6. Pruebas Bioquímicas Para Identificación Bacteriana 6.1. Introducción

6 -  PRUEBAS PRUE BAS BIOQUÍMICAS CAS PRUEB PRUEBAS AS BIOQUÍMI BIOQU ÍMICAS

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6. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA 6.1. INTRODUCCIÓN La identificación bacteriana se realiza tras el estudio de las características tintoriales, morfológicas y bioquímicas de los microorganismos. La identificación bioquímica se basa en la habilidad de las bacterias de producir enzimas fácilmente detectables, en las características metabólicas específicas de cada microorganismo, microorganismo, etc. Con este fin, existen en el mercado una enorme variedad de medios de cultivo diseñados no sólo para permitir el crecimiento y multiplicación de los microorganismos, sino también para inhibir los de otros (medios selectivos) o resaltar determinadas características metabólicas (medios diferenciales). Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicación y liberando al medio productos de desecho, desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias y características. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimático. La caracterización de dichas enzimas es una útil herramienta para la identificación y clasificación bacteriana.

6.2. ACTIVIDAD BIOLÓGICA Un ser vivo se define principalmente por desarrollar una serie de actividades ac tividades biológicas, durante su ciclo vital. Ésta actividad biológica consiste en un variedad de reacciones físicoquímicas que transcurren en el marco de las células y denominamos como bioquímica. El conjunto de reacciones que puede realizar un ser vivo se llama metabolismo y engloba tanto las reacciones de degradación (catabolismo) como de síntesis (anabolismo). Las reacciones parten de una base denominada nutriente o sustrato, a partir de la cual se obtiene la energía y las moléculas necesarias para formar sus propios compuestos. Las bacterias forman un grupo muy heterogéneo, ya que la diversidad de especies existentes, pueden realizar todo tipo de metabolismo. Algunas Algunas especies poseen dos tipos de metabolismo diferente que utilizan facultativamente, dependiendo de la abundancia nutritiva del medio.

Requerimientos químicos Carbono .

Los microorganismos microorganismos son extraordinariamente extraordinariamente diversos tanto respecto respecto a la clase como al número de compuestos orgánicos que pueden usar como fuente principal de carbono y energía. Esta diversidad, se manifiesta en el hecho de que no hay ningún compuesto orgánico que exista en la naturaleza que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y energía por algún organismo.

Los organismos que realizan la fotosíntesis y las bacterias que obtienen la energía a partir de la oxidación de compuestos inorgánicos (quimiolitótrofas) usan típicamente la forma mas oxidada del Carbono, el C02, como única o principal fuente de Carbono celular.


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Todos los demás organismos obtienen el carbono principalmente a partir de nutriente orgánicos. Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy sencillas como ácido acético, alcohol, citrato sódico, etc. En otras ocasiones, la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosa, etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejos para obtener energía, como es el caso del almidón. Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso, hidrocarburos como fuente de energía. Por último, existen especies, como por ejemplo Pseudomonas, que pueden utilizar como fuente de energía un gran número de componentes hidrocarbonados diferentes. En general, conocer el tipo de azúcar utilizado por cada bacteria es muy útil para su identificación bioquímica y consiguiente clasificación taxonómica.

Nitrógeno, azufre, fósforo El nitrógeno y el azufre se encuentran en los compuestos orgánicos de la célula principalmente en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo. La mayoría de los organismos fotosintéticos, así como muchas bacterias no fotosintéticas y hongos, asimilan estos dos elementos en estado orgánico oxidado, como nitratos y sulfatos, su utilización implica, pues, una reducción preliminar. Los requerimientos de nitrógeno y azufre pueden satisfacerse también con frecuencia, con nutrientes orgánicos que contengan estos dos elementos en combinación orgánica reducida (aminoácidos o productos más complejos de la degradación de las proteínas, como las peptonas). Existen muchos tipos de peptonas y son excelentes fuentes de nitrógeno. Entre las más frecuentes y conocidas se encuentran los extractos de levadura que son extractos hidrosolubles preparados a partir de un lisado de levadura que se utiliza util iza en muchos medios de cultivo.

Fósforo, la fuente habitual de este elemento lo constituyen los fosfatos. Iones metálicos (K, Mg, Fe, Zn, Mn, Co, etc.) agua. Está RESPIRACIÓN . El oxígeno se encuentra a disposición de las células en forma de agua. contenido además en el anhídrido carbónico y en muchos compuestos orgánicos. Muchos microorganismos necesitan además oxígeno molecular (O2). En función del requerimiento de oxígeno para la respiración celular:

a. aerobios obligados o estrictos , sólo pueden obtener energía mediante la respiración y necesitan O2. Entre los microorganismos que son aerobios estrictos, algunos crecen mejor a presiones parciales de oxígeno considerablemente mas bajas que las presentes en el aire. Se denominan mícroaerófilos. b. anaerobios obligados, sólo crecen en un medio exento de O2, el O2 es tóxico para ellos.


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c. anaerobios facultativos crecen tanto en presencia como en ausencia de O2. Entre ellos hay que distinguir dos tipos: aerotolerantes, bacterias del ácido láctico, aunque pueden crecer en  presencia de O2, no pueden utilizarlo, sino que obtienen energía exclusivamente por fermentación. anaerobias facultativas (Enterobacteriaceas) y muchas levaduras pueden  obtener energía tanto por respiración (en presencia de O2), como por fermentación (en ausencia de O2). 6.3 RESPIRACIÓN Y FERMENTACIÓN Una vez que la glucosa se ha degradado a ácido áci do pirúvico, este ácido puede seguir oxidándose por la vía de la respiración o la fermentación. La RESPIRACIÓN (fosforilación oxidativa) es un proceso, en el que funciona una cadena transportadora de electrones mediante coenzimas que se reducen, hasta llegar a una molécula inorgánica, que actúa como aceptor final de electrones (generalmente (generalmente el O2). La oxidación produce energía en forma de ATP.

Respiración aeróbica se llama así cuando el aceptor final de hidrógeno (electrones) es el oxígeno molecular O2. Respiración anaeróbica es aquella en la que el aceptor final de hidrógeno (electrones) es una molécula inorgánica distinta del oxígeno molecular, como iones nitrato, sulfato o carbonato. FERMENTACIÓN Este proceso se inicia a partir del ácido pirúvico, tiene como características fundamentales: 1. No requiere oxígeno (aunque (aunque a veces veces puede ocurrir ocurrir en su su presencia) 2. No necesita cadenas transportadoras transportadoras de electrones (ciclo de Krebs) 3. Utiliza moléculas orgánicas como aceptor final de electrones 4. Libera energía energía a partir de azúcares u otras moléculas orgánicas como aminoácidos, ácidos orgánicos, etc. 5. Tiene un un rendimiento menor menor que la respiración respiración En la respiración toda la energía de la glucosa se aprovecha, ya que los productos finales CO2 y H2O están exentos de energía. En cambio, en la fermentación; al dar como productos finales CO2 y un compuesto orgánico (etanol, ácido láctico) todavía dotado de energía, significa un aprovechamiento incompleto de las posibilidades energéticas de la glucosa. La fermentación es un sistema utilizado frecuentemente por algunos m.o. como, levaduras y determinadas bacterias). También en algunas células animales y plantas en condiciones especiales. Algunas células (anaerobias estrictas) realizan la fermentación porque carecen de la dotación enzimática precisa para la respiración; pero es frecuente que esta se produzca cuando las células no tienen a su disposición el oxígeno (anaerobia facultativas). Esta circunstancia se da en las levaduras.

6 -  PRUEBAS BIOQUÍMICAS

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Las levaduras actúan sobre el mosto, degradando la glucosa por vía respiratoria. Cuando en los lagares, por efecto de la acumulación del CO2 encima del mosto, el aire no entra en contacto con la levadura, se inicia entonces la fermentación de la glucosa con la correspondiente formación de alcohol. Hay que remarcar, respecto al papel que desempeña el oxígeno en la respiración, que el proceso respiratorio, al igual que la fermentación, es un proceso de oxidación, pero en el que esta oxidación sucede no por ganancia de oxígeno , sino pérdida de hidrógeno. El oxígeno es, simplemente, el aceptor final de hidrógeno en la respiración, como lo son otros compuestos orgánicos en la fermentación.

Metabolismo: Los conceptos “heterotrofo” y “autotrofo” pensados para denominar los tipos de nutrición de animales y plantas, no son suficiente para caracterizar la variedad de tipos nutricionales que se dan en los microorganismos. Los tipos nutricionales en este reino, se clasifican según sea: a. Fuente de energía Fototrofas (Foto) obtienen la energía directamente de la luz.  Quimiotrofas (Quimio) obtienen la energía por reacciones red-ox degradando sustancias independientemente de que realizen respiración o fermentación. b. Dadores de hidrógeno y fuentes de carbono Organotrofos Utilizan sustancias orgánicas como dadores de  hidrógeno Litotrofos Utilizan dadores de hidrógeno inorgánicos (H2, NH3, H2S,  S, CO, Fe2+...)  

