Actividad Biológica de la Urtica Dioica (Final)

ACTIVIDAD INSECTICIDA Y FERTILIZANTE DE Urtica dioica (Ortiga). RESUMEN Se realizó la evaluación de las actividades insecticida y fertilizante atribuidas a la especie vegetal Urtica dioica (ortiga). Los ensayos con el extracto crudo etanólico de dicha especie permitieron comprobar la actividad insecticida. La posterior purificación del extracto por medio de cromatografía en columna y el subscuente ensayo de las fracciones colectadas nos permiten indicar que la actividad biológica se debe a un solo compuesto, el cual es el menos abundante de los presentes en el extracto polar. Debido a la utilidad potencial del compuesto, conviene continuar con su estudio por medio de técnicas más avanzadas para la total elucidación de sus propiedades químicas y físicas. Al realizar la evaluación de la actividad fertilizante atribuida a la ortiga por medio de tres especies (pasto, frijol y maíz) comprobamos que dicha actividad no es cierta. Aún más, se observó una inhibición de la germinación a concentraciones elevadas.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. Debido a que existen diversas plagas que atacan a las plantas comestibles de nuestro país (produciendo daños económicos al atacar a los cultivos), hubo un interés por investigar especies vegetales que estuvieran reportadas con acción insecticida, para que en caso de poseer la actividad biológica que se les atribuye, poder elaborar un insecticida biológico y así evitar el uso de de sustancias sintetizadas por el hombre en el laboratorio, que a la larga dañan nuestra salud y contaminan el ambiente. Seleccionamos la planta Urtica dioica para corroborar las referencias informales que le atribuyen las actividades insecticida y fertilizante. En caso de poseer ambas, podría elaborarse un producto que bien puede traer beneficios a los campos de de cultivo por dos dos vías, además de ser una opción para el cuidado de nuestro ambiente por tratarse de una planta cosmopolita que se encuentra en la mayoría de los lugares habitados en nuestro país, por lo cual no se corre gran riesgo al ser usada con fines industriales.

OBJETIVOS. •

•

Determinar si la especie vegetal Urtica dioica (Ortiga) posee las propiedades de insecticida y fertilizante que se le atribuyen. Si la planta posee las actividades biológicas indicadas, determinar si la actividad (sea insecticida o fertilizante) se debe a un solo compuesto o a una mezcla de sustancias.

1

MARCO TEÓRICO. Nombre vulgar: Ortiga mayor. Clasificación científica de la especie vegetal:

Reino: División: Clase: Orden: Familia: Género: Especie:

Plantae. Magnoliophyta. Magnoliopsida. Rosales. Urticaceae. Urtica. Urtica dioica.

Figura 1. Urtica dioica

División: Magnoliophyta. También llamados angiospermas. Poseen una estructura particular llamada ovario, formado por unas o varias hojas llamadas carpelos, y que encierra en su interior los óvulos. El ovario se prolonga a menudo en una especie de tubo llamado estilo, que termina en una porción destinada a recibir recibir el polen llamada estigma. El conjunto formado por el ovario, el estilo y el estigma se conoce como gineceo y constituye el órgano reproductor de la planta. Otro rasgo que define a las angiospermas es la denominada doble fecundación, un proceso en el cual hay intervención de dos gametos masculinos; uno que se fusiona con uno de los núcleos de la ovocélula dando lugar a un embrión, embrión, y el otro a otro núcleo para producir producir un alimento que que sirve de alimento, el endospermo secundario. Otra característica que poseen las angiospermas es la compleja estructura de la flor, que además de los órganos sexuales, lleva en general pétalos y sépalos, como elementos auxiliares. Las dimensiones de las angiospermas oscilan entre unos pocos centímetros y varias decenas de metros de altura, y adoptan diversas formas. Constituyen además una importante fuente de alimentación para el hombre.

Clase: Magnoliopsida. También llamados comúnmente con el nombre de Dicotiledóneas. El rasgo diferencial de este grupo de plantas es la producción de semillas que poseen dos o más cotiledones . Debido a la existencia de cambiúm y felógeno, presentan crecimiento en el grosor del tallo, lo que les permite alcanzar un grosor considerable. considerable. Las hojas hojas suelen suelen tener pecíolos y son son de diversas formas, aunque con nerviación ramificada. Las raíces consisten de una principal con varias ramificaciones. Las flores están formadas por un mayor número de elementos que las monocotiledóneas.

2

Orden: Rosales. Es uno de los órdenes más importantes que hay debido a su gran variedad. Compuesto por casi 8000 especies según el Grupo para la Filogenia de las Angiospermas.

