UNIVERSIDAD DE SONORA DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO EN ALIMENTOS
CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS CONSERVACIÓN Y PROCESAMIENTO DE PRODUCTOS MARINOS
BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS
Mecanismos de Regulación de la Enzima Proteolítica Tripsina en Mamíferos
ROSA LINDA LÓPEZ ENRÍQUEZ
HERMOSILLO, SONORA
DICIEMBRE, 2012 1
CONTENIDO CONTENIDO INTRODUCCIÓN REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Enzimas Involucradas en el Proceso General de la Digestión de Proteínas Características Generales de las Serina Proteasas Estructura y Función Metabólica de la Tripsina Regulación de la Actividad Proteolítica de la Tripsina Activación por Modificación Covalente (Proteólisis) Inhibición por Unión No Covalente Inhibidor Pancreático Bovino de Tripsina (BPTI) Inhibición por Unión Covalente Serina Proteasas Inhibitorias (Serpinas) Inhibidores de Tripsina en la Industria Farmacéutica y Alimentaria CONCLUSIONES REFERENCIAS
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INTRODUCCIÓN Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Se consideran indispensables para la vida pues tienen un sinnúmero de funciones de gran importancia para mantener la homeostasis del organismo humano (estructural, contráctil, regulación, inmunidad, catálisis, señalización, transporte y protectora) (Mathews et al., 2002). Las proteínas una vez consumidas tienen que ser digeridas en el estómago e intestino delgado para poderse absorber. La tripsina es una de las enzimas proteolíticas más importantes secretadas en el jugo pancreático en el intestino delgado. Esta enzima es una endopeptidasa pues cataliza la hidrolisis de enlaces peptídicos con especificidad del lado carboxilo de los aminoácidos arginina y lisina. La tripsina se produce en páncreas por estimulación por colecistoquinina y se secreta en el duodeno como el zimógeno tripsinógeno (forma inactiva). Una vez en el intestino, la enzima enteropeptidasa hidroliza al tripsinógeno en un punto de su cadena aminoacídica para activar la enzima tripsina. Éste mecanismo de activación es necesario, pues de esa manera se evita la degradación de los tejidos del páncreas de acción de la proteasa. En este sentido, es conocido que una mala regulación de la activación del zimógeno de tripsina conduce a la enfermedad denominada pancreatitis. Existen otros mecanismos de regulación de la enzima tripsina que se basan en la unión de un compuesto análogo al sitio activo de la enzima ya sea por unión covalente o no covalente. Ejemplos de estos compuestos son los inhibidores de serina proteasas (serpinas) los cuales se unen por un enlace covalente a la proteasa diana, y el inhibidor pancreático de tripsina, el cual se une de manera no covalente al sitio activo. En este trabajo se pretende revisar las características generales de la tripsina como su estructura, función metabólica y regulación (activación e inhibición). Así también este trabajo tuvo interés en revisar más detalladamente aspectos relacionados con la inhibición de de la tripsina y los compuestos que ocasionan dicha inhibición.
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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Enzimas Involucradas en el Proceso General de la Digestión de Proteínas Para lograr el aprovechamiento de las proteínas en el organismo humano, éstas tienen que ser digeridas para producir compuestos de un bajo peso molecular que puedan ser absorbidos en el tracto gastrointestinal. La digestión de las proteínas se lleva a cabo en el tubo digestivo, mediante la acción de varias enzimas proteolíticas (proteasas), que hidrolizan las uniones peptídicas (Peña-Diaz et al , 1988) En general se pueden distinguir las enzimas endopeptidasas y las exopeptidasas. Las primeras hidrolizan uniones peptídicas del interior de la cadena polipetidica. En cambio, las exopeptidasas (aminopeptidasas y carboxipeptidasas) hidrolizan específicamente uniones peptídicas de los aminoácidos terminales. Las endopeptidasas más importantes son la pepsina, la tripsina y la quimiotripsina. Las tres enzimas se sintetizan en forma de precursores inactivos (zimógenos); el pepsinógeno se convierte en pepsina por acción de la extrema acidez del jugo gástrico en el estómago, y por un proceso autocatalítico de la propia molécula (Peña-Díaz, 1988). La activación de pepsina; se realizar por proteólisis de la misma; y el fragmento aminoacídico liberado por su activación, actúa como péptido de señalización para la liberación de la hormona colecistoquinina, la cual, a su vez libera tripsinogeno y quimiotripsinogeno al intestino delgado. La enzima enteroquinasa, sintetizada en las células de la pared intestinal, cataliza la conversión de tripsinógeno en tripsina, y ésta la de quimotripsinógeno en quimotripsina. Estas endopeptidasas producen oligopeptidos, por lo que éstos son hidrolizados por otro grupo de enzimas (aminopeptidasas, carboxipeptidasas, dipeptidasas y tripeptidasas). Los productos de la digestión de las proteínas son aminoácidos libres y/o péptidos (dipeptidos o tripeptidos), los cuales son fácilmente absorbidos por las paredes del tracto gastrointestinal (RodríguezRivera, 2008).