Estos términos “organotrofos” y “litotrofos” sustituyen a los tradicionales: Autotrofo obtienen la mayoría del carbono por fijación del CO2. Heterotrofo extraen el carbono celular de sustancias orgánicas.

Energía Foto (luz) Quimio

Fuente de C auto (CO2) Hetero

dador de electrones Lito (comp. inorg.) Órgano (comp. org)

En general, basta con indicar el proceso de obtención de energía y el dador de hidrógenos. 1. Foto lito trofoh Fotoautolitotrofo (plantas, cianobacterias, bacterias rojas del S) 2. Foto órgano trofo h Fotoheteroórganotrofo (Piloodobacterias, bacterias rojas no S) 3. Quimio lito trofo h Quimioautolitotrofo (bacterias nitrificantes) 4. Quimio órgano trofo h Quimioheteroórganotrofo (animales, hongos, bacterias) (1 y 4 ------------> Eucariotas)


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Bacterias fototróficas . La capacidad de utilizar la luz como fuente de energía para el crecimiento es propia de dos grupos de bacterias: 1. Cianobacterias. Utilizan agua como dador de hidrógenos y liberan oxígeno en presencia de la luz solar (fotosíntesis oxigénica). 2. Bacterias rojas y verdes . No pueden utilizar el H2O como dador de hidrógenos, sino que necesitan un dador de [H] fuertemente reducido (H2S, H2, materia orgánica). Como consecuencia estas bacterias no liberan oxígeno durante la fotosíntesis (fotosíntesis anoxigénica). Se las considera como reliquias de los primeros tiempos de la fotosíntesis. Son bacterias unicelulares acuáticas , de color rojo, naranja o verde, en función del contenido que posean de pigmentos fotosintéticos: bacterioclorofilas y carotenoides.


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En las zonas anaeróbicas de los lagos (10-30 m. de profundidad) se da un crecimiento estacional de las bacterias rojas del azufre por darse condiciones para su crecimiento: 

 

Radiación solar en la zona del espectro azul, verde-azul (450-500 nm) que corresponde a la zona de absorción de los carotenoides. H2S (descomposición sulfatos y proteínas) CO2 y materia orgánica.

El metabolismo de las bacterias fototróficas representa el grupo de organismos metabólicamente más versátil. Hay grupos con capacidades de desarrollo diversas:    

anaeróbicamente con luz y aeróbicamente en la oscuridad anaeróbicos estrictos y fototrofos obligados Dador de hidrógenos: H2S, H2, S (según grupos). Fuente de carbono: CO2, materia orgánica (según grupos).

Bacterias aeróbicas quimiolitotrofas . Bacterias de suelos y aguas con capacidad de utilizar compuestos o iones inorgánicos como dadores de hidrógenos y CO2 como fuente de carbono. La Nitrobacterias (Nitrosomas, Nitrobacter), son bacterias nitrificantes que oxidan el NH4+ (liberado en el proceso de descomposición microbiana de la materia orgánica) a NO2- y éste a su vez de NO2- a NO3NH3 ------ -----> NO2-

Nitrosomas

NO2- -----------> NO3-

Nitrobacter

S0, S2-, S2O32--------------> SO42-

Thiobacillus thiooxidans

Fe2+ --------------> Fe 3+

Thiobacillus ferrooxidans

La obtención de energía tiene lugar, por lo general, a través de la respiración con O2 y sólo escasos m.o. pueden utilizar NO3-, NO2-, N2O como aceptor de electrones (R.anaerobia).

Fijación del nitrógeno molecular : Solo algunos procariotas son capaces de captar y fijar el nitrógeno atmosférico (N2). En parte en formas de vida libre, en parte en simbiosis con plantas superiores, pueden pasar al N2 inerte a una combinación orgánica, incorporándolo directamente (Rhizobium) o a través de las sustancias celulares a la proteína del suelo. N2 + 8 [H] -------> 2 NH3 + H2 La fijación simbiótica del N2 por leguminosas (Rhizobium) produce 100-300 Kg N/(Ha.a.) Los microorganismos de vida libre fijadores de N 2 aportan al suelo entre 1-3 Kg. N/(Ha.a.) Las lluvias pueden aportar al suelo entre 3-30 Kg N/(Ha.a.)


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Respiración anaerobia: En sedimentos, lagunas y suelos permanentemente inundados (condiciones anóxica) se desarrollan bacteria que utilizan como fuente de carbono y dadores de hidrógeno los compuestos producidos por las bacterias fermentadoras, o que estas no han utilizado (final cadena alimentaria).    

NO3sulfato, azufre CO2, CO32Fe3+

-------> N2, N2O (óxido nitroso) -----> H2S -------> CH4, CH3COOH --------> Fe2+

Los respiradores anaeróbicos tienen gran importancia por: Ciclos de los elementos y mantenimiento de los equilibrios en la biosfera.   Respiración anaeróbica como forma predominante en las primeras etapas de formación de la biosfera en la Tierra (almacenamiento de carbono orgánico en los sedimentos arcaicos). Cuando los campos no están bien aireados se produce un proceso de desnitrificación  por la respiración de los nitratos.

Tipos de fermentaciones anaeróbicas puesto que la vida surgió en una atmósfera carente de oxígeno, la fermentación anaeróbica constituye el mecanismo biológico mas primitivo destinado a obtener energía de los alimentos. 6.4 VÍAS FERMENTATIVAS DEL ÁCIDO PIRÚVICO: 1. Láctica. Se produce ácido láctico en la fermentación del pirúvico. a. Homoláctica se produce únicamente ácido (Lactobacillus, Streptococcus en la producción de derivados de la leche1 : yogur, queso, leche ácida..., ) b. Fermentación heteroláctica . aparecen ademas del ácido láctico, otros compuestos como etanol o dióxido de carbono. I. Ácido mixta. II. Butanodiólica 1. Fermentación alcohólica el ácido pirúvico se transforma en etanol y dióxido de carbono (típica en levaduras muy rara en bacterias). Esta fermentación la realizan levaduras del tipo Saccharomyces y, dependiendo de la cepa de levadura y del proceso de fabricación, se originan gran variedad de bebidas alcohólicas: wisky, cerveza, sidra, vino... La fermentación de los polisacáridos de la harina en el proceso de fabricación del pan es también un ejemplo de fermentación alcohólica. El dióxido de carbono es el responsable del ahuecamiento de la masa y tanto el como el alcohol desaparecen en el proceso de cocción. 2. Fermentación propiónica. Vía lenta. (Corynebacterium) 3. Fermentación butírica - butílica (típica de anaerobios) 4. Fermentación pútrida o PUTREFACCIÓN Consiste en la desintegración de las grandes moléculas proteicas de los residuos vegetales y cadáveres animales llegando a formarse aminoácidos. En este proceso se liberan gases como el amoníaco, dióxido de carbono, hidrógeno, metano y otros de olor fétido, como el sulfuro de hidrógeno, el nidol y el escatol. se producen también ptomaínas (muy tóxicas).

1

la enzima -galactosidasa permite a estos m.o. hidrolizar la lactosa en glucosa-galactosa


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Fermentación acética El término fermentación se suele utilizar en un sentido más amplio, al aplicarlo también, para referirse a una serie de procesos en los que sí interviene oxígeno, aunque el producto final es un compuesto orgánico y por tanto no hay degradación completa de la materia orgánica (fermentaciones oxidativas). La fermentación acética la realizan bacterias del género Acetobacter transformando el etanol en ácido acético, por un proceso de oxidación en presencia de oxígeno (vino en vinagre). Los m.o. aeróbicos que producen el vinagre forman una telilla sobre la superficie del vino, para poder permanecer en contacto con el aire.

6.5. CARÁCTERES BIOQUÍMICOS. Basadas en el estudio del metabolismo de diferentes tipos de sustrato, las reacciones bioquímicas son un carácter taxonómico, que permite la clasificación de las bacterias por su posesión de enzimas.

1. ENZIMAS EXTRACELULARES: Las biomoléculas de estructura polimerizada como almidón, proteínas y lípidos, tienen un peso molecular excesivo para atravesar la membrana celular. Para que la célula pueda utilizar dichas sustancias como sustrato, será preciso que disponga del equipo enzimático adecuado. Estas moléculas deben ser primero hidrolizadas por enzimas extracelulares específicas, en sus respectivas unidades de construcción. Estas moléculas de bajo peso molecular podrán ser entonces transportadas al interior de las células y utilizadas en el metabolismo celular.