Familia: Urticaceae. Familia de plantas herbáceas, anuales o perennes, raras veces leñosas (en los trópicos); frecuentemente con pelos urticantes (cistolitos). Sin látex. Hojas simples, opuestas o alternas, con frecuencia estipuladas. Flores inconspicuas (verdosas), generalmente unisexuales, de disposición monóica o dióica, monoclamídeas, tetrámeras o pentámeras; gineceo supero, unicarpelar (un estigma), con un óvulo; reunidas en inflorescencias axilares en panículas, cimas o amentos. Fruto en aquenio o núcula, unas 550 especies, propias sobre todo de las regiones cálidas.

Género: Urtica. Las plantas de este género se caracterizan por tener pelos urticantes que liberan una sustancia ácida que produce escozor e inflamación de la piel. Estas plantas están consideradas como “malas hierbas” y es bien conocida por sus cualidades urticantes. Conocidas anteriormente como “la planta de los ciegos”, ya que hasta ellos la reconocían con solo rozarla. La ortiga es una de las plantas que más aplicaciones medicinales posee.

Descripción botánica de la Urtica dioica. La ortiga mayor, también conocida como ortiga verde o simplemente como ortiga es una de las plantas más comunes dentro del género de las Urtica. Es una planta arbustiva perenne, dioica y de aspecto tosco. Puede medir desde 50 cm. hasta 1.5 metros de altura, sus hojas son aceradas de aproximadamente 15 cm. de largo, puntiagudas y de color verde oscuro. Las hojas al igual que el tallo se caracterizan por la presencia de pelos urticantes cuyo líquido cáustico (acetilcolina, ácido fórmico, resina, histamina) produce una irritación con ardor intenso en la piel cuando se toca. Los pelos son muy frágiles en la punta, es por ello que es suficiente un roce para provocar su rotura. La raíz es muy rica en taninos, lo cual le confiere acción astringente. Su tallo es rojizo amarillento, cuadrangular, ramificado, ahuecado en los entrenudos y esta recubierto de pelos urticantes. Florea generalmente en el mes de Julio en adelante. Las flores son verdes amarillosas de estambres amarillos, encontrándose en racimos de hasta 10 cm, normalmente son unisexuales; las fémeninas se encuentran en largos amentos colgantes y las masculinas en inflorescencias mas cortas. Sus frutos son aquenios (cápsulas) secos.

3

Principios activos. La ortiga contiene gran cantidad de principios activos entre los que se incluyen flavonoides, sales minerales (hierro, calcio, sílice, azufre, potasio, manganeso), provitamina A y C, ácido fórmico, acetilcolina, clorofila, taninos, histamina y serotonina. Propiedades de la ortiga comprobadas científicamente: los extractos son ligeramente hipoglucemiantes. Tiene propiedades bactericidas y efectos favorables en los tratamientos de las afecciones de la piel (Príhoda, 1990; Wren, 1988). Localización de la Planta. La Urtica dioica es una planta cosmopolita, es decir que se encuentra básicamente en todos el mundo, aunque se desarrolla mas propiamente en lugares altos, con suelos húmedos y ricos en nitrógeno. Se extiende desde todo Japón hasta Europa y América. Se puede encontrar en cualquier lugar donde habite el humano o el ganado, crece en huertos, corrales, muros de piedra, en el campo, o en la montaña. Uso de planta. La planta se recoge entera y puede utilizarse seca. Las hojas de los tallos jóvenes se utilizan en fitoterapia principalmente. La recolección se debe de realizar antes de la floración y lo más rápidamente posible. Puede recolectarse todo el año, aunque para fines medicinales se recolectará en los meses de mayo, junio, julio y agosto. La planta es más tierna antes de la aparición de las flores. Las hojas viejas no deben utilizarse ya que son muy irritantes. A pesar de la mala fama de la planta, esta puede tener numerosas propiedades nutrimentales y medicinales. Nutricionalmente es de gran importancia por sus sales minerales y vitaminas vitaminas que benefician incluso a personas que realizan dietas sin sal. Contienen vitamina A y C, hierro, ácido salicílico y proteínas. Medicinalmente tiene gran cantidad de propiedades curativas como: analgésica, antigotosa, diurética, astringente, depurativa, hemostática, hipoglucemiante, entre otras. Textilmente es utilizada de forma similar al lino.

Sobre los insecticidas biológicos. Aunque actualmente se nos ofrece una muy amplia gama de productos para el control de plagas, hoy en día aun continua vigente la búsqueda de métodos de protección natural para los cultivos. La naturaleza es capaz de otorgarnos estos medios, ya que estos se originan de manera intrínseca junto con otras 4