Características Generales de las Serina Proteasas Casi una tercera parte de todas las proteasas se pueden clasificar como serina proteasas, su nombre se lo deben a un residuo nucleofílico de serina en su sitio activo (Hedstrom, 2002). Las enzimas más comunes dentro de este grupo de proteasas son la tripsina, quimiotripsina, la acetilcolinesterasa y la elastasa (Whitfor, 2005). Éstas proteasas catalizan la hidrolisis de los enlaces peptídicos de las proteínas con cierta especificidad. Entran en la clasificación de endopeptidasas, pues hidrolizan uniones internas de los péptidos, es decir no 4
liberan aminoácidos terminales (Peña-Díaz et al., 1988). Las uniones que hidrolizan no son al azar, pues muestran una especificidad de sustrato que difiere ampliamente de una enzima a otra. Las serina proteasas manifiestan estructuras similares con un sitio activo que contiene tres residuos invariantes dispuestos en estrecha proximidad. Los residuos son His57, Asp102 y Ser195 y juntos forman una tríada catalítica unidos por una red de enlaces de hidrógeno (Polgar, 2005). Además de dichos residuos invariantes, las serina proteasas tienen un hueco localizado cerca de la serina del sitio activo, el cual influye fuertemente en la especificidad de sustrato. A pesar de la adaptación de especificidad de sustrato a través de las propiedades del hueco, todas las proteasas de serina manifiestan un mecanismo catalítico similar basado en el residuo de serina altamente reactive (Hedstrom, 2002). Las secuencias de tripsina, quimiotripsina y elastasa exhiben una homología de aproximadamente 40%. Se sabe que la estructura tridimensional de todas estas enzimas comparte similares conformaciones plegadas. La similitud en la secuencia y la estructura entre quimotripsina, elastasa y tripsina indica que estas proteínas surgieron de la duplicación génica de un gen de la proteasa ancestral con la contabilidad de la evolución posterior de las diferencias individuales (Whitford, 2005).
Estructura y Función Metabólica de la Tripsina La tripsina es una serina proteasa que hidroliza a los polipéptidos de las proteínas preferentemente después de cadenas laterales cargadas positivamente, tales como arginina o lisina (Whitford, 2005). Se encuentra en el sistema digestivo de vertebrados, donde hidroliza las cadenas peptídicas de las proteínas (Rawlings y Barret, 1994).
Figura 1. Estructura molecular de la tripsina Fuente: PDB, 2003 5
En general, la tripsina presenta un sitio activo similar a las demás serina proteasas, una triada catalítica que consiste en His57, Asp102 y Ser 195 (Polgar, 2005). Como se describió anteriormente, la estructura de las serina proteasas se caracteriza por tener un hueco en donde resguardan el sitio activo. En el caso de la tripsina, el hueco es relativamente largo y estrecho con un carboxilato de una cadena lateral estratégicamente situada en la parte inferior del hueco. En vista de la especificidad preferida de la tripsina para la segmentación cadenas laterales después de lisina o arginina, este hueco parece haber sido adaptado para capturar el sustrato de manera muy eficaz (Whitford, 2005)
Figura 2. Sitio activo de la tripsina. Aquí se presenta la triada catalítica conformada por histidina 57, Aspartato 102 y Serina 195. Fuente: PDB, 2003 La tripsina rompe las cadenas de péptidos principalmente en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina, excepto si están seguidas por prolina (Evnin et al ., 1990). En este sentido, Olsen et al . (2004), utilizando espectroscopia de masas, identificaron que en los péptidos obtenidos por hidrolisis de tripsina fueron cortados únicamente del lado carboxilo terminal de la arginina y lisina, corroborando la especificidad de esta enzima. La tripsina se activa a partir de la proteólisis de su zimógeno (tripsinógeno) en el intestino delgado por enteropeptidasa. La tripsina cataliza la hidrolisis de enlaces peptídicos en el duodeno, rompiendo a las proteínas en péptidos de bajo peso molecular. A su vez, estos péptidos se pueden seguirse hidrolizando en
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aminoácidos por otras proteasas (exopeptidasas) antes de entrar en el torrente sanguíneo (Rodríguez-Rivera, 2008).