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Almidón ------- amilasa --------> Maltosa ---------- maltasa ----------> Glucosa Triglicéridos ---- lipasas --------> ácidos grasos + glicerol Proteínas -------- proteasas (proteólisis) --------> Peptonas ----------> Aminoácidos

2. HIDRATOS DE CARBONO A. Polisacáridos: Almidón: La amilasa hidroliza el almidón. si añadimos al medio una pequeña cantidad de Lugol, este reacciona con el almidón, dando color azul intenso. Alrededor de las colonias que poseen amilasa, aparece una zona clara que indica que el almidón ha sido consumido. B. Disacáridos. Lactosa: La bacterias que poseen la encima  -galactosidasa son capaces de desdoblar la lactosa (medios Mc Conkey, KIA...) en glucosa y galactosa. La glucosa es fermentada y acidifica el medio. La disminución del pH del medio se evidencia por el uso de indicadores. Las bacterias que carecen de la enzima galactosidopermesasa dan fermentación tardía de la lactosa (prueba ONPG2). C. Monosacáridos Capacidad de metabolizar (GLU, ARA3). 3. PRÓTIDOS. a. Proteínas completas: Gelatina. Proteína derivada del colágeno, uno de los componentes del tejido conjuntivo. La enzima gelatinasa hidroliza la gelatina y la licúa, sobre todo en la superficie del medio. La prueba se realiza a 22 ºC (la gelatina funde a 30 ºC y daría falsos "+") b. Aminoácidos. Se pueden degradar de tres formas: I. Desaminación: Eliminación del grupo amino (-NH2). La prueba de la fenilalanina consiste en desaminar este aminoácido (fenilalanina desaminasa) dando ácido fenilpirúvico. Añadiendo FeCl3 forma un complejo verde intenso.(TDA 4) II. Descarboxilación: Ruptura del grupo carboxilo (-COOH), por la enzima descarboxilasa, produciéndose la alcalinización del medio y formación de CO2. Son importantes las descarboxilaciones anaeróbicas. Aminoácidos lisina 5, ornitina 6 . 2

ONPG - Las bacterias que poseen  -galactosidasa pero no galactosidopermeasa dan (-) en la prueba de la lactosa. La ONPG (ortonitrofenolgalactosido) atraviesa fácilmente la pared bacteriana y es desdoblada por la  -galactosidasa en galactosa más un radical de color amarillo. Se utiliza esta prueba bioquímica para la identificación de las bacterias fermentadoras tardías de la lactosa (entre 2-15 días en fermentar la lactosa). 3 GLU, ARA capacidad de metabolizar los monosacáridos glucosa y arabinosa 4 TDA- Se detecta la presencia de la enzima TDA (triptofano desaminasa) La enzima produce la desaminación del sustrato (triptófano) Identificación: la adición de FeCl3 da verde obscuro si esta presente TDA 5 LDC - En la degradación proteica intervienen numerosos hongos y bacterias (Bacillus cereus, Mycoides, Pseudomonas, Proteus vulgaris...). Las bacterias que poseen la enzima lisina descarboxilasa pueden catabolizar anaeróbicamente aminoácidos (lisina) según la siguiente reacción de descarboxilación: Lisina H2N - (CH2)4-CHNH2-COOH ------->H2N-(CH2)4-CH2-NH2 (cadaverina) + CO2


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III. Degradación total del aminoácido (descarboxilación + desaminación) Indol

  

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H2S 8

a. Derivados de aminoácidos: Urea 9 1. LÍPIDOS La lipasa actúa sobre los lípidos dando ácidos grasos . Las sales de estos ácidos grasos se emplean como única fuente de carbono (agar citrato 10) . La producción de sustancias alcalinas provocan el viraje del azul de bromotimol (amarillo pH<6 y azul pH>7,6) 2. VÍAS DE OBTENCIÓN DE ENERGÍA: a. Respiración (enzimas respiratorios: Oxidasa11, Catalasa12, reducción de nitratos13) b. Fermentación (amplia variedad de tipos) I. Ácido mixta. Prueba de RM II. Butanodiólica. Prueba VP

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ODC - Degradación anaeróbica de aminoácidos. La enzima ornitina descarboxilasa permite degradar: Ornitina ------(descarboxilación)---------->H2N-(CH2)4-NH2 (putrescina) + CO2 7 IND - La degradación total del aminoácido triptófano por la enzima triptofanasa Triptofano-------descarboxilación + desaminación-------> indol+ piruvato+amoníaco Indol + p-dimetilaminobenzaldehído (R. Kovaks) ----------------> anillo color rojo 8

H2S - La fermentación de aminoácidos sulfurados: cisteína, metionina (generalmente se añade al medio de cultivo una fuente adicional de azufre en forma de tiosulfato de sodio) puede dar H2S. Al unirse a las sales de hierro da un precipitado de color negro 9 URE - H2N-CO-NH2 -----------------ureasa------------> CO2+NH3+H2O (+ rojo fenol) 10 CIT. La capacidad de metabolizar lípidos se evidencia utilizando ácidos grasos (o mejor sus sales) como única fuente de carbono. La producción de sustancias alcalinas provocan el viraje del azul de bromotimol (amarillo pH<6 y azul pH>7,6) 11 OX - Detección de la enzima respiratoria citocromo c. Realizar la prueba de la Oxidasa con una colonia, en un papel de filtro, antes de empezar con la galería. De esta forma si da un resultado positivo, se descarta el grupo de enterobacterias. El test API 10S está pensado para identificar enterobacterias y otros bacilos Gram (-) 12

Catalasa Capacidad de eliminar el peróxido de hidrógeno 2 H2O2 --------> H2O + O2

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NO2 - Detecta la presencia de la enzima nitratoreductasa que permite a las bacterias reducir los nitratos a nitritos (aceptor final de electrones) NO3- -------> NO2- ---------> N2, NH3, N2O3 Se visualiza mediante el reactivo de Griess (-naftilamina y ácido sulfanílico) (+ color rojo).


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1. OTRAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS a. Coagulasa : Lo poseen las bacterias que coagulan el plasma, al inhibir el efecto anticoagulante del EDTA o del oxalato presente en el plasma. b. DNAasa: La desoxiribonucleasa desdobla el DNA en sus nucleótidos constituyentes. c. Hemólisis: Capacidad de producir la lisis de los hematíes de la sangre. d. Motilidad Observación de la difusión lateral de la turbidez, en la siembra por picadura en un tubo con agar blando (0,4 % de agar). e. Producción de pigmentos: Determinados medios estimulan a las bacterias a producir pigmentos. 6.6 DESCRIPCIÓN DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS. A. PRESENCIA DE OXIDASA Fundamento La prueba se basa en comprobar la existencia de proteínas citocromo c que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones propias del metabolismo respirador. La presencia de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-pfenilendiamina de oxidarse al ceder electrones al citocromo c, apareciendo una coloración azul (forma oxidada). Fig. 6.1 Esta prueba permite diferenciar el grupo Enterobacteriacea (que carece de citocromo c) del género Pseudomonas (que posee citocromo c).

Reactivos Tetrametil-p-fenilen diamida en solución de alcohol isoamílico al 1,1 %.  El reactivo, una vez preparado, no tiene color o es ligeramente rosado. A causa de la  capacidad de autooxidación que tiene, se debe guardar a 4 ºC y preservarlo de la luz. Procedimiento 1. Sembrar en estría escocesa, para obtener colonias aisladas, dos placas de agar sangre o TSA (no utilizar medios glucosados) con inóculos de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. 2. Incubar a 37 ºC durante 48 h. 3. Tomar una colonia y extenderla encima de un papel de filtro Whatman nº 1 (utilizar asa de platino, pipeta de plástico, torunda algodón impregnada, palillo de madera). 4. Dejar caer una gota de reactivo sobre la colonia a determinar. 5. Las bacterias productoras de oxidasa, oxidan rápidamente el reactivo y la colonia se vuelve de color violeta (durante los primeros 30-60 seg)


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B. PRUEBA DE LA CATALASA Fundamento. En los ambientes acuosos, que contienen oxígeno disuelto, como el citoplasma de las células, aparecen formas tóxicas derivadas del oxígeno. Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un equipo enzimático capaz de neutralizar estas formas tóxicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.Fig. 6.1. Son ejemplos de catalasa positivo Escherichia coli y catalasa negativo Enterococcus faecalis.