especies y a su vez se adaptan y adquieren características específicas para garantizar su supervivencia frente a distintos depredadores. La protección de los cultivos por medios naturales reduce el riesgo de que los insectos desarrollen resistencia, tal como sucede en los insecticidas de manufactura química, además de traer consecuencias menos letales a lo enemigos naturales de las plagas, lo que reduce el riesgo de aumento de plagas secundarias, además de ser menos nocivo para el hombre, y no ocasiona daños para el medio ambiente (Stoll, 1989). Como alternativa, los productos naturales provenientes de una gran variedad de plantas, actúan inhibiendo, repeliendo, disuadiendo o eliminando insectos plagas de distinto tipo (rastreros, voladores, chupadores, etc.) así como también estimulan procesos vitales de los cultivos para fortalecerlos y protegerse de los ataques de las distintas pestes. Algunas de estas plantas han sido estudiadas científicamente y otras siguen vigentes por leyenda popular (Sánchez, 2002; Stoll, 1989). Un ejemplo de estas últimas plantas es la ortiga. Los insecticidas biológicos en México. Otro de los factores que nos motivaron para la realización de este proyecto es que el uso de insecticidas biológicos en México es incipiente, tal y como lo informa la Academia Mexicana de Ciencias (Boletín AMC/47/08). Patricia Tamez, afirma que solo el cinco por ciento de los insecticidas utilizados en el país son de origen biológico y el resto son químicos tradicionales por lo que se espera que esto puede ser un tema de amplia investigación. La misma investigadora ha señalado que espera que dentro de los próximos 20 años esta relación de 5 por ciento contra 95 por ciento cambie drásticamente a raíz de la creciente demanda de productos orgánicos a nivel mundial, dado que esto obliga a distintos agricultores a buscar nuevos métodos para mantener el control de plagas. Dentro de las ventajas que ofrecen los insecticidas biológicos se encuentra que su formulación no es tóxica para los seres humanos, y su acción es muy específica, en algunos casos solo dañan a insectos plaga sin dañar a otros que pudieran beneficiar a las plantas, esto quiere decir que el daño a la ecología es el mínimo posible. El presente trabajo tuvo como objetivo demostrar si la ortiga ( Urtica dioica) posee propiedades insecticida y/o fertilizante. Pero,…¿de dónde salen los rumores que justifican esta investigación?, a continuación citaremos algunas fuentes que atribuyen dichas propiedades a la ortiga. a) http://organicsa.net/insecticidas-organicos-naturales-de-uso-popular.html Ortiga. (Principios activos: serotonina, histamina, filosterina. Acelera la descomposición de la materia orgánica para la formación del composta con la 5

cual se estimula el crecimiento de las plantas y controla orugas y pulgones. b) http://articulos.infojardin.com/boletin-archivo/5-insecticidas-biologicosinsecticidas-naturales.htm

Preparación popular de insecticida biológico a partir de ortiga . 1.- Se trocea la planta (la raíz no) y se macera en agua fría. La proporción es 100 g por litro si está fresca (20 g si está seca). 2.- Es preferible utilizar un recipiente de madera o cerámica tapado y que deje circular el aire. 3.- Se remueve todos los días, y a partir del 14, cuando ya no haya espuma, se filtra. Esta mezcla, diluida con agua dos veces su volumen (si es 1 litro, se mezcla con 2 litros de agua), actúa como repelente para pulgones y araña roja. c) http://www.corazonverde.org/monografias/huertosano.html

Ortiga. Fortalece las plantas y actúa como insecticida. Purín fermentado con 1kg de planta fresca en 10 L de agua o 200 g de planta seca en 10 L de agua. Diluído 20 veces estimula el crecimineto de las plantas. Sin diluir actúa como insecticida.

Sobre el insecto elegido para el ensayo de actividad insecticida. La Drosophila melanogaster , conocida como mosca de la fruta o mosca del vinagre, fue la especie escogida para la realización de los ensayos de insecticida durante nuestra investigación. Es una especie utilizada frecuentemente en experimentación genética, dado que posee un reducido número de cromosomas (4 pares), breve ciclo de vida (15-21 días) y aproximadamente el 61% de los genes de enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de las moscas de la fruta, y el 50% de las secuencias proteínicas de la mosca tiene análogos en los mamíferos.

Figura 2. Drosophila melanogaster

6

Sobre las plantas utilizadas para el ensayo de fertilizante. Maíz. El maíz también conocido como elote, es una gramínea anual nativa de América. Actualmente es el cereal con mayor consumo en el mundo, superando al trigo y al arroz. Constituye la base histórica de la alimentación y es uno aspecto central en las culturas de Mesoamérica.

Reino: División: Clase: Subclase: Orden: Familia: Subfamilia: Tribu: Género: Especie:

Plantae. Magnoliophyta. Liliopsida. Commelinidae Poales. Poaceae. Panicoidae. Andropodoneae. Zea. Zea mays. Figura 3. Planta de Maíz.