Regulación de la Actividad Proteolítica de la Tripsina Activación por Modificación Covalente (Proteólisis) La proteolisis regula la actividad enzimática por la síntesis de enzimas precursoras inactivas que contienen secuencias de precursores en el terminal N. La eliminación de estas regiones por proteasas conduce a la activación de la enzima. La tripsina se sintetiza inicialmente como una molécula precursora más grande e inactiva llamada tripsinógeno o zimógeno de tripsina. La tripsina se produce en páncreas por estimulación por colecistoquinina y se secreta en el duodeno como el zimógeno tripsinógeno (forma inactiva). Una vez en el intestino, la enzima enteropeptidasa se secreta por la membrana mucosa y corta un hexapéptido del N terminal del tripsinógeno para formar tripsina (PeñaDíaz et al., 1988; Whitford, 2005). La forma inactiva de ésta proteinasa evita el ataque proteolítico al páncreas y a la propia pared del tracto gastrointestinal (Rodríguez-Rivera, 2008). La enteropeptidasa está bajo control hormonal, el producto es la tripsina con una especificidad natural para el corte de residuos de Lys o Arg y una pequeña cantidad de tripsina producida es capaz de catalizar la producción adicional de tripsina a partir del zimógeno. Como resultado este proceso describe a menudo autolítico (Whitford, 2005). Los zimógenos son comunes para las enzimas proteolíticas, tales como las que se encuentran en el tracto digestivo de mamíferos, donde la producción de la enzima activa podría conducir a la degradación de células inmediatamente después de la traducción. La activación de la tripsina por hidrolisis proteolítica del tripsinógeno en el páncreas puede conllevar a una serie de situaciones que provoquen la autodigestión pancreática, lo que resulta en la enfermedad denominada pancreatitis. La pancreatitis aguda es una enfermedad que se da por el daño al páncreas, y éste resulta de la activación prematura de las enzimas digestivas (Voet y Voet, 2004).
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Figura 3. Activación del tripsinógeno a tripsina. Proteólisis limitada del tripsinogeno por una enteropeptidasa y donde se remueve una hexapéptido corto del N-terminal. Fuente: Whitford, 2005 La tripsina juega un papel importante en la activación de otras enzimas proteolíticas pancreáticas (Figura 4). La tripsina activa a la quimotripsina y a la elastasa mediante la ruptura proteolítica del quimotripsinógeno y de la proelastasa, respectivamente (Mathews, 2002; Whitford, 2005).
Tripsinógeno Enteropeptidasa Tripsina
Proelastasa
Quimotripsinógeno
Quimiotripsina Elastina Figura 4. Activación de zimógenos mediante ruptura proteolítica. En este esquema se muestra la activación de los zimógenos que pasan a ser catalíticamente activos cuando sufren ruptura. Fuente: Mathews et al ., 2002
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Inhibición por Unión No Covalente Los procesos de inhibición y regulación de las enzimas están interrelacionados con el procesamiento de las proteínas en las células que inhiben enzimas como parte de la función celular normal (Whitford, 2005). La inhibición reversible de la tripsina involucra la unión no covalente de un inhibidor de la enzima. Se da por inhibidores simples se unen como "llave-cerradura" y bloquean el acceso al sitio activo de la proteasas (Yamasaki et al ., 2008). Inhibidor Pancreático Bovino de Tripsina (BPTI) El modo de inhibición tipo unión no covalente, se manifiesta por el inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI), que es una proteína que actúa como inhibidor natural de tripsina, previniendo su actividad proteolítica. La alta estabilidad de la molécula es debido a los 3 enlaces disulfuro que unen las 6 miembros de cisteína de la cadena (Cys5-Cys55, Cys14-Cys38 y Cys30 Cys51. La cadena larga y básica de la lisina 15 se une muy fuertemente en el hueco de especificidad en el sitio activo de la tripsina e inhibe su acción enzimática (Kasell y Laskowski, 1965).