Procedimiento 1. Tomar una colonia con un palillo de madera y depositarla en el centro de un porta. 2. Añadir una gota de peróxido de hidrógeno (3%). 3. Si la reacción es positiva, se produce inmediatamente un apreciable burbujeo de O2. C. PRUEBA DEL INDOL Fundamento. Esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias. Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, compuesto que se determina en el ensayo. Para realizar esta prueba, la bacteria se cultiva en un caldo de triptona con NaCl al 0,5 % (medio especialmente rico en triptófano). Si la bacteria tiene la enzima triptofanasa, al añadir al medio el reactivo de Kovacks, este formará un complejo con el indol y se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. El genero Enterobacter da negativo en la prueba del indol y Escherichia coli positivo. Fig 6.1 Procedimiento 1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. caldo de triptona (BTW) sendos inóculos de Enterobacter y Escherichia coli. 2. Incubar 24 h. a 37 ºC 3. Añadir a 1 ml. de los tubos incubados 5 gotas de reactivo de Kovacks, dejándolo caer por la pared interior del tubo. Lectura de resultados. En caso dudoso incubar hasta un máximo de 5 días.


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Fig. 6.1 D-E. PRUEBAS DEL ROJO DE METILO (RM) Y VOGES-PROSKAUER (VP). Fundamento. Las bacterias que en anaerobiosis fermentan los azúcares pueden realizar esto por distintas rutas. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente, consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Esta fermentación puede ser de dos tipos: a. Fermentación ácido-mixta. Los productos finales son ácidos orgánicos (fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol. Fermentación característica de los géneros Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia. b. Fermentación butilén-glicólica. Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario. Fermentación característica de los géneros Enterobacter, Serratia y la mayoría de especies Erwinia. La liberación de ácidos orgánicos en el primer tipo de fermentación (ácido-mixta) generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH de alrededor 4,0). Si la fermentación que se ha llevado a cabo es del tipo butilén-glicólica, la producción de acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol (prueba Voges-Proskauer) que reaccionará con este compuesto produciendo un color rojo característico.Fig. 6.2 y 6.3.


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Fig. 6.2. Fermentación ácido-mixta

Fig. 6.3 Fermentación butano-diólica


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Prueba del Rojo de metilo (RM). Procedimiento: 1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inóculos de Enterobacter aerogenes y de Escherichia coli. 2. Incubar 48-72 h a 37 ºC. 3. Añadir a 1 ml. de los tubos incubados cinco gotas de rojo de metilo. 4. Observar el color resultante: En caso de duda incubar 48 h. más. 5. Interpretación: El medio de cultivo toma color rojo: (+). El medio permanece amarillo o color amarillo naranja (indica que hay productos ácidos débiles): (-) Prueba de Voges-Proskauer Glucosa --> Ác. pirúvico -->Acetoína --->Diacetilo ---->Complejo rojo + KOH (aire)+ naftol

Procedimiento: 1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inóculos de Enterobacter aerogenes y de Escherichia coli. 2. Incubar 48 h a 37 ºC 3. Añadir a 1 ml. de los tubos incubados 10 gotas de -naftol al 5 % y 10 gotas de KOH al 40 % (por este orden) 4. Agitar para mezclar y colocar los tubos en posición de máxima inclinación durante 10-15 min. (facilita la difusión del O2 atmosférico). 5. Observar a las 2, 12 y 24 horas. 6. Observar el color resultante: Interpretación: Aparición del color rosa eosina: (+). En caso de duda incubar 48 h. más. Los productos finales neutros (butanodiol y en menor cantidad etanol) predominan sobre los ácidos; como consecuencia, la cantidad total de ácido que se forma por mol de Glucosa fermentada es considerablemente más pequeña en una fermentación butanodiólica que en una fermentación ácido-mixta.

Productos de la fermentación de glucosa por bacterias entéricas PRODUCTOS, MOLES POR CADA 100 MOLES DE GLUCOSA FERMENTADA FERMENTACIONES ÁCIDOFERMENTACIONES MIXTAS BUTANODIÓLICAS Esch Aeromonas Vibrio Enterobacter Serratia erich punctata cholerae aerogenes marcescens ia coli

Etanol 50 2,3 butanodiol Äcido acético 36 Ácido láctico 79 Ácido succínico 11 Ácido fórmico 2,5 H2 75 CO2 88 Total ácidoformado 129

64 62 43 22 105 232

51 39 53 28 73 193

70 66 0,5 3 17 35 172 20

46 64 4 10 8 48 116 70


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Fermentación de la lactosa Lactosa C12H22O11 ------(hidrólisis por enzima lactasa)------->

d − Glu cos a ( fermentacio´n) + d − Galactosa

La capacidad de fermentar la Lactosa (disacárido formado por dos monosacáridos, unidos por el enlaces  -1,4, entre la glucosa y la galactosa), depende de la presencia de la enzima  galactosidasa. La utilización efectiva de la Lactosa, también requiere la presencia de la Galactósido permeasa que favorece la entrada de la lactosa en el interior de la célula. Las bacterias que producen  -galactosidasa pero les falta permeasa no pueden incorporar Lactosa a una velocidad suficiente para producir una fermentación rápida y vigorosa, y generalmente, se clasifican como NO fermentadores de lactosa. La fermentación de Lactosa es especialmente característica de Escherichia y Enterobacter, y ausente de Shigella, Salmonella y Proteus. La formación de Gas en la fermentación de azúcares es un carácter de valor considerable para la diferenciación taxonómica de estos grupos, ya que permite diferenciar entre los formadores de gas del género Escherichia y los patógenos del grupo Shigella y Salmonella typhi, que fermentan sin producir gas. En una fermentación ácido-mixta simple, solamente se puede formar gas por descomposición del ácido fórmico. La producción de gas refleja la presencia de Hidrogenoliasa fórmica. Esta enzima no es esencial para el metabolismo fermentativo; existen colonias de Escherichia coli (especie típicamente productora de gas) que no son productoras de gas. Las bacterias que realizan la fermentación Butanodiólica también presentan diferencias respecto a la presencia de la Hidrogenoliasa fórmica. La colonias del género Enterobacter casi siempre tienen esta enzima y son intensos productores de gas; los del género Serratia no lo presentan y en ellos la producción de gas es inapreciable.

Resumen de los patrones de fermentación del grupo entérico FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA A. Producen CO2+H2 (poseen hidrogenoliasa fórmica): Escherichia Proteus Salmonella (la mayoría de especies) Photobacterium (algunas de las especies) B. No producen gas (carecen de hidrogenoliasa fórmica): Shigella Salmonella typhi Yersinia Vibrio Aeromonas (algunas especies) Photobacterium (algunas especies Beneckea (la mayoría de las especies)


85

MODIFICACIÓN BUTANODIÓLICA DE LA FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA A. Producen CO2 + H2 (poseen hidrogenoliasa fórmica): Enterobacter, Aeromonas hydrophila, Photobacterium phosphoreum B. Producen únicamente CO2 (carecen de hidrogenoliasa fórmica); formación de gas ligeramente apreciable o indetectable: Serratia, Erwinia herbicola, E. carotovara... F. AGAR MC CONKEY. Es un medio selectivo por contener sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas. Es también un medio diferencial, porque contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azúcar producirán un cambio en el pH del medio por la liberación de productos ácidos. Como consecuencia sus colonias aparecerán de color violeta, contrastando con la coloración amarillenta de las colonias de bacterias no fermentadoras de lactosa. G. AGAR SANGRE. Es un medio general rico en nutrientes, por lo que permitirá el crecimiento de una amplia variedad de bacterias. Además es un medio diferencial, ya que permite comprobar si la bacteria es capaz de hemolizar los eritrocitos del medio de cultivo. Algunas bacterias, sobre todo los estreptococos, pueden romper los hematies de la sangre (Hemólisis). Si la hemólisis que se produce es total , se denomina betahemólisis; si es parcial alfa-hemólisis, y cuando no existe, se habla de hemólisis tipo gamma. Los tres tipos de hemólisis se manifiestan de la siguiente manera: -hemólisis: Halo verde alrededor de la colonia, debido a una destrucción parcial de  los hematíes.  -hemólisis: Halo intensamente claro alrededor de la colonia por la lisis total de los  hematíes. -hemólisis: Ausencia de halo claro.  H. AGAR CITRATO DE SIMMONS. Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno y azul de bromotimol como indicador de pH. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato (indica presencia de la enzima citrato permeasa) podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, utilizarán los fosfatos presentes liberando iones amonio. Estos iones amonio que evolucionan a amoníaco, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que se manifestará por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Incubar a 37 ºC 18-24 h. I. AGAR FENILALANINA. La mayoría de las bacterias poseen enzimas capaces de hidrolizar específicamente algún aminoácido, liberando al medio los grupos amino (desaminación). En este medio el aminoácido presente es la fenilalanina, y es empleado para determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa en las bacterias. La acción de esta encima se evidencia por la aparición en el medio del producto resultante (ácido fenilpirúvico), que se detecta mediante la adición de cloruro de hierro (III), resultando un compuesto de coloración verde oscura. Procedimiento: 1. Efectuar una siembra en estría de un cultivo fresco. 2. Incubar 18-24 h a 37 ºC 3. Añadir varias veces cloruro de hierro (III) al 10 %. Esperar hasta 5 min. 4. Resultados: Color inicial del medio (-). Color verde intenso (+).