Frijol. Los frijoles son una especie anual de la familia de las leguminosas. Es una planta originaria de América, sin embargo su cultivo se ha extendido a todo el mundo

Reino: División: Clase: Subclase: Orden: Familia: Subfamilia: Subfamilia: Tribu: Subtribu. Género: Selección. Especie:

Plantae. Magnoliophyta. Magnoliopsida. Rosidae. Fabales. Fabaceae. Panicoidae. Faboideae. Phaseoleae. Phaseolinae Phaseolus P. sect. Phaseolus P. vulgaris

Figura 4. Frijol.

HIPÓTESIS. Se ha reportado de manera informal la actividad fertilizante e insecticida de diversas especies vegetales, entre ellas de Urtica dioica (Ortiga mayor). Dados los efectos observados en otras especies, es de esperarse que el extracto polar obtenido de dicha planta posea actividad insecticida y fertilizante si se ensaya por medio de protocolos bien establecidos. 7

DESARROLLO. Obtención del extracto polar de la Urtica dioica. Material. Molino para café. 2050 g de material biológico seco ( Urtica dioica). 3 L de etanol 96º. 5 Vasos de precipitado de 1000 mL. 2 Soportes universales. Bomba de vacío. 1 matraz Kitazato de 250 mL. 1 matraz Kitazato de 500 mL. 1 Embudo Bushner, 7 cm de diámetro. 1 equipo de destilación fraccionada. 1 Parilla eléctrica. 1 Vidrio de reloj. 1 Mini bomba de agua. Varias magueras de hule. El material vegetal empleado para los ensayos fue adquirido en un mercado tradicional dedicado a la venta de este tipo de artículos: el mercado de Sonora, en la Ciudad de México. Se comprobó que el aspecto del material adquirido correspondiera al de la literatura encontrada. Cabe mencionar que ahí se vende con fines terapéuticos para el humano. Para asegurar un mínimo contenido de agua, el material biológico se dejó secar sobre papel durante dos semanas a resguardo del sol. Una vez seco se procedió a pulverizar la planta por medio del molino.

Figura 5. Ortiga en secado. Lab. LACE P-4.

Se molieron en un molino para café 2050 g de la planta seca ( Urtica dioica) hasta quedar como un polvo fino.

8

Se dividió el polvo colocándose en 5 vasos de precipitados de 1000 mL. El polvo se sumergió en etanol, empleándose aproximadamente 600 mL por vaso de precipitado. Se dejo reposar durante 10 días a temperatura ambiente con agitación cada 2 días para posteriormente decantar el sólido. El líquido se filtro al vació y se procedió a evaporarlo a presión reducida, por medio de una bomba conectada a un equipo de destilación fraccionada, para así obtener un extracto casi sólido. La presión reducida permite que el solvente (etanol) destile a una temperatura mas baja, eliminando la posibilidad de que los compuestos lábiles contenidos en el extracto se descompongan debido a una temperatura elevada.

Figura 6. Destilación a vacío. Lab. 307, P-4.

Ensayo de actividad insecticida. DETERMINACIÓN DEL MEJOR SOLVENTE PARA EL EXTRACO. Material.

Reactivos.

1 micropipeta. 5 tubos de ensaye. Parafilm

Agua destilada. Éter etílico. Metanol. Etanol. Acetona.

Para los ensayos realizados se requiere determinar previamente el mejor solvente. Se realizaron pruebas pruebas con éter etílico, acetona, acetona, metanol, etanol y agua destilada. El mejor solvente demostró ser el metanol.

9

PREPARACIÓN DE FRASCOS DE AGAR SOYA TRIPTICASEÍNA. Material. 22 frascos de 250 mL de boca ancha. 1100 mL de agua destilada. 42 g de agar soya tripticaseína. 11 tapones para los frascos. 11 capuchones para los frascos. 1 autoclave. 1 parilla eléctrica. 1 balanza granataria. 1 micro pipeta. Se pesaron 42 g de agar tripticaseína de soya (Balanza OHAUS Modelo Scout Pro SP601) disolviéndose en 2100 mL de agua destilada, calentándose en una parrilla eléctrica (CIMAREC. Barnstead Internacional Modelo. HP131225), hasta obtener una apariencia transparente. El líquido así obtenido se dividió en 22 frascos, ya previamente lavados, secados y enjuagados con agua destilada, colocando 50 mL del medio bacteriológico en cada uno de los frascos. Se taparon con los tapones de algodón provistos de capuchón y se metieron en la autoclave ( ALL AMERICAN Modelo. 1941X). Se esterilizó por medio de calor húmedo (120º C durante 20 minutos). Pasado el tiempo de esterilización se colocaron los frascos en un recipiente para esperar su solidificación. Antes de que el medio solidifique, se agrega el extracto solubilizado adecuadamente en un área estéril para evitar la contaminación (Campana de flujo laminar, PUL, modelo DOP, Emery 3004). Se peso una cantidad adecuada del extracto etanólico obtenido como de describió anteriormente (sólido) en una balanza analítica (aprox. 0.2 g), solubilizándolo a una concentración tal que permitiese obtener una concentración de 10, 100 y 1000 ppm en los frascos con agar, al agregar respectivamente 10, 100 y 1000 microlitos del extracto solubilizado en metanol por medio de la micro pipeta. El ensayo se realiza por triplicado. Finalmente, a 3 frascos de les agrego metanol como grupo control, para comprobar que la actividad insecticida (en caso de haberla) no se debiese al solvente empleado.