Inhibición por Unión Covalente Serina Proteasas Inhibitorias (Serpinas) Las serpinas son una superfamilia de proteínas clasifica das dentro de 16
secciones. El genoma humano contiene aproximadamente 36 serpinas implicadas en la regulación de numerosos sistemas que incluyen la hemostasia y fibrinólisis, angiogénesis, la cascada del complemento y la inflamación. ( Rau et al , 2007). El nombre serpina se deriva de la combinación de serina proteasa inhibitoria, en
virtud de sus propiedades funcionales (Carrell y Travis, 1985). Los inhibidores de serina proteasas (serpinas) pueden formar un enlace covalente con la proteasa de serina, inhibiendo su función. Ejemplos de este tipo de inhibidores de tripsina son por ejemplo α1-antitripsin y antitrombina. Estos inhibidores son parte de la defensa contra su activación inapropiada de tripsina (Voet y Voet, 2004). Todas ellas presentan un alto grado de homología estructural. Están típicamente compuestas por aproximadamente 400 aminoácidos que se organizan en 9 hélices y tres hojas β (A, B, C). Las s erpinas también poseen una región expuesta denomina el bucle centro reactivo (RCL) que, en moléculas inhibidoras, incluye la región determinada específica y forma la interacción inicial con la proteasa diana (Whisstock et al., 2006). 9
Un esquema minimalista de la cinética de inhibición de las serpinas consta de dos pasos: 1) la formación de un complejo michaeliano, donde la secuencia el bucle reactivo (RCL) es reconocida por la proteasa como un sustrato; y 2) la formación de un complejo covalente donde la proteasa es atrapada en un estado inactivo (Burghaus et al ., 2006) Las serpinas son de particular interés para la biología estructural, debido a que sufren un cambio único y dramático en la forma (o cambio conformacional) cuando inhiben las proteasas diana (Huntington et al ., 2000). Aunque el mecanismo de inhibición de la proteasa confiere ciertas ventajas, también tiene desventajas, y las serpinas son vulnerables a mutaciones que resultan en mal plegamiento de proteínas y la formación de inactivos polímeros de cadena larga.
Figura 5. Estructura de la serpina α1-antitripsina humana. Fuente: PDB
Inhibidores de Tripsina en la Industria Farmacéutica y Alimentaria En la industria farmacéutica, el estudio de los inhibidores naturales así como el desarrollo de inhibidores sintéticos de tripsina puede ayudar de manera importante al control de enfermedades relacionadas con la actividad proteolítica de ésta enzima, como es el caso de la pancreatitis. La investigación los perfiles cinéticos de reacciones catalizadas de la enzima en presencia de un inhibidor puede 10
identificar los mecanismos de inhibición y proporcionar pistas importantes en ausencia de datos estructurales de la geometría del sitio activo y la composición. Armados con el conocimiento estructural, la industria farmacéutica ha producido nuevos inhibidores con acción mejorada que desempeñan papeles cruciales en la lucha contra la enfermedad. Existen fuentes naturales de inhibidores de tripsina: jugo pancreático bovino, serpina, ovomucoide, soya, y frijol lima. Cada inhibidor actúa como un substrato análogo y se une con las serina proteasas para formar complejos inactivos, porque las proteasas se inactivan. Sin embargo, la presencia de inhibidores de tripsina en alimentos de consumo habitual puede ser un problema, pues comprometen la nutrición del organismo que los consume. Lo anterior sucede debido a que, al inhibir la enzima tripsina, no se lleva a cabo la degradación de las proteínas y se evita la absorción de éstas por el organismo.