86

J. AGAR KLIGLER (KIA). Este medio diferencial complejo (de color rojo) es muy útil, ya que demuestra varias características enzimáticas de la bacteria. Esta compuesto principalmente por dos azúcares en distinta proporción (glucosa al 0,1 % y lactosa al 1 %), tiosulfato sódico, citrato férrico y rojo fenol como indicador de pH. Para estudiar el comportamiento de las bacterias en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, la siembra en este medio de cultivo se realizará tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de este (anaerobiosis). La información que podemos obtener es la siguiente: a. Fermentación de la glucosa: viraje a color amarillo en el fondo del tubo inclinado. Si la bacteria fermenta sólo la glucosa, en la superficie del tubo inclinado la utilizará por vía respiratoria, y, donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la descarboxilación oxidativa de las proteínas (proceso que depende del oxígeno). Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambio de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad del tubo inclinado emplearán desde el primer momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un descenso de pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiará a amarillo. b. Fermentación de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del tubo inclinado. Si la bacteria, además, fermenta la lactosa, los ácidos producidos modifican también el pH de la superficie del medio. En este caso las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiará a amarillo. c. No fermentación de los azúcares: el tubo inclinado no cambia de color. Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), como, por ejemplo, el género Pseudomonas, el medio permanecerá de color rojo. En este caso, los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH. d. Producción de gas en la fermentación: aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo. Enzima hidrogenoliasa fórmica. e. Producción de ácido sulfhídrico: aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxibiónticas son capaces de emplear el tiosulfato sódico como aceptor final de electrones de la transportadora. Como consecuencia, este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico, que, a su vez, reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro (fig. 6.1). Los iones Fe2+ proceden de los Fe3+ del citrato férrico y aparecen debido a los cambios en los potenciales redox producidos al someter al autoclave al medio de cultivo. f. La degradación de las peptonas (aeróbica o anaeróbicamente) origina un proceso de descarboxilación que produce amoníaco, produciendo el viraje del indicador a un rojo intenso.


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TABLA DE LECTURA E INTERPRETACIONES DE RESULTADOS EN AGAR TRES-AZÚCARES-HIERRO Género y especie

Fondo inclinada

Superficie Producción de SH2

Escherichia coli

AG

A

-

Enterobacter aerogenes

AG

A

-

Enterobacter cloacae

AG

A

-

Citrobacter freundii

AG

A

+

A/AG

R/K

-

R/K

R/K

-

Proteus vulgaris

AG(1)

K/A

+

Proteus mirabilis

AG(1)

K/A

+

Proteus morganii

AG(1)

R/K

-

A/K

R/K

-

A

R/K

+,(2)

Salmonella typhimurium

A/G

R/K

+

Salmonella paratyphi B

A/G

R/K

+

Salmonella enteritidis

A/G

R/K

+

Salmonella paratyphi A

A/G

R/K

-

Salmonella gallinarum

A

R/K

+

Salmonella choleraesuis

A/G

R/K

-

Shigella flexneri

A

R/K

-

Shigella dysenteriae

A

R/K

-

Shigella boydii

A

R/K

-

Shigella sonnei

A

R/K

-

R/K

R/K

-

Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis

Proteus rettgeri Salmonella typhi

Pseudomonas aeruginosa


CLAVE Color y aspecto A

Amarillo

G

Aparición de burbujas o grietas Rojo intenso

K

R SH2

NOTAS:

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INTERPRETACIÓN Fondo Fermentación de GLUCOSA y formación de ÁCIDO

Superficie inclinada Fermentación de LACTOSA y/o SACAROSA con producción de ÁCIDO

Formación de GAS a partir de GLUCOSA No fermentación de GLUCOSA y No fermentación de formación de ALCALI LACTOSA ni SACAROSA. Formación de ALCALI. No hay cambio del color No fermentación de GLUCOSA No fermentación de original (Rojo anaranjado). LACTOSA ni SACAROSA + Enengrecimiento Formación de SH2 - Sin ennegrecimiento

No formación de SH2

(1) Algunas cepas son A, sin producción de gas. (2) Sólo en parte superior de la columna, y a veces formando anillo a las 48 h.


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K. AGAR MANITOL SAL. Éste es un medio selectivo y diferencial muy utilizado para el aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. La alta concentración de sal (NaCl al 7,5 %) le proporciona su carácter selectivo, ya que sólo este tipo de microorganismos osmotolerantes y los microorganismos osmófilos pueden multiplicarse en él. Además, en su composición el único azúcar presente es el manitol, que únicamente son capaces de fermentar las cepas patógenas de este género bacteriano, diferenciándolas así de las que no lo son. La producción de ácidos proveniente de la fermentación del manitol es detectada por un viraje del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus aureus, fermentador del manitol, crecerá en el medio dando lugar a colonias grandes rodeadas de un halo amarillo, mientras que Staphylococcus hepidermidis, que no fermenta el manitol, dará lugar a colonias pequeñas rodeadas de un halo púrpura (a veces permite el desarrollo de Enterococcus faecalis, pero con un crecimiento muy pobre).

L. PRUEBA DE LA COAGULASA. Fundamento. Es una enzima semejante a la protrombina, que transforma el fibrinógeno en fibrina, dando un coágulo visible. Lo producen las bacterias que coagulan el plasma, inhibiendo el efecto anticoagulante del EDTA (etilendiamino tetracético) presente en el plasma. Es ejemplo de coagulasa positivo Staphylococcus aureus. Procedimiento 1. En tubos de 5 ml colocar 0,5 ml de plasma de conejo-EDTA rehidratado. 2. Añadir con asa Kolle 1 colonia bacteriana. 3. Homogeneizar con asa Kolle. 4. Incubar 4 h a 37 ºC. Lecturas a la 1/2 , 4 y 24 h. 5. Comprobar si presenta coagulación por hemólisis del plasma de conejo


90

6.7. DIFERENCIACIÓN ENTRE E.COLI Y ENTEROBACTER CLOACAE. PRUEBAS IMVIC. Escherichia coli crece bien sobre medios de cultivo que contengan glucosa, o lactosa y peptona. Para establecer ya desde un principio condiciones selectivas para que puedan crecer pocas bacterias, se utiliza la lactosa. La utilización de lactosa supone la capacidad de escindir la lactosa con formación de gas, mediante la  -galactosidasa, enzima utilizado por coliformes y bacterias lácticas. Como algunas bacterias del ácido láctico son capaces de desdoblar la lactosa formando gas, por lo que podrían falsear los resultados, son necesarios otros procedimientos para la diferenciación. Si se siembran en placa organismos de un cultivo de este tipo sobre agar eosina-azul de metileno Levine (lactosa-peptona-eosina-azul de metileno) las colonias de E.coli se diferencian porque sus colonias son planas de 2-3 mm de diámetro de color violeta oscuro y centro negro con un brillo metálico característico de color verdoso con luz reflejada. . Los organismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Para una diferenciación más exacta de las dos especies se ha acostumbrado a seguir un método rutinario denominado "IMVIC".

