Teknik Kuantifikasi
Menggunakan Zat Standar Fajar Nugraha, M.Sc., Apt.
Setujukah Anda Dengan Teknik Perhitungan Kadar Obat Tanpa Menggunakan Standar ???
PERHIT. KDR
2
Teknik Kuantitasi Untuk pembuatan Kurva baku, yang akan digunakan untuk perhitungan kadar zat dalam sampel dapat digunakan berbagai macam teknik standar
Teknik: Standar Eksternal Standar Internal Standar Adisi TNK STD
3
Standar Eksternal
TNK STD
4
Standar Eksternal - Senyawa yg digunakan sama dengan senyawa yg dianalisis dalam sampel
- D ipe rsimp apkelan dan dianalisis secara terpisah dar i sa - Penggunaan standar eksternal lebih disukai pada kebanyakan sampel HP L C d an Spektrofotometri yg tidak memerlukan tahapan panjang penyiapan sampel TNK STD
5
Standar Eksternal Misal
Penetapan kadar Parasetamol dalam tablet, secara Spektrofotometri UV digunakan standar baku Parasetamol
Penetapan
kadar Asam mefenamat dalam darah secara HPLC-UV digunakan standar baku Asam mefenamat
TNK STD
6
Plot S tandar Untuk Kuantitasi Dalam
beberapa contoh di industri farmasi, produk obat dibuat dengan berbagai kadar, misal: Tablet Methyl Prednisolon dengan kadar: 4 mg, 8 mg, 16 mg Untuk keperluan mengembangkan dan memvalidasi metode penetapan kadarnya, dapat ditempuh tiga strategi:
PERHIT. KDR
7
1. Single-Point Calibration Digunakan
satu macam konsentrasi standar
Plot
standar yang dibuat, digunakan untuk menetapkan semua kadar tablet
H al
yang perlu diperhatikan adalah:
- metode ini perlu skema pengenceran dan ekstraksi yang berbeda untuk kadar obat yang bermacam-macam tersebut, dengan target: Mendapatkan konsentrasi akhir serupa yang mendekati konsentarsi standar yang dibuat [ Respon Berdekatan ] PERHIT. KDR
8
Perbandingan Absorban Absorban sampel x Kadar baku = Kadar sampel Absorban baku
Syarat: Nilai Abs.baku dan Nilai Abs.sampel berdekatan
PERHIT. KDR
Chan dkk., 2004, p.14.
9
2. Multiple-Point Calibration Digunakan
seri konsentrasi standar yang dapat mengkover semua kadar produk obat tersebut.
Pada
rentang konsentrasi tersebut, responnya harus linear.
R pon (larru yp an akeasn dis be alcuar)uhbkeard aa dra ob pa atda etnatn anagkhrires og n kurva kalibrasi. Syarat: Tidak diperbolehkan adanya Ekstrapolasi KENAPA??
PERHIT. KDR
10
PERHIT. KDR
11
3. One Standard Calibration for Each Strength Digunakan satu konsentrasi standar untuk setiap kadar obat
Kapan Metode ini dipilih ? Apabila analit tidak menunjukkan linearitas pada rentang konsentrasi yang layak PERHIT. KDR
12
Bagaimana Menghitung Kadar Dengan
perbandingan nilai absorban sampel terhadap nilai absorban baku [yang sudah diketahui kadarnya] Apa yang harus diperhatikan ?
Dengan
menggunakan kurva baku/persamaan garis regresi linear. Apa yang harus diperhatikan ?
PERHIT. KDR
13
Linearitas [ Menurut ICH, Q 2(R1) ] Chan dkk., 2004, p.14.
Linearitas suatu metode analisis: adalah kemampuan metode tersebut (pada rentang tertentu) untuk mencapai hasil uji yang berupa variasi data (misal: absorban, luas area kromatogram) yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel PERHIT. KDR
14
Linearitas (lanjutan) Variasi
data yang digunakan untuk mengkuantifikasi analit dapat berupa: - luas area kromatogram - tinggi puncak kromatogram - rasio antara luas area (tinggi puncak) kromatogram analit terhadap luas area (tinggi puncak) kromatogram standar internal
PERHIT. KDR
15
Kuatitasi Analit Tergantung
pada
kepatuhan
p em en u h an
hukum Beer Tergantung
linearitas pada rentang konsen-
trasi tertentu Oleh
karenanya:
- konsentrasi sampel kerja dan sampel yang diuji untuk akurasi harus pada rentang yang linear . PERHIT. KDR
16
Linearitas Biasanya
dipersiapkan langsung pengenceran larutan baku stock.
dengan
Disarankan
linearitas dikerjakan dengan seri pengenceran larutan stock.