CONCLUSIONES Las serina proteasas tienen una estructura similar, por lo que se considera que tienen una actividad similar. Pero la importancia de tripsina radica en que una vez activada en el intestino delgado, promueve la activación de las otras serinas proteasas (quimotripsina y elastasa). La activación de estas enzimas tiene que estar regulada, especialmente de la tripsina. Para esto, los inhibidores naturales de tripsina evitan que ésta se active inapropiadamente y que degrade los tejidos del páncreas. El estudio de inhibidores de tripsina fisiológicos o el desarrollo de inhibidores sintéticos ha sido una alternativa para prevenir la activación inadecuada de esta enzima y evitar o aliviar enfermedades como la pancreatitis. En relación a la presencia de inhibidores de tripsina en alimentos, estos sin duda causan una reducción de la disponibilidad biológica de aminoácidos para su absorción en el organismo, por lo que es necesario controlar la presencia de inhibidores en productos alimentarios para no comprometer la salud nutricional de los consumidores.
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REFERENCIAS Burghaus B, Langer C, Thedieck S, Nowak-Gottl U. 2006. Elevated alpha1antitrypsin is a risk factor for arterial ischemic stroke in childhood. Acta Haematol. 115 (3-4): 186-91. Carrell R, Travis J. 1985. α1-Antitrypsin and the serpins: Variation and countervariation. Trends Biochem. Sci. 10: p. 20-24. Evnin, Luke B.; Vásquez, John R.; Craik, Charles S. 1990. Substrate specificity of trypsin investigated by using a genetic selection". Hedstrom L. 2002. Serine Protease Mechanism and Specificity. Chem. Rev. 102, 4501-4523. Huntington J, Read R, Carrell R. 2000. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation. Nature 407 (6806): 923 –6. Kassell B, Laskowski M.1965. The basic trypsin inhibitor of bovine pancreas. V. The disulfide linkages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 20 (4): 463 –8. Leiros HK, Brandsdal BO, Andersen OA, Os V, Leiros I, Helland R, Otlewski J, Willassen NP, Smalås AO. 2004. Trypsin specificity as elucidated by LIE calculations, X-ray structures, and association constant measurements. Noone PG, Zhou Z, Silverman LM, Jowell PS, Knowles MR, Cohn JA. 2001. Cystic fibrosis gene mutations and pancreatitis risk: relation to epithelial ion transport and trypsin inhibitor gene mutations" Olsen JV, Ong SE, Mann M. 2004. Trypsin cleaves exclusively c-terminal to arginine and lysine residues. Molecular & Cellular Proteom-ics 3:608 – 614. Peña-Díaz A, Arroyo-Begovich A, Gómez Puyou A, Tapia-Ibarguengoytia R. 1988. Bioquimica. Editorial Limusa. 398 p. Polgár L. 2005. The catalytic triad of serine peptidases. Cell. Mol. Life Sci. 62 (19 – 20): 2161 –72. Proteín Data Bank (PDB). 2003. www.wwpdb.org Rau JC, Beaulieu LM, Huntington JA, Church FC. 2007. Serpins in thrombosis, hemostasis and fibrinolysis. J Thromb Haemost. 5 Suppl 1: 102 -15. Rawlings ND, Barrett AJ. 1994. Families of serine peptidases. Meth. Enzymol.. Methods in Enzymology 244: 19 –61. Rodríguez-Rivera VM. 2008. Bases de la Alimentación Humana. 592 p. Voet D, Voet JG. 2004. Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level. 3rd Edition. Wiley. 1616 p. Whisstock J, Bottomley S. 2006. Molecular gymnastics: serpin structure, folding and misfolding. Curr Opin Struct Biol 16 (6): 761 –8. Whitford D. 2005. Proteins Structure and Function. Wiley. Yamasaki M, Li W, Johnson DJ, Huntington JA. 2008. Crystal structure of a stable dimer reveals the molecular basis of serpin polymerization. Nature 455 (7217): 1255 –8. Zhou, J.M., et al. 1989 Kinetics of trypsin inhibition by its specific inhibitors. Biochemistry, 3, 1070-1076.
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