I: Indol

M: Rojo de metilo

Escherichia coli Enterobacter cloacae

I + -

V: Voges Proskauer M + -

V +

C: Citrato C +

Procedimiento: 1. Preparar dos placas de agar nutritivo. 2. Preparar un cultivo puro de E. coli y E. cloacae por siembra escocesa en las placas de agar nutritivo. 3. Incubar 48 h. a 37 ºC. 4. Observar al microscopio mediante una tinción Gram los diversos tipos de colonias aisladas. 5. Tomar una colonia y resuspenderla en un tubo de ensayo con 5 ml de solución Ringer. 6. Realizar la batería de pruebas IMVIC. (ver 6.6.C, 6.6.D-E, 6.6.H)


91

6.8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE UN CULTIVO MIXTO. Procedimiento 1. Realizar en una placa de agar TSA una siembra escocesa de la muestra de partida (cultivo mixto de un bacilo Gram negativo (E.coli) y un coco Gram positivo S.epidermidis). 2. Incubar a 37 º C durante 48 h. 3. Realizar una Tinción Gram de cada tipo de colonia aislada. 4. A partir de cada tipo de colonia, realizar un agotamiento por estrías en placas de agar sangre y de agar Mc.Conkey. Incubar a 37 º C durante 24 h.. 5. Comprobar el aspecto de las colonias. Verificar que en la placa de agar sangre se multiplican ambas bacterias y en la placa de agar Mc.Conkey sólo crecerá el bacilo Gram negativo. Observar en la placa de agar sangre si se ha producido hemólisis y de qué tipo es, y en la placa de agar Mc.Conkey si ha sido fermentada la lactosa. 6. A partir de las colonias de los cocos Gram positivos se realiza la prueba de la catalasa, que permite diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus. Para ello tomar con palillo de madera una colonia Gram+ del agar sangre y colocarla sobre un portaobjetos limpio. Añadir una gota de reactivo de la catalasa (peróxido de hidrógeno) . Si la prueba es positiva (aparición de burbujas), sembrar en el medio agar manitol sal . Incubar a 37 ºC durante 24 h. 7. A partir de las colonias de los bacilos Gram negativos se realiza la prueba de la citocromo c oxidasa. Para ello, colocar un trocito de papel de filtro sobre un portaobjetos limpio. Con un palillo de madera tomar una colonia Gram - del agar sangre y extenderla en el papel de filtro. Añadir encima una gota del reactivo oxidasa Observar si aparace coloración azul. Confirmar que el bacilo Gram negativo es una enterobacteria (citocromo c oxidasa negativa). 8. A partir de una colonia del bacilo Gram negativo sembrar los siguientes medios diferenciales: agar citrato de Simmons, agar fenilalanina, caldo de triptona con NaCl al 0,5 %, dos caldos de RMVP y agar de Kliger (KIA). Todos estos medios se siembran tal como se explicó en el capítulo 4 , excepto el agar de Kliger, que se siembre con una aguja de inoculación como muestra la fig. 6.4. 9. Incubar todos los medios a 37 ºC durante 24 h. 10. Añadir los distintos reactivos (4 gotas/tubo) a sus correspondientes cultivos. Las pruebas del citrato, manitol y KIA no requieren la adición de ningún reactivo. Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con la ayuda de la tabla nº 6-1, y 6-2 identificar las bacterias analizadas.


92

Aislamiento e identificación bacterianas

Tabla 6.1

Fig. 6.4


93

6.9 MÉTODOS MINIATURIZADOS DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA La batería de pruebas bioquímicas descrita es la forma clásica y general de identificación de enterobacterias y cocos Gram + . Sin embargo, actualmente estos métodos están siendo sustituidos por micropruebas en sistemas semiautomáticos, que permiten una identificación más rápida y menos laboriosa, imprescindible en grandes laboratorios (sistema API, etc.).

SISTEMA API. El sistema API comercializa diversas versiones (API 20 E, API 10 S, ...) miniaturizadas y estandarizadas de los procedimientos convencionales para la identificación de m iembros de la familia de las Enterobacterias y otras bacterias Gram negativas relacionadas. Consiste en una colección de microtubos (pocillos) donde se puede reproducir una serie de pruebas bioquímicas con una sola colonia de bacterias. En un soporte de plástico están alineados los microtubos que contienen los medios deshidratados (liofilizados). La siembra se realiza con una pipeta a partir de una suspensión bacteriana procedente de un cultivo puro. Algunos microtubos se cubren con parafina para crear anaerobiosis. Procurar no producir burbujas, mezclar líquido de microtubos distintos, ni llenar los microtubos demasiado, salvo indicación.

API 10 S. (BIOMERIUX) Las características bioquímicas que se estudian son: 

















ONPG: hidrólisis del ortonitrofenolgalactosidasa por la ß-galactosidasa, liberando ortonitrofenol de color amarillo. GLU (glucosa), ARA (arabinosa): la utilización de hidratos de carbono por las bacterias produce ácidos, que originan una caída del pH. El indicador azul de bromotimol virará de azul a amarillo. LDC: actividad lisina descarboxilasa. Transforma la lisina en una amina llamada cadaverina que incrementa el pH. El indicador virará de amarillo a rojo. ODC: actividad ornitina descarboxilasa. la enzima transforma la ornitina en una amina llamada putrescina, produciéndose un incremento del pH y un viraje de indicador de amarillo a rojo. CIT: utilización del citrato como única fuente de carbono. Esto produce un aumento de pH y que el indicador (azul de bromotimol) vire de verde a azul. H2S: producción de sulfhídrico a partir del tiosulfato. El sulfhídrico producido reacciona con las sales de hierro, obteniéndose un precipitado negro. URE: actividad ureasa. Esta enzima libera amoníaco a partir de la urea, produciéndose un incremento de pH y que el indicador (rojo de fenol), vire de amarillo a rojo. TDA: actividad triptófano-desaminasa. Esta enzima forma ácido indol pirúvico a partir del triptófano. El ácido producido forma un compuesto marmáceo en presencia de cloruro de hierro (III). IND: producción de indol a partir del metabolismo del tritófano. El reactivo de Kovacs forma un complejo rojo con el indol.


94

Pruebas complementarias: 



OXI: prueba de la oxidasa. Se basa en comprobar la producción de la enzima citocromo c oxidasa por parte de las bacterias. La presencia de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamida de oxidarse frente al citocromo c, apareciendo una coloración azul (forma oxidada). NO2: nitrato reductasa. Esta enzima reduce el nitrato a nitrito. La aparición de nitritos se manifiesta por la coloración de rojo que adquiere el medio tras añadir los reactivos ácido sulfanílico y N,N dimetil-alfa-naftilamina.

Procedimiento: 1. Preparar una cubeta de incubación con tapa. Anotar nº de identificación de la muestra 2. Sacar la galería API de la envoltura y colocarla en la cubeta en posición inclinada. 3. Con asa de Kolle se toma una colonia bien aislada de un cultivo de 24 h. y se emulsiona en agua estéril. 4. Con la pipeta Pasteur se inocula la galeria API. 5. Llenar la sección tubular del microtubo colocando la punta de la pipeta contra el lado de la cúpula. 6. Llenar la sección tubular y la cúpula de los microtubos CIT 7. Después de inocular, llenar completamente las cúpulas DE LOS MICROTUBOS LDC , ODC , H2S , URE , con aceite de parafina. 8. Humedecer la tapa con agua, para evitar evaporación. Eliminar el exceso de agua, tapar y dejarlo incubar en estufa 24 h a 37 ºC. 9. Anotar los resultados obtenidos según la tabla adjunta. 10. Una vez anotados los resultados obtenidos, el sistema API 10 se complementa con las siguientes pruebas bioquímicas: A. TDA - añadir en el microtubo TDA 1 gota de cloruro de hierro (III) al 10 % B. IND - añadir en el microtubo IND 1 gota de reactivo de Kovacs C. OX - añadir 1 gota del reactivo de la oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %) en el microtubo ONPG o al H2S si es negativo. D. NO2 - añadir en el microtubo GLU 2 gotas de ácido sulfanílico al 0,8 % (NIT 1) y 2 gotas de N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 % (NIT 2). Nota: Respetar el orden indicado para la 4 pruebas, ya que se liberan productos gaseosos que podrían interferir en otros microtubos de la galería.


95

Tabla 6.2 TEST ONPG

REACCION O ENZIMAS

SUBSTRATO

RESULTADOS NEGATIVO POSITIVO incoloro amarillo (1)

ß-galactosidasa

GLU

Ortonitrofenolgalactosido Glucosa

fermentación / oxidación (4)

azul/ azul verdoso

amarillo o gris

ARA

Aarabinosa

fermentación / oxidación (4)

azul/ azul verdoso

amarillo

LDC

Lisina

lisina descarboxilasa

ODC

Ornitina

ornitina descarboxilasa

citrato sódico

utilización del citrato

H2S

tiosulfato de sodio

producción de H 2S

URE

Urea

TDA (5)

amarillo/ naranja

rojo/ naranja

amarillo

rojo/ naranja (3)

verde palido/ amarillo

azul-verde/ azul (3)

Incoloro/ grisaceo

depósito negro (2)

ureasa

amarillo

rojo/ naranja

Triptófano

triptófano desaminasa

amarillo

marrón oscuro

IND (6)

Triptófano

producción de indol

amarillo

anillo rojo

OXI (7)

En microtubo: ONPG o H2S

citocromo oxidasa

incoloro / violeta claro

NO2 (8)

En microtubo: GLU

reducción de nitratos a NO 2 reducción a gas N 2

(+Zn)

CIT

amarillo rojo

violeta oscuro (2 min)