Tidak
disarankan mempersiapkan seri konsentrasi larutan baku dengan seri penimbangan zat standar, Kenapa ? karena:
Terjadi kesalahan penimbangan Tidak menjamin diperolehnya linearitas yang baik PERHIT. KDR
17
Evaluasi Linearitas Paling
baik dilakukan dengan pengamatan secara visual plot respon (signal) sebagai fungsi konsentrasi analit.
S etla tneynag , hvia de arts aau ya ng arkeasni un un kjum turinagsi p mm au am n ng ard isigu re dengan metode kuadrat terkecil ( Y=bX+a )
Syarat Linearitas: Coeffcient of determination ( r 2 ) ≥ 0.997 PERHIT. KDR
18
lanjutan… Linearity = Linieritas
Y = bX + a
hasil pengukuran menggunakan suatu metode analisis yang berupa: abs, luas area, atau tinggi puncak menunjukkan proporsionalitas dengan kadar zat yang dianalisis
Syarat: Koefisien korelasi [ r ] ≥ 0,999 Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292; Snyder dkk., 1997, p. 691 dan Chan dkk., 2004, p.16. PERHIT. KDR
19
Rentang Linearitas [ ICH ]
Pada rentang tersebut: Paling tidak digunakan 5 (lima) macam tingkatan konsentrasi
PERHIT. KDR
20
Cara Menentukan Linearitas Kalibrasi [ Replikasi 3 kali ] bolehkah repeatasi?
PERHIT. KDR
21
PERHIT. KDR
22
PERHIT. KDR
23
Kurva Baku [ 3 replikasi ]
Lakukan replikasi !
PERHIT. KDR
24
Apa perbedaan replikasi dan repeatasi??
TNK STD
25
Lakukan replikasi ! Haruskah Abs: 0,2 08? Kenapa?
PERHIT. KDR
26
TNK STD
27
R e s p on S a m pe l Respon
Kadar ?
sampel hasil pengukuran dicatat
Kemudian
nilai tersebut dimasukkan persamaan garis regresi yang merupakan:
ke
Hubungan antara kadar standar versus respon standar
Kadar Sampel
TNK STD
28
Contoh
Seorang peneliti melakukan dalam suatu sampel tablet Standar External multiple kromatogram dari sampel amoxicillin tsb?
pengukuran kadar amoxicillin secara HPLC dengan metode point calibration. Luas Area adalah 11345. hitung kadar
pengukuran Standar baku amoxicillin adalah sbagai berikut.
TNK STD
Konsentrasi standar
Luas Area
5 ppm
7685
10 ppm
14567
15 ppm
21987
20 ppm
29087
25 ppm
35879 29
Standar Internal
TNK STD
30
Standar Internal -Senyawa yg digunakan berbeda dg senyawa yg dianalisis dalam sampel
-kromatografi Harus dapat terpisah sempurna pada proses -Dapat mengkompensasi perubahan sampel atau konsentrasi akibat instrumental
TNK STD
ukuran variasi
31
lanjutan… PENGGUNAAN STANDAR INTERNAL Utamanya Untuk Sampel Yang Memerlukan TAHAPAN PREPARASI yang cukup signifikan panjang/rumit
TNK STD
32
lanjutan… TAHAPA TERSEBUT MELIPUTI Reaksi derivatisasi Filtrasi Ekstraksi
sebagian sampel hilang
TNK STD
33
lanjutan… Bila ditambahkan pada sampel sebelum mulai preparasi dapat digunakan untuk mengkoreksi sampel yang hilang selama preparasi
TNK STD
34
Syarat Standar Internal
TNK STD
35
Syarat Standar Internal - Terpisah sempurna dari peak senyawa yg
dianalisis dan peak lain (HPLC) - Memiliki waktu retensi mirip sampel - Tidak terdapat dalam sampel awal - Dapat me mimic analit disetiap tahap preparasi
sampel TNK STD
36
lanjutan… - Memiliki
respon terhadap detektor serupa dengan respon analit pada konsentrasi yg digunakan
- Tidak harus memiliki kemiripan secara kimiawi
dengan analit - Stabil dan tidak bereaksi dg sampel atau fase
gerak - Tersedia komersial dg kemurnian tinggi TNK STD
37
lanjutan… Ditambahkan ke dalam larutan seri kadar senyawa baku dan sampel dengan konsentrasi tetap ( kons. Sampel )
TNK STD
38
Calibration Methods Internal Standards 1.)
