma especie a la del lote abandonado de vecinos.

La selección del sitio de siembra es también de gran importancia en la producción de semilla certificada, ya que se debe evitar esta práctica en valles altamente contaminados con virus. Por ejemplo la semilla de papa es producida por algunos productores en regiones aisladas de Chihuahua y Jalisco, con éxito relativo.

1.5. Higiene del cultivo.

Para evitar la introducción y dispersión del inóculo a un lote o invernadero, se pueden tomar diversa medidas tales como evitar el manipuleo excesivo de las plántulas por los obreros, evitar en lo posible entrada de fumadores en los invernaderos de tomate y chile.

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También se recomienda la desinfección de herramientas y de las manos de los obreros, con la idea de prevenir la dispersión de virus como el VMT, de manera mecánica.

Entre los productores de sandía es muy común el acomodo de guías, y el descole. Se ha demostrado que estas prácticas incrementan significativamente la dispersión mecánica de virus. Se recomienda la desinfección de manos y herramientas con agua con cloro. Una situación similar se da en los cultivos de tomate bajo estacado, ya que los desbrotes o las podas, conllevan a la transmisión de virus y bacterias. Conviene valorar este factor de riesgo antes de iniciar esta práctica y hacer lo posible por disminuir al máximo el problema mediante la desinfección de herramientas (cuchillas y tijeras).

1.6. Selección de la época de siembra.

Este factor esta muy ligado a la fluctuación poblacional de vectores en cualquier región. El conocimiento del comportamiento de las poblaciones de vectores más importante permite tomar algunas decisiones tendientes a disminuir los riesgos de epidemias devastadoras. Así es posible escoger la época de siembra más favorable o al menos estar prevenido si se escoge una época más riesgosa. Por ejemplo, aunque el tomate se puede establecer en el Valle del Fuerte, a partir de septiembre, las compañías que siembran tomate para uso industrial, prefieren sembrar hasta en noviembre con la idea de evadir en lo posible las poblaciones de mosca blanca (como plaga y como vectores de geminivirus) y de trips (únicos vectores del Virus de la Marchitez Manchada del Tomate). Los productores que siembran muy temprano tienen el riesgo de pérdidas totales por lo que tienen que gastar mas en insecticidas y a veces estas son infructuosas.

1.7. Uso de semilla sana.

En algunas enfermedades virales, e uso de semilla sana es uno de los aspectos más importantes, sobre todo cuando no existen otras fuentes importantes de inóculo primario. Un ejemplo común es el del Virus del Mosaico Común del Frijol (VMCF). Aunque el VMCF puede albergarse en algunas leguminosas silvestres, la transmisión por semilla llega

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a ser la fuente de inóculo más importante. Otro ejemplo ilustrativo es el del Virus Mosaico de la Lechuga, ya que en California se determinó que mediante el uso de semilla sana se pueden incrementar los rendimientos hasta en 30%. El uso de semilla vegetativa libre de virus es de especial interés en papa (tubérculos) y en ornamentales (esquejes, bulbos).

1.8. Árboles de vivero sanos.

La sanidad de los arboles de vivero no solamente debe de efectuarse en base a la apariencia libre de síntomas de la planta. En cultivos como cítricos es conveniente analizar la sanidad de las plantas de vivero antes de su establecimiento en el campo. Esto se puede hacer mediante ELlSA o PCR.

2. Control químico de vectores.

Se han obtenido resultados satisfactorios en el control de vectores aéreos transmisores de virus en la forma persistente, tales como los transmitidos por mosca blanca, chicharritas y trips. En estos casos los insecticidas matan al insecto 27 antes de que logre transmitir al virus. Recuérdese que en estos casos tanto el período de adquisición como el de inoculación es relativamente lento y que además se requiere de un período de incubación en el vector, de tal manera que la muerte del insecto en alguna de estas fases, rompe la transmisión. Sin embargo cuando las poblaciones de estos insectos son demasiado altas y las fuentes de inóculo muy abundantes, el control de estas virosis no es eficiente, aún con los insecticidas más potentes. Este fenómeno se puede ilustrar en varias regiones de México con el problema de la mosca blanca, insecto que adquirió resistencia a prácticamente todos los insecticidas comúnmente empleados. Por lo anterior el uso de nuevos productos eficientes contra mosca blanca, (como el Confidor), deberá ser muy cuidadoso.

En contraste, el uso de insecticidas contra virus transmitidos de manera no persistente ha tenido resultados erráticos e infructuosos, sobre todo cuando se quiere depender de este único método para abatir las virósis. En el caso de la mayoría de los virus transmitidos por áfidos, tanto la adquisición como la inoculación del virus se pueden efectuar en cuestión de

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segundos y no se requiere de un período de incubación. El uso de insecticidas (aún los mas fulminantes) no maten al insecto de inmediato; La excitación nerviosa inducida por el tóxico altera su comportamiento, tornándose temporalmente más activos de tal forma que tienden a hacer mas "piquetes de prueba". En consecuencia el número de plantas visitadas puede aumentar y la incidencia se llega a incrementar substancialmente. A lo anterior hay que agregar que muchas de las especies de áfidos también han desarrollado resistencia a numerosos insecticidas. En cultivos de bajo valor económico no puede ni pensarse en este método.

En países como Inglaterra, se cuenta con sistemas de pronóstico de enfermedades virales, mediante un esquema de manejo integrado, en cultivos de remolacha, cebada y papa. El control de vectores es técnicamente posible mediante la aplicación de insecticidas granulados de lenta liberación. Tal es el caso del Témik. El control de virus transmitidos por nemátodos y hongos es también factible mediante la oportuna aplicación de nematicidas o fungicidas. Sin embargo en México no existe experiencia con estos patosistemas, que solamente ocurre en ciertos cultivos y en condiciones muy específicas, según se ha reportado en otros países.

3. Control Físico.

3.1. Barreras biológicas.

Consisten generalmente del establecimiento de hileras de plantas no susceptibles en las orillas o alrededor de las plantaciones, buscando romper el mecanismo de transmisión, sobre todo en el caso de virus no persistentes. Se pretende que el áfido visite las plantas de la barrera antes de alimentarse de las plantas cultivables. Se señala que los áfidos tienen la costumbre de picar cualquier especie sobre la que aterricen, con el fin de probar (tientas) una posible fuente de alimento. Se supone que en estos ensayos de alimentación el estilete presuntamente contaminado con partículas virales, es limpiado al efectuar estos piquetes, posteriormente al emigrar el insecto al cultivo, ya va libre de virus no persistentes.

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En la región se usan principalmente barreras de maíz o de zacate Sudán, alrededor de lotes de hortalizas. Estas barreras se deben establecer con suficiente anticipación para que lograr una mayor efectividad. Existe la opción de aplicar insecticidas residuales en las plantas de la barrera, para que los vectores mueran ahí. La eficiencia de esta técnica es limitada bajo una alta presión de vectores.

En Veracruz se han evaluado las barreras de plantas de jamaica para limpiar estiletes de áfidos, en un intento de controlar al Virus de la Mancha Anular de la Papaya, con éxito limitado.

3.2. Superficies reflejantes.

Algunos materiales que reflejan la luz solar se han usado también para ahuyentar insectos vectores. Por ejemplo se ha observado que los plásticos (usados en acolchado) de color gris o plateado son repelentes de trips y de áfidos. Se obtiene protección durante las primeras etapas del cultivo, pero una vez que el follaje cubre la cama, la capacidad reflejante disminuye considerablemente. Algunos productores usan también tiras de papel aluminio con este propósito; en este caso las tiras se cuelgan de las estacas de las espalderas. 3.3. Franjas amarillas.

En la región se generalizó el uso de pancartas, botes y franjas de plástico de color amarillo; especialmente estas últimas. En estas se atrapan altas cantidades de insectos vectores ya que este color atrae a diversos insectos, especialmente áfidos y moscas blancas, que quedan atrapados en el pegamento depositado previamente sobre estas trampas. Una variante es el uso de franjas de color azul, el cual es preferido por los trips.

3.4. Cubiertas de plástico.

Incluye el uso de láminas de polietileno transparente con perforaciones ("plásticos multiperforados") y el agribón. En esta región se utilizan generalmente en tomate, y

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cucurbitáceas. La idea es evitar el acceso de los insectos a las plantas en etapas tempranas de desarrollo, por lo que estas láminas de deben de colocar antes de la emergencia o inmediatamente después del trasplante. Las cubiertas se retiran generalmente 30-45 días después, con el fin de que la planta complete su desarrollo normalmente.

3.5. Aceites.

El uso de derivados del petróleo para el control de virosis transmitidas por áfidos o mosca blanca, fue común en años pasados. Se pretende que la fina película de aceite depositada sobre el follaje sirva como "filtro limpiador" del estilete contaminado por el virus. En otras palabras, cuando un áfido se alimenta de una planta enferma las partículas virales son atrapadas por el aceite al extraer el estilete; o cuando un áfido con el estilete contaminado llaga a alimentarse de una planta sana tratada, el virus es desprendido por el aceite, antes de que el estilete ingrese en el tejido sano.

La eficiencia de esta técnica ha sido de moderada a baja, ya que se requiere de una buena cobertura de la superficie de la planta, lo cual no es siempre fácil de lograr con los equipos convencionales de aspersión. Se reporta que en Israel se ha logrado una buena eficiencia mediante el uso de aceites aplicados a alta presión. Otro inconveniente es el riesgo potencial de fitotoxicidad de los aceites.

3.6. Termoterapia.

El material vegetativo (generalmente en estado de reposo; semillas, bulbos ,esquejes, tubérculos) se puede tratar con aire o agua caliente, siendo mas común esto último. Para lograr el éxito es necesario conocer la susceptibilidad del virus al calor, así como la de la planta u órgano a tratar. Generalmente se usa en material vegetativo de alto valor económico o biológico.

La termoterapia se puede utilizar en combinación con técnicas de cultivo de tejidos. Entre los virus más fáciles de eliminar se encuentran los Virus X, Y y del enrollamiento de

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la Papa; por el contrario uno de los más difíciles es el VMT que es termoestable aún a 900 C.

4. Protección cruzada.

Este método de control se basa en un principio análogo al de inmunización de animales de sangre caliente mediante el uso de vacunas. Las plantas de interés se inoculan deliberadamente con cepas .débiles o atenuadas artificialmente, antes de que estas resulten infectadas por el patógeno en el campo. Se pretende estimular los mecanismos de defensa de la plantas (proceso análogo a la inducción de anticuerpos en humanos) de tal forma que al llegar el patógeno silvestre se encuentra con los posibles sitios de infección ocupados.

Esta técnica se utilizó en los años 70, contra el VMT en tomate. Cepas silvestres del virus se trataron con ácido nitroso para obtener mutantes debilitados, que posteriormente se inoculaban en tomate. Con esta técnica se logró incrementar la producción en 15% en algunos invernaderos de Europa. Ya no se utilizó esta técnica, una vez que se obtuvieron variedades resistentes al VMT.

En Brasil también se obtuvieron buenos resultados con esta técnica, pero contra el Virus Tristeza de los Cítricos. En Hawaii se utiliza exitosamente la protección cruzada contra el Virus de la Mancha Anular de la Papaya. Desafortunadamente, en México se evaluaron algunas de estas cepas debilitadas procedentes de EUA, pero no se obtuvo control de la virosis del papayo. La protección cruzada es un método riesgoso, ya que a partir de las cepas virales alteradas se pueden originar nuevas variantes aún más agresivos que el virus silvestre. Es una opción conveniente en ausencia de otros métodos de control.

5. Resistencia genética.

5.1. Conceptos y principios generales.

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El control genético consiste en la utilización de variedades resistentes o tolerantes a virus. Este método se basa en el hecho de que en cualquier población de plantas existe variabilidad genética; es decir que en el caso particular de un determinado virus una especie de plantas puede tener variedades o clones que son resistentes o inmunes al patógeno; igualmente habrá individuos altamente susceptibles o medianamente susceptibles.

Susceptibilidad. Una planta susceptible es aquella que permite fácilmente la infección y la multiplicación del virus. Es lo opuesto a resistente. Alta susceptibilidad y baja resistencia son sinónimos. Inmunidad. Son plantas que no llegan a ser infectadas. Se consideran aquí a las plantas que no son hospedantes de determinado virus. De hecho la mayoría de las plantas son inmunes a la mayoría de los virus. La inmunidad es la regla, la susceptibilidad es la excepción. Resistencia. Es aquella que es capaz de retardar o suprimir la multiplicación de un virus, o de retardar el desarrollo de los síntomas de la enfermedad. Es lo opuesto a susceptible. Se han reconocido varios tipos de mecanismos de resistencia a virus, que pueden agruparse en: a) resistencia a la infección; b) resistencia a la multiplicación; c) resistencia al movimiento del virus en la planta. En el caso de la resistencia a la infección se ignoran muchas cosas, pero se puede deber a diversos factores. Algunos de ellos es la presencia de cutícula gruesa y setas o pilosidad abundante que interfiera con la alimentación de los vectores. Algunos materiales resistentes limitan la multiplicación de virus a pesar de ser infectados, tal y como ocurre en algunos cultivares de tabaco con VMT o de pepino con VMP. Resulta obvio suponer que algunas substancias de las plantas tienen propiedades inhibidoras de la multiplicación. En cambio algunos materiales resistentes al Virus Y de la Papa, el movimiento del virus se retarda significativamente, lo cual posiblemente se deba a la acción de ciertas proteínas involucradas en la translocación de virus. Tolerancia. La planta es susceptible al virus, pero los síntomas desarrollan lentamente o son moderados. La concentración del virus y su movimiento en la planta es similar al de las plantas susceptibles. Tolerancia no es sinónimo de resistencia.

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Hipersensibilidad. Es un caso extremo de alta resistencia. Una vez que el virus se introduce a la planta, el tejido inoculado muere y el virus generalmente no se dispersa en la planta. El resultado puede ser una lesión local necrótica o la muerte completa por un shock de la planta. En el primer caso se puede usar este mecanismo para obtener variedades resistentes.

5. 2. Tipos de resistencia.

Resistencia vertical.

Tipo de resistencia que se debe generalmente a uno o pocos pares de genes. Tiene la desventaja de que con frecuencia la resistencia es rota por alguna nueva variante del virus. La ventaja es que este tipo de resistencia es más fácil de incorporar en las plantas y de manejar durante el proceso de mejoramiento. El nivel de resistencia puede ser del 100% Y el ambiente no determina generalmente a este tipo de resistencia. También se le denomina resistencia monogénica.

Resistencia horizontal.

Es controlada generalmente por muchos pares de genes que trabajan de manera coordinada. La ventaja es que esta resistencia es más estable, ya que no es generalmente afectada por las variantes. Es más difícil de incorporar y de manejar durante el proceso de obtención de variedades. El nivel de resistencia es variable y puede ser afectado por las condiciones ambientales.

5. 3. Fuentes de resistencia.

La primer gran taréa en cualquier programa de mejoramiento clásico es identificar germoplasma que posea un alto nivel de resistencia al patógeno. A veces este factor se encuentra en variedades comerciales en uso ya usadas con anterioridad. Esta resistencia

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también se puede aprovechar para integrarla a un material que tiene resistencia a otros patógenos. Cuando la resistencia es conferida por un par de genes el proceso se hace más simple. A veces hay que probar muchas variedades conocidas y líneas en desarrollo para poder detectar alguna resistencia. Con frecuencia los materiales resistentes no presentan buenas características agronómicas y hay necesidad de cruzarlos con materiales susceptibles que si los posean, para poder obtener la variedad deseada. Lo más deseable es contar con genotipos resistentes con diferentes características agronómicas aceptables, que se ajusten a las necesidades de los productores.

A veces sucede que en una variedad susceptible de buenas características agronómicas se detectan una o pocas plantas que pueden seleccionarse o mejorarse para lograr un material resistente. Puede suceder que no se detecta resistencia en ninguna variedad comercial y entonces se tienen que buscar fuentes de resistencia en materiales silvestres de la misma especie o de especies del mismo género.

El proceso de obtención de variedades resistentes no es fácil. Es una taréa laboriosa que requiere de una alta preparación teórica y práctica. La cruza de materiales silvestres con cultivados puede dar origen individuos no fértiles, pero con el auxilio de técnicas de cultivo de tejidos se pueden lograr resultados satisfactorios. Mediante procedimientos de biología molecular de pueden extraer genes de una especie resistente e insertarse en otra especie, lo que en condiciones normales sería imposible, por la incompatibilidad entre especies. Este tipo de técnicas empieza a utilizarse con éxito, pero aún se sabe poco de los riesgos de estas plantas transgénicas.

Una vez obtenida la variedad resistente puede suceder que presente características agronómicas indeseables, por lo que es necesario hacer retrocruzas para incorporar los factores deseados. Siempre es deseable incorporar resistencia a otros patógenos importantes, ya que una variedad resistente a determinado virus puede ser de poco valor si es susceptible a otro virus o patógeno importante.

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El control de patógenos y plagas mediante variedades resistentes tiene la ventaja de que es él más económico, contribuye a disminuir la contaminación y es fácil de utilizar. El desarrollo de variedades resistentes es aún más importante cuando no existen otros métodos eficientes y económicos de control. Entre los inconvenientes se mencionan el largo tiempo requerido para desarrollar las variedades resistentes, mismas que además deberán poseer características agronómicas aceptables, característica que resulta especialmente importante en el caso de productos hortícolas. Para obtener una variedad resistente mediante los métodos tradicionales se puede tardar 8 o más años, tiempo que se puede acortar notablemente mediante el uso de los nuevos métodos de mejoramiento, en los que se hace uso de la biología molecular y del cultivo de tejidos. El costo de las variedades resistentes es alto durante el proceso de obtención, pero en el caso de productos de grano básico, es siempre la mejor opción, pues resulta antieconómico el uso de otros métodos.

5. 4. Variación patogénica de los virus.

Sin embargo el principal inconveniente de este método, es que con frecuencia la resistencia de las variedades es "rota" por el desarrollo de cepas llamadas variantes del virus, que llegan a afectar severamente a genotipos de plantas que normalmente no eran atacadas por las variantes comunes conocidas. Esto se debe a que así como entre las plantas existe variabilidad genética, en los virus también ocurre, ya que pequeños cambios en las cadenas de ácido nucleico pueden bastar para que surja una nueva variante que sea capaz de vencer la resistencia de las variedades. La existencia de variantes virales complica el proceso de mejoramiento y la durabilidad misma de la resistencia. Puede suceder que la resistencia a un virus en una región es rota en un tiempo más corto que el requerido para desarrollar la propia variedad. Una variedad resistente en una región puede no serio en otras en las que se presentes diferentes variantes del mismo virus (en variedades con resistencia vertical) o en donde las condiciones ambientales sean distintas (en variedades con resistencia horizontal).

Una de las grandes desventajas de la agricultura moderna ha sido que en muchos casos los programas de mejoramiento genético se enfocaron a la obtención de variedades de

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alto rendimiento y calidad alimenticia o de aspecto agradable al consumidor. Esto provocó el descuido en lo relativo a la resistencia a plagas y patógenos, ya que la mayoría de estos genotipos rendidores o de alta calidad comercial, con frecuencia son demasiado susceptibles a diversos patógenos.

En cursos posteriores se profundizará más sobre este tema.

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