(2-3 min)

violeta amarillo

(1) Un amarillo muy pálido debe considerarse como positivo. (2) La producción de H2S puede variar de un depósito negro denso a una línea negra muy fina alrededor del fondo del tubo. Examinar cuidadosamente el fondo del tubo antes de considerar la reacción negativa. Un viraje a marrón del medio es una reacción negativa a menos que haya un depósito negro. Esto sucede con organismos TDA positivos. (3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis). (4) La fermentación empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la cúpula. (5) TDA - añadir 1 gota de cloruro de hierro (III) al 10 %. (6) IND - añadir 1 gota de reactivo de Kovacs. La reacción se leerá a los dos minutos después de añadir el reactivo de Kovacs. Después de varios minutos, el HCl liberado por el reactivo de Kovacs puede reaccionar con el material plástico de la cúpula resultando un cambio de amarillo (negativo) a rojo pardusco (se continúa considerando negativo). (7) Añadir en el microtubo H2S o ONPG 1 gota de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %. Esperar 20 min antes de considerar la reacción negativa. (8) NO2 - añadir en el microtubo GLU 2 gotas de ácido sulfanílico al 0,8 % y 2 gotas de N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 %. Antes de añadir los reactivos, observar si el tubo GLU (positivo o negativo) presenta burbujas. Estas burbujas son indicio de la reducción de nitratos a N 2. Después de haber añadido los reactivos de reducción de nitratos, confirmar un posible test negativo añadiendo polvo de zinc. Un color rojo después de 10 min confirma la reacción negativa, un color amarillo indica la reducción de los nitratos a un estado de nitrógeno.


96

IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS: A los test contenidos en API 10 S, se suman los test de la oxidasa (OXI) y el de reducción de nitratos (NO2), como test 11 y 12. 1. Los resultados pueden ser: A. Positivo: Se anota el valor correspondiente (1, 2, 4) B. Negativo: Se anota un 0.

Codificación del germen. Sumando los 3 valores obtenidos en cada triada se obtiene un número. Con la secuencia de 4 números encontrados, se busca en las tablas a que bacteria corresponde. Tabla 6.3. Ejemplo: Citrobacter freundii ONPG GLU ARA + + + | | | 1 2 4 \ | / \ | /

7

LDC ODC CIT H2S URE TDA IND OX NO2 + + + | | | | | | | | | 0 0 4 1 0 0 0 0 4 \ | / \ | / \ | \ | / \ | / \ |

4

1

4

/ /


97

TABLA Nº 6.3 DIRECTORIO DE PERFILES PARA INTERPRETACIÓN TEST API 10 S OO16

Pseudomonas putrefaciens

2.665

Proteus

6.514

Salmonella (2)

OO75

Proteus vulgaris

2.674

Proteus mirabilis

6.524

Klebsiella / Serratia

O206


2.675

Proteus mirabilis

6.604


O216


2.707

Vibrio

6.614

Citrob.freund./Salmon.(2)

O221

Proteus morganii

2.714

Salmonella (2)

6.674

Proteus mirabilis

O225

Proteus morganii

2.724

Serratia

6.704

Salmonella (2)

O261

Proteus morganii

2.764

Proteus mirabilis

6.707

Vibrio

O265

Proteus morganii

2.774

Proteus mirabilis

6.714

Salmonella (2)

O274

Proteus mirabilis

6.715

Salmonella (2)

O412


3.004

Shigella (2)

O416


3.005

Escherichia coli/Shigella (2)

7.000

Enterobacter agglomer

O422


3.007

Aeromonas hydrophila

7.001


O475

Proteus vulgaris

3.014


7.005

Escherichia coli

O500

Pseudomonas maltophilia

3.024

Yersinia pseudotuberculosis

7.006


O504


3.105

Escherichia coli

7.007


O616


3.107


7.014


O664

Proteus mirabilis

3.204

Shigella (2)

7.025

Yersinia enterocolítica

O674

Proteus mirabilis

3.205

Escherichia coli

7.034


3.224


7.040


1.500


3.225


7.041


1.504


3.305

Escherichia coli

7.044


3.307

Aeromonas shigell./Vibrio(2)

7.045


2.004

Shigella (2) / Klebsiella

3.402

Pseudomonas cepacia

7.105

Escherichia coli

2.005

Shigella

3.404


7.107


2.035

Proteus vulgaris

3.406

Pseudomonas cepacia

7.115

Escherichia coli

2.045

Providencia

3.407


7.124


2.055

Proteus vulgaris

3.465

Proteus rettgeri

7.125

Kleb. pneumon. oxytec

2.064

Proteus

3.502

Pseudomonas cepacia

7.204

Shigella/Enterobacter

2.065

Proteus

3.507


7.205

Escherichia coli

2.074

Proteus

3.524

Klebsieella / Serratia

7.214


2.075

Proteus vulgaris

3.614


7.224

Yerinia enterocolítica

2.104

Salmonella typhi (2)

3.674

Proteus mirabilis

7.225


2.105

Escherichia coli

3.704

Serratia marcescens

7.234


2.114

Salmonella (2)

3.707

Vibrio (2)

7.305

Escherichia coli

2.221

Proteus morganii

3.724

Serratia marcescens

7.314

Salmon. arizonae(2)

2.224


7.315

Escherichia coli

2.234

Proteus mirabilis

4.402

Pseudomonas fluorescens

7.400

Enterobacter agglom.

2.241

Proteus morganii

4.406


7.401


2.245

Proteus morganii

4.422


7.405


2.254

Proteus mirabilis

4.426


7.407


2.261

Proteus morganii

7.414



98

2.264

Proteus mirabilis

6.000

Acinetobacter calcoacéticus

7.415


2.265

Proteus morganii

6.004

Shigella (2)

7.425


2.274

Proteus mirabilis

6.005

Shigella (2)/Escherichia coli

7.434


2.305

Edwardsiella tarda

6.045

Providencia

7.440

Enterobacter agglom

2.307

Vibrio

6.065

Proteus

7.441

Enterobacter agglom

2.314

Salmonella (2)

6.104

Salmonella (2)

7.444

Enterobacter agglom

2.315

Edwardsiella tarda

6.105

Salmonella (2)/ E. coli

7.445

Enterobacter agglom

2.324

Enterobacter hafniae

6.114

Salmonella (2)

7.504


2.365

Proteus morganii

6.204

Salmonella (2)/Shigella (2)

7.505


2.374

Proteus mirabilis

6.205

Escherichia coli

7.507


2.402


6.214

Citrobacter / Salmonella (2)

7.524

Klebsiella pneumoniae

2.404

Klebsiella ozaenae

6.224


7.525


2.405

Providencia

6.225


7.604

Enterob. cloac/Serratia

2.422

Pseudomonas

6.261

Proteus morganii

7.605

Citrobacter

2.425

Proteus rettgeri

6.265

Proteus morganii

7.614


2.426


6.274

Proteus mirabilis

7.615


2.444

Providencia

6.304

Enterob. hafniae/Salmon(2)

7.624


2.445

Providencia

6.305

Escherichia coli

7.634


2.464

Proteus

6.307

Vibrio

7.714

Salmonella (2)

2.465

Proteus rettgeri

6.314

Salmonella (2)

7.702

Pseudomonas cepácea

2.474

Proteus

6.400

Acinetobacter calcoacéticus

7.704

Enterobacter / Serratia

2.475

Proteus

6.402


7.706

Pseudomonas cepácea

2.545

Providencia

6.406


7.714

Salmon. arizonae (2)

2.624

Proteus mirabilis

6.414

Citrob. freund./Salmon.(2)

7.724

Enterobacter / Serratia

2.634

Proteus mirabilis

6.422


7.725


2.644

Proteus mirabilis

6.426


2.654

Proteus mirabilis

6.445

Providencia

2.664

Proteus mirabilis

6.475

Proteus vulgaris


99

6.10. Calculo probabilístico. Galería API 10 S La bacteria Proteus vulgaris correspondería a cualquiera de las siguientes secuencias numéricas: 0075, 0475, 2055, 2075, 6475. La fiabilidad del resultado obtenido no es igual en todos los casos, por lo que es preciso realizar un cálculo probabilístico. En la tabla adjunta, figuran las frecuencias con que una bacteria determinada dará positivo en la prueba bioquímica considerada. Ello nos indica un margen de fiabilidad. Por ejemplo, si la bacteria que queremos identificar ha dado: 



POSITIVO a ONPG: descartamos como candidatas a las bacterias que nunca dan positivo (0 % de pruebas), Edward tarda y P.vulgaris. NEGATIVO a NO2: descartamos las que siempre dan positivo (100 % de pruebas), E.coli, Shigella sp., Edward tarda, Salmonella sp., K. neumoniae, etc.