Known amount of a compound, different from analyte, added to the unknown. (i)
Signal from unknown analyte is compared against signal from internal standard Relative signal intensity is proportional to concentration of unknown - Valuable for samples/instruments where response varies between runs - Calibration curves only accurate under conditions curve obtained
- relative between unknown and standard are constant Widely used inresponse chromatography Useful if sample is lost prior to analysis
Area under curve proportional to concentration of unknown (x) and standard (s)
Area of analytesignal areaof s tan dard signal F Concentration of analyte Concentration of s tan dard Ax X TNK STD
F
AS S 39
TNK STD
40
R e s p on S a m pe l
Kadar ?
Respon
sampel juga dibuat rasio dengan respon standar internal [ IS ].
Kemudian
nilai tersebut dimasukkan persamaan garis regresi yang merupakan:
ke
Hubungan antara kadar standar versus respon standar/respon IS
Kadar Sampel TNK STD
41
Contoh
Penetapan kadar hidrokortison dalam dengan menggunakan baku internal dengan konsentrasi standar 5 ppm. sampel menunjukkan luas puncak
sebuah krim betametason Jika respon hidrokortison
23564 luas puncak betametason maka tentukandan konsentrasi hidrokortison dalam5693. sampel!
TNK STD
42
TNK STD
43
Standar Adisi
TNK STD
44
Standar Adisi - Senyawa standar yg di + kan sama dengan
senyawa analit dalam matriks
- Standar dg berat yg berbeda ditambahkan dalam sampel (matriks) yang jumlahnya samake - Kemudian dilakukan pengukuran kadarnya - Paling sering digunakan dalam trace analysis
( kons. analit < 0,1 % ) TNK STD
45
lanjutan… SYARAT
Respon analit sebelum di spiking harus menghasilkan nilai
S/N > TNK STD
46
Standard Addition Methods
Calibration Methods Standard Addition 1.)
Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (i)
Known quantities of an analyte are added to the unknown - known and unk nown are the same analyte - increase in analytical signal is related to the total quantity of the analyte - requires a linear response to analyte
(ii)
Very useful for complex mixtures - compensates for matrix effect change in analytical signal caused by anything else than the analyte of interest.
(iii) Procedure: (a) place known volume of unknown sample in multiple flasks
STD
TNK
48
Calibration Methods Standard Addition
1.)
Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (iii) Procedure: (b) add different (increasing) volume of known standard to each unknown sample
(c) fill each flask to a constant, known volume
STD
TNK
49
Method of Standard Addition adds varying amount of standard to an unknown which already contains some analyte
1. Add same quantity of unknown sample to a series of flasks 2. Add varying amounts of standard (made in solvent) to each flask, ex. 0,5,10,15mL) 3. Fill each fl ask to line, mix and measure
TNK STD
50
Calibration Methods Standard Addition
1.)
Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (iii) Procedure: (f) Plot signals as a function of the added known analyte concentration and determine the best-fit line.
X-intercept (y=0) yields X which is used to calculate
X
STD
TNK
i
X
f
f
X
i
from:
V Vo
51
Calibration Methods Standard Addition
1.)
Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (iii) Example:
Tooth enamel consists mainly of the mineral calcium hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2. Trace elements in teeth of archaeological specimens provide anthropologists with clues about diet and disease of ancient people. Students at Hamline University measured strontium in enamel from extracted w isdom teeth by atomic absorption spectroscopy. Solutions with a constant total volume of 10.0 mL contained 0.750 mg of dissolved tooth enamel plus variable concentrations of added Sr. Find the concentration of Sr.
STD
TNK
Added Sr (ng/mL = ppb)
Signal (arbitrary units)
0
28.0
2.50
34.3
5.00
42.8
7.50
51.5
10.00
58.6 52
Standard Addition
TNK STD
53
Terima Kasih
TNK STD
54