ACTIVIDAD INSECTICIDA. Material. Balanza analítica (OHAUS Adventurer. Modelo 2207140). Metanol Extracto etanólico de la planta Urtica dioica Jeringa de 10 mL 110 moscas de la fruta (10 por frasco) 11 frascos con agar de soya tripticaseína 10

1 tubo de ensayo 1 micro pipeta (0 a 200 µL, marca Finpippete), y sus puntas estériles respectivas Se acondiciona la campana de flujo laminar siguiendo el protocolo habitual antes de su uso (limpieza con gasa impregnada con alcohol al 70°, funcionamiento durante 15 minutos con luz UV encendida). Ya con la campana lista y limpia, se fueron colocando 10 moscas en cada uno de los frascos. Al final se contaba con 3 frascos con una concentración de 10 ppm, 3 frascos con 100 ppm y 3 con 1000 ppm del extracto. Se tuvo un grupo control con metanol (solvente) y otro grupo sin agregar nada. Se hace la lectura a las 24 horas de colocadas la moscas. Se cuentan las moscas muertas y las vivas, procediendo a realizar el análisis.

Figura 7. Colocación del extracto obtenido. Lab. LACE. P-4. Campana de flujo laminar.

Figura 8. Evaporación del metanol en la campana de flujo laminar. Lab. LACE. P-4.

Ensayo de actividad fertilizante. Material. Molino para café. Material biológico seco ( Urtica dioica). 2 L de tierra de monte (la relación es volumen/volumen). 2 L de aserrín molido (le relación es volumen/volumen). 120 viales 10 mL. 40 semillas de maíz. 120 semillas de pasto. 120 semillas de frijol. La tierra de monte se tamiza de tal modo que se obtenga a modo de un polvo, el aserrín es triturado en el molino para café hasta que se obtenga un polvo fino a partir de él. Posteriormente se mezclan hasta que ambos formen una mezcla homogénea y así se obtiene lo que denominamos “medio de siembra”. 11

Posteriormente se realizo el mismo procedimiento con el material biológico seco de la especie Urtica dioica. Para realizar la prueba prueba con una relación 1:1 se calculó que eran necesarios 240 mL de mezcla, para lo cual se procedió a mezclar 120 mL de material biológico con 120 mL de la mezcla aserrín-tierra y así formar una mezcla homogénea que posteriormente fue repartida en 30 viales en cantidades aproximadas de 8 mL. Este mismo proceso se realizo de igual modo para obtener obtener relaciones de medio de siembra/material siembra/material biológico 1:5 y 1:10. Adicionalmente se mantuvo un grupo control que solo contenía contenía la mezcla tierra-aserrín: no se le adicionó ortiga molida. Se emplearon 10 viales para cada relación medio de siembre/ortiga. Las semillas quedaron distribuidas de la siguiente manera: Semilla Frijol Pasto Maíz

Tabla 1. Distribución de las semillas. Semillas por vial Semillas Totales 3 120 3 120 1 40

Una vez que las semillas eran insertadas en el medio de cultivo (tierra-aserrín / ortiga) a las tres relaciones ya indicadas y al grupo control, se les ubicó (a los viales) en un lugar donde les favoreciera la luz del sol. Se les suministraba 1 mL de agua cada tercer día a cada vial para mantener la humedad adecuada.

Figura 9. Viales con medio siembra/ortiga. Lab. LACE. P-4.

de

Cromatografía. DETERMINACIÓN DE LA MEJOR FASE MÓVIL. Material. Extracto de la planta Urtica dioica solubilizado con metanol. Hexano. Acetato de etilo. Tubos capilares. 12

Placas de aluminio para cromatografía en capa fina. Lámpara de luz ultravioleta. Dado que es necesario separar los componentes del extracto para determinar si la acción insecticida se debe a un compuesto o a una mezcla de ellos, fue necesario realizar pruebas para determinar cual sería la fase móvil que separaría los componentes del extracto de mejor forma durante la cromatografía en columna. Esto se determino mediante cromatografías en placa fina, en placas de aluminio (Sigma-Aldrich, sílica gel, tamaño de partícula de 25 micrómetros, con indicador para fluorescencia). Las fases móviles utilizadas fueron distintas mezclas v/v de acetato de etilo/hexano. Se revelaron por medio de una lámpara de luz UV. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Material. Columna de vidrio Sílica gel, 230-400 mesh, Natland 80 tubos de ensayo Cloruro de Sodio Hexano Acetato de Etilo Pipeta de 10 mL La cromatografía en columna se realizo con las técnicas convencionales para columnas de vidrio empacadas con sílica flash (sílica gel, 230-400 mesh, Natland). Los sistemas de elusión elegidos se determinaron por medio de ensayos de cromatografía en capa fina, en placas de aluminio (Sigma-Aldrich, sílica gel, tamaño de partícula de 25 micrómetros, con indicador para fluorescencia), visualizándose visualizándose el avance por medio de una lámpara de luz UV. UV. La columna cromatográfica empleada fue de 45 cm. de longitud por 3 cm. de diámetro provista de reservorio para fase móvil. Las alícuotas obtenidas de la columna cromatográfica fueron de 5 mL, recolectándose en tubos de ensayo de 10 mL. Al realizarse el monitoreo de las alícuotas obtenidas por medio de la cromatografía en placa se determino cuales tubos de ensayo había que juntar (fracciones) por considerarse que contenían el mismo compuesto. Se juntaban dichos tubos y se concentraba nuevamente por medio de destilación a presión reducida. Posteriormente a la evaporación de la fase móvil (una vez obtenidas las fracciones de interés), se cuantificaron las cantidades obtenidas de compuesto y se procedió a realizar el ensayo de actividad insecticida con dichas fracciones (por el método ya descrito) a la única concentración de 100 ppm (esto último debido a la poca cantidad de compuesto obtenido en algunas fracciones, que no permitía realizar el ensayo para actividad insecticida a las tres concentraciones, como se realizo en el caso del extracto crudo).

13

Figura 10. Columna cromatográfica. LACE. P-4.

Lab.

RESULTADOS. Obtención del extracto. La masa original de material biológico seco fue de 2050 g. La cantidad de extracto después de la extracción etanólica y la posterior evaporación del solvente: Extracto

Tabla 2. Masa de extracto obtenida. Masa inicial Masa del extracto

Etanólico

2050 g

28.67 g

DETERMINACIÓN DEL MEJOR SOLVENTE PARA EL EXTRACTO. Tubo 1 2 3 4 5

Masa del extracto 0.0023g 0.0030g 0.0033g 0.0020g 0.0017g

Tabla 3. Observaciones de las pruebas de solubilidad. Solvente Volumen Observaciones Agua destilada Éter etílico Metanol Etanol Acetona

30 µL 30 µL 30 µL 30 µL 30 µL

No se disolvió todo. Presenta sólido. El extracto sedimenta. Se disolvió completamente. Se disolvió la mayor parte. Se disolvió lentamente y no totalmente.

El mejor solvente demostró ser el metanol. 14

Ensayo de actividad insecticida. Primer ensayo. Lectura a las 24 horas. Tabla 4. Ensayo 1 de actividad insecticida. No. de frasco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentración del extracto (ppm) 1000 1000 1000 100 100 100 10 10 10 Control con metanol Control

Moscas Vivas 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 10

Moscas muertas. 10 10 10 10 10 10 0 0 0 0 0

Segundo ensayo. Lectura a las 24 horas. Tabla 5. Ensayo 2 de actividad insecticida. No. de frasco. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentración del extracto (ppm) 1000 1000 1000 100 100 100 10 10 10 Control con metanol. Control.

Moscas Vivas. 0 0 0 0 0 0 9 10 10 10 10

Moscas muertas. 10 10 10 10 10 10 1 0 0 0 0

Tercer ensayo. Lectura a las 24 horas. Tabla 6. Ensayo 3 de actividad insecticida. No. de frasco. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentración del extracto (ppm) 1000 1000 1000 100 100 100 10 10 10 Control con metanol. Control.

Moscas Vivas. 0 0 0 0 1 0 10 10 10 10 10

Moscas muertas. 10 10 10 10 9 10 0 0 0 0 0

15

Se concluyo que la especie Urtica dioica posee actividad insecticida a 100 y 1000 ppm, por lo cual se procedió a purificar el extracto por medio de cromatografía en columna, y con ello determinar si la actividad se debe a un solo compuesto compuesto o a una mezcla de éstos.

CROMATOGRAFÍA. Determinación de la fase móvil. Se ensayaron 5 relaciones acetato de etilo/hexano, las cuales fueron: Tabla 7. Fases móviles ensayadas. Acetato de etilo/hexano 1/0 2/8 4/6 6/4 8/2

Fase móvil 1 2 3 4 5

Figura 11. Cromatografías en placa. De izquierda a derecha, fases 1 a 5. Revelado con luz UV.

La mejor fase móvil demostró ser la fase 4, al revelarse con luz UV y obtenerse, en apariencia, una mejor separación de los compuestos que integraban el extracto.

Cromatografía en columna. Como ya se indico en el apartado de desarrollo, para la separación de los compuestos se empleo una columna de sílica flash, siendo la fase móvil empleada de una relación 6:4 de acetato de etilo/hexano. Se recolectaron recolectaron 130 viales de 5 mL aproximadamente. El seguimiento de la cromatografía en columna fue por cromatografía en capa fina y revelado con luz UV. Las placas se muestran a continuación. Se introdujo en la columna 1.103 g de extracto crudo.

16

Fracción 1 I Fracción 2 I

Fracción 3

I

Fracción 4 I Barrido

Figura 12. Cromatografías en placa de las alícuotas obtenidas en la columna de separación. Se indican las 4 fracciones obtenidas. Fase móvil 4. Revelado con luz UV.

Posteriormente se juntaron las fracciones y se eliminó la fase móvil mediante destilación a presión reducida. Las masas de las fracciones así obtenidas fueron las siguientes:

Tabla 8. Fracciones reunidas y concentradas a partir de la cromatografía en columna. Viales 5-25 26-55 56-200 201-225 225 en adelante (barrido)

Masa (g) 0.250 0.120 0.504 0.023 0.140

Clave A B C D E

Puede notarse la cantidad tan pequeña obtenida de la fracción D, lo cual impidió realizar el ensayo de actividad insecticida a las tres concentraciones manejadas en el extracto crudo. Se determinó que la concentración a la que se realizaría el ensayo con las fracciones fuese a 100 ppm para todas las fracciones, incluyendo el barrido.

Actividad insecticida de las fracciones obtenidas. Fracción A. Lectura a las 24 horas. Tabla 9. Actividad insecticida de la fracción A. No. de frasco 1 2 3 4 5

Concentración del extracto (ppm) 100 100 100 Control con metanol Control

Moscas Vivas 10 9 10 10 10

Moscas muertas. 0 1 0 0 0

17

Fracción B. Lectura a las 24 horas. Tabla 10. Actividad insecticida de la fracción B. No. de frasco 1 2 3 4 5




Fracción C. Lectura a las 24 horas. Tabla 11. Actividad insecticida de la fracción C. No. de frasco 1 2 3 4 5




Fracción D. Lectura a las 24 horas. Tabla 12. Actividad insecticida de la fracción D. No. de frasco 1 2 3 4 5




Fracción E. Lectura a las 24 horas. Tabla 13. Actividad insecticida de la fracción E. No. de frasco 1 2 3 4 5




18

ENSAYO DE ACTIVIDAD FERTILIZANTE. Para el ensayo de fertilizante fueron escogidas las siguientes plantas: Frijol, pasto y maíz.

Figura 13. Sembrado de las semillas de pasto, maíz fri ol. Lab. LACE. P-4.

Los resultados resultados obtenidos fueron fueron los siguientes:

Frijol Tabla 14. Actividad fertilizante de la ortiga en frijol. Viales 01-10 11-20 21-30 31-40

Concentraciones Planta/Tierra 1:1 1:5 1:10 Control

Observaciones. Sin germinación Crecimiento similar a control Crecimiento similar a control Crecimiento similar a control

Pasto. Tabla 15. Actividad fertilizante de la ortiga en pasto. Viales 41-50 51-60 61-70 71-80



Maíz. Tabla 16. Actividad fertilizante de la ortiga en maíz. Viales 81-90 91-100 101-110 111-120



19

Figuras 14 y 15. Crecimiento de frijol y maíz respectivamente. Ambas figuras: los primeros 5 frascos tienen la relación 1:1, los siguientes 5 frascos la relación 1:5, y los últimos 5 son el grupo control (sin ortiga molida).

ANÁLISIS DE RESULTADOS. Por los resultados reportados en las tablas 4, 5 y 6 podemos observar que el extracto de ortiga si presenta una actividad insecticida a 100 y a 1000 ppm. A 10 ppm no mostró actividad insecticida. Sin embargo se decidió que los resultados obtenidos eran lo suficientemente interesantes como para justificar la cromatografía en columna del extracto, y así poder determinar si la actividad mostrada era debida a un solo compuesto ó a una mezcla de éstos (en caso de que la actividad fuese debida a una sola sustancia, convendría determinar sus propiedades químicas y físicas). Después de la cromatografía en columna del extracto crudo, se procedió a realizar el mismo ensayo de actividad insecticida para las fracciones recolectadas. A diferencia de los tres primeros ensayos (tablas 4, 5 y 6), en el caso de las fracciones la cantidad obtenida de una de ellas (fracción D) era muy pequeña, por lo que se decidió que la prueba biológica para actividad insecticida ahora fuese realizada a una sola concentración para las 5 fracciones obtenidas de la columna: 100 ppm. De esta manera, y debido a la alta concentración ensayada, se tenía casi la seguridad de observar que fracción de las 5 era la activa (si es que no era un efecto sinergista el observado). Los resultados obtenidos para actividad insecticida de las fracciones A, B, C, D y E muestran claramente que la fracción D es la que posee la actividad insecticida (tablas 9, 10, 11, 12 y 13, respectivamente). Asimismo, por lo observado en la cromatoplaca correspondiente (Figura 10), la fracción fracción D contiene un solo compuesto, con lo que la actividad insecticida no es sinergista. Desgraciadamente, cabe hacer notar que dicha fracción es la menos abundante en cuanto a masa se refiere del extracto etanólico obtenido (tabla 8).

20

En cuanto a las propiedades de fertilizante que se le atribuyen a la ortiga, por los resultados obtenidos (tablas 14, 15 y 16) podemos indicar que no son ciertas, pues no se observaron beneficios en el crecimiento de las plantas adicionadas con ortiga en su medio de cultivo: el crecimiento fue muy similar al control. Cabe mencionar que no se observó germinación cuando la cantidad de ortiga molida era elevado (Figuras 14 y 15), atribuible esto quizá a la cantidad tan elevada de material biológico presente en el medio de cultivo vegetal. Sin embargo, repetimos, aún a una relación 1:10 en las tres semillas ensayadas, no se observaron beneficios significativos. En resumen: la ortiga no sirve como fertilizante.

CONCLUSIONES. Con los resultados obtenidos, se pudo comprobar que el extracto polar de la especie Urtica dioica posee propiedades insecticidas. Al realizar la cromatografía del extracto, se determinó que la actividad biológica se debe a un solo compuesto presente en el extracto etanólico obtenido. Sin embargo, el compuesto que presenta dicha actividad insecticida es el menos abundante en el extracto. Con los resultados obtenidos podemos afirmar que las propiedades insecticidas a la ortiga son ciertas. Es conveniente seguir con las investigaciones sobre este compuesto para poder determinar las propiedades de éste y, llegado el caso, poder incorporarlo como ingrediente activo de un insecticida. En cuanto a las propiedades fertilizantes que le atribuyen a la ortiga, podemos indicar que en base a los resultados obtenidos, dicha especie vegetal no posee la actividad indicada. Aún más, a elevadas concentraciones la ortiga inhibe la germinación de las tres especies ensayadas. Convendría seguir en el estudio de las potenciales propiedades herbicidas de la Urtica dioica.

BIBLIOGRAFÍA. Academia Mexicana de Ciencias. En México el uso de insecticidas biológicos es incipiente. Boletín AMC/47/08. México, D.F., miércoles 30 de abril de 2008. Antonopoulou S, Demopoulos CA, Andrikopoulos NK . Lipid separation from Urtica dioica: Existence of Platelet-Activating Factor . J Agric Food Chem 1996. Baraibar CP, Broncano FJ, Lazaro-Carrasco MJ, Rebuelta M, Villuna L . Acute and chronic toxicity studies on Nettle (Urtica dioica L.). An Bromatol 1983, 35: 99-103 Bever BO, Zahnd GR. Plants with Oral Hypoglycaemic Action. Q J Crude Drug Res 1979, 17(3-4): 139-96

21

Broncano FJ, Rebuelta M, Lazaro-Carrasco MJ, Vivas JM. Estudio del efecto sobre musculatura lisa uterina de distintos preparados de las hojas de Urtica dioica L. An Real Acad Farm 1987a 53: 69-76 S, 13ªedicion, Mèxico 1989. DeBach P., Control biologico de las l as plagas de insectos y malas hierb Legssyer A, Ziyyat A, Mekhfi H, Bnouham M, Tahri A, Serhrouchni M et al . Cardiovascular effects of Urtica dioica L. in isolated rat heart and aorta. Phytother Res 2002, 16(6): 503 –7 Matthews G. A., Mètodos para la aplicacion de insecticidas. 2ª ediciòn, Mèxico, 1988. Tita B, Faccendini P, Bello U, Martinoli L, Bolle P. Urtica dioica L.: Pharmacological effect of ethanol extract . Pharmacol Res 1993, 27(Suppl. 1): 21-2 Prihoda, A. 1989 The Healing Powers of Nature, Octopus, London. Sanchez, T .. Contaminación del suelo y www.corazonverde.org/proyectos/ecojardin.html

lucha

biológica.

2002

Stoll, G. Protección Natural de Cultivos en zonas tropicales. J. Margaf Ed. 1989 Wren, R.C. 1994. Enciclopedia de Medicina Herbolaria y Preparados Botánicos. Editorial Grijalbo. San Miguel. México.pp. 233-234.

CIBERGRAFÍA. a) http://organicsa.net/insecticidas-organicos-naturales-de-uso-popular.html b) http://articulos.infojardin.com/boletin-archivo/5-insecticidas-biologicosinsecticidas-naturales.htm

22

Actividad Biológica de la Urtica Dioica (Final)

Recommend Documents