Este descarte de bacterias permite reducir el número de candidatas. Suponiendo que después de aplicar este criterio selectivo se centraran las posibilidades en las bacterias siguientes: K.oxytoca, P. rettgeri y Y. enterocolitica. Se procede entonces a completar un cuadrante con el conjunto de pruebas realizadas. A modo de ejemplo, el cuadro siguiente lo realiza con 4 de las pruebas.

S.marcenses P.rettgeri Y.enterocolítica Pruebas bioq. S.marcenses P.rettgeri Y.enterocolítica

ONPG 94 1 81

+ 0,94 0,01 0,81

% % %

CIT 97 70 0

URE 28 98 93

IND 95 90 66

-

+

-

0,03 0,30 0,99

0,28 0,98 0,93

% % %

0,05 = 0,0003948 % 0,10 = 0,0002940 % 0,34 = 0,2535607 Suma total = 0,2542495 %

Cálculo de probabilidad porcentual : S.marcenses = P.rettgeri =

0,0003948 0,25442495 % 100 = 0,0002940 0,2542495 % 100 =

Y.enterocolítica =

0,15 %

0,11 %

0,2535607 0,2542495 % 100 =

99, 72 %

Conclusión: Con una probabilidad de un 99,5 % se trata de la bacteria Y.enterocolítica. % Identificación % Identificación % Identificación % Identificación

= 80.0 Identificación aceptable = 90,0 " buena = 99,0 " muy buena = 99,9 " excelente


100

TABLA 6.4. CÁLCULO PROBABILÍSTICO O N P G

G L U

A R A

L D C

O D C

C I T

H 2S U R E

T D A

I N D

O X I

N O

E. coli

95

100

83

77

70

0

3

1

0

94

0

Shigella sp.

26

99

50

0

0

0

0

0

0

38

0

Edward. tarda

0

100

1

100

100

0

94

0

0

100

0

Salmonella sp.

3

100

94

96

95

74

85

0

0

3

0

C. freundii

93

100

96

0

32

62

65

3

0

6

0

10 0 10 0 10 0 10 0 98

K. pneumoniae

99

99

99

74

0

95

0

63

0

0

0

K. oxytoca

99

99

96

86

1

84

0

60

0

100

0

E. cloacae

99

100

99

1

96

94

0

1

0

0

0

H. alvei

71

99

90

100

97

13

0

4

0

0

0

S. liquefac.

98

100

98

87

99

85

0

5

0

0

0

S. marcescens

94

100

19

98

95

97

0

28

0

1

0

10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 95

S. odorífera

95

100

95

97

43

87

0

0

0

99

0

99

P. mirabilis

1

96

1

1

98

57

83

99

98

2

0

93

P. vulgaris

0

97

1

0

0

31

83

98

99

94

0

Prov. rettgeri

1

99

1

0

0

70

0

98

99

90

0

10 0 98

Y. enterocolítica

81

99

69

0

90

0

0

93

0

66

0

98

a s o c u l g

a s o t c a l

) ) a a c t i x l i ó i m d o o n d a i t c u á b . . F ( F (

l o d n i

a n í o t e c a

s a a n g i e e e n o d d d t n ó i a n s a n n i c r l a s a ó ó ó t l i t i i i i i c l c c n C n a a a ó e e r r m m r e m t m a a r r a F r S m o r r 2 g g e e M P g . o o o r A A F F R V A A F H F F P y e k n n o ó i C c a c A I t M K n e

3 - Proteus vulgaris 4 - Klebsiella + 5 - Escherichia coli +

K/A A/A A/A

+ - + - + + ! + + - + + + ! + + - + - + + + + - - - + - + - -

2


101

Cuestionario pruebas bioquímicas 1. En que se distinguen las bacterias según sean: a. anaerobias obligadas b. anaerobias facultativas c. aerotolerantes 2. Se siembran 2 gotas de inóculo de 5 tipos de microorganismos con diferentes tipos de requerimientos de O2, en un agar que se mantiene líquido a 45 ºC. Se agita hasta homogeneizar los tubos y se enfría rapidamente. Se incuban los tubos 48 h. a 37 ºC. Considerando que los medios satisfacían todos los requerimientos químic os de los metabolismos de los diversos microorganismos. De acuerdo con el esquema que refleja los diversos tipos de crecimiento que ha habido en cada tubo, explica que tipo de microorganismo ha crecido y que metabolismo ha utilizado.

3. Distingue entre los términos: metabolismo, catabolismo, anabolismo. 4. Distingue entre Fototrofo y quimiotrofo 5. Efectúa una asociación entre los términos siguientes : fotolitotrofo fotoórganotrofo Quimiolitotrofo Quimioórganotrofo

Champiñón Lechuga Escherichia coli Bacterias nitrificantes


102

6. ¿Qué es la glicólisis? ¿Cuáles son las sustancias que forma en su degradación? 7. Describe la función del ATP 8. ¿Cuáles son las diferencias más significativas entre respiración y fermentación? 9. ¿Porqué la fermentación desprende menor energía que la respiración? 10. ¿Qué información del metabolismo de una bacteria nos permite conocer la siembra por picadura en un agar KIA, respecto a: a. Tipo de sustrato que ha fermentado b. Exigencia de O2 Tipos de enzimas que posee la bacteria c. 11. ¿Qué procesos bioquímicos se pueden observar en un hemocultivo tipo Agar sangre? 12. Clasifica en selectivos o generales los siguientes medios: a. TSA b. A. Sangre c. A. Mc Conkey d. Levine e. A. Citrato f. Solución Ringer g. TSB h. RMVP i. A. Manitol sal 13. El medio RMVP: ¿A qué pruebas bioquímicas se aplica? ¿Qué sustancias se buscan en cada caso?¿Cómo las identificamos? 14. Qué información nos aportan las siguientes pruebas bioquímicas: Prueba del Indol Prueba de la Oxidasa Prueba de la Catalasa Agar Citrato 15. Efectuar las asociaciones adecuadas entre los términos siguientes: A - Fermentación ácido-mixta B - Fermentación de lactosa C - Aerobios/Anaerobios facultativos D - Fermentación de proteínas E - Fermentación butanodiólica F - Fermentación de lípidos G - Fermentadoras tardías de lactosa H - Respiración I - Respiración anaeróbica J - Hemólisis

1 - Prueba de la ONPG 2 - Agar KIA (por picadura en tubo) 3 - Prueba del Rojo Metilo (RM) 4 - Desaminación/descarboxilación 5 - Enzima  -galactosidasa 6 - Coenzima Citocromo c 7- Prueba de Voges Proskauer (VP) 8 - Prueba de la catalasa 9 - Agar Sangre 10 - Agar Citrato


103

16. Efectuar las asociaciones adecuadas entre los términos siguientes: A - Fermentación ácido-mixta B - Respiración C - Respiración anaeróbica D - Fermentación de proteínas E - Fermentación butanodiólica F - Fermentación homoláctica G - Fermentación heteroláctica

1 - ácido láctico 2 - ácidos orgánicos 3 -C02 + H20 4 - Acetoína 5 - ácido láctico y otros ácidos orgánicos 6 - Indol 7 - N02- , SO32-......

Indicar para las siguientes afirmaciones Verdadero o Falso : 17. Las bacterias aerobias estrictas no pueden fermentar. 18. En ausencia de oxígeno molecular siempre se producirá fermentación, nunca respiración. 19. La fermentación no se produce en condiciones de aerobiosis. 20. La fermentación se puede producir en condiciones de anaerobiosis. 21. Si hay producción de ácidos la bacteria ha respirado. 22. Si se produce CO2 , podemos asegurar que ha habido respiración. 23. Las enterobacterias son anaerobias facultativas. Pueden obtener energía por respiración y por fermentación. 24. Las bacterias aerotolerantes pueden respirar. 25. En una fermentación, los nitratos pueden actuar como aceptores finales de electrones. 26. En la respiración anaeróbica el amonio no puede actuar como aceptor final de electrones. 27. Si una bacteria da positivo en la prueba de la oxidasa puede respirar. 28. Si una bacteria da negativo con la prueba de la oxidasa, no puede respirar. 29. Todas las bacterias aerobias o anaerobios facultativos darán positivo con la catalasa. 30. Las bacterias aerotolerantes nunca darán positivo en la prueba de la oxidasa. 31. Una bacteria que de negativo a las pruebas de oxidasa y catalasa será anaerobia estricta. 32. De acuerdo con los perfiles bioquímicos correspondientes (tabla 6.4 ), justifica el comportamiento previsto en el agar KIA (superficie/fondo/gas/H2S) , de las bacterias: E.coli, Salmonella sp., Proteus vulgaris

6. Pruebas Bioquímicas Para Identificación Bacteriana 6.1. Introducción

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