Monografia de Microbiologia

UNIVERSIDAD NACIONALDE JAÉN CARRERA PROFESIONAL: INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

TRABAJO MONOGRÁFICO CURSO: Microbiología TEMA: Reproducción Bacteriana DOCENTE: Juan Javier Pedro Huamán ALUMNA: Mileidy Guevara Benavides CICLO: III FECHA: 22 -05 -2014

JAEN-PERU

INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

1

INDICE INTRODUCCION………………………………………………………………………… .3 REPRODUCCION BACTERIANA………………………………………………………4

TIPOS DE REPRODUCCION BACTERIANA…………………………………………4 FORMACION DE ENDOESPORAS ……………………………………………………6 CULTIVOS PUROS………………………………………………………………………8 TECNICAS PARA LA OBTENC ION DE CULTIVOS PUROS……………………….8 METODOS PARA LA OBTENCION DE CULTIV OS PUROS……………………….8 CONSERVACION DE CULTIVOS PUR OS…………………………………………... 10

INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INTRODUCCIÓN Las bacterias constituyen un grupo taxonómico muy importante en la naturaleza por su papel de microorganismos descomponedores que cumplen, el alto número de especias identificadas y la gran diversidad de ambientes que ocupan: suelo, agua, aire, manantiales calientes, pozos de petróleo, dentro y sobre el cuerpo de humanos y animales. No todas las bacterias son perjudiciales, existe una gran cantidad de especies benéficas que intervienen en el ciclo del carbono y del nitrógeno, como descontaminantes del medio ambiente y como control biológico de plagas; mientras algunas especies si son patógenas llegando a originar enfermedades como el cólera, la fiebre tifoidea e intoxicaciones alimenticias.

Figura 1


I.

Reproducción Bacteriana En las bacterias, el aumento en el tamaño de las células (crecimiento) y la

reproducción por división celular están íntimamente ligados, como en la mayor parte de los organismos unicelulares. Las bacterias crecen hasta un tamaño fijo y después se reproducen por fisión binaria, una forma de reproducción asexual .En condiciones apropiadas, una bacteria Gram-positiva puede dividirse cada 20 –30 minutos y una Gramnegativa cada 15 –20 minutos, y en alrededor de 16 horas su número puede ascender a unos 5.000 millones (aproximadamente el número de personas que habitan la Tierra). Bajo condiciones óptimas, algunas bacterias pueden crecer y dividirse muy rápido, tanto como cada 9,8 minutos.105 En la división celular se producen dos células hijas idénticas. Algunas bacterias, todavía reproduciéndose asexualmente, forman estructuras reproductivas más complejas que facilitan la dispersión de las células hijas recién formadas. Ejemplos incluyen la formación de cuerpos fructíferos (esporangios) en las mixobacterias, la formación de hifas en Streptomyces y la gemación. En la gemación una célula forma una protuberancia que a continuación se separa y produce una nueva célula hija.

Tipos de reproducción bacteriana Tenemos:

1 Asexualmente, por bipartición o división binaria. Es la forma más habitual. En ésta, después de la replicación del ADN, dirigida por la ADN polimerasa de los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un tabique transversal que separa las dos nuevas bacterias.

a) Fisión binaria (bipartición) El mecanismo de reproducción habitual en bacterias es la bipartición. Mediante este mecanismo se obtienen dos células hijas, con idéntica información en el ADN circular, entre sí y respecto a la célula madre, y de contenido citoplásmico celular similar. Las células hijas son clones de la progenitora. Por este sistema de reproducción se puede originar una colonia de células con material idéntico; sin embargo, esto no ocurre debido al alto índice de mutaciones que se producen en las bacterias. La bipartición se produce cuando la célula ha aumentado su tamaño y ha duplicado su ADN. El ADN bacteriano se une a un mesosoma, que separa el FIGURA 2 INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

citoplasma en dos y reparte cada copia del ADN duplicado a cada lado. Al final del proceso el mesosoma se ha unido al resto de la membrana plasmática y se han formado dos células hijas genéticamente iguales.

b) Gemación Se forman dos núcleos, uno de ellos se desplaza hacia la membrana y forma una especie de yema o botones en la superficie del organismo unicelular que se rodea de citoplasma formándose dos células de diferentes tamaños. Ej. Noctiluca sp.

c) Esporulación Consiste en una serie de divisiones por mitosis del núcleo que se rodea de citoplasma se forma la membrana de cada una y al romperse la célula original quedan en libertad numerosas células llamadas esporas. Ej. Plasmodium sp. Agente que provoca el paludismo o malaria.

2 Mecanismos parasexuales En ocasiones, la célula bacteriana tiene la oportunidad de intercambiar información genética por procesos de recombinación. Estos procesos son la transformación, la transducción y la conjugación. En estos procesos no hay formación de ningún tipo de gametos, por lo que no es reproducción sexual.

a) Transformación: Consiste en el intercambio genético producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive

b) Transducción:

FIGURA 3

En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

FIGURA 4


c) Conjugación Este proceso se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F, que contiene la información genética para formar Pili, puentes que sirven de unión citoplásmica entre dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se denomina F+; la célula que no lo contiene se llama F-. La bacteria F+(donadora de información) se une a una bacteria F(receptora) mediante uno de sus Pili. A través de él introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se convierte en bacteria F+.

FIGURA 5

En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo del ADN bacteriano. Entonces, la bacteria donadora se denomina Hfr (High frequency of recombination). De esta forma la bacteria Hfrpuededonar a otras células cualquier gen de su ADN.

II.

Formación De Endoesporas Diversas bacterias Gram positivas pueden formar una estructura latente, de especial

resistencia, denominada endoesporas. Las endoesporas se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas de tan sólo algunos géneros como: Bacillus y Clostridium (bacilos), y Sporosarcina (cocos). Estas estructuras son extraordinariamente resistentes a situaciones estrechamente ambientales, como calor, radiación ultravioleta, desinfectantes químicos y desecación. De hecho, algunas endoesporas han permanecido viables durante unos 100 000 años, habiéndose recuperado vivas endoesporas de actinomicetos (que no son auténticas endoesporas), después de haber estado enterradas en el barro durante 7500 años. Debido a su resistencia y al hecho de que varias especies de bacterias formadoras de endoesporas son agentes patógenos peligrosos. Las endoesporas tienen una gran importancia en microbiología alimentaria, industrial y médica. Las endoesporas sobreviven a menudo la cocción durante una o más horas; por ello, hay que emplear autoclaves, para esterilizar muchos materiales. Las endoesporas tienen también un interés teorético considerable. Como las bacterias producen estas entidades intrincadas de una manera muy organizada, en pocas horas, la formación de endoesporas es un tema muy conveniente para investigar la construcción de estructuras biológicas complejas. En el ambiente, las endoesporas permiten la supervivencia de las bacterias cuando la humedad o los nutrientes son escasos. Resistencia de endoesporas a temperaturas elevadas. Las endoesporas pueden estar situadas centralmente, cerca de un


extremo (subterminal), o claramente terminales .La endoesporas está a menudo rodeada por una capa delicada y delgada, denominada exosporio

Formación de una Endoesporas en un Bacilo Gram Positivo Etapa0 La célula se encuentra en la etapa final de crecimiento exponencial y contiene dos cromosomas. Etapa 1 El DNA celular se hace más denso y ocupa el centro de la célula. Comienza un importante recambio intracelular de proteínas. Etapa 2 Se forma un tabique (septo) cerca del polo celular a causa de la invaginación de la membrana citoplasmática. El DNA es segregado en dos compartimentos (la espora en desarrollo y la célula madre). Etapa 3 El citoplasma de la espora en formación queda delimitado por dos membranas debido al crecimiento de la membrana citoplasmática alrededor del protoplasto. La membrana más interna se transformará en la membrana citoplasmática de la espora en germinación Etapa 4 Comienza a formarse la corteza de la espora por el depósito de un peptidoglicano esporoespecífico entre la membrana externa e interna. La espora aparece como un cuerpo refractario, comienza a acumularse calcio, y a sintetizarse Acido Dipicolínico. Etapa 5 Aparece el exosporio. La membrana exterior se transforma en la capa cortical por la incorporación de proteínas ricas en cisteína. Esta etapa le confiere a la espora resistencia frente a los agentes antimicrobianos. Resistencia frente a

los agentes antimicrobianos.

Etapa 6 Maduración de la espora. Su citoplasma se vuelve homogéneo y electrodenso. La capa cortical se completa.

Etapa 7 La endoesporas es liberada por la lisis de la célula.


III.

CULTIVOS PUROS Son aquellos que contienen un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener

estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones).

Obtención de un cultivo puro La obtención de un cultivo puro se hace mediante una técnica de aislamiento. La técnica de aislamiento más utilizada consiste en sembrar en un medio de cultivo sólido en placa de tal manera que los microorganismos generen colonias separadas ("Aislamiento por agotamiento en estrías"). Se sabe que cada colonia procede de una sola célula. Por lo tanto el cultivo descendiente de una colonia es un cultivo puro.

Características de los cultivos puros Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y color Que no existan formas inhibidas. Al microscopio deben tener un aspecto común. Tiene que tener iguales propiedades tintoriales Deben ser bioquímicamente y fisiológicamente iguales. Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

IV.

TÉCNICA DE LA SIEMBRA La técnica para el aislamiento comienza preparando un inóculo de siembra, que es

la deposición de una pequeña porción de la muestra en el medio o en los medios de cultivo adecuado, en función de las especies microbianas que se espera encontrar. Por eso existen distintos métodos o tipos de siembra, en función de la muestra de partida, del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos la siembra para inoculación y la siembra para aislamiento.

a) Siembra para inoculación: la inoculación consiste en tomar una pequeña porción de la muestra y diluirla para dispersarla y que crezca con más facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular en medio líquido o en medio sólido.

b) Siembra para aislamiento: la finalidad de este tipo de siembras es la de obtener cultivos puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios de cultivo sólidos.


1 Métodos para obtener los cultivos puros A. Método de siembra para aislamiento por agotamiento o en estría 

Estría única: depositamos la muestra lo más

alejado de nosotros y realizamos la siembra en forma de zig-zag. De esta forma vamos descargando la muestra del asa. Es importante no volver a repasar el trozo de medio de cultivo que ya hemos sembrado. Para conseguir que al final de la estría tengamos colonias aisladas es importante que al principio hagamos la estría más junta y que la cantidad de muestra tomada en el asa sea la 

adecuada.

Estría múltiple: en esta técnica de aislamiento por agotamiento se realizan varias

estrías. Esto se puede llevar a cabo flameando el asa de paso en paso, es decir, de estría en estría, o sin flamear el asa. Además, dependiendo de la forma en la que hagamos las estrías, existen varios tipos de estriados: 

Estriado

sobre

cuatro

cuadrantes: Se utiliza cuando queremos conservar algún microorganismo que nos interesa. Consiste en sembrar uno a uno los cuadrantes, sin flamear el asa entre estría y estría, de tal forma que en el cuarto cuadrante, al ir agotando la muestra del asa, tendremos los microorganismos aislados.

B. Método de siembra para aislamiento por diluciones sucesivas 1) Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados. Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas.

2) Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de ensayo,

allí se extiende por toda la superficie con el asa

bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo. Medio de cultivo: agar base inclinado Instrumento: asa o aguja bacteriológica

3) Siembra por estría por agotamiento: Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas: Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material. Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente. Medio de cultivo: solido en placa de Petri Por picadura o punción: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias. Medio de cultivo. Semisólido Instrumento: aguja bacteriológica Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias Siembra en TSI: (Por picadura y estrías en superficie): el TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol. En este medio sembraremos por picadura y estrías en superficie, como ya conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los azucares.


Técnica del cultivo por enriquecimiento Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar. Ejemplo: nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas. Ejemplo: queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoautótrofas. Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37º, mientras que para incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45º .

V. 

CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PUROS Almacenamiento a temperaturas bajas. Ponemos las bacterias con glicerol al 20 50% a -70º y podemos mantenerlas así durante años y décadas.

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Liofilización: es un método más eficaz. En un vial de liofilización ponemos leche desnatada y las bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilización. La liofilización es una evaporación por condensación. Se basa en el punto triple del agua; podemos pasar de sólido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante décadas.

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Colecciones de cultivo: en todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos puros o tipo. En España existe la C.E.C.T (Colección española de cultivos tipo), que está en Valencia. La más grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).

Mantenimiento 1. Debemos transferir periódicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua. 2. Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer más tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer. 3. Se disminuye la temperatura, congelamos las células. Para proteger las células y que no se formen cristales que las dañen se usa el glicerol 4. La liofilización es la sublimación a alto vacío de las muestras congeladas con rapidez